特許 6063103 グリコサミノグリカンの硫酸化方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B1)

(11)【特許番号】6063103

(24)【登録日】2016年12月22日

(45)【発行日】2017年1月18日

(54)【発明の名称】グリコサミノグリカンの硫酸化方法

(51)【国際特許分類】

   C08B 37/08 20060101AFI20170106BHJP

   C08B 37/00 20060101ALI20170106BHJP

   A61K 31/737 20060101ALI20170106BHJP

   A61P 7/02 20060101ALI20170106BHJP

【ＦＩ】

   C08B37/08 Z

   C08B37/00 H

   C08B37/00 Q

   A61K31/737

   A61P7/02

【請求項の数】8

【全頁数】53

(21)【出願番号】特願2016-552543(P2016-552543)

(86)(22)【出願日】2016年3月31日

(86)【国際出願番号】JP2016060788

【審査請求日】2016年8月16日

(31)【優先権主張番号】特願2015-73148(P2015-73148)

(32)【優先日】2015年3月31日

(33)【優先権主張国】JP

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】000195524

【氏名又は名称】生化学工業株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100100549

【弁理士】

【氏名又は名称】川口 嘉之

(74)【代理人】

【識別番号】100126505

【弁理士】

【氏名又は名称】佐貫 伸一

(74)【代理人】

【識別番号】100131392

【弁理士】

【氏名又は名称】丹羽 武司

(72)【発明者】

【氏名】南澤 俊和

(72)【発明者】

【氏名】浅見 長正

(72)【発明者】

【氏名】藤田 寛

(72)【発明者】

【氏名】鈴木 喜義

【審査官】 小川 由美

(56)【参考文献】

【文献】 特公昭３８−０２５６５２（ＪＰ，Ｂ１）

【文献】 特開平１−３１８００２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開昭６２−０２７４０２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平１１−０１２１３７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平９−１６８３８４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００７−０１６０９９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００３−２６８００４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００８−１７４６４２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平１１−１４７９０１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００１−０９７９９７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許第６３８８０６０（ＵＳ，Ｂ１）

【文献】 国際公開第２００６／１０１０００（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 BHATTACHARYYA Sumit et al，Cell-Bound IL-8 Increases in Bronchial Epithelial Cells after Arylsulfatase B Silencing due to Seque，American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology，２０１０年，42，51-61，ISSN:1535-4989

【文献】 RIGDEN D. J. et al，Structures of Streptococcus pneumoniae Hyaluronate Lyase in Complex with Chondroitin and Chondroitin，The Journal of Biological Chemistry，２００３年，278(50)，50596-50606，ISSN:1083-351X

【文献】 FULLER K. et al，Heparin Augments Osteoclast Resorption-Stimulating Activity in Serum，Journal of Cellular Physiology，１９９１年，147，208-214，ISSN:1097-4652

【文献】 HINTZE Vera et al，Sulfated Glycosaminoglycans Exploit the Conformational Plasticity of Bone Morphogenetic Protein-2 (B，BioMacromolecules，２０１４年，15，3083-3092，ISSN:1526-4602

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０８Ｂ３７

ＣＡｐｌｕｓ（ＳＴＮ）

ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

グリコサミノグリカンと硫酸化剤を共存させたｐＨ１１．５以上の強塩基性の溶液中で硫酸化反応を行う、グリコサミノグリカンの硫酸化方法。

【請求項2】

グリコサミノグリカンが、下記（Ａ）〜（Ｄ）から選択されるグリコサミノグリカンである、請求項１に記載の方法。
（Ａ）ヘキスロン酸残基を有するグリコサミノグリカン。
（Ｂ）前記（Ａ）のグリコサミノグリカンに置換基又は官能基の付加又は脱離をしてなるグリコサミノグリカン。
（Ｃ）前記（Ａ）のグリコサミノグリカンを脱アセチル化してなるグリコサミノグリカン。
（Ｄ）前記（Ａ）のグリコサミノグリカンをアルキル化してなるグリコサミノグリカン。

【請求項3】

請求項１又は２に記載の方法を行う工程を含む、硫酸化グリコサミノグリカンの製造方法。

【請求項4】

グリコサミノグリカンの脱アセチル化反応を行う工程をさらに含む、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

グリコサミノグリカンのアルキル化反応を行う工程をさらに含む、請求項３又は４に記載の方法。

【請求項6】

硫酸化グリコサミノグリカンが、ヘパリン様の抗凝固活性を有する硫酸化グリコサミノグリカンである、請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

硫酸化グリコサミノグリカンが、ヘパリン様の抗凝固活性を有する硫酸化ヘパロサンである、請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

硫酸化グリコサミノグリカンが、下記（ｉ）〜（ｉｖ）から選択されるコンドロイチン硫酸、又は、下記（ｖ）若しくは（ｖｉ）から選択される硫酸化ヒアルロン酸である、請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。
（ｉ）二糖組成比において下記構造式で示される構造を含む二糖を３モル％以上有するコンドロイチン硫酸。
［ＨｅｘＡ（２Ｓ）１−３ＧａｌＮ１−４］
（式中、「ＨｅｘＡ」はヘキスロン酸残基を、「ＧａｌＮ」はガラクトサミン残基を、「１−３」は１−３グリコシド結合を、「１−４」は１−４グリコシド結合を、「２Ｓ」は２−Ｏ−硫酸基を、それぞれ示す。）
（ｉｉ）二糖組成比において下記構造式（ａ）で示される構造を含む二糖に対する下記構造式（ｂ）で示される構造を含む二糖の割合が３超であるコンドロイチン硫酸。
［ＨｅｘＡ１−３ＧａｌＮ（４Ｓ）１−４］ （ａ）
［ＨｅｘＡ（２Ｓ）１−３ＧａｌＮ１−４］ （ｂ）
（式中、「ＨｅｘＡ」はヘキスロン酸残基を、「ＧａｌＮ」はガラクトサミン残基を、「１−３」は１−３グリコシド結合を、「１−４」は１−４グリコシド結合を、「４Ｓ」は４−Ｏ−硫酸基を、「２Ｓ」は２−Ｏ−硫酸基を、それぞれ示す。）
（ｉｉｉ） 二糖組成比において下記構造式（ｃ）で示される構造を含む二糖に対する下記構造式（ｄ）で示される構造を含む二糖の割合が０．１超であるコンドロイチン硫酸。
［ＨｅｘＡ１−３ＧａｌＮ（６Ｓ）１−４］ （ｃ）
［ＨｅｘＡ（２Ｓ）１−３ＧａｌＮ１−４］ （ｄ）
（式中、「ＨｅｘＡ」はヘキスロン酸残基を、「ＧａｌＮ」はガラクトサミン残基を、「１−３」は１−３グリコシド結合を、「１−４」は１−４グリコシド結合を、「６Ｓ」は６−Ｏ−硫酸基を、「２Ｓ」は２−Ｏ−硫酸基を、それぞれ示す。）
（ｉｖ）二糖組成比において下記構造式で示される構造を含む二糖を２５モル％以上有するコンドロイチン硫酸。
［ＨｅｘＡ（２Ｓ）１−３ＧａｌＮ（６Ｓ）１−４］
（式中、「ＨｅｘＡ」はヘキスロン酸残基を、「ＧａｌＮ」はガラクトサミン残基を、「１−３」は１−３グリコシド結合を、「１−４」は１−４グリコシド結合を、「２Ｓ」は２−Ｏ−硫酸基を、「６Ｓ」は６−Ｏ−硫酸基を、それぞれ示す。）
（ｖ）二糖組成において下記構造式で示される構造を含む二糖を有する硫酸化ヒアルロン酸。
［ＨｅｘＡ１−３ＧｌｃＮ（４Ｓ）１−４］
（式中、「ＨｅｘＡ」はヘキスロン酸残基を、「ＧｌｃＮ」はグルコサミン残基を、「１−３」は１−３グリコシド結合を、「１−４」は１−４グリコシド結合を、「４Ｓ」は４−Ｏ−硫酸基を、それぞれ示す。）
（ｖｉ）以下の（Ａ）及び（Ｂ）の特徴を有する硫酸化ヒアルロン酸。
（Ａ）分子量が２００万Ｄａ以上である。
（Ｂ）硫黄含量が２質量％以上である。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、グリコサミノグリカンを硫酸化する方法等に関する。

【背景技術】

【0002】

本願の明細書においては、以下の略号を使用する。
ＧＡＧ：グリコサミノグリカン
ＨｅｘＮ：ヘキソサミン
ＨｅｘＮＡｃ：Ｎ−アセチルヘキソサミン
ＧａｌＮ：ガラクトサミン
ＧａｌＮＡｃ：Ｎ−アセチルガラクトサミン
ＧｌｃＮ：グルコサミン
ＧｌｃＮＡｃ：Ｎ−アセチルグルコサミン
ＧｌｃＮＳ：Ｎ−スルホグルコサミン
ＨｅｘＡ：へキスロン酸
ＧｌｃＡ：グルクロン酸
ＩｄｏＡ：イズロン酸
ΔＨｅｘＡ：不飽和ヘキスロン酸
ＣＳ：コンドロイチン硫酸
ＤＳ：デルマタン硫酸
ＣＨ：コンドロイチン
ｄＣＨ：脱硫酸化コンドロイチン硫酸
ＨＡ：ヒアルロン酸
ＨＰＮ：ヘパロサン
ＮＡＨ：Ｎ−アセチルヘパロサン
ＨＳ：ヘパラン硫酸
ＨＥＰ：ヘパリン
ｄＨＥＰ：脱硫酸化ヘパリン
ＡＳ：アカラン硫酸
ＡＣＨ：アカラン（２−Ｏ−脱硫酸化ＡＳ）
ＫＳ：ケラタン硫酸
ＫＰＳ：ケラタンポリ硫酸
ΔＤｉ−０Ｓ：ΔＨｅｘＡα１−３ＧａｌＮＡｃ
ΔＤｉ−６Ｓ：ΔＨｅｘＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）
ΔＤｉ−４Ｓ：ΔＨｅｘＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）
ΔＤｉ−２Ｓ：ΔＨｅｘＡ（２Ｓ）α１−３ＧａｌＮＡｃ
ΔＤｉ−ｄｉＳ_Ｄ：ΔＨｅｘＡ（２Ｓ）α１−３ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）
ΔＤｉ−ｄｉＳ_Ｅ：ΔＨｅｘＡα１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ，６Ｓ）
ΔＤｉ−ｄｉＳ_Ｂ：ΔＨｅｘＡ（２Ｓ）α１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）
ΔＤｉ−ｔｒｉＳ：ΔＨｅｘＡ（２Ｓ）α１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ，６Ｓ）
ΔＤｉＨＡ−０Ｓ：ΔＨｅｘＡα１−３ＧｌｃＮＡｃ
ΔＤｉＨＡ−６Ｓ：ΔＨｅｘＡα１−３ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）
ΔＤｉＨＡ−４Ｓ：ΔＨｅｘＡα１−３ＧｌｃＮＡｃ（４Ｓ）
ΔＤｉＨＡ−２Ｓ：ΔＨｅｘＡ（２Ｓ）α１−３ＧｌｃＮＡｃ
ΔＤｉＨＳ−０Ｓ：ΔＨｅｘＡα１−４ＧｌｃＮＡｃ
ΔＤｉＨＳ−ＮＳ：ΔＨｅｘＡα１−４ＧｌｃＮＳ
ΔＤｉＨＳ−６Ｓ：ΔＨｅｘＡα１−４ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）
ΔＤｉＨＳ−２Ｓ：ΔＨｅｘＡ（２Ｓ）α１−４ＧｌｃＮＡｃ
ΔＤｉＨＳ−ｄｉＳ_１：ΔＨｅｘＡα１−４Ｇｌｃ（ＮＳ，６Ｓ）
ΔＤｉＨＳ−ｄｉＳ_２：ΔＨｅｘＡ（２Ｓ）α１−４ＧｌｃＮＳ
ΔＤｉＨＳ−ｄｉＳ_３：ΔＨｅｘＡ（２Ｓ）α１−４ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）
ΔＤｉＨＳ−ｔｒｉＳ：ΔＨｅｘＡ（２Ｓ）α１−４Ｇｌｃ（ＮＳ，６Ｓ）
上記において、α１−３はα１−３グリコシド結合を、α１−４はα１−４グリコシド結合を、６Ｓは６−Ｏ−硫酸基を、４Ｓは４−Ｏ−硫酸基を、２Ｓは２−Ｏ−硫酸基をそれぞれ示す。

【0003】

グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を硫酸化する方法としては、化学合成法、酵素合成法、これらを組み合わせた化学酵素合成法が知られている。化学合成法において、ＧＡＧの水酸基を硫酸化する方法（Ｏ−硫酸化法）としては、有機溶媒を用いる方法が知られている。Ｏ−硫酸化法としては、第四級アンモニウム塩に変換したＧＡＧを有機溶媒に溶解し、硫酸化剤を添加してＯ−硫酸化する方法が知られており、例えば、Ｎ−アセチルヘパロサンのトリブチルアミン塩をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解し、三酸化硫黄−ピリジン錯体を添加してＯ−硫酸化する方法が知られている（特許文献１）。また、Ｏ−硫酸化法としては、ＧＡＧを極性有機溶媒に溶解し、硫酸化剤を添加してＯ−硫酸化する方法も知られており、例えば、コンドロイチンをホルムアミドに溶解し、三酸化硫黄−トリエチルアミン錯体を添加してＯ−硫酸化する方法が知られている（特許文献２）。有機溶媒を用いる方法において硫酸化反応を停止させる方法としては、例えば、硫酸化剤が水によって失活する性質を有することから、ｐＨ調整のための塩（例えば、酢酸ナトリウム）を含む水溶液を添加する方法が用いられている（特許文献２）。

【0004】

化学合成法において、ＧＡＧのアミノ基を硫酸化する方法（Ｎ−硫酸化法）としては、Ｎ−脱アセチル化したＧＡＧを炭酸ナトリウム水溶液や炭酸水素ナトリウム水溶液などのｐＨが１０程度の弱塩基性の水溶液に溶解し、硫酸化剤を添加してＮ−硫酸化する方法が知られている。Ｎ−硫酸化法としては、例えば、コンドロイチン硫酸をヒドラジン分解によってＮ−脱アセチル化した後に炭酸ナトリウム水溶液に溶解し、三酸化硫黄−トリエチルアミン錯体を添加してＮ−硫酸化する方法や、Ｎ−アセチルヘパロサン（Ｋ５多糖）をアルカリ加水分解によってＮ−脱アセチル化した後に中和し、炭酸ナトリウムと三酸化硫黄−ピリジン錯体を添加してＮ−硫酸化する方法が知られている（非特許文献１、２）。しかしながら、このような弱塩基性の水溶液中で硫酸化反応を行う方法はＧＡＧのアミノ基を特異的に硫酸化する方法であり、ＧＡＧの水酸基を硫酸化することはできなかった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特開２００５−２９０３８３号公報

【特許文献2】特表２０１３−５２０９９５号公報

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Nadkarni VD, Toida T, Van Gorp CL, Schubert RL, Weiler JM, Hansen KP, Caldwell EE, Linhardt RJ., Carbohydr Res. 1996 Aug 26; 290(1): 87-96.

【非特許文献2】Leali D, Belleri M, Urbinati C, Coltrini D, Oreste P, Zoppetti G, Ribatti D, Rusnati M, Presta M., J Biol Chem. 2001 Oct 12; 276(41): 37900-8.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明者らは、ＧＡＧの水酸基を化学的に硫酸化する方法において有機溶媒が用いられている現状を鑑み、グリーンケミストリーやサスティナブルケミストリーの観点から、有機溶媒の使用量を低減したＧＡＧの硫酸化の方法、好ましくは有機溶媒を使用しないＧＡＧの硫酸化の方法について鋭意検討した。

【0008】

本発明は、非有機溶媒の溶液中でＧＡＧを硫酸化する方法を提供することを課題とする。また、本発明は、一態様において、非有機溶媒の溶液中でＧＡＧの水酸基を硫酸化する方法を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ＧＡＧと硫酸化剤を共存させた強塩基性の溶液中で硫酸化反応を行うことにより、有機溶媒を使用しない方法（水性溶媒を使用する方法）においてＧＡＧの水酸基の硫酸化が可能であることを見出した。また、本発明者らは、当該方法によって得られる硫酸化ＧＡＧは、一態様において有機溶媒中で硫酸化して得られる硫酸化ＧＡＧや動物から抽出して得られるＧＡＧとは異なる新規の二糖組成比を有する硫酸化ＧＡＧであることを見出した。本発明者らは、これらの知見に基づいて本発明を完成するに至った。

【0010】

すなわち、前記課題を解決する本発明は、以下に例示する態様を包含する。
［１］
グリコサミノグリカンと硫酸化剤を共存させた強塩基性の溶液中で硫酸化反応を行う、グリコサミノグリカンの硫酸化方法。
［２］
強塩基性の溶液が、ｐＨ１１．５以上の溶液である、前記［１］に記載の方法。
［３］
強塩基性の溶液が、強塩基を含む強塩基性の溶液である、前記［１］又は［２］に記載の方法。
［４］
グリコサミノグリカンが、下記（Ａ）〜（Ｄ）から選択されるグリコサミノグリカンである、前記［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
（Ａ）へキスロン酸残基を有するグリコサミノグリカン。
（Ｂ）前記（Ａ）のグリコサミノグリカンに置換基又は官能基の付加又は脱離をしてなるグリコサミノグリカン。
（Ｃ）前記（Ａ）のグリコサミノグリカンを脱アセチル化してなるグリコサミノグリカン。
（Ｄ）前記（Ａ）のグリコサミノグリカンをアルキル化してなるグリコサミノグリカン。
［５］
硫酸化剤が、三酸化硫黄錯体である、前記［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］
前記［１］〜［５］のいずれかに記載の方法を行う工程を含む、硫酸化グリコサミノグリカンの製造方法。
［７］
グリコサミノグリカンの脱アセチル化反応を行う工程をさらに含む、前記［６］に記載の方法。
［８］
グリコサミノグリカンのアルキル化反応を行う工程をさらに含む、前記［６］又は［７］に記載の方法。
［９］
二糖組成比において下記構造式で示される構造を含む二糖を３モル％以上有するコンドロイチン硫酸。
［ＨｅｘＡ（２Ｓ）１−３ＧａｌＮ１−４］
（式中、「ＨｅｘＡ」はヘキスロン酸残基を、「ＧａｌＮ」はガラクトサミン残基を、「１−３」は１−３グリコシド結合を、「１−４」は１−４グリコシド結合を、「２Ｓ」は２−Ｏ−硫酸基を、それぞれ示す。）
［１０］
二糖組成比において下記構造式（ａ）で示される構造を含む二糖に対する下記構造式（ｂ）で示される構造を含む二糖の割合が３超であるコンドロイチン硫酸。
［ＨｅｘＡ１−３ＧａｌＮ（４Ｓ）１−４］ （ａ）
［ＨｅｘＡ（２Ｓ）１−３ＧａｌＮ１−４］ （ｂ）
（式中、「ＨｅｘＡ」はヘキスロン酸残基を、「ＧａｌＮ」はガラクトサミン残基を、「１−３」は１−３グリコシド結合を、「１−４」は１−４グリコシド結合を、「４Ｓ」は４−Ｏ−硫酸基を、「２Ｓ」は２−Ｏ−硫酸基を、それぞれ示す。）
［１１］
二糖組成比において下記構造式（ｃ）で示される構造を含む二糖に対する下記構造式（ｄ）で示される構造を含む二糖の割合が０．１超であるコンドロイチン硫酸。
［ＨｅｘＡ１−３ＧａｌＮ（６Ｓ）１−４］ （ｃ）
［ＨｅｘＡ（２Ｓ）１−３ＧａｌＮ１−４］ （ｄ）
（式中、「ＨｅｘＡ」はヘキスロン酸残基を、「ＧａｌＮ」はガラクトサミン残基を、「１−３」は１−３グリコシド結合を、「１−４」は１−４グリコシド結合を、「６Ｓ」は６−Ｏ−硫酸基を、「２Ｓ」は２−Ｏ−硫酸基を、それぞれ示す。）
［１２］
二糖組成比において下記構造式で示される構造を含む二糖を２５モル％以上有するコンドロイチン硫酸。
［ＨｅｘＡ（２Ｓ）１−３ＧａｌＮ（６Ｓ）１−４］
（式中、「ＨｅｘＡ」はヘキスロン酸残基を、「ＧａｌＮ」はガラクトサミン残基を、「１−３」は１−３グリコシド結合を、「１−４」は１−４グリコシド結合を、「２Ｓ」は２−Ｏ−硫酸基を、「６Ｓ」は６−Ｏ−硫酸基を、それぞれ示す。）
［１３］
二糖組成において下記構造式で示される構造を含む二糖を有する硫酸化ヒアルロン酸。
［ＨｅｘＡ１−３ＧｌｃＮ（４Ｓ）１−４］
（式中、「ＨｅｘＡ」はヘキスロン酸残基を、「ＧｌｃＮ」はグルコサミン残基を、「１−３」は１−３グリコシド結合を、「１−４」は１−４グリコシド結合を、「４Ｓ」は４−Ｏ−硫酸基を、それぞれ示す。）
［１４］
以下の（Ａ）及び（Ｂ）の特徴を有する硫酸化ヒアルロン酸。
（Ａ）分子量が２００万Ｄａ以上である。
（Ｂ）硫黄含量が２質量％以上である。
［１５］
硫酸化グリコサミノグリカンが、ヘパリン様の抗凝固活性を有する硫酸化グリコサミノグリカンである、前記［６］〜［８］のいずれかに記載の方法。
［１６］
硫酸化グリコサミノグリカンが、ヘパリン様の抗凝固活性を有する硫酸化ヘパロサンである、前記［６］〜［８］のいずれかに記載の方法。
［１７］
硫酸化グリコサミノグリカンが、前記［９］〜［１２］のいずれかに記載のコンドロイチン硫酸、又は、前記［１３］若しくは［１４］に記載の硫酸化ヒアルロン酸である、前記［６］〜［８］のいずれかに記載の方法。
［１８］
硫酸化グリコサミノグリカンが、前記［９］、［１０］、［１１］及び／又は［１２］に記載のコンドロイチン硫酸である、前記［６］〜［８］のいずれかに記載の方法。
［１９］
硫酸化グリコサミノグリカンが、前記［１３］及び／又は［１４］に記載の硫酸化ヒアルロン酸である、前記［６］〜［８］のいずれかに記載の方法。

【発明の効果】

【0011】

本発明によれば、非有機溶媒の溶液中でＧＡＧを硫酸化することができる。また、本発明によれば、非有機溶媒の溶液中でＧＡＧの水酸基を硫酸化することができる。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】ＮａＯＨ水溶液中にＣＨと三酸化硫黄トリメチルアミン錯体（ＴＭＡ−ＳＯ_３）を共存させて得られる硫酸化ＣＨの硫酸化度とＮａＯＨの濃度の関係を示す図である。

【図2】強塩基性の溶液を用いた硫酸化方法により得た硫酸化ヒアルロン酸の^１３Ｃ−ＮＭＲ測定の結果を示す図である。

【図3】有機溶媒中での硫酸化方法により得た硫酸化ヒアルロン酸の^１３Ｃ−ＮＭＲ測定の結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0013】

（１）本発明の硫酸化方法
前述のとおり、本発明においては、ＧＡＧと硫酸化剤を共存させた非有機溶媒の溶液中でＧＡＧの硫酸化反応（ＧＡＧを硫酸化する反応）を行うことを特徴としたＧＡＧを硫酸化する方法（以下「本発明の硫酸化方法」という。）が提供される。本発明において「非有機溶媒」とは、有機溶媒以外の溶媒（例えば、無機溶媒）を含む溶媒であることを意味する。ここにいう非有機溶媒の溶液は、具体的には、強塩基性の溶液である。本発明の硫酸化方法において、強塩基性は、ｐＨ１１．５以上であることが好ましい。本発明の硫酸化方法において、強塩基性は、ｐＨ１１．６以上、ｐＨ１１．８以上、ｐＨ１２以上、ｐＨ１２．２以上、ｐＨ１２．４以上、ｐＨ１２．６以上、ｐＨ１２．８以上、またはｐＨ１３以上であってもよい。

【0014】

本発明の硫酸化方法において、硫酸化反応は、ＧＡＧと硫酸化剤を強塩基性の溶液中に共存させることにより行うことができる。共存とは、対象物同士が接触し得る状態にあることを意味する。よって、硫酸化反応は、例えば、ＧＡＧを含む強塩基性の溶液に硫酸化剤を添加することや、硫酸化剤を含む強塩基性の溶液にＧＡＧを添加することや、ＧＡＧと硫酸化剤を含む溶液を強塩基性にすることによって行うことができる。また、硫酸化反応は、ＧＡＧと硫酸化剤を共存させている時間内において溶液が強塩基性となっている時間がある限り進行させることが可能であり、その時間内において溶液が常に強塩基性であることは必要としない。すなわち、本発明の硫酸化方法の実施態様によっては、具体的には、例えば、用いる硫酸化剤の種類や量によっては、ＧＡＧと硫酸化剤を共存させている時間内に溶液のｐＨが変動することがありうるが、ＧＡＧと硫酸化剤を共存させている時間内において溶液が強塩基性となっている時間が後述する硫酸化反応を行う時間の範囲内である限りにおいて、本発明の硫酸化方法によってＧＡＧを硫酸化したことになる。

【0015】

強塩基性の溶液は、非有機溶媒の溶液であればよく、具体的には、例えば、無機溶媒の溶液であってもよく、無機溶媒と有機溶媒とを混合した溶液であってもよい。ここにいう有機溶媒は、特に制限されないが、無機溶媒との混和が可能な有機溶媒であることが好ましい。そのような有機溶媒としては、極性有機溶媒が挙げられる。極性有機溶媒は、非プロトン性極性溶媒であってもよく、プロトン性極性溶媒であってもよい。極性有機溶媒は、非プロトン性極性溶媒であることが好ましい。極性有機溶媒としては、エタノール等のアルコール、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ホルムアミド、テトラヒドロフラン、ピリジン、アセトン、アセトニトリルが挙げられる。また、ここにいう無機溶媒は、特に限定されないが、中性又は塩基性の溶媒であることが好ましい。無機溶媒としては、具体的には水などの水性溶媒が挙げられる。よって、強塩基性の溶液は、一態様において、強塩基性の水溶液であってよい。さらに、硫酸化反応が行われる強塩基性の溶液の量（液量）は制限されず、使用するＧＡＧの量、硫酸化剤の量等に応じて、適宜設定することができる。

【0016】

本発明の硫酸化方法において、硫酸化反応を行う時の溶液（以下「硫酸化反応溶液」という。）は、有機溶媒を含む溶液であってもよく、有機溶媒を含まない溶液であってもよい。硫酸化反応溶液に含まれる有機溶媒の量は特に制限されず、有機溶媒の種類や所望する硫酸化の程度等の諸条件に応じて適宜設定することができる。本発明の硫酸化方法において、有機溶媒は、例えば、硫酸化反応溶液における有機溶媒の体積濃度（ｖ／ｖ）が以下に例示する濃度範囲となるように用いることができる。有機溶媒の体積濃度は、０％超であってよく、例えば、０．００１％以上、０．０１％以上、０．１％以上、１％以上、５％以上であってよい。有機溶媒の体積濃度は、例えば、９９％以下、８０％以下、６０％以下、４０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下であってよい。有機溶媒の体積濃度としては、０％超９９％以下、０％超８０％以下、０％超６０％以下、０％超４０％以下、０％超２０％以下、０％超１０％以下、０％超５％以下等が好ましく例示される。有機溶媒は１種のみであってもよく、２種またはそれ以上の組み合わせであってもよい。有機溶媒が２種またはそれ以上の組み合わせである場合は、ここにいう有機溶媒の体積濃度は、各有機溶媒における有機溶媒の体積濃度の総和を意味する。

【0017】

硫酸化反応溶液は、有機溶媒を実質的に含まない溶液であることが好ましく、有機溶媒を含まない溶液であることがより好ましい。「有機溶媒を実質的に含まない溶液」とは、有機溶媒を含まない溶液（有機溶媒を実質的に含まない溶液の調製時に混合する有機溶媒を水等の無機溶媒に置き換えて調製される溶液）を用いた場合と比較して、得られる硫酸化グリコサミノグリカンの硫酸化の程度が全く変化（増加または減少）しない、あるいはほとんど変化（増加または減少）しない程度の有機溶媒しか含まない溶液であることを意味する。「硫酸化の程度がほとんど変化しない」とは、具体的には、硫酸化グリコサミノグリカンの硫酸化度または硫黄含量を指標として比較した場合に２０％以下、１０％以下、５％以下、２％以下、１％以下、０．５％以下、または０．１％以下の変化しか起こらないことを意味してよい。すなわち、「硫酸化の程度がほとんど変化しない」とは、有機溶媒を含まない溶液を用いて硫酸化反応を行った場合の硫酸化度または硫黄含量がｎ％である場合に、有機溶媒を実質的に含まない溶液を用いて硫酸化反応を行った場合の硫酸化度または硫黄含量が０．８ｎ％以上かつ１．２ｎ％以下、０．９ｎ％以上かつ１．１ｎ％以下、０．９５ｎ％以上かつ１．０５ｎ％以下、０．９８ｎ％以上かつ１．０２ｎ％以下、０．９９ｎ％以上かつ１．０１ｎ％以下、０．９９５ｎ％以上かつ１．００５ｎ％以下、または０．９９９ｎ％以上かつ１．００１ｎ％以下であることを意味してよい。このような「有機溶媒を実質的に含まない溶液」とは、具体的には、有機溶媒を体積濃度（ｖ／ｖ）として、０％超２０％以下、０％超１０％以下、０％超５％以下、０％超２％以下、０％超１％以下、０％超０．５％以下、または０％超０．１％以下含む溶液を意味してよい。

【0018】

また、硫酸化反応溶液に含まれる無機溶媒の量は特に制限されず、無機溶媒の種類や所望する硫酸化の程度等の諸条件に応じて適宜設定することができる。本発明の硫酸化方法において、無機溶媒は、例えば、硫酸化反応溶液における無機溶媒の体積濃度（ｖ／ｖ）が以下に例示する濃度範囲となるように用いることができる。無機溶媒の体積濃度は、例えば、１％以上、５％以上、１０％以上、２０％以上、４０％以上、６０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上、９９．９％以上、１００％であってよい。無機溶媒の体積濃度は、例えば、１００％以下、９９％以下、９５％以下、９０％以下、８０％以下、６０％以下、４０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下であってよい。無機溶媒の体積濃度としては、１％〜１００％、２０％〜１００％、４０％〜１００％、６０％〜１００％、８０％〜１００％、９０％〜１００％、９５％〜１００％等が好ましく例示される。無機溶媒は１種のみであってもよく、２種またはそれ以上の組み合わせであってもよい。無機溶媒が２種またはそれ以上の組み合わせである場合は、ここにいう無機溶媒の体積濃度は、各無機溶媒における無機溶媒の体積濃度の総和を意味する。

【0019】

強塩基性の溶液としては、強塩基を含む強塩基性の溶液が挙げられる。強塩基は、水と共存した時に溶液を強塩基性にする化合物である限り特に制限されない。強塩基は、水と共存した時に水酸化物イオンを遊離する化合物であってよく、イオン化した時に水酸化物イオンを遊離する化合物であってよい。すなわち、強塩基はアレニウス塩基であってよい。ここにいう強塩基の種類は、特に制限されない。強塩基としては、金属水酸化物、テトラアルキルアンモニウム水酸化物、グアニジン、アンミン錯体水酸化物が挙げられる。強塩基は、安価で入手が容易な化合物であることが好ましく、金属水酸化物であることが好ましい。金属水酸化物としては、アルカリ金属水酸化物、アルカリ土類金属水酸化物が挙げられる。金属水酸化物は、廃棄や排水が容易な化合物であることが好ましく、アルカリ金属水酸化物であることが好ましい。アルカリ金属水酸化物としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウムが挙げられる。

【0020】

硫酸化反応溶液に含まれる強塩基の量は特に制限されず、強塩基の種類、所望する硫酸化の程度やｐＨ等の諸条件に応じて適宜設定することができる。本発明の硫酸化方法において、強塩基は、例えば、硫酸化反応溶液における強塩基のモル濃度が以下に例示する濃度範囲となるように用いることができる。強塩基のモル濃度は、例えば、０．００５Ｍ以上、０．０１Ｍ以上、０．０５Ｍ以上、０．１Ｍ以上、０．２Ｍ以上、０．５Ｍ以上、１Ｍ以上であってよい。強塩基のモル濃度は、例えば、１０Ｍ以下、５Ｍ以下、４Ｍ以下、３Ｍ以下であってよい。強塩基のモル濃度としては、０．００５Ｍ〜１０Ｍ、０．０１Ｍ〜５Ｍ、０．０１Ｍ〜４Ｍ、０．０５Ｍ〜５Ｍ、０．０５Ｍ〜４Ｍ、０．１Ｍ〜５Ｍ、０．１Ｍ〜４Ｍ、０．２Ｍ〜５Ｍ、０．２Ｍ〜４Ｍ、０．５Ｍ〜５Ｍ、０．５Ｍ〜４Ｍ、１Ｍ〜３Ｍ等が好ましく例示される。強塩基は１種のみであってもよく、２種またはそれ以上の組み合わせであってもよい。強塩基が２種またはそれ以上の組み合わせである場合は、ここにいう強塩基のモル濃度は、各強塩基における強塩基のモル濃度の総和を意味する。また、ここにいう強塩基のモル濃度は、水酸化物イオンのモル濃度を意味してもよい。

【0021】

強塩基の形状は、気体であってもよく、粉末や顆粒等の固体であってもよく、液体であってもよい。ここにいう液体は、気体や固体の強塩基と溶媒を共存させたものであってよい。ここにいう溶媒は、有機溶媒であってもよく、無機溶媒であってもよく、有機溶媒と無機溶媒の混合溶媒であってもよい。また、ここにいう溶媒は、共存させる強塩基を溶解する溶媒であってもよく、共存させる強塩基を溶解しない溶媒であってもよい。ここにいう強塩基を溶解しない溶媒は、共存させる強塩基を一切溶解しない溶媒であってもよいし、共存させる強塩基を一部溶解するが完全には溶解しない溶媒であってもよい。

【0022】

本発明の硫酸化方法に供されるＧＡＧは、本発明の属する技術分野においてＧＡＧとして認識される限り特に制限されない。ＧＡＧは、アミノ糖を含む二糖が繰り返し重合した構造を骨格として有する直鎖状の多糖である。アミノ糖は、ヘキソサミン（ＨｅｘＮ）であってよく、グルコサミン（ＧｌｃＮ）であってもよく、ガラクトサミン（ＧａｌＮ）であってもよい。ヘキソサミン（ＨｅｘＮ）は、Ｎ−アセチルヘキソサミン（ＨｅｘＮＡｃ）であってよく、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）であってもよく、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）であってもよい。

【0023】

本発明の硫酸化方法に供されるＧＡＧは、硫酸基を有するＧＡＧであってもよく、硫酸基を有しないＧＡＧであってもよい。硫酸基を有するＧＡＧとしては、ＣＳ、ＤＳ、ＨＳ、ＨＥＰ、ＡＳ、ＫＳ、ＫＰＳが挙げられる。硫酸基を有するＧＡＧは、本発明の硫酸化方法や公知の硫酸化方法等によって硫酸化されたＧＡＧであってもよい。硫酸基を有しないＧＡＧとしては、ＣＨ、ＨＡ、ＨＰＮ、テストステロナンが挙げられる。また、本発明の硫酸化方法に供されるＧＡＧは、脱硫酸化されたＧＡＧであってもよい。脱硫酸化されたＧＡＧとは、脱硫酸化反応を行う前の硫酸基を有するＧＡＧに比して硫酸化の程度が低下したＧＡＧであることを意味し、硫酸基を一切有しないＧＡＧには限定されない。脱硫酸化反応に供されるＧＡＧは、特に制限されず、上記に例示した硫酸基を有するＧＡＧであってよい。脱硫酸化されたＧＡＧとしては、ｄＣＨ、ｄＨＥＰ、ＡＣＨが挙げられる。

【0024】

本発明の硫酸化方法に供されるＧＡＧは、酸性糖を含む二糖が繰り返し重合した構造を骨格として有する直鎖状の多糖（すなわち酸性多糖）であることが好ましい。酸性糖はヘキスロン酸（ＨｅｘＡ）であってよく、グルクロン酸（ＧｌｃＡ）であってもよく、イズロン酸（ＩｄｏＡ）であってもよい。すなわち、本発明の硫酸化方法に供されるＧＡＧは、ＨｅｘＡ残基を有するＧＡＧであることが好ましい。酸性多糖としては、ＣＳ、ＤＳ、ＣＨ、ＨＡ、ＨＳ、ＨＥＰ、ＨＰＮ、ＡＳ、ＡＣＨ、テストステロナンが挙げられる。

【0025】

本発明の硫酸化方法に供されるＧＡＧは、上述の通り、アミノ糖と酸性糖からなる二糖が繰り返し重合した構造を骨格として有する直鎖状の多糖であってよい。本発明の硫酸化方法に供されるＧＡＧは、構成成分としてアミノ糖とＨｅｘＡを含む多糖であってよく、アミノ糖とＧｌｃＡのみを含む多糖であってもよく、アミノ糖とＩｄｏＡのみを含む多糖であってもよく、アミノ糖、ＧｌｃＡ、ＩｄｏＡを含む多糖であってもよい。構成成分としてアミノ糖とＧｌｃＡのみを含む多糖としてはＣＳ、ＣＨ、ＨＡ、ＨＰＮ、テストステロナンが挙げられる。構成成分としてアミノ糖とＩｄｏＡのみを含む多糖としては、ＡＳ、ＡＣＨが挙げられる。構成成分としてアミノ糖、ＧｌｃＡ、ＩｄｏＡを含む多糖としては、ＤＳ、ＨＳ、ＨＥＰが挙げられる。

【0026】

構成成分としてＩｄｏＡを含む多糖としては、上記に例示した多糖の他、ＧｌｃＡ残基をＩｄｏＡ残基に異性化して得られる多糖であってよい。例えば、本発明の硫酸化方法に供されるＧＡＧは、構成成分としてＧｌｃＡを含む多糖のＧｌｃＡ残基の一部または全てをＩｄｏＡ残基に異性化して得られる多糖であってよい。そのような多糖としては、ＧｌｃＡ残基の一部または全てがＩｄｏＡ残基に異性化されたＨＰＮの異性体（異性化ヘパロサン）が挙げられる。ＨＰＮの異性化は、例えば、文献（ＷＯ２０１４／２０００４５）に記載された方法を参照して行うことができる。

【0027】

構成成分としてＧｌｃＡを含む多糖としては、上記に例示した多糖の他、ＩｄｏＡ残基をＧｌｃＡ残基に異性化して得られる多糖であってよい。例えば、本発明の硫酸化方法に供されるＧＡＧは、構成成分としてＩｄｏＡを含む多糖のＩｄｏＡ残基の一部または全てをＧｌｃＡ残基に異性化して得られる多糖であってよい。そのような多糖としては、ＩｄｏＡ残基の一部または全てがＧｌｃＡ残基に異性化されたｄＨＥＰやＨＥＰの異性体（異性化ヘパリン）、ＡＣＨやＡＳの異性体（異性化アカラン）が挙げられる。ｄＨＥＰやＡＣＨの異性化は、例えば、文献（ＷＯ２０１４／２０００４５）に記載された方法を参照して行うことができる。

【0028】

本発明の硫酸化方法に供されるＧＡＧは、側鎖の糖残基を有するＧＡＧであってもよく、側鎖の糖残基を有しないＧＡＧであってもよい。側鎖の糖残基としては、フルクトース（Ｆｒｃ）残基が挙げられる。側鎖の糖残基を有するＧＡＧとしては、側鎖としてＦｒｃ残基を有するＣＨであるＫ４多糖（フルクトシル化コンドロイチン）が挙げられる。本発明の硫酸化方法に供されるＧＡＧは、側鎖の糖残基を有しないＧＡＧであることが好ましい。

【0029】

本発明の硫酸化方法に供されるＧＡＧは、ＧＡＧそのものであってもよく、ＧＡＧの誘導体であってもよい。ＧＡＧの誘導体とは、ＧＡＧそのものに対して置換基や官能基の付加や脱離がされたＧＡＧであることを意味する。ＧＡＧの誘導体は、本発明の硫酸化方法により硫酸化される部位を有するＧＡＧである限り特に制限されない。本発明の硫酸化方法により硫酸化される部位としては、水酸基やアミノ基が挙げられる。ここにいう水酸基は、ＧＡＧが本来的に有する水酸基（ＧＡＧの糖残基の水酸基）であってよい。ここにいうアミノ基は、ＧＡＧが本来的に有するアミノ基（ＧＡＧの糖残基のアミノ基）であってよい。ＧＡＧの誘導体としては、アセチル基が脱離（脱アセチル化）されたＧＡＧや疎水基（メチル基等のアルキル基、アセチル基等のアシル基、フェニル基等のアリール基等）が付加されたＧＡＧが挙げられる。

【0030】

本発明の硫酸化方法に供されるＧＡＧの誘導体としては、ＧＡＧのアセチル基を脱離（脱アセチル化）してなるＧＡＧ（以下「脱アセチル化ＧＡＧ」という。）が挙げられる。ここにいう脱アセチル化は、アミノ基の脱アセチル化（Ｎ−脱アセチル化）であってよく、脱アセチル化ＧＡＧは、一態様において、Ｎ−脱アセチル化ＧＡＧであってよい。脱アセチル化ＧＡＧは、ＧＡＧの糖残基のアセチル基が完全または部分的に脱離されたものであってよい。また、本発明の硫酸化方法に供されるＧＡＧ誘導体としては、ＧＡＧにアルキル基を導入（アルキル化）してなるＧＡＧ（以下「アルキル化ＧＡＧ」という。）が挙げられる。ここにいうアルキル化は、水酸基のアルキル化（Ｏ−アルキル化）であってよく、アルキル化ＧＡＧは、一態様において、Ｏ−アルキル化ＧＡＧであってよい。アルキル化ＧＡＧは、ＧＡＧの糖残基の一級または二級の水酸基やアルデヒド基等の官能基が完全または部分的にアルキル化されたものであってよい。アルキル化としては、メチル化やエチル化が挙げられる。

【0031】

本発明の硫酸化方法に供されるＧＡＧの由来は特に制限されず、化学的に合成されたもの、酵素により合成されたもの、動物や微生物に由来するもの等を本発明の硫酸化方法に供することができる。本発明の硫酸化方法に供されるＧＡＧは、公知の方法等により調製されたものであってもよく、市販のものであってもよい。

【0032】

本発明の硫酸化方法に供されるＧＡＧは、ＧＡＧそのものであってもよく、他の物質と複合体を形成しているＧＡＧであってもよい。ここにいう他の物質としては、特に制限されないが、タンパク質が挙げられる。本発明の硫酸化方法においては、例えば、プロテオグリカン等のＧＡＧとタンパク質との複合体をＧＡＧの硫酸化反応のために供してもよい。本発明の硫酸化方法に供されるＧＡＧは、他の物質と複合体を形成していないＧＡＧであることが好ましい。

【0033】

本発明の硫酸化方法に供されるＧＡＧの分子量は特に制限されず、任意の値であってよい。分子量は、例えば、４ＭＤａ（メガダルトン）（４００万Ｄａ）以下、３ＭＤａ以下、２ＭＤａ以下、１ＭＤａ以下、５００ｋＤａ以下、２００ｋＤａ以下、１００ｋＤａ以下、５０ｋＤａ以下であってよい。分子量は、例えば、５ｋＤａ以上、１０ｋＤａ以上、２０ｋＤａ以上、３０ｋＤａ以上、５０ｋＤａ以上、１００ｋＤａ以上、５００ｋＤａ以上、１ＭＤａ以上、２ＭＤａ以上であってよい。分子量としては、５ｋＤａ〜４ＭＤａ、５ｋＤａ〜３ＭＤａ、５ｋＤａ〜２ＭＤａ、５ｋＤａ〜１ＭＤａ、５ｋＤａ〜５００ｋＤａ、５ｋＤａ〜１００ｋＤａ、５ｋＤａ〜５０ｋＤａ、１０ｋＤａ〜３ＭＤａ、１０ｋＤａ〜１ＭＤａ、１０ｋＤａ〜５００ｋＤａ、１０ｋＤａ〜１００ｋＤａ、１０ｋＤａ〜５０ｋＤａ、２０ｋＤａ〜１００ｋＤａ、２０ｋＤａ〜５０ｋＤａ、３０ｋＤａ〜５０ｋＤａ、５００ｋＤａ〜４ＭＤａ、５００ｋＤａ〜３ＭＤａ、１ＭＤａ〜４ＭＤａ、１ＭＤａ〜３ＭＤａ、２ＭＤａ〜３ＭＤａ等が好ましく例示される。ここにいう分子量は、重量平均分子量を意味する。ＧＡＧが他の物質との複合体である場合は、ここにいう分子量は、ＧＡＧそのものの分子量であってよい。ＧＡＧの分子量は、例えば、公知の方法により測定することができる。ＧＡＧの分子量は、具体的には、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィーにより測定した重量平均分子量であってよい。ＧＡＧの分子量は、より具体的には、例えば、後述する＜参考例４＞または＜参考例５＞に記載の方法により測定することができる。

【0034】

硫酸化反応溶液に含まれるＧＡＧの量は制限されず、強塩基性の溶液の種類や液量、所望する硫酸化の程度等の諸条件に応じて適宜設定することができる。本発明の硫酸化方法において、ＧＡＧは、例えば、硫酸化反応溶液におけるＧＡＧの重量濃度（ｗ／ｖ）が以下に例示する濃度範囲となるように用いることができる。ＧＡＧの重量濃度は、例えば、０．００１％以上、０．０１％以上、０．１％以上、１％以上であってよい。ＧＡＧの重量濃度は、例えば、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下であってよい。ＧＡＧの重量濃度としては、０．００１％〜５０％、０．０１％〜４０％、０．１％〜３０％、０．１％〜２０％、１％〜２０％、１％〜１０％、０．１％〜１０％、０．１％〜１％等が好ましく例示される。ＧＡＧは１種のみであってもよく、２種またはそれ以上の組み合わせであってもよい。ＧＡＧが２種またはそれ以上の組み合わせである場合は、ここにいうＧＡＧの重量濃度は、各ＧＡＧにおけるＧＡＧの重量濃度の総和を意味する。ここにいうＧＡＧの重量濃度は、ＧＡＧの乾燥粉末の重量を硫酸化反応溶液の液量で除した値であってもよいし、ＧＡＧの濃度の分析法による測定値であってもよい。ＧＡＧの濃度の分析法としては、カルバゾール硫酸法（BITTER T, MUIR HM., Anal Biochem. 1962 Oct; 4: 330-4.）が挙げられる。

【0035】

ＧＡＧの形状は、真空乾燥物、凍結乾燥物、粉末、顆粒等の固体であってもよく、液体であってもよい。ここにいう液体は、固体のＧＡＧと溶媒を共存させたものであってよい。ここにいう溶媒は、有機溶媒であってもよく、無機溶媒であってもよく、有機溶媒と無機溶媒の混合溶媒であってもよい。また、ここにいう溶媒は、共存させるＧＡＧを溶解する溶媒であってもよく、共存させるＧＡＧを溶解しない溶媒であってもよい。ここにいうＧＡＧを溶解しない溶媒は、共存させるＧＡＧを一切溶解しない溶媒であってもよいし、共存させるＧＡＧを一部溶解するが完全には溶解しない溶媒であってもよい。

【0036】

硫酸化剤は、ＧＡＧを硫酸化することが可能な化合物である限り特に制限されない。硫酸化剤は、例えば、硫酸化反応に通常用いられる公知の硫酸化剤であってよい。硫酸化剤は、例えば、三酸化硫黄そのものや三酸化硫黄との複合体、クロロスルホン酸などのハロゲンスルホン酸等であってよい。硫酸化剤は、三酸化硫黄との複合体であることが好ましい。三酸化硫黄との複合体としては、三酸化硫黄錯体が挙げられる。三酸化硫黄錯体は、三酸化硫黄とルイス塩基が配位結合してなる化合物である。ここにいうルイス塩基としては、アミンやピリジンが挙げられる。三酸化硫黄錯体としては、三酸化硫黄とアミンからなる錯体（三酸化硫黄アミン錯体）や三酸化硫黄とピリジンからなる錯体（三酸化硫黄ピリジン錯体）が挙げられる。三酸化硫黄アミン錯体としては、三酸化硫黄トリアルキルアミン錯体が挙げられる。三酸化硫黄トリアルキルアミン錯体としては、三酸化硫黄トリメチルアミン錯体、三酸化硫黄ジメチルエチルアミン錯体、三酸化硫黄メチルジエチルアミン錯体、三酸化硫黄トリエチルアミン錯体が挙げられる。

【0037】

硫酸化反応溶液に含まれる硫酸化剤の量は特に制限されず、硫酸化剤の種類や所望する硫酸化の程度等の諸条件に応じて適宜設定することができる。本発明の硫酸化方法において、硫酸化剤は、例えば、硫酸化反応溶液における硫酸化剤の重量濃度（ｗ／ｖ）が以下に例示する濃度範囲となるように用いることができる。硫酸化剤の重量濃度は、例えば、０．００１％以上、０．０１％以上、０．１％以上、１％以上であってよい。硫酸化剤の重量濃度は、例えば、１００％以下、６０％以下、４０％以下、２０％以下であってよい。硫酸化剤の重量濃度としては、０．００１％〜１００％、０．０１％〜６０％、０．１％〜４０％、１％〜２０％等が好ましく例示される。硫酸化剤は１種のみであってもよく、２種またはそれ以上の組み合わせであってもよい。硫酸化剤が２種またはそれ以上の組み合わせである場合は、ここにいう硫酸化剤の重量濃度は、各硫酸化剤における硫酸化剤の重量濃度の総和を意味する。

【0038】

また、本発明の硫酸化方法において、硫酸化剤は、例えば、硫酸化反応溶液に含まれるＧＡＧの構成二糖単位の総数に対する硫酸化剤の量が以下に示す当量の範囲となるように用いることができる。以下に示す硫酸化剤の量における「当量」は、特に断らない限り「モル当量」を意味する。ＧＡＧの構成二糖単位の総数に対する硫酸化剤の量は、例えば、０．００１当量以上、０．０１当量以上、０．１当量以上であってよい。ＧＡＧの構成二糖単位の総数に対する硫酸化剤の量は、例えば、２００当量以下、１２０当量以下、６０当量以下、３０当量以下、１０当量以下、５当量以下であってよい。ＧＡＧの構成二糖単位の総数に対する硫酸化剤の量としては、０．００１当量〜２００当量、０．０１当量〜１２０当量、０．１当量〜６０当量、０．１当量〜３０当量、０．１当量〜１０当量、０．１当量〜５当量等が好ましく例示される。硫酸化剤が２種またはそれ以上の組み合わせである場合は、ここにいうＧＡＧの構成二糖単位の総数に対する硫酸化剤の量は、各硫酸化剤におけるＧＡＧの構成二糖単位の総数に対する硫酸化剤の量の総和を意味する。ＧＡＧの構成二糖単位の総数は、例えば、公知の方法により測定することができる。ＧＡＧの構成二糖単位の総数は、具体的には、例えば、後述する＜参考例６＞、＜参考例１０＞、＜参考例１１＞に記載の二糖分析法によって測定することができる。また、ＧＡＧの構成二糖単位の総数は、例えば、カルバゾール硫酸法（BITTER T, MUIR HM., Anal Biochem. 1962 Oct; 4: 330-4.）によって測定することもできる。

【0039】

硫酸化剤の形状は、気体であってもよく、粉末や顆粒等の固体であってもよく、液体であってもよい。ここにいう液体は、気体や固体の硫酸化剤と溶媒を共存させたものであってよい。ここにいう溶媒は、有機溶媒であってもよく、無機溶媒であってもよく、有機溶媒と無機溶媒の混合溶媒であってもよい。また、ここにいう溶媒は、共存させる硫酸化剤を溶解する溶媒であってもよく、共存させる硫酸化剤を溶解しない溶媒であってもよい。ここにいう硫酸化剤を溶解しない溶媒は、共存させる硫酸化剤を一切溶解しない溶媒であってもよいし、共存させる硫酸化剤を一部溶解するが完全には溶解しない溶媒であってもよい。

【0040】

硫酸化反応溶液は、溶媒以外の成分としてＧＡＧと硫酸化剤のみを含む強塩基性の溶液であってもよく、溶媒以外の成分としてＧＡＧ、硫酸化剤、強塩基のみを含む強塩基性の溶液であってもよく、溶媒以外の成分としてこれら以外の他の成分をさらに含む強塩基性の溶液であってもよい。ここにいう他の成分は、硫酸化反応溶液中に含まれていても硫酸化反応が可能な成分である限り特に制限されない。そのような他の成分としては、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、リン酸塩、硫酸塩、界面活性剤、緩衝剤、ＧＡＧを抽出した動物または微生物に由来する成分（核酸、タンパク質、炭水化物、脂質等）が挙げられる。他の成分としては、具体的には、硫酸ナトリウムやエシェリヒア・コリ等の微生物に由来する成分が挙げられる。

【0041】

本発明の硫酸化方法において、硫酸化反応に用いられる物質は、任意の順序または同時に添加して共存させることができる。硫酸化反応は、例えば、ＧＡＧ、硫酸化剤、無機溶媒に加え、必要に応じて、強塩基、他の成分、有機溶媒を任意の順序で添加して行うことができる。また、本発明の硫酸化方法においては、硫酸化反応溶液の調製後にさらに任意の溶媒を添加することもできる。例えば、調製した硫酸化反応溶液において強塩基や硫酸化剤の一部または全てが溶解しない状態であった場合は、それらを溶解させるために必要な溶媒をさらに添加することで完全に溶解させることができる。硫酸化反応溶液の調製は、用いる物質を添加するごとに適宜撹拌し混合させて行うことが好ましい。

【0042】

本発明の硫酸化方法において、硫酸化反応溶液中のＧＡＧは一切溶解されない状態であってもよいし、一部溶解されるが完全には溶解されない状態であってもよいし、完全に溶解された状態であってもよい。硫酸化反応溶液中のＧＡＧが一切溶解されない状態または一部溶解されるが完全には溶解されない状態である場合は、硫酸化反応溶液を適宜撹拌してＧＡＧを溶媒中に分散させた状態を保つことが好ましい。

【0043】

硫酸化反応を行う温度は特に制限されず、硫酸化剤の種類や所望する硫酸化の程度等の諸条件に応じて適宜設定することができる。本発明の硫酸化方法において、硫酸化反応を行う温度は、例えば、以下に例示する温度範囲となるように設定することができる。硫酸化反応を行う温度は、例えば、０℃以上、４℃以上、１０℃以上、２０℃以上、３０℃以上、４０℃以上であってよい。硫酸化反応を行う温度は、例えば、１００℃以下、９０℃以下、８０℃以下、７０℃以下、６０℃以下であってよい。硫酸化反応を行う温度としては、０℃〜１００℃、０℃〜６０℃、４℃〜９０℃、４℃〜６０℃、１０℃〜８０℃、２０℃〜７０℃、２０℃〜６０℃、３０℃〜７０℃、４０℃〜６０℃等が好ましく例示される。

【0044】

硫酸化反応を行う時間は特に制限されず、硫酸化剤の種類や所望する硫酸化の程度等の諸条件に応じて適宜設定することができる。本発明の硫酸化方法において、硫酸化反応を行う時間は、例えば、以下に例示する時間の範囲となるように設定することができる。硫酸化反応を行う時間は、例えば、１分間以上、５分間以上、１０分間以上、２０分間以上、３０分間以上、１時間以上であってよい。硫酸化反応を行う時間は、例えば、１６８時間以下、４８時間以下、２４時間以下、１８時間以下、６時間以下、３時間以下であってよい。硫酸化反応を行う時間としては、１分間〜１６８時間、５分間〜１６８時間、５分間〜４８時間、１０分間〜２４時間、２０分間〜１８時間、３０分間〜６時間、１時間〜３時間等が好ましく例示される。

【0045】

硫酸化反応は静置した状態で行うことができるが、硫酸化反応溶液を適宜撹拌してＧＡＧと硫酸化剤を溶液中に均一に分散させた状態を保つことが好ましい。

【0046】

本発明において、糖残基（ＨｅｘＮやＨｅｘＡなど）はＤ体であることが好ましい。

【0047】

本発明の硫酸化方法によれば、ＧＡＧを硫酸化することができる。本発明の硫酸化方法において、硫酸化は、アミノ基の硫酸化（Ｎ−硫酸化）および／または水酸基の硫酸化（Ｏ−硫酸化）であってよい。言い換えると、硫酸化は、Ｎ−硫酸化およびＯ−硫酸化（Ｎ，Ｏ−硫酸化）、Ｎ−硫酸化、またはＯ−硫酸化であってよい。

【0048】

（２）本発明の硫酸化ＧＡＧの製造方法１
本発明の硫酸化ＧＡＧの製造方法１（以下「本発明の製造方法１」という。）は、本発明の硫酸化方法を行う工程を含むことを特徴とした、硫酸化ＧＡＧの製造方法である。

【0049】

本発明において、硫酸化ＧＡＧとは、硫酸化反応を行う前のＧＡＧに比して硫酸化の程度が高まったＧＡＧであること、言い換えると、ＧＡＧの硫酸化の程度を示す指標が硫酸化反応を行う前のＧＡＧに比して増加したＧＡＧであることを意味する。

【0050】

ＧＡＧの硫酸化の程度を示す指標は、例えば、ＧＡＧが有する硫酸基の数を構成二糖単位の数で除して算出される値（構成二糖単位あたりの硫酸基の数の平均値）を百分率換算した値（以下「硫酸化度」という。）として示すことができる。硫酸化度は、例えば、公知の手法により算出することができる。硫酸化度は、具体的には、例えば、＜参考例７＞、＜参考例８＞、＜参考例１３＞に記載の方法により算出することができる。

【0051】

また、ＧＡＧの硫酸化の程度を示す指標は、例えば、ＧＡＧが有する硫黄原子の量（ＧＡＧが有する硫黄原子の数と硫黄の原子量を乗じた値）をＧＡＧの分子量で除して算出される値を百分率換算した値（ＧＡＧを構成する原子の総重量に対する硫黄原子の総重量を重量パーセント濃度（ｗ／ｗ）で示した値）（以下「硫黄含量」という。）として示すこともできる。硫黄含量は、例えば、公知の手法により測定することができる。硫黄含量は、具体的には、例えば、酸素フラスコ燃焼法によって測定することができる。また、硫黄含量は、具体的には、例えば、＜参考例９＞、＜参考例１２＞に記載の方法により算出することができる。

【0052】

本発明の硫酸化方法に供されるＧＡＧは、前述の通り、ＧＡＧそのものであってもよく、異性化されたＧＡＧであってもよく、側鎖を有するＧＡＧであってもよく、ＧＡＧの誘導体であってもよい。すなわち、本発明において、硫酸化ＧＡＧは、ＧＡＧそのものが硫酸化されたものであってもよいし、異性化されたＧＡＧが硫酸化されたものであってもよいし、側鎖を有するＧＡＧが硫酸化されたものであってもよいし、ＧＡＧの誘導体が硫酸化されたものであってもよい。ＧＡＧの誘導体としては、脱アセチル化されたＧＡＧや疎水基（メチル基等のアルキル基、アセチル基等のアシル基、フェニル基等のアリール基等）が付加されたＧＡＧが挙げられ、具体的には、脱アセチル化ＧＡＧやアルキル化ＧＡＧが挙げられる。本発明において硫酸化ＧＡＧは、硫酸化されたＧＡＧの誘導体であってよく、具体的には、例えば、硫酸化された脱アセチル化ＧＡＧであってよく、硫酸化されたアルキル化ＧＡＧであってよい。

【0053】

本発明の製造方法１は、本発明の硫酸化方法を行う工程の他、必要に応じて他の工程をさらに含んでいてよい。ここにいう他の工程としては、硫酸化反応を停止させる工程が挙げられる。硫酸化反応は、例えば、硫酸化反応溶液を硫酸化反応に好適なｐＨよりも低いｐＨにすることにより、好ましくは硫酸化反応溶液を中性または弱酸性にすることにより停止させることができる。硫酸化反応は、具体的には、例えば、ｐＨを０〜８に、好ましくはｐＨを２〜８に、より好ましくはｐＨを４〜８に、さらに好ましくはｐＨを６〜８にすることにより停止させることができる。硫酸化反応は、例えば、硫酸化反応溶液に中和成分や酸性成分等を添加することにより停止させることができる。ここにいう酸性成分は、水と共存した時に溶液を酸性にする化合物である限り特に制限されない。酸性成分としては、具体的には、酢酸や塩酸が挙げられる。

【0054】

また、ここにいう他の工程としては、硫酸化ＧＡＧのアセチル化を行う工程も挙げられる。硫酸化ＧＡＧをアセチル化する方法は特に制限されず、例えば、公知の手法により行うことができる。硫酸化ＧＡＧをアセチル化する方法としては、無水酢酸を用いる方法が挙げられる。無水酢酸を用いる方法としては、公知の文献（Purkerson ML, Tollefsen DM, Klahr S., J Clin Invest. 1988 Jan; 81(1): 69-74.）に記載の方法が挙げられる。

【0055】

さらに、ここにいう他の工程としては、硫酸化ＧＡＧの精製を行う工程も挙げられる。硫酸化ＧＡＧを精製する方法は特に制限されず、例えば、公知の手法により行うことができる。硫酸化ＧＡＧを精製する方法としては、エタノール等の溶媒を利用するアルコール沈殿法や、陰イオン交換等のクロマトグラフィーが挙げられる。

【0056】

（３）本発明の硫酸化ＧＡＧの製造方法２
本発明の硫酸化ＧＡＧの製造方法２（以下「本発明の製造方法２」という。）は、本発明の硫酸化方法によって硫酸化反応を行う工程を含むことの他、ＧＡＧの脱アセチル化反応（ＧＡＧを脱アセチル化する反応）を行う工程をさらに含むことを特徴とした、硫酸化ＧＡＧの製造方法である。本発明の製造方法２によって製造される硫酸化ＧＡＧは、硫酸化反応および脱アセチル化反応を行う前のＧＡＧに比してアセチル化の程度が低下したＧＡＧであること、言い換えると、アセチル化の程度を示す指標が硫酸化反応および脱アセチル化反応を行う前のＧＡＧに比して低下したＧＡＧである。アセチル化の程度を示す指標は、例えば、ＧＡＧが有するアセチル基の数を構成二糖単位の数で除して算出される値（構成二糖単位あたりのアセチル基の数の平均値）を百分率換算した値（以下「脱アセチル化度」という。）として示すことができる。

【0057】

本発明の製造方法２において、脱アセチル化は、アミノ基の脱アセチル化（Ｎ−脱アセチル化）および／または水酸基の脱アセチル化（Ｏ−脱アセチル化）であってよい。言い換えると、脱アセチル化は、Ｎ−脱アセチル化およびＯ−脱アセチル化（Ｎ，Ｏ−脱アセチル化）、Ｎ−脱アセチル化、またはＯ−脱アセチル化であってよい。ここにいうアミノ基は、ＧＡＧが本来的に有するアミノ基（ＧＡＧの糖残基のアミノ基）であってよい。ここにいう水酸基は、ＧＡＧが本来的に有する水酸基（ＧＡＧの糖残基の水酸基）であってよい。

【0058】

本発明の製造方法２において、脱アセチル化反応を行う方法は、例えば、アルカリ加水分解法である。本発明の製造方法２において、脱アセチル化反応は、例えば、塩基性の溶液とＧＡＧを共存させることにより行うことができる。よって、脱アセチル化反応は、例えば、塩基性の溶液にＧＡＧを添加することや、ＧＡＧを含む溶液を塩基性にすることによって行うことができる。

【0059】

本発明の製造方法２において、脱アセチル化反応と硫酸化反応は同時に行ってもよいし、脱アセチル化反応を行った後に硫酸化反応を行ってもよいし、硫酸化反応を行った後に脱アセチル化反応を行ってもよい。また、本発明の製造方法２において、溶液のｐＨや溶液に含まれる成分は、脱アセチル化反応を行う時と硫酸化反応を行う時においてそれぞれ同じであってもよいし、異なってもよい。例えば、脱アセチル化反応を行った後に硫酸化反応を行う場合、脱アセチル化反応を行った後に酸や塩基を添加して溶液のｐＨを変化させた後に硫酸化反応を行ってもよいし、脱アセチル化反応を行った後に他の成分を添加して溶液に含まれる成分を変化させた後に硫酸化反応を行ってもよい。

【0060】

脱アセチル化反応を行う時の溶液のｐＨ（以下「脱アセチル化反応時のｐＨ」という。）は特に制限されず、所望する脱アセチル化の程度等の諸条件に応じて適宜設定することができる。脱アセチル化反応時のｐＨは、例えば、ｐＨ１１以上、ｐＨ１１．５以上、ｐＨ１２以上、ｐＨ１２．５以上、ｐＨ１３以上であってよい。脱アセチル化反応時のｐＨは、例えば、ｐＨ１４以下、ｐＨ１３．５以下であってよい。

【0061】

脱アセチル化反応を行う時の溶液の温度（以下「脱アセチル化反応時の温度」という。）は特に制限されず、溶液のｐＨや所望する脱アセチル化の程度等の諸条件に応じて適宜設定することができる。脱アセチル化反応時の温度は、例えば、以下に例示する温度の範囲となるように設定することができる。脱アセチル化反応時の温度は、例えば、２０℃以上、３０℃以上、４０℃以上であってよい。脱アセチル化反応時の温度は、例えば、１００℃以下、９０℃以下、８０℃以下、７０℃以下、６０℃以下であってよい。脱アセチル化反応時の温度としては、２０℃〜１００℃、２０℃〜９０℃、３０℃〜８０℃、３０℃〜７０℃、４０℃〜６０℃等が好ましく例示される。

【0062】

脱アセチル化反応を行う時間は特に制限されず、溶液の温度やｐＨ、所望する脱アセチル化の程度等の諸条件に応じて適宜設定することができる。脱アセチル化反応を行う時間は、例えば、以下に例示する時間の範囲となるように設定することができる。脱アセチル化反応を行う時間は、例えば、１分間以上、５分間以上、１０分間以上、３０分間以上、１時間以上であってよい。脱アセチル化反応を行う時間は、例えば、７２時間以下、４８時間以下、２４時間以下、８時間以下、４時間以下であってよい。脱アセチル化反応を行う時間としては、１分間〜７２時間、５分間〜４８時間、１０分間〜２４時間、３０分間〜８時間、１時間〜４時間等が好ましく例示される。

【0063】

本発明の製造方法２は、必要に応じて他の工程をさらに含んでいてよい。ここにいう他の工程としては、例えば、本発明の製造方法１に挙げた他の工程が挙げられる。

【0064】

（４）本発明の硫酸化ＧＡＧの製造方法３
本発明の硫酸化ＧＡＧの製造方法３（以下「本発明の製造方法３」という。）は、本発明の硫酸化方法によって硫酸化反応を行う工程を含むことの他、ＧＡＧのアルキル化反応（ＧＡＧをアルキル化する反応）を行う工程をさらに含むことを特徴とした、硫酸化ＧＡＧの製造方法である。本発明の製造方法３によって製造される硫酸化ＧＡＧは、硫酸化反応およびアルキル化反応を行う前のＧＡＧに比してアルキル化の程度が高まったＧＡＧであること、言い換えると、アルキル化の程度を示す指標が硫酸化反応およびアルキル化反応を行う前のＧＡＧに比して高まったＧＡＧである。アルキル化の程度を示す指標は、例えば、ＧＡＧが有するアルキル基の数を構成二糖単位の数で除して算出される値（構成二糖単位あたりのアルキル基の数の平均値）を百分率換算した値（以下「アルキル化度」という。）として示すことができる。ここにいうアルキル化としては、具体的には、メチル化やエチル化が挙げられる。

【0065】

本発明の製造方法３において、アルキル化は、アミノ基のアルキル化（Ｎ−アルキル化）および／または水酸基のアルキル化（Ｏ−アルキル化）であってよい。言い換えると、アルキル化は、Ｎ−アルキル化およびＯ−アルキル化（Ｎ，Ｏ−アルキル化）、Ｎ−アルキル化、またはＯ−アルキル化であってよい。ここにいうアミノ基は、ＧＡＧが本来的に有するアミノ基（ＧＡＧの糖残基のアミノ基）であってよい。ここにいう水酸基は、ＧＡＧが本来的に有する水酸基（ＧＡＧの糖残基の水酸基）であってよい。

【0066】

本発明の製造方法３において、アルキル化反応は、例えば、ＧＡＧとアルキル化剤を塩基性の溶液中に共存させることにより行うことができる。よって、アルキル化反応は、例えば、ＧＡＧを含む塩基性の溶液にアルキル化剤を添加することや、アルキル化剤を含む塩基性の溶液にＧＡＧを添加することや、ＧＡＧとアルキル化剤を含む溶液を塩基性にすることによって行うことができる。

【0067】

アルキル化剤は、アルキル化反応に通常用いられる公知のアルキル化剤であってよく、ＧＡＧをアルキル化することが可能な化合物である限り特に制限されない。アルキル化剤としては、ハロゲン化アルキルが挙げられる。ハロゲン化アルキルとしては、ヨードメタン、ヨードエタンが挙げられる。

【0068】

本発明の製造方法３において、アルキル化反応と硫酸化反応は同時に行ってもよいし、アルキル化反応を行った後に硫酸化反応を行ってもよいし、硫酸化反応を行った後にアルキル化反応を行ってもよい。また、本発明の製造方法３において、溶液のｐＨや溶液に含まれる成分は、アルキル化反応を行う時と硫酸化反応を行う時においてそれぞれ同じであってもよいし、異なってもよい。例えば、アルキル化反応を行った後に硫酸化反応を行う場合、アルキル化反応を行った後に酸や塩基を添加して溶液のｐＨを変化させた後に硫酸化反応を行ってもよいし、アルキル化反応を行った後に他の成分を添加して溶液に含まれる成分を変化させた後に硫酸化反応を行ってもよい。

【0069】

アルキル化反応を行う時の溶液のｐＨ（以下「アルキル化反応時のｐＨ」という。）は特に制限されず、所望するアルキル化の程度等の諸条件に応じて適宜設定することができる。アルキル化反応時のｐＨは、例えば、ｐＨ１１以上、ｐＨ１１．５以上、ｐＨ１２以上、ｐＨ１２．５以上、ｐＨ１３以上であってよい。アルキル化反応時のｐＨは、例えば、ｐＨ１４以下、ｐＨ１３．５以下であってよい。

【0070】

アルキル化反応を行う時の溶液の温度（以下「アルキル化反応時の温度」という。）は特に制限されず、溶液のｐＨや所望するアルキル化の程度等の諸条件に応じて適宜設定することができる。アルキル化反応時の温度は、例えば、以下に例示する温度の範囲となるように設定することができる。アルキル化反応時の温度は、例えば、２０℃以上、３０℃以上、４０℃以上であってよい。アルキル化反応時の温度は、例えば、１００℃以下、９０℃以下、８０℃以下、７０℃以下、６０℃以下であってよい。アルキル化反応時の温度としては、２０℃〜１００℃、２０℃〜９０℃、３０℃〜８０℃、３０℃〜７０℃、４０℃〜６０℃等が好ましく例示される。

【0071】

アルキル化反応を行う時間は特に制限されず、溶液の温度やｐＨ、所望するアルキル化の程度等の諸条件に応じて適宜設定することができる。アルキル化反応を行う時間は、例えば、以下に例示する時間の範囲となるように設定することができる。アルキル化反応を行う時間は、例えば、１分間以上、５分間以上、１０分間以上、３０分間以上、１時間以上であってよい。アルキル化反応を行う時間は、例えば、７２時間以下、４８時間以下、２４時間以下、８時間以下、４時間以下であってよい。アルキル化反応を行う時間としては、１分間〜７２時間、５分間〜４８時間、１０分間〜２４時間、３０分間〜８時間、１時間〜４時間等が好ましく例示される。

【0072】

本発明の製造方法３は、必要に応じて他の工程をさらに含んでいてよい。ここにいう他の工程としては、例えば、本発明の製造方法１に挙げた他の工程が挙げられる。

【0073】

本発明の製造方法２および本発明の製造方法３において、塩基性の溶液については、本発明の製造方法１における強塩基性の溶液についての記載を準用できる。例えば、塩基性の溶液は、強塩基を含む溶液であってよく、この場合における強塩基については、本発明の製造方法１における強塩基についての記載を準用できる。

【0074】

本発明の製造方法１、本発明の製造方法２、および本発明の製造方法３（以下総称して「本発明の製造方法」という。）は、一態様において、それぞれ独立して、アミノ基および水酸基が硫酸化されたＧＡＧ（Ｎ，Ｏ−硫酸化ＧＡＧ）の製造方法、アミノ基が硫酸化されたＧＡＧ（Ｎ−硫酸化ＧＡＧ）の製造方法、または、水酸基が硫酸化されたＧＡＧ（Ｏ−硫酸化ＧＡＧ）の製造方法であってよい。また、本発明の製造方法が２以上の反応を含むことを特徴とした方法である場合は、それらの反応はワンポット合成で行われることを特徴としてもよい。例えば、本発明の製造方法２における硫酸化反応と脱アセチル化反応は、ワンポット合成で行われることを特徴としてもよい。また、例えば、本発明の製造方法３における硫酸化反応とアルキル化反応は、ワンポット合成で行われることを特徴としてもよい。ワンポット合成とは、２以上の反応を伴う多段階合成を行う場合において、反応中間体を精製して単離することなく目的産物を調製する合成方法であることを意味する。本発明の製造方法において、ワンポット合成は、さらに溶媒の置換をすることなく目的産物を調製する合成方法であってもよい。

【0075】

（５）本発明の硫酸化ＧＡＧ
本発明の製造方法により製造することができる硫酸化ＧＡＧ（以下「本発明の硫酸化ＧＡＧ」という。）は、構成二糖単位の組成比（以下「二糖組成比」という。）において特に制限されないＧＡＧであってよい。本発明の硫酸化ＧＡＧの二糖組成比は、本発明の硫酸化方法を行う時の諸条件に応じて任意の値に制御することができる。具体的には、ＧＡＧの種類や濃度、硫酸化剤や強塩基の種類や量、ｐＨ、反応時間、反応温度、有機溶媒の濃度等の諸条件を適宜設定し、反応産物が所望の二糖組成比を有する硫酸化ＧＡＧとなる条件に設定すればよい。

【0076】

本発明の硫酸化ＧＡＧは、例えば、二糖組成比において以下の特徴を有するＧＡＧであってよい。

【0077】

以下に示す二糖組成比における「％」は、特に断らない限り「モル％」を意味する。本発明の硫酸化ＧＡＧにおいて、二糖組成比は任意の値であってよい。本発明の硫酸化ＧＡＧは、例えば、二糖組成比において以下の特徴を有するＧＡＧであってよい。本発明の硫酸化ＧＡＧの二糖組成比は、例えば、各二糖においてそれぞれ独立して、９９．９％以下、９９％以下、９５％以下、９０％以下、８５％以下、８０％以下、７５％以下、７０％以下、６５％以下、６０％以下、５５％以下、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下であってよい。また、本発明の硫酸化ＧＡＧの二糖組成比は、例えば、各二糖においてそれぞれ独立して、０．００１％以上、０．０１％以上、０．１％以上、１％以上、２％以上、３％以上、４％以上、５％以上、６％以上、７％以上、８％以上、９％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上であってよい。本発明の硫酸化ＧＡＧの二糖組成比としては、各二糖においてそれぞれ独立して、０．１％〜９９．９％、０．１％〜９９％、０．１％〜９５％、０．１％〜９０％、０．１％〜８５％、０．１％〜８０％、０．１％〜７５％、０．１％〜７０％、０．１％〜６５％、０．１％〜６０％、０．１％〜５５％、０．１％〜５０％、０．１％〜４５％、０．１％〜４０％、０．１％〜３５％、０．１％〜３０％、０．１％〜２５％、０．１％〜２０％、０．１％〜１５％、０．１％〜１０％、０．１％〜９％、０．１％〜８％、０．１％〜７％、０．１％〜６％、０．１％〜５％、０．１％〜４％、０．１％〜３％、０．１％〜２％、０．１％〜１％、１％〜５％、１％〜６％、１％〜７％、１％〜８％、１％〜９％、１％〜１０％、１％〜１５％、１％〜２０％、１％〜２５％、２％〜５％、２％〜６％、２％〜７％、２％〜８％、２％〜９％、２％〜１０％、２％〜１５％、２％〜２０％、２％〜２５％、３％〜５％、３％〜６％、３％〜７％、３％〜８％、３％〜９％、３％〜１０％、３％〜１５％、３％〜２０％、３％〜２５％、４％〜５％、４％〜６％、４％〜７％、４％〜８％、４％〜９％、４％〜１０％、４％〜１５％、４％〜２０％、４％〜２５％、５％〜６％、５％〜７％、５％〜８％、５％〜９％、５％〜１０％、５％〜１５％、５％〜２０％、５％〜２５％、５％〜３０％、５％〜４０％、５％〜５０％、５％〜６０％、５％〜７０％、５％〜８０％、５％〜９０％、１０％〜１５％、１０％〜２０％、１０％〜２５％、１０％〜３０％、１０％〜４０％、１０％〜５０％、１０％〜６０％、１０％〜７０％、１０％〜８０％、１０％〜９０％、１５％〜２０％、１５％〜２５％、１５％〜３０％、１５％〜４０％、１５％〜５０％、１５％〜６０％、１５％〜７０％、１５％〜８０％、１５％〜９０％、２０％〜２５％、２０％〜３０％、２０％〜４０％、２０％〜５０％、２０％〜６０％、２０％〜７０％、２０％〜８０％、２０％〜９０％、２５％〜３０％、２５％〜４０％、２５％〜５０％、２５％〜６０％、２５％〜７０％、２５％〜８０％、２５％〜９０％、３０％〜４０％、３０％〜５０％、３０％〜６０％、３０％〜７０％、３０％〜８０％、３０％〜９０％、４０％〜５０％、４０％〜６０％、４０％〜７０％、４０％〜８０％、４０％〜９０％等が好ましく例示される。

【0078】

本発明の硫酸化ＧＡＧの二糖組成比は、例えば、公知の方法により測定することができる。二糖組成比は、具体的には、例えば、後述する＜参考例６＞、＜参考例１０＞又は＜参考例１１＞に記載の二糖分析法によって測定することができる。

【0079】

（６）本発明の硫酸化コンドロイチン（本発明のコンドロイチン硫酸）
本発明の硫酸化ＧＡＧがＣＨを硫酸化して得られるＧＡＧ（以下「本発明の硫酸化ＣＨ」という。）である場合は、例えば、二糖組成比において以下の特徴を有するＧＡＧであってよい。以後の説明において、［ＨｅｘＡ１−３ＧａｌＮ１−４］で示される構造を含む二糖をＣＨ−０Ｓ、［ＨｅｘＡ１−３ＧａｌＮ（６Ｓ）１−４］で示される構造を含む二糖をＣＨ−６Ｓ、［ＨｅｘＡ１−３ＧａｌＮ（４Ｓ）１−４］で示される構造を含む二糖をＣＨ−４Ｓ、［ＨｅｘＡ（２Ｓ）１−３ＧａｌＮ１−４］で示される構造を含む二糖をＣＨ−２Ｓ、［ＨｅｘＡ（２Ｓ）１−３ＧａｌＮ（６Ｓ）１−４］で示される構造を含む二糖をＣＨ−ｄｉＳ_Ｄ、［ＨｅｘＡ１−３ＧａｌＮ（４，６Ｓ）１−４］で示される構造を含む二糖をＣＨ−ｄｉＳ_Ｅ、［ＨｅｘＡ（２Ｓ）１−３ＧａｌＮ（４Ｓ）１−４］で示される構造を含む二糖をＣＨ−ｄｉＳ_Ｂ、［ＨｅｘＡ（２Ｓ）１−３ＧａｌＮ（４，６Ｓ）１−４］で示される構造を含む二糖をＣＨ−ｔｒｉＳとそれぞれ略記する。前記において、式中、「１−３」は１−３グリコシド結合を、「１−４」は１−４グリコシド結合を、「６Ｓ」は６−Ｏ−硫酸基を、「４Ｓ」は４−Ｏ−硫酸基を、「２Ｓ」は２−Ｏ−硫酸基をそれぞれ示す。「ＨｅｘＡ」は、ＧｌｃＡまたはＩｄｏＡであってよい。「１−３グリコシド結合」は、ＨｅｘＡがＧｌｃＡである場合はβ１−３グリコシド結合であってよく、ＨｅｘＡがＩｄｏＡである場合はα１−３グリコシド結合であってよい。「１−４グリコシド結合」は、β１−４グリコシド結合であってよい。上記において、各二糖は明記された硫酸基以外の硫酸基を有しないものとする。上記において、「含む」という表現は「からなる」場合を包含する。よって、例えば、「［ＨｅｘＡ１−３ＧａｌＮ１−４］で示される構造を含む二糖」は、「［ＨｅｘＡ１−３ＧａｌＮ１−４］で示される構造からなる二糖」であってもよい。また、例えば、上記において、「ＧａｌＮ」は、ＧａｌＮＡｃであってよい。よって、例えば、「［ＨｅｘＡ１−３ＧａｌＮ１−４］で示される構造を含む二糖」は、「［ＨｅｘＡ１−３ＧａｌＮＡｃ１−４］で示される構造を含む二糖」であってもよく、「［ＨｅｘＡ１−３ＧａｌＮＡｃ１−４］で示される構造からなる二糖」であってもよい。

【0080】

本発明の硫酸化ＣＨは、例えば、二糖組成比において硫酸基を有する二糖（ＣＨ−０Ｓを除く二糖）の中でＣＨ−６Ｓを最も多く有することを特徴としたＧＡＧであってよい。本発明の硫酸化ＣＨは、二糖組成比においてＣＨ−６Ｓが占める割合が１０％以上であることが好ましく、２０％以上であることがより好ましく、３０％以上であることがさらに好ましく、４０％以上であることが特に好ましい。本発明の硫酸化ＣＨは、二糖組成比においてＣＨ−６Ｓが占める割合が１００％以下、８０％以下、６０％以下、５０％以下であってよい。本発明の硫酸化ＣＨにおいて、ＣＨ−６Ｓが占める二糖組成比の範囲としては、上記「（５）本発明の硫酸化ＧＡＧ」に例示した二糖組成比の範囲が挙げられる。本発明の硫酸化ＣＨにおいて、ＣＨ−６Ｓが占める割合の範囲としては、具体的には、例えば、１０％〜１００％、２０％〜８０％、２０％〜６０％、２０％〜５０％、３０％〜６０％、３０％〜５０％、４０％〜５０％が挙げられる。

【0081】

本発明の硫酸化ＣＨは、例えば、二糖組成比においてＣＨ−４ＳをＣＨ−６Ｓより少なく有することを特徴としたＧＡＧであってよい。本発明の硫酸化ＣＨは、二糖組成比においてＣＨ−４Ｓが占める割合が５％以下であることが好ましく、４％以下であることがより好ましく、３％以下であることがさらに好ましく、２％以下であることが特に好ましい。本発明の硫酸化ＣＨは、二糖組成比においてＣＨ−４Ｓが占める割合が０．１％以上、０．２％以上、０．５％以上、１％以上であってよい。本発明の硫酸化ＣＨにおいて、ＣＨ−４Ｓが占める二糖組成比の範囲としては、上記「（５）本発明の硫酸化ＧＡＧ」に例示した二糖組成比の範囲が挙げられる。本発明の硫酸化ＣＨにおいて、ＣＨ−４Ｓが占める割合の範囲としては、具体的には、例えば、０．１％〜５％、０．２％〜４％、０．２％〜３％、０．２％〜２％、０．５％〜３％、０．５％〜２％、１％〜２％が挙げられる。

【0082】

本発明の硫酸化ＣＨは、例えば、二糖組成比においてＣＨ−２ＳをＣＨ−４Ｓより多く有することを特徴としたＧＡＧであってよい。本発明の硫酸化ＣＨは、二糖組成比においてＣＨ−２Ｓが占める割合が３％以上であることが好ましく、４％以上であることがより好ましく、５％以上であることがさらに好ましく、６％以上であることが特に好ましい。本発明の硫酸化ＣＨは、二糖組成比においてＣＨ−２Ｓが占める割合が２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下であってよい。本発明の硫酸化ＣＨにおいて、ＣＨ−２Ｓが占める二糖組成比の範囲としては、上記「（５）本発明の硫酸化ＧＡＧ」に例示した二糖組成比の範囲が挙げられる。本発明の硫酸化ＣＨにおいて、ＣＨ−２Ｓが占める割合の範囲としては、具体的には、例えば、３％〜２５％、４％〜２０％、４％〜１５％、４％〜１０％、５％〜１５％、５％〜１０％、６％〜１０％が挙げられる。

【0083】

本発明の硫酸化ＣＨは、例えば、二糖組成比においてＣＨ−４Ｓに対するＣＨ−２Ｓの割合（２Ｓ／４Ｓ比）が以下に例示する範囲であることを特徴としたＧＡＧであってよい。本発明の硫酸化ＣＨは、２Ｓ／４Ｓ比が３超であることが好ましく、３．５以上であることがより好ましく、４以上であることがさらに好ましく、５以上であることが特に好ましい。本発明の硫酸化ＣＨは、２Ｓ／４Ｓ比が２０以下、１５以下、１０以下であってよい。本発明の硫酸化ＣＨにおいて、２Ｓ／４Ｓ比の範囲としては、３超〜２０、３超〜１５、３．５〜１５、３．５〜１０、４〜１０、５〜１０等が挙げられる。

【0084】

本発明の硫酸化ＣＨは、例えば、二糖組成比においてＣＨ−２ＳをＣＨ−６Ｓより少なく有することを特徴としたＧＡＧであってよい。本発明の硫酸化ＣＨは、二糖組成比においてＣＨ−２Ｓが占める割合が２５％以下であることが好ましく、２０％以下であることがより好ましく、１５％以下であることがさらに好ましく、１０％以下であることが特に好ましい。本発明の硫酸化ＣＨは、二糖組成比においてＣＨ−２Ｓが占める割合が３％以上、４％以上、５％以上、６％以上であってよい。本発明の硫酸化ＣＨにおいて、ＣＨ−２Ｓが占める二糖組成比の範囲としては、上記「（５）本発明の硫酸化ＧＡＧ」に例示した二糖組成比の範囲が挙げられる。本発明の硫酸化ＣＨにおいて、ＣＨ−２Ｓが占める割合の範囲としては、具体的には、例えば、３％〜２５％、４％〜２０％、４％〜１５％、４％〜１０％、５％〜１５％、５％〜１０％、６％〜１０％が挙げられる。

【0085】

本発明の硫酸化ＣＨは、例えば、二糖組成比においてＣＨ−６Ｓに対するＣＨ−２Ｓの割合（２Ｓ／６Ｓ比）が以下に例示する範囲であることを特徴としたＧＡＧであってよい。本発明の硫酸化ＣＨは、２Ｓ／６Ｓ比が２以下であることが好ましく、１．５以下であることがより好ましく、１以下であることがさらに好ましく、０．５以下であることが特に好ましい。本発明の硫酸化ＣＨは、２Ｓ／６Ｓ比が０．１超、０．１２５以上、０．１５以上であってよい。本発明の硫酸化ＣＨにおいて、２Ｓ／６Ｓ比の範囲としては、０．１超〜２、０．１２５〜２、０．１２５〜１．５、０．１５〜１．５、０．１５〜１、０．１５〜０．５等が挙げられる。

【0086】

本発明の硫酸化ＣＨは、例えば、二糖組成比においてＣＨ−ｄｉＳ_Ｂを実質的に有しないことを特徴としたＧＡＧであってよい。本発明の硫酸化ＣＨは、ＣＨ−ｄｉＳ_Ｂが占める二糖組成比が１％以下であることが好ましく、０．５％以下であることがより好ましく、０．１％以下であることが特に好ましい。また、本発明の硫酸化ＣＨは、二糖組成比においてＣＨ−ｄｉＳ_Ｂを有しないことを特徴としたＧＡＧであってもよい。

【0087】

本発明の硫酸化ＣＨは、例えば、二糖組成比においてＣＨ−ｄｉＳ_ＤをＣＨ−４Ｓより多く有することを特徴としたＧＡＧであってよい。本発明の硫酸化ＣＨは、二糖組成比においてＣＨ−ｄｉＳ_Ｄが占める割合が１０％以上であることが好ましく、１５％以上であることがより好ましく、２０％以上であることがさらに好ましく、２５％以上であることが特に好ましい。本発明の硫酸化ＣＨは、二糖組成比においてＣＨ−ｄｉＳ_Ｄが占める割合が５０％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下であってよい。本発明の硫酸化ＣＨにおいて、ＣＨ−ｄｉＳ_Ｄが占める二糖組成比の範囲としては、上記「（５）本発明の硫酸化ＧＡＧ」に例示した二糖組成比の範囲が挙げられる。本発明の硫酸化ＣＨにおいて、ＣＨ−ｄｉＳ_Ｄが占める割合の範囲としては、具体的には、例えば、１０％〜５０％、１５％〜４０％、１５％〜３５％、１５％〜３０％、２０％〜３５％、２０％〜３０％、２５％〜３０％、２５％〜４０％、２５％〜５０％が挙げられる。

【0088】

本発明の硫酸化ＣＨにおいて、ＣＨ−０Ｓ、ＣＨ−ｄｉＳ_Ｅ、ＣＨ−ｔｒｉＳが占める二糖組成比は、各二糖においてそれぞれ独立して任意の値であってよい。本発明の硫酸化ＣＨにおいて、ＣＨ−０Ｓ、ＣＨ−ｄｉＳ_Ｅ、ＣＨ−ｔｒｉＳが占める二糖組成比の範囲としては、上記「（５）本発明の硫酸化ＧＡＧ」に例示した二糖組成比の範囲が挙げられる。

【0089】

本発明の硫酸化ＣＨの二糖組成比は、例えば、後述する＜参考例６＞に記載の二糖分析法によって不飽和二糖の組成比を測定して算出することができる。具体的には、ＣＨ−０Ｓの二糖組成比はΔＤｉ−０Ｓの組成比として、ＣＨ−６Ｓの二糖組成比はΔＤｉ−６Ｓの組成比として、ＣＨ−４Ｓの二糖組成比はΔＤｉ−４Ｓの組成比として、ＣＨ−２Ｓの二糖組成比はΔＤｉ−２Ｓの組成比として、ＣＨ−ｄｉＳ_Ｄの二糖組成比はΔＤｉ−ｄｉＳ_Ｄの組成比として、ＣＨ−ｄｉＳ_Ｅの二糖組成比はΔＤｉ−ｄｉＳ_Ｅの組成比として、ＣＨ−ｄｉＳ_Ｂの二糖組成比はΔＤｉ−ｄｉＳ_Ｂの組成比として、ＣＨ−ｔｒｉＳの二糖組成比はΔＤｉ−ｔｒｉＳの組成比として、それぞれ測定することができる。

【0090】

本発明の硫酸化ＣＨの分子量は特に制限されず、任意の値であってよい。分子量は、例えば、前記「（１）本発明の硫酸化方法」に本発明の硫酸化方法に供されるＧＡＧの分子量として例示した分子量であってよい。

【0091】

本発明の硫酸化ＣＨの硫酸化度は特に制限されず、任意の値であってよい。硫酸化度は、例えば、１％以上、５％以上、１０％以上、２５％以上、５０％以上であってよい。硫酸化度は、例えば、４００％以下、２００％以下、１５０％以下、１２５％以下であってよい。硫酸化度としては、１％〜４００％、５％〜２００％、１０％〜２００％、１０％〜１５０％、１０％〜１２５％、２５％〜２００％、２５％〜１５０％、２５％〜１２５％、５０％〜２００％、５０％〜１５０％、５０％〜１２５％等が好ましく例示される。

【0092】

（７）本発明の硫酸化ヒアルロン酸
本発明の硫酸化ＧＡＧがＨＡを硫酸化して得られるＧＡＧ（以下「本発明の硫酸化ＨＡ」という。）である場合は、例えば、二糖組成比において以下の特徴を有するＧＡＧであってよい。以後の説明において、［ＨｅｘＡ１−３ＧｌｃＮ１−４］で示される構造を含む二糖をＨＡ−０Ｓ、［ＨｅｘＡ１−３ＧｌｃＮ（６Ｓ）１−４］で示される構造を含む二糖をＨＡ−６Ｓ、［ＨｅｘＡ１−３ＧｌｃＮ（４Ｓ）１−４］で示される構造を含む二糖をＨＡ−４Ｓ、［ＨｅｘＡ（２Ｓ）１−３ＧｌｃＮ１−４］で示される構造を含む二糖をＨＡ−２Ｓとそれぞれ略記する。前記において、式中、「１−３」は１−３グリコシド結合を、「１−４」は１−４グリコシド結合を、「６Ｓ」は６−Ｏ−硫酸基を、「４Ｓ」は４−Ｏ−硫酸基を、「２Ｓ」は２−Ｏ−硫酸基をそれぞれ示す。「ＨｅｘＡ」は、ＧｌｃＡまたはＩｄｏＡであってよい。「１−３グリコシド結合」は、ＨｅｘＡがＧｌｃＡである場合はβ１−３グリコシド結合であってよく、ＨｅｘＡがＩｄｏＡである場合はα１−３グリコシド結合であってよい。「１−４グリコシド結合」は、β１−４グリコシド結合であってよい。上記において、「含む」という表現は「からなる」場合を包含する。よって、例えば、「［ＨｅｘＡ１−３ＧｌｃＮ１−４］で示される構造を含む二糖」は、「［ＨｅｘＡ１−３ＧｌｃＮ１−４］からなる二糖」であってもよい。また、例えば、上記において、「ＧｌｃＮ」は、ＧｌｃＮＡｃであってよい。よって、例えば、「［ＨｅｘＡ１−３ＧｌｃＮ１−４］で示される構造を含む二糖」は、「［ＨｅｘＡ１−３ＧｌｃＮＡｃ１−４］で示される構造を含む二糖」であってもよく、「［ＨｅｘＡ１−３ＧｌｃＮＡｃ１−４］からなる二糖」であってもよい。

【0093】

本発明の硫酸化ＨＡは、例えば、二糖組成比においてＨＡ−４Ｓを有することを特徴としたＧＡＧであってよい。本発明の硫酸化ＨＡにおいて、ＨＡ−４Ｓが占める二糖組成比は任意の値であってよい。本発明の硫酸化ＨＡにおいて、ＨＡ−４Ｓが占める二糖組成比は、例えば、０．００１％以上、０．０１％以上、０．１％以上、０．５％以上、１％以上、２％以上、３％以上、４％以上、５％以上であってよい。ＨＡ−４Ｓが占める二糖組成比は、例えば、２５％以下、２０％以下、１５％以下であってよい。本発明の硫酸化ＨＡにおいて、ＣＨ−４Ｓが占める二糖組成比の範囲としては、上記「（５）本発明の硫酸化ＧＡＧ」に例示した二糖組成比の範囲が挙げられる。本発明の硫酸化ＨＡにおいて、ＨＡ−４Ｓが占める割合の範囲としては、具体的には、例えば、０．１％〜２５％、１％〜２０％、１％〜１５％、２％〜２０％、２％〜１５％、３％〜２０％、３％〜１５％、４％〜２０％、４％〜１５％、５％〜２０％、５％〜１５％が挙げられる。

【0094】

本発明の硫酸化ＨＡにおいて、ＨＡ−０Ｓ、ＨＡ−６Ｓ、ＨＡ−２Ｓが占める二糖組成比は、各二糖においてそれぞれ独立して任意の値であってよい。本発明の硫酸化ＨＡにおいて、ＨＡ−０Ｓ、ＨＡ−６Ｓ、ＨＡ−２Ｓが占める二糖組成比の範囲としては、上記「（５）本発明の硫酸化ＧＡＧ」に例示した二糖組成比の範囲が挙げられる。

【0095】

本発明の硫酸化ＨＡの二糖組成比は、例えば、後述する＜参考例１０＞に記載の二糖分析法によって不飽和二糖の組成比を測定して算出することができる。具体的には、ＨＡ−０Ｓの二糖組成比はΔＤｉＨＡ−０Ｓの組成比として、ＨＡ−６Ｓの二糖組成比はΔＤｉＨＡ−６Ｓの組成比として、ＨＡ−４Ｓの二糖組成比はΔＤｉＨＡ−４Ｓの組成比として、ＨＡ−２Ｓの二糖組成比はΔＤｉＨＡ−２Ｓの組成比として、それぞれ測定することができる。

【0096】

本発明の硫酸化ＨＡの分子量は特に制限されず、任意の値であってよい。分子量は、例えば、前記「（１）本発明の硫酸化方法」に本発明の硫酸化方法に供されるＧＡＧの分子量として例示した分子量であってよい。また、本発明の硫酸化ＨＡは、例えば、高分子であることを特徴としたＧＡＧであってよい。分子量は、例えば、４ＭＤａ（メガダルトン）以下、３．５ＭＤａ以下、３ＭＤａ以下、２．５ＭＤａ以下であってよい。分子量は、例えば、１ＭＤａ以上、１．５ＭＤａ以上、２ＭＤａ以上であってよい。分子量としては、１ＭＤａ〜４ＭＤａ、１ＭＤａ〜３．５ＭＤａ、１ＭＤａ〜３ＭＤａ、１ＭＤａ〜２．５ＭＤａ、１．５ＭＤａ〜４ＭＤａ、１．５ＭＤａ〜３．５ＭＤａ、１．５ＭＤａ〜３ＭＤａ、１．５ＭＤａ〜２．５ＭＤａ、２ＭＤａ〜４ＭＤａ、２ＭＤａ〜３．５ＭＤａ、２ＭＤａ〜３ＭＤａ、２ＭＤａ〜２．５ＭＤａ等が好ましく例示される。ここにいう分子量は、重量平均分子量を意味する。硫酸化ＨＡの分子量は、例えば、公知の方法により測定することができる。硫酸化ＨＡの分子量は、具体的には、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィーにより測定した重量平均分子量であってよい。硫酸化ＨＡの分子量は、より具体的には、例えば、後述する＜参考例５＞に記載の方法により測定することができる。

【0097】

以下に示す硫黄含量における「％」は、特に断らない限り「質量％」を意味する。本発明の硫酸化ＨＡは、例えば、硫黄含量において以下の特徴を有するＧＡＧであってよい。本発明の硫酸化ＨＡにおいて、硫黄含量は任意の値であってよい。硫黄含量は、例えば、１０％以下、８％以下、６％以下、４％以下であってよい。硫黄含量は、例えば、０．５％以上、１％以上、２％以上であってよい。硫黄含量としては、０．５％〜１０％、０．５％〜８％、０．５％〜６％、０．５％〜４％、１％〜１０％、１％〜８％、１％〜６％、１％〜４％、２％〜１０％、２％〜８％、２％〜６％、２％〜４％等が好ましく例示される。

【0098】

（８）本発明の硫酸化ヘパロサン
本発明の硫酸化ＧＡＧがＨＰＮを硫酸化して得られるＧＡＧ（以下「本発明の硫酸化ＨＰＮ」という。）である場合は、例えば、二糖組成比において以下の特徴を有するＧＡＧであってよい。以後の説明において、［ＨｅｘＡ１−４ＧｌｃＮ１−４］で示される構造を含む二糖をＨＳ−０Ｓ、［ＨｅｘＡ１−４ＧｌｃＮＳ１−４］で示される構造を含む二糖をＨＳ−ＮＳ、［ＨｅｘＡ１−４ＧｌｃＮ（６Ｓ）１−４］で示される構造を含む二糖をＨＳ−６Ｓ、［ＨｅｘＡ（２Ｓ）１−４ＧｌｃＮ１−４］で示される構造を含む二糖をＨＳ−２Ｓ、［ＨｅｘＡ１−４Ｇｌｃ（ＮＳ，６Ｓ）１−４］で示される構造を含む二糖をＨＳ−ｄｉＳ_１、［ＨｅｘＡ（２Ｓ）１−４ＧｌｃＮＳ１−４］で示される構造を含む二糖をＨＳ−ｄｉＳ_２、［ＨｅｘＡ（２Ｓ）１−４ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）１−４］で示される構造を含む二糖をＨＳ−ｄｉＳ_３、［ＨｅｘＡ（２Ｓ）１−４Ｇｌｃ（ＮＳ，６Ｓ）１−４］で示される構造を含む二糖をＨＳ−ｔｒｉＳとそれぞれ略記する。前記において、式中、「１−４」は１−４グリコシド結合を、「６Ｓ」は６−Ｏ−硫酸基を、「ＮＳ」はＮ−硫酸基を、「２Ｓ」は２−Ｏ−硫酸基をそれぞれ示す。「ＨｅｘＡ」は、ＧｌｃＡまたはＩｄｏＡであってよい。「ＨｅｘＡの還元末端側の１−４グリコシド結合」は、ＨｅｘＡがＧｌｃＡである場合はβ１−４グリコシド結合であってよく、ＨｅｘＡがＩｄｏＡである場合はα１−４グリコシド結合であってよい。「ＨｅｘＡの非還元末端側の１−４グリコシド結合」は、α１−４グリコシド結合であってよい。上記において、各二糖は明記された硫酸基以外の硫酸基を有しないものとする。上記において、「含む」という表現は「からなる」場合を包含する。よって、例えば、「［ＨｅｘＡ１−４ＧｌｃＮ１−４］で示される構造を含む二糖」は、「［ＨｅｘＡ１−４ＧｌｃＮ１−４］からなる二糖」であってもよい。また、例えば、上記において、「ＧｌｃＮ」は、ＧｌｃＮＡｃであってよい。よって、例えば、「［ＨｅｘＡ１−４ＧｌｃＮ１−４］で示される構造を含む二糖」は、「［ＨｅｘＡ１−４ＧｌｃＮＡｃ１−４］で示される構造を含む二糖」であってもよく、「［ＨｅｘＡ１−４ＧｌｃＮＡｃ１−４］からなる二糖」であってもよい。

【0099】

本発明の硫酸化ＨＰＮにおいて、ＨＳ−０Ｓ、ＨＳ−ＮＳ、ＨＳ−６Ｓ、ＨＳ−２Ｓ、ＨＳ−ｄｉＳ_１、ＨＳ−ｄｉＳ_２、ＨＳ−ｄｉＳ_３、ＨＳ−ｔｒｉＳが占める二糖組成比は、各二糖においてそれぞれ独立して任意の値であってよい。本発明の硫酸化ＨＰＮにおいて、ＨＳ−０Ｓ、ＨＳ−ＮＳ、ＨＳ−６Ｓ、ＨＳ−２Ｓ、ＨＳ−ｄｉＳ_１、ＨＳ−ｄｉＳ_２、ＨＳ−ｄｉＳ_３、ＨＳ−ｔｒｉＳが占める二糖組成比の範囲としては、上記「（５）本発明の硫酸化ＧＡＧ」に例示した二糖組成比の範囲が挙げられる。

【0100】

本発明の硫酸化ＨＰＮの二糖組成比は、例えば、後述する＜参考例１１＞に記載の二糖分析法によって不飽和二糖の組成比を測定して算出することができる。具体的には、ＨＳ−０Ｓの二糖組成比はΔＤｉＨＳ−０Ｓの組成比として、ＨＳ−ＮＳの二糖組成比はΔＤｉＨＳ−ＮＳの組成比として、ＨＳ−６Ｓの二糖組成比はΔＤｉＨＳ−６Ｓの組成比として、ＨＳ−２Ｓの二糖組成比はΔＤｉＨＳ−２Ｓの組成比として、ＨＳ−ｄｉＳ_１の二糖組成比はΔＤｉＨＳ−ｄｉＳ_１の組成比として、ＨＳ−ｄｉＳ_２の二糖組成比はΔＤｉＨＳ−ｄｉＳ_２の組成比として、ＨＳ−ｄｉＳ_３の二糖組成比はΔＤｉＨＳ−ｄｉＳ_３の組成比として、ＨＳ−ｔｒｉＳの二糖組成比はΔＤｉＨＳ−ｔｒｉＳの組成比として、それぞれ測定することができる。

【0101】

本発明の硫酸化ＨＰＮの分子量は特に制限されず、任意の値であってよい。分子量は、例えば、前記「（１）本発明の硫酸化方法」に本発明の硫酸化方法に供されるＧＡＧの分子量として例示した分子量であってよい。

【0102】

本発明の硫酸化ＨＰＮの硫酸化度は特に制限されず、任意の値であってよい。硫酸化度は、例えば、１％以上、５％以上、１０％以上、２５％以上、５０％以上であってよい。硫酸化度は、例えば、４００％以下、２００％以下、１５０％以下、１２５％以下であってよい。硫酸化度としては、１％〜４００％、５％〜２００％、１０％〜２００％、１０％〜１５０％、１０％〜１２５％、２５％〜２００％、２５％〜１５０％、２５％〜１２５％、５０％〜２００％、５０％〜１５０％、５０％〜１２５％等が好ましく例示される。

【0103】

（９）本発明の硫酸化ＧＡＧの用途
本発明の硫酸化ＧＡＧは、一態様において、ＨＥＰやＤＳ等の硫酸基を有するＧＡＧと同様の抗凝固活性を有することを特徴としたＧＡＧである。よって、本発明の硫酸化ＧＡＧは、ヘパリン様の抗凝固活性を有することを特徴としたグリコサミノグリカンであってよく、具体的には、ヘパリン様の抗凝固活性を有することを特徴としたヘパロサンであってよい。本発明の硫酸化ＧＡＧは、例えば、血液の抗凝固剤として使用することができる。

【0104】

また、本発明の硫酸化ＧＡＧは、一態様において、動物由来のＧＡＧや、有機溶媒を用いる方法において硫酸化されたＧＡＧなどの公知のＧＡＧとは二糖組成比が異なることを特徴とするＧＡＧである。よって、本発明の硫酸化ＧＡＧは、新規の素材としても有用である。

【実施例】

【0105】

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するものではない。

【0106】

以下に説明する実施例において、硫酸化反応の停止は、酢酸または塩酸を添加して硫酸化反応溶液をｐＨ６〜８に中和することにより行った。

【0107】

以下に説明する実施例において、添加した硫酸化剤の量における当量は、モル当量を意味する。

【0108】

以下に説明する実施例において使用したＧＡＧのうち、ＨＡとＣＳは市販品（生化学工業社製）を使用し、それら以外のＧＡＧ（ＣＨ、ｄＣＨ、ＮＡＨ）は以下に説明する＜参考例１＞〜＜参考例３＞に記載の方法に従って調製したものを使用した。

【0109】

＜参考例１＞コンドロイチンの調製
コンドロイチン（ＣＨ）は、公知の文献（特表２０１３−５２０９９５号公報）に記載の方法に従い、大腸菌ＭＳＣ７０２株（大腸菌Ｗ３１１０株（ATCC 27325）に、大腸菌Ｋ４株のkfoA、kfoB、kfoC、kfoF、kfoG遺伝子を各４コピー、大腸菌Ｋ４株のkpsF、kpsE、kpsD、kpsU、kpsC、kpsS、kpsM、kpsT遺伝子を各１コピー、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）のxylS遺伝子を１コピー導入して構築）を培養し、培養上清を精製して得た。

【0110】

＜参考例２＞脱硫酸化コンドロイチン硫酸の調製
脱硫酸化コンドロイチン硫酸（ｄＣＨ）は、公知の文献（J. Am. Chem. Soc., 1957, 79 (1), pp 152-153）に記載の方法に従い、コンドロイチン硫酸Ｃ（ＣＳＣ）を脱硫酸化して得た。ｄＣＨの調製手順を以下に示す。

【0111】

メタノール塩酸溶液（メタノール９３ｍＬに塩化アセチルを７ｍＬ添加して調製）にＣＳＣ（サメ軟骨由来、生化学工業社製）を１０ｇ添加し、マグネチックスターラー（以下単に「スターラー」という。）で２０時間撹拌した後、遠心分離して沈殿を回収した。この沈殿を１００ｍＬの精製水に溶解し、ＮａＯＨ水溶液を添加して中和した後、精製水に対して透析を一晩行った。この溶液を凍結乾燥して得た乾燥粉末に０．１Ｍ ＮａＯＨを添加し、２０ｇ／Ｌとなるように調製した溶液をスターラーで一晩撹拌した。この溶液にＨＣｌを添加して中和した後、精製水に対して透析を一晩行った。この溶液を凍結乾燥してｄＣＨの凍結乾燥品を得た。このようにして得られたｄＣＨは、二糖組成比において、ＣＨ−０Ｓが９９．８％かつＣＨ−６Ｓが０．２％であり、他の二糖は検出されないＧＡＧであった。

【0112】

＜参考例３＞Ｎ−アセチルヘパロサンの調製
Ｎ−アセチルヘパロサン（ＮＡＨ）は、公知の文献（特開２００４−０１８８４０号公報）に記載の方法に従い、大腸菌Ｋ５株（Serotype O10:K5(L):H4, ATCC 23506）を培養し、培養上清を精製して得た。

【0113】

＜参考例４＞グリコサミノグリカンの分子量測定（１）
ＣＨ、硫酸化ＣＨ、ＨＰＮ、硫酸化ＨＰＮの分子量は、以下の条件に従ったゲルろ過クロマトグラフィーにより測定した重量平均分子量である。

【0114】

ＣＨ、硫酸化ＣＨ、ＨＰＮ、硫酸化ＨＰＮの分子量の測定は、カラムとしてＴＳＫｇｅｌのＧ４０００ＰＷＸＬ、Ｇ３０００ＰＷＸＬ、Ｇ２５００ＰＷＸＬ（内径：７．８ｍｍ×長さ：３００ｍｍ、東ソー社製）を順に連結して用い、カラム温度を４０℃に設定して行った。移動相には０．２Ｍ ＮａＣｌを用い、流速は０．６ｍＬ／ｍｉｎとした。検出は示差屈折率検出器で行い、分子量は１ｍｇ／ｍＬに溶解した試料を１００μＬアプライして得られるピークの保持時間から較正曲線を用いて算出した。較正曲線は、ＣＳＣ（サメ軟骨由来、生化学工業社製）を段階的にエタノール分画して調製し、静的光散乱法（ＳＬＳ）により絶対分子量を測定した標準品（分子量：５２．２ｋＤａ、３１．４ｋＤａ、２０．０ｋＤａ、１０．２ｋＤａ、６．５７ｋＤａ）を用いて作成した。

【0115】

＜参考例５＞グリコサミノグリカンの分子量測定（２）
ＨＡ、硫酸化ＨＡの分子量は、以下の条件に従ったゲルろ過クロマトグラフィーにより測定した重量平均分子量である。

【0116】

ＨＡ、硫酸化ＨＡの分子量の測定は、カラムとしてＵｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ Ｌｉｎｅａｒ（内径：７．８ｍｍ×長さ：３００ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ社製）を用い、カラム温度を４０℃に設定して行った。移動相には０．２Ｍ ＮａＣｌを用い、流速は０．６ｍＬ／ｍｉｎとした。検出は示差屈折率検出器で行い、分子量は１ｍｇ／ｍＬに溶解した試料を５０μＬアプライして得られるピークの保持時間から較正曲線を用いて算出した。較正曲線はプルラン（５．９ｋＤａ、１１．８ｋＤａ、２２．８ｋＤａ、４７．３ｋＤａ、１１２ｋＤａ、２１２ｋＤａ、４０４ｋＤａ、７８８ｋＤａ、１．２２ＭＤａ、２．３５ＭＤａ、昭和電工社製）を用い、公知文献（Yomota C, Miyazaki T, Okada S., Kokuritsu Iyakuhin Shokuhin Eisei Kenkyusho Hokoku. 1999; 117: 135-9.）に記載の方法に従ったマークホーインク補正を行って作成した。マークホーインク補正は、流体力学的体積が固有粘度［η］と重量平均分子量［Ｍｗ］の積の値に比例すること、言い換えると、ゲルろ過クロマトグラフィーにおいて同一の溶出位置（保持時間）を示す２種類の高分子ポリマーにおいては［η］と［Ｍｗ］の積の値が等しくなること、を利用して異種ポリマー間の分子量を補正する方法である。よって、マークホーインク補正を行うことにより、例えば、プルランを標準試料とした場合においても、ＨＡや硫酸化ＨＡの分子量を測定することができる。マークホーインク補正は、プルランは下記の式１で示される数式を、ＨＡは下記の式２で示される数式を用いて、固有粘度［η］をそれぞれ算出して行った。

【0117】

【数1】

【0118】

【数2】

【0119】

上記の数式において、Ｍｗは各物質の重量平均分子量を示す。マークホーインク補正は、ＨＰＬＣシステム（Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ＧＰＣ、島津製作所社製）に付属のソフトウェアを用いて行った。

【0120】

＜参考例６＞硫酸化コンドロイチンの組成分析
硫酸化ＣＨの組成分析は、硫酸化ＣＨを酵素で分解して得られる二糖の組成分析（以下「二糖分析」という。）により行った。二糖の検出は、ＨＰＬＣポストカラム誘導体化法により行った。硫酸化ＣＨの二糖分析の手順を以下に示す。

【0121】

（１）硫酸化コンドロイチンの分解
硫酸化ＣＨに精製水を添加して１０ｍｇ／ｍＬとなるように調製した溶液に対し、１／２容量の１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）と１／２容量のコンドロイチナーゼ溶液（コンドロイチナーゼＡＢＣ（生化学工業社製）に０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加して０．１Ｕ／μＬとなるように調製）を添加した溶液を３７℃で３時間静置した。この溶液を沸騰水中に１分間静置した後、４倍容の精製水を添加した溶液を遠心ろ過デバイス（マイクロコン−１０、ミリポア社製）にアプライし、遠心後のろ液を二糖分析用の試料として回収した。

【0122】

（２）ＨＰＬＣポストカラム誘導体化法による分析
二糖分析は、カラムとしてＳｅｎｓｈｕ Ｐａｋ ＤＯＣＯＳＩＬ ＳＰ１００（内径：４．６ｍｍ×長さ：１５０ｍｍ、センシュー科学社製）を用い、カラム温度を５５℃に設定して行った。溶離液には溶媒Ａ（精製水）、溶媒Ｂ（２００ｍＭ ＮａＣｌ）、溶媒Ｃ（１０ｍＭテトラブチルアンモニウム）、溶媒Ｄ（５０％アセトニトリル）をオンライン混合した溶液を用い、流速は１．１ｍＬ／ｍｉｎとした。カラムの溶出液と０．７ｍＬ／ｍｉｎで送液した誘導体化試薬の溶液（０．５％ ２−シアノアセトアミドと０．２５Ｍ ＮａＯＨを１：１の割合でオンライン混合させた溶液）を三方ジョイントに通して混合させた後、この混合液を反応コイル（内径：０．５ｍｍ×長さ：１０ｍ）、冷却コイル（内径：０．２５ｍｍ×長さ：３ｍ）、蛍光検出器の順に通液させた。反応コイルは、１２５℃に加温して使用した。冷却コイルは、室温の蒸留水に浸して使用した。蛍光検出器は、励起波長を３４６ｎｍに、蛍光波長を４１０ｎｍに設定して使用した。

【0123】

溶離はリニアグラディエントにより行い、溶媒Ｂの混合比率を分析開始後から１０分後までの間に１％から４％に増加させ、１０分後から１１分後までの間に４％から１５％に増加させ、１１分後から２０分後までの間に１５％から２５％に増加させ、２０分後から２２分後までの間に２５％から５３％に増加させ、２２分後から２９分後までの間は５３％で維持させた。また、溶媒Ｃと溶媒Ｄは混合比率の変更を行わず、溶媒Ｃの混合比率は１２％、溶媒Ｄの混合比率は１７％で維持させた。

【0124】

（３）二糖組成の比率の算出
二糖組成の比率（以下「二糖組成比」という。）は、上記（１）で調製した試料を１０μＬアプライし、上記（２）に従った分析により得られるピークの面積から較正曲線を用いて各二糖のモル数を算出し、各二糖のモル数を全二糖のモル数を総和した値で除した値を百分率換算して算出した。較正曲線は、標準試料としてコンドロイチン硫酸由来の不飽和二糖（ΔＤｉ−０Ｓ（以下「０Ｓ」という。）、ΔＤｉ−６Ｓ（以下「６Ｓ」という。）、ΔＤｉ−４Ｓ（以下「４Ｓ」という。）、ΔＤｉ−２Ｓ（以下「２Ｓ」という。）、ΔＤｉ−ｄｉＳ_Ｄ（以下「ｄｉＳ_Ｄ」という。）、ΔＤｉ−ｄｉＳ_Ｅ（以下「ｄｉＳ_Ｅ」という。）、ΔＤｉ−ｔｒｉＳ（以下「ｔｒｉＳ」という。）、いずれも生化学工業社製）を用いて作成した。

【0125】

＜参考例７＞硫酸化コンドロイチンの硫酸化度の算出
硫酸化ＣＨの硫酸化度は、上記＜参考例６＞で算出した二糖組成比を下記の式３で示される数式に代入して算出した。

【0126】

【数3】

【0127】

上記の数式において、Ｓ_１は６Ｓ、４Ｓ、２Ｓの二糖組成比の合計を、Ｓ_２はｄｉＳ_Ｄ、ｄｉＳ_Ｅの二糖組成比の合計を、Ｓ_３はｔｒｉＳの二糖組成比をそれぞれ示す。

【0128】

＜参考例８＞硫酸化ヒアルロン酸の硫酸化度の測定
硫酸化ＨＡの硫酸化度は、硫酸化ＨＡを酸加水分解して得られる試料を測定対象としたキャピラリー電気泳動により測定した。具体的には、硫酸化ＨＡを酸加水分解して得られる試料に含まれるグルコサミン（ＧｌｃＮ）と硫酸イオンのモル濃度をキャピラリー電気泳動により測定し、硫酸イオンのモル濃度をＧｌｃＮのモル濃度で除した値を百分率換算して硫酸化度を算出した。硫酸化ＨＡの硫酸化度測定の手順を以下に示す。

【0129】

（１）グリコサミノグリカンの分解
硫酸化ＨＡに精製水を添加して１ｍｇ／ｍＬとなるように調製した溶液に対し、３倍容の６Ｎ ＨＣｌを添加した溶液を１１５℃で３時間静置して酸加水分解した。この溶液を遠心エバポレーターに供して乾固させた後、硫酸化ＨＡに添加した時と等量の精製水を添加して再溶解した。この溶液を遠心して不溶物を沈殿させた後、上清をＧｌｃＮと硫酸イオンのモル濃度測定用の試料として回収した。

【0130】

（２）キャピラリー電気泳動による分析
ＧｌｃＮと硫酸イオンのモル濃度の測定は、キャピラリーとしてＵｎｃｏａｔｅｄ ｆｕｓｅｄ ｓｉｌｉｃａ ｃａｐｉｌｌａｒｙ（内径：５０μｍ×長さ：１０４ｃｍ、アジレント社製）を用い、温度を２５℃に設定して行った。移動相にはＢａｓｉｃ Ａｎｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（アジレント社製）を用い、印加電圧を−３０ｋＶに設定した。検出は分光光度検出器で行い、測定波長を３５０ｎｍ、対照波長を２３０ｎｍに設定した。

【0131】

（３）硫酸化度の算出
硫酸化度は、上記（１）で調製した試料を１００ｍｂａｒで８秒間加圧してアプライし、上記（２）に従った分析により得られるピークの面積から較正曲線を用いてＧｌｃＮと硫酸イオンのモル濃度を算出し、硫酸イオンのモル濃度をＧｌｃＮのモル濃度で除した値を百分率換算して算出した。較正曲線は、標準試料としてＧａｌＮＡｃと硫酸ナトリウム（Ｎａ_２ＳＯ_４）を用い、上記（１）に従った酸加水分解等の処理に供した後の試料を用いて作成した。

【0132】

＜参考例９＞硫酸化グリコサミノグリカンの硫黄含量の算出
硫酸化ＧＡＧの硫黄含量は、硫酸化度を下記の式４で示される数式に代入して算出した。

【0133】

【数4】

【0134】

上記の数式において、０Ｓの分子量は３７９．３、ＳＯ_３の分子量は８０．１、硫黄の原子量は３２．１とした。

【0135】

＜参考例１０＞硫酸化ヒアルロン酸の組成分析
硫酸化ＨＡの組成分析は、硫酸化ＨＡを酵素で分解して得られる二糖の組成分析（二糖分析）により行った。硫酸化ＨＡの二糖分析の手順を以下に示す。

【0136】

（１）硫酸化ヒアルロン酸の分解
硫酸化ＨＡに精製水を添加して１０ｍｇ／ｍＬとなるように調製した溶液に対し、１／２容量の１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）と１／２容量のコンドロイチナーゼ溶液（コンドロイチナーゼＡＢＣ（生化学工業社製）に０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加して０．１Ｕ／μＬとなるように調製）を添加した溶液を３７℃で３時間静置した。この溶液を沸騰水中に１分間静置した後、４倍容の精製水を添加した溶液を遠心ろ過デバイス（マイクロコン−１０、ミリポア社製）にアプライし、遠心後のろ液を二糖分析用の試料として回収した。

【0137】

（２）ＨＰＬＣ分析
二糖分析は、カラムとしてＵＫ−Ａｍｉｎｏ（内径：４．６ｍｍ×長さ：１５０ｍｍ、センシュー科学社製）を用い、カラム温度を６０℃に設定して行った。溶離液には、溶媒Ａ（精製水）、溶媒Ｂ（０．８Ｍ ＮａＨ_２ＰＯ_４）をオンラインで混合した溶液を用い、流速は１ｍＬ／ｍｉｎとした。検出は分光光度検出器で行い、測定波長を２３２ｎｍに設定した。

【0138】

溶離はリニアグラディエントにより行い、溶媒Ｂの混合比率を分析開始後から２０分後までの間に２％から６５％に増加させた。

【0139】

（３）二糖組成比の比率の算出
二糖組成比は、上記（１）で調製した試料を１０μＬアプライし、上記（２）に従った分析により得られるピークの面積から較正曲線を用いて各二糖のモル数を算出し、各二糖のモル数を全二糖のモル数を総和した値で除した値を百分率換算して算出した。較正曲線は、標準試料として硫酸化ヒアルロン酸由来の不飽和二糖（ΔＤｉＨＡ−０Ｓ（以下「０Ｓ」という。）、ΔＤｉＨＡ−６Ｓ（以下「６Ｓ」という。）、ΔＤｉＨＡ−４Ｓ（以下「４Ｓ」という。）、ΔＤｉＨＡ−２Ｓ（以下「２Ｓ」という。））を用いて作成した。硫酸化ヒアルロン酸由来の不飽和二糖は、本発明の硫酸化方法により硫酸化したＨＡを上記（１）の方法により二糖に分解した後、陰イオン交換およびゲルろ過クロマトグラフィーを行って調製し、質量分析およびＮＭＲによって硫酸基の結合位置を同定したものを使用した。

【0140】

＜参考例１１＞硫酸化ヘパロサンの組成分析
硫酸化ヘパロサンの組成分析は、硫酸化ヘパロサンを酵素で分解して得られる二糖の組成分析（二糖分析）により行った。二糖の検出は、ＨＰＬＣポストカラム誘導体化法により行った。硫酸化ヘパロサンの二糖分析の手順を以下に示す。

【0141】

（１）硫酸化ヘパロサンの分解
硫酸化ヘパロサンに精製水を添加して１０ｍｇ／ｍＬとなるように調製した溶液に対し、１／２容量の２０ｍＭ酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ７．０）／２ｍＭ酢酸カルシウムと１／２容量のＥＭII溶液（３ｍＵ／μＬ ヘパリチナーゼＩ、２ｍＵ／μＬ ヘパリチナーゼＩＩ、５ｍＵ／μＬ ヘパリナーゼ（いずれも生化学工業社製）となるように０．１％ＢＳＡを添加して調製）を添加した溶液を３７℃で３時間静置した。この溶液を沸騰水中に１分間静置した後、４倍容の精製水を添加した溶液を遠心ろ過デバイス（マイクロコン−１０、ミリポア社製）にアプライし、遠心後のろ液を二糖分析用の試料として回収した。

【0142】

（２）ＨＰＬＣポストカラム誘導体化法による分析
二糖分析は、＜参考例６＞の「（２）ＨＰＬＣポストカラム誘導体化法による分析」に記載の方法と同じ条件により行った。

【0143】

（３）二糖組成比の比率の算出
二糖組成比は、上記（１）で調製した試料を１０μＬアプライし、上記（２）に従った分析により得られるピークの面積から較正曲線を用いて各二糖のモル数を算出し、各二糖のモル数を全二糖のモル数を総和した値で除した値を百分率換算して算出した。較正曲線は、標準試料としてヘパリンまたはヘパラン硫酸由来の不飽和二糖（ΔＤｉＨＳ−０Ｓ（以下「０Ｓ」という。）、ΔＤｉＨＳ−ＮＳ（以下「ＮＳ」という。）、ΔＤｉＨＳ−６Ｓ（以下「６Ｓ」という。）、ΔＤｉＨＳ−ｄｉＳ_１（以下「ｄｉＳ_１」という。）、ΔＤｉＨＳ−ｄｉＳ_２（以下「ｄｉＳ_２」という。）、ΔＤｉＨＳ−ｔｒｉＳ（以下「ｔｒｉＳ」という。）、いずれも生化学工業社製）を用いて作成した。

【0144】

＜参考例１２＞アルキル化された硫酸化コンドロイチンの硫黄含量の算出
アルキル化された硫酸化ＣＨの硫黄含量は、当該硫酸化ＣＨを酸加水分解して得られる試料を測定対象としたキャピラリー電気泳動により測定した。具体的には、アルキル化された硫酸化ＣＨを酸加水分解して得られる試料に含まれる硫酸イオンのモル濃度をキャピラリー電気泳動により測定した後、下記の式５で示される数式により硫黄含量を算出した。

【数5】

【0145】

上記の式において、硫黄の原子量は３２．１、硫酸イオンの分子量は９６．１とした。また、上記の式において、ＧＡＧの濃度は、アルキル化された硫酸化ＣＨの乾燥重量を試料溶液の液量で除した値である。

【0146】

上記の方法において、酸加水分解とキャピラリー電気泳動による測定は、＜参考例８＞に記載の方法と同じ条件により行った。

【0147】

＜参考例１３＞硫酸化ヘパロサンの硫酸化度の算出
硫酸化ＨＰＮの硫酸化度は、上記＜参考例１１＞で算出した二糖組成比を下記の式６で示される数式に代入して算出した。

【0148】

【数6】

【0149】

上記の数式において、Ｓ_１はＮＳ、６Ｓ、２Ｓの二糖組成比の合計を、Ｓ_２はｄｉＳ_１、ｄｉＳ_２、ｄｉＳ_３の二糖組成比の合計を、Ｓ_３はｔｒｉＳの二糖組成比をそれぞれ示す。

【0150】

＜実施例１＞強塩基のモル濃度の検討（１）
ＣＨ（３５．８ｋＤａ）にＮａ_２ＳＯ_４と０．１Ｍ〜４ＭのＮａＯＨ水溶液を添加し、ＣＨが１００ｍｇ／ｍＬ（１０％ ｗ／ｖ）、Ｎａ_２ＳＯ_４が５００ｍｇ／ｍＬとなるように溶液を調製した。これらの溶液を４０℃に加温し、２．９当量（重量濃度（ｗ／ｖ）でＣＨと同じ濃度となる量）の三酸化硫黄トリメチルアミン錯体（ＴＭＡ−ＳＯ_３）（シグマアルドリッチ社製）を添加した後、スターラーで１時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に３倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を２日間行った。この溶液にＮａＯＨ水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。このようにして得た硫酸化ＣＨを二糖分析し、硫酸化度を算出した。結果を表１及び図１に示す。

【0151】

【表1】

【0152】

本発明の硫酸化方法により得られた硫酸化ＣＨは、いずれもＣＨ−ｄｉＳ_Ｂの二糖組成比が０．１％未満であったため表への記載を省略している。以後の実施例においてもＣＨ−ｄｉＳ_Ｂの表への記載を省略する。

【0153】

表１に示した通り、強塩基性の溶液中でＧＡＧと硫酸化剤を共存させることにより、ＧＡＧの硫酸化が可能であることをＣＨを用いて確認した。また、強塩基のモル濃度を適宜設定することにより、所望の硫酸化度からなる硫酸化ＧＡＧを得られることを確認した。

【0154】

＜実施例２＞強塩基のモル濃度の検討（２）
ＨＡ（８００ｋＤａ）にＮａ_２ＳＯ_４と０．５Ｍ〜４ＭのＮａＯＨ水溶液を添加し、ＨＡが１０ｍｇ／ｍＬ（１％ ｗ／ｖ）、Ｎａ_２ＳＯ_４が１００ｍｇ／ｍＬとなるように溶液を調製した。これらの溶液を４０℃に加温し、５８当量（重量濃度（ｗ／ｖ）でＨＡの２０倍の濃度となる量）のＴＭＡ−ＳＯ_３を添加した後、スターラーで３時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に等量の精製水を添加した後、精製水に対して透析を一晩行った。この溶液にＮａＯＨ水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。このようにして得た硫酸化ＨＡの硫酸化度を測定し、硫黄含量を算出した。結果を表２に示す。

【0155】

【表2】

【0156】

表２に示した通り、ＧＡＧとしてＨＡを用いた場合においても、ＧＡＧの硫酸化が可能であることを確認した。

【0157】

＜実施例３＞強塩基のモル濃度の検討（３）
ＣＨ（３５．８ｋＤａ）にＮａ_２ＳＯ_４と０．０５Ｍ〜２ＭのＮａＯＨ水溶液を添加し、ＣＨが１００ｍｇ／ｍＬ（１０％ ｗ／ｖ）、Ｎａ_２ＳＯ_４が５００ｍｇ／ｍＬとなるように溶液を調製した。これらの溶液を４０℃に加温し、２．９当量のＴＭＡ−ＳＯ_３を添加した後、スターラーで５分間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に３倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を２日間行った。この溶液にＮａＯＨ水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。このようにして得た硫酸化ＣＨを二糖分析し、硫酸化度を算出した。結果を表３に示す。

【0158】

【表3】

【0159】

表３に示したｐＨは、反応終了時（硫酸化剤を添加してから５分後）に測定した硫酸化反応溶液のｐＨである。表３に示したとおり、ｐＨ１１．５以上の溶液中でＧＡＧと硫酸化剤を共存させることにより、ＧＡＧの硫酸化が可能であることを確認した。

【0160】

＜実施例４＞反応温度の検討
ＣＨ（４１．８ｋＤａ）にＮａ_２ＳＯ_４と２ＭのＮａＯＨ水溶液を添加し、ＣＨが２００ｍｇ／ｍＬ（２０％ ｗ／ｖ）、Ｎａ_２ＳＯ_４が５００ｍｇ／ｍＬとなるように溶液を調製した。この溶液を０〜６０℃に加温または冷却し、２．９当量のＴＭＡ−ＳＯ_３を添加した後、スターラーで１時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に３倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を２日間行った。この溶液にＮａＯＨ水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。このようにして得た硫酸化ＣＨを二糖分析し、硫酸化度を算出した。また、硫酸化ＣＨの分子量を測定した。結果を表４に示す。

【0161】

【表4】

【0162】

表４に示した通り、任意の反応温度においてＧＡＧの硫酸化が可能であることを確認した。また、反応温度を適宜設定することにより、所望の硫酸化度からなる硫酸化ＧＡＧを得られることを確認した。また、ＣＨを硫酸化して得られる硫酸化ＣＨは、一態様において、二糖組成比においてＣＨ−６Ｓを最も多く有することを特徴としたＧＡＧであり、このような特徴はコンドロイチン硫酸Ｃ（ＣＳＣ）と共通する特徴である。よって、本発明によればＣＳＣ様多糖の調製が可能であることも分かった。

【0163】

＜実施例５＞グリコサミノグリカンの濃度の検討（１）
ＣＨ（３０．２ｋＤａ）にＮａ_２ＳＯ_４と２ＭのＮａＯＨ水溶液を添加し、ＣＨが１０〜６６．７ｍｇ／ｍＬ（１〜６．６７％ ｗ／ｖ）、Ｎａ_２ＳＯ_４が５００ｍｇ／ｍＬとなるように溶液を調製した。これらの溶液を４０℃に加温し、２．９当量のＴＭＡ−ＳＯ_３を添加した後、スターラーで１時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に３倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を２日間行った。この溶液にＮａＯＨ水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。このようにして得た硫酸化ＣＨを二糖分析し、硫酸化度を算出した。また、硫酸化ＣＨの分子量を測定した。結果を表５に示す。

【0164】

【表5】

【0165】

表５に示した通り、任意のＧＡＧの濃度においてＧＡＧの硫酸化が可能であることをＣＨを用いて確認した。また、ＧＡＧの濃度を適宜設定することにより、所望の硫酸化度からなる硫酸化ＧＡＧを得られることを確認した。

【0166】

＜実施例６＞グリコサミノグリカンの濃度の検討（２）
精製水に溶解したＨＡ（２．７ＭＤａ）にＮａ_２ＳＯ_４と２ＭのＮａＯＨ水溶液を添加し、終濃度で１〜１０ｍｇ／ｍＬ（０．１〜１％ ｗ／ｖ）ＨＡ、８０ｍｇ／ｍＬ Ｎａ_２ＳＯ_４、１Ｍ ＮａＯＨとなるように溶液を調製した。これらの溶液を４℃に冷却し、５８当量のＴＭＡ−ＳＯ_３を添加した後、スターラーで１８時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に２倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を２日間行った。この溶液にＮａＯＨ水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。このようにして得た硫酸化ＨＡの硫酸化度を測定し、硫黄含量を算出した。また、硫酸化ＨＡの分子量を測定した。結果を表６に示す。

【0167】

【表6】

【0168】

表６に示した通り、ＧＡＧとしてＨＡを用いた場合においても、任意のＧＡＧの濃度においてＧＡＧの硫酸化が可能であることを確認した。また、本発明の硫酸化方法により調製される硫酸化ＨＡは、一態様において、硫酸化反応後においても２ＭＤａ以上の分子量を有するＧＡＧであることを確認した。

【0169】

＜実施例７＞反応時間の検討（１）
ＣＨ（４１．８ｋＤａ）にＮａ_２ＳＯ_４と２ＭのＮａＯＨ水溶液を添加し、ＣＨが２００ｍｇ／ｍＬ（２０％ ｗ／ｖ）、Ｎａ_２ＳＯ_４が５００ｍｇ／ｍＬとなるように溶液を調製した。この溶液を４０℃に加温し、２．９当量のＴＭＡ−ＳＯ_３を添加した後、スターラーで１時間〜９時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に３倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を２日間行った。この溶液にＮａＯＨ水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。このようにして得た硫酸化ＣＨを二糖分析し、硫酸化度を算出した。また、硫酸化ＣＨの分子量を測定した。結果を表７に示す。

【0170】

【表7】

【0171】

表７に示した通り、任意の反応時間においてＧＡＧの硫酸化が可能であることをＣＨを用いて確認した。

【0172】

＜実施例８＞反応時間の検討（２）
精製水に溶解したＨＡ（２．７ＭＤａ）にＮａ_２ＳＯ_４と２ＭのＮａＯＨ水溶液を添加し、終濃度で１ｍｇ／ｍＬ（０．１％ ｗ／ｖ）ＨＡ、８０ｍｇ／ｍＬ Ｎａ_２ＳＯ_４、１Ｍ ＮａＯＨとなるように溶液を調製した。この溶液を４℃に冷却し、５８当量のＴＭＡ−ＳＯ_３を添加した後、スターラーで１日間〜７日間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に２倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を２日間行った。この溶液にＮａＯＨ水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。このようにして得た硫酸化ＨＡの硫酸化度を測定し、硫黄含量を算出した。結果を表８に示す。

【0173】

【表8】

【0174】

表８に示した通り、ＧＡＧとしてＨＡを用いた場合においても、任意の反応時間においてＧＡＧの硫酸化が可能であることを確認した。

【0175】

＜実施例９＞硫酸化剤の添加量の検討（１）
ＣＨ（４１．８ｋＤａ）にＮａ_２ＳＯ_４と２ＭのＮａＯＨ水溶液を添加し、ＣＨが２００ｍｇ／ｍＬ（２０％ ｗ／ｖ）、Ｎａ_２ＳＯ_４が５００ｍｇ／ｍＬとなるように溶液を調製した。この溶液を４０℃に加温し、０．３〜２．９当量のＴＭＡ−ＳＯ_３を添加した後、スターラーで２０時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に１．５倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を２日間行った。この溶液にＮａＯＨ水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。このようにして得た硫酸化ＣＨを二糖分析し、硫酸化度を算出した。結果を表９に示す。

【0176】

【表9】

【0177】

表９に示した通り、任意の量の硫酸化剤を添加することによりＧＡＧの硫酸化が可能であることをＣＨを用いて確認した。また、硫酸化剤の添加量を適宜設定することにより、所望の硫酸化度からなる硫酸化ＧＡＧを得られることを確認した。

【0178】

＜実施例１０＞硫酸化剤の添加量の検討（２）
精製水に溶解したＨＡ（２．７ＭＤａ）にＮａ_２ＳＯ_４と２ＭのＮａＯＨ水溶液を添加し、終濃度で１ｍｇ／ｍＬ（０．１％ ｗ／ｖ）ＨＡ、８０ｍｇ／ｍＬ Ｎａ_２ＳＯ_４、１Ｍ ＮａＯＨとなるように溶液を調製した。この溶液を４℃に冷却し、２９〜１１６モル当量のＴＭＡ−ＳＯ_３を添加した後、スターラーで１８時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に２倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を２日間行った。この溶液にＮａＯＨ水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。このようにして得た硫酸化ＨＡの硫酸化度を測定し、硫黄含量を算出した。結果を表１０に示す。

【0179】

【表10】

【0180】

表１０に示した通り、ＧＡＧとしてＨＡを用いた場合においても、任意の量の硫酸化剤を添加することによりＧＡＧの硫酸化が可能であることを確認した。

【0181】

＜実施例１１＞強塩基の種類の検討
ＨＡ（８００ｋＤａ）にＮａ_２ＳＯ_４と１Ｍの強塩基性水溶液（ＮａＯＨ水溶液、ＫＯＨ水溶液、またはＬｉＯＨ水溶液）を添加し、終濃度で１ｍｇ／ｍＬ（０．１％ｗ／ｖ）ＨＡ、１００ｍｇ／ｍＬ Ｎａ_２ＳＯ_４となるように溶液を調製した。これらの溶液を４℃に冷却し、５８当量のＴＭＡ−ＳＯ_３を添加した後、スターラーで１８時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に２倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を２日間行った。この溶液にＮａＯＨ水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。このようにして得た硫酸化ＨＡの硫酸化度を測定し、硫黄含量を算出した。結果を表１１に示す。

【0182】

【表11】

【0183】

表１１に示した通り、強塩基性の溶液としてＫＯＨ水溶液やＬｉＯＨ水溶液を用いた場合においても、ＧＡＧの硫酸化が可能であることを確認した。

【0184】

＜実施例１２＞硫酸化剤の種類の検討（１）
ＣＨ（４１．８ｋＤａ）にＮａ_２ＳＯ_４と２ＭのＮａＯＨ水溶液を添加し、ＣＨが２００ｍｇ／ｍＬ（２０％ ｗ／ｖ）、Ｎａ_２ＳＯ_４が５００ｍｇ／ｍＬとなるように溶液を調製した。この溶液を４０℃に加温し、２．９当量の三酸化硫黄ピリジン錯体（Ｐｙｒ−ＳＯ_３、東京化成工業社製）を添加した後、スターラーで１時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に３倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を２日間行った。この溶液にＮａＯＨ水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。このようにして得た硫酸化ＣＨを二糖分析し、硫酸化度を算出した。結果を表１２に示す。

【0185】

【表12】

【0186】

表１２に示した通り、硫酸化剤としてＰｙｒ−ＳＯ_３を用いた場合においても、ＧＡＧの硫酸化が可能であることを確認した。

【0187】

＜実施例１３＞硫酸化剤の種類の検討（２）
ＣＨ（４１．８ｋＤａ）に２ＭのＮａＯＨ水溶液を添加し、ＣＨが１００ｍｇ／ｍＬ（１０％ ｗ／ｖ）となるように溶液を調製した。この溶液を４０℃に加温し、２．９当量の三酸化硫黄ジメチルエチルアミン錯体（ＤＭＥＡ−ＳＯ_３）（ジメチルエチルアミン１００ｍＬとクロロホルム１００ｍＬの混合溶媒にクロロスルホン酸１０ｍＬとクロロホルム２０ｍＬの混合溶媒を氷冷下で添加して調製）を添加した後、スターラーで１時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に３倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を２日間行った。この溶液にＮａＯＨ水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。このようにして得た硫酸化ＣＨを二糖分析し、硫酸化度を算出した。結果を表１３に示す。

【0188】

【表13】

【0189】

表１３に示した通り、硫酸化剤としてＤＭＥＡ−ＳＯ_３を用いた場合においても、ＧＡＧの硫酸化が可能であることを確認した。

【0190】

＜実施例１４＞強塩基のモル濃度の検討（４）
ＨＡ（８００ｋＤａ）にＮａ_２ＳＯ_４と２Ｍまたは３ＭのＮａＯＨ水溶液を添加し、ＨＡが１０ｍｇ／ｍＬ（１％ ｗ／ｖ）、Ｎａ_２ＳＯ_４が８０ｍｇ／ｍＬとなるように溶液を調製した。これらの溶液を４℃に冷却し、５８当量のＴＭＡ−ＳＯ_３を添加した後、スターラーで１８時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に２倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を一晩行った。この溶液にＮａＯＨ水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。このようにして得た硫酸化ＨＡの硫酸化度を測定し、硫黄含量を算出した。結果を表１４に示す。

【表14】

【0191】

表１４に示した通り、反応温度を４℃とした場合のＮａＯＨ濃度は、１Ｍ（反応温度を４０℃とした場合において最も高い硫酸化反応効率を示した濃度。表２参照）よりも２Ｍや３Ｍにおいて高い硫酸化反応効率を示した。

【0192】

＜実施例１５＞硫酸ナトリウムの添加量の検討
ＣＨ（４１．８ｋＤａ）にＮａ_２ＳＯ_４と２ＭのＮａＯＨ水溶液を添加し、ＣＨが２００ｍｇ／ｍＬ（２０％ ｗ／ｖ）、Ｎａ_２ＳＯ_４が２００〜６００ｍｇ／ｍＬとなるように溶液を調製した。また、ＣＨに２ＭのＮａＯＨ水溶液のみを添加し、Ｎａ_２ＳＯ_４を含まない溶液も調製した。これらの溶液を４０℃に加温し、２．９当量のＴＭＡ−ＳＯ_３を添加した後、スターラーで１時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に３倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を２日間行った。この溶液にＮａＯＨ水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。このようにして得た硫酸化ＣＨを二糖分析し、硫酸化度を算出した。また、硫酸化ＣＨの分子量を測定した。結果を表１５に示す。

【0193】

【表15】

【0194】

表１５に示した通り、硫酸ナトリウムの添加量によらず、ＧＡＧの硫酸化が可能であることを確認した。また、硫酸化反応に伴う分子量の低下を抑制するためには、硫酸ナトリウムなどの硫酸塩を共存させない態様が好ましいことを確認した。

【0195】

＜実施例１６＞硫酸基を有するＧＡＧの硫酸化の検討（１）
コンドロイチン硫酸Ａ（ＣＳＡ）（２０．１ｋＤａ）に２ＭのＮａＯＨ水溶液を添加し、ＣＳＡが２００ｍｇ／ｍＬ（２０％ ｗ／ｖ）となるように溶液を調製した。この溶液を４０℃に加温し、２．９当量のＴＭＡ−ＳＯ_３を添加した後、スターラーで１時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に３倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を２日間行った。この溶液にＮａＯＨ水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。このようにして得た硫酸化ＣＳを二糖分析し、硫酸化度を算出した。結果を表１６に示す。

【0196】

【表16】

【0197】

表１６に示した通り、強塩基性の溶液中で硫酸基を有するＧＡＧと硫酸化剤を共存させることにより、硫酸基を有するＧＡＧを硫酸化してさらに硫酸化度を増加させることが可能であることをＣＳＡを用いて確認した。また、ＣＳＡを硫酸化して得られる硫酸化ＣＳＡは、一態様において、二糖組成比においてＣＨ−ｄｉＳ_Ｅを最も多く有することを特徴としたＧＡＧであり、このような特徴はコンドロイチン硫酸Ｅ（ＣＳＥ）と共通する特徴である。よって、本発明によればＣＳＥ様多糖の調製が可能であることも分かった。

【0198】

＜実施例１７＞硫酸基を有するＧＡＧの硫酸化の検討（２）
コンドロイチン硫酸Ｃ（ＣＳＣ）（１４．８ｋＤａ）に２ＭのＮａＯＨ水溶液を添加し、ＣＳＣが２００ｍｇ／ｍＬ（２０％ ｗ／ｖ）となるように溶液を調製した。この溶液を４０℃に加温し、２．９当量のＴＭＡ−ＳＯ_３を添加した後、スターラーで１時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に３倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を２日間行った。この溶液にＮａＯＨ水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。このようにして得た硫酸化ＣＳを二糖分析し、硫酸化度を算出した。結果を表１７に示す。

【0199】

【表17】

【0200】

表１７に示した通り、強塩基性の溶液中で硫酸基を有するＧＡＧと硫酸化剤を共存させることにより、硫酸基を有するＧＡＧを硫酸化してさらに硫酸化度を増加させることが可能であることをＣＳＣを用いて確認した。また、ＣＳＣを硫酸化して得られる硫酸化ＣＳＣは、一態様において、二糖組成比においてＣＨ−ｄｉＳ_Ｄを２０％以上の割合で有することを特徴としたＧＡＧであり、このような特徴はコンドロイチン硫酸Ｄ（ＣＳＤ）と共通する特徴である。よって、本発明によればＣＳＤ様多糖の調製が可能であることも分かった。

【0201】

＜実施例１８＞混合溶媒を用いた硫酸化の検討（１）
ｄＣＨ（８．２ｋＤａ）に５％（ｖ／ｖ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を含む２ＭのＮａＯＨの溶液を添加し、ＣＨが１００ｍｇ／ｍＬ（１０％ ｗ／ｖ）となるように溶液を調製した。この溶液を４０℃に加温し、２．９当量のＴＭＡ−ＳＯ_３を添加した後、スターラーで１時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に３倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を２日間行った。この溶液にＮａＯＨ水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。このようにして得た硫酸化ＣＨを二糖分析し、硫酸化度を算出した。結果を表１８に示す。

【0202】

【表18】

【0203】

表１８に示した通り、有機溶媒を含む混合溶媒を用いた場合においても、ＧＡＧの硫酸化が可能であることをＤＭＦを用いて確認した。

【0204】

＜実施例１９＞混合溶媒を用いた硫酸化の検討（２）
ｄＣＨ（８．２ｋＤａ）に５％（ｖ／ｖ）の有機溶媒（ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ホルムアミド（ＦＡ）、ピリジン（Ｐｙｒ）、アセトニトリル（ＭｅＣＮ）、エタノール（ＥｔＯＨ）、またはテトラヒドロフラン（ＴＨＦ））を含む２ＭのＮａＯＨの溶液を添加し、ｄＣＨが１００ｍｇ／ｍＬ（１０％ ｗ／ｖ）となるように溶液を調製した。これらの溶液を４０℃に加温し、２．９当量のＴＭＡ−ＳＯ_３を添加した後、スターラーで３時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に３倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を２日間行った。この溶液にＮａＯＨ水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。このようにして得た硫酸化ＣＨを二糖分析し、硫酸化度を算出した。結果を表１９に示す。

【0205】

【表19】

【0206】

表１９に示した通り、ＤＭＦ以外の有機溶媒を含む混合溶媒を用いた場合においても、ＧＡＧの硫酸化が可能であることを確認した。

【0207】

＜実施例２０＞混合溶媒を用いた硫酸化の検討（３）
ｄＣＨ（８．２ｋＤａ）に１０〜４０％（ｖ／ｖ）の有機溶媒（ＤＭＳＯまたはＥｔＯＨ）を含む２ＭのＮａＯＨの溶液を添加し、ｄＣＨが１００ｍｇ／ｍＬ（１０％ ｗ／ｖ）となるように溶液を調製した。これらの溶液を４０℃に加温し、２．９当量のＴＭＡ−ＳＯ_３を添加した後、スターラーで３時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に３倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を２日間行った。この溶液にＮａＯＨ水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。このようにして得た硫酸化ＣＨを二糖分析し、硫酸化度を算出した。結果を表２０に示す。

【0208】

【表20】

【0209】

表２０に示した通り、有機溶媒を含む混合溶媒を用いた場合においても、ＧＡＧの硫酸化が可能であることを確認した。また、有機溶媒の濃度を適宜設定することにより、所望の硫酸化度からなる硫酸化ＧＡＧを得られることを確認した。また、有機溶媒としてＤＭＳＯを含む混合溶媒を用いた場合には、ＤＭＳＯを有機溶媒として含まない溶液を用いた場合と比較して、得られる硫酸化グリコサミノグリカンの硫酸化度が増加する傾向が認められた。具体的には、この傾向は１０％〜３０％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯを含む混合溶媒を用いた場合において認められた。さらに、３０％（ｖ／ｖ）程度のＤＭＳＯを含む混合溶媒を用いた場合に、得られる硫酸化グリコサミノグリカンの硫酸化度が最も高くなることが分かった。よって、本発明の硫酸化方法においては有機溶媒としてＤＭＳＯを含む態様を好ましく例示できることが分かった。

【0210】

＜実施例２１＞従来の硫酸化方法との比較（１）
（１）強塩基性の溶液を用いた硫酸化
ＣＨにＮａ_２ＳＯ_４と２ＭのＮａＯＨ水溶液を添加し、ＣＨが６６．７ｍｇ／ｍＬ（６．６７％ ｗ／ｖ）、Ｎａ_２ＳＯ_４が５００ｍｇ／ｍＬとなるように溶液を調製した。この溶液を４０℃に加温し、２．９当量のＴＭＡ−ＳＯ_３を添加した後、スターラーで１時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に３倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を２日間行った。この溶液にＮａＯＨ水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。

【0211】

（２）有機溶媒中での硫酸化
ＣＨにホルムアミド（ＦＡ）を添加し、ＣＨが２００ｍｇ／ｍＬ（２０％ ｗ／ｖ）となるように溶液を調製した。この溶液に５当量の三酸化硫黄トリエチルアミン錯体（ＴＥＡ−ＳＯ_３）を添加した後、スターラーで２時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に３倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を２日間行った。この溶液にＮａＯＨ水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。

【0212】

上記（１）と（２）で得た硫酸化ＣＨを二糖分析し、硫酸化度を算出した。結果を表２１に示す。

【0213】

【表21】

【0214】

表２１に示した通り、本発明（強塩基性の溶液を用いた硫酸化）によって得られる硫酸化ＣＨは、従来技術（有機溶媒中での硫酸化）によって得られる硫酸化ＣＨに比して、二糖組成比においてＣＨ−２Ｓを多く含むことを特徴としたＧＡＧであることを確認した。

【0215】

＜実施例２２＞従来の硫酸化方法との比較（２）
（１）強塩基性の溶液を用いた硫酸化
ＣＨに２ＭのＮａＯＨ水溶液を添加し、ＣＨが２００ｍｇ／ｍＬ（２０％ ｗ／ｖ）となるように溶液を調製した。この溶液を４０℃に加温し、２．９当量のＴＭＡ−ＳＯ_３を添加した後、スターラーで１時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に３倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を２日間行った。この溶液にＮａＯＨ水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。

【0216】

（２）有機溶媒中での硫酸化
ＣＨにホルムアミド（ＦＡ）を添加し、ＣＨが２００ｍｇ／ｍＬ（２０％ ｗ／ｖ）となるように溶液を調製した。この溶液を４０℃に加温し、５当量のＴＥＡ−ＳＯ_３を添加した後、スターラーで２時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に３倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を２日間行った。この溶液にＮａＯＨ水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。

【0217】

上記（１）と（２）で得た硫酸化ＣＨを二糖分析し、硫酸化度を算出した。結果を表２２に示す。

【0218】

【表22】

【0219】

表２２に示した通り、本発明（強塩基性の溶液を用いた硫酸化）によって得られる硫酸化ＣＨは、従来技術（有機溶媒中での硫酸化）によって得られる硫酸化ＣＨに比して、二糖組成比においてＣＨ−２Ｓを多く含むことを特徴としたＧＡＧであることを改めて確認した。

【0220】

＜実施例２３＞従来の硫酸化方法との比較（３）
（１）強塩基性の溶液を用いた硫酸化
精製水に溶解したＨＡにＮａ_２ＳＯ_４と２ＭのＮａＯＨ水溶液を添加し、終濃度で１ｍｇ／ｍＬ（０．１％ ｗ／ｖ）ＨＡ、８０ｍｇ／ｍＬ Ｎａ_２ＳＯ_４、１Ｍ ＮａＯＨとなるように溶液を調製した。この溶液を４℃に冷却し、５８当量のＴＭＡ−ＳＯ_３を添加した後、スターラーで１８時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に２倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を２日間行った。この溶液にＮａＯＨ水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。

【0221】

（２）有機溶媒中での硫酸化
ＨＡのトリブチルアミン（ＴＢＡ）塩にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を添加し、ＨＡが１０ｍｇ／ｍＬ（１％ ｗ／ｖ）となるように溶液を調製した。この溶液を６０℃に加温し、１２当量のＴＭＡ−ＳＯ_３を添加した後、スターラーで４８時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に２．５倍容のアセトンを添加して３０分間撹拌した後、３時間静置した。この溶液から沈殿物を回収してＨＡが８ｍｇ／ｍＬ（０．８％ ｗ／ｖ）となるように精製水に溶解した後、精製水に対して透析を２日間行った。この溶液にＮａＯＨ水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。

【0222】

上記（１）と（２）で得た硫酸化ＨＡを二糖分析した。結果を表２３に示す。

【0223】

【表23】

【0224】

表２３に示した通り、従来技術（有機溶媒中での硫酸化）によって得られる硫酸化ＨＡが二糖組成比においてＨＡ−６Ｓを多く含み、ＨＡ−４ＳやＨＡ−２Ｓを実質的に含まないことを特徴とするＧＡＧであるのに対し、本発明（強塩基性の溶液を用いた硫酸化）によって得られる硫酸化ＨＡはＨＡ−４ＳやＨＡ−２Ｓを含むことを特徴とするＧＡＧであることを確認した。

【0225】

＜実施例２４＞ヘパロサンの脱アセチル化と硫酸化のワンポット反応
ＮＡＨ（３３．１ｋＤａ）に２ＭのＮａＯＨ水溶液を添加し、ＮＡＨが４０ｍｇ／ｍＬ（４％ ｗ／ｖ）となるように溶液を調製した。この溶液を６０℃に加温し、スターラーで４時間撹拌して脱アセチル化反応を行った。温度を４０℃に変更し、７当量または１２当量のＴＭＡ−ＳＯ_３を添加した後、スターラーで２０時間撹拌して硫酸化反応を行った。この溶液にＨＣｌを添加して中和した後、精製水に対して透析を２日間行った。この溶液にＮａＯＨ水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。このようにして得た硫酸化ヘパロサンを前記＜参考例１１＞の方法に従って二糖分析した。結果を表２４に示す。

【0226】

【表24】

【0227】

表２４に示した通り、強塩基性の溶液中でＧＡＧと硫酸化剤を共存させることにより、ＧＡＧの硫酸化が可能であることをＮＡＨを用いて確認した。また、強塩基性の溶液中でＧＡＧの脱アセチル化と硫酸化をワンポット合成により行うことが可能であることを確認した。

【0228】

＜実施例２５＞コンドロイチンのアルキル化と硫酸化のワンポット反応
（１）メチル化された硫酸化コンドロイチンの調製
ＣＨに２ＭのＮａＯＨ水溶液を添加し、ＣＨが１００ｍｇ／ｍＬ（１０％ ｗ／ｖ）となるように溶液を調製した。この溶液を４０℃に加温し、０．５倍容のヨードメタン（ＣＨ_３Ｉ）を添加した後、スターラーで２時間撹拌してメチル化反応を行い、一部をメチル基の導入率（メチル化度）の測定用試料として分取した。その後、この溶液に２．９当量のＴＭＡ−ＳＯ_３を添加し、室温においてスターラーで２時間撹拌して硫酸化反応を行った。メチル化度の測定用試料と反応停止後の溶液それぞれに３倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を２日間行った。この溶液にＮａＯＨ水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。このようにして得たメチル化されたコンドロイチン（硫酸化反応に供する前のコンドロイチン）とメチル化された硫酸化コンドロイチンを以下の分析に供した。

【0229】

（２）メチル化度の測定
メチル化度の測定は、^１Ｈ−ＮＭＲにより行った。上記（１）で得たメチル化されたコンドロイチン５ｍｇに０．０１％の３−（トリメチルシリル）プロピオン酸ナトリウム−２，２，３，３−ｄ_４（ＴＳＰ）を含有する重水を添加して調製した溶液を^１Ｈ−ＮＭＲに供し、ＣＨに導入したメチル基由来のシグナル（２．９ｐｐｍ、３．１ｐｐｍ、３．２ｐｐｍ、３．４ｐｐｍ、３．５ｐｐｍ）の積分比をＧａｌＮＡｃ残基のアセチル基由来のシグナル（２．０ｐｐｍ）の積分比で除した値を百分率換算してメチル化度を算出した。その結果、メチル化されたコンドロイチンのメチル化度は５８％であった。

【0230】

（３）硫黄含量の測定
硫黄含量の測定は、＜参考例１２＞に記載の方法により行った。その結果、上記（１）で得たメチル化された硫酸化コンドロイチンの硫黄含量は３．８％であった。

【0231】

以上の結果より、強塩基性の溶液中でＧＡＧのアルキル化と硫酸化をワンポット合成により行うことが可能であることを確認した。

【0232】

＜実施例２６＞従来の硫酸化方法との比較（４）
ＣＨ（５．０ｋＤａ、２８．０ｋＤａ、３０．２ｋＤａ、３２．０ｋＤａ、３５．８ｋＤａ、または４１．８ｋＤａ）に溶媒を添加し、ＣＨが１０〜２００ｍｇ／ｍＬ（１〜２０％ ｗ／ｖ）となるように溶液を調製した。これらの溶液を０〜６０℃に加温または冷却し、０．９〜１０当量の硫酸化剤（ＴＭＡ−ＳＯ_３、ＴＥＡ−ＳＯ_３、Ｐｙｒ−ＳＯ_３、または三酸化硫黄Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド錯体（ＤＭＦ−ＳＯ_３））を添加した後、スターラーで０．５〜２０時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に３倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を２日間行った。この溶液にＮａＯＨ水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。

【0233】

上記の反応条件において、本発明の硫酸化方法（強塩基性の溶液を用いた硫酸化）を行う場合には、溶媒として０．１〜２ＭのＮａＯＨ水溶液を用いた。また、上記の反応条件において、従来の硫酸化方法（有機溶媒中での硫酸化）を行う場合には、溶媒としてホルムアミド（ＦＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、またはＮ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）を用いた。

【0234】

上記に従って得られた硫酸化ＣＨを二糖分析し、ＣＨ−４Ｓに対するＣＨ−２Ｓの割合（２Ｓ／４Ｓ比）、およびＣＨ−６Ｓに対するＣＨ−２Ｓの割合（２Ｓ／６Ｓ比）を算出した。本発明の硫酸化方法により得られた硫酸化ＣＨ（２９検体）を二糖分析した結果を表２５に、従来の硫酸化方法により得られた硫酸化ＣＨ（２６検体）を二糖分析した結果を表２６に、それぞれ示す。また、動物から抽出して得られるＣＳを二糖分析した結果を表２７に示す。表２７において、コンドロイチン硫酸Ａ（ＣＳＡ）はチョウザメの脊索から、コンドロイチン硫酸Ｂ（ＣＳＢ）はブタの皮膚から、コンドロイチン硫酸Ｃ（ＣＳＣ）とコンドロイチン硫酸Ｄ（ＣＳＤ）はサメの軟骨から、コンドロイチン硫酸Ｅ（ＣＳＥ）はイカの軟骨から、それぞれ抽出して得られたＣＳである。

【0235】

【表25】

【0236】

【表26】

【0237】

【表27】

【0238】

表２５に示した通り、本発明の硫酸化方法により得られた硫酸化ＣＨは、２Ｓ／４Ｓ比として３．５０〜９．７５の値を、２Ｓ／６Ｓ比として０．１５〜０．５０の値を、それぞれ示した。一方、表２６に示した通り、従来の硫酸化方法により得られた硫酸化ＣＨは、２Ｓ／４Ｓ比として０．００〜３．００の値を、２Ｓ／６Ｓ比として０．００〜０．１０の値を、それぞれ示した。また、表２７に示した通り、動物から抽出して得られるＣＳ（自然界に存在するＣＳ）からはＣＨ−２Ｓが検出されず、２Ｓ／４Ｓ比と２Ｓ／６Ｓ比はどちらも０．００の値を示した。

【0239】

＜実施例２７＞低分子ヒアルロン酸の硫酸化
ＨＡ（２０ｋＤａ、または１００ｋＤａ）に２ＭのＮａＯＨ水溶液を添加し、ＨＡが５０ｍｇ／ｍＬ（５％ ｗ／ｖ）となるように溶液を調製した。この溶液を４℃に冷却し、８．７当量のＴＭＡ−ＳＯ_３を添加した後、スターラーで２４時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に２倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を２日間行った。この溶液にＮａＯＨ水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。このようにして得た硫酸化ＨＡの硫酸化度を測定し、硫黄含量を算出した。結果を表２８に示す。

【0240】

【表28】

【0241】

表２８に示した通り、本発明の硫酸化方法に供して硫酸化が行われるＨＡは、高分子のＨＡには限定されず、低分子のＨＡ（分子量１００ｋＤａ以下）であってもよいことを確認した。

【0242】

＜実施例２８＞硫酸化ヘパロサンの調製（１）

【0243】

（１）ヘパロサンの脱アセチル化
ＮＡＨ（３３．１ｋＤａ）に２ＭのＮａＯＨ水溶液を添加し、ＮＡＨが１００ｍｇ／ｍＬ（１０％ ｗ／ｖ）となるように溶液を調製した。この溶液を６０℃に加温し、スターラーで４時間撹拌して脱アセチル化反応を行った。この溶液にＨ_２ＳＯ_４を添加して中和した後、精製水に対して透析を２日間行った。この溶液にＮａＯＨ水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。このようにして脱アセチル化ＨＰＮを得た。

【0244】

（２）脱アセチル化ヘパロサンの硫酸化
上記（１）で得た脱アセチル化ＨＰＮに２０％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯを含む２ＭのＮａＯＨの溶液を添加し、脱アセチル化ＨＰＮが５０ｍｇ／ｍＬ（５％ ｗ／ｖ）となるように溶液を調製した。この溶液を４０℃に加温し、１８当量のＴＭＡ−ＳＯ_３を添加した後、スターラーで２０時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に２倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を２日間行った。この溶液にＮａＯＨ水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。

【0245】

上記（２）で得た硫酸化されたＨＰＮ（硫酸化ＨＰＮ）を二糖分析した結果を表２９に示す。

【0246】

【表29】

【0247】

＜実施例２９＞硫酸化ヘパロサンの抗凝固活性の測定
ＨＥＰと実施例２８で得た硫酸化ＨＰＮを測定対象試料とし、下記の方法に従って活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）を測定した。

【0248】

ＳＤ系雄性ラットからベノジェクトＩＩ真空採血管（３．２％クエン酸ナトリウム入り、テルモ社製）を用いて採血して血漿を得た。０．１ｍｇ／ｍＬとなるように蒸留水で溶解した試料（硫酸化ＮＡＨまたはＨＥＰ）の溶液２５μＬと血漿２２５μＬを混合して測定用試料を調製した。また、蒸留水２５μＬと血漿２２５μＬを混合して陰性対照を調製した。ＡＰＴＴの測定には全自動血液凝固線溶測定装置ＳＴＡ Ｃｏｍｐａｃｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用い、添付文書に記載の方法に従って試験を実施した。

【0249】

結果を表３０に示す。

【0250】

【表30】

【0251】

表３０に示した通り、実施例２８で得た硫酸化ＨＰＮはＨＥＰと同程度のＡＰＴＴを示した。よって、本発明の硫酸化方法により得られる硫酸化ＧＡＧは、一態様において、ヘパリン様の抗凝固活性を有する硫酸化ＧＡＧであることが確認された。

【0252】

＜実施例３０＞硫酸化ヘパロサンの調製（２）
（１）異性化ヘパロサンの調製
文献（ＷＯ２０１４／２０００４５）に記載の方法を参照してＮＡＨ（３３．１ｋＤａ）の異性化反応を行い、一部のＧｌｃＡ残基がＩｄｏＡ残基に異性化されたＨＰＮ（ＥｐＨＰＮ）を得た。ＥｐＨＰＮのＩｄｏＡ含量は３２．８％であった。

【0253】

（２）異性化ヘパロサンの脱アセチル化と硫酸化
ＮＡＨに代えて上記（１）で得たＥｐＨＰＮを用い、実施例２８に記載の方法に従って行った。

【0254】

上記（２）で得た硫酸化されたＥｐＨＰＮ（硫酸化ＥｐＨＰＮ）を二糖分析した結果を表３１に示す。

【0255】

【表31】

【0256】

表３１に示した通り、本発明の硫酸化方法に供して硫酸化が行われるＧＡＧは、ＨｅｘＡ残基としてＧｌｃＡ残基のみを有するＧＡＧには限定されず、ＩｄｏＡ残基を有するＧＡＧであってもよいことを確認した。また、本発明者らは、上記の硫酸化ＥｐＮＡＨが実施例２８に記載の硫酸化ＮＡＨと同様にヘパリン様の抗凝固活性を有するＧＡＧであることを確認している。したがって、本発明によれば、ＨｅｘＮ残基としてＧｌｃＮ残基を、ＨｅｘＡ残基としてＧｌｃＡ残基とＩｄｏＡ残基を有し、かつ抗凝固活性を示す硫酸化多糖であるＨＰＮと同様の組成および性質を有するＧＡＧを調製できることが確認された。

【0257】

＜実施例３１＞硫酸化コンドロイチンの調製（１）
ＣＨ（１１３ｋＤａ）に２Ｍ〜４ＭのＮａＯＨ水溶液を添加し、ＣＨが５０ｍｇ／ｍＬ（５％ ｗ／ｖ）となるように溶液を調製した。この溶液を４℃に冷却し、１４．５当量のＴＭＡ−ＳＯ_３を添加した後、スターラーで２４時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に３倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を２日間行った。この溶液にＮａＯＨ水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。このようにして得た硫酸化ＣＨを二糖分析し、硫酸化度を算出した。結果を表３２に示す。

【0258】

【表32】

【0259】

＜実施例３２＞硫酸化コンドロイチンの調製（２）
ＣＨ（１１３ｋＤａ）に２ＭのＮａＯＨ水溶液を添加し、ＣＨが５０ｍｇ／ｍＬ（５％ ｗ／ｖ）となるように溶液を調製した。この溶液を４℃に冷却し、８．７当量のＴＭＡ−ＳＯ_３を添加した後、スターラーで２４時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応終了時（硫酸化剤を添加してから２４時間後）に測定した硫酸化反応溶液のｐＨは１３．８であった。反応停止後の溶液に３倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を２日間行った。この溶液にＮａＯＨ水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。

【0260】

上記により得た乾燥粉末を上記と同じ条件に従った硫酸化反応に供して、再度乾燥粉末を得た。このようにして得た硫酸化ＣＨを二糖分析し、硫酸化度を算出した。結果を表３３に示す。

【0261】

【表33】

【0262】

＜実施例３３＞硫酸化コンドロイチンの調製（３）
ＣＨ（２７ｋＤａ）に２ＭのＮａＯＨ水溶液を添加し、ＣＨが５０ｍｇ／ｍＬ（５％ ｗ／ｖ）となるように溶液を調製した。この溶液を４℃に冷却し、８．７当量のＴＭＡ−ＳＯ_３を添加した後、スターラーで２４時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に３倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を２日間行った。この溶液にＮａＯＨ水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。

【0263】

上記により得た乾燥粉末を上記と同じ条件に従った硫酸化反応に供して、再度乾燥粉末を得た。この乾燥粉末を再度上記と同じ条件に従った硫酸化反応に供して、再々度乾燥粉末を得た。このようにして得た硫酸化ＣＨを二糖分析し、硫酸化度を算出した。結果を表３４に示す。

【0264】

【表34】

【0265】

表３２〜表３４に示した通り、ＣＨを硫酸化して得られる硫酸化ＣＨは、一態様において、二糖組成比においてＣＨ−ｄｉＳ_Ｄを２０％以上の割合で有することを特徴としたＧＡＧであり、このような特徴はコンドロイチン硫酸Ｄ（ＣＳＤ）と共通する特徴である。よって、本発明によればＣＳＤ様多糖の調製が可能であることを確認した。

【0266】

＜実施例３４＞従来の硫酸化方法との比較（５）
（１）強塩基性の溶液を用いた硫酸化
精製水に溶解したＨＡにＮａ_２ＳＯ_４と２ＭのＮａＯＨ水溶液を添加し、終濃度で１０ｍｇ／ｍＬ（１％ ｗ／ｖ）ＨＡ、８０ｍｇ／ｍＬ Ｎａ_２ＳＯ_４、１Ｍ ＮａＯＨとなるように溶液を調製した。この溶液を４℃に冷却し、５８当量のＴＭＡ−ＳＯ_３を添加した後、スターラーで１８時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に２倍容の精製水を添加した後、精製水に対して透析を２日間行った。この溶液にＮａＯＨ水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。このようにして得た硫酸化ヒアルロン酸の硫黄含量は２．９％であった。

【0267】

（２）有機溶媒中での硫酸化
ＨＡのトリブチルアミン（ＴＢＡ）塩にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を添加し、ＨＡが１ｍｇ／ｍＬ（０．１％ ｗ／ｖ）となるように溶液を調製した。この溶液を４０℃に加温し、１当量のＰｙｒ−ＳＯ_３を添加した後、スターラーで３時間撹拌して硫酸化反応を行った。反応停止後の溶液に等量の精製水を添加した後、精製水に対して透析を２日間行った。この溶液にＮａＯＨ水溶液を添加して中和した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得た。このようにして得た硫酸化ヒアルロン酸の硫黄含量は３．０％であった。

【0268】

（３）ＮＭＲによる硫酸基の測定
硫酸基の測定は、^１３Ｃ−ＮＭＲにより行った。上記に従って得た硫酸化ヒアルロン酸５ｍｇに０．０１％のテトラメチルシラン（ＴＭＳ）を含有する重水を添加して調製した溶液を^１３Ｃ−ＮＭＲに供し、ＧｌｃＮＡｃ残基の４−Ｏ−硫酸基に由来するシグナル（７７．５ｐｐｍ）の有無を確認した。本発明の硫酸化方法に供して得た硫酸化ヒアルロン酸を測定した結果を図２に、従来の硫酸化方法に供して得た硫酸化ヒアルロン酸を測定した結果を図３に、それぞれ示す。

【0269】

図２に示した通り、本発明の硫酸化方法に供して得た硫酸化ヒアルロン酸は７７．５ｐｐｍのシグナルを示したことから、ＧｌｃＮＡｃ残基に４−Ｏ−硫酸基を有することが確認された。一方、図３に示した通り、従来の硫酸化方法に供して得た硫酸化ヒアルロン酸は７７．５ｐｐｍのシグナルを示さなかったことから、ＧｌｃＮＡｃ残基に４−Ｏ−硫酸基を有しないことが確認された。

【産業上の利用可能性】

【0270】

本発明によれば、非有機溶媒の溶液中でＧＡＧを硫酸化することができ、よって、硫酸化ＧＡＧを製造することができる。

【0271】

日本国特許出願第２０１５−０７３１４８号（出願日：２０１５年３月３１日）の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書に参照により取り込まれる。

【要約】

非有機溶媒の溶液中でグリコサミノグリカンを硫酸化する方法を提供することを課題とする。本発明では、グリコサミノグリカンと硫酸化剤を強塩基性の非有機溶媒の溶液中に共存させて硫酸化反応を行う。本発明において強塩基性はｐＨ１１．５以上であることが好ましい。本発明によれば、例えば、ヘパリン様の抗凝固活性を有するグリコサミノグリカンをＮ−アセチルヘパロサンからワンポット合成することができる。また、本発明によって得られる硫酸化グリコサミノグリカンは、一態様において新規の二糖組成比を有する硫酸化グリコサミノグリカンであり、新規の素材として有用である。

【図1】

【図2】

【図3】