特許 6063383 インビトロでの肝臓への分化

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6063383

(24)【登録日】2016年12月22日

(45)【発行日】2017年1月18日

(54)【発明の名称】インビトロでの肝臓への分化

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/10 20060101AFI20170106BHJP

   C12N 5/071 20100101ALI20170106BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20170106BHJP

   G01N 33/68 20060101ALI20170106BHJP

   G01N 33/15 20060101ALI20170106BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20170106BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20170106BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/10

   C12N5/071

   C12Q1/02

   G01N33/68

   G01N33/15 Z

   G01N33/50 Z

   !C12N15/00 AZNA

【請求項の数】30

【全頁数】54

(21)【出願番号】特願2013-525350(P2013-525350)

(86)(22)【出願日】2011年8月25日

(65)【公表番号】特表2013-535980(P2013-535980A)

(43)【公表日】2013年9月19日

(86)【国際出願番号】GB2011001275

(87)【国際公開番号】WO2012025725

(87)【国際公開日】20120301

【審査請求日】2014年8月18日

(31)【優先権主張番号】1014169.5

(32)【優先日】2010年8月25日

(33)【優先権主張国】GB

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】500341551

【氏名又は名称】ケンブリッジ エンタープライズ リミティッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000523

【氏名又は名称】アクシス国際特許業務法人

(72)【発明者】

【氏名】リュドビック・バリエール

(72)【発明者】

【氏名】シェイク・タミール・ラシッド

(72)【発明者】

【氏名】ニコラス・ハナン

(72)【発明者】

【氏名】シン−フア・チョー

【審査官】 大久保 智之

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００８−５４５４１０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００９／０９０８８２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００９−５１２４５８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００９／０１２４２８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Hepatology，２０１０年 ５月，51，1754-1765

【文献】 Hepatology，２０１０年 １月，51，297-305

【文献】 iPS細胞の創薬研究への応用について，２００８年 ２月２６日，http://www8.cao.go.jp/cstp/project/ips/haihu3/siryo2.pdf及びhttp://www8.cao.go.jp/cstp/project/ips/参照

【文献】 J. Clin. Invest.，２０１０年 ８月２５日，120，3127-3136

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ ５／００

Ｃ１２Ｎ １５／００

Ｃ１２Ｑ １／００

Ｇ０１Ｎ ３３／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

肝臓への分化を誘導するための方法であって、以下のステップを含む方法：
（ｉ）人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞の集団を提供するステップ；
（ｉｉ）前記集団を内胚葉誘導培地中で培養し、前方胚体（ａｎｔｅｒｉｏｒ ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ）内胚葉（ＡＤＥ）細胞の集団を生成するステップ
（ここで、前記内胚葉誘導培地は、以下を含む所定の化学培地である：
１〜５００ｎｇ／ｍｌの線維芽細胞成長因子；
１０〜１０００ｎｇ／ｍｌのＳＭＡＤ２及びＳＭＡＤ３を介したシグナリング経路を刺激するＴＧＦβリガンド；
１〜５００ｎｇ／ｍｌの骨形成蛋白質；
１〜１００μＭのホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤；及び
０．３〜３０μＭのグリコーゲン・シンターゼ・キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）阻害剤）；並びに
（ｉｉｉ）ＡＤＥ細胞の前記集団を肝臓性誘導培地中で培養し、肝臓性前駆細胞の集団を生成するステップ
（ここで、前記肝臓性誘導培地は、ＳＭＡＤ２及びＳＭＡＤ３を介したシグナリング経路を刺激する５〜５００ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβリガンドを含む所定の化学培地であり、前記ｉＰＳ細胞が、肝臓病を有する個体から得た細胞に由来し、前記集団中の肝臓性前駆細胞が病気の表現型を示す）。

【請求項2】

請求項１に記載の方法であって、前記ＴＧＦβリガンドがアクチビンである該方法。

【請求項3】

請求項１又は２に記載の方法であって、前記ＰＩ３Ｋ阻害剤がＬＹ２９４００２である該方法。

【請求項4】

請求項１〜３の何れか１項に記載の方法であって、前記ＧＳＫ３β阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１である該方法。

【請求項5】

請求項１〜４の何れか１項に記載の方法であって、前記ＴＧＦβリガンドがアクチビンである該方法。

【請求項6】

請求項１〜５の何れか１項に記載の方法であって、前記ステップ（ｉｉ）が、以下のサブステップを含む該方法：
（ａ）ｉＰＳＣの前記集団を前記内胚葉誘導培地中で培養すること；
（ｂ）ＧＳＫ３β阻害剤が欠如した前記内胚葉誘導培地中で前記集団を更に培養すること；並びに
（ｃ）前方胚体内胚葉（ＡＤＥ）誘導培地中で前記集団を更に培養して、ＡＤＥ細胞の前記集団を生成すること（ここで、該培地はＳＭＡＤ２及びＳＭＡＤ３シグナリング経路を刺激する１０〜１０００ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβリガンド、並びに線維芽細胞成長因子を含む）。

【請求項7】

請求項６に記載の方法であって、前記ＴＧＦβリガンドがアクチビンである該方法。

【請求項8】

請求項６又は７に記載の方法であって、前記集団を、前記サブステップａ）〜ｃ）のそれぞれにおいて２４時間培養する該方法。

【請求項9】

請求項１〜８の何れか１項に記載の方法であって、更に以下のステップを含む方法：
（ｉｖ）前記肝臓性前駆細胞の集団を肝臓性成熟培地中で培養し、病気の表現型を示す肝細胞の集団を生成するステップ。

【請求項10】

請求項９に記載の方法であって、前記ステップ（ｉｖ）が、前記肝臓性前駆細胞の集団を１０〜２０日間培養し、前記肝細胞の集団を生成するステップである、該方法。

【請求項11】

請求項９又は請求項１０に記載の方法であって、前記肝細胞の集団によるアルブミンの産生及び／又はα１-アンチトリプシンの産生を測定するステップを含む該方法。

【請求項12】

請求項９〜１１の何れか１項に記載の方法であって、少なくとも８０％の前記肝細胞の集団がアルブミン及び／又はα１-アンチトリプシンを発現する該方法。

【請求項13】

請求項９〜１２の何れか１項に記載の方法であって、肝細胞の集団を増殖させるステップを含む該方法。

【請求項14】

請求項９〜１３の何れか１項に記載の方法であって、肝細胞の集団を培養又は維持するステップを含む該方法。

【請求項15】

請求項９〜１４の何れか１項に記載の方法であって、肝細胞の集団を保存するステップを含む該方法。

【請求項16】

請求項１〜１５の何れか１項に記載の方法であって、前記ｉＰＳ細胞がヒトｉＰＳ細胞である該方法。

【請求項17】

請求項１〜１６の何れか１項に記載の方法であって、前記ｉＰＳ細胞が継代された回数が３０回以下である該方法。

【請求項18】

請求項１〜１７の何れか１項に記載の方法であって、前記ｉＰＳ細胞が１の個体から得た線維芽細胞に由来する該方法。

【請求項19】

請求項１〜１８の何れか１項に記載の方法であって、前記肝臓病が遺伝的代謝異常（ＩＭＤ）である該方法。

【請求項20】

請求項１９に記載の方法であって、前記ＩＭＤが以下の群から選ばれる該方法：α１アンチトリプシン欠損、糖原病、家族性高コレステロール血症、遺伝性高チロシン血症、クリグラー・ナジャール症候群、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損、第ＩＸ因子欠損、ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、Ｄｕｂｉｎ−Ｊｏｈｎｓｏｎ症候群、家族性アミロイドーシス、及びレフサム病。

【請求項21】

請求項１〜２０の何れか１項に記載の方法であって、前記肝細胞の集団における１種以上の病理を検出又は測定するステップを含む該方法。

【請求項22】

請求項２１に記載の方法であって、前記肝細胞の集団において以下の１種以上の事象を測定又は検出することによって前記病理を検出する該方法：蛋白質の凝集又は重合化；ＥＲ内での蛋白質封じ込め；コレステロール取り込み；脂質及び／又はグリコーゲン蓄積；並びに乳酸の生成。

【請求項23】

請求項９〜１５の何れか１項に記載の方法によって製造された肝細胞の集団であって、前記肝細胞が病気の表現型を示し、成熟肝細胞のマーカーであるアルブミン（ＡＬＢ）及びα１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）並びに胎児肝細胞のマーカーであるα−フェトプロテイン及びＣＹＰ３Ａ７を発現する該集団。

【請求項24】

化合物をスクリーニングする方法であって、以下のステップを含む方法：
請求項９〜２２の何れか１項に記載の方法で製造され、単離された肝細胞を試験化合物に接触させるステップ；及び
前記肝細胞に対する前記試験化合物の効果、及び／又は前記試験化合物に対する前記肝細胞の効果を測定するステップ。

【請求項25】

請求項２４に記載の方法であって、試験化合物が無い場合と比べて試験化合物が有るときの前記肝細胞の成長若しくは生存率、又は１種以上の肝細胞の機能を実践する前記肝細胞の能力を測定するステップを含む該方法（ここで、成長が低下すること、生存率が低下すること、又は１種以上の肝細胞の機能を実践する能力が低下することは、前記化合物が肝臓毒性の効果を有することを示す）。

【請求項26】

請求項２４に記載の方法であって、前記肝細胞による前記試験化合物の代謝を測定する該方法。

【請求項27】

請求項２６に記載の方法であって、以下の事象を決定又は測定するステップを含む方法：
前記試験化合物の量若しくは濃度の減少、及び／又は
前記試験化合物の代謝産物の量若しくは濃度の増加。

【請求項28】

肝臓病の治療において有用な化合物をスクリーニングするための方法であって、以下のステップを含む該方法：
請求項１〜２２の何れか１項に記載の方法で製造された肝細胞の集団を試験化合物と接触させるステップ；、及び
前記肝細胞に対する前記試験化合物の効果を測定するステップ
（ここで、前記肝細胞が病気の表現型を示し、前記肝細胞における１種以上の病理に対する前記試験化合物の効果を測定する）。

【請求項29】

請求項２８に記載の方法であって、以下の１種以上の事象に対する前記試験化合物の効果を決定する該方法：蛋白質の凝集又は重合化；ＥＲ内での蛋白質封じ込め；コレステロール取り込み；脂質及び／又はグリコーゲン蓄積；並びに乳酸の生成。

【請求項30】

請求項２８又は２９に記載の方法であって、試験化合物が無い場合と比べて試験化合物が有るときの、前記肝細胞における１種以上の病理が減少又は改善することにより、前記肝臓病の治療において前記試験化合物が有用となり得ることを示す該方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、多能性ヒト細胞、特にヒトｉＰＳ細胞において、肝臓への分化（肝臓性細胞への分化）をインビトロで誘導することに関する。

【背景技術】

【0002】

体細胞内で数種類の転写因子を過剰発現させるだけで、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）を誘導できる可能性があり、こうした可能性は、再生医療及びインビトロでの病気のモデリングのための新たな機会を開いてきた（［１］）。そして、種々の病気に苦しむ患者からｈｉＰＳＣが生成されてきた（［２］［３］［４］）。ここで、幾つかの群では、これらの細胞が続いて神経前駆細胞に分化したときに、病気特有の表現型が報告される（［５］［６］）。しかし、今日までは、非神経細胞（例えば、中胚葉系統及び内胚葉系統の細胞）の病気に特有のｈｉＰＳＣベースのモデルは報告されてこなかった。あるいは、完全に分化した成人細胞にのみ見られる機能を失うという結果を生じさせる病気（後期に発症する病気）に特有のｈｉＰＳＣベースのモデルは報告されてこなかった。更に、再プログラミング及び分化につきまとう細胞ストレスによって、蛋白質の輸送及び活性を支配する無数の緻密な相互作用が、ｈｉＰＳＣ由来の細胞モデルにおいて保存されない（保存が阻害される）という懸念が残っている。様々な病気のメカニズムを理解するにあたって、こうした相互作用を理解することが中心になって行われる。また該相互作用を理解することにより、同一の遺伝的背景を持つ個体間で観察され、及び現在説明の付かない臨床の表現型のバリエーションについての病識与えることができる（［７］［８］［９］）。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0003】

こうした課題は、特に肝臓病（特に肝臓の遺伝的代謝異常（ＩＭＤ））に関連している。こうした群の病気は、肝細胞の鍵（キー）となる蛋白質に影響を与える遺伝的変異から生じる。こうした群の病気は、肝臓を全器官移植することによって治療することができるが、こうした手順は、相当のリスクを生じる。従って、病気のメカニズムに対する理解を深め、代替治療法を開発する必要がある（［１０］［１１］）。しかし、そのための研究においては幾つかの困難が立ちふさがっており、該困難としては：肝細胞を初代培養することが困難であることや；病気の原因となる蛋白質の機能不全、ひいては細胞の欠陥を忠実に再現し、関連のあるヒト肝細胞様細胞株を提供することができない点が挙げられる（［１２］）

【0004】

本発明は、ヒトｉＰＳ細胞を肝臓性前駆細胞及び肝細胞へインビトロで高効率誘導するための方法に関する。本発明は、例えば、細胞ベースの治療法又は病気のモデリングのための肝細胞を生成する際に有用となる可能性がある。

【0005】

一態様において、本発明は以下の方法を提供する。
肝臓への分化を誘導するための方法であって、以下のステップを含む方法：
（ｉ）人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞の集団を提供するステップ；
（ｉｉ）前記集団を内胚葉誘導培地中で培養し、前方胚体（ａｎｔｅｒｉｏｒ ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ）内胚葉（ＡＤＥ）細胞の集団を生成するステップ
（ここで、前記内胚葉誘導培地は、
以下の性質を持つ所定の化学培地である：
線維芽細胞成長因子活性を有し、
ＳＭＡＤ２及びＳＭＡＤ３を介したシグナリング経路、並びにＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ５及びＳＭＡＤ９を介したシグナリング経路を刺激し、並びに
ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）及びグリコーゲン・シンターゼ・キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）を阻害する）
（ｉｉｉ）ＡＤＥ細胞の前記集団を肝臓性誘導培地中で培養し、肝臓性前駆細胞の集団を生成するステップ
（ここで、前記肝臓性誘導培地は、ＳＭＡＤ２及びＳＭＡＤ３を介したシグナリング経路を刺激する所定の化学培地である）。

【0006】

本発明の方法は更に以下のステップを含むことができる；
（ｉｖ）前記肝臓性前駆細胞の集団を肝臓性成熟培地（肝臓性細胞へと成熟させる培地）中で培養し、肝細胞の集団を生成するステップ。

【0007】

好ましくは、 前記ｉＰＳ細胞はヒトｉＰＳ細胞である。

【0008】

ｉＰＳ細胞は、非多能性且つ完全に分化した先祖細胞に由来する多能性細胞である。適切な先祖細胞には、成人の線維芽細胞や、末しょう血球が含まれる。通常、先祖細胞は、多能性の遺伝子又は蛋白質（例えば、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２及びＳｏｘ１）を細胞に導入することにより再プログラムされる。前記遺伝子又は蛋白質は、分化した細胞へ、任意の適切な技術によって導入することができる。該技術としては、プラスミド性、若しくはより好ましくは、ウィルス性のトランスフェクション、又は直接的な蛋白質の送達が含まれる。また、他の遺伝子を細胞に導入して、誘導効率を増加させても良い：例えば、Ｋｉｆ遺伝子（例えば、Ｋｉｆ−１、−２、−４及び−５）；Ｍｙｃ遺伝子（例えば、ｃ−Ｍｙｃ、Ｌ−Ｍｙｃ及びＮ−Ｍｙｃ）；ｎａｎｏｇ；及びＬｉｎ２８。多能性の遺伝子又は蛋白質を導入した後、先祖細胞を培養することができる。多能性のマーカーを発現する細胞は、単離及び／又は精製を行い、ｉＰＳ細胞の集団を生成することができる。ｉＰＳ細胞を製造するための技術は周知である（Ｙａｍａｎａｋａ ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ ２００７； ４４８：３１３−７； Ｙａｍａｎａｋａ ６ ２００７ Ｊｕｎ ７；１（１）：３９−４９． Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ． ２００８ Ｊｕｌ ３１；４５４（７２０４）：６４６−５０； Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｃｅｌｌ． ２００７ Ｎｏｖ ３０；１３１（５）：８６１−７２． Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ． ２００８ Ｊａｎ １０；４５１（７１７５）：１４１−６； Ｋｉｍｅｔ ａｌ Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ． ２００９ Ｊｕｎ ５；４（６）：４７２−６； Ｖａｌｌｉｅｒ， Ｌ．， ｅｔ ａｌ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ， ２００９． ９９９９（９９９Ａ）： ｐ． Ｎ／Ａ．）。

【0009】

ｉＰＳ細胞は、以下の多能性に関連したマーカーを１種以上発現することができる：Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、アルカリ・ホスファターゼ、ＳＳＥＡ−３、ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、ＫＬＦ−４及びｃ−Ｍｙｃ。

【0010】

幾つかの実施形態において、本明細書に記載の方法で使用されるｉＰＳ細胞は、１つの個体から得られた健常な細胞（例えば線維芽細胞）（即ち、病気に関連した表現型又は遺伝子型を持たない細胞）に由来する。

【0011】

健常細胞に由来するｉＰＳ細胞は、本明細書に記載の通り使用して、正常な（即ち、病気に関連しない）表現型を示す肝細胞を生成することができる。

【0012】

健常細胞は、正常な肝臓機能をもつ個体から得ることができる。或いは、健常細胞は、損傷した又は機能不全の肝臓細胞を有する患者から得ることができる（例えば、肝臓の損傷又は病気を有する患者（例えば、肝炎（例えば、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型、Ｇ型又はＫ型の肝炎）、肝硬変、肝臓細胞の癌、非アルコール性脂肪性肝炎、薬剤誘発肝臓損傷、アルコール性肝疾患又は自己免疫性の肝疾患））。

【0013】

幾つかの実施形態において、ｉＰＳ細胞は、固有の遺伝的背景を有する個体から得られた健常細胞に由来してもよい。例えば、ｉＰＳ細胞は、肝臓病を患った個体、肝臓病を患うリスクの高い個体、及び／又は 肝臓病を患うリスクの低い個体からの健常細胞から生成することができる。本明細書に記載に従って固有の遺伝的背景を有する個体から生成された肝細胞は、肝臓病のメカニズムの研究、及び治療用ターゲットの同定に有用となる可能性がある。

【0014】

正常な（即ち、病気に関連しない）表現型を示す肝細胞は、後述するように、肝臓の損傷又は病気を有する患者を治療する際に有用となる可能性がある。例えば、ｉＰＳ細胞の由来元となる健常細胞の供給元となった患者の治療の際に有用となる可能性がある。

【0015】

他の実施形態では、本明細書に記載の方法で使用されるｉＰＳ細胞は、１つの個体から得た細胞であって病気に関連した細胞に由来する。即ち、細胞は、肝臓病又は肝臓の機能不全に関連した表現型又は遺伝子型を示す。そして、該表現型又は遺伝子型としては、例えば、肝臓の遺伝的代謝疾患（ＩＭＤ）があり、該疾患の例としては以下の物が挙げられる：α１アンチトリプシン欠損、糖原病（例えば、 糖原病１ａ型）、家族性高コレステロール血症、遺伝性高チロシン血症、クリグラー・ナジャール症候群、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損、又は第ＩＸ因子欠損若しくは他の血友病、ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、Ｄｕｂｉｎ−Ｊｏｈｎｓｏｎ症候群、家族性アミロイドーシス、又はレフサム病。前記遺伝子型（例えば遺伝的変異又は遺伝的欠陥）を有する任意の細胞は、ＩＭＤ又は他の肝臓病と関連し、また、線維芽細胞のサンプル（例えば、皮膚の線維芽細胞）から適宜得ることができるが、こうした任意の細胞を使用することができる。

【0016】

ある個体から得た細胞であって、病気に関連した細胞に由来するｉＰＳ細胞（即ち、病気特有のｉＰＳ細胞：ｄｓ−ｉＰＳ又はｄｈｉＰＳ）は、本明細書に記載の通り使用して、肝臓病に関連した表現型（例えばＩＭＤ表現型）を示す肝細胞を生成することができる。通常は、前記肝細胞は、肝臓病に関連した遺伝的変異又は遺伝的欠陥を有するであろう。こうした細胞は、上述したように、肝臓の損傷又は病気を有する患者の治療、又は肝臓病のモデリング及びスクリーニングにおいて有用となる可能性がある。

【0017】

他の実施形態では、肝臓病を有する個体から得た、病気に関連した細胞に由来するｉＰＳ細胞（即ち、病気特有のｉＰＳ細胞：ｄｓ−ｉＰＳ又はｄｈｉＰＳ）は、肝臓病に関連した遺伝的変異又は遺伝的欠陥を有する（例えば、α１−アンチトリプシンにおけるＧｌｕ３４２Ｌｙｓの変異であって、Ａ１ＡＴ欠損の原因となる変異）。前記変異及び欠損は、分化する前に、ｉＰＳ細胞内で、修復することができる。例えば、病気に関連した遺伝的な変異又は損傷を含むｄｓ−ｉＰＳ細胞内のヌクレオチド配列は、野生型ヌクレオチド配列に置換することができる。遺伝的変異及び欠損を修復するための適切な方法は周知であり、本明細書以外の所でも記載されている。こうした修復された（ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ）ｉＰＳ細胞（ｃ−ｉＰＳＣ）は、上述したように、肝臓の損傷又は病気を有する患者の治療において有用となる可能性がある。

【0018】

肝臓の病気については上述した通りであり、遺伝的代謝異常（ＩＭＤ）を含めることができる。ＩＭＤは、ＥＲ内での蛋白質のミスフォールディングに関連したＩＭＤであってもよい。例えば、以下の病気が挙げられる：α１−アンチトリプシン欠損；肝臓に関連した受容体疾患（ｒｅｃｅｐｔｏｒｏｐａｔｈｙ）（例えば、家族性高コレステロール血症（ＦＨ））；代謝異常（例えば、糖原病、例えば、ＧＳＤ１ａ）。

【0019】

肝臓病は、後期に発症する異常、又は成熟成人肝臓細胞に関連した異常であってもよい。

【0020】

製造後、ｉＰＳ細胞の集団は、従来の技術を用いて培養又は維持をすることができる（Ｖａｌｌｉｅｒ， Ｌ． ｅｔ ａｌ Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． ２７５， ４０３−４２１ （２００４）， Ｃｏｗａｎ， Ｃ．Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３５０， １３５３−１３５６ （２００４）， Ｊｏａｎｎｉｄｅｓ， Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２４， ２３０−２３５ （２００６） Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ， Ｉ． ｅｔ ａｌ． Ｌａｎｃｅｔ ３６５， １６３６−１６４１ （２００５）， Ｌｕｄｗｉｇ， Ｔ．Ｅ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２４， １８５−１８７ （２００６））。例えば、本発明の方法での使用に適したｉＰＳ細胞（特にヒトｉＰＳ細胞）は、適宜以下の条件で培養することができる：培養ディッシュ内での支持細胞（例えば、放射状マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ））の層の上で、培地としては、例えば、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（ＫＳ）培地（添加物として、４ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２）で、そして、適切な密度（例えば、１０⁵〜１０⁶細胞／６０ｍｍディッシュ）で培養することができる。或いは、条件付の供給物を有する若しくは所定の培地とともに適切な基質の上で培養することができる。

【0021】

好ましくは、継代数が少ないｉＰＳ細胞が本明細書に記載の方法において用いられる。継代数が少ないｉＰＳ細胞は、培養した細胞の継代数が４０以下、好ましくは３５以下、又は３０以下である。本発明の方法において使用するためのｉＰＳ細胞は、酵素的手段又は機械的手段で継代することができる。

【0022】

ｉＰＳ細胞に適した培養培地には、以下の物が挙げられる：
４ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２を添加したＫｎｏｃｋｏｕｔ（ＫＳ）培地；
Ｋｎｏｃｋｏｕｔダルベッコ改変イーグル培地（ＫＯ−ＤＭＥＭ）（添加物として、 ２０％の血清置換物、１％の非必須アミノ酸、１ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、及び４ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌのヒトＦＧＦ２）； 並びに
ＤＭＥＭ／Ｆ１２（添加物として、２０％のＫｎｏｃｋｏｕｔ血清置換物（ＫＳＲ）、 ６ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、１ｍＭのＬ−Ｇｌｎ、１００μＭの非必須アミノ酸、１００μＭの２−メルカプトエタノール、５０Ｕ／ｍｌのペニシリン及び５０ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン）。

【0023】

培養中、細胞は、コラゲナーゼを含まない試薬（例えば、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）（ＢｉｏＷｅｓｔ））を用いて回収することが好ましい。

【0024】

本明細書に記載の方法に従って、ｉＰＳ細胞を肝細胞に分化させるには、３つの段階を経る。第１の段階では、ｉＰＳ細胞の集団は、前方胚体内胚葉（ＡＤＥ）細胞の集団へと分化する。第２の段階では、前記ＡＤＥ細胞は、肝臓性前駆細胞に分化する。そして、随意的な第３の段階では、前記肝臓性前駆細胞は、肝細胞に分化する。これらの方法で使用される全ての培地は、所定の化学培地であり、好ましくはヒトに適応化した培地である。

【0025】

ＡＤＥ細胞への分化を誘導するために、前記ｉＰＳ細胞の集団は、内胚葉誘導培地中で培養される。

【0026】

前記内胚葉誘導培地は、所定の化学培地（ＣＤＭ）であり、以下の性質を持つ：
（ｉ）ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、及びＳＭＡＤ５が介するシグナリング経路を刺激する；
（ｉｉ）ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）及びグリコーゲン・シンターゼ・キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）を阻害する；及び
（ｉｉｉ）線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）活性を有する。

【0027】

所定の化学培地は、特定の成分のみ、好ましくは既知の化学構造の成分のみを含有する、細胞培養用のための、栄養溶液である。好ましくは、前記所定の化学培地は、ヒトに適応化した培地である。ヒトに適応化した所定の化学培地は、ヒト以外の動物に由来する成分又は添加物（例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、マウス支持細胞）を含まない。

【0028】

前記内胚葉誘導培地には、所定の化学的基礎培地が含まれる。

【0029】

適切な所定の化学的基礎培地では、ＩＭＤＭ及び／又はＦ１２を含み、添加物としては、インシュリンを、例えば０．５μｇ／ｍｌ〜７０μｇ／ｍｌ、トランスフェリンを、例えば、濃度１．５μｇ／ｍｌ〜１５０μｇ／ｍｌ、抗酸化剤（例えば、１−チオールグリセロール）を、例えば、濃度４５μＭ〜４．５ｍＭ、及び脂質が挙げられる。

【0030】

適切な所定の化学的基礎培地としては、Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ ａｎｄ Ｗｉｌｅｓ ＣＤＭ （Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ ａｎｄ Ｗｉｌｅｓ （１９９５） Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １５， １４１−１５１）が挙げられ、添加物としては、ポリビニルアルコール、インシュリン、トランスフェリン及び所定の脂質を添加できる。Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ ａｎｄ Ｗｉｌｅｓ ＣＤＭは、以下の物から構成される：５０％のＩＭＤＭ（Ｇｉｂｃｏ）、これに加えて、５０％のＦ１２ ＮＵＴ−ＭＩＸ（Ｇｉｂｃｏ）；７μｇ／ｍｌのインシュリン；１５μｇ／ｍｌのトランスフェリン；１ｍｇ／ｍｌのポリビニルアルコール（ＰＶＡ）；１％の所定の化学的脂質濃縮物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；、及び４５０μＭの１−チオールグリセロール。

【0031】

他の適切な所定の化学的基礎培地については公知である。

【0032】

ウシ又はヒトの血清アルブミンの使用を避けるために、所定の化学的基礎培地は、内胚葉誘導培地の中に、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を０．５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度で添加することができる。ポリビニルアルコールを添加した所定の化学的基礎培地は、慣用的にＣＤＭ−ＰＶＡと呼ばれる。

【0033】

内胚葉誘導培地の中で、ＣＤＭ−ＰＶＡは、追加因子、好ましくは組み換え型ヒト因子を添加することができ、該培地は、ｉＰＳ細胞を誘導し、前方胚体内胚葉（ＡＤＥ）細胞へ分化させる。

【0034】

例えば、ＣＤＭ−ＰＶＡは、線維芽細胞成長因子を添加する。

【0035】

線維芽細胞成長因子は、蛋白質の因子であり、線維芽細胞成長因子の受容体（ＦＧＦＲ）へ結合することによって、細胞の成長、増殖、及び細胞の分化を刺激する。適切な線維芽細胞成長因子は、ＦＧＦファミリーの任意のメンバーが含まれる。例えば、ＦＧＦ１〜ＦＧＦ１４及びＦＧＦ１５〜ＦＧＦ２３のうちの任意の１つが含まれる。

【0036】

前記線維芽細胞成長因子は、以下の物であることが好ましい：ＦＧＦ２（ＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ： ２２４７， 核酸配列 ＮＭ＿００２００６．３ ＧＩ： ４１３５２６９４， アミノ酸配列 ＮＰ＿００１９９７．４ ＧＩ： ４１３５２６９５）；ＦＧＦ７（ケラチノサイト成長因子（又はＫＧＦ）としても知られている， ＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ： ２２４７， 核酸配列 ＮＭ＿００２００６．３ ＧＩ： ４１３５２６９４， アミノ酸配列 ＮＰ＿００１９９７．４ ＧＩ： ４１３５２６９５）；、又はＦＧＦ１０（ＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ： ２２４７， 核酸配列 ＮＭ＿００２００６．３ ＧＩ： ４１３５２６９４， アミノ酸配列 ＮＰ＿００１９９７．４ ＧＩ： ４１３５２６９５）。

【0037】

最も好ましくは、線維芽細胞成長因子は、ＦＧＦ２である（Ａｍｉｔ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２２７：２７１−２７８ （２０００））。

【0038】

線維芽細胞成長因子（例えば、ＦＧＦ２、ＦＧＦ７及びＦＧＦ１０）は、ルーチンの組み換え型技術を用いて生成することができ、又は販売元から入手できる（例えば、 Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， ミネアポリス， ＭＮ； Ｓｔｅｍｇｅｎｔ Ｉｎｃ， ＵＳＡ）。

【0039】

便宜上、内胚葉誘導培地中のＦＧＦ濃度は、１〜５００ｎｇ／ｍｌであってもよく、好ましくは約４０ｎｇ／ｍｌであってもよい。

【0040】

ＣＤＭ−ＰＶＡは、更に第一のＴＧＦβリガンドを添加してもよく、該リガンドは、ｉＰＳ細胞中において、ＳＭＡＤ２及びＳＭＡＤ３を介した細胞内シグナリング経路を刺激する。

【0041】

ＴＧＦβリガンドはＴＧＦβスーパーファミリーのペプチドである。ＴＧＦβ スーパーファミリーのメンバーは、特徴的な構造を有しており、周知である。

【0042】

第一のＴＧＦβリガンドは、アクチビン（Ａｃｔｉｖｉｎ）又はＴＧＦβであってもよい。

【0043】

アクチビン（アクチビンＡ： ＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ： ３６２４ 核酸参照配列 ＮＭ＿００２１９２．２ ＧＩ： ６２９５３１３７， アミノ酸参照配列 ＮＰ＿００２１８３．１ ＧＩ： ４５０４６９９）は、二量体性ポリペプチドであり、アクチビン／Ｎｏｄａｌ経路の刺激を介して、細胞へのある範囲の効果を及ぼす（Ｖａｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１８：４４９５−４５０９ （２００５））。アクチビンは販売元から容易に入手できる（例えば、 Ｓｔｅｍｇｅｎｔ Ｉｎｃ． ＭＡ ＵＳＡ）。便宜上、培地中のアクチビン濃度は、１０〜１０００ｎｇ／ｍｌの範囲であってもよく、好ましくは約１００ｎｇ／ｍｌであってもよい。

【0044】

ＴＧＦβ（ＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ： ７０４０ 核酸参照配列 ＮＭ＿０００６６０．４ ＧＩ： ２６０６５５６２１， アミノ酸参照配列 ＮＰ＿０００６５１．３ ＧＩ： ６３０２５２２２）は、ホモダイマーのポリペプチドであり、増殖及び分化を制御する（Ｗａｔａｂｅ， Ｔ． ｅｔ ａｌ （２００９）．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ． １９：１０３−１１５）。組み換え型ヒトＴＧＦβは販売元から容易にから入手できる（例えば、 Ｓｔｅｍｇｅｎｔ Ｉｎｃ． ＭＡ ＵＳＡ）。便宜上、培地中のＴＧＦβ濃度は、１０〜１０００ｎｇ／ｍｌであっても良く、好ましくは約１００ｎｇ／ｍｌであっても良い。

【0045】

ＣＤＭ−ＰＶＡは、更に第二のＴＧＦβリガンドを添加することができ、ｉＰＳ細胞中において、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ５及びＳＭＡＤ９を介した細胞内シグナリング経路を刺激する。

【0046】

第二のＴＧＦβリガンドは、骨形成蛋白質（ＢＭＰ）であってもよい。骨形成蛋白質は、骨形成蛋白質受容体（ＢＭＰＲ）に結合して、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ５及びＳＭＡＤ９を介した経路を通して、細胞内シグナリングを刺激する。適切な骨形成蛋白質は、ＢＭＰファミリーの任意のメンバー（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６又はＢＭＰ７）が挙げられる。好ましくは、第二のＴＧＦβリガンドは以下の通りである：ＢＭＰ２（ＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ： ６５０， 核酸配列 ＮＭ＿００１２００．２ ＧＩ： ８０８６１４８４； アミノ酸配列 ＮＰ＿００１１９１．１ ＧＩ： ４５５７３６９）；、又は、ＢＭＰ４（ＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ： ６５２， 核酸配列 ＮＭ＿００１２０２．３ ＧＩ： １５７２７６５９２； アミノ酸配列 ＮＰ＿００１１９３．２ ＧＩ： １５７２７６５９３）。

【0047】

骨形成蛋白質は、ルーチンの組み換え技術を用いて生成することができ、又は販売元から入手することができる（例えば、Ｒ＆Ｄ， ミネアポリス， ＵＳＡ， Ｓｔｅｍｇｅｎｔ Ｉｎｃ， ＵＳＡ）。

【0048】

便宜上、骨形成蛋白質の培地中の濃度（例えば、ＢＭＰ２又はＢＭＰ４）は、１〜５００ｎｇ／ｍｌであってもよく、好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌであってもよい。

【0049】

したがって、内胚葉誘導培地には、所定の化学的基礎培地を含むことができ、該培地には、ポリビニルアルコール、ＦＧＦ、第一の及び第二のＴＧＦβリガンド、ＰＩ３Ｋ阻害剤、並びにＧＳＫ３β阻害剤を添加することができる。

【0050】

ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（例えば、ホスファチジルイノシトール−４，５−ビスホスフェート ３−キナーゼ（ＥＣ２．７．１．１５３））の活性を阻害する。

【0051】

適切なＰＩ３Ｋ阻害剤は、以下の物が含まれる：ウォルトマンニン；ＬＹ３０１４９７（１７−ｂ−ヒドロキシウォルトマンニン）；ＬＹ２９４００２（２−モルホリン−４−イル−８−フェニルクロメン−４−オン： Ｍａｃｌｅａｎ ｅｔ ａｌ （２００７） Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２５ ２９−３８）；ＣＬＢ１３０９（ＫＮ３０９：（±）−２−（｛１−［７−メチル−２−（モルホリン−４−イル）−４−オキソ−ピリド［１，２−ａ］ピリミジン−９−イル］エチル｝アミノ）安息香酸）；ＰＸ−８６６（（１Ｅ，４Ｓ，４ａＲ，５Ｒ，６ａＳ，９ａＲ）− ５−（アセチルオキシ）−１−［（ジ−２−プロペン−１−イルアミノ）メチレン］−４，４ａ，５，６，６ａ，８，９，９ａ−オクタヒドロ−１１−ヒドロキシ−４−（メトキシメチル）−４ａ，６ａ−ジメチルシクロペンタ ［５，６］ナフト［１，２−ｃ］ピラン−２，７，１０（１Ｈ）−トリオン）；ＩＣ８７１１４（キノロン・ピロロピリミジン； ＃６ 図１７）； ＧＤＣ−０９４１ （＃３ 図１７； ２−（１Ｈ−インダゾール−４−イル）−６−［［４−（メチルスルホニル）−１−ピペラジニル］メチル］−４−（４−モルホリニル）−チエノ［３，２− ｄ］ピリミジン）； ＴＧＸ−２２１ （７−メチル−２−（４−モルホリニル）−９−［１−（フェニルアミノ）エチル］−４Ｈ−ピリド［１，２−ａ］ピリミジン−４−オン）， ケルセチン； ＢＥＺ２３５ （＃４ 図１７）； ＸＬ１４７ （＃１ 図１７）； Ｘｌ７６５ （＃２ 図１７）； ＰＸ−８６６ （＃５ 図１７）； ＺＳＴＫ４７４ （２−（２−ジフルオロメチルベンジミダゾール−１−イル）４，６−ジモルホリノ−１，３，５−トリアジン）； 及びＳＦ１１２６ （２−［２−メトキシエチルアミノ］−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン）。他のＰＩ３Ｋ阻害剤は、当分野で入手可能である。

【0052】

適切なＰＩ３Ｋ阻害剤は、販売元から入手可能である（例えば、 Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ ＣＡ ＵＳＡ）。

【0053】

例えば、内胚葉誘導培地は、１〜１００μＭのＰＩ３Ｋ阻害剤（例えば、ＬＹ２９４００２）を含むことができ、好ましくは約１０μＭ含むことができる。

【0054】

ＧＳＫ３β阻害剤は、グリコーゲン・シンターゼ・キナーゼ３β（Ｇｅｎｅ ＩＤ ２９３２： ＥＣ２．７．１１．２６）の活性を阻害する。適切な阻害剤には、以下の物が含まれる：ＣＨＩＲ９９０２１（６−（（２−（（４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）ピリミジン−２−イル）アミノ）エチル）アミノ）ニコチノニトリル； Ｒｉｎｇ Ｄ． Ｂ． ｅｔ ａｌ．， Ｄｉａｂｅｔｅｓ， ５２：５８８−５９５ （２００３））、ａｌｓｔｅｒｐａｕｌｌｏｎｅ、ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ、ＳＢ２１６７６３ （３−（２，４−ジクロロフェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン）、及びＳＢ４１５２８６ （３−［（３−クロロ−４−ヒドロキシフェニル）アミノ］−４−（２−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン）。

【0055】

適切なグリコーゲン・シンターゼ・キナーゼ３β阻害剤は、販売元から入手可能である（例えば、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ Ｉｎｃ． ＭＡ ＵＳＡ； Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ． ＭＩ ＵＳＡ）。例えば、内胚葉誘導培地は、０．３〜３０μＭのＧＳＫ３β阻害剤（例えば、ＣＨＩＲ９９０２１）を含むことができ、好ましくは約３μＭ含むことができる。

【0056】

幾つかの実施形態において、内胚葉誘導培地は、ＣＤＭ−ＰＶＡ基礎培地から構成されてもよく、該培地は、アクチビン、ＦＧＦ２、ＢＭＰ−４、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ阻害剤（好ましくはＬＹ２９４００２）、及びグリコーゲン・シンターゼ・キナーゼ３β阻害剤（好ましくはＣＨＩＲ９９０２１）を添加してもよい。

【0057】

好ましくは、内胚葉誘導培地中のアクチビン、ＦＧＦ２及びＢＭＰ−４は、全て組み換え型ヒト蛋白質である。

【0058】

ほ乳動物の細胞培養については周知である（例えば、以下の文献を参照されたい：Ｂａｓｉｃ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｃ． Ｈｅｌｇａｓｏｎ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ． Ｕ．Ｓ． （１５ Ｏｃｔ ２００４） ＩＳＢＮ： １５８８２９５４５１； Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ （Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｓ．） Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， Ｕ．Ｓ． （９ Ｄｅｃ ２００４） ＩＳＢＮ： １５８８２９２２２３； Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ， Ｒ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ （２ Ａｕｇ ２００５） ＩＳＢＮ： ０４７１４５３２９３， Ｈｏ ＷＹ ｅｔ ａｌ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ． （２００６） ３１０：４０−５２， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ （ｅｄ． Ｒ． Ｌａｎｚａ） ＩＳＢＮ： ０１２４３６６４３０）。これらの培地及び成分は、販売元から入手可能である（例えば、Ｇｉｂｃｏ、Ｒｏｃｈｅ、Ｓｉｇｍａ、Ｅｕｒｏｐａ ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）。標準的なほ乳動物の細胞培養条件を用いることができる。例えば、３７℃、２１％酸素、５％二酸化炭素といった条件を用いることができる。培地は、２日ごとに交換することが好ましく、細胞は、重力によって設置されることが好ましい。

【0059】

細胞は以下の条件で培養することが好ましい：単層で、支持細胞が存在せず、血清（好ましくはヒト血清）又は細胞外マトリックス蛋白質（例えば、フィブロネクチン、ラミニン、又はコラーゲン）で被覆（コーティング）された基質上で培養。適切な培養技術は周知である。

【0060】

好ましい実施形態において、ｉＰＳ細胞を前方胚体内胚葉（ＡＤＥ）細胞へと分化させる工程は、３つの別々のステップで行うことができる。例えば、ｉＰＳ細胞の集団をＡＤＥ細胞へ分化させる工程は以下のステップを含むことができる：
（ａ）ｉＰＳＣ(ｉＰＳ細胞)の集団を内胚葉誘導培地中で培養するステップであって、例えば１２〜３６時間、好ましくは約２４時間培養するステップ；
（ｂ）更に、前記集団を、グリコーゲン・シンターゼ・キナーゼ３β阻害剤が存在しない内胚葉誘導培地中で培養するステップであって、例えば１２〜３６時間、好ましくは約２４時間培養するステップ；並びに
（ｃ）更に、前記集団を、ＡＤＥ誘導培地中で培養するステップであって、該培地は、ＳＭＡＤ２及びＳＭＡＤ３シグナリング経路を刺激し、線維芽細胞成長因子活性を有し、例えば１２〜３６時間、好ましくは約２４時間培養し、前方胚体内胚葉（ＡＤＥ）細胞の集団を生成するステップ。

【0061】

前記ＡＤＥ誘導培地は、所定の化学培地であって、所定の化学的基礎培地が含まれる。適切な所定の化学的基礎培地には、ＲＰＭＩ−１６４０が含まれる。

【0062】

ＲＰＭＩ−１６４０（Ｍｏｏｒｅ， Ｇ．Ｅ． ａｎｄ Ｗｏｏｄｓ Ｌ．Ｋ．， （１９７６） Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ． ３， ５０３−５０８）は、無機塩、アミノ酸、ビタミン、抗酸化剤及び緩衝剤（バッファ）を含有する無血清基礎培地である。ＲＰＭＩ−１６４０は周知であり、販売元から容易に入手できる（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ ＭＩ ＵＳＡ）。ＲＰＭＩ−１６４０培地の成分を表２に示す。

【0063】

所定の化学的基礎培地は、無血清培地添加物を添加することができる。適切な無血清培地添加物には、Ｂ２７（Ｂｒｅｗｅｒ ｅｔ ａｌ Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ ３５ ５６７−５７６ （１９９３））及びＮＳ２１（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｍｅｔｈｓ （２００８） １７１ ２３９−２４７）が含まれる。無血清培地添加物（例えば、Ｂ２７及びＮ２１）は周知であり、幅広く市場で入手可能である（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ； Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｉｎｃ）。

【0064】

また、ＡＤＥ誘導培地においては、所定の化学的基礎培地に、追加的因子、好ましくは組み換え型ヒト因子を添加して、前方胚体内胚葉（ＡＤＥ）細胞の集団を生成する。例えば、所定の化学的基礎培地には、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）及び第一のＴＧＦβリガンドを添加することができ、該リガンドは、ＳＭＡＤ２及びＳＭＡＤ３を介する細胞内シグナリング経路を刺激する。ＦＧＦ及び第一のＴＧＦβリガンドについては、これまでの記載の所で更に詳しく述べたとおりである。

【0065】

幾つかの実施形態において、ＡＤＥ誘導培地は、所定の化学的基礎培地を含むことができ、該培地には以下の添加物を添加することができる：１〜１０００ｎｇ／ｍｌの第一のＴＧＦβリガンド（例えば、アクチビン、好ましくは１００ｎｇ／ｍｌ）、及び４〜４００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ（例えば、ＦＧＦ２、好ましくは４０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ）。所定の化学的基礎培地は、ＲＰＭＩ−１６４０であってもよく、該培地には、Ｂ２７又はＮＳ２１培地添加物を添加してもよい。

【0066】

好ましくは、ｉＰＳ細胞の集団は、２〜４日間、最も好ましくは３日間培養して、ＡＤＥ細胞の集団を生成する。

【0067】

前方胚体内胚葉（ＡＤＥ）細胞は、内胚葉マーカーを発現することができ、例えば、Ｓｏｘ１７、ｆｏｘＡ２、ＧＳＣ、Ｍｉｘｌ１、Ｌｈｘ１、ＣＸＣＲ４、ＧＡＴＡ６、Ｅｏｍｅｓ及びＨｅｘを発現することができる。

【0068】

前方胚体内胚葉（ＡＤＥ）細胞は、多能性のマーカー、又は内胚葉の若しくは中胚葉の系統と関連するマーカーの発現が欠損してもよい。例えば、ＡＤＥ細胞は、以下のマーカを、検出可能なレベルで、１種以上、好ましくは全て発現しなくてもよい：Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、アルカリ・ホスファターゼ、ＳＳＥＡ−３、ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０及びＫＬＦ−４。

【0069】

１種以上のＡＤＥ細胞マーカー、及び／又は１種以上の多能性細胞マーカーの発現は、分化している細胞集団中でモニター及び／又は検出することができる。これにより前記細胞集団に対してどの程度分化又は内胚葉誘導が成されているかを決定することができる。

【0070】

分化した後、ＡＤＥ細胞の集団は、実質的に他の細胞種を含まなくても良い。例えば、培地で培養した後、前記集団は、ＡＤＥ細胞を８５％以上、９０％以上、９５％以上又は９８％以上含むことができる。好ましくは、ＡＤＥ細胞の集団は、他の細胞種の存在が十分排除されており、精製を必要としない。要すれば、ＡＤＥ細胞の集団は、任意の便宜的な技術（例えば、ＦＡＣＳ）によって精製することができる。

【0071】

幾つかの実施形態において、ＡＤＥ細胞の集団は、肝臓性の系統へ更に分化させる前に増殖させることができる。ＡＤＥ細胞は、任意の便宜的な技術によって増殖させることができ、例えば、上述したように、ＦＧＦを添加した培地（例えば、ＡＤＥ誘導培地）内で増殖させることができる。

【0072】

肝臓性前駆細胞への分化を誘導するために、ＡＤＥ細胞の集団は、肝臓性誘導培地中で培養する。前記肝臓性誘導培地は、所定の化学培地（ＣＤＭ）であり、該培地は、ＳＭＡＤ２及びＳＭＡＤ３を介するシグナリング経路を刺激し、肝臓性の系統への分化を誘導する。

【0073】

肝臓性誘導培地は、所定の化学的基礎培地が含まれ、該培地には、１種以上の追加的因子、好ましくは組み換え型ヒト因子が添加され、ＡＤＥ細胞が肝臓性前駆細胞に分化することを誘導する。

【0074】

適切な所定の化学的基礎培地（ＣＤＭ）には、上述したＲＰＭＩ−１６４０が含まれる。前記ＣＤＭは、第一のＴＧＦβリガンド（例えば、上述したように、ＴＧＦβ又はアクチビン）を添加することができ、該リガンドは、ＳＭＡＤ２及びＳＭＡＤ３を介したシグナリング経路を刺激することができる。前記培地には、５〜５００ｎｇ／ｍｌの第一のＴＧＦβリガンド（例えば、アクチビン、好ましくは約５０ｎｇ／ｍｌ）を添加することが好ましい。

【0075】

ＡＤＥ細胞の集団は、４〜６日間、好ましくは約５日間培養することができ、肝臓性前駆細胞の集団を生成することができる。

【0076】

分化している細胞の集団において、１種以上の肝臓性前駆細胞マーカー及び／又は１種以上のＡＤＥ細胞マーカーの発現を、モニター及び／又は検出を行うことができる。これにより、培養時の分化の度合い（程度）を測定することが可能となる。

【0077】

肝臓性前駆細胞は、肝細胞、又は胆管細胞（ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃｙｔｅｓ）のいずれかへ分化する能力があり、両方の系統のマーカーを発現する。肝臓性前駆細胞は、以下の１種以上を発現することができる：α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、サイトケラチン１８（ＣＫ１８）、サイトケラチン１９（ＣＫ１９）、 肝細胞核因子４（ＨＮＦ４）、及び肝細胞核因子６（ＨＮＦ６）。１種以上のこれらのマーカーが検出されれば、それは、肝臓性の系統へ分化したことを示す。

【0078】

肝臓性前駆細胞の集団は、実質的に他の細胞種を含まなくても良い。例えば、前記集団は、培地中で培養した後、８０％以上、８５％以上、９０％以上又は９５％以上の肝臓性前駆細胞を含むことができる。

【0079】

好ましくは、肝臓性前駆細胞の集団は、他の細胞種の存在が十分排除されており、精製を必要としない。要すれば、前記肝臓性前駆細胞の集団は、任意の便宜的な技術によって精製することができる。

【0080】

上述したように倍地中で培養した後、肝臓性前駆細胞の集団は、培地から単離及び／又は除去することができる。そのための適切な技術については、周知である。

【0081】

肝臓性前駆細胞は、従来の技術を用いて、増殖させたり、培養中で維持したり、保存したり（例えば凍結保存）することができる。あるいは、肝臓性前駆細胞は、本明細書に記載したように、治療又は他の応用において使用することができる。

【0082】

例えば、肝臓性前駆細胞は、後述するように細胞ベースの治療法において使用することができる。

【0083】

幾つかの実施形態において、本発明の方法は、肝臓性前駆細胞を肝細胞に分化するように誘導するステップを含むことができる。分化を誘導するために、肝臓性前駆細胞の集団は、肝臓性成熟培地中で培養する。該培地は、所定の化学的基礎培地（ＣＤＭ）から構成され、追加的因子（好ましくは組み換え型ヒト因子）が添加されている。培養の結果、肝臓性前駆細胞は、誘導されて、肝細胞（ｈｅｐａｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ）へと成熟する。

【0084】

適切な所定の化学的基礎培地（ＣＤＭ）には、ＣＭＲＬ及びＨｅｐａｔｏｚｙｍｅ ＳＦＭが含まれる（Ｇｉｂｃｏ（商標）；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ）。

【0085】

ＣＭＲＬ基礎培地は、無血清基礎培地であり、該培地は周知であり、販売元から容易に入手できる（例えば、 Ｃａｔ Ｎｏ： １１５３００３７ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ； Ｐｒｏｄｕｃｔ ＃Ｃ０４２２ Ｓｉｇｍａ）。ＣＭＲＬ培地の組成は、表３に示す。

【0086】

Ｈｅｐａｔｏｚｙｍｅ ＳＦＭは、無血清基礎培地であり、該培地は販売元から入手できる（例えば、 Ｃａｔ Ｎｏ １７７０５； Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。

【0087】

所定の化学培地（ＣＤＭ）培地は、１種以上の因子を添加してもよく、該因子とは、肝芽細胞又は肝臓性前駆細胞から肝細胞への分化又は成熟を誘導する因子である。例えば、基礎培地には、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）又は上皮成長因子（ＥＧＦ）を添加することができる。

【0088】

肝細胞成長因子（ＨＧＦ）（ＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ： ３０８２， 核酸配列 ＮＭ＿０００６０１．４ ＧＩ： ５８５３３１６８， アミノ酸配列 ＮＰ＿０００５９２．３ ＧＩ： ３３８５９８３５）は、Ｓ１ペプチダーゼのプラスミノーゲン・サブファミリーのメンバーである間充織由来の分裂促進因子である。ＨＧＦは、ルーチンの組み換え技術を用いて生成することができ、又は販売元から入手することができる（例えば、 ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ Ｉｎｃ ＮＪ ＵＳＡ）。便宜上、培地中のＨＧＦの濃度は、２〜２００μｇ／ｍｌであってもよく、好ましくは約２０μｇ／ｍｌであってもよい。

【0089】

上皮成長因子（ＥＧＦ）（ＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ： １９５０， 核酸配列 ＮＭ＿００１１７８１３０．１ ＧＩ： ２９６０１１０１２ アミノ酸配列 ＮＰ＿００１１７１６０１．１ ＧＩ： ２９６０１１０１３； Ｒｅｙｎｏｌｄｓ， Ｂ． Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １２： ４５６５−４５７４ （１９９２））は、成長因子であり、該因子の受容体（ＥＧＦＲ）への結合を通して増殖及び分化を制御することができる。ＥＧＦは、ルーチンの組み換え技術を用いて生成することができ、又は販売元から入手することができる（例えば、 ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ Ｉｎｃ ＮＪ ＵＳＡ， Ｓｔｅｍｇｅｎｔ Ｉｎｃ ＵＳＡ）。便宜上、培地中のＥＧＦの濃度は、２〜２００μｇ／ｍｌであってもよく、好ましくは約２０μｇ／ｍｌであってもよい。

【0090】

また、所定の化学培地（ＣＤＭ）培地は、１種以上の因子を添加してもよく、該因子は、肝細胞の分化及び成熟を誘導し、例えば、オンコスタチン−Ｍ等が挙げられる。オンコスタチン−Ｍ（ＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ： ５００８， 核酸配列 ＮＭ＿０２０５３０．３ ＧＩ： ２８１７８８６２， アミノ酸配列 ＮＰ＿０６５３９１．１ ＧＩ： １００９２６２１）は、ＩＬ−６ファミリーのサイトカインである。オンコスタチン−Ｍは、ルーチンの組み換え技術を用いて生成することができ、又は販売元から入手することができる（例えば、 Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ， ＭＮ ＵＳＡ； Ａｂｃａｍ Ｌｔｄ， ＵＫ）。便宜上、培地中のオンコスタチン−Ｍの濃度は、１〜１００μｇ／ｍｌであってもよく、好ましくは約１０μｇ／ｍｌであってもよい。

【0091】

肝臓性前駆細胞の集団は、１０〜４０日間、好ましくは約２５日間培養することができ、肝細胞の集団を生成することができる。

【0092】

肝細胞は、以下の１種以上を発現することができる：アルブミン（Ａｌｂｕｍｉｎ）、α１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）、シトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）（例えば、Ｃｙｐ３Ａ４、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｃ９及びＣＹＰ２Ｄ６）、第ＩＸ因子、アポリポプロテインＡ２（ａｐｏｐｏｌｉｐｒｏｔｅｉｎ）、ＣＥＢＰα及びトランスチレチン。

【0093】

幾つかの実施形態において、肝細胞は、１種以上の前駆細胞マーカー（例えば、ＡＦＰ、ＣＫ１８及びＳｏｘ１７）を発現しなくともよい。

【0094】

前記細胞集団内で、１種以上の肝臓性前駆細胞マーカー及び／又は１種以上の肝細胞マーカーの発現は、モニター及び／又は検出を行うことができる。例えば、肝細胞の集団による、アルブミン及び／又はα１−アンチトリプシンの発現又は製造を測定することができる。これにより、培養集団中での分化の度合いを測定又は及び／又はモニターすることが可能となる。細胞マーカーの発現は、任意の適切な技術によって、測定することができ、該技術としては、免疫細胞化学、免疫蛍光、ＲＴ−ＰＣＲ、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、及び酵素的分析が含まれる。

【0095】

集団において、１種以上の肝細胞の機能を実践する細胞の能力を、モニター及び／又は測定することができる。例えば、以下の１種以上を行う細胞の能力をモニター及び／又は測定することができる：解毒、グリコーゲン貯蓄、ＡＡＴ又はアルブミンの分泌、胆汁の製造、トロンボポイエチンの製造、アンギオテンシノゲンの製造、アンモニアから尿素への変換（尿素サイクル）、コレステロール合成、グリコーゲン分解、グリコーゲン合成、及び脂質生成。

【0096】

肝細胞の集団は実質的に他の細胞種を含まなくても良い。例えば、前記集団は、培地中で培養した後、肝細胞を、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上含むことができる。集団中の肝細胞の存在又は割合は、上述したように、アルブミン及び／又はα１−アンチトリプシンの発現を通して測定することができる。

【0097】

好ましくは、肝細胞の集団は、他の細胞種の存在が十分排除されており、精製を必要としない。要すれば、肝細胞の集団は、ＦＡＣＳを含む任意の便宜的な技術によって精製することができる。

【0098】

本明細書に記載の方法において任意の段階で生成されたＡＤＥ細胞、肝臓性前駆細胞、及び／又は肝細胞は、単離及び／又は精製することができる。細胞は、当業者に知られた任意の技術を用いて、集団中の他の細胞種から分離することができる。該技術としては、後述するが以下に基づいたものが含まれる：抗体による細胞外エピトープの認識、及び磁気ビーズ又は蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ、細胞外領域の特徴的マーカーに対する抗体を使用することを含む）。

【0099】

本明細書に記載の方法で生成された肝細胞の集団は、標準的なほ乳動物の細胞培養技術を用いて、増殖、培養、又は維持することができる。

【0100】

幾つかの実施形態において、本明細書に記載の方法で生成された肝細胞の集団は、保存することができ、例えば、凍結乾燥及び／又は凍結保存などがある。

【0101】

肝細胞の集団は、他の試薬と混合してもよく、例えば、緩衝剤、キャリア、希釈剤、保存薬（防腐剤）又は医薬的に適用可能な賦形剤が挙げられる。適切な試薬については、後で更に詳述する。

【0102】

上述したように、病気特有のｉＰＳ細胞を用いて肝細胞を生成することができ、生成された細胞は、肝臓病に関連した表現型（例えば、ＩＭＤ）を示す。病気に関連した表現型を有する肝細胞は、病気に関連した１種以上の病理を示すことができる。

【0103】

本明細書に記載の方法は、肝細胞の集団において、１種以上の病理を検出又は測定するステップを含むことができる。

【0104】

病理には以下の１種以上の事象を含めることができる：異常な成長、アポトーシスの上昇、異常な遺伝子発現；グルカゴン刺激に対する異常な応答；蛋白質の凝集又は重合化（ポリマー化）；ＥＲ内での蛋白質封じ込め；コレステロール取り込み；脂質及び／又はグリコーゲン蓄積；乳酸の生成；、及び前記肝細胞の集団における上述した１種以上の肝細胞の機能の欠陥。

【0105】

病理を有する肝細胞を生成する方法は以下のステップを含むことができる：
上述したように、ｄｓ−ｉＰＳ細胞の集団をインビトロで肝臓へ分化することを誘導するステップ。
これにより、病理を有する肝細胞の集団を生成するステップ。

【0106】

ｄｓ−ｉＰＳ細胞からの分化を開始した後、ｄｓ−ｉＰＳ細胞由来の肝細胞は、１０日、２０日、４０日、又は複数日以内に病理を示すことができる。

【0107】

一旦生成されると、病気の表現型（例えば、ＩＭＤ表現型）を有する肝細胞は、例えば、スクリーニングにおいて使用するために、培養、増殖、及び維持することができる。上述したように、病気の表現型を有する肝細胞を維持する方法は、次のステップを含むことができる：病気の表現型有し、且つｄｓ−ｉＰＳ細胞に由来する肝細胞の集団を培養するステップ。

【0108】

本発明の別態様は、上述した方法によって生成され、そして単離された肝細胞又は肝臓性前駆細胞の集団を提供することである。

【0109】

前記集団は、肝細胞又は肝臓性前駆細胞を８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上含むことができる。

【0110】

本明細書に記載の方法で生成された肝細胞は、成熟肝細胞に特有の１種以上の機能、又は機能的特徴を示すことができる。例えば、肝細胞は、グリコーゲン及びＬＤＬ、分泌ＡＡＴ及び／又はアルブミンを蓄えることができ、ＣｙｔＰ４５０経路を介して薬剤を代謝することができ、並びに、肝細胞特有のＡｐｏＡＩＩプロモーターを制御してＧＦＰ蛋白質を発現することができる。肝細胞は、胆汁、トロンボポイエチン、アンギオテンシノゲン、尿素及びコレステロールを１種以上生成することができ；、並びに、グリコーゲン分解、グリコーゲン合成及び脂質生成のうち１種以上を行うことができる。

【0111】

幾つかの実施形態において、肝細胞は、成熟した成人肝細胞に完全に分化しなくともよい。そして、肝細胞は、１種以上の前駆細胞マーカー（例えば、ＡＦＰ）を発現し続けてもよく、減少したレベルでＡＬＢを発現してもよく、及び／又は成熟成人肝細胞と比べると低いＣｙｐ３Ａ４活性を示してもよい。

【0112】

肝細胞は、以下の特徴を１種以上随時示すことができる：二核性；グリコーゲン貯蔵；頂部の微小突起（ａｐｉｃａｌ ｍｉｃｒｏｐｒｏｔｒｕｓｉｏｎｓ）；粗面小胞体及び滑面小胞体（ＥＲ）、並びに顕著な（ｐｒｏｍｉｎｅｎｔ）ゴルジ体。

【0113】

本明細書に記載の方法で生成された肝細胞又は肝臓性前駆細胞は、ｉＰＳ細胞を生成するために使用した外因性の再プログラミング因子を発現しない（レトロウイルス性の転移遺伝子として、細胞内に依然として存在している可能性があるが）。

【0114】

肝細胞又は肝臓性前駆細胞の集団は、ヒト又は動物の身体の治療（例えば、損傷した又は機能不全の肝臓性組織を有する患者の治療）の方法において使用することができる。また、前記集団は、損傷した又は機能不全の肝臓性組織の治療において使用するための医薬の製造において使用することができる。損傷した又は機能不全の肝臓性組織を有する個体は、以下の症状を有してもよい：肝炎（例えば、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型、Ｇ型又はＫ型の肝炎）、肝硬変、肝臓細胞の癌、非アルコール性脂肪性肝炎、薬剤誘発肝臓損傷、アルコール性肝疾患、自己免疫性の肝疾患若しくは遺伝的代謝異常（例えば、α１アンチトリプシン欠損）、糖原病（例えば糖原病１ａ型）、家族性高コレステロール血症、遺伝性高チロシン血症、クリグラー・ナジャール症候群、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損、又は第ＩＸ因子欠損若しくは他の血友病、ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、Ｄｕｂｉｎ−Ｊｏｈｎｓｏｎ症候群、家族性アミロイドーシス、及びレフサム病。治療への応用を目的として、肝細胞は、臨床のグレードの肝細胞であることが好ましい。

【0115】

損傷した又は機能不全の肝臓性組織を有する患者を治療する方法は以下のステップを含むことができる：
上述したように生成された肝細胞又は肝臓性前駆細胞の集団を、該集団を必要とする個体に投与するステップ。

【0116】

前記肝細胞の集団は、移植することもでき、注入することもでき、或いは、個体の臓器に投与することもできる。これらのための適切な技術は周知である。

【0117】

肝細胞の集団は、前記個体から得た細胞に由来するｉＰＳ細胞から生成することができる。幾つかの実施形態において、ｉＰＳ細胞における病気に関連した変異又は遺伝的欠損は、上述したように、肝細胞又は肝臓性前駆細胞へ分化する前に、修復することができる。

【0118】

また、本発明の態様は、医薬組成物、医薬、薬剤、又は他の組成物にも拡張され、これらは、本明細書に記載の方法で生成された肝細胞又は肝臓性前駆細胞を含む。また、本発明の方法では、上述したように、例えば、損傷した又は機能不全の肝臓性組織を治療（予防的な治療も含めることができる）を目的として、こうした肝細胞又は肝臓性前駆細胞を患者に投与するステップを含む。そして、医薬組成物を製造するための本発明の方法は、医薬的に適用可能な賦形剤、ビヒクル又はキャリア、そして、随意的に１種以上の他の成分を、こうした肝細胞又は肝臓性前駆細胞と混合するステップを含む。

【0119】

個体に投与される肝細胞又は肝臓性前駆細胞は、遺伝的に操作して、治療用分子（例えば、薬剤又は成長因子）を生成することができる（Ｂｅｈｒｓｔｏｃｋ Ｓ ｅｔ ａｌ， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００６ Ｍａｒ；１３（５）：３７９−８８， Ｋｌｅｉｎ ＳＭ ｅｔ ａｌ， Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００５ Ａｐｒ；１６（４）：５０９−２１）。

【0120】

本発明は、本発明に従い生成された肝細胞又は肝臓性前駆細胞と、１種以上の追加的成分とを含有する組成物を提供する。本発明に従った医薬組成物、及び本発明に従った使用を目的とする医薬組成物は、前記肝細胞のほかに以下の物を含むことができる：医薬的に適用可能な賦形剤、キャリア、緩衝剤、保存薬（防腐剤）、安定化剤、抗酸化剤、又は当業者に周知の他の物質。こうした物質は、毒性を持たない物にすべきであり、前記肝細胞の活性と干渉しない物にすべきである。キャリア、又は他の物質の正確な特性は、投与経路に依存するであろう。

【0121】

液体医薬組成物は、一般的に、水、石油、動物性油若しくは植物性油、鉱物油、又は合成油などの液体キャリアが含まれる。また、以下の物も含めることができる：生理食塩水溶液、組織培地若しくは細胞培養培地、デキストロース又は他の糖類溶液、グリコール（例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、又はポリエチレングリコール）。

【0122】

組成物は、非経口的に許容可能な水性溶液の形態であってもよく、感染源を含まず、適切なｐＨ、等張性及び安定性を有する。当分野の関係者であれば、例えば、等張性のビヒクル（例えば、塩化ナトリウム、リンゲル液、乳酸リンゲル液）を用いて適切な溶液を調製することは十分可能である。組成物は、人工的な脳脊髄液を用いて調製することができる。

【0123】

肝細胞又は肝臓性前駆細胞は、任意の公知技術によって、患者に移植することができる（例えば、 Ｌｉｎｄｖａｌｌ， Ｏ． （１９９８） Ｍｏｖ． Ｄｉｓｏｒｄ． １３， Ｓｕｐｐｌ． １：８３−７； Ｆｒｅｅｄ， Ｃ．Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， （１９９７） Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ， ６， ２０１−２０２； Ｋｏｒｄｏｗｅｒ， ｅｔ ａｌ．， （１９９５） Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ３３２， １１１８−１１２４； Ｆｒｅｅｄ， Ｃ．Ｒ．，（１９９２） Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ３２７， １５４９−１５５５， Ｌｅ Ｂｌａｎｃ ｅｔ ａｌ， Ｌａｎｃｅｔ ２００４ Ｍａｙ １；３６３（９４１９）：１４３９−４１）。特に、細胞懸濁液は、患者の門脈に注入することができる。

【0124】

本発明に従った組成物の投与は、「予防としての有効量」又は「治療としての有効量」であることが好ましい（場合によっては、予防を治療とみなすこともできるかもしれないが）。そして、該量とは、個体に対して利点を示すのに十分な量である。実際の投与する量、割合、及び時間変化は、治療対象の性質や深刻度によるだろう。治療の処方箋（例えば、投与量等の決定）については、一般的に実践する者、又は他の医療ドクターの責任の範囲内である。

【0125】

組成物は、治療する症状に応じて、単独で投与することもでき、又は他の治療と組み合わせて同時に若しくは連続のいずれかで投与することができる。

【0126】

幾つかの実施形態において、本明細書に記載の方法で生成された集団中における肝細胞又は肝臓性前駆細胞は、正常な表現型を示すことができる。例えば、細胞は、肝臓の損傷又は機能不全を有する個体から得ることができ、ｉＰＳ細胞を生成するために使用することができる。幾つかの実施形態において、ｉＰＳ細胞は、変異や遺伝的な欠陥を含んでいてもよい。また、該変異又は欠陥は、従来の組み換え技術を用いて修復し、正常な表現型を有するｉＰＳ細胞を生成することができる。正常な表現型を有する肝細胞又は肝臓性前駆細胞は、本明細書に記載のように、これらのｉＰＳ細胞から生成することができる。そして、患者に移植して、肝臓の損傷又は機能不全を修復又は改善することができる。

【0127】

他の実施形態では、本明細書に記載の方法で生成された集団中の肝細胞又は肝臓性前駆細胞は、病気の表現型を示しても良い。例えば、細胞は、肝臓の損傷又は機能不全を有する個体から得ることができ、病気特有のｉＰＳ（ｄｓ−ｉＰＳ）細胞を生成するために使用することができる。病気の表現型を有する肝細胞又は肝臓性前駆細胞は、本明細書に記載のように、これらのｉＰＳ細胞から生成することができる。そして、これらの細胞は、正常な表現型を取り戻すために処理することができる。例えば、病気の表現型の原因となる遺伝的変異又は遺伝的欠陥は、インビトロで修復することができる。単離したほ乳動物の細胞内で、遺伝的変異又は欠陥を修復するための様々な技術が利用可能である。一旦、欠陥又は変異が修復され、正常な表現型を取り戻すと、肝細胞又は肝臓性前駆細胞は、患者に移植することができ、肝臓の損傷又は機能不全を修復又は改善することができる。

【0128】

上述した方法で生成された肝細胞の集団は、試験化合物と肝臓細胞との相互作用をモデリングする際に有用となる可能性ある（例えば、毒性スクリーニングにおける、肝臓病のモデリング、及び潜在的な治療用効果を有する化合物のためのスクリーニング）。

【0129】

化合物をスクリーニングする方法は、以下のステップを含むことができる：
上述の方法によって生成される肝細胞の集団を、試験化合物に接触させるステップ；及び
前記肝細胞に対する試験化合物の効果、及び／又は、試験化合物に対する前記肝細胞の効果を測定するステップ。

【0130】

肝細胞は、正常の又は病気の表現型を示すことができる。

【0131】

試験化合物が無い場合と比べた試験化合物が有るときの肝細胞の成長又は生存率を測定することができる。成長又は生存率が低下することは、化合物が肝臓毒性の効果があることを示す。

【0132】

試験化合物が無い場合と比べた試験化合物が有るときの遺伝子発現を測定できる。例えば、以下の遺伝子の発現を測定することができる：アルブミン、α１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）、シトクロームＰ４５０酵素（例えば、Ｃｙｐ３Ａ４、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｃ９及びＣＹＰ２Ｄ６）、第ＩＸ因子、アポリポプロテインＡ２、ＣＥＢＰα及び／又はトランスチレチン。発現が低下することは、化合物が肝臓毒性の効果を有することを示す。遺伝子発現は、核酸レベルについて、例えばＲＴ−ＰＣＲによって、測定することができる。蛋白質レベルについてであれば、免疫学的な技術（例えば、ＥＬＩＳＡ）又は、活性アッセイによって、測定することができる。シトクロームＰ４５０アッセイ（例えば、ルミネッセンスのアッセイ、蛍光性のアッセイ、発色性のアッセイ）は周知であり、販売元から入手できる。

【0133】

肝細胞による試験化合物の代謝、変性、又は分解を測定することができる。幾つかの実施形態において、前記試験化合物の量若しくは濃度、及び／又は前記試験化合物の代謝産物における変化は、ある時間の範囲にわたって、連続的又は１以上の時間ポイントのいずれかで、決定又は測定することができる。例えば、前記試験化合物の量又は濃度の減少、及び／又は前記試験化合物の代謝産物の量若しくは濃度の増加を、決定又は測定することができる。幾つかの実施形態において、前記試験化合物の量若しくは濃度、及び／又は代謝産物における変化速度を決定（測定）することができる。試験化合物又は代謝産物の量を測定するための適切な技術として、質量分析法が挙げられる。

【0134】

該方法は、試験化合物についての、インビボ半減期、毒性、効能、又は他のインビボ特性を測定する際に、有用となる可能性がある。

【0135】

試験化合物が無い場合と比べて試験化合物が有るときとで、肝細胞の１種以上の機能を決定及び／又は測定することができる。例えば、以下の１種以上の事を行うための肝細胞の機能を決定及び／又は測定することができる：有機化合物の解毒、グリコーゲン貯蓄、ＡＡＴ又はアルブミンの分泌、胆汁の製造、トロンボポイエチンの製造、アンギオテンシノゲンの製造、アンモニアから尿素への変換、コレステロール合成、グリコーゲン分解、グリコーゲン合成、及び脂質生成。

【0136】

試験化合物が無い場合と比べて試験化合物が有るときで、１種以上のこれらの機能を実行するための肝細胞の能力が低下した場合、それは、化合物が肝臓毒性の効果を有することを示す。

【0137】

肝臓病の治療において有用な化合物をスクリーニングするための方法は、以下のステップを含むことができる：
上述した方法で生成された（病気の表現型を示す）肝細胞の集団を、試験化合物と接触させるステップ；及び
前記肝細胞に対する試験化合物の効果を決定するステップ。

【0138】

前記肝細胞は、病気の表現型を示すことができる。肝細胞において、１種以上の病理に対する試験化合物の効果を決定することができる。例えば、以下の１種以上の事象に対する試験化合物の効果を決定することができる：細胞の成長、遺伝子発現、蛋白質の凝集又は重合化；ＥＲ内での蛋白質封じ込め；コレステロール取り込み；脂質及び／又はグリコーゲン蓄積；並びに乳酸の生成。

【0139】

そのための適切な技術は周知であり、免疫染色、質量分析法、ウェスタンブロット法、及び酵素的アッセイが挙げられる。

【0140】

試験化合物が無い場合と比べて試験化合物が有るときで、肝細胞中の１種以上の病理が減少又は改善された場合、それは、肝臓病の治療（例えば遺伝的代謝異常）において、試験化合物が有用となる可能性があることを示すことができる。遺伝的代謝異常の具体例については、既に述べた通りである。

【0141】

本明細書に記載の方法は、肝細胞における１種以上の病理（例えばＩＭＤ病理）を減少又は改善させる試験化合物を特定するステップを含むことができる。病理を減少させる化合物は、肝臓病の治療のための治療薬の開発において有用となる可能性がある。

【0142】

他の実施形態では、肝細胞は、正常な表現型を示すことができる。また、該肝細胞は、一般的な集団と比べて、例えば、肝臓病に対するリスクが高い、又は肝臓病の影響を非常に受けやすい個体に由来する物であっても良い。以下の１種以上の事象に対する試験化合物の効果を測定することができる：細胞の成長、又は遺伝子発現（例えば、シトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）の発現（例えば、Ｃｙｐ３Ａ４、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｃ９、及びＣＹＰ２Ｄ６）。肝細胞の１種以上の機能に対する試験化合物の効果を測定することができる。例えば、試験化合物が無い場合と比べて試験化合物が有るときとで、以下の１種以上を行う肝細胞の機能について、決定及び／又は測定することができる：有機化合物の解毒、グリコーゲン貯蓄、ＡＡＴ又はアルブミンの分泌、胆汁の製造、トロンボポイエチンの製造、アンギオテンシノゲンの製造、アンモニアから尿素への変換、コレステロール合成、グリコーゲン分解、グリコーゲン合成、及び脂質生成。

【0143】

試験化合物が無い場合と比べて試験化合物が有るときに、遺伝子発現、成長及び／又は１種以上の機能が増加した場合には、前記化合物が肝臓病（例えば、肝炎（例えば、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型、Ｇ型又はＫ型の肝炎）、肝硬変、肝臓細胞の癌、非アルコール性脂肪性肝炎、薬剤誘発肝臓損傷、アルコール性肝疾患、又は自己免疫性の肝疾患）の治療において有用である可能性を示す。

【0144】

肝細胞において１種以上の病理を減少又は改善する化合物を同定した後、前記化合物は、該化合物の医薬的特性を最適化するために改変することができる。こうした改変は、周知のモデリング技術を用いて行うことができる。

【0145】

肝細胞において１種以上の病理（例えば、ＩＭＤ病理）を減少又は改善する能力を有する物として、１種以上の初期スクリーニングを用いて同定された試験化合物は、１種以上の２次スクリーニングを用いて更に評価することができる。

【0146】

２次スクリーニングでは、インビトロ及び／又はインビボ（例えば、動物モデルにて）での生物学的機能又は活性を試験することを含むことができる。例えば、病気の動物モデルにおいて、肝臓病に関連する１種以上の症状又は病理を減少又は改善するための試験化合物の能力を測定することができる。

【0147】

肝細胞において、１種以上の病理を減少又は改善する試験化合物を同定した後、前記化合物を単離及び／又は精製することができる。或いは、組み換え発現又は化学合成等の従来の技術を用いて、合成することができる。更に、化合物は、組成物（例えば、医薬、医薬組成物又は薬剤）の調製（即ち、製造又は配合）において製造又は使用することができる。これらの組成物は肝臓病の治療を目的として個体に投与することができる。

【0148】

本明細書に開示した内容を参照すれば、本発明に係る更なる様々な態様及び実施形態があることが当業者にとって明らかであろう。

【0149】

本明細書で記述した全ての文献は、参照により、その内容全体を本明細書に組み込む。

【0150】

本明細書で使用する「及び／又は」という表現（該表現において、「及び」を「並びに」に置き換えた場合や、「又は」を「若しくは」に置き換えた場合も同様）は、特定の二つの特性又は成分のうちのそれぞれであって、他方の要素を伴うもの、又は伴わないものである旨を特定して開示するものとして解釈すべきものである。例えば、「Ａ及び／又はＢ」という表現は、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、及び（ｉｉｉ）ＡとＢ、のそれぞれが、ちょうど本明細書において個別に列挙されたかのように、特定して開示するものとして解釈すべきものである。

【0151】

特記しない限り、上述した特徴に関する記載や定義は、本発明のあらゆる特定の態様や実施形態に限定されない。そして、記載した全ての態様及び実施形態に等しくあてはまるものである。

【0152】

本発明の特定の態様及び実施形態については、後述する図面及び表を参照しながら、例示的な意味合いで以下述べることとする。

【図面の簡単な説明】

【0153】

【図1】図１〜５は、病気特有のｈｉＰＳＣ（ｄｈｉＰＳＣ）からの肝細胞の生成を表す。図１は、ｄｈｉＰＳＣライブラリーを肝細胞へ分化させるために使用されるプロトコルの概要を表したフロー図を示す。

【図2】肝細胞の発生の鍵となる段階を表す（マーカーとなる）特定の蛋白質の発現を分析した免疫染色を示す（４日目 内胚葉：ＣＸＣＲ４、Ｓｏｘ１７及びｆｏｘＡ２；２０日目 肝臓性前駆細胞 ＣＫ１８、ＣＫ１９及びα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）；２５日目 胎児の肝細胞：アルブミン（ＡＬＢ、ａｌｂｕｍｉｎ）、ＡＦＰ及びα１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）。

【図3】ｄｈｉＰＳＣが肝細胞へと分化する鍵となる段階のマーカーとなる遺伝子の発現に関するリアルタイムＰＣＲ分析を表す。

【図4A】図４Ａ〜Ｆは、ｈＥＳＣ由来の決定的な内胚葉が胎児の肝細胞へ所定の培養条件で分化することを示す。図４Ａは、肝臓への分化を誘導するための条件において、２５日間、ＤＥ細胞を増殖させた際の肝細胞マーカーの発現を示す。

【図4B】図４Ｂは、ＦＡＣＳ分析を示しており、ｈＥＳＣ由来の胎児肝細胞（２５日目）において、アルブミン（ＡＬＢ）、α−１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）、及びα−１−フェトプロテイン（ＡＦＰ）が共発現していることを表している。

【図4C】図４Ｃは、ｈＥＳＣ由来の胎児肝細胞（２５日目）において、アルブミン（ＡＬＢ）、サイトケラチン（Ｃｙｏｋｅｒａｔｉｎ）１８（ＣＫ１８）、及びα−１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）の発現を免疫染色分析したものを示す。スケールバーは５０μｍである。

【図4D】図４Ｄは、ＥＬＩＳＡ分析を示しており、ｈＥＳＣ由来の胎児肝細胞の培養培地中でのα１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）及びアルブミンの分泌（Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ）を示す。

【図4E】図４Ｅは、ｈＥＳＣ由来の胎児肝細胞での、デキサメタゾン（ＤＥＸ）によるＣｙｐ３Ａ４の誘導活性（Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｃｙｐ３Ａ４ Ａｃｔｉｖｉｔｙ）を示す。

【図4F】図４Ｆは、ｈＥＳＣ由来の胎児肝細胞中において、コレステロールの取り込みを示すＤＩＬアッセイ、及びグリコーゲン貯蓄を示すＰＡＳ染色を示す。スケールバーは５０μｍである。

【図5】図５は、ＦＡＣＳ分析を示したものであるが、肝臓への分化２５日後でのアルブミンを発現する細胞の割合を表す。

【図6】ｄｈｉＰＳＣ由来の肝細胞（２５日目）を透過型電子顕微鏡によって形態学的に分析したものを示し、該分析は、（１）頂側微絨毛（ａｐｉｃａｌ ｍｉｃｒｏｖｉｌｌｉ）及び（２）グリコーゲン・ロゼット（ｒｏｓｅｔｔｅｓ）の存在を示す。ここに示した本データは、１つの系統（ｌｉｎｅ）（１患者；１系統）から採取したものであるが、同様の特徴を持つ全ての系統を代表するものである。

【図7】図７〜１０は、ｄｈｉＰＳＣを用いたα１−アンチトリプシン欠損（Ａ１ＡＴＤ）のインビトロ・モデリングを示す。図７は、１ＡＴＤ−ｄｈｉＰＳＣから分化した肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）が、初期のヒト肝細胞に特徴的な機能的活性を示すことを表した図であり、該特徴としては、以下のものが含まれる：細胞内アルブミン（Ａｌｂｕｍｉｎ）の存在、過ヨウ素酸シッフ染色（ＰＡＳ）で示されるグリコーゲン貯蓄（グリコーゲン，Ｇｌｙｃｏｇｅｎ）、蛍光標識低密度リポ蛋白質（ＤＩＬ）取込によって示される低密度リポ蛋白質コレステロール取り込み（ＬＤＬ取込、ＬＤＬ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、アルブミン分泌（Ａｌｂｕｍｉｎ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ、単位としてｎｇ／ｍｌ／日／１００万細胞）、及び活性を有するＣｙｔＰ４５０代謝（Ｃｙｐ３Ａ４活性、Ｃｙｐ３Ａ４ Ａｃｔｉｖｉｔｙ、単位としてＲＬＵ／ｍｌ／１００万細胞）。

【図8】免疫染色分析を示し、ミスフォールドされたポリマー性α１−アンチトリプシン（Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ＡＡＴ）の発現について示している。該分析では、以下の抗体を用いた：ポリマー特有の２Ｃ１抗体（中央パネル、緑色蛍光）；又は、α１−アンチトリプシンの全ての形態（Ａｌｌ ＡＡＴ）を検出する抗体（左側パネル、赤色蛍光）。該図で示しているのは、患者特有の肝細胞（Ａ１ＡＴＤ、上段）及びコントロールのｈｉＰＳＣ由来の肝細胞（コントロール、下段パネル）である。

【図9】Ａ１ＡＴＤであるｄｈｉＰＳＣ由来の肝細胞でのミクロソーム細胞内（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ）画分のエンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ Ｈ）消化を表す。ミスフォールドされたポリマー性α１−アンチトリプシン（ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ）蛋白質が小胞体内に滞在していることを裏付けている。ｎ＝３である。

【図10】ＥＬＩＳＡを示しており、全ての（ａｌｌ）、及びポリマー性（Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ）のα１−アンチトリプシン蛋白質の細胞内発現（ｃｅｌｌｓ）及び分泌（ｍｅｄｉｕｍ）を評価している。該評価は、患者特有の肝細胞（Ａ１ＡＴＤ）及びコントロールのｈｉＰＳＣ由来の肝細胞（ｃｏｎｒｏｌ）について、ＭＧ１３２で一晩プロテアソームの阻害（ｐｒｏｔｅｏｓｏｍａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）を行った後で行った。ｎ＝３である。縦軸の単位は、標準化させたスペクトル吸光度である。

【図11】図１１及び１２は、ｄｈｉＰＳＣを用いた家族性高コレステロール血症のインビトロ・モデリングを示す。図１１は、肝細胞（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）へと分化するＦＨ−ｄｈｉＰＳＣが初期のヒト肝細胞の機能的且つ活性的特徴を示すことを示す。該特徴としては、以下のものが含まれる：アルブミン（Ａｌｂｕｍｉｎ）の細胞内の存在、グリコーゲン貯蓄（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ）、アルブミン分泌（Ａｌｂｕｍｉｎ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ、単位としてｎｇ／ｍｌ／日／１００万細胞）、及び活性のあるＣｙｔＰ４５０代謝（Ｃｙｐ３Ａ４ Ａｃｔｉｖｉｔｙ、単位としてＲＬＵ／ｍｌ／１００万細胞）。

【図12】蛍光標識された低密度リポ蛋白質取込に関するＦＡＣＳ分析を示す。該分析では、ポジティブ・コントロール（ｃｏｎｔｒｏｌ，青の曲線）と比べて、ＦＨ−ｄｈｉＰＳＣ由来の肝細胞（ＦＨ， 赤の曲線）が低密度リポ蛋白質を効率的に取り込む能力が欠如していることを裏付ける。ＬＤＬ非存在下で増殖したｈｉＰＳＣをネガティブ・コントロール（ｕｎｓｔａｉｎｅｄ）として使用した。

【図13】図１３〜１７は、ｄｈｉＰＳＣを用いた糖原病１ａ型のインビトロ・モデリングを示す。図１３は、肝細胞へと分化するＧＳＤ−ｄｈｉＰＳＣが、初期のヒト肝細胞の機能的且つ活性的特徴を示すことを示す。該特徴としては、以下のものが含まれる：アルブミン（Ａｌｂｕｍｉｎ）の細胞内の存在、アルブミン分泌（Ａｌｂｕｍｉｎ Ｓｃｒｅｔｉｏｎ、単位としてｎｇ／ｍｌ／日／１００万細胞）、及び活性のあるＣｙｔＰ４５０代謝（Ｃｙｐ３Ａ４ Ａｃｔｉｖｉｔｙ、単位としてＲＬＵ／ｍｌ／１００万細胞）。

【図14】過ヨウ素酸シッフ染色を示す。コントロール被験体から生じたｈｉＰＳＣ由来の肝細胞（ｃｏｎｔｒｏｌ）と比べると、ＧＳＤ−ｄｈｉＰＳＣ由来の肝細胞（ＧＳＤ１ａ）では、細胞内グリコーゲンが過剰に蓄積していることが示される。ｎ＝３である。

【図15】ＢＯＤＩＰＹ染色を示す。コントロール被験体から生じたｈｉＰＳＣ由来の肝細胞（ｃｏｎｔｒｏｌ）と比べると、ＧＳＤ−ｄｈｉＰＳＣ由来の肝細胞（ＧＳＤ１ａ）では、細胞内脂質が過剰に蓄積していることが示される。ｎ＝３である。

【図16】ｄｈｉＰＳＣ由来の肝細胞が、グルカゴンによって転写ターゲットを適切にアップレギュレートしていることを示す。ＰＥＰＣＫ、Ｇ６Ｐ及びＩＧＦＢＰ１の発現についてのｑＲＴ−ＰＣＲ分析で示す。１００ｎＭのグルカゴン塩酸で刺激した後の時間として、０、１、２及び３時間後に分析した。ｎ＝３である。

【図17】コントロール被験体から生じたｈｉＰＳＣ由来の肝細胞（ｃｏｎｔｒｏｌ）と比べると、ＧＳＤ−ｄｈｉＰＳＣ由来の肝細胞（ＧＳＤ１ａ）は、より多くのラクテート（Ｌａｃｔａｔｅ）を分泌することを示す（ＧＳＤ１ａ）。該分泌は、細胞培養培地を２４時間回収して、ＥＬＩＳＡ分析を行って評価した時に示されたものである。ｎ＝３である。

【図18】ＰＩ３Ｋ阻害剤の具体例を示す。★印は標的物理療法で用いられる旨を表す（ｗｉｔｈ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｍｏｄａｌｉｔｙ）。

【図19a】ｃ−ｈｉＰＳＣ由来肝細胞様細胞において、Ａ１ＡＴの回復を機能的に分析したものを示す。図１９Ａは、ｃ−ｈｉＰＳＣから生じる肝細胞様細胞において、ポリマー性Ａ１ＡＴ蛋白質（Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ Ａ１ＡＴ）が存在しないこと示す免疫蛍光の結果を示す。全ての形態のＡ１ＡＴ（Ａｌｌ Ａ１ＡＴ）については左側パネル、ミスフォールドされたポリマー性 １２ Ａ１ＡＴについては、中央パネルに示した。

【図19b】図１９Ｂ及び１９Ｃは、ＥＬＩＳＡのデータを示す。Ａ１ＡＴＤ−ｈｉＰＳＣ（ＺＺ）、ｃｈｉＰＳＣ（ＲＲ）及びコントロールｈｉＰＳＣ（＋＋）に由来する肝細胞様細胞において、ポリマー性Ａ１ＡＴ蛋白質に関する細胞内レベル（１９Ｂ）及び分泌レベル（１９Ｃ）を評価した。単位は、μｇ・ｍｇ^-1である。

【図19c】図１９Ｂ及び１９Ｃは、ＥＬＩＳＡのデータを示す。Ａ１ＡＴＤ−ｈｉＰＳＣ（ＺＺ）、ｃｈｉＰＳＣ（ＲＲ）及びコントロールｈｉＰＳＣ（＋＋）に由来する肝細胞様細胞において、ポリマー性Ａ１ＡＴ蛋白質に関する細胞内レベル（１９Ｂ）及び分泌レベル（１９Ｃ）を評価した。単位は、μｇ・ｍｇ^-1である。

【図19d】図１９Ｄは、Ａ１ＡＴに関するエンドグリコシダーゼＨ（Ｅ）消化及びペプチド：Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ（Ｐ）消化を示す。これらは、未修復（ＺＺ）、修復（ＲＲ）及びコントロール（＋＋）のｈｉＰＳＣ由来の肝細胞様細胞（上段パネル）及び対応する培養培地（下段パネル）から免疫沈降を行った。Ｃｅｌｌは細胞内、Ｍｅｄｉｕｍは培地を示す。

【図19e】図１９Ｅは、キモトリプシンＥＬＩＳＡを示す。該図では、修復された細胞（ＲＲ）は、Ａ１ＡＴ酵素阻害活性を有しており、該活性は未修復細胞（ＺＺ）よりも優れており、成人肝細胞に近いことを示している。

【図19f】図１９Ｆ及び１９Ｇは、移植した肝臓片に関する免疫蛍光を示し、ヒトアルブミン（図１９Ｆ）及びＡ１ＡＴ（図１９Ｇ）を検出している。ＤＮＡは、ＤＡＰＩで対照染色した。

【図19g】図１９Ｆ及び１９Ｇは、移植した肝臓片に関する免疫蛍光を示し、ヒトアルブミン（図１９Ｆ）及びＡ１ＡＴ（図１９Ｇ）を検出している。ＤＮＡは、ＤＡＰＩで対照染色した。

【図19h】図１９Ｈは、ＥＬＩＳＡを示し、各マウスについて長期間にわたってマウス血清中のヒトアルブミンを測定した。アスタリスクは、マウスに対して組織分析が行われたことを示す。図１９ａ〜ｈ中に記載されたスケールバーは１００μｍである。図１９のデータのＢ、Ｃ及びＥは、平均±標準偏差（ｎ＝３）として示した。Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ検定を行った。ＮＳは有意差なし（ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）を意味する。

【実施例】

【0154】

方法
ｈｉＰＳＣ派生物及び培養物
倫理的な承認と患者の同意を適切に得た後、８ｍｍの皮膚パンチの生体検査材料を、Ａｄｄｅｎｂｒｏｏｋｅ病院のボランティア患者から得た（Ｅｔｈｉｃｓ ｒｅｆ ｎｕｍｂｅｒ ０８／Ｈ０３１１／２０１； Ｒ＆Ｄ Ｎｏ： Ａ０９１４８５）。標準化された屋内（ｉｎ ｈｏｕｓｅ）プロトコルを用いて、ＧＭＰ条件で、提供された組織から線維芽細胞を生成した。そして、標準的な線維芽細胞培養培地中で増殖させた。更なる線維芽細胞サンプルをＩＮＳＥＲＭ（フランス）及びＣｏｒｉｅｌｌ Ｂｉｏｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙから得た。全部で５つの異なる病気サンプルを、７人の異なる患者から得た。詳細を表１に示す。モロニーマウス白血病ウイルス由来のベクター（該ベクターは、４種類のヒト遺伝子Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ及びＫｌｆ４のうち１つのコーディング配列をそれぞれ含有する）と、対応するウィルス性粒子とをＶｅｃｔａｌｙｓ社（Ｔｏｕｌｏｕｓｅ， フランス）が生成した。そして、感染効率（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ）を１０にして、線維芽細胞に感染させるために使用した。これらの技術については、山中氏及び共同研究者が当初記載した通りであり、また、本発明者が近年記載したとおりである［２９］。一旦誘導されると、ｈｉＰＳＣは、放射状マウス供給物（ｆｅｅｄｅｒｓ）を含有するプレート上で、そして、標準的なｈＥＳＣ培養条件（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ［ＫＳＲ］， （Ｇｉｂｃｏ） ＋ ＦＧＦ２ （４ｎｇ／ｍｌ； Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．， ミネアポリス））で培養される。

【0155】

ＲＮＡ抽出及びリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応

【0156】

ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ， Ｈｉｌｄｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、ｈｉＰＳＣ又は分化した前駆細胞から、トータルＲＮＡを抽出した。各サンプルは、ＤＮＡの混入をさけるため、ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）で処理した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ 逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、トータルＲＮＡの各サンプル０．６μgを逆転写した。リアルタイム・ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の反応混合物を、文献の記載に従って調製した（ＳｅｎｓｉＭｉＸ Ｐｒｏｔｃｏｌ； Ｑｕａｎｔａｃｅ， Ｌｏｎｄｏｎ）。そして、９４℃で５分間変性させた。その後、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、そして、７２℃で３０秒というサイクルで反応させた。４０サイクルが完了した後、続いて、７２℃で１０分間、最後の伸長反応を行った。プライマー配列については別途記載の通りである［１６］。リアルタイムＰＣＲ反応は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＭｘ３００５Ｐ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）を用いてトリプリケートで行った。そして、同一の反応実験内（ｔｈｅ ｓａｍｅ ｒｕｎ）で、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ（ＰＢＧＤ）に対して標準化を行った。ＱＰＣＲデータは、３件の独立した実験の平均として表され、エラーバーは、平均値の標準誤差を表す。リアルタイムＰＣＲ分析用に用いるプライマーは、最後のところに表として記載した。

【0157】

免疫蛍光
ｈｉＰＳＣ、又はこれらから分化した前駆細胞は、４％パラホルムアルデヒド中で、２０分間、４℃で固定した。その後、ＰＢＳで３回洗浄した。１０％のロバ血清（Ｓｅｒｏｔｅｃ Ｌｔｄ．）を含有するＰＢＳ中で、２０分間室温で細胞をインキュベートした。続いて、１％のロバ血清を含有するＰＢＳ中で希釈した一次抗体を用いて一晩４℃でインキュベートした。用いた抗体（及び希釈率）は下記の通り：Ｏｃｔ−４ （１：１００； Ａｂｃａｍ ａｂ１８９７６ ［ケンブリッジ， Ｕ．Ｋ．］ Ｓｏｘ２ （１：１００； Ａｂｃａｍ ａｂ１５８３０）， Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ （１：１００； Ａｂｃａｍ ａｂ２０６８０ ｏｒ Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）， Ｓｏｘ１７ （Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）， ｆｏｘＡ２ （１：５０； Ａｂｃａｍ ａｂ５０７４）， ＧＡＴＡ４ （１：２５０； Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．）， ＧＡＴＡ６ （１：２００； Ａｂｃａｍ ａｂ２２６００ ｏｒ Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．）， ＣＸＣＲ４ （１：１００； Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ． 又は ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）， ＣＫ１８ （１：５０， Ｄａｋｏ） ＣＫ１９ （１：５０， Ｄａｋｏ）， アルブミン （１：１００； Ｒ＆Ｄ１４５５ ）， α−フェトプロテイン （１：３００， Ｄａｋｏ Ａ００８ ）， α１−アンチトリプシン （１：１００， Ｓｉｇｍａ Ａ０６０８）。その後細胞はＰＢＳで三回洗浄した。そして、以下の物と結合したＴｅｘａｓ Ｒｅｄ又はフルオレセインイソチオシアネート結合抗体を用いて２時間室温でインキュベートした：マウス ＩｇＧ （Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ； １％のロバ血清を含有したＰＢＳで１：２００で希釈）、又はウサギ ＩｇＧ （Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ， ＭＥ； ロバ血清を含有したＰＢＳで１：４００で希釈） 又はヤギ ＩｇＧ （Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；ロバ血清を含有したＰＢＳで１：４００で希釈）。結合しなかった二次抗体は、ＰＢＳで三回洗浄して除去した。Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８を最初の洗浄液に添加した（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ； １：１０，０００）。脂質を視覚化するために、脂質特異的な染色であるＢＯＤＩＰＹ （ボロン−ジピロメテン； ＢＯＤＩＰＹ（登録商標） ４９３／５０３ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．Ｄ−３９２２）を用いた。

【0158】

奇形腫
ｈｉＰＳＣは、移植する直前に回収した。約１０⁶個の細胞を、８週齢のＣ．Ｂ．−１７／ＧｂｍｓＴａｃ−ｓｃｉｄｂｇＤＦＮ７雄マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｍ＆Ｂ， ｅｊｂｙ， Ｄｅｎｍａｒｋ）の精嚢（ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ ｃａｐｓｕｌｅ）の下に接種した。該マウスは、ケージに入れ、温度を２０℃−２４℃、５０％の室内湿度、１４時間と１０時間との明暗サイクル、適宜飼料と水を与えて、維持した。６０日後にマウスを犠牲にし、接種をした精巣をレーザーブレードで均等な切片にカットした。材料を４％中性緩衝性のホルムアルデヒドで一晩固定し、アルコールからキシレンへの一連の段階処理を通して脱水化した。前記組織をパラフィン中に包埋し、５μｍの連続切片とした。その後、Ｈ＆Ｅ染色を行い、特徴について分析した。ヒト由来のエリアを選択するに当たっては、蛍光性のｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションによって確認した（ヒト−特異的なプローブ， ＣＥＰ ＸＹ； Ｖｙｓｉｓ Ｉｎｃ．，Ｄｏｗｎｅｒｓ Ｇｒｏｖｅ， ＩＬ）。実験は、動物実験に関する地域委員会（Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ ）（Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，スウェーデン； Ｄｎｒ Ｎ１０７／０６）からの許可の下行った。

【0159】

核型分析
ｈｉＰＳＣは、１０ｃｍディッシュ上でコンフルエントになるまで増殖させた。その後、ディッシュを回収し、中期スプレッド（ｍｅｔａｐｈａｓｅ ｓｐｒｅａｄ）を、ケンブリッジ大学病院細胞遺伝学診断用研究室によって得た。

【0160】

ｈｉＰＳＣから肝細胞への分化
ｈｉＰＳＣは、５ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＩＶ／ディスパーゼ（０．１％， Ｇｉｂｃｏ）（比率１：１ （ｖ／ｖ））の混合液を用いて継代した。その後、過去の文献に記載の通り（［１６］）、ＣＤＭ−ＰＶＡ中でウシ胎児血清（ＦＢＳ）で予め被覆したプレート上に、又はヒト・フィブロネクチンで予め被覆したプレート内に移した。その翌日の間（Ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｄａｙ）、細胞は、ＣＤＭ−ＰＶＡ中で以下の物を添加して増殖させた：ＣＨＩＲ９９０２１ （３ μＭ， Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）， ＬＹ２９４００２ （１０ μＭ， Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）， アクチビン （１００ ｎｇ／ｍｌ， Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）， ＦＧＦ２ （４０ ｎｇ／ｍｌ， Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、及びＢＭＰ４ （１０ ｎｇ／ｍｌ，Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）。そして、ｈｉＰＳＣから原始線条様の細胞への分化を誘導した。翌日、得られた細胞は、ＣＤＭ−ＰＶＡ中で以下の物を添加して増殖させた：ＬＹ２９４００２ （１０ μＭ， Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）， アクチビン （１００ ｎｇ／ｍｌ）， ＦＧＦ２ （４０ ｎｇ／ｍｌ， Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、及びＢＭＰ４ （１０ ｎｇ／ｍｌ， Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）。そして、決定的な内胚葉への分化を誘導した。３日目には、基礎培地をＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ １６４０）に変更し、アクチビン（１００ ｎｇ／ｍｌ， Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ），ＦＧＦ２（４０ ｎｇ／ｍｌ， Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）及びＢ２７を添加した。そして、前方胚体内胚葉細胞（ＡＤＥ）を得た。その後、肝臓性内胚葉を誘導するために、ＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ １６４０）（添加物として、アクチビン（５０ ｎｇ／ｍｌ， Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ））の存在下でＡＤＥ細胞を５日間培養した。最後に、得られた肝臓性前駆細胞を成熟させるために、細胞を、ＣＭＲＬ／Ｈｅｐａｔｏｚｙｍｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）基礎培地（添加物として、ＨＧＦ（２０μｇ／ｍｌ， ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）及びオンコスタチン−Ｍ（１０μｇ／ｍｌ，Ｒ＆Ｄ））中で増殖させた。

【0161】

フローサイトメトリー
アルブミン陽性細胞を検出するため、肝細胞分化プロトコルの最後で、接着細胞をＰＢＳで二回洗浄した。細胞分離バッファ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）中３７℃で２０分間インキュベートした。細胞は、穏やかにピペッティングすることによって分離した。そして、約０．１〜１×１０⁵細胞／ｍＬの密度で、ＰＢＳ＋３％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）（含有物として、０．１％アジド（Ｓｅｒｏｔｅｃ Ｌｔｄ．， Ｏｘｆｏｒｄ， Ｕ．Ｋ．）及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ）中で再懸濁した。その後、一次マウス抗ヒトアルブミン抗体（Ｒ＆Ｄ １４５５；１００分の１に希釈）、又はマウスＩｇＧアイソタイプ コントロール（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で、細胞を４０分間４℃でインキュベートした。そして、細胞を、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ ｍａｃｈｉｎｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， ＵＳＡ）で分析した。アルブミン陽性細胞の数は、３つの独立した実験からの平均値として記録した。

【0162】

イオジキサノール（ＯｐｔｉＰｒｅｐ Ａｘｉｓ Ｓｈｉｅｌｄ ２０１０）ステップ勾配を用いた細胞内画分、及びＥｎｄｏＨ消化
ｄｈｉＰＳＣ由来の肝細胞を６ウェルプレート中で増殖させ、セルスクレイパーで回収した。そして、ボール・ベアリング・ホモジェナイザーを繰り返し通すことによって機械的に破壊した。細胞懸濁液を５分間（４℃）かつ３０００Ｇで遠心した。上澄みを、希釈して、最終濃度３５％のＯｐｔｉＰｒｅｐ液とし、新たな遠心管に移した。前記上澄みの上に、２ｍｌの３０％ＯｐｔｉＰｒｅｐと、１ｍｌの０％ＯｐｔｉＰｒｅｐを慎重に連続して層を重ね、遠心管を２時間（４℃）７０，０００Ｇで回転させた。２つの下層の間に形成された液体中間層を、注意深く吸引して、再度、４５分間（４℃）１００，０００Ｇで回転させた。形成された連続ペレットを５０μｌの緩衝剤で再懸濁した。そして、ミクロソーム・画分としてラベルした。エンドグリコシダーゼＨ［ＥＣ ３．２．１．９６， グリコペプチド−Ｄ−マンノシル−Ｎ４−（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニル）２−アスパラギン １，４−Ｎ−アセチル−ｂ−グルコサミノヒドロラーゼ］で消化するため、ミクロソーム細胞画分は、５００ユニットのＥｎｄｏＨ酵素（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｈｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）で、３時間３７℃で消化した。そして、後述の通り分析を行った。

【0163】

ＳＤＳ ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット法分析
サンプル３０μｌを、１０μｌの４ｘローディング・バッファ（含有物として、１０％（ｖ／ｖ）β−メルカプトエタノール及び４％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ）と混合し、８％（ｗ／ｖ）のアクリルアミドＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ウェスタンブロット分析を行うため、２００ｍＡで２時間、前記蛋白質を、前記ゲルから、イモビロンＰメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．， Ｂｅｄｆｏｒｄ， ＭＡ）へとブロット（トランスファー）した。ブロット用のバッファーには、２０％（ｖ／ｖ）メタノールを加えた。ブロット後、メンブレンをＰＢＴ（ＰＢＳに０．１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ ２０をプラスした物）で洗浄した。更に、ＰＢＴに５％（ｗ／ｖ）の乾燥スキムミルク粉末を添加した物を用いて、一晩ブロッキングを行った。翌日、前記メンブレンを、ＰＢＴミルク中で１：１０，０００で希釈した抗−α１−アンチトリプシン抗体で１時間インキュベートした。ＰＢＴで５分間の洗浄を６回行った。次に、ＰＢＴミルク中１：１００，０００で希釈した抗マウスＩｇＧ−ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ抗体で１時間インキュベートした。メンブレンについては、ＰＢＴでの５分間の洗浄と、ＰＢＳでの１５分間の洗浄とを更に６回行った。その後、ＥＣＬ Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ ｍａｘｉｍｕｍ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用し、メンブレンをフィルムに曝して現像作業を行った。

【0164】

α１−アンチトリプシン用の酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）
α１−アンチトリプシンに対するアフィニティ精製ウサギポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ ３１６５７， ケンブリッジ， ＵＫ）を、炭酸/重炭酸バッファ（Ｎａ₂ＣＯ₃／ＮａＨＣＯ₃、ｐＨ ９．５）中２μｇ／ｍｌの濃度で用いて、高結合表面ＣＯＳＴＡＲ９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ， ＮＹ， ＵＳＡ）を一晩コーティングした。洗浄（０．９％ ｗ／ｖ ＮａＣｌ， ０．０５％ ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ ２０）後、ブロッキング・バッファ（ＰＢＳ， ０．２５％ ｗ／ｖ ＢＳＡ，０．０５％ ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ ２０）で、前記プレートを２時間ブロッキングした。サンプルとしては：培養培地；又は、５０μｌのＮｏｎｉｄｅｔ溶解バッファ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ， ５０ｍＭ トリス−Ｃｌ， ｐＨ ７．５， １％ （ｖ／ｖ） Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０）で溶解させた細胞；、及び標準液（血漿精製したＭ型又はＺ型のα１−アンチトリプシン）を用いた。そして、これらをブロッキングバッファで希釈し、各ウェルに５０μｌ加えて、２時間インキュベートした。洗浄後、ウェルを、９Ｃ５又は２Ｃ１モノクローナル抗体（１μｇ／ｍｌ、ブロッキングバッファで希釈）のいずれかで２時間インキュベートした。結合したモノクローナル抗体は、ウサギ抗−マウスＩｇＧ ＨＲＰラベル抗体（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｈａｖｅｒｈｉｌｌ， ＵＫ， １：２０，０００）を１時間用いて検出した。ＴＭＢ液体基質（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｈａｖｅｒｈｉｌｌ， ＵＫ）を用いて１０分間暗所で反応を進め、該反応を１ＭのＨ₂ＳＯ₄で停止させた。Ｔｈｅｒｍｏ−ｍａｘ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ， Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて、４５０ｎｍの波長で吸光度を測定した。プロテオソーム・ブロッキング・アッセイを行うため、細胞は、回収する前に１６時間（一晩）、６ウェルプレート中で増殖させ、１０，０００分の１に希釈したＭＧ１３２（ＡＧ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ＵＳＡ）を培養培地に添加した。コントロール・サンプルには、等しい体積量のＰＢＳを加えた。

【0165】

アルブミン用の酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）
細胞培養培地は２４時間にわたって収集し、ケンブリッジ大学病院生物化学診断用研究室（ラボ）にて、屋内用ヒトアルブミン特異的ＥＬＩＳＡキット（ＢｉｏＳｕｐｐｌｙ ＵＫ）を用いて、トリプリケートで分析を行った。値は、培養培地１ｍｌの１００万個の細胞あたりのｎｇとして表した。

【0166】

シトクロームＰ４５０活性
Ｃｙｐ３Ａ４活性アッセイについては、Ｐ４５０−Ｇｌｏアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造業者の指示に従って使用して、トリプリケートで行った。そして、シトクローム活性は、Ｐ４５０−ＧｌｏＭａｘ ９６マイクロプレート・ルミノメーターを使用して分析した。

【0167】

過ヨウ素酸シッフ染色（ＰＡＳ）
製造業者の指示のガイダンスの下、キット（Ｓｉｇｍａ ３９５Ｂ − １ＫＴ）を使用して、トリプリケートで細胞に対してＰＡＳ染色を行った。続いてジアスターゼ消化を行い、陽性染色の原因がグリコーゲンの存在であることを確かめた。

【0168】

透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）
細胞を０．９％ＮａＣｌ溶液で短時間リンスし、温度４℃で４％グルタルアルデヒドで２時間固定した。そして、固定したプレートから、細胞をかきとり、０．１ＭのＰＩＰＥＳでリンスすることによって再懸濁した。分析はＴＥＭで行った。

【0169】

ＬＤＬの取り込み
Ｄｉｌ−ＬＤＬ染色キットを提供元から（Ｓｔｏｕｇｈｔｏｎ，ＭＡ）から購入した。アッセイは、提供元の指示に従って行った。ＦＡＣＳ分析は、ＦＨ病特有のｈｉＰＳＣ肝細胞中のＤｉｌ取込と、コントロール（ＨｅｐＧ２細胞）中のＤｉｌ取込とを比べて行った。

【0170】

ＧＦＰレポーター
細胞は、過去の文献に記載されているように［１６］、ＡＰＯＡ−ＩＩ−ＧＦＰレンチウイルスベクターを用いて形質転換し、顕微鏡で検証を行った。

【0171】

グルカゴン刺激に応答する代謝酵素
ｄｈｉＰＳＣ由来の肝細胞は、無血清の高グルコースＤＭＥＭ培地で６時間培養した（培地への添加物として、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｌのペニシリン、１００ｕｇ／ｍｌのストレプトマイシン、及び０．５％のウシ血清アルブミン（全て、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈより入手）を添加した）。細胞を、１００ｎＭのグルカゴン２３塩酸（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ， Ｂａｇｓｖａｅｒｄ， Ｄｅｎｍａｒｋ）又はＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（ネガティブ・コントロールとして）で刺激した。刺激して０、１、２、３時間後に、ＲＮｅａｓｙ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ， Ｈｉｌｄｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してトータルＲＮＡを回収した。そして、製造業者のガイドラインに従って精製した。逆転写については、製造業者のガイドラインに従って、１ｕｇのＲＮＡに対して、２５μｌの反応混合物中で行った。反応混合物は、２００Ｕのモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素、５００ｎｇのランダムプライマー、及び０．５ｍＭのデオキシヌクレオチド三燐酸（全て、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， ＭＡ）から入手）を含有する。ｃＤＮＡについては、以下の物を用いてリアルタイム定量ＰＣＲを行った：ＡＢＩ７９００ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ システム （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）；Ｔａｑｍａｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、及び遺伝子特異的なフォワード及びリバースプライマー、並びに蛍光発生プローブ。全ての結果については、ヒト３６Ｂ４を参照遺伝子として標準化させた。ＰＥＰＣＫ（Ｈｓ００１５９９１８＿ｍ１）、Ｇ６Ｐ（Ｈｓ００６０９１７８＿ｍ１）、及びＩＧＦＢＰ１（Ｈｓ００４２６２８５＿ｍ１）に関するプライマー及びプローブは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから、予め製造済みのストックとして購入した。３６Ｂ４に関するオリゴヌクレオチドは、本発明者側で設計し、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社が合成した（フォワード ５’−ＧＣＡＧＡＴＣＣＧＣＡＴＧＴＣＣＣＴＴ−３’； リバース， ５’−ＴＧＴＴＴＴＣＣＡＧＧＴＧＣＣＣＴＣＧ−３’； プローブ， ５’−［ＪＯＥＥ］ＡＧＧＣＴＧＴＧＧＴＧＣＴＧＡＴＧ［ＴＡＭＲＡ］−３’）。

【0172】

Ａ１ＡＴＤ−ｈｉＰＳＣにおけるＺ型変異の修復
Ａ１ＡＴＤ−ｈｉＰＳＣについては、上記説明の通りである。
２×１０⁶のｈｉＰＳＣをＺＦＮ発現ベクター及びドナー・テンプレートでコトランスフェクトした。そして、トランスフェクションから４日後、ピューロマイシン選択（１μｇ・ｍｌ^-1）を開始した。トランスポゾンを除去するため、標的細胞にｐＣＭＶ−ｙＰＢａｓｅ（Ｙｕｓａ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ ＰＮＡＳ Ｕ Ｓ Ａ １０８， １５３１−１５３６ （２０１１））をトランスフェクトし、４日間培養した。そして、別の培養環境に移し、２５０ｎＭの１−（２−デオキシ−２−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−インドウラシル （ＦＩＡＵ）で、セレクションをかけた。コロニー形成能力を増加させるために、分離する４時間前、且つプレートにまいて２４時間後に、細胞をＲＯＣＫ阻害剤²⁶、Ｙ−２７６３２（１０μＭ）で、処理を行った。得られたコロニーを２週間後に拾い、ＰＣＲで分析し、更にサザンブロット分析で確認を行った。

【0173】

免疫不全のｕＰＡトランスジェニック・マウスにおけるｈｉＰＳＣ由来肝細胞様細胞移植
全てのマウスは、感染源のない屋内に収容した。動物を使った研究については、パスツール研究所の動物実験に関する委員会、及びフランス農務省の承認を得た。分化した細胞（５０μｌのＤＭＥＭ中５×１０⁵細胞／動物）を、３〜４週齢のＡＬＢ−ｕＰＡ＋／＋；Ｒａｇ２−／−；Ｉｌ２ｒｇ−／−マウス（ｎ＝７）の脾臓に注射した。組織学的分析を行うために移植から２週間後にレシピエント・マウスを犠牲にした。血液サンプルを収集し、血漿中のヒトアルブミンの定量をＥＬＩＳＡ（Ｂｅｔｈｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で行った。ヒトアルブミン（Ｄａｋｏ）又はヒトＡ１ＡＴ（Ｄａｋｏ）特異的な抗体を用いて免疫蛍光を行うことにより凍結肝臓切片を分析した。移植を行っていないマウスをコントロールとして用いた。

【0174】

結果
罹患した患者からのｈｉＰＳＣ由来肝細胞の５例については、関連する病気で見られる細胞病理の鍵となる特徴（例えば、ミスフォールドされた突然変異体α１−アンチトリプシンが小胞体に蓄積すること；ＬＤＬ受容体を介したコレステロール取り込みの欠損；、並びに細胞脂質及びグリコーゲン蓄積の上昇）を再現することに成功した。ｈｉＰＳＣが、成人細胞における種々の範囲の遺伝性疾患のモデルとして使用できることを示したのは、これらのデータが初めてである。

【0175】

肝臓の遺伝性代謝病（ＩＭＤ）を患う患者からのｈｉＰＳＣライブラリーの生成
ある範囲のＩＭＤを有する７人の個体及び３人の健常なコントロールからの皮膚生検試料から皮膚の線維芽細胞を得た（２０個のｈｉＰＳＣ株、７人の患者、５種類の病気、表１参照）。Ｙａｍａｎａｋａらによって開発された４種類の因子を用いたアプローチ（［１３］）を用いて、これらの体細胞を多能性幹細胞へと再プログラムした。ｈｉＰＳＣ誘導の成功率は、個体ごとに０．０１％〜０．１％の範囲で極端に変動した。このことは、異なる年齢及び性別の患者から得た皮膚の線維芽細胞において再プログラムする能力が変動することがあること裏付ける。可能である場合には、同一の個体から生じた株の間で存在する分化能力の保存された多様性を決定するために、更なる分析を目的として、１個体につき３つのｈｉＰＳＣ株を連続して用いた。得られたｈｉＰＳＣ株のライブラリ（１０人の個体からの２０種類の株）は、以下の事柄で特徴づけた：これらの株の形態、多能性マーカーの発現、三胚葉への誘導物をインビボ及びインビトロで形成する能力、正常の核型、並びに内因性及び外因性の多能性遺伝子の発現プロファイル。

【0176】

全てのｈｉＰＳＣが内因性の多能性のマーカーを発現し、神経外胚葉、内胚葉及び中胚葉の細胞へと分化することができた。このことは、本発明者らが、体細胞から多能性幹細胞を生成することができたことを裏付ける。興味深いことに、１つの特定の胚葉へ分化する能力が欠如したｈｉＰＳＣ株は存在しなかった。このことは、本研究の為に生成したｈｉＰＳＣ株の分化能力において、大きな違いがなかったことを示している。更に、異常な核型は、所定の化学的条件の下で長期間（継代４０回）増殖させたｈｉＰＳＣでのみ観察された。このことは、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）（［１４］）についての文献に記載のごとく、ｈｉＰＳＣを増殖させるために使用される培養システムが、遺伝的安定性に影響を及ぼす可能性があることを示唆している。そこで、「継代数が少ない」ｈｉＰＳＣ（継代数３０未満、＜ｐ３０）のみを本研究に用いた。ウイルス組み込みの数は、株や患者間で変化が見られた。このことは、完全な再プログラミングは、ウイルス組み込みの特有のパターンとは関係しない（［１５］）という過去の研究を補強するものである。

【0177】

最後に、外因性導入遺伝子の異所発現は、本発明者らのｈｉＰＳＣ株においては、ほとんど検出されなかった。このことは、多能性幹細胞において、本発明者らのウィルス性ベクターの効率がサイレンシングを起こしたことを示している。まとめると、これらの結果は、本研究のために生成したｈｉＰＳＣ株は、完全に再プログラムされ、従って、ＩＭＤを有する患者に由来するｈｉＰＳＣ株のユニークなライブラリを代表する物であること示している。

【0178】

患者特有のｈｉＰＳＣ由来の肝細胞を生成するための確実で簡潔な方法の開発
近年、本発明者らは、ヒトＥＳ及び正常ｈｉＰＳＣを肝細胞に分化させるための確実性の高いプロトコルを開発した（［１６］）。本発明の培養システムは、患者特有のｈｉＰＳＣ用いて使用するのに最も適した、新規な分化方法の基礎を提供する。本発明者らの主要な目的は、幅広い数のｈｉＰＳＣ株を肝細胞へ効果的に分化させることができる簡潔な方法を開発することであった。健常な個体に由来するｈｉＰＳＣ株（ｎ＝６；２つの異なる被験体）、及びα１−アンチトリプシン欠損を有する個体に由来するｈｉＰＳＣ株（ｎ＝６；３つの異なる患者）を使用して、広い範囲の培養条件で経験則的にスクリーニングを行った。

【0179】

得られたプロトコルを図１に記載した。肝細胞の発生の通常の経路での鍵となるステージの後で、３段階のプロトコルが続く。１番目のステップは、ｈｉＰＳＣを内胚葉細胞へと誘導することからなる。ここで、内胚葉細胞は、Ｓｏｘ１７、ＣＸＣＲ４、ｆｏｘＡ２及びＨｅｘを発現し、これらは、前方胚体内胚葉の特異的マーカーである。そして、前方胚体内胚葉は、肝臓細胞の生成元となるものであり（図１ｂ及び１ｃ）、ＣＤＭ−ＰＶＡ培地（添加物として、アクチビン、ＦＧＦ２、ＢＭＰ−４及びＰＩ３キナーゼ阻害剤）を用いて生成される。得られた内胚葉細胞は、アクチビン及びＢ２７添加物を用いて、肝臓性前駆細胞へと分化させる。肝臓性前駆細胞は、ＡＦＰ、ＣＫ１８、ＣＫ１９、ＨＮＦ４、及びＨＮＦ６（図２、３）を発現する。

【0180】

最後に、ＣＭＲＬ／肝細胞培養培地混合物（添加物として肝細胞成長因子（ＨＧＦ）及びオンコスタチン−Ｍ）中で成熟させる。このことにより、アルブミン及びα１−アンチトリプシンの両方を発現する肝細胞様細胞が２５日目までに生じる（図２、３及び４）。ＦＡＣＳ分析によれば、これらの培養条件で生成した８０％の細胞がアルブミンを発現した（図４）。このことは、上記アプローチで生成された細胞集団が均一であることを裏付ける。２５日目までに、前記細胞は、ヒト肝細胞に非常に酷似した形態を示した。そして、以下の事象をしめした：時折見られる二核性（図１）；グリコーゲン貯蔵及び頂部の微小突起（図５）；粗面小胞体及び滑面小胞体（ＥＲ）、並びに顕著なゴルジ体。更に、ｈｉＰＳＣ由来の肝細胞は、生来のヒト肝細胞に類似した機能的特徴をインビトロで共有する。即ち、これらの細胞は、グリコーゲン＆ＬＤＬを蓄えることができ、アルブミンを分泌することができ、ＣｙｔＰ４５０経路を介して薬剤を代謝することができ（図６）、肝細胞特有のＡｐｏＡＩＩプロモーターの制御下でＧＦＰ蛋白質を発現することができる。更に、外因性再プログラミング因子の発現は、これらの細胞で抑制されたままであり、このことは、分化した後のレトロウイルス性の導入遺伝子はサイレンシングされたままであることを裏付けている。

【0181】

これらのデータは、本発明者らによる培養システムで生成した肝臓細胞の関連する機能的特徴を示す相当量の証拠を提供してはいる。しかしながら、これらの細胞が最終的に分化しているわけではないことも本発明者らは認識している。このことは、ＡＦＰの発現が持続していることによって証拠付けされる（図２及び３）。その代わり、これらの肝細胞は、胎児の胚発生の最初の三ヶ月間の終わりと、及び完全な成人細胞（α１−アンチトリプシン遺伝子発現のレベル、及びＦＡＣＳで確認されるアルブミン発現細胞のパーセンテージで示される）という発生学的な両者位置の間のどこかしらに位置している可能性が高い（図１ｄ）。

【0182】

本発明者らの培養システムで生成した肝臓細胞は、肝細胞マーカーを発現する（例えば、アルブミン（ＡＬＢ）、α−１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）、αＡＰＯＦ、ＴＡＴ、ＴＤＯ２、ＴＴＲ、ＨＮＦ４α及びＨＨＥＸ）（図４Ａ）。また、胎児のマーカー（例えば、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）及びＣＹＰ３Ａ７）の発現も、分化の過程を通じて維持された。その一方で、成人シトクロームＣｙｐ３Ａ４の発現は、比較的低いままだった（図４Ａ）。このことは、これらの細胞が、胎児様肝細胞であることを表し、また、成人細胞を生成するために更なる成熟が必要であることを示唆している。これらの知見は、免疫染色分析及びＦＡＣＳ分析によって裏付けることができる。これらの分析では、ＡＬＢ、サイトケラチン１８、ＡＡＴ及びＡＦＰが、均質な（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ）共発現を示している（図４Ｂ及び４Ｃ）。しかし、これらの細胞では、肝細胞の機能的特徴も示した（例えば：（ｉ）ＡＬＢ及びＡＡＴの分泌（図４Ｄ）、（ｉｉ）デキサメタゾンにより誘導可能なＣｙｐ３Ａ４活性（図４Ｅ）、（ｉｉｉ）コレステロール取り込み、及び（ｉｖ）グリコーゲン貯蓄（図４Ｆ））。

【0183】

最後に、本発明者が観察したところでは、本発明の培養システムは、数多くの株に適用された（１０人の個体から得た２０種類のｈｉＰＳＣ株）。肝臓細胞に分化できなかったｈｉＰＳＣ株は２種類のみであった。

【0184】

総合すると、これらの結果は、成熟肝細胞に特有の幾つかの機能的特徴を示す集団であり、均一に近い集団であり、そして、胎児の肝臓性細胞である集団へとｈｉＰＳＣが分化することを誘導するための、本発明者らによる所定の培養条件が効率的であること示す。

【0185】

患者特有のｈｉＰＳＣを用いた肝臓病のインビトロ・モデリング：α１−アンチトリプシン欠損
肝臓病をインビトロでモデリングするための、本発明者らのアプローチの有効性については、病気特有のｈｉＰＳＣ（ｄｈｉＰＳＣ）由来の肝細胞が、該肝細胞の由来元となった病気の鍵となる特徴を再現できるかどうかを調べることで評価した。本発明者らは、まずα１−アンチトリプシン欠損ｄｈｉＰＳＣに着目した。これまでの研究によれば、Ｚ型の対立遺伝子（Ｇｌｕ３４２Ｌｙｓ）の結果として、ＥＲ内に保持されるα１−アンチトリプシンが秩序だったポリマー形態で形成されることが示されている（［１７］）。これらのポリマーは、肝細胞内に蓄積し、ヘテロ接合体を、新生児の肝炎、肝硬変及び肝臓細胞の癌へとかかりやすくさせる（［１８］）。こうしたα１−アンチトリプシン・ポリマー化の経路は、臨床上の表現型の中心的なものとなる（［１７］）。そこで、本発明者らは、２Ｃ１ポリマー特異的モノクローナル抗体（［３０］）を使用し、α１−アンチトリプシン欠損型のｄｈｉＰＳＣ由来の肝細胞内でのポリマーを検出した。ポリマーは、免疫染色（図８）及びＥＬＩＳＡ（図１０）分析で検出した。これらのデータが示すところによれば、α１−アンチトリプシン・ポリマーの蓄積は、α１−アンチトリプシン欠損を有する個体から得たｄｈｉＰＳＣ由来の肝細胞でのみ発生した。コントロール被験体から得たｈｉＰＳＣ由来の肝細胞内では、ポリマーは存在しなかった。前記ポリマーの細胞内の局在については、以下の手順で確認した、即ち、細胞の細胞内画分を得て、その後、エンドグリコシダーゼＨ（図９）で消化した。該酵素は、高マンノースＥＲ形態であるＮ−結合型グリカンを除去し、且つゴルジ体内でシアル酸付加した後の多糖類鎖に影響しない酵素である。

【0186】

エンドグリコシダーゼＨ処理により、患者特有のｈｉＰＳＣ由来の肝細胞における全ての細胞内α１−アンチトリプシンが、単一の５０−ｋＤａのバンドに減少（分解）した。しかし、コントロールのｈｉＰＳＣ由来の肝細胞では減少しなかった。このことは、こうした全ての細胞内α１−アンチトリプシンがＥＲ内に保持されたことを示している。重要なこととして、同一の患者から採取した３種類の異なるｈｉＰＳＣ株間では、一貫してポリマーの増加が観察された。しかし、患者が異なる場合のｈｉＰＳＣ株間では違いが見られた。こうした表現型の多様性は、患者の病状と相関しうるものであり、従って、該病気の臨床上の特徴を反映している可能性がある。しかし、Ａ１ＡＴＤ患者２に由来するｈｉＰＳＣ株について観察したところ、ポリマーの発現レベルは低かった。また、該細胞では特に内胚葉分化に対して抵抗性であった。従って、本研究において観察された病気の表現型の多様性は、肝臓への効率的な分化を達成するｈｉＰＳＣの能力を主に反映している。

【0187】

最後に、将来的なインビトロでの薬剤スクリーニングを目的とした、本発明の細胞株の潜在的な応用について調査するため本発明者らは、プロテアソーム阻害剤（ＭＧ１３２）を培地に一晩添加したことによる効果を評価した。この重要な蛋白質分解経路をブロックすることにより、α１−アンチトリプシン・ポリマーが病気特有の細胞内増加を示すことが明らかとなった（図１０）。総合すると、これらの結果により、ｄｈｉＰＳＣ由来肝細胞は、インビトロにおいて、α１−アンチトリプシン欠損の病理学上の鍵となる特徴をモデリングする能力があり、また、将来的な薬剤スクリーニング・アッセイにおいて有用なものとなる可能性があることが示された。

【0188】

患者特有のｈｉＰＳＣを用いた肝臓病のインビトロ・モデリング：家族性高コレステロール血症
本発明者らの培養システムが臨床上の病気をモデリングする能力を確認すること、他の細胞内の局在に特有の病気プロセスを検証できる可能性について調査することを目的として、家族性高コレステロール血症（ＦＨ）を有する１人の個体から得たｄｈｉＰＳＣ由来の肝細胞の特徴を分析した。ＦＨにおける原始的な欠陥は、ＬＤＬ受容体の機能が損なわれることにある。この結果として、血漿でのＬＤＬが過剰となり、未成熟なアテローマとなる（［１９］）。ＦＨを有する個体から生成したｄｈｉＰＳＣ株は、肝細胞へと分化して、典型的な機能的特徴を示す（図１１）。分化した細胞をウェスタンブロット法で分析したところ、ＬＤＬ受容体が欠損していることを確認した。

【0189】

こうした受容体の欠陥によるインビボでの機能は、免疫染色及びＦＡＣＳ分析で示すように、本発明者らのモデルにおいても、保存されて表現されている。このことは、ＦＨ−ｄｈｉＰＳＣ由来の肝細胞は、ＬＤＬを取り込む能力が欠損していることを示す（図１２）。これらの結果は、ＦＨをモデリングためにｄｈｉＰＳＣを使用することに成功する可能性を示しており、従って、膜を通る蛋白質輸送や受容体機能不全に関わる他の病気のモデリングにも適している可能性があることを示している。

【0190】

患者特有のｈｉＰＳＣを用いた肝臓病のインビトロ・モデリング：糖原病１ａ型（ＧＳＤ−１ａ）
最後に、本発明者らは、サイトゾルでの代謝の欠損を表す病状のモデリングを行うためのアプローチを用いた。ＧＳＤ−１ａは、グルコース−６−ホスファターゼの欠陥によって引き起こされる。該酵素は、グルコース−６−リン酸をグルコースとリン酸とに加水分解する反応を触媒する主な酵素であり、該反応は、糖新生及びグリコーゲン分解の最終ステップである。ＧＳＤ−１ａを有する個体は、グルコースのホメオスタシスを維持することができず、以下のような症状を経験することとなる：高脂質血症、乳酸アシドーシス、高尿酸血症、低血糖、肝腫脹、腎腫大、及び成長遅延（［２０］）。１つの被験体に由来する３種類のＧＳＤ−１ａ株を分化させ、得られた細胞については、これらの肝細胞に類似の性質についての特徴分析を行った（図１３）。

【0191】

過ヨウ素酸シッフ染色を行ったあとで、細胞内の病気の表現型を確認した。ＧＳＤ１ａの病状のｄｈｉＰＳＣ由来の肝細胞では、コントロールと比べると、細胞内グリコーゲンの蓄積量が有意に大きいことが明らかになった（図１４）。更に、同細胞は、過剰な脂質蓄積（図１５）、及び過剰な乳酸の製造（図１７）といった、前記病気に関する他の特徴も再現した。重要なこととして、前記細胞においては、グルカゴンで刺激した後、３つの標準的なグルカゴン応答性遺伝子の発現が誘導された（図１６）（［２１］［２２］）。これらの結果が示すところによれば、ＧＳＤ１ａの鍵となる細胞の態様をインビトロでモデリングできるだけでなく、本発明者らの培養システムで生成した肝細胞は、中間代謝の鍵となるホルモンに対する少なくとも幾つかの応答を示すことができる。従って、本発明者らのアプローチは、他のより一般的な代謝異常のモデリングに応用できることを示唆している。

【0192】

数多くのｈｉＰＳＣ株を成熟した肝臓の状態の細胞へと効率的に分化させることを可能にするシンプルな所定の化学的培養システムを開発することにより、非神経由来の病気群（該病気は表現型が成人細胞内での複雑な蛋白質調節不全の結果となる病気である）をモデリングを本発明者らは示した。本発明者がモデリングした３種類の病気は、多様な範囲の病理学上の機構を包含している（ＥＲ内での蛋白質のミスフォールディングから、細胞表面受容体機能不全まで、そして、最後は、サイトゾルの代謝の阻害）。それにより、本発明の新規のプラットフォームを他の研究領域へと開拓するための幅広い応用できる可能性が潜在することを示す。

【0193】

本発明者らのモデリング・システムの可能性については、その最たる例として、一群の病気の中から最もありふれており、非常に特徴の分析が行われている病気である、α１−アンチトリプシン欠損を最初に検討する。これまでの研究では、ミスフォールディングが起こること、及びＺ型ポリマーがＥＲ内にトラップされることが、臨床上の表現型のメカニズムとして存在していることが示されている（［１７］）。しかし、同じ遺伝子型を有する個体間で示す表現型が変化することについては未だ説明がついていない。こうした変化は、ミスフォールドされた蛋白質を取り扱う能力が患者で異なることが原因となっている可能性がある（［２３］［２４］［８］［９，１８］［７］）。こうした蛋白質の処理を担う、肝細胞に特異的な質的コントロールのメカニズムは、今日（こんにち）明らかになりつつある（［２５，２６］）。こうした経路の１つであるプロテオソームは、幾つかの肝臓性細胞株（［２７］）及び肝臓外のほ乳動物の細胞株（［２８］）において、Ｚ型α１−アンチトリプシンを代謝する際に重要な役割を果たしている。しかし、これらのプロテオソームは、ヒト肝細胞のプロテオソームにおいて、蛋白質の取り扱いを近似できるに過ぎない。更に言えば、蛋白質分解経路に関する我々の理解が深まってきているものの、Ｚ型のα１アンチトリプシンの蓄積がどのようにして細胞死や肝臓不全を引き起こすのかについては依然として不明である。こうした不明点に対する我々の理解や、及び類似の蛋白質のミスフォールディング異常の原因として重要となる他の関連機構とに対する我々の理解を深めることを目的として、ヒト肝細胞に特有の蛋白質分解経路を解明することは、次の段階の研究として重要である。患者特有のｈｉＰＳＣ由来の肝細胞であって、病気特有の蛋白質のポリマー化及びＥＲ内トラップの中核となる要素を保存することができる肝細胞を生成することによって、そして、この新規なインビトロの細胞システムを用いることによって、こうした精巧な細胞内プロセスを潜在的に研究できることを本発明者は本明細書に示している。

【0194】

更に、本発明者らのデータは、高ストレス（即ち、エキソ・ビボでの再プログラミング及び分化プロトコルは細胞に対して影響を及ぼす可能性がある（［８，２４］））であることにも関わらず、同細胞内プロセスを正確に保存できることも示している。

【0195】

続いて、本発明者らのモデリング・システムを用いて、他の２つの病気について評価したが、該評価により、肝細胞における蛋白質の機能不全の下流への影響が、ｄｈｉＰＳＣを用いた患者特異的な態様内でも保存されていることが強く示された。まず、本発明者らは、ＬＤＬ脂質を肝細胞内へ取り込むことを仲介するＬＤＬ受容体の欠損を再現することにより、家族性高コレステロール血症に関する新たな細胞モデルを確立することに成功した。前記ＦＨモデルは、受容体機能不全（核合成から、ＥＲを介した輸送まで、果ては細胞膜のリサイクルまで）を支配する肝細胞に特有で生来のプロセスの全体像（ｈｏｌｉｓｔｉｃ ｉｍｐｒｅｓｓｉｏｎ）を提供するために、いかにして本発明のプラットフォームがユニークに構築されるかを示している。本発明のプラットフォームは、広範囲の肝臓に関連する受容体の病気（ｒｅｃｅｐｔｏｒｏｐａｔｈｉｅｓ）の研究へと更にフォローアップするのに非常に適している可能性がある。

【0196】

ｈｉＰＳＣ由来の肝細胞における遺伝的欠陥の修復
本発明者らは、次に、α１−アンチトリプシン欠損（Ａ１ＡＴＤ）を有する個体に由来するｈｉＰＳＣにおいて、ｐｉｇｇｙｂａｃｋ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎｓを用いて、変異の修復を行った（Ｙｕｓａ ｅｔ ａｌ （２０１１） ＰＮＡＳ ＵＳＡ １０８ １５３１−１５３６； Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ （２００８） １０５ ９２９０−９２９５）。Ａ１ＡＴＤは、北欧系において２０００人に１人の割合で見られる染色体劣勢異常であり、最もありふれたものとして肝臓の遺伝的代謝疾患を代表するものである（Ｐｅｒｌｍｕｔｔｅｒ， Ｄ． Ｈ． Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ １６， ３９−４５ （２００９）； Ｇｏｏｐｔｕ， Ｂ． ＆ Ｌｏｍａｓ， Ｄ． Ａ． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ７８， １４７−１７６ （２００９））。該病気は、Ａ１ＡＴ遺伝子の単一の点突然変異（Ｚ型対立遺伝子；Ｇｌｕ３４２Ｌｙｓ）から生じる。そして、該変異により肝細胞の小胞体内で、前記蛋白質の秩序だったポリマー形成を引き起こす。結果として肝硬変を引き起こし、現在唯一の治療法は、肝臓移植のみである。主に、ドナー不足の深刻化や、免疫抑制治療による有害な効果によって、臓器移植が大きく制限されている。従って、ｈｉＰＳＣに基づく治療法の可能性は、大いに魅力的なものとなる。本発明者らはＺＦＮ技術を用いた。該技術は、ｈＥＳＣ並びにｈｉＰＳＣにおいて遺伝子ターゲティングを刺激する（Ｕｒｎｏｖ， Ｆ． Ｄ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ １１， ６３６−６４６ （２０１０）、Ｈｏｃｋｅｍｅｙｅｒ， Ｄ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２７， ８５１−８５７ （２００９）； Ｚｏｕ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ５， ９７−１１０ （２００９））。Ｚ型変異のサイトを特異的に切断するようにＺＦＮペアを設計した。ターゲティング・ベクターを、ＰＧＫ−ｐｕｒｏΔｔｋカセットに隣接するｐｉｇｇｙＢａｃリピートとともに同質遺伝子型のＤＮＡから構築した。突然変異部位と、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンの間の隔たり（違い）を最小限にするため、変異部位の１０ｂｐ上流にあるＣＴＧロイシン・コドンを、ＴＴＡロイシン・コドンに変更した。この結果、ＴＴＡＡ配列が生じた。なお、この配列は、ｐｉｇｇｙＢａｃ除去の後もゲノムの中に残る。

【0197】

ＺＦＮ発現ベクター及びターゲティング・ベクターをエレクトロポレーション法で共に導入し、その後、ピューロマイシン耐性ｈｉＰＳＣコロニーを得た。そして、ＰＣＲを用いて、ターゲット・クローンのスクリーニングを行った。３人の異なる患者に由来するＡ１ＡＴＤ−ｈｉＰＳＣ株を用いてテーゲット・クローンを生成した（表４）。特筆すべきこととして、５４％のピューロマイシン耐性コロニーでは、対立遺伝子を片方だけターゲッティングしていた。一方で、対立遺伝子両方を同時にターゲティングしたのは４％であった。

【0198】

ｐｉｇｇｙＢａｃ隣接選択カセットを、これら改変クローンから除去するため、本発明者らは、高活性形態のｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼ（Ｙｕｓａ ｅｔ ａｌ （２０１１） ｓｕｐｒａ）を２つのホモ接合体のターゲット・クローン（Ｂ−１６及びＣ−Ｇ４）に一時的にトランスフェクトした。そして、これらのクローンをＦＩＡＵ選択にかけた。得られたＦＩＡＵ耐性コロニーの遺伝子型を、ＰＣＲで分析し、サザンブロットで確認した。１１％のＦＩＡＵ耐性コロニーで、２対の対立遺伝子の除去が観察された（表５）。配列を分析したところ、Ｚ型変異は、両方の対立遺伝子上で修復されており、当初の計画通り、トランスポゾン除去により、ＴＴＡＡ配列が生じていた。得られた修復済みのＡ１ＡＴＤ−ｈｉＰＳＣ（ｃ−ｈｉＰＳＣ）株は、２０回を超える継代の間、多能性のマーカーの発現を維持した。そして、三胚葉のマーカーを発現する細胞へと分化する能力を維持していた。このことは、ゲノム改変によって、ｃ−ｈｉＰＳＣの多能性が変化しなかったことを示している。

【0199】

本発明者らは、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）を用いて、ｈｉＰＳＣ株のゲノムの一貫性を分析した。Ａ１ＡＴＤ−ｈｉＰＳＣ初期株３種のうち２種が、親の線維芽細胞とは異なっており、２０ｋｂ〜１．３Ｍｂの範囲で、増幅や欠損を示していた（ｈＥＳＣで頻繁に増幅が起こる領域である２０ｑ１１．２１でのゲインを含む）（Ｌｅｆｏｒｔ， Ｎ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２６， １３６４−１３６６ （２００８）； Ｓｐｉｔｓ， Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２６， １３６１−１３６３ （２００８））。株Ａは、該株の親の線維芽細胞と比べると、通常のゲノム量を保持していた。ＺＦＮがターゲティングを刺激した後、６種類のホモ接合体クローンのうち、４種類では、これらの種の親のｈｉＰＳＣ株と比べるとゲノムに変化がないことを本発明者は確認して安心を得た。二対立遺伝子のｐｉｇｇｙＢａｃ除去が行われた１６種類の細胞株を、これらと対応する初期のｈｉＰＳＣを比較した。そして、１２種類でゲノムに変化が無かった。また、本発明者はｈｉＰＳＣ株をＳＮＰアレイにより分析し、異型接合性が失われたかどうかについてチェックした。そして、分析した全ての株の全ゲノムで、異型接合性を維持していたことを見出した。こうした知見が示すこととして、二対立遺伝子の遺伝子修復は、同時に相同組換えが起こり、続いて、両方の対立遺伝子が同時に削除された結果起こったものであり、これらのプロセスにおいては有糸分裂組換は関与していなかった。

【0200】

本発明者らは、修復されたＢ−１６−Ｃ２株、及び該株の親の線維芽細胞のエクソーム解析を行った。これらのエクソームの比較により、２９種類の変異を特定した。これらの変異の発生については、初期のｈｉＰＳＣ株と、ホモ接合体のターゲット中間体を分析して決定した。２４箇所の点突然変異と、１つの１ｂｐの欠損を、初期のｈｉＰＳＣ株で検出した。そして、遺伝子修復の間、４つの変異が発生した：１つは、ターゲティングの間に発生し、後の３つは、ｐｉｇｇｙＢａｃ除去の間に発生した。これらの遺伝的署名（Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）は、ＺＦＮのオフ−ターゲットサイト、又はｐｉｇｇｙＢａｃ組み込みサイトとも一致しないため、これらの変異は、明らかに培養中に発生したものである。総合すると、本発明者らは、ＺＦＮをｐｉｇｇｙＢａｃと組み合せることにより、ｈｉＰＳＣの基本的な特徴に影響を与えることなく、該ｈｉＰＳＣにおいて迅速且つクリーンに点突然変異を修復することが可能になると結論付けた。

【0201】

ｈｉＰＳＣの遺伝的修復により、予想通りの表現型修復が得られることを確認するべく、ｈｉＰＳＣ（これらの主な細胞種は、病気Ａ１ＡＴＤの影響を受けている）を、インビトロで肝細胞様細胞へと分化させた。修復した株を分化させたところ、予想通り、ほぼ同質の肝細胞様集団が生じた。

【0202】

特筆すべきこととして、分化細胞をＣＧＨ分析したところ、肝臓への分化によって、遺伝的な異常の数を増加させることもなく、また、異常な核型を有する細胞へと選択されることもなかった。得られた細胞は、これらのインビボでの対応物と共通する形で、鍵となる機能的属性を有していた（該属性として、グリコーゲン貯蓄、ＬＤＬ−コレステロール取り込み、アルブミン分泌、及びシトクロームＰ４５０活性が挙げられる）。重要なこととして、ｃ−ｈｉＰＳＣ由来肝細胞様細胞において、突然変異ポリマー性Ａ１ＡＴが存在せず、代わりに、エンドグリコシダーゼ−Ｈ非感受性である通常のモノマーＡ１ＡＴを効率的に分泌することが、免疫蛍光及びＥＬＩＳＡの両方で示された（図１９Ａ−Ｄ）。更に言うと、分泌されたＡ１ＡＴは、正常な成人肝細胞から得られた物に匹敵する酵素的阻害活性を示した（図１９Ｅ）。かくして、酵素阻害活性の生理学的回復が達成できたことが示された。

【0203】

最後に、ＡＬＢ−ｕＰＡ＋／＋；Ｒａｇ２−／−；Ｉｌ２ｒｇ−／−マウスの肝臓へ脾内注射により移植した後、ｃ−ｈｉＰＳＣ由来肝細胞様細胞（Ｂ−Ｃ１６−２株）のインビボでの機能を評価した。注射して１４日後に肝臓を回収した。そして、ヒト細胞がコロニー化しているのが見出された。これについては、ヒトアルブミン及びＡ１ＡＴに特異的な抗体で特定した（図１９Ｆ、Ｇ）。これらヒト肝細胞様細胞は、肝臓の各葉全体に分散していた。そして、既存のマウス柔組織に組み込まれているのが観察された（図１９Ｆ、Ｇ）。更に言うと、ヒトアルブミンが、少なくとも５週間の間、移植した動物の血清中で検出された（図１８Ｈ）。一方で、どのマウスでも腫瘍の形成は検出されなかった。従って、ｃ−ｈｉＰＳＣ由来肝細胞様細胞は、インビボ（肝臓）で、コロニーを形成することができ、ヒトＥＳＣ由来の該当物に特徴的な機能的活性を示した（Ｔｏｕｂｏｕｌ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ５１， １７５４−１７６５ （２０１０））。纏めると、これらの分析から、Ｚ型変異を遺伝的に修復することにより、患者由来の細胞におけるＡ１ＡＴの機能を回復させることができることが示された。

【0204】

上述した実験証拠により、Ａ１ＡＴＤの細胞ベースの治療を目的とした、患者特有のｉＰＳＣにおける遺伝的修復へ応用できる可能性が示された。

【0205】

遺伝的修復は、より臨床面から関係の深い細胞において、線維芽細胞から再プログラムされた患者特有のｉＰＳＣを用いて、センダイウイルス・ベクター（組み込みを行わない方法）で繰り返し行われてきた（Ｆｕｓａｋｉ， Ｎ．， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｊｐｎ Ａｃａｄ Ｓｅｒ Ｂ Ｐｈｙｓ Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ ８５， ３４８−３６２ （２００９））。ＣＧＨ分析により、未修復のゲノムを有することが分かっている初期のｈｉＰＳＣ株は、上述した方法で修復した。最終生成物であるｉＰＳＣ−３−Ｇ５−Ａ７は、修復されたＡ１ＡＴを有し、親の線維芽細胞を比べると無傷のゲノムを有しており、肝細胞様細胞へと分化した際には、通常のＡ１ＡＴ蛋白質を発現した。変異修復済みの患者特有のｉＰＳＣを生成できることを示したのは今回が初めてである。

【0206】

修復されたｉＰＳＣは、効率的に肝細胞様細胞へと分化し、また、腫瘍を形成することなく、肝臓損傷の動物モデルへと移植された。更に言えば、異なる患者に由来するｈｉＰＳＣが効果的に修復することができ、このことは、本発明の方法が多数のＡ１ＡＴＤ−ｈｉＰＳＣ株に適用可能であることを示している。２対の対立遺伝子の修復が４ヶ月未満で行うことができたことから、本発明者らのアプローチは、Ａ１ＡＴＤのみならず、他の単一遺伝子性の異常についても修復された患者特有のｈｉＰＳＣを大規模に生成することに適合できる可能性がある。

【0207】

結論として、本研究は、幾つかの意味で、ｈｉＰＳＣの分野を発展させるものとなった。第一に、成人細胞に影響を及ぼす異なる病気を、単一のプラットフォームを用いて、モデリングできる可能性があることを示した。このことは、ｈｉＰＳＣ病気のモデリングの分野において、最も差し迫った問いに対する答えの一つとなった。従って、これらの実現化により、多様な研究分野への潜在的な応用のための、確実で、容易で、再現性の高い技術的資源を提供することが可能となった。第二に、種々の遺伝的及び病理的背景を有する多数の患者から、ｈｉＰＳＣ由来の肝細胞を生成することができることを示した。このことにより、本発明者らのシステムは、肝臓を標的とし、且つ医薬産業に潜在的に関連する化合物について、早期段階での安全性や治療用スクリーニングを行うための効率的且つ新規の方法となることが示された。最後に、そして、おそらく最も重要なこととして、細胞ベースの治療法に理想的な肝細胞であり、ある群の病気を有する多数の患者特異的な肝細胞を均一に生成する能力があることを示した。このことは、患者特有のｈｉＰＳＣ技術を提供するための別途重要なステップを本発明者らが再度踏み出したことを示している。
本発明は一側面において以下の発明を包含する。
（発明１）
肝臓への分化を誘導するための方法であって、以下のステップを含む方法：
（ｉ）人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞の集団を提供するステップ；
（ｉｉ）前記集団を内胚葉誘導培地中で培養し、前方胚体（ａｎｔｅｒｉｏｒ ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ）内胚葉（ＡＤＥ）細胞の集団を生成するステップ
（ここで、前記内胚葉誘導培地は、以下の性質を持つ所定の化学培地である：
線維芽細胞成長因子活性を有し、
ＳＭＡＤ２及びＳＭＡＤ３を介したシグナリング経路、並びにＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ５及びＳＭＡＤ９を介したシグナリング経路を刺激し、並びに
ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）及びグリコーゲン・シンターゼ・キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）を阻害する）；並びに
（ｉｉｉ）ＡＤＥ細胞の前記集団を肝臓性誘導培地中で培養し、肝臓性前駆細胞の集団を生成するステップ
（ここで、前記肝臓性誘導培地は、ＳＭＡＤ２及びＳＭＡＤ３を介したシグナリング経路を刺激する所定の化学培地である）。
（発明２）
発明１に記載の方法であって、前記内胚葉誘導培地が線維芽細胞成長因子を含む該方法。
（発明３）
発明１又は発明２に記載の方法であって、ＳＭＡＤ２及びＳＭＡＤ３を介したシグナリング経路を刺激する第一のＴＧＦβリガンドを前記内胚葉誘導培地が含む該方法。
（発明４）
発明３に記載の方法であって、前記第一のＴＧＦβリガンドがアクチビンである該方法。
（発明５）
発明１〜４の何れか１項に記載の方法であって、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ５及びＳＭＡＤ９を介したシグナリング経路を刺激する第二のＴＧＦβリガンドを前記内胚葉誘導培地が含む該方法。
（発明６）
発明５に記載の方法であって、前記第二のＴＧＦβリガンドが骨形成蛋白質である該方法。
（発明７）
発明１〜６の何れか１項に記載の方法であって、前記内胚葉誘導培地が、ＰＩ３Ｋ阻害剤及びＧＳＫ３β阻害剤を含む該方法。
（発明８）
発明７に記載の方法であって、前記ＰＩ３Ｋ阻害剤がＬＹ２９４００２である該方法。
（発明９）
発明７又は発明８に記載の方法であって、前記ＧＳＫ３β阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１である該方法。
（発明１０）
発明１〜９の何れか１項に記載の方法であって、ＳＭＡＤ２及びＳＭＡＤ３を介したシグナリング経路を刺激する第一のＴＧＦβリガンドを前記肝臓性誘導培地が含む該方法。
（発明１１）
発明１０に記載の方法であって、前記第一のＴＧＦβリガンドがアクチビンである該方法。
（発明１２）
発明１〜１１の何れか１項に記載の方法であって、前記ステップ（ｉｉ）が、以下のサブステップを含む該方法：
（ａ）ｉＰＳＣの前記集団を前記内胚葉誘導培地中で培養すること；
（ｂ）ＧＳＫ３β阻害剤が欠如した前記内胚葉誘導培地中で前記集団を更に培養すること；並びに
（ｃ）前方胚体内胚葉（ＡＤＥ）誘導培地中で前記集団を更に培養して、ＡＤＥ細胞の前記集団を生成すること（ここで、該培地はＳＭＡＤ２及びＳＭＡＤ３シグナリング経路を刺激し、並びに線維芽細胞成長因子活性を有する）。
（発明１３）
発明１２に記載の方法であって、前記ＡＤＥ誘導培地が線維芽細胞成長因子を含む該方法。
（発明１４）
発明１２又は発明１３に記載の方法であって、ＳＭＡＤ２及びＳＭＡＤ３を介したシグナリング経路を刺激する第一のＴＧＦβリガンドを前記ＡＥ誘導培地が含む該方法。
（発明１５）
発明１４に記載の方法であって、前記第一のＴＧＦβリガンドがアクチビンである該方法。
（発明１６）
発明１２〜１５の何れか１項に記載の方法であって、前記集団を、前記サブステップａ）〜ｃ）のそれぞれにおいて２４時間培養する該方法。
（発明１７）
発明１〜１６の何れか１項に記載の方法であって、更に以下のステップを含む方法：
（ｉｖ）前記肝臓性前駆細胞の集団を肝臓性成熟培地中で培養し、肝細胞の集団を生成するステップ。
（発明１８）
発明１７に記載の方法であって、前記肝臓性前駆細胞の集団を１０〜２０日間培養し、前記肝細胞の集団を生成するステップ。
（発明１９）
発明１７又は発明１８に記載の方法であって、前記肝細胞の集団によるアルブミンの産生及び／又はα１-アンチトリプシンの産生を測定するステップを含む該方法。
（発明２０）
発明１７〜１９の何れか１項に記載の方法であって、少なくとも８０％の前記肝細胞の集団がアルブミン及び／又はα１-アンチトリプシンを発現する該方法。
（発明２１）
発明１７〜２０の何れか１項に記載の方法であって、前記肝臓性前駆細胞の集団又は肝細胞を増殖させるステップを含む該方法。
（発明２２）
発明１７〜２１の何れか１項に記載の方法であって、前記肝臓性前駆細胞又は肝細胞の集団を培養又は維持するステップを含む該方法。
（発明２３）
発明１７〜２２の何れか１項に記載の方法であって、前記肝臓性前駆細胞又は肝細胞の集団を保存するステップを含む該方法。
（発明２４）
発明１〜２３何れか１項に記載の方法であって、前記肝臓性前駆細胞又は肝細胞の集団を、医薬的に許容可能な賦形剤と混合するステップを含む該方法。
（発明２５）
発明１〜２４何れか１項に記載の方法であって、前記ｉＰＳ細胞がヒトｉＰＳ細胞である該方法。
（発明２６）
発明１〜２５何れか１項に記載の方法であって、前記ｉＰＳ細胞が継代された回数が３０回以下である該方法。
（発明２７）
発明１〜２６何れか１項に記載の方法であって、前記ｉＰＳ細胞が１の個体から得た線維芽細胞に由来する該方法。
（発明２８）
発明１〜２７何れか１項に記載の方法であって、前記ｉＰＳ細胞は、損傷した又は機能不全の肝臓組織を有する１の個体から得た細胞に由来し、そして、前記集団中の前記肝細胞が正常な表現型を示す該方法。
（発明２９）
発明２８に記載の方法であって、肝臓病に関連した遺伝的変異又は遺伝的欠陥が、前記ｉＰＳ細胞において修復され、その結果、前記肝細胞が正常な表現型を示す該方法。
（発明３０）
発明２９に記載の方法であって、前記肝臓病が遺伝的代謝異常（ＩＭＤ）である該方法。
（発明３１）
発明３０に記載の方法であって、前記ＩＭＤが以下の群から選ばれる該方法：α１アンチトリプシン欠損、糖原病、家族性高コレステロール血症、遺伝性高チロシン血症、クリグラー・ナジャール症候群、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損、第ＩＸ因子欠損、ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、Ｄｕｂｉｎ−Ｊｏｈｎｓｏｎ症候群、家族性アミロイドーシス、及びレフサム病。
（発明３２）
発明２９に記載の方法であって、前記遺伝的変異又は遺伝的欠陥が、Ａ１ＡＴにおけるＧｌｕ３４２Ｌｙｓ変異であり、前記肝臓病がα１アンチトリプシン欠損である該方法。
（発明３３）
発明１〜２７の何れか１項に記載の方法であって、前記ｉＰＳ細胞が、肝臓病を有する個体から得た細胞に由来し、前記集団中の前記肝細胞が病気の表現型を示す該方法。
（発明３４）
発明３３に記載の方法であって、前記肝臓病が遺伝的代謝異常である該方法。
（発明３５）
発明３４に記載の方法であって、前記ＩＭＤが以下の群から選ばれる該方法：α１アンチトリプシン欠損、糖原病、家族性高コレステロール血症、遺伝性高チロシン血症、クリグラー・ナジャール症候群、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損、第ＩＸ因子欠損、ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、Ｄｕｂｉｎ−Ｊｏｈｎｓｏｎ症候群、家族性アミロイドーシス、及びレフサム病。
（発明３６）
発明３３〜３５の何れか１項に記載の方法であって、前記肝細胞の集団における１種以上の病理を検出又は測定するステップを含む該方法。
（発明３７）
発明３６に記載の方法であって、前記肝細胞の集団において以下の１種以上の事象を測定又は検出することによって前記病理を検出する該方法：蛋白質の凝集又は重合化；ＥＲ内での蛋白質封じ込め；コレステロール取り込み；脂質及び／又はグリコーゲン蓄積；並びに乳酸の生成。
（発明３８）
発明３３〜３７の何れか１項に記載の方法であって、前記集団中の前記肝細胞における遺伝的変異又は遺伝的欠陥を修復して、前記肝細胞が正常な表現型を示すステップを含む該方法。
（発明３９）
発明１〜３５又は３８の何れか１項に記載の方法によって製造され、単離された肝臓性前駆細胞又は肝細胞の集団であって、前記前駆細胞又は肝細胞が正常な表現型を示す該集団。
（発明４０）
ヒト又は動物の身体を治療する方法において使用するための発明３９に記載の集団。
（発明４１）
損傷した又は機能不全の肝臓性組織を有する患者を治療する方法において使用するための発明４０に記載の集団。
（発明４２）
発明３６〜３７の何れか１項に記載の方法によって製造された肝細胞の集団であって、前記肝細胞が病気の表現型を示す該集団。
（発明４３）
損傷した又は機能不全の肝臓性組織を有する患者を治療する方法であって、以下のステップを含む方法：
肝細胞の発明３９に記載の肝細胞の集団を、該集団を必要とする個体に投与するステップ。
（発明４４）
損傷した又は機能不全の肝臓性組織を有する患者の治療で使用するための医薬の製造における発明３９に記載の集団の使用。
（発明４５）
化合物をスクリーニングする方法であって、以下のステップを含む方法：
発明１〜３８の何れか１項に記載の方法で製造され、単離された肝細胞を試験化合物に接触させるステップ；及び
前記肝細胞に対する前記試験化合物の効果、及び／又は前記試験化合物に対する前記肝細胞の効果を測定するステップ。
（発明４６）
発明４５に記載の方法であって、試験化合物が無い場合と比べて試験化合物が有るときの前記肝細胞の成長若しくは生存率、又は１種以上の肝細胞の機能を実践する前記肝細胞の能力を測定するステップを含む該方法（ここで、成長が低下すること、生存率が低下すること、又は１種以上の肝細胞の機能を実践する能力が低下することは、前記化合物が肝臓毒性の効果を有することを示す）。
（発明４７）
発明４６に記載の方法であって、前記肝細胞による前記試験化合物の代謝を測定する該方法。
（発明４８）
発明４７に記載の方法であって、以下の事象を決定又は測定するステップを含む方法：
前記試験化合物の量若しくは濃度の減少、及び／又は
前記試験化合物の代謝産物の量若しくは濃度の増加。
（発明４９）
肝臓病の治療において有用な化合物をスクリーニングするための方法であって、以下のステップを含む該方法：
発明１〜３８の何れか１項に記載の方法で製造された肝細胞の集団を試験化合物と接触させるステップ；、及び
前記肝細胞に対する前記試験化合物の効果を測定するステップ。
（発明５０）
発明４９に記載の方法であって、前記肝細胞が病気の表現型を示し、前記肝細胞における１種以上の病理に対する前記試験化合物の効果を測定する該方法。
（発明５１）
発明５０に記載の方法であって、以下の１種以上の事象に対する前記試験化合物の効果を決定する該方法：蛋白質の凝集又は重合化；ＥＲ内での蛋白質封じ込め；コレステロール取り込み；脂質及び／又はグリコーゲン蓄積；並びに乳酸の生成。
（発明５２）
発明５０〜５１の何れか１項に記載の方法であって、試験化合物が無い場合と比べて試験化合物が有るときの、前記肝細胞における１種以上の病理が減少又は改善することにより、前記肝臓病の治療において前記試験化合物が有用となり得ることを示す該方法。
（発明５３）
発明４９に記載の方法であって、前記肝細胞が正常な表現型を示す方法であり、１種以上の肝細胞の機能を実践する前記肝細胞の能力に対する前記試験化合物の効果を測定する該方法。
（発明５４）
発明５３に記載の方法であって、前記１種以上の肝細胞の機能が以下から選択される該方法：解毒、グリコーゲン貯蓄、ＡＡＴ又はアルブミンの分泌、胆汁の生成、 トロンボポイエチンの生成、アンギオテンシノゲンの生成、アンモニアから尿素への変換、コレステロール合成、グリコーゲン分解、グリコーゲン合成、及び脂質生成。
（発明５５）
発明５３〜５４の何れか１項に記載の方法であって、試験化合物が無い場合と比べて試験化合物が有るときの、１種以上の肝細胞の機能を実践する前記肝細胞の能力が増加することにより、前記肝臓病の治療において前記試験化合物が有用となり得ることを示す該方法。

【0208】

参考文献
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３０． Ｍｉｒａｎｄａ， Ｅ．， ｅｔ ａｌ．， （ｉｎ ｐｒｅｓｓ − Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ）

【0209】

【表1】

【0210】

【表2】

【0211】

【表3】

【0212】

【表4】

【0213】

【表5】

【図2】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図4F】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19a】

【図19b】

【図19c】

【図19d】

【図19e】

【図19f】

【図19g】

【図19h】

【図1】

【図3】

【図9】