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特許6064110冬虫夏草のリボソームＲＮＡ遺伝子塩基配列および冬虫夏草の種を分類する方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6064110
(24)【登録日】2017年1月6日
(45)【発行日】2017年2月15日
(54)【発明の名称】冬虫夏草のリボソームＲＮＡ遺伝子塩基配列および冬虫夏草の種を分類する方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/68 20060101AFI20170206BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20170206BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/68 A
C12N15/00 AZNA
【請求項の数】6
【全頁数】46
(21)【出願番号】特願2001-4805(P2001-4805)
(22)【出願日】2001年1月12日
(65)【公開番号】特開2002-204696(P2002-204696A)
(43)【公開日】2002年7月23日
【審査請求日】2008年1月10日
【審判番号】不服2011-14488(P2011-14488/J1)
【審判請求日】2011年7月5日
(73)【特許権者】
【識別番号】597087804
【氏名又は名称】大蔵製薬株式会社
(73)【特許権者】
【識別番号】597056659
【氏名又は名称】金城 典子
(74)【代理人】
【識別番号】100143959
【弁理士】
【氏名又は名称】住吉 秀一
(74)【代理人】
【識別番号】100167852
【弁理士】
【氏名又は名称】宮城 康史
(72)【発明者】
【氏名】金城 典子
【合議体】
【審判長】
鈴木 恵理子
【審判官】
植原 克典
【審判官】
高堀 栄二
(56)【参考文献】
【文献】
日本菌学会第４４回大会講演要旨集（２０００）ｐ．４０，２１２
【文献】
Ｊｕｎｗｕ Ｘｉｔｏｎｇ（２０００）Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．４，ｐ．４９２−４９７
【文献】
特別研究報告集，通商産業省工業技術院，２００１年１月１０日，ｐ．３７４−３７５
【文献】
Ｇｅｎｂａｎｋ アクセッション番号 ＡＪ３０１９９３
【文献】
Ｇｅｎｂａｎｋ アクセッション番号 ＡＦ１６０２２９
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
C12N15/00-90
C12Q1/68
WPI
JSTPLUS
JMEDPLUS
JST7580
MEDLINE
CA
BIOSIS
GENBANK
EMBL
DDBJ
GENESEQ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
冬虫夏草の分類において、冬虫夏草のリボソームＲＮＡのＩＴＳ領域を、配列表のＩＤＮＯ：２、５、８、１１、１４、１７、２０、２３、２６、２９、３１のいずれかに記載の塩基配列と比較し、その異同により分類することを特徴とする、冬虫夏草の分類方法。
【請求項2】
上記分類方法において、上記比較が、上記領域の塩基配列を決定し、その相同性の割合を測定して比較するものであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
上記比較における塩基配列の決定において、配列表のＩＤ ＮＯ：２、５、８、１１、１４、１７、２０、２３、２６、２９、３１で示される塩基配列または配列表のＩＤ ＮＯ：２、５、８、１１、１４、１７、２０、２３、２６、２９、３１で示される塩基配列の相補的配列のうち、連続する１５ないし４０塩基からなる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを、塩基配列決定のプライマーとして用いることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
上記塩基配列の決定におけるプライマーが、配列表のＩＤＮＯ：２の塩基番号５７から１９３及び３５１から５３８、ＩＤＮＯ：５の塩基番号５７から２１７及び３７４から５５０、ＩＤ ＮＯ：８の塩基番号５７から２１６及び３７４から５５０、ＮＯ：１１の塩基番号５７から２１６及び３７４から５５０、ＮＯ：１４の塩基番号５７から２１６及び３７４から５５０、ＩＤＮＯ：１７の塩基番号５７から２１６及び３７４から５５０、ＩＤ ＮＯ：２０の塩基番号５７から２１６及び３７４から５５０、ＩＤＮＯ：２３の塩基番号５７から２１６及び３７５から５３８、ＩＤ ＮＯ：２６の塩基番号５７から２０７及び３７２から５３１、ＩＤＮＯ：２９の塩基番号５７から２１７及び３７４から５５０、ＩＤ ＮＯ：３１の塩基番号５７から２１６及び３７２から５４９で示される塩基配列またはその相補的配列のうち、連続する１５ないし４０塩基からなる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
上記分類方法における上記比較が、配列表のＩＤ ＮＯ：２、５、８、１１、１４、１７、２０、２３、２６、２９、３１で示される塩基配列または配列表のＩＤ ＮＯ：２、５、８、１１、１４、１７、２０、２３、２６、２９、３１で示される塩基配列の相補的配列のうち、連続する１５ないし４０塩基からなる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる、ＤＮＡ増幅の過程を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
上記ＤＮＡ増幅のプライマーが、配列表のＩＤ ＮＯ：２の塩基番号５７から１９３及び３５１から５３８、ＩＤ ＮＯ：５の塩基番号５７から２１７及び３７４から５５０、ＩＤＮＯ：８の塩基番号５７から２１６及び３７４から５５０、ＮＯ：１１の塩基番号５７から２１６及び３７４から５５０、ＮＯ：１４の塩基番号５７から２１６及び３７４から５５０、ＩＤＮＯ：１７の塩基番号５７から２１６及び３７４から５５０、ＩＤ ＮＯ：２０の塩基番号５７から２１６及び３７４から５５０、ＩＤＮＯ：２３の塩基番号５７から２１６及び３７５から５３８、ＩＤ ＮＯ：２６の塩基番号５７から２０７及び３７２から５３１、ＩＤＮＯ：２９の塩基番号５７から２１７及び３７４から５５０、ＩＤ ＮＯ：３１の塩基番号５７から２１６及び３７２から５４９で示される塩基配列またはその相補的配列のうち、連続する１５ないし４０塩基からなる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は冬虫夏草のリボソームRNA遺伝子塩基配列とそれを利用した分類方法に関する。【背景技術】
【0002】
冬虫夏草は子嚢菌(バッカクキン科)の一種で、漢方薬として珍重されている。冬虫夏草とは昆虫やクモに寄生し、子実体を形成する菌類の総称であり、一般に「広義には昆虫類・蜘蛛類に寄生してその体上に著しい子実体を形成するノムシタケ属（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ）やＨｉｒｓｕｔｅｌｌａ属などの菌類をいうが、狭義には中国においてヤガ科の幼虫に生じるＣｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓを虫体とともに採って乾燥した生薬を指す」（生物学辞典、岩波書店）とされている。【0003】
冬虫夏草の薬効については近年学術的論文でも多く報告がなされており、気管支の拡張作用や鎮静作用（Furuya et al, 1983, Phytochem. 22: 2509-2512、生本ら、1991、薬学雑誌 111: 504-509）、代謝機能や免疫機能の制御・亢進、血圧低下作用、細胞増殖への関与等、様々な効果が確認されている（Chiou WF. et al. Life Sci. 2000, 66(14): 1369-1376、 Zhu JS et al. J Altern Complement Med. 1998 Winter; 4(4): 429-457）。【0004】
上記のように、自然界において昆虫や蜘蛛類に寄生し子実体を形成する菌には、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ属だけではなく、Ｈｉｒｓｕｔｅｌｌａ属やＩｓａｒｉａ属等もあり、これらのどの種類が漢方薬としての冬虫夏草に含められるかの判断は、ほとんど経験によるものである。また、冬虫夏草とされたものについてのさらに詳細な分類は、主に宿主と産地に基づいて行われてきた。【0005】
例えば、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｃｒａｓｓｉｓｐｏｒａは冬虫夏草として薬効が認められているが、１９９０年代に入るまで、分類学においてＣｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓに含まれ、漢方薬の分野でも冬虫夏草を区別する最も慣用的な方法である、産地による判別によって「雲南省の冬虫夏草」として区別されていたにすぎない。Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｃｒａｓｓｉｓｐｏｒａがＣ．ｓｉｎｅｎｓｉｓと同一であるとされていた理由は、どちらもコウモリガの幼虫に寄生することと、肉眼的な形態が酷似していることである。しかしながらＣｏｒｄｙｃｅｐｓ ｃｒａｓｓｉｓｐｏｒａは、冬虫夏草として最も一般的なＣｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓとは明らかに異なる薬効があることが示されている（Ｋｉｎｊｏら、Ａｓｉａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｙｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ、１９９６）。【0006】
さらに、冬虫夏草として最も一般に用いられているＣ．ｓｉｎｅｎｓｉｓについても、地域によっていくつかに分類され、それぞれ効能の種類や程度の違いが認められている。しかしそれらを明確に分類する方法はなく、購買者にとって、薬効の種類や強度の違いの種類分けが非常に曖昧でわかり難いものになっている。また、天然の冬虫夏草はその需要に答えるほど採取されず、市場に出回っている冬虫夏草がいくつかの原産地から採取され、混合されたものであっても、それを確認する方法がなく、購買者のみならず当業者にとっても明確な分類法が望まれている。【0007】
一方近年の分子遺伝学の発展は、生物分類学における方法論に多大な影響を与えた。すなわちこれまでの形態学的な分類に加えて、ある特定の遺伝子を選択して、生物種についてその塩基配列を比較すると、遺伝子の相同性からその進化の過程を推定し、分類することが可能となった。【0008】
生物種による遺伝子の分散の度合いは、基本的な生命活動をつかさどる蛋白質をコードする遺伝子で驚くほど保存されている一方、多くの遺伝子ではそれぞれの蛋白質の機能の分散に従って変化し、もはや同一起源であるかどうかの判断さえ難しいものまで様々である。従って分類の対象となる生物種の範囲に応じて適切な遺伝子領域を選択することで、例えば鯨と他の哺乳類との関係のような、広い範囲の近縁関係から、カラスの地域差のような、ごく限定された範囲内の詳細な分類まで可能となる。このような進化上の相対距離の推定及び分類に最も一般的に利用される遺伝子としては、リボソームＲＮＡ遺伝子（Bruce Alberts et al., Essential Cell Biology,, Garland Publishing Inc., 439-440, 1998）やミトコンドリアの遺伝子（宝来聰、細胞工学、１４巻、１０３１〜１０３５、１９９５）等が数多く報告されている。【0009】
真核生物リボソームＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼによって転写されたＲＮＡがプロセッシングを受けて、いくつかの断片に分かれ、リボソームを構成する小サブユニット（ＳＳ；Ｓｍａｌｌ Ｓｕｂｕｎｉｔ）と大サブユニット（ＬＳ；Ｌａｒｇｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ）に組み込まれる。小サブユニットに組み込まれるＲＮＡは１８ＳｒＲＮＡ（「１８Ｓ」は超遠心での沈降速度を表す）とよばれ、約１９００（酵母）ないし２０００塩基（ヒト）から成り、大サブユニットに組み込まれるＲＮＡは２８ＳｒＲＮＡと５．８ＳｒＲＮＡの２種類で、２８ＳｒＲＮＡは約４７００（酵母）ないし５０００塩基、５．８ＳｒＲＮＡは約１６０塩基（酵母またはヒト）から成る。【0010】
これらはｒＲＮＡ遺伝子上に１８ＳｒＲＮＡ（以下、「ＳＳ領域」という）、５．８ＳｒＲＮＡ、２８ＳｒＲＮＡ（以下、「ＬＳ領域」という）の順に縦列にならび、１８ＳｒＲＮＡと５．８ＳｒＲＮＡ、５．８ＳｒＲＮＡと２８ＳｒＲＮＡの間はＩＴＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ Ｓｐａｃｅｒ）とよばれる非転写領域によって分断されている。なおこの２つのＩＴＳとその間にある５．８Ｓを、以下、まとめてＩＴＳ領域と称している(図１参照)。【0011】
これまで冬虫夏草のリボソームＲＮＡの配列については、Ｃ．ｓｉｎｅｎｓｉｓのＩＴＳを中心としたごく限られた領域についてのみ、いくつか報告されているが、それぞれの産地と関連づけた報告はされていない。また、冬虫夏草のなかでも薬効が高いと言われているＣ．ｃｒａｓｓｉｓｐｏｒａのリボソームＲＮＡ遺伝子配列については、まったく未報告である。【発明が解決しようとする課題】
【0012】
本発明の目的はＣｏｒｄｙｃｅｐｓ ｃｒａｓｓｉｓｐｏｒａとＣｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓの産地別各種のリボソームＲＮＡ遺伝子配列の一部を提供し、冬虫夏草の産地別分類について、客観的鑑別方法を提供することである。【課題を解決するための手段】
【0013】
以上のような課題を解決すべく、本願発明者は、実際に当地に赴き、冬虫夏草の主な生育地で自らサンプル採取を行い、さらに顕微鏡下において形態上の厳しい選択をした上で、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｃｒａｓｓｉｓｐｏｒａ（中国雲南産）とＣｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓのＭａｒｃｈ（中国甘粛産）、Ｓｅｉｓａｚａｎ（中国青海産）、Ｄｅｒｕｇｅ（中国四川産）、Ｇｙｏｋｕｊｕ（中国青海産）、Ｂｉｎｇｏ（チベット産）、Ｒｏｈｏ（中国四川産）、Ｙａｋｕｚａｎ（中国貴州産）、Ｇｙｏｋｕｒｙｕｓｅｔｕｚａｎ（中国雲南産）、Ｎｙａｒａｍｕ（ヒマラヤ産）、Ｒｕｓｙａｓｙａ（ヒマラヤ産）のそれぞれのリボソームＲＮＡ遺伝子の一部、即ちＳＳ領域からＩＴＳ領域、及びＬＳ領域にいたる約３．７Ｋｂｐの塩基配列を決定した。その結果、当該配列において相互鑑別に用いることができる程度の相違を見出し、これに基づいて本発明を完成させたものである。【0014】
即ち、本発明の塩基配列の第１の態様は、配列表のＩＤ ＮＯ：１で示される、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｃｒａｓｓｉｓｐｏｒａにおけるリボソームＲＮＡ遺伝子の一部である塩基配列である。上述したリボソームＲＮＡ遺伝子の一部は、ＳＳ領域の一部、即ちＳＳ領域の３'側約１．８Ｋｂｐの塩基配列である。【0015】
本発明の塩基配列の第２の態様は、配列表のＩＤ ＮＯ：２で示される、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｃｒａｓｓｉｓｐｏｒａにおけるリボソームＲＮＡ遺伝子の一部である塩基配列である。上述したリボソームＲＮＡ遺伝子の一部は、ＩＴＳ領域、即ちＩＴＳ１、５.８Ｓ、ＩＴＳ２を含む約０.７Ｋｂｐの塩基配列である。【0016】
本発明の塩基配列の第３の態様は、配列表のＩＤ ＮＯ：３で示される、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｃｒａｓｓｉｓｐｏｒａにおけるリボソームＲＮＡ遺伝子の一部である塩基配列である。上述したリボソームＲＮＡ遺伝子の一部は、ＬＳ領域の一部、即ちＬＳ領域の５’側約１.３Ｋｂｐの塩基配列である。【0017】
本発明の塩基配列の第４の態様は、配列表のＩＤ ＮＯ：４で示される、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ Ｍａｒｃｈ におけるリボソームＲＮＡ遺伝子の一部である塩基配列である。上述したリボソームＲＮＡ遺伝子の一部は、ＳＳ領域の一部、即ちＳＳ領域の３’側約１.８Ｋｂｐの塩基配列である。【0018】
本発明の塩基配列の第５の態様は、配列表のＩＤ ＮＯ：５で示される、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ Ｍａｒｃｈ におけるリボソームＲＮＡ遺伝子の一部である塩基配列である。上述したリボソームＲＮＡ遺伝子の一部は、ＩＴＳ領域、即ちＩＴＳ１、５．８Ｓ、ＩＴＳ２を含む約０.７Ｋｂｐの塩基配列である。【0019】
本発明の塩基配列の第６の態様は、配列表のＩＤ ＮＯ：６で示される、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ Ｍａｒｃｈ におけるリボソームＲＮＡ遺伝子の一部である塩基配列である。上述したリボソームＲＮＡ遺伝子の一部は、ＬＳ領域の一部、即ちＬＳ領域の５’側約1.４Ｋｂｐの塩基配列である。【0020】
本発明の塩基配列の第７の態様は、配列表のＩＤ ＮＯ：７で示される、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ ＳｅｉｓａｚａｎにおけるリボソームＲＮＡ遺伝子の一部である塩基配列である。上述したリボソームＲＮＡ遺伝子の一部は、ＳＳ領域の一部、即ちＳＳ領域の３’側約１.８Ｋｂｐの塩基配列である。【0021】
本発明の塩基配列の第８の態様は、配列表のＩＤ ＮＯ：８で示される、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ ＳｅｉｓａｚａｎにおけるリボソームＲＮＡ遺伝子の一部である塩基配列である。上述したリボソームＲＮＡ遺伝子の一部は、ＩＴＳ領域、即ちＩＴＳ１、５．８Ｓ、ＩＴＳ２を含む約０．６Ｋｂｐの塩基配列である。【0022】
本発明の塩基配列の第９の態様は、配列表のＩＤ ＮＯ：９で示される、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ ＳｅｉｓａｚａｎにおけるリボソームＲＮＡ遺伝子の一部である塩基配列である。上述したリボソームＲＮＡ遺伝子の一部は、ＬＳ領域の一部、即ちＬＳ領域の５'側約1.４Ｋｂｐの塩基配列である。【0023】
本発明の塩基配列の第１０の態様は、配列表のＩＤ ＮＯ：１０で示される、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ ＤｅｒｕｇｅにおけるリボソームＲＮＡ遺伝子の一部である塩基配列である。上述したリボソームＲＮＡ遺伝子の一部は、ＳＳ領域の一部、即ちＳＳ領域の３'側約１.８Ｋｂｐの塩基配列である。【0024】
本発明の塩基配列の第１１の態様は、配列表のＩＤ ＮＯ：１１で示される、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ ＤｅｒｕｇｅにおけるリボソームＲＮＡ遺伝子の一部である塩基配列である。上述したリボソームＲＮＡ遺伝子の一部は、ＩＴＳ領域、即ちＩＴＳ１、５．８Ｓ、ＩＴＳ２を含む約０．６Ｋｂｐの塩基配列である。【0025】
本発明の塩基配列の第１２の態様は、配列表のＩＤ ＮＯ：１２で示される、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ ＤｅｒｕｇｅにおけるリボソームＲＮＡ遺伝子の一部である塩基配列である。上述したリボソームＲＮＡ遺伝子の一部は、ＬＳ領域の一部、即ちＬＳ領域の５'側約1.４Ｋｂｐの塩基配列である。【0026】
本発明の塩基配列の第１３の態様は、配列表のＩＤ ＮＯ：１３で示される、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ ＧｙｏｋｕｊｕにおけるリボソームＲＮＡ遺伝子の一部である塩基配列である。上述したリボソームＲＮＡ遺伝子の一部は、ＳＳ領域の一部、即ちＳＳ領域の３'側約１.８Ｋｂｐの塩基配列である。【0027】
本発明の塩基配列の第１４の態様は、配列表のＩＤ ＮＯ：１４で示される、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ ＧｙｏｋｕｊｕにおけるリボソームＲＮＡ遺伝子の一部である塩基配列である。上述したリボソームＲＮＡ遺伝子の一部は、ＩＴＳ領域、即ちＩＴＳ１、５.８Ｓ、ＩＴＳ２を含む約０.７Ｋｂｐの塩基配列である。【0028】
本発明の塩基配列の第１５の態様は、配列表のＩＤ ＮＯ：１５で示される、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ ＧｙｏｋｕｊｕにおけるリボソームＲＮＡ遺伝子の一部である塩基配列である。上述したリボソームＲＮＡ遺伝子の一部は、ＬＳ領域の一部、即ちＬＳ領域の５'側約１.４Ｋｂｐの塩基配列である。【0029】
本発明の塩基配列の第１６の態様は、配列表のＩＤ ＮＯ：１６で示される、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ ＢｉｎｇｏにおけるリボソームＲＮＡ遺伝子の一部である塩基配列である。上述したリボソームＲＮＡ遺伝子の一部は、ＳＳ領域の一部、即ちＳＳ領域の３'側約１.８Ｋｂｐの塩基配列である。【0030】
本発明の塩基配列の第１７の態様は、配列表のＩＤ ＮＯ：１７で示される、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ ＢｉｎｇｏにおけるリボソームＲＮＡ遺伝子の一部である塩基配列である。上述したリボソームＲＮＡ遺伝子の一部は、ＩＴＳ領域、即ちＩＴＳ１、５.８Ｓ、ＩＴＳ２を含む約０.６Ｋｂｐの塩基配列である。【0031】
本発明の塩基配列の第１８の態様は、配列表のＩＤ ＮＯ：１８で示される、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ ＢｉｎｇｏにおけるリボソームＲＮＡ遺伝子の一部である塩基配列である。上述したリボソームＲＮＡ遺伝子の一部は、ＬＳ領域の一部、即ちＬＳ領域の５'側約1.４Ｋｂｐの塩基配列である。【0032】
本発明の塩基配列の第１９の態様は、配列表のＩＤ ＮＯ：１９で示される、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ ＲｏｈｏにおけるリボソームＲＮＡ遺伝子の一部である塩基配列である。上述したリボソームＲＮＡ遺伝子の一部は、ＳＳ領域の一部、即ちＳＳ領域の３'側約１.８Ｋｂｐの塩基配列である。【0033】
本発明の塩基配列の第２０の態様は、配列表のＩＤ ＮＯ：２０で示される、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ ＲｏｈｏにおけるリボソームＲＮＡ遺伝子の一部である塩基配列である。上述したリボソームＲＮＡ遺伝子の一部は、ＩＴＳ領域、即ちＩＴＳ１、５.８Ｓ、ＩＴＳ２を含む約０.６Ｋｂｐの塩基配列である。【0034】
本発明の塩基配列の第２１の態様は、配列表のＩＤ ＮＯ：２１で示される、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ ＲｏｈｏにおけるリボソームＲＮＡ遺伝子の一部である塩基配列である。上述したリボソームＲＮＡ遺伝子の一部は、ＬＳ領域の一部、即ちＬＳ領域の５'側約1.４Ｋｂｐの塩基配列である。【0035】
本発明の塩基配列の第２２の態様は、配列表のＩＤ ＮＯ：２２で示される、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ ＹａｋｕｚａｎにおけるリボソームＲＮＡ遺伝子の一部である塩基配列である。上述したリボソームＲＮＡ遺伝子の一部は、ＳＳ領域の一部、即ちＳＳ領域の３'側約1.8Ｋｂｐの塩基配列である。【0036】
本発明の塩基配列の第２３の態様は、配列表のＩＤ ＮＯ：２３で示される、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ ＹａｋｕｚａｎにおけるリボソームＲＮＡ遺伝子の一部である塩基配列である。上述したリボソームＲＮＡ遺伝子の一部は、ＩＴＳ領域、即ちＩＴＳ１、５.８Ｓ、ＩＴＳ２を含む約０.７Ｋｂｐの塩基配列である。【0037】
本発明の塩基配列の第２４の態様は、配列表のＩＤ ＮＯ：２４で示される、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ ＹａｋｕｚａｎにおけるリボソームＲＮＡ遺伝子の一部である塩基配列である。上述したリボソームＲＮＡ遺伝子の一部は、ＬＳ領域の一部、即ちＬＳ領域の５'側約１.４Ｋｂｐの塩基配列である。【0038】
本発明の塩基配列の第２５の態様は、配列表のＩＤ ＮＯ：２５で示される、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ ＧｙｏｋｕｒｙｕｓｅｔｕｚａｎにおけるリボソームＲＮＡ遺伝子の一部である塩基配列である。上述したリボソームＲＮＡ遺伝子の一部は、ＳＳ領域の一部、即ちＳＳ領域の３'側約１.８Ｋｂｐの塩基配列である。【0039】
本発明の塩基配列の第２６の態様は、配列表のＩＤ ＮＯ：２６で示される、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ ＧｙｏｋｕｒｙｕｓｅｔｕｚａｎにおけるリボソームＲＮＡ遺伝子の一部である塩基配列である。上述したリボソームＲＮＡ遺伝子の一部は、ＩＴＳ領域、即ちＩＴＳ１、５.８Ｓ，ＩＴＳ２を含む約０.７Ｋｂｐの塩基配列である。【0040】
本発明の塩基配列の第２７の態様は、配列表のＩＤ ＮＯ：２７で示される、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ ＧｙｏｋｕｒｙｕｓｅｔｕｚａｎにおけるリボソームＲＮＡ遺伝子の一部である塩基配列である。上述したリボソームＲＮＡ遺伝子の一部は、ＬＳ領域の一部、即ちＬＳ領域の５'側約１.４Ｋｂｐの塩基配列である。【0041】
本発明の塩基配列の第２８の態様は、配列表のＩＤ ＮＯ：２８で示される、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ ＮｙａｒａｍｕにおけるリボソームＲＮＡ遺伝子の一部である塩基配列である。上述したリボソームＲＮＡ遺伝子の一部は、ＳＳ領域の一部、即ちＳＳ領域の３'側約１.８Ｋｂｐの塩基配列である。【0042】
本発明の塩基配列の第２９の態様は、配列表のＩＤ ＮＯ：２９で示される、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ ＮｙａｒａｍｕにおけるリボソームＲＮＡ遺伝子の一部である塩基配列である。上述したリボソームＲＮＡ遺伝子の一部は、ＩＴＳ領域、即ちＩＴＳ１、５.８Ｓ、ＩＴＳ２を含む約０.７Ｋｂｐの塩基配列である。【0043】
本発明の塩基配列の第３０の態様は、配列表のＩＤ ＮＯ：３０で示される、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ ＮｙａｒａｍｕにおけるリボソームＲＮＡ遺伝子の一部である塩基配列である。上述したリボソームＲＮＡ遺伝子の一部は、ＬＳ領域の一部、即ちＬＳ領域の５'側約１.４Ｋｂｐの塩基配列である。【0044】
本発明の塩基配列の第３１の態様は、配列表のＩＤ ＮＯ：３１で示される、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ ＲｕｓｙａｓｙａにおけるリボソームＲＮＡ遺伝子の一部である塩基配列である。上述したリボソームＲＮＡ遺伝子の一部は、ＩＴＳ領域、即ちＩＴＳ１、５.８Ｓ、ＩＴＳ２を含む約０.７Ｋｂｐの塩基配列である。【0045】
本発明の塩基配列の第３２の態様は、配列表のＩＤ ＮＯ：１から３１で示される塩基配列において、１もしくは複数の塩基配列が付加、欠失もしくは置換されていることを特徴とする、上記リボソームＲＮＡ遺伝子の一部である塩基配列である。【0046】
また本発明のプライマーの第１の態様は、配列表のＩＤ ＮＯ：１からＮＯ：３１で示される塩基配列または配列表のＩＤ ＮＯ：１からＮＯ：３１で示される塩基配列の相補的配列のうち、連続する１５ないし４０塩基からなる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、塩基配列決定用のプライマーである。【0047】
本発明のプライマーの第２の態様は、配列表のＩＤ ＮＯ：１からＮＯ：３１で示される塩基配列または配列表のＩＤ ＮＯ：１からＮＯ：３１で示される塩基配列の相補的配列のうち、連続する１５ないし４０塩基からなる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、ＤＮＡ増幅用のプライマーである。【0048】
本発明のプライマーの第３の態様は、配列表のＩＤ ＮＯ：２の塩基番号５７から１９３及び３５１から５３８、ＩＤ ＮＯ：５の塩基番号５７から２１７及び３７４から５５０、ＩＤ ＮＯ：８の塩基番号５７から２１６及び３７４から５５０、ＮＯ：１１の塩基番号５７から２１６及び３７４から５５０、ＮＯ：１４の塩基番号５７から２１６及び３７４から５５０、ＩＤ ＮＯ：１７の塩基番号５７から２１６及び３７４から５５０、ＩＤ ＮＯ：２０の塩基番号５７から２１６及び３７４から５５０、ＩＤ ＮＯ：２３の塩基番号５７から２１６及び３７５から５３８、ＩＤ ＮＯ：２６の塩基番号５７から２０７及び３７２から５３１、ＩＤ ＮＯ：２９の塩基番号５７から２１７及び３７４から５５０、ＩＤ ＮＯ：３１の塩基番号５７から２１６及び３７２から５４９で示される塩基配列またはその相補的配列のうち、連続する１５ないし４０塩基からなる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、上記塩基配列決定用またはDNA増幅用のプライマーである。【0049】
さらに、本発明の方法の第１の態様は、冬虫夏草のリボソームＲＮＡ遺伝子のＳＳ領域の３'側１．４ＫｂｐからＩＴＳ領域、及びＬＳ領域５'側１．７Ｋｂｐにいたる領域の塩基配列の全部または一部を、配列表のＩＤ ＮＯ：１から３１に記載の塩基配列と比較し、その異同により、冬虫夏草を分類する方法である。【0050】
本発明の方法の第２の態様は、上記比較が、上記領域の塩基配列を決定し、その相同性の割合を測定して比較するものであることを特徴とする、冬虫夏草を分類する方法である。【0051】
本発明の方法の第３の態様は、上記比較が、冬虫夏草のリボソームＲＮＡのＩＴＳ領域と、配列表ＩＤ ＮＯ：２、５、８、１１、１４、１７、２０、２３、２６、２９、３１のいずれかに記載の塩基配列との相同性の比較であることを特徴とする、冬虫夏草を分類する方法である。【0052】
本発明の方法の第４の態様は、上記塩基配列決定において、配列表のＩＤ ＮＯ：１からＮＯ：３１で示される塩基配列または配列表のＩＤ ＮＯ：１からＮＯ：３１で示される塩基配列の相補的配列のうち、連続する１５ないし４０塩基からなる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを、塩基配列決定のプライマーとして用いることを特徴とする、冬虫夏草を分類する方法である。即ち、相同性の比較である。【0053】
本発明の方法の第５の態様は、上記塩基配列の決定におけるプライマーが、配列表のＩＤ ＮＯ：２の塩基番号５７から１９３及び３５１から５３８、ＩＤ ＮＯ：５の塩基番号５７から２１７及び３７４から５５０、ＩＤ ＮＯ：８の塩基番号５７から２１６及び３７４から５５０、ＮＯ：１１の塩基番号５７から２１６及び３７４から５５０、ＮＯ：１４の塩基番号５７から２１６及び３７４から５５０、ＩＤ ＮＯ：１７の塩基番号５７から２１６及び３７４から５５０、ＩＤ ＮＯ：２０の塩基番号５７から２１６及び３７４から５５０、ＩＤ ＮＯ：２３の塩基番号５７から２１６及び３７５から５３８、ＩＤ ＮＯ：２６の塩基番号５７から２０７及び３７２から５３１、ＩＤ ＮＯ：２９の塩基番号５７から２１７及び３７４から５５０、ＩＤ ＮＯ：３１の塩基番号５７から２１６及び３７２から５４９で示される塩基配列またはその相補的配列のうち、連続する１５ないし４０塩基からなる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、冬虫夏草を分類する方法である。即ち、相同性の比較である。【0054】
本発明の方法の第６の態様は、上記分類方法における比較が、配列表のＩＤ ＮＯ：１からＮＯ：３１で示される塩基配列または配列表のＩＤ ＮＯ：１からＮＯ：３１で示される塩基配列の相補的配列のうち、連続する１５ないし４０塩基からなる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる、ＤＮＡ増幅の過程を含むことを特徴とする、冬虫夏草を分類する方法である。【0055】
本発明の方法の第７の態様は上記ＤＮＡ増幅の過程において、配列表のＩＤ ＮＯ：２、５、８、１１、１４、１７、２０、２３、２６、２９、３１のいずれかに記載の塩基配列またはそれらの相補的配列のうち、連続する１５ないし４０塩基からなる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いることを特徴とする、冬虫夏草を分類する方法である。【0056】
本発明の方法の第８の態様は、上記ＤＮＡ増幅過程におけるプライマーが、配列表のＩＤ ＮＯ：２の塩基番号５７から１９３及び３５１から５３８、ＩＤ ＮＯ：５の塩基番号５７から２１７及び３７４から５５０、ＩＤ ＮＯ：８の塩基番号５７から２１６及び３７４から５５０、ＮＯ：１１の塩基番号５７から２１６及び３７４から５５０、ＮＯ：１４の塩基番号５７から２１６及び３７４から５５０、ＩＤ ＮＯ：１７の塩基番号５７から２１６及び３７４から５５０、ＩＤ ＮＯ：２０の塩基番号５７から２１６及び３７４から５５０、ＩＤ ＮＯ：２３の塩基番号５７から２１６及び３７５から５３８、ＩＤ ＮＯ：２６の塩基番号５７から２０７及び３７２から５３１、ＩＤ ＮＯ：２９の塩基番号５７から２１７及び３７４から５５０、ＩＤ ＮＯ：３１の塩基番号５７から２１６及び３７２から５４９で示される塩基配列またはその相補的配列のうち、連続する１５ないし４０塩基からなる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、冬虫夏草を分類する方法である。【発明を実施するための形態】
【0057】
上述のように、リボソーム遺伝子配列は、生物の分類に広く用いられている。その理由としては、真核生物のなかで最も単純な酵母から非常に複雑な哺乳動物にいたるまで広く保存されている一方、一部ＩＴＳ領域のようにプロセッシングの過程で捨てられる配列については、ある程度の分散が期待できるからである。本発明のように、限られた種の地域差を見るには、配列のある程度の分散が必要であるが、あまりにも分散の度合いが強い場合は配列の決定や増幅のプライマーに問題が生じたりすることがある。その点リボソームＲＮＡ遺伝子のＩＴＳを中心とする配列決定は、保存性の高いＳＳ領域やＬＳ領域を足がかりに、分散度の高いＩＴＳ領域を探索できるという利点がある。【0058】
Ｃ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ又はＣ．ｃｒａｓｓｉｓｐｏｒａの塩基配列を決定するにあたり、最も一般的な方法は、まず菌体を培養してＤＮＡを抽出し、それを鋳型としてＰＣＲ（ｐｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）によってリボソームＲＮＡ遺伝子をクローニングし、それらについて塩基配列を決定する方法である。ＰＣＲ、塩基配列決定は、どちらも定法により行うことができる。ＰＣＲに用いたプライマーの配列は酵母（Ｓ．Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の塩基配列に基づいて決定し、常法に従って合成することができる。またシーケンスに用いたプライマーは、ＰＣＲプライマーと同様に酵母の塩基配列に基づいて作成してもよいし、あるいは、これらのプライマーでまず最初に読み進み、その後は読み取った配列にもとづき順次プライマー合成を行ってもよい。【0059】
一般的に塩基配列に基づく判別・分類方法としては、数１００ｂｐの一定領域の塩基配列全体を比較する方法、１ないし数カ所の特定部位の塩基の違いを比較する方法、あるいは１ないし数カ所の特定部位の塩基の違いを複数組合わせ、パターン化して比較する方法がある。【0060】
数１００ｂｐの一定領域の塩基配列全体を比較する方法としては、判別・分類の対象となるサンプルの一定領域の塩基配列を決定し、既知の塩基配列と比較し、その相同性の割合で判定する方法がある。一般に生物種は近接する地域であっても、進化の過程を反映して微妙にその相同性に違いをみせるので、サンプルの配列は必ずしも既知の配列と100％同一ではないことが多い。このような場合にも、相同性の割合を求めることにより、相対的な類縁関係の推測を容易に行うことができる。【0061】
この相同性の割合を比較する方法には、生育地によって相違の生じるＩＴＳ領域を用いるのが望ましい。また、ＩＴＳ領域内のＩＴＳ１またはＩＴＳ２を用いて比較する方法は最も望ましい。ＩＴＳ１とＩＴＳ２は、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｃｒａｓｓｉｓｐｏｒａではそれぞれ配列表ＩＤ Ｎｏ．２の塩基番号５７−１９３と３５１−５３８、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ Ｍａｒｃｈではそれぞれ配列表ＩＤ Ｎｏ．５の塩基番号５７−２１７と３７４−５５０、Ｓｅｉｓａｚａｎではそれぞれ配列表ＩＤ Ｎｏ．８の塩基番号５７−２１６と３７４−５５０、Ｄｅｒｕｇｅではそれぞれ配列表ＩＤ Ｎｏ．１１の塩基番号５７−２１６と３７４−５５０、Ｇｙｏｋｕｊｕではそれぞれ配列表ＩＤ Ｎｏ．１４の塩基番号５７−２１６と３７４−５５０、Ｂｉｎｇｏではそれぞれ配列表ＩＤ Ｎｏ．１７の塩基番号５７−２１６と３７４−５５０、Ｒｏｈｏではそれぞれ配列表ＩＤ Ｎｏ．２０の塩基番号５７−２１６と３７４−５５０、Ｙａｋｕｚａｎではそれぞれ配列表ＩＤ Ｎｏ．２３の塩基番号５７−２１６と３７５−５３８、Ｇｙｏｋｕｒｙｕｓｅｔｕｚａｎではそれぞれ配列表ＩＤ Ｎｏ．２６の塩基番号５７−２０７と３７２−５３１、Ｎｙａｒａｍｕではそれぞれ配列表ＩＤ Ｎｏ．２９の塩基番号５７−２１７と３７４−５５０、Ｒｕｓｙａｓｙａではそれぞれ配列表ＩＤ Ｎｏ．３１の塩基番号５７−２１６と３７２−５４９であることが相同性により推定される。ただし上記の位置は報告により若干のずれがある。【0062】
１ないし数カ所の特定部位の塩基の違いを利用する方法としては、ＰＣＲのプライマーによる判別がある。塩基配列を比較し、相違のある領域にＰＣＲのプライマーを設定し、どのプライマーによって増幅されるかによって判別する方法である。この場合非相同的な領域だけでなく、相同的な領域にもプライマーを設定し、インターナルコントロールとするのが望ましい。増幅が見られないのは、反応の失敗ではなく、サンプルのリボソームＲＮＡ遺伝子の配列によるものであることを確認するためである。上記ＰＣＲのプライマーによる判別方法において、プライマーを設定する領域は、本発明のＳＳ領域配列（配列表ＩＤ ＮＯ：１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８）、ＩＴＳ領域配列（配列表ＩＤ ＮＯ：２、５、８、１１、１４、１７、２０、２３、２６、２９、３１）、またはＬＳ領域配列（配列表ＩＤ ＮＯ：３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０）のいずれでもよい。ＳＳ領域とＬＳ領域はＩＴＳ領域に比較して相同性が高いが、上記方法は、１ないし数塩基の非相同性でも充分判別可能なので、いずれの領域においても容易にプライマーを設定することができる。【0063】
上記の、特定のプライマーによってリボソームＲＮＡ遺伝子が増幅するかどうかで判別する方法は、ＰＣＲ以外の増幅法であってもよい。例えば最近発表されたＬＡＭＰ法（栄研化学）、ＩＣＡＮ法（宝酒造）のプライマーとして設定することも可能である。【0064】
分類は必ずしも核酸の増幅によるものでなくてもよい。例えば1本鎖の核酸同士をハイブリダイズさせて、それを電気的に検出する方法は、非常に感度が良いので、核酸の増幅なしで検出が可能である。１本鎖のプローブを上記増幅法と同様に非相同的な領域に設定することにより、ハイブリダイズしたかどうかで配列を確認できる。【0065】
また、１ないし数カ所の特定部位の塩基の違いを比較する方法による判別・分類は、ＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法でも可能である。鑑定の対象となる何種類かの塩基配列を比較し、制限酵素による切断に違いのある部分を見つけ、増幅されたＤＮＡ断片にその部分が含まれるように、プライマーを設定する。増幅したＤＮＡ断片がその制限酵素によって切断されるか否かによって配列の違いが判断できる。切断の有無は通常の電気泳動法等によって容易に判定可能である。【0066】
さらに、上記の特定部位における塩基の違いを複数組合わせ、パターン化して比較する方法がある。例えば、上記プライマー法で、ぃくつかのプライマー対を用いる方法や、あるいは上記ＲＦＬＰ法で、比較的広い領域を増幅し、複数の制限酵素で切断し、それぞれの切断パターンによって判別することも可能である。このＲＦＬＰ法では、上述のプライマーによる判別法と同様、ＳＳ領域、ＩＴＳ領域、ＬＳ領域のいずれを用いることができるが、非相同性の高いＩＴＳ領域は、切断パターンが多様であり、制限酵素の選択肢も多く、望ましい。さらに、ＩＴＳ領域内のＩＴＳ１またはＩＴＳ２は、生育地による相違を最も反映していると考えられるので、パターン作成にこれらの領域を含めることは、より望ましい。上述のように、自然界においては近接した生物種であっても、たとえばＩＴＳのようにその生物種にとって必須ではない塩基配列領域は広く分散していることが多いので、往々にして配列全体の比較が必要になることがあり、その点ＲＦＬＰは、塩基配列を決定して相同性の割合を求めるより簡便で、かつ配列全体の比較であるので、有効性が高く、かつ実用的である。【0067】
以下、本発明を実施例に基づき、より具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。【実施例】
【0068】
冬虫夏草は主に中国の高山帯で採取されるが、本発明に用いたＣ．ｃｒａｓｓｉｓｐｏｒａ（この発明の塩基配列の第１、２、３の態様）のサンプルは、特に中国雲南省の標高３０００ｍ以上の高山帯で採取された。また、Ｃ．ｓｉｎｅｎｓｉｓのそれぞれのサンプルは、この発明の塩基配列の第４、５、６の態様にあるＭａｒｃｈは中国甘粛省、この発明の塩基配列の第７、８、９の態様にあるＣ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ Ｓｅｉｓａｚａｎは中国青海省、この発明の塩基配列の第１０、１１、１２の態様にあるＣ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ Ｄｅｒｕｇｅは中国四川省、この発明の塩基配列の第１３、１４、１５の態様にあるＣ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ Ｇｙｏｋｕｊｕは中国青海省、この発明の塩基配列の第１６、１７、１８の態様のＣ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ Ｂｉｎｇｏはチベット自治区、この発明の塩基配列の第１９、２０、２１の態様のＣ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ Ｒｏｈｏは中国四川省、この発明の塩基配列の第２２、２３、２４の態様のＣ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ Ｙａｋｕｚａｎは中国貴州省、この発明の塩基配列の第２５、２６、２７の態様のＣ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ Ｇｙｏｋｕｒｙｕｓｅｔｕｚａｎは中国雲南省、この発明の塩基配列の第２８、２９、３０の態様のＣ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ Ｎｙａｒａｍｕと、この発明の塩基配列の第３１の態様のＣ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ Ｒｕｓｙａｓｙａはヒマラヤにおいてそれぞれ採取された。【0069】
冬虫夏草からのＤＮＡ抽出可及的にアガロース部分を除去した培養菌体を、滅菌水に一晩浸水し、含まれている培地由来の成分を除去した。上記処理を行った培養菌体を、酵素溶液（ＳＣＥ ０．５ｍｌ、Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ２０−Ｔ ５ｍｇ、Ｃｈｉｔｉｎａｓｅ−ＧＯＤＯ ５ｍｇ（生化学工業））中で２４時間室温でインキュベートした。これにＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（プロメガ社、特異的活性３０単位／ｍｇ以上）を５０ｍｇ及び１０％ＳＤＳを５μｌ、５５℃で３時間インキュベートした。その後、室温で１０，０００ｒｐｍ５分遠心し、水相４００μｌを２００μｌづつ２本の新しい１．５ｍｌチューブへ移し、等量のフェノール・クロロフォルム混合液を加え５分間転倒混和した。再度室温にて１５，０００ｒｐｍ、５分遠心して、水相を新しいチューブに移し、３Ｍ酢酸ナトリウム２０μｌ、ｅｔｈａｃｈｉｎｍａｔｅ（日本ジーン）２μｌ、エタノール５００μｌを加え、転倒混和し、４℃、１５，０００ｒｐｍで１５分で遠心した。上清を捨て、７０％エタノール１ｍｌと４℃、１５，０００ｒｐｍ、２分の遠心で上清を捨て、塩分を除いた。ペレットを凍結乾燥した後２００μｌＴＥに溶解し、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（キアゲン社）を用い精製した。
【0070】
冬虫夏草リボソームＲＮＡ遺伝子の部分クローニング冬虫夏草リボソームＲＮＡ遺伝子のＳＳ領域の一部、ＬＳ領域の一部を、上記抽出ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ（Ｐｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法によってクローニングした。用いたプライマーは、ＳＳ領域にはＳＳＪ（5'-ctggt tgatc ctgcc agtag-3' ）又はＳＳ１０（5'-agtag tcata tcct gtctc aaag-3'）のフォワード側プライマーとＳＳＴ（5'-acgga acctt gttac gact-3'）のリバース側プライマーのセット、ＬＳ領域にはＬＳ１（5'-agtac ccgct gaact taag-3'）のフォワード側プライマーとＬＳＤ（5'-ggaac ctttc cccac ttc-3'）のリバース側プライマーのセットである。これらのプライマーは酵母（Ｓ．Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の塩基配列に基づいて作製した。またこれらのプライマーの相対的位置を図２に示した。
【0071】
ＰＣＲの反応液を図３のように設定し、最初に９５℃で3分変性させた後、９４℃で０．５分、５３℃で０．５分、７２℃で１分のサイクルを４０回行い、最後に７２℃３分加熱した。【0072】
（３）ＳＳ領域とＬＳ領域の塩基配列の決定上記ＰＣＲ産物をＳｈｒｉｍｐ Ａｌｋａｌｉｎｅ ＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅとＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅＩにより処理した後、ＰＣＲに用いたプライマー(ＳＳＪ、ＳＳ１０、ＳＳＴ、ＬＳ１、ＬＳＤ)と、さらに、ＳＳ２（ 5'-aattc cagct ccaat agcgt-3'）、ＳＳ３（5'-tcagc cttgc gacca tactc-3'）、ＳＳ４（5'-acttt cgatg tttgg gtagt-3'）、ＳＳＵ（5'-gtaat tccag ctcca atagc-3' ）、ＳＳ５（5'-gtgct gggga tagag cattg-3' ）、ＳＳ６（5'-caatg ctcta tcccc agcac-3'）、ＳＳ７（5'-acttt cgatg tttgg gtagt-3'）、ＳＳ８（5'-catcg aaagt tgata ggg-3'）、ＳＳ１１（5'-catgc tgaaa atccc gactc cggaa gg-3'）ＳＳ１２（5'-ctgtt tcccc gccac gccca gtg-3'）、ＳＳ１３（5'-agtac cttac tactt ggata accg-3'）、ＬＳＣ（5'-gcctt agtaa cggcg agtg-3'）、ＬＳ４（5'-ttgtg cgcta tcggt ctc-3'）、ＬＳ６（5'-tcaag ttctc attga agtat ttgc-3'）、ＬＳ９(5'-ggtaa gcaga actgg cgatg cggga tg-3')、ＬＳ１０(5'-caagt agagt gatcg aaaga-3')、ＬＳ１１(5'-ttcat cccgc atcgc cagtt ct-3')、ＬＳ１２(5'-caagg atgct ggcgt aatgg t-3')をシーケンスプライマーとして、Ｔｈｅｒｍｏ ＳｅｑｕｅｎａｓｅII ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（アマシャムファルマシアバイオテク社）を用い、Ｃ．ｃｒａｓｓｉｓｐｏｒａ及びＣ．ｓｉｎｅｎｓｉｓの８種について、ＳＳ領域の３'側約１.８ＫｂｐとＬＳ領域の５'側約１.４Ｋｂｐの塩基配列を決定した（図２、図４参照）。
【0073】
（４）ＩＴＳ領域の塩基配列の決定上記により決定したＳＳ領域、ＬＳ領域の塩基配列に基づき、ＩＴＳ領域の塩基配列を決定した。酵母（Ｓ．Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の塩基配列に基づいて、ＰＣＲプライマーＩＴＳ７(5'-ggccg ggaag ctctc caaac tcggt catt-3')とＩＴＳ８(5'-cctct gcaaa ttaca actcg ggcc-3')を作製し、ＩＴＳ領域を増幅し、上記プライマーに加えて、ＩＴＳ２(5'-gctgc gttct tcatc gatgc-3')、ＩＴＳ３(5'-gcatc gatga agaac gcagc-3')、ＩＴＳ４(5'-tcctc cgctt attga tatgc-3')、ＩＴＳ５(5'-ggaag taaaa gtcgt aacaa gg-3')のシーケンスプライマーを用いて配列決定を行った(図２)。具体的実験方法は上記ＳＳ領域、ＬＳ領域の決定と同様に行った。
【0074】
（５）相同性の決定上記により決定した、Ｃ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ Ｍａｒｃｈと、Ｃ．ｃｒａｓｓｉｓｐｏｒａのＩＴＳ領域の相同性をＤＮＡＳＩＳのマキシマムマッチング（日立ソフト）によって調べたところ、７８％であった（図５参照）。一方、保存性が高いことが予測されているＬＳ領域では相同性９３％を示した。
【0075】
（６）ＲＦＬＰによるパターン分析Ｃ．ｃｒａｓｓｉｓｐｏｒａとＣ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ ＤｅｒｕｇｅよりＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＩＴＳ５、ＩＴＳ４のプライマー対でＰＣＲ法による増幅を行った。Ｃ．ｃｒａｓｓｉｓｐｏｒａから得られた６０４ｂｐのＤＮＡ断片とＣ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ Ｄｅｒｕｇｅから得られた５６８ｂｐのＤＮＡ断片を、ＢｃｇＩ、ＢｇｌＩ、ＤｄｅＩ、ＤｒｄＩ、ＭａｅＩ、ＭｓｅＩ、ＸｈｏＩの7種類の制限酵素処理を行った。得られた断片を６％アクリルアミドゲル（０．５ｘＴＢＥ）により電気泳動し、比較したところ、塩基配列より予想されたとおりのパターンの相違が示された（図６、図７参照）。
【発明の効果】
【0076】
上述したように、この発明によると、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｃｒａｓｓｉｓｐｏｒａとＣｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓの産地別各種のリボソームＲＮＡ遺伝子配列の一部を提供することができ、更に、冬虫夏草の産地別分類について、客観的鑑別方法を提供することができる。【0077】
【配列表】
【0078】
【0079】
【0080】
【0081】
【0082】
【0083】
【0084】
【0085】
【0086】
【0087】
【0088】
【0089】
【0090】
【0091】
【0092】
【0093】
【0094】
【0095】
【0096】
【0097】
【0098】
【0099】
【0100】
【0101】
【0102】
【0103】
【0104】
【0105】
【0106】
【0107】
【図面の簡単な説明】