特許 6066904 追加のキシロースイソメラーゼ活性を有する組換えザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）中における改善されたキシロース利用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6066904

(24)【登録日】2017年1月6日

(45)【発行日】2017年1月25日

(54)【発明の名称】追加のキシロースイソメラーゼ活性を有する組換えザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）中における改善されたキシロース利用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20170116BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20170116BHJP

   C12P 7/06 20060101ALI20170116BHJP

   C12N 9/90 20060101ALN20170116BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C12N1/21

   C12P7/06

   !C12N9/90

【請求項の数】3

【全頁数】87

(21)【出願番号】特願2013-518564(P2013-518564)

(86)(22)【出願日】2011年6月28日

(65)【公表番号】特表2013-532979(P2013-532979A)

(43)【公表日】2013年8月22日

(86)【国際出願番号】US2011042132

(87)【国際公開番号】WO2012003178

(87)【国際公開日】20120105

【審査請求日】2014年6月20日

(31)【優先権主張番号】61/359,463

(32)【優先日】2010年6月29日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】390023674

【氏名又は名称】イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー

【氏名又は名称原語表記】Ｅ．Ｉ．ＤＵ ＰＯＮＴ ＤＥ ＮＥＭＯＵＲＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＡＮＹ

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100140132

【弁理士】

【氏名又は名称】竹林 則幸

(72)【発明者】

【氏名】ロベル・ワイ・カーシー

(72)【発明者】

【氏名】ミン・チイ

(72)【発明者】

【氏名】ルワン・タオ

(72)【発明者】

【氏名】ポール・ヴイ・ヴィータネン

(72)【発明者】

【氏名】ジエンジュイン・ヤーン

【審査官】 原 大樹

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００９／１２０７３１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１０−５０４７５８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Biochemical Journal，１９９１年，Vol.278，p.285-292

【文献】 APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY，１９９５年，Vol.61, No.5，p.1867-1875

【文献】 European Journal of Biochemistry，２００１年，Vol.268，p.6291-6301

【文献】 Appl Microbiol Biotechnol，１９９２年，Vol.38，p.354-361

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｎ １／００−７／０８

Ｃ１２Ｎ ９／００−９／９９

Ｃ１２Ｐ １／００−４１／００

ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＥＭＢＡＳＥ／ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ／ＣＡｐｌｕｓ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

組換えザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株であって、前記株が大腸菌キシルロキナーゼ、大腸菌トランスケトラーゼおよび大腸菌トランスアルドラーゼを含み、さらに配列番号６６を含むＩ群キシロースイソメラーゼをコードする異種核酸分子を含み、前記株が炭素源としてキシロースを利用する組換え細菌株。

【請求項2】

ａ）大腸菌キシルロキナーゼ、大腸菌トランスケトラーゼおよび大腸菌トランスアルドラーゼを含んでなる、組換えザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株を提供するステップと；
ｂ）配列番号６６を含むＩ群キシロースイソメラーゼをコードする異種核酸分子を前記組換えザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株に導入するステップを含んでなり；
Ｉ群に属さないキシロースイソメラーゼを含有する同一株と比較して前記組換えザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株によるキシロース利用が改善される、組換えザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞中でキシロース利用を改善する方法。

【請求項3】

ａ）請求項１に記載の組換えザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株を提供するステップと；
ｂ）それによって株がエタノールを産生する条件下で、（ａ）の株をキシロースと接触させるステップ
を含んでなる、エタノールを製造する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、その内容全体を参照によって援用する、２０１０年６月２９日に出願された、米国仮特許出願第６１／３５９４６３号明細書の優先権を主張する。

【0002】

政府の権利についての宣言
本発明は、エネルギー省によって与えられた契約番号第ＤＥ−ＦＣ３６−０７ＧＯ１７０５６の下に、米国政府の支援によってなされたものである。米国政府は、本発明に関して一定の権利を有する。

【0003】

本発明は、微生物学および遺伝子工学の分野に関する。より具体的には、改善されたキシロース利用およびエタノール産生を提供する、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）中で高活性のキシロースイソメラーゼが同定された。

【背景技術】

【0004】

微生物によるエタノールの生産は化石燃料の代替エネルギー源を提供し、したがって現在の重要な研究分野である。キシロースは加水分解リグノセルロース系バイオマス中の主要な五炭糖であることから、エタノール、ならびにその他の有用な生成物を産生する微生物が、炭素源としてキシロースを使用できることが望ましい。バイオマスは、豊富に入手できる低コストの炭素基質を提供し得る。１）キシロースのキシルロースへの変換を触媒するキシロースイソメラーゼ；２）キシルロースをリン酸化してキシルロース−５−リン酸を形成するキシルロキナーゼ；３）トランスケトラーゼ；および４）トランスアルドラーをコードする遺伝子の導入によって、キシロースを天然で利用しない、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）およびその他の細菌エタノロジェンが、キシロース利用のために遺伝子改変されている。典型的に、使用されたコード領域は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）遺伝子からのものであった。

【0005】

Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株（特許文献１〜４、非特許文献１、２）、ならびにザイモバクター・パルメ（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ ｐａｌｍａｅ）株（非特許文献３）をキシロース代謝のために遺伝子改変する上で、成功が見られた。しかし、典型的に遺伝子改変株はキシロース上では、グルコース上と同様には成長せず、エタノールを産生しない。特許文献５および６に記載されるように、キシロース利用について遺伝子改変された株が、キシロース培地上での連続継代培養によって適応され、キシロース利用が改善された株がもたらされている。同一譲受人同時係属米国特許出願公開第２００９０２４６８４６Ａ１号明細書で開示されるのは、突然変異高活性ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター（Ｐｇａｐ）からの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現による、改善されたキシロース利用のための遺伝子改変である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】米国特許第５５１４５８３号明細書

【特許文献2】米国特許第５７１２１３３号明細書

【特許文献3】米国特許第６５６６１０７号明細書

【特許文献4】国際公開第９５／２８４７６号パンフレット

【特許文献5】米国特許第７，２２３，５７５号明細書

【特許文献6】米国特許第７，７４１，１１９号明細書

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Ｆｅｌｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：３５４−３６１

【非特許文献2】Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６７：２４０−２４３

【非特許文献3】Ｙａｎａｓｅ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｒｏｂｉｏｌ．７３：２５９２−２５９９

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

キシロース利用がさらに改善されたザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株、およびその他の細菌エタノロジェンに対する必要性がなおもある。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明は、改善されたキシロース利用およびエタノール産生を提供する、高活性キシロースイソメラーゼを発現する、組換えキシロース利用ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）細胞を提供する。

【0010】

したがって本発明は、キシロースイソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸分子を含んでなる、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）およびザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）からなる群から選択される組換え細菌株であって、ポリペプチドがＩ群キシロースイソメラーゼでありＥＣ５．３．１．５によって同定される酵素クラスに含まれ、株が炭素源としてキシロースを利用する組換え細菌株を提供する。

【0011】

本発明で有用なキシロースイソメラーゼ酵素は、配列番号２、２４、３２、３４、４２、５４、６６、６８、７８、９６、１００、１０６、１０８、１２２、１２６、１２８、１３０、１３２、１３５、１３７、および１４２を使用して作成されたプロファイル隠れマルコフモデルを使用してクエリーした際に、１Ｅ−１５以下のＥ値スコアを有するものであり；クエリーは、Ｚパラメータが１０億に設定されるｈｍｍｓｅａｒｃｈアルゴリズムを使用して実施され、またはＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ ２５０シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを使用したアラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｗ法に基づいて、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、および１４７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するものであり；または配列番号６６の参照アミノ酸配列と比較して、以下の保存されたアミノ酸を有し、または以下の保存されたアミノ酸の９０％を有するものである
ａ）位置２２６のロイシン、
ｂ）位置２２３のメチオニン、
ｃ）位置１９１のイソロイシン、
ｄ）位置１９５のスレオニン、セリン、またはバリン、
ｅ）位置８８のメチオニン、スレオニンまたはグアニン（ｑｕａｎｉｎｅ）、
ｆ）位置２９０のヒスチジン、
ｇ）位置２２１のグルタミン酸またはアスパラギン酸、
ｈ）位置２４２のフェニルアラニン、バリン、またはロイシン、
ｉ）位置２４３のヒスチジン、
ｊ）位置１９３のロイシン、フェニルアラニン、またはメチオニン、
ｋ）位置２５６のグルタミン、
ｌ）位置２１３のグリシン、
ｍ）位置２８８のプロリン、チロシン、アラニン、またはセリン、および
ｎ）位置２４９のグルタミン。

【0012】

別の実施形態では本発明は、
ａ）Ｉ群に属さないキシロースイソメラーゼを含んでなるキシロース利用経路を含んでなる、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）およびザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）からなる群から選択される組換え細菌株を提供するステップと；
ｂ）キシロースイソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸分子を導入するステップを含んでなり、ポリペプチドがＩ群キシロースイソメラーゼである、組換え細菌細胞中でキシロース利用を改善する方法を提供する。

【0013】

代案としては、本発明は、
ａ）本発明の組換え細菌株を提供するステップと；
ｂ）（ａ）の株がエタノールを産生する条件下で株をキシロースと接触させるステップ
を含んでなる、エタノールを製造する方法を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】キシロース利用のために遺伝子改変された、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）中のエタノール発酵経路の略図を示す。

【図2】Ｉ群およびＩ群の枝を示す、キシロースイソメラーゼ系統樹の略図である。

【図3】Ｉ群キシロースイソメラーゼ系統樹の略図である。

【図4】対照ＺＷ６４１株、およびＡ．ミズーリエンシス（Ａ．ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）（３５５−１、３５５−２）、Ｌ．ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）（３５６−１、３５６−２）、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（３５７−１、３５７−２）からのキシロースイソメラーゼ発現についてコドン最適化されたコーディング領域を有する遺伝子で形質転換されたＺＷ６４１株の成長曲線のグラフである。

【図5】システイン・カルバゾール法によって測定された、対照ＺＷ６４１株、およびＡ．ミズーリエンシス（Ａ．ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）（３５５−１）、Ｌ．ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）（３５６−２）、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（３５７−２）からのキシロースイソメラーゼ発現についてコドン最適化されたコーディング領域を有する遺伝子で形質転換されたＺＷ６４１株中のキシロースイソメラーゼ活性のグラフである。

【図6】対照ＺＷ６４１株、およびＡ．ミズーリエンシス（Ａ．ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）（ＡＭｘｙｌＡ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＥＣｘｙｌＡ）、ゲオデルマトフィルス・オブスクルス（Ｇｅｏｄｅｒｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ ｏｂｓｃｕｒｕｓ）（ＧＯｘｙｌＡ）、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）（ＭＳｘｙｌＡ）、サリニスポラ・アレニコーラ（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ａｒｅｎｉｃｏｌａ）（ＳＡｘｙｌＡ）、またはキシラニモナス・セルシリティカ（Ｘｙｌａｎｉｍｏｎａｓ ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃａ）（ＸＣｘｙｌＡ）からのキシロースイソメラーゼの発現ためのコドン最適化コーディング領域を有する遺伝子で形質転換されたＺＷ６４１株の成長曲線のグラフである。

【図7】システイン−カルバゾール法によって測定された、対照ＺＷ６４１株、およびＡ．ミズーリエンシス（Ａ．ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）（ＡＭｘｙｌＡ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＥＣｘｙｌＡ）、ゲオデルマトフィルス・オブスクルス（Ｇｅｏｄｅｒｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ ｏｂｓｃｕｒｕｓ）（ＧＯｘｙｌＡ）、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）（ＭＳｘｙｌＡ）、サリニスポラ・アレニコーラ（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ａｒｅｎｉｃｏｌａ）（ＳＡｘｙｌＡ）、またはキシラニモナス・セルシリティカ（Ｘｙｌａｎｉｍｏｎａｓ ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃａ）（ＸＣｘｙｌＡ）からのキシロースイソメラーゼ発現のためのコドン最適化コーディング領域を有する遺伝子で形質転換されたＺＷ６４１株中のキシロースイソメラーゼ活性のグラフである。

【0015】

表１は、キシロースイソメラーゼＩ群タンパク質のためのプロファイルＨＭＭの表である。表１は添付して電子的に提出され、参照によって本明細書に援用される。

【0016】

表２は、Ｉ群プロファイルＨＭＭを使用してクエリーした配列番号によってそれぞれ同定される、ＸＩタンパク質のＥ値スコアの表である。表２は添付して電子的に提出され、参照によって本明細書に援用される。

【0017】

本発明は、本明細書の一部を構成する、以下の詳細な説明、および添付の配列説明からより完全に理解され得る。

【0018】

以下の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を含む特許出願の要件−配列規則」）を満たし、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８）およびＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、および実施細則第２０８号および附属書Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用される記号および型式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２で述べられる規則に従う。

【0019】

【表1】

【0020】

【表2】

【0021】

【表3】

【0022】

【表4】

【0023】

【表5】

【0024】

【表6】

【0025】

【表7】

【0026】

【表8】

【0027】

【表9】

【0028】

【表10】

【0029】

配列説明
配列番号３０７は、ＬｏｘＰｗ−ａａｄＡ−ＬｏｘＰｗ ＤＮＡ断片ＰＣＲ産物のヌクレオチド配列である

【0030】

配列番号３０８は、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）のためにコドン最適化された、アクチノプラネス・ミズーリエンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）キシロースイソメラーゼのコーディング領域である。

【0031】

配列番号３０９は、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）のためにコドン最適化された、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）キシロースイソメラーゼのコーディング領域である。

【0032】

配列番号３１０は、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）のためにコドン最適化された、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼのコーディング領域である。

【0033】

配列番号３１１は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）からのグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターのヌクレオチド配列（ＺｍＰｇａｐ）である。

【0034】

配列番号３１２は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）Ｌ−リブロース５−リン酸４−エピメラーゼ遺伝子からのターミネーターのヌクレオチド配列である。

【0035】

配列番号３１３は、ｐＡＲＡ３５４プラスミドのヌクレオチド配列である。

【0036】

配列番号３１４〜３２７、３２９、３３０、および３３２〜３３４は、ＰＣＲおよびシークエンシングプライマーのヌクレオチド配列である。

【0037】

配列番号３２８は、ＬＤＨ−Ｌ ＤＮＡ断片ＰＣＲ産物のヌクレオチド配列である。

【0038】

配列番号３３１は、ＬＤＨ−Ｒ ＤＮＡ断片ＰＣＲ産物のヌクレオチド配列である。

【0039】

配列番号３３５は、ゲオデルマトフィルス・オブスクルス（Ｇｅｏｄｅｒｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ ｏｂｓｃｕｒｕｓ）キシロースイソメラーゼのコドン最適化コーディング領域のヌクレオチド配列である。

【0040】

配列番号３３６は、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）キシロースイソメラーゼのコドン最適化コーディング領域のヌクレオチド配列である。

【0041】

配列番号３３７は、サリニスポラ・アレニコーラ（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ａｒｅｎｉｃｏｌａ）キシロースイソメラーゼのコドン最適化コーディング領域のヌクレオチド配列である。

【0042】

配列番号３３８は、キシラニモナス・セルシリティカ（Ｘｙｌａｎｉｍｏｎａｓ ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃａ）キシロースイソメラーゼのコドン最適化コーディング領域のヌクレオチド配列である。

【0043】

配列番号３３９は、キメラ遺伝子構築で使用されるプロモーターＰ_ｇａｐＳのヌクレオチド配列である。

【0044】

配列番号３４０−３４５は、ＰＣＲおよびシークエンシングプライマーのヌクレオチド配列である。

【発明を実施するための形態】

【0045】

本明細書で開示されるのは、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）中で高度に活性であり、それを使用してキシロース利用とエタノール産生を増大させてもよい、キシロースイソメラーゼ酵素である。エタノールは、化石燃料の置き換えにおいて使用される、重要な化合物である。

【0046】

特許請求の範囲および明細書の説明のために、以下の定義が使用されることもある。

【0047】

本明細書での用法では、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」、「ｈａｓ」、「ｈａｖｉｎｇ」、「ｃｏｎｔａｉｎｓ」または「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ」という用語、またはあらゆるその他のバリエーションは、非排他的包含を範囲に含むことが意図される。例えば要素の一覧を構成する組成物、混合物、工程、方法、物品、または装置は、必ずしもそれらの要素のみに限定されず、明示的に列挙されないその他の要素、またはこのような組成物、混合物、工程、方法、物品、または装置に固有のその他の要素を含んでもよい。さらに特に断りのない限り、「または」は包含的「または」を指し、排他的「または」を指さない。例えば条件ＡまたはＢは、以下のいずれか１つによって満たされる。Ａが真であり（または存在する）Ｂは偽である（または存在しない）、Ａが偽であり（または存在しない）Ｂは真である（または存在する）、ＡおよびＢの双方が真である（または存在する）。

【0048】

また本発明の要素または構成要素に先行する不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、要素または構成要素の事例（すなわち発生）の数に関して非制限的であることが意図される。したがって「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは少なくとも１つを含むものと解釈されるべきであり、要素または構成要素の単数語形は、数が明らかに単数形を意味する場合を除き複数形もまた含む。

【0049】

「発明」または「本発明」という用語は、本明細書の用法では非限定的用語であり、特定の発明のいずれかの単一の実施形態を指すことは意図されず、本明細書および特許請求の範囲に記載される全ての可能な実施形態を網羅する。

【0050】

本明細書の用法では、用いられる本発明の成分または反応物質の量を修飾する「約」という用語は、例えば、実際に濃縮物または調製溶液を作成するために使用される典型的な測定および液体取り扱い手順を通じて；これらの手順における不注意による誤りを通じて；組成物を作成しまたは方法を実施するのに用いられる成分の製造、原料、または純度の差違を通じて、生じ得る数量の変動を指す。「約」という用語は、特定の最初の混合物から得られる組成物の異なる平衡条件のために、異なる量もまた網羅する。「約」という用語によって修飾されているか否かを問わず、特許請求の範囲は量の同等物を含む。一実施形態では、「約」という用語は、報告される数値の１０％以内、好ましくは報告される数値の５％以内を意味する。

【0051】

「炭素基質」または「発酵性炭素基質」という用語は、本発明の宿主生物が代謝できる炭素源、特に単糖類、オリゴ糖類、および多糖類からなる群から選択される炭素源を指す。

【0052】

「遺伝子」は特定タンパク質または機能的ＲＮＡ分子を発現する核酸断片を指し、それはコード配列に先行する制御配列（５’非コード配列）と、コード配列に続く制御配列（３’非コード配列）を任意選択的に含んでもよい。「天然遺伝子」または「野性型遺伝子」は、それ自身の制御配列と共に自然界に見られる遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、自然界に一緒には見られない制御配列およびコード配列を含んでなる、天然遺伝子でないあらゆる遺伝子を指す。したがってキメラ遺伝子は、異なる起源に由来する制御配列およびコード配列を含んでなってもよく、または同一起源に由来するが、自然界に見られるのとは異なる様式で配列する制御配列およびコード配列を含んでなってもよい。「内在性遺伝子」は、生物のゲノム中のその天然の位置にある天然遺伝子を指す。「外来性」遺伝子は、常態では宿主生物中に見られず、遺伝子移入によって宿主生物に導入された遺伝子を指す。外来遺伝子は、非天然生物に挿入された天然遺伝子またはキメラ遺伝子を含んでなり得る。

【0053】

「遺伝子コンストラクト」という用語は、１つまたは複数の特定タンパク質または機能性ＲＮＡ分子の発現をコードする、核酸断片を指す。遺伝子コンストラクト中では、遺伝子は天然、キメラ、または外来性であってもよい。典型的に遺伝子コンストラクトは、「コード配列」を含んでなる。「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。

【0054】

「プロモーター」または「開始制御領域」は、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を制御できるＤＮＡ配列を指す。一般にコード配列は、プロモーター配列に対して３’側に位置する。プロモーターはその全体が天然遺伝子に由来してもよく、または自然界に見られる異なるプロモーターに由来する異なる要素から構成されてもよく、またはさらには合成ＤＮＡセグメントを含んでなってもよい。異なるプロモーターが、異なる組織または細胞型において、または異なる発達段階において、または異なる環境条件に応じて、遺伝子の発現を誘導してもよいことは、当業者によって理解される。ほとんどの場合にほとんどの細胞型で遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と称される。

【0055】

「発現」という用語は、本明細書での用法では、遺伝子から誘導されるコーディング（ｍＲＮＡ）または機能性ＲＮＡの転写と安定した蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳も指す。「過剰発現」は、通常のまたは非形転換生物中の生成レベルを越える、遺伝子導入生物中における遺伝子産物の生成を指す。

【0056】

「形質転換」という用語は、本明細書での用法では、遺伝的に安定した遺伝形質をもたらす宿主生物中への核酸断片の転移を指す。転移核酸は、宿主細胞中に保持されるプラスミドの形態であってもよく、またはいくつかの転移核酸は、宿主細胞のゲノムに組み込まれてもよい。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物は、「遺伝子導入」または「組み換え」または「形質転換」生物と称される。

【0057】

「プラスミド」および「ベクター」という用語は、本明細書での用法では、細胞の中央代謝の一部でなく、通常、環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である遺伝子を保有することが多い染色体外の要素を指す。このような要素は、あらゆる起源に由来する直鎖または環状の一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの自己複製配列、ゲノム一体化配列、ファージまたはヌクレオチド配列であってもよく、その中ではいくつかのヌクレオチド配列が結合されまたは組み換えられて独自構造体になり、それは選択された遺伝子産物のために、適切な３’非翻訳配列と共にプロモーター断片およびＤＮＡ配列を細胞内に導入できる。

【0058】

「作動的に連結する」という用語は、一方の機能が他方によって影響されるような単一核酸断片上の核酸配列の結合を指す。例えばプロモーターがコード配列の発現に影響を与えられる場合、それはコード配列と作動的に連結する（すなわちコード配列はプロモーターの転写制御下にある）。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向で制御配列と作動的に連結し得る。

【0059】

「選択可能なマーカー」という用語は、マーカー遺伝子の効果、すなわち抗生物質に対する耐性に基づいて選択できる、通常、抗生物質または耐薬品性遺伝子である識別因子を意味し、効果を使用して関心のある核酸の遺伝形質を追跡し、および／または関心のある核酸を受け継いだ細胞または生物を同定する。

【0060】

本明細書での用法では「コドン縮重」という用語は、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響を与えることなく、ヌクレオチド配列のバリエーションを可能にする遺伝コード中の性質を指す。当業者は、所定のアミノ酸を特定するヌクレオチドコドンの使用において、特定の宿主細胞によって示される「コドンバイアス」を十分承知している。したがって宿主細胞中における改善された発現のために遺伝子を合成する場合、そのコドン使用頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近づくように、遺伝子をデザインすることが望ましい。

【0061】

「コドン最適化された」という用語は、様々な宿主の形質転換のための遺伝子または核酸分子コード領域について言及される場合、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドを変化させることのない、宿主生物の典型的なコドン使用頻度を反映する遺伝子または核酸分子コード領域中のコドンの改変を指す。

【0062】

「発酵性糖」という用語は、発酵プロセス中で微生物によって炭素源として使用され得る、オリゴ糖類および単糖類を指す。

【0063】

「リグノセルロース誘導体」という用語は、リグニンおよびセルロースの双方を含んでなる組成物を指す。リグノセルロース系材料はまた、ヘミセルロースを含んでなってもよい。

【0064】

「セルロース誘導体」という用語は、セルロースと、ヘミセルロースをはじめとする追加的構成要素とを含んでなる組成物を指す。

【0065】

「糖化」という用語は、多糖類からの発酵性糖の生成を指す。

【0066】

「前処理バイオマス」という用語は、糖化に先だって、熱的、物理的および／または化学的に前処理されて、バイオマス中の多糖類へのアクセスしやすさが増大されているバイオマスを意味する。

【0067】

「生物由来資源」は、あらゆるセルロースまたはリグノセルロース系材料を指し、セルロースを含んでなる材料、および任意にヘミセルロース、リグニン、デンプン、オリゴ糖類および／または単糖類をさらに含んでなる材料を含む。生物由来資源はまた、タンパク質および／または脂質などの追加的構成要素を含んでなってもよい。生物由来資源は単一原料に由来してもよく、または生物由来資源は１つを超える原料に由来する混合物を含んでなり得る。生物由来資源は、単一原料に由来してもよく、または生物由来資源は１つ以上の原料に由来する混合物からなり得て、例えば生物由来資源は、トウモロコシの穂軸とトウモロコシ茎葉の混合物、または草と葉の混合物を含んでなり得る。生物由来資源としては、バイオエネルギー作物、農業残渣、都市固形廃棄物、工業固形廃棄物、製紙業からの汚泥、庭ごみ、木材および森林廃棄物が挙げられるが、これに限定されるものではない。生物由来資源の例としては、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ苞葉などの作物残渣、トウモロコシ茎葉、草、小麦、小麦藁、大麦藁、干し草、稲藁、スイッチグラス、古紙、サトウキビバガス、ソルガム、穀物製粉から得られる成分、木材、枝、根、葉、木くず、おがくず、灌木および低木、野菜、果物、花、および動物堆肥が挙げられるが、これに限定されるものではない。

【0068】

「生物由来資源加水分解産物」は、生物由来資源の糖化から得られる生成物を指す。生物由来資源はまた、糖化に先だって前処理または前加工されてもよい。

【0069】

「キシロースイソメラーゼ」という用語は、Ｄ−キシロースとＤ−キシルロースの相互変換を触媒する酵素を指す。キシロースイソメラーゼ（ＸＩ）は、ＥＣ５．３．１．５に分類される酵素群に属する。

【0070】

バイオインフォマティクス技術分野で公知の「Ｅ値」という用語は、一致が偶発する確率を提供する「期待値」である。それは配列に対する一致の統計的有意性を提供する。Ｅ値が低いほど、ヒットの有意性がより高い。

【0071】

「Ｉ群キシロースイソメラーゼ」という用語は、本明細書で、以下の基準の少なくとも１つによって定義されるＩ群に属する、キシロースイソメラーゼタンパク質を指す。ａ）それは、実施例４の分子系統学的バイオインフォマティクス解析を使用して作成される、Ａ．ミズーリエンシス（Ａ．ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）ＸＩを含む５０％の配列一致度の閾値分類に含まれる；ｂ）それは、実施例４の表６に示す分子系統学的解析から判定された、Ｉ群およびＩＩ群ＸＩセットのＧｒｏｕｐＳｉｍ分析を使用して同定される、特異性決定位置（ＳＤＰ）においてＩ群のアミノ酸に実質的に適合する；および／またはｃ）それは、配列番号２、２４、３２、３４、４２、５４、６６、６８、７８、９６、１００、１０６、１０８、１２２、１２６、１２８、１３０、１３２、１３５、１３７、および１４２を使用して作成されたプロファイル隠れマルコフモデルを使用してクエリーした際に、１Ｅ−１５以下のＥ値を有し、クエリーは実施例４と同様にＺパラメータを１０億に設定したｈｍｍｓｅａｒｃｈアルゴリズムを使用して実施される。「１群」キシロースイソメラーゼは公知であり、文献で定義されているが、本明細書で提供される定義は、文献定義よりもさらに正確であり、以下の考察を与える定義であると理解される。したがって「Ｉ群」が本明細書の用法では出願人らの定義を指すのに対し、「ＩＩ群」は、当該技術分野で一般に理解される定義を指す。

【0072】

「異種性」という用語は、関心のある位置に天然では見られないことを意味する。例えば異種遺伝子は、宿主生物中には天然では見られず、遺伝子移入によって宿主生物内に導入された遺伝子を指す。さらに、キメラ遺伝子中に存在する異種性核酸分子は、天然では互いに付随しないコード領域およびプロモーターセグメントを有する核酸分子など、天然ではキメラ遺伝子のその他のセグメントに付随して見られない核酸分子である。

【0073】

本明細書での用法では、「単離核酸分子」は、任意に合成、非自然的または改変ヌクレオチド塩基を含有する、一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡポリマーの形態の単離核酸分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つ以上のセグメントを含んでなってもよい。

【0074】

核酸断片は、適切な温度および溶液イオン強度条件下で、一本鎖形態の核酸断片が他の核酸断片とアニールし得る場合に、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡ分子などの別の核酸断片と「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件については良く知られており、（その内容全体を参照によって本明細書に援用する）Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９年）、特にその中の第１１章および表１１．１で例証されている。温度およびイオン強度条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。ストリンジェンシー条件は、（遠縁の生物からの相同的配列などの）中程度に類似した断片から、（近縁関係にある生物からの機能性酵素を複製する遺伝子などの）類似性の高い断片までをスクリーンするために調節し得る。ハイブリダイゼーション後の洗浄が、ストリンジェンシー条件を決定する。好ましい条件の１つの組は、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで室温で１５分間に始まり、次に２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで４５℃で３０分間の繰り返し、次に０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで５０℃で３０分間の２回の繰り返しの一連の洗浄を使用する。ストリンジェントな条件のより好ましい組はより高い温度を使用し、その中で洗浄は、０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中での最後の２回の３０分間の洗浄温度が６０℃に増大されること以外は上と同一である。高度にストリンジェントな条件の別の好ましい組は、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で６５℃で２回の最終洗浄を使用する。追加的なストリンジェントな条件の組は、例えば０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃でのハイブリダイゼーション、および２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含む。

【0075】

ハイブリダイゼーションは２つの核酸が相補的配列を含有することを要するが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー次第で、塩基間のミスマッチもあり得る。核酸をハイブリダイズさせる適切なストリンジェンシーは、当該技術分野で良く知られている変数である、核酸の長さおよび相補性の程度に左右される。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きいほど、これらの配列を有する核酸ハイブリッドのＴｍ値はより大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対安定性（より高いＴｍに対応する）は、以下の順に低下する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さが１００を超えるヌクレオチドのハイブリッドでは、Ｔｍを計算する式が導かれている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出参照、９．５０〜９．５１）。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションでは、ミスマッチの位置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出参照、１１．７〜１１．８）。一実施態様ではハイブリダイズ可能な核酸の長さは、少なくとも約１０ヌクレオチドである。好ましくはハイブリダイズ可能な核酸の最小長さは、少なくとも約１５ヌクレオチドであり、より好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチドであり、最も好ましくは長さは少なくとも約３０ヌクレオチドである。さらに当業者は、プローブ長などの要素に準じて、温度および洗浄溶液塩濃度を必要に応じて調節してもよいことを認識するであろう。

【0076】

「相補的」という用語は、互いにハイブリダイズできるヌクレオチド塩基間の関係を記載するのに使用される。例えばＤＮＡに関して、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。

【0077】

「相同性」および「相同的」という用語は、本明細書で同義的に使用される。これらは、その中で１つ以上のヌクレオチド塩基の変更が、核酸断片が遺伝子発現を仲介し、または特定の表現型を生成する能力に影響を及ぼさない、核酸断片を指す。これらの用語はまた、最初の無修飾断片と比較して、得られる核酸断片の機能特性を実質的に変化させない、１つ以上のヌクレオチドの欠失または挿入などの本発明の核酸断片の修飾も指す。したがって当業者は理解するであろうように、本発明は、特定の具体的配列以上のものを包含すると理解される。

【0078】

さらに当業者は、本発明に包含される相同的な核酸配列はまた、中程度にストリンジェントな条件（例えば０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃）下で、本明細書で例証される配列とハイブリダイズする、または本明細書で開示される核酸配列のいずれかと機能的に同等である本明細書で開示されるヌクレオチド配列のあらゆる部分とハイブリダイズする、それらの能力によって定義されることを認識する。

【0079】

「％同一性」という用語は、当該技術分野で知られているように、配列を比較して判定される、２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。当該技術分野で「同一性」はまた、場合によっては、このような配列ストリング間のマッチにより判定される、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度を意味する。「同一性」および「類似性」は、以下に記載されるものをはじめとするが、これに限定されるものではない既知の方法によって容易に計算され得る。１．）Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：ＮＹ（１９８８年）；２．）Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ：ＮＹ（１９９３年）；３．）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編）Ｈｕｍａｎｉａ：ＮＪ（１９９４年）；４．）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ， Ｇ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ（１９８７年）；および５．）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ：ＮＹ（１９９１年）。

【0080】

同一性を判定する好ましい方法は、試験される配列間に最良のマッチを与えるようにデザインされる。同一性および類似性を判定する方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラム中で体系化される。配列アラインメントおよび％同一性の計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス演算スイート（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラムを使用して実施してもよい。

【0081】

配列の多重アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖとラベルされるアラインメント法に相当し、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス演算スイート（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラムにある、「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｖ法」（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１〜１５３（１９８９年）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ら，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，８：１８９〜１９１（１９９２年）によって記載される）をはじめとする、アルゴリズムのいくつかのバラエティーを包含する「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ法」を使用して実施される。多重アラインメントでは、デフォルト値は、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０およびＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に相当する。Ｃｌｕｓｔａｌ法を使用したタンパク質配列のペアワイズアラインメントおよび％同一性計算のデフォルトパラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝５である。核酸では、これらのパラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝４である。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖプログラムを使用した配列のアラインメント後、同一プログラム中の「配列距離」表を見ることで「％同一性」得ることができる。

【0082】

さらにＣｌｕｓｔａｌ Ｗとラベルされるアラインメント法に相当して、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス演算スイート（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）ｖ６．１プログラムにある、「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｗ法」（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１〜１５３（１９８９年）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ら、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．８：１８９〜１９１（１９９２年）によって記載される）を利用できる。多重アラインメントのデフォルトパラメーター（ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．２、Ｄｅｌａｙ Ｄｉｖｅｒｇｅｎ Ｓｅｑｓ（％）＝３０、ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ Ｗｅｉｇｈｔ＝０．５、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ Ｓｅｒｉｅｓ、ＤＮＡ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｔｒｉｘ＝ＩＵＢ）。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを使用した配列のアラインメント後、同一プログラム中の「配列距離」表を見ることで、「％同一性」を得ることができる。

【0083】

その他の種からのポリペプチドを同定する上で、多くのレベルの配列同一性が有用であることは、当業者によって良く理解され、このようなポリペプチドは同一のまたは類似した機能または活性を有する。％同一性の有用な例としては、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％が挙げられるが、これに限定されるものではなく、または本発明を説明するのに、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％などの５０％から１００％までのあらゆる整数百分率が有用であることもある。適切な核酸断片は、上の相同性を有するだけでなく、典型的に少なくとも５０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも１００個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも１５０個のアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも２００個のアミノ酸、および最も好ましくは少なくとも２５０個のアミノ酸を有するポリペプチドをコードする。

【0084】

「配列分析ソフトウェア」という用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析のために有用なあらゆるコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は、市販のものでも、あるいは独立して開発されても良い。典型的な配列分析ソフトウェアとしては、１．）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）からのＧＣＧプログラム一式（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０）、２．）ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９０年））、および３．）ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）からのＤＮＡＳＴＡＲ、４．）Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）からのＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ、および５．）スミス−ウォーターマン・アルゴリズムを組み入れたＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４年），１９９２年会議，１１１〜２０，編集者：Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。本明細書の文脈で分析のために配列分析ソフトウェアが使用される場合、特に断りのない限り、分析結果は言及されるプログラムの「デフォルト値」に基づくものと理解される。本明細書での用法では、「デフォルト値」とは、最初に初期化されるときにソフトウェアに元からロードされる、あらゆる値またはパラメータの組を意味する。

【0085】

本明細書で使用される標準リコンビナントＤＮＡおよび分子クローニング技術については当該技術分野で良く知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９年）（下文において「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）；Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．およびＥｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４年）；およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅによる出版（１９８７年）に記載されている。

【0086】

本発明は、キシロース含有培地中で発酵させると、改善されたキシロース利用を有する、キシロース利用ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）の遺伝子改変株に関する。典型的に生物由来資源の前処理および糖化によって生成される生物由来資源加水分解産物を含む培地における、生体触媒発酵によるエタノール生産改善の難しい課題は、キシロースースの最適な資化を得ることである。キシロースは、加水分解リグノセルロース系材料中の主要な五炭糖の１つであり、その他はアラビノースである。出願人らは、キシロース利用ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株中で発現されると、キシロース含有培地中で発酵した際に、キシロース利用の効率増大およびエタノールの収率増大を提供する、１群のキシロースイソメラーゼを同定した。

【0087】

高度に効果的なキシロースイソメラーゼの発見
キシロースからキシルロースへの変換を触媒するキシロースイソメラーゼ（ＸＩ）は、細菌細胞中で発現されると炭素源としてキシロースを利用する能力を提供する、４つの酵素の１つである。キシルロキナーゼ、トランスケトラーゼ、およびトランスアルドラーゼと共に、ＸＩは、図１に示されるように、エタノール生合成中に供給される果糖−６−Ｐおよびグリセルアルデヒド−３−Ｐを生成する、キシロースからの経路を提供する。キシロース利用経路の第１の酵素として、キシロースイソメラーゼ活性は、究極的にキシロースをエタノールに変換する能力を提供する上で、特に重要である。出願人らは、エタノール産生細菌、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）中で発現された際に、典型的に使用される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＩと比較して、より高い活性を有して改善されたキシロース利用およびエタノール産生を支援する、キシロースイソメラーゼを同定した。

【0088】

大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からのキシロースイソメラーゼは、キシロース利用のためにザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）を遺伝子改変するのに使用されている。キシロースイソメラーゼは、それらのサイズ、アミノ酸配列類似性、および二価のカチオン選択性に基づいて、２つの群に分類される（Ｐａｒｋ ａｎｄ Ｂａｔｔ（２００４）Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ７０：４３１８−４３２５）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＩはＩＩ群に属する。

【0089】

出願人らは、Ｉ群（本明細書の定義による）に属するＸＩが、キシロース利用ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）中のキシロース利用およびエタノール産生に、改善された特性を提供することを発見した。アクチノプラネス・ミズーリエンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）ＸＩは、下述するように、Ｉ群ＸＩであることが分かった。コドン最適化コード配列（配列番号３０８）を使用してザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）中で発現されると、アクチノプラネス・ミズーリエンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）からのＸＩは、（コドン最適化コード配列：配列番号３１０を使用して）同様に発現された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＩの比活性、または（コドン最適化コード配列：配列番号３０９を使用して）同様に発現されたラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）の他のＩＩ群ＸＩの比活性よりも高い、キシロースイソメラーゼ比活性を有した。Ａ．ミズーリエンシス（Ａ．ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、およびＬ．ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）ＸＩのためのコドン最適化コード配列は、非最適化コード配列から発現された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼをはじめとする、キシロース利用のための４酵素全てを用いて遺伝子改変されたザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）中でそれぞれ発現された。Ａ．ミズーリエンシス（Ａ．ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）ＸＩを発現する株は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはＬ．ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）のどちらかからのＸＩを発現する株よりも、キシロース含有培地中でより良く成長し、より多くのキシロースを利用して、より多くのエタノールを産生した。

【0090】

下述するように、Ｉ群に属すると同定された追加的なＸＩを発現するザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株もまた、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはＬ．ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）からのＩＩ群ＸＩを発現する株よりも、キシロース含有培地中でより良く成長し、より多くのキシロースを利用して、より多くのエタノールを産生することが分かった。これらは、ゲオデルマトフィルス・オブスクルス（Ｇｅｏｄｅｒｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ ｏｂｓｃｕｒｕｓ）（配列番号６４）、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）（配列番号１０）、サリニスポラ・アレニコーラ（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ａｒｅｎｉｃｏｌａ）（配列番号１８）、およびキシラニモナス・セルシリティカ（Ｘｙｌａｎｉｍｏｎａｓ ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃａ）（配列番号４０）からのＸＩを含有する株である。

【0091】

Ｉ群ＸＩ発現株では、ＩＩ群ＸＩ発現株と比較して、成長増大、キシロース利用改善、およびエタノール産生改善は、それぞれ程度が変動してもよい。差違は、特定ＸＩをコードする遺伝子の発現特性、キシロースやその他の炭素源の量をはじめとする培地中の炭素源組成などの培養条件、およびキシロース利用および／またはエタノール産生に関与する追加的な遺伝子修飾などの株の特性などの要素に基づいてもよい。

【0092】

Ｉ群キシロースイソメラーゼ
Ｉ群に属するあらゆるＸＩを検討中の株で使用して、キシロース利用を改善してもよい。Ｉ群ＸＩは、それらの長さによってＩＩ群ＸＩから区別される。Ｉ群ＸＩは長さが典型的に約３８０〜３９０個のアミノ酸であるのに対し、ＩＩ群ＸＩは長さが典型的に約４４０〜４６０個のアミノ酸であることが分かった。Ｉ群ＸＩ中では少なくとも約５０％のアミノ酸同一性があるのに対し、ＩＩ群ＸＩはＩ群ＸＩと２０〜３０％のアミノ酸同一性のみを有する。したがってこれらの構造基準を使用して、ＸＩはＩ群またはＩＩ群に属すると容易に分類され得る。

【0093】

Ｐａｒｋ ａｎｄ Ｂａｔｔ（前出）において、Ｉ群に属すると同定されたＸＩは、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、アクチノプラーネス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ）、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、およびアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）からのものである一方、ＩＩ群に属すると同定されたＸＩは、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、およびサーモアナエロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）からのものである。

【0094】

バイオインフォマティクス解析を使用して、ＩＩ群ＸＩとの対比でＩ群ＸＩをより詳しく特性解析し、検討中の株で使用してもよいＸＩを同定する。ＸＩアミノ酸配列の分子系統学的解析を使用して、Ｉ群キシロースイソメラーゼのメンバーが同定された。配列番号２、２４、３２、３４、４２、５４、６６、６８、７８、９６、１００、１０６、１０８、１２２、１２６、１２８、１３０、１３２、１３５、１３７、１４２、および１４８〜３０６のＳＷＩＳＳＰＲＯＴデータベースから取得した機能注解付きの１８０個のＸＩシード配列を使用して、複数クエリー配列ＢＬＡＳＴ分析（ｂｌａｓｔａｌｌ）を使用して、公共データベースから収集された４４４個のＸＩ配列に対して、分子系統学的解析を実施した。

【0095】

図２に示される得られた系統樹では、Ｉ群と称される１系統学的分類内にＡ．ミズーリエンシス（Ａ．ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）ＸＩを、ＩＩ群と称される別個の分類に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＩを置く。Ｉ群およびＩＩ群は、Ｐａｒｋ ａｎｄ Ｂｒａｔｔ（前出）の分類と一致するようにラベルされる。本明細書の実施例３で試験され、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からのＸＩと同等の効果を有することが示されたラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）ＸＩは、ＩＩ群にもある。２１個のシード配列（配列番号２、２４、３２、３４、４２、５４、６６、６８、７８、９６、１００、１０６、１０８、１２２、１２６、１２８、１３０、１３２、１３５、１３７、および１４２）は、Ｉ群ＸＩに属することが分かった。Ｉ群に属する同定されたＸＩ配列は、実施例４に記載されるように、５０％の一致度の閾値クラスターを形成する。ＩＩ群に属するＸＩ配列は、別個の５０％の一致度の閾値クラスターを形成する。各同定されたＩ群ＸＩは、以下の微生物の１つのゲノムによってコードされ、したがってそれに内在性である。アクチノプラーネス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、サーモバキュラム（Ｔｈｅｒｍｏｂａｃｕｌｕｍ）、ヘルペトシフォン（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ）、アシドバクテリア（Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ロゼイフレクサス（Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ）、メイオサーマス（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ）、デイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、メイオサーマス（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ）、スタッケブランドチア（Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔｉａ）、クリベラ（Ｋｒｉｂｂｅｌｌａ）、キシラニモナス（Ｘｙｌａｎｉｍｏｎａｓ）、ノカルジオプシス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ）、カテヌリスポラ（Ｃａｔｅｎｕｌｉｓｐｏｒａ）、ストレプトスポランギウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ）、ゲオデルマトフィルス（Ｇｅｏｄｅｒｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ）、アクチノシネマ（Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ）、サッカロモノスポラ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）、アシドサーマス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ）、サーモビフィダ（Ｔｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ）、ノカルジオイデス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｄｅｓ）、ジャニバクター（Ｊａｎｉｂａｃｔｅｒ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、レイフソニア（Ｌｅｉｆｓｏｎｉａ）、クラビバクター（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ）、ミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）、サリニスポラ（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ）、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）、ジョネシア（Ｊｏｎｅｓｉａ）、ナカムレラ（Ｎａｋａｍｕｒｅｌｌａ）、アクチノミセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）、モビルンカス（Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ）、ブラキバクテリウム（Ｂｒａｃｈｙｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ボイテンベルギア（Ｂｅｕｔｅｎｂｅｒｇｉａ）、フランキア（Ｆｒａｎｋｉａ）、およびアクチノバクテリウム（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）。

【0096】

本明細書の実施例４に記載される分子系統学的解析による測定によってＩ群ＸＩに属するあらゆるＸＩは、検討中の株で使用されてもよい。Ｉ群ＸＩの分子系統学は、図３により詳細に示される。図３中のＩ群ＸＩは、２〜１３０の偶数と１３１〜１４７の配列番号を有するものとして、表３に列挙される。これらのタンパク質のコード領域は、１〜１２９の奇数の配列番号を有するものとして、表３に列挙される。本明細書の実施例４に記載される分子系統学的解析を使用してＩ群に属すると同定され得る、あらゆるその他の同定されたＸＩは、検討中の株で使用されてもよい。代案としては、検討中の株で使用されてもよいＸＩは、２〜１３０の偶数、および１３１〜１４７の配列番号のＸＩアミノ酸配列のいずれかと、少なくとも約７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、または少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列がある、キシロースイソメラーゼタンパク質として同定されてもよい。一実施形態では、検討中の株で使用されてもよいＸＩは、キシロースイソメラーゼ活性があり、配列番号２４、６６、１３４、１４０、１４３、１４５、および１４７のＸＩアミノ酸配列と、少なくとも約７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、または少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列がある、タンパク質として同定されてもよい。同一性は、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．１、およびＧｏｎｎｅｔ ２５０シリーズのタンパク質重量マトリックスのデフォルトパラメーターを使用した、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｗ法に基づく。

【0097】

Ｉ群およびＩＩ群ＸＩは、本明細書の実施例４に記載されるＧｒｏｕｐＳｉｍ分析を使用してさらに特性解析された。この分析を通じて、特定アミノ酸部分が、Ｉ群およびＩＩ群ＸＩタンパク質の構造を区別するための特異性決定位置（ＳＤＰ）として判定された。これらのＳＤＰアミノ酸の位置は、本明細書で、アクチノプラネス・ミズーリエンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）（配列番号６６）からの代表的Ｉ群タンパク質Ｐ１２８５１中の対応する位置、およびサーモアナエロバクテリウム・サーモスルフリゲネス（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓｕｌｆｕｒｉｇｅｎｅｓ）（配列番号２６７）からの代表的ＩＩ群タンパク質Ｐ１９１４８中の対応する位置において提示される。ＩＩ群タンパク質中の位置は、一般にＩ群タンパク質よりも約５１個多い。その他のＩ群およびＩＩタンパク質中の対応する位置は、配列アラインメントおよびコンテクストにより、当業者によって容易に同定され得る。スコア０．９以上のＩ群およびＩＩ群ＸＩ（完全スコア１は、群内の全てのタンパク質が指定位置で列挙されるアミノ酸を有し、群間ではアミノ酸が常に異なることを示す）を区別するＳＤＰ識別子は、Ｐ１２８５１とＰ１９１４８の対比における以下のアミノ酸（ＡＡ）位置である：
１）ＡＡ２２６はロイシンであり；ＡＡ２７７はヒスチジンである
２）ＡＡ２２３はメチオニンであり；ＡＡ２７４はロイシンである
３）ＡＡ１９１はイソロイシンであり；ＡＡ２４２はグルタミンである
４）ＡＡ１９５はスレオニン、セリン、またはバリンであり；ＡＡ２４６はアスパラギン酸である
５）ＡＡ８８はメチオニン、スレオニン、またはグアニンであり；ＡＡ１３９はアルギニンまたはトリプトファンである
６）ＡＡ２９０はヒスチジンであり；ＡＡ３３７はアスパラギンまたはメチオニンである７）ＡＡ２２１はグルタミン酸またはアスパラギン酸であり；ＡＡ２７２はアラニン、スレオニン、またはグリシンである
８）ＡＡ２４２はフェニルアラニン、バリン、またはロイシンであり；Ａ２９３はグリシン、システイン、またはトリプトファンである
９）ＡＡ２４３はヒスチジンであり；ＡＡ２９４はセリン、アスパラギン、グリシン、またはロイシンである
１０）ＡＡ１９３はロイシン、フェニルアラニン、またはメチオニンであり；ＡＡ２４４はアスパラギン酸である
１１）ＡＡ２５６はグルタミンであり；ＡＡ３０８はスレオニン、イソロイシン、バリン、ロイシン、メチオニン、チロシン、またはヒスチジンである
１２）ＡＡ２１３はグリシンであり；ＡＡ２６４はリジン、アスパラギン、セリン、グルタミン酸、アラニン、ロイシン、アルギニン、またはグルタミンである
１３）ＡＡ２８８はプロリン、チロシン、アラニン、またはセリンであり；ＡＡ３３５はバリンまたはグリシンである
１４）ＡＡ２４９はグルタミンであり；ＡＡ３０１はアスパラギン酸、ヒスチジン、アスパラギン、アルギニン、セリン、またはアラニンである。

【0098】

これらのアミノ酸位置識別子を使用して、Ｉ群ＸＩは、当業者によって容易に同定され得る。実質的に上に列挙したようなＩ群アミノ酸位置識別子を有するＸＩは、本明細書で長さに関わりなくＩ群ＸＩと見なされる。したがってＩＩ群ＸＩについて示される実質的に全ての位置が、Ｉ群ＸＩについて示されるアミノ酸で埋まれば、タンパク質は長さに関わりなくＩ群ＸＩと見なされる。このパターンがその他のアミノ酸識別子に対しても保持されるなら、例えばヒスチジンの代わりに、２７７位置にＩ群ＡＡ２２６ロイシン識別子を有するＸＩは、Ｉ群ＸＩである。実質的に、スコア１との対比でスコア０．９によって示されるように、全位置における完全に正確な一致がなくてもよいことが、意図される。Ｉ群ＸＩは、ＳＤＰで、上の一覧と一致するアミノ酸の少なくとも９０％を有する。

【0099】

ＨＭＭＥＲソフトウェアパッケージ（Ｊａｎｅｌｉａ Ｆａｒｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃａｍｐｕｓ，Ａｓｈｂｕｒｎ，ＶＡ）のｈｍｍｓｅａｒｃｈアルゴリズムを使用して、Ｉ群ＸＩの追加的なバイオインフォマティクス解析を実施した。ｈｍｍｓｅａｒｃｈアルゴリズムのＺパラメータは、１０億に設定した。タンパク質配列セットを使用したＨＭＭＥＲ分析の出力は、プロファイル隠れマルコフモデル（プロファイルＨＭＭ）であった。どちらも参照によって本明細書に援用する、Ｄｕｒｂｉｎ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ：ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９８）およびＫｒｏｇｈ ｅｔ ａｌ．（１９９４ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３５：１５０１−１５３１）に記載される、プロファイルＨＭＭの背後にある理論は、タンパク質セットの配列比較における各位置の各アミノ酸の存在確率に基づく、タンパク質セットの特性解析である。

【0100】

既知のキシロースイソメラーゼ活性を有して、上述の分子系統学的解析により群ＸＩに属することが分かった２１個のシード配列をタンパク質セットとして使用して、プロファイルＨＭＭを作成した。これらのタンパク質は、配列番号２、２４、３２、３４、４２、５４、６６、６８、７８、９６、１００、１０６、１０８、１２２、１２６、１２８、１３０、１３２、１３５、１３７、および１４２を有する。分子系統学的解析によってＩ群に属すると同定され表３に列挙される全てのＸＩは、Ｚパラメータを１０億に設定して、Ｅ値スコアが２．２ｅ−１８１以下のＩ群シード配列から作成されたプロファイルＨＭＭに一致する。分子系統学的解析によってＩＩ群に属すると同定された全てのＸＩは、Ｅ値スコアが１．５ｅ−０７以上の同一プロファイルＨＭＭに一致する。添付の表２は、各ＸＩ配列番号のＥ値スコアを列挙する。したがって作成されたプロファイルＨＭＭは、機能的Ｉ群ＸＩの構造的特性解析を与え、分子系統学的解析を裏付ける。したがって、Ｉ群ＸＩの最大スコアとＩＩ群ＸＩの最小スコアの間である１Ｅ−１５以下のＥ値で、上述の２１個のＩ群ＸＩシード配列を使用して作成されたプロファイルＨＭＭと一致するあらゆるＸＩタンパク質が、検討中の株で使用されてもよい。より低いＥ値スコアは、より良い一致を示す。

【0101】

さらに、本明細書に記載され、または当該技術分野で記載されるＩ群ＸＩ配列を使用して、自然界のその他の相同体を同定してもよい。例えば本明細書に記載されるＸＩをコードする核酸断片のそれぞれを使用して、相同タンパク質をコードする遺伝子を単離してもよい。配列依存プロトコルを使用した相同遺伝子の単離については、当該技術分野で良く知られている。配列依存プロトコルの例としては以下が挙げられるが、これに限定されるものではない。１）核酸ハイブリダイゼーション法；２）核酸増幅技術の様々な使用［例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、Ｍｕｌｌｉｓらに付与された米国特許第４，６８３，２０２号明細書；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｔａｂｏｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：１０７４（１９８５）；または鎖置換増幅（ＳＤＡ）、Ｗａｌｋｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９：３９２（１９９２）］によって例証される、ＤＮＡおよびＲＮＡ増幅法；および３）相補性によるライブラリー構築およびスクリーニング法。

【0102】

当該技術分野で知られているように、遺伝コードの縮重の理由から、アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列中に多様性があってもよい。標的宿主細胞中におけるアミノ酸配列発現のためにコドンを最適化して、最適なコードされたタンパク質発現を提供してもよい。

【0103】

Ｉ群ＸＩ発現
検討中の株では、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）やザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）などのザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株または関連エタノロジェン中で、上述したようなキシルロキナーゼ、トランスケトラーゼ、およびトランスアルドラーゼをコードする遺伝子と共に、上述のＩ群ＸＩのいずれかを発現させてもよく、次にそれは下述するようにキシロースを利用できる。ザイモバクター・パルメ（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ ｐａｌｍａｅ）は、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）について下述するように、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼおよびエノラーゼプロモーターを使用して、キシロース利用のための遺伝子発現によってキシロース利用のために遺伝子改変されている、エタノール産生細菌である（Ｙａｎａｓｅ ｅｔ ａｌ．Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００７）７３：２５９２−２５９９）。

【0104】

Ｉ群ＸＩを発現するのに使用してもよいコード領域としては、１〜１２９の奇数配列番号として表１に列挙されるもの、２〜１３０の偶数および１３１〜１４７の配列番号として表１に列挙されるＸＩタンパク質をコードするその他の配列、ならびに本明細書に記載されるバイオインフォマティクスまたは実験法を使用して、Ｉ群ＸＩをコードすると当該技術分野で同定された配列、および当該技術分野で周知のものが挙げられる。

【0105】

発現のためには、キメラ遺伝子中で、作動可能に結合するプロモーターおよび典型的に終止配列と共に、Ｉ群ＸＩコーディング領域が構築される。別法としては、Ｉ群ＸＩコーディング領域が、プロモーターおよび終止配列と作動可能に結合して、１つまたは複数の追加的なコード領域を含む、オペロンの一部として構築される。使用されてもよいプロモーターは、ｓｕｐｅｒＧＡＰプロモーターまたはＰ_ｇａｐｓと称されることもある、参照によって本明細書に援用する米国特許出願公開第２００９０２４６８７６号明細書で開示されるより高活性のＧＡＰプロモーター変異体をはじめとする、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰプロモーターまたはＰ_ｇａｐ）のプロモーターなどのザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）細胞中で発現されるプロモーター、およびＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）エノラーゼ（ＥＮＯプロモーター）遺伝子である。終結シグナルもまた、標的細胞中で発現されるものである。ＸＩ発現のためのキメラ遺伝子またはオペロンは、典型的にさらなる操作のために、ベクター中で構築され、またはそれに移転される。ベクターについては、当該技術分野で良く知られている。特定のベクターは、広範な宿主細菌中で自己複製でき、接合によって移転され得る。ｐＲＫ４０４と、３つの関連ベクターｐＲＫ４３７、ｐＲＫ４４２、およびｐＲＫ４４２（Ｈ）の完全なアノテート付き配列が利用できる。これらの誘導体は、グラム陰性細菌における遺伝子操作の有益なツールであることが判明している（Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ ５０（１）：７４−７９（２００３））。

【0106】

ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）中における発現のために特に有用なのは、米国特許第５，５１４，５８３号明細書に記載されるｐＺＢ１８８などの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の双方の中で自己複製し得るベクターである。ベクターは、細胞内の自律複製のためのプラスミドと、細菌ゲノムに組み込まれるコンストラクトを保有するためのプラスミドを含んでもよい。ＤＮＡ組み込みのためのプラスミドは、トランスポゾン、標的細菌ゲノムと相同的な核酸配列領域、または組み込みを支援するその他の配列を含んでもよい。追加的なタイプのベクターはまた、例えば商業的にＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）から入手できるシステムを使用して生成されるトランスポゾームであってもよい。所望の標的宿主および所望の機能のために、適切なベクターをどのように選択するかは良く知られている。

【0107】

細菌細胞は、凍結解凍形質転換、カルシウム媒介形質転換、電気穿孔、または接合の使用などの周知の方法によって、キシロースイソメラーゼコーディング領域を含んでなるキメラ遺伝子を有するベクターを導入することで、遺伝子改変されてもよい。キシロースイソメラーゼ酵素を発現させることで、キシロース利用のために遺伝子改変されるあらゆる細菌細胞は、本明細書に記載される株を遺伝子改変するための形質転換の標的宿主細胞である。特に適切な宿主細胞は、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）およびザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）細胞である。導入されたキメラ遺伝子は、安定複製型プラスミド上で細胞中に維持されて、または導入に続いてゲノムに組み込まれてもよい。

【0108】

細菌細胞ゲノム中に組み込まれたキシロースイソメラーゼキメラ遺伝子またはオペロンがある株を遺伝子操作するために、相同的組換え、トランスポゾン挿入、またはトランスポゾーム挿入などの当該技術分野で周知の方法を使用してもよい。相同的組換えでは、標的組み込み部位の側面に位置するＤＮＡ配列は、標的ゲノム部位への選択可能なマーカーおよびキシロースイソメラーゼキメラ遺伝子の挿入をもたらす、スペクチノマイシン耐性遺伝子、またはその他の選択可能なマーカー、およびキシロースイソメラーゼキメラ遺伝子と境を接して配置される。さらに選択可能なマーカーは、対応する部位特異的リコンビナーゼの発現後に耐性遺伝子がゲノムから切除されるように、部位特異的組み換え部位と境を接してもよい。

【0109】

完全キシロース利用経路の遺伝子操作
Ｉ群ＸＩコーディング領域を含んでなるキメラ遺伝子またはオペロンによる形質転換に加えて、検討中の株はまた、キシロースの利用に必要な３つのその他の酵素の発現のために遺伝子改変される。キシルロースをリン酸化してキシルロース５−リン酸を形成するキシルロキナーゼ；およびペントース代謝を解糖作用エントナー・ドウドロフ経路に連結してキシロースがエタノールに代謝できるようにする中間体に、キシルロース５−リン酸を変換するペントースリン酸経路の２つの酵素、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼ（図１参照）。キシロース利用ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株は、米国特許第５５１４５８３号明細書、米国特許第５７１２１３３号明細書、米国特許第６５６６１０７号明細書、国際公開第９５／２８４７６号パンフレット、Ｆｅｌｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（（１９９２）Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３８：３５４−３６１）、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：２４０−２４３に記載される。これらの株は、ＩＩ群キシロースイソメラーゼをはじめとする大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）遺伝子からのコード配列によって形質転換された。

【0110】

Ｉ群ＸＩは、キシロース利用のために発現される唯一のＸＩであってもよく、またはそれは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からのものなどの発現されたＩＩ群ＸＩに加えて発現されてもよい。したがってＩ群ＸＩは、ＩＩ群キシロースイソメラーゼをコードする遺伝子を含む完全キシロース利用経路を有してキシロースを利用できる、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）株に導入されてもよい。代案としては、Ｉ群ＸＩは、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼ、およびトランスケトラーゼを発現し、キシロース利用のためのキシロースイソメラーゼ活性だけが欠如しているザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）株に導入されてもよい。Ｉ群ＸＩの導入によって、株はキシロースが利用できるようになる。

【0111】

当業者に良く知られているように、個々のキメラ遺伝子から、または２つ以上のコーディング領域を含むオペロンから、追加的な３つの酵素が発現されてもよい。これらの酵素をコードするＤＮＡ配列は、腸内細菌、およびある種の酵母および真菌などのキシロースを代謝できる多数の微生物のいずれかから得られてもよい。コード領域の起源としては、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓ）、およびザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）が挙げられる。特に有用なのは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のコード領域である。

【0112】

内在性遺伝子は、キシロース発酵経路の一部を提供してもよく、またはキシロース代謝に有用な酵素活性があるタンパク質を提供する、あらゆる公知の遺伝子操作技術によって改変されてもよい。例えば、内在性トランスケトラーゼは、キシロース利用経路の作成において、その他の導入された酵素機能を補足してもよい。

【0113】

公知であり、使用されてもよいキシロース利用株の例としては、ＣＰ４（ｐＺＢ５）（米国特許第５，５１４，５８３号明細書）、ＡＴＣＣ３１８２１／ｐＺＢ５（米国特許第６，５６６，１０７号明細書）、８ｂ（米国特許出願公開第２００３０１６２２７１号明細書；Ｍｏｈａｇｈｅｇｈｉ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２５；３２１−３２５）、およびＺＷ６５８（ＡＴＴＣＣ＃ＰＴＡ−７８５８；米国特許第７，７４１，１１９号明細書）が挙げられる。

【0114】

天然基質でないキシロースのようなその他の糖類を利用するようにさらに遺伝子改変されたザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）またはザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）株もまた、検討中のプロセスで使用されてもよい。アラビノース利用のために遺伝子改変されたＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の株の例は、参照によって本明細書に援用する、米国特許第５，８４３，７６０号明細書に記載される。株をその他の追加的な方法で改変して、キシロース利用およびエタノール産生を改善してもよい。

【0115】

改善されたキシロース利用株の発酵
Ｉ群キシロースイソメラーゼキメラ遺伝子、およびキシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼ、およびトランスケトラーゼ発現のための遺伝子またはオペロンを有する遺伝子改変キシロース利用株を発酵で使用して、株の天然生成物を生産し、または株がそれを産生するように遺伝子改変されている生成物を生産してもよい。例えばザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）およびザイモバクター・パルメ（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ ｐａｌｍａｅ）は、天然のエタノロジェンである。一例として、発明のＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株によるエタノールの生産が記載される。

【0116】

エタノール生産のために、Ｉ群キシロースイソメラーゼキメラ遺伝子を有する組換えキシロース利用Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）をキシロースをはじめとする混合糖類を含有する培地に接触させる。典型的に培地は、アラビノース、キシロース、およびグルコースを含む混合糖を含有する。培地は、加工セルロース性またはリグノセルロース性バイオマスに由来する糖を含む、生物由来資源加水分解産物を含有してもよい。

【0117】

米国特許第７，６２９，１５６号明細書で開示されるように、成長が阻害される程に混合糖の濃度が高い場合、培地はソルビトール、マンニトール、またはその混合物を含む。ガラクチトールまたはリビトールをソルビトールまたはマンニトールで置換してもよく、またはそれと組み合わせてもよい。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）は、発酵が起きてエタノールが生産される培地中で培養する。発酵は、空気、酸素、またはその他の気体の補給なしに（嫌気性、微有酸素性、または微好気性発酵などの条件を含んでもよい）、少なくとも約２４時間実施され、３０以上時間実施されてもよい。最大のエタノール生産に達するタイミングは、発酵条件次第で変動する。典型的に、培地中に阻害物質が存在するとより長い発酵時間が必要である。発酵は、約３０℃〜約３７℃の温度および約４．５〜約７．５のｐＨで実施されてもよい。

【0118】

本Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）は、実験室規模の発酵槽内で、および商業的な量のエタノールが生産される大規模発酵において、キシロースを含む混合糖を含有する培地中で培養してもよい。エタノールの商業生産が所望される場合、多様な培養法を応用してもよい。例えば本Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株からの大量生産は、バッチおよび連続培養法の双方によって生成されてもよい。古典的バッチ培養法は閉鎖系であり、培地組成物は培養開始時に設定され、培養過程中に人為的変更を受けない。したがって培養過程の開始時に所望の生物を培地に接種して、システムに何も添加することなく成長または代謝活性を生じさせる。しかし典型的に、「バッチ」培養は炭素源の添加に関してのバッチであり、ｐＨおよび酸素濃度などの要素を制御する試みがなされることが多い。バッチシステムでは、システムの代謝産物および生物由来資源組成物は、培養が終結する時点まで常に変化する。バッチ培養中では、細胞は、静止遅滞期から高成長対数期を経て、最後に成長率が減少しまたは停止する定常期に至る。処置されない場合、定常期の細胞はやがて死滅する。対数期の細胞は、いくつかのシステムにおいて、最終産物または中間体の生成の大半の責を負うことが多い。その他のシステムでは、静止期または対数後期生産があり得る。

【0119】

標準バッチシステムの変法が、流加システムである。流加培養過程もまた、本Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株の成長に適し、培養過程の進行に伴って基質が徐々に添加されることを除いては、典型的なバッチシステムを含んでなる。流加システムは、異化代謝産物抑制が細胞代謝を阻害する傾向がある場合、そして培地中に限定的量の基質を有することが望ましい場合に有用である。流加システム中の実際の基質濃度の測定は困難であり、したがってｐＨやＣＯ_２などの廃ガス分圧などの測定可能な要素の変化に基づいて推定される。バッチおよび流加培養法は一般的で、当該技術分野で良く知られており、参照によって本明細書に援用するＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｒｕｅｇｅｒ，Ｃｒｕｅｇｅｒ，およびＢｒｏｃｋ，第２版（１９８９年）Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ、またはＤｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ Ｖ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３６，２２７，（１９９２年）に例が見られる。

【0120】

エタノールの商業生産はまた、連続培養を用いて達成されてもよい。連続培養は、規定培地がバイオリアクターに連続的に添加され、同時に加工のために等量の慣熟培地が取り出される開放系である。連続の培養は、一般に、細胞が主として対数成長期にある一定の高液相密度に細胞を保つ。代案としては、固定化細胞を用いて連続培養を実施してもよく、そこでは炭素および栄養素が連続的に添加され、価値ある生成物、副産物または老廃物は細胞集団から連続的に除去される。細胞固定化は、当業者に知られている天然および／または合成材料から構成される、多様な固体担体を使用して実施してもよい。

【0121】

連続または半連続培養は、細胞成長または最終産物濃度に影響を及ぼす、１つの要素またはあらゆる数の要素の調節を可能にする。例えば１つの方法は、炭素源または窒素レベルなどの制限的栄養物質を定率に保ち、その他の全パラメーターを加減する。別のシステムでは、培地濁度によって測定される細胞濃度を一定に保ちながら、成長に影響を及ぼすいくつかの要素を連続的に変更し得る。連続系は恒常的成長条件を保つことを目指し、したがって培地の除去による細胞損失は、培養中の細胞成長率に対して平衡状態になくてはならない。連続培養過程のために栄養素および増殖因子を調節する方法、ならびに生成物形成速度を最大化する技術は工業微生物学の技術分野で良く知られており、多様な方法がＢｒｏｃｋ、前出で詳述されている。

【0122】

エタノール生産に特に適するのは、次のような発酵計画である。本発明の所望のＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株を軌道振盪機内で約１５０ｒｐｍで振盪しながら約３０℃〜約３７℃の半天然培地中で振盪フラスコ内で培養し、次に同様の培地を含有する１０Ｌの種発酵槽に移す。ＯＤ_６００が３〜６になるまで種培養物を種発酵槽内で嫌気的に培養してから、発酵パラメーターをエタノール生産のために最適化した生産発酵槽に移す。種タンクから生産タンクに移される典型的な接種体積は、約２％から約２０％ｖ／ｖの範囲に及ぶ。典型的な発酵培地は、リン酸カリウム（１．０〜１０．０ｇ／ｌ）、硫酸アンモニウム（０〜２．０ｇ／ｌ）、硫酸マグネシウム（０〜５．０ｇ／ｌ）、酵母抽出物またはダイズベース製品などの複合窒素源（０〜１０ｇ／ｌ）などの最少培地構成要素を含有する。最終濃度約５ｍＭのソルビトールまたはマンニトールが培地中に存在する。最初の炭素源バッチ（５０〜２００ｇ／ｌ）の枯渇に際し、炭素源を提供するキシロースと、グルコース（またはスクロース）などの少なくとも１つの追加的糖とを含む混合糖が発酵容器に継続的に添加されて、エタノール速度と力価を最大化する。炭素源供給速度は動的に調節されて、酢酸などの毒性副産物の蓄積をもたらし得る過剰なグルコースを培養が蓄積しないようにする。資化される基質から生成するエタノールの収率を最大化するために、最初にバッチ供給され、または発酵過程中に供給される一定量のリン酸塩によって、バイオマス成長を制限する。発酵は、腐食性溶液（水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、または水酸化ナトリウムなど）および硫酸またはリン酸のどちらかを使用して、ｐＨ５．０〜６．０に調節される。発酵槽の温度は３０℃〜３５℃に調節される。気泡を最小限にするために、消泡剤（シリコーン基剤、有機基剤などのあらゆる種類）を必要に応じて容器に添加する。株中にそれに対する抗生物質耐性マーカーがある場合、カナマイシンなどの抗生物質を任意に使用して汚染を最小限にしてもよい。

【0123】

あらゆる上述の条件のセット、およびさらに当該技術分野で周知のこれらの条件のバリエーションが、キシロース利用組換えザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株によるエタノール生産のための適切な条件である。

【実施例】

【0124】

本発明を以下の実施例でさらに定義する。実施例は、本発明の好ましい実施態様を示唆しながら、例証としてのみ提供されることを理解すべきである。上の考察およびこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的特徴を見極め得て、その精神と範囲を逸脱することなく本発明に様々な変更と修正を加えて、それを様々な用途と条件に適応させ得る。

【0125】

一般方法
略語の意味は次の通り。「ｋｂ」はキロベースを意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｎｔ」はヌクレオチドを意味し、「ｈｒ」は時間を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｄ」は日を意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍｌ」または「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ｍｇ」はミリグラムを意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「μＭ」はマイクロモル濃度を意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「μｍｏｌ」はマイクロモルを意味し、「ｐｍｏｌ」はピコモルを意味し、「Ｃｍ」はクロラムフェニコールを意味し、「Ｃｍ^ｒ」はクロラムフェニコール耐性を意味し、「Ｃｍ^ｓ」はクロラムフェニコール感受性を意味し、「Ｓｐ^ｒ」はスペクチノマイシン耐性を意味し、「Ｓｐ^ｓ」はスペクチノマイシン感受性を意味し、「ＸＩ」はキシロースイソメラーゼであり、「ＸＫ」はキシルロキナーゼであり、「ＴＡＬ」はトランスアルドラーゼであり、「ＴＫＴ」はトランスケトラーゼであり、「ＲＭ」は１０ｇ／Ｌの酵母抽出物プラス２ｇ／ＬのＫＨ_２ＰＯ_４を含有する富栄養培地を意味し、「ＭＭ」は１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、５ｇ／Ｌのトリプトン、２．５ｇ／Ｌの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、および０．２ｇ／ＬのＫＨ_２ＰＯ_４を含有する交配培地を意味する。

【0126】

実施例で使用する標準組み換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該技術分野でよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９年）（下文において「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）；およびＳｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．およびＥｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４年）；およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅによる出版，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ（１９８７年）に記載されている。

【0127】

実施例１
キメラキシロースイソメラーゼ遺伝子の構築および二重交叉自殺ベクターのアセンブリー ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）への組み込みおよび発現のために、アクチノプラネス・ミズーリエンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）（ＡＭｘｙｌＡ）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）（ＬＢｘｙｌＡ）、および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＥＣｘｙｌＡ）からのキシロースイソメラーゼのコード領域のコンストラクトを作成した。コード配列は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＭ４のコドンバイアスに従ってＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）中の発現のために最適され、合成された。それぞれＥｃｏＲＶ部位でｐＵＣ５７にクローンされ、プラスミドｐＵＣ５７−ＡＭｘｙｌＡ（コドン最適化ＡＭｘｙｌＡコーディング領域：配列番号３０８）、ｐＵＣ５７−ＬＢｘｙｌＡ（コドン最適化ＬＢｘｙｌＡコーディング領域：配列番号３０９）、およびｐＵＣ５７−ＥＣｘｙｌＡ（コドン最適化ＥＣｘｙｌＡコーディング領域：配列番号３１０）として提供された。最適化ｘｙｌＡコード配列は、天然キシロースイソメラーゼ（ＸＩ）をコードする。

【0128】

Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（Ｐ_ｇａｐ；配列番号３１１）からの３０５ｂｐのプロモーターと、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｌ−リブロース５リン酸４−エピメラーゼ遺伝子（ａｒａＤ３’ＵＴＲ；配列番号３１２）からの１６６ｂｐのターミネーターとの連結によって、ｘｙｌＡコード配列をＰ_ｇａｐ−ｘｙｌＡ−ａｒａＤ３’ＵＴＲ構造があるキメラ遺伝子に構築した。この目的で、Ｐ_ｇａｐおよびａｒａＤ３’ＵＴＲ重複断片をＰＣＲによって合成した。１つのＰＣＲ反応は、５０μＬのＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｐｆｘ ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、テンプレート（配列番号３１３）としての１μＬの４０ｎｇ／μＬ ｐＡＲＡ３５４、および１μＬの１０μＭ順方向および逆方向プライマーからなった。プラスミドｐＡＲＡ３５４（配列番号３１３）は、参照によって本明細書に援用する、同一譲受人同時係属米国特許出願第１２／７９６０２５号明細書に記載され、それはｐＢＳ ＳＫ（＋）ベクターであり、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からのａｒａＢ、ａｒａＡ、およびａｒａＤ（それぞれタンパク質Ｌ−リブロースキナーゼ、Ｌ−アラビノースイソメラーゼ、およびＬ−リブロース−５−リン酸−４−エピメラーゼをコードする）のコード領域に隣接するＰ_ｇａｐプロモーターであるＰ_ｇａｐ−ａｒａＢＡＤオペロンを含む。オペロンは、ａｒａＤコーディング領域に対して３’である３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。ｐＡＲＡ３５４については、下でさらに記載される。反応は、エッペンドルフＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ（Ｈｅｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上で、３０サイクルの９５℃で３０秒間の変性／５８℃で３０秒間のアニーリング（ａｒａＤ３’ＵＴＲでは５６℃）／６８℃で２分間の伸長のホットスタートＰＣＲプログラムに従って実施された。

【0129】

プライマーａｒａ９８およびａｒａ１２０（配列番号３１４および３１５）は、Ｐ_ｇａｐ−ＡＭ重複断片を生成する。プライマーａｒａ９８およびａｒａ１２１（配列番号３１４および３１６）は、Ｐ_ｇａｐ−ＥＣ重複断片を生成する。プライマーａｒａ９８およびａｒａ１２２（配列番号３１４および３１７）は、Ｐ_ｇａｐ−ＬＢ重複断片を生成する。３０５ｂｐのＰ_ｇａｐ配列に加えて、３つのＰ_ｇａｐ重複ＰＣＲ断片は全て、ＳｔｕＩおよびＳｐｅＩ部位を付加する１７ｂｐの５’配列と、プライマー中に提供されるそれらの対応ｘｙｌＡコード配列の最初の２２ヌクレオチドに一致する２２ｂｐの３’配列を含んだ。

【0130】

プライマーａｒａ９６およびａｒａ９７（配列番号３１８および３１９）は、２１０ｂｐのａｒａＤ３’ＵＴＲ重複断片を生成した。それは１６６ｂｐのａｒａＤ３’ＵＴＲの他に、ＸｂａＩ部位が末端にある２４ｂｐの５’配列、およびＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩ、およびＦｓｅＩ部位を提供する２０ｂｐの３’配列を含んだ。同様のＰＣＲもまた実施されてｘｙｌＡ重複断片が合成されたが、アニーリング温度は５５℃に低下された。これらの反応では、プライマーａｒａ１１４およびａｒａ１１５（配列番号３２０および３２１）を使用して、１，２２９ｂｐのＡＭｘｙｌＡ重複断片がｐＵＣ５７−ＡＭｘｙｌＡから増幅された。プライマーａｒａ１１６およびａｒａ１１７（配列番号３２２および３２３）を使用して、１，３６７ｂｐのＥＣｘｙｌＡ重複断片がｐＵＣ５７−ＥＣｘｙｌＡから増幅された。プライマーａｒａ１１８およびａｒａ１１９（配列番号３２４および３２５）を使用して、１，３９４ｂｐのＬＢｘｙｌＡ重複断片がｐＵＣ５７−ＬＢｘｙｌＡから増幅された。全てのｘｙｌＡ重複断片は、Ｐ_ｇａｐの最後の１８ヌクレオチドと一致する１８ｂｐの５’配列、ＸｂａＩ部位を提供してａｒａＤ３’ＵＴＲの最初の１８ヌクレオチドに一致する２４ｂｐの３’配列、ならびにその間のｘｙｌＡコード配列を有する。Ｐ_ｇａｐ、ａｒａＤ３’ＵＴＲ、およびｘｙｌＡ重複断片は、５μＬの各ＰＣＲサンプルをアガロースゲル上で泳動し、次にＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して精製して確認された。

【0131】

重複断片は、重複ＰＣＲによって共に結合された。第１の重複ＰＣＲは、以下のようにして、５０μＬのＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｐｆｘ ＳｕｐｅｒＭｉｘ、１μＬの２０ｎｇ／μＬ Ｐ_ｇａｐ重複断片、２μＬの１０ｎｇ／μＬ対応ｘｙｌＡ重複断片、および１μＬの１０μＭ順方向および逆方向プライマーを含むように構築された。反応は、３０サイクルの９５℃で３０秒間の変性／５５℃で３０秒間のアニーリング／６８℃で２分間の伸長のホットスタートＰＣＲプログラムに従って実施された。その結果、プライマーａｒａ９８およびａｒａ１１５（配列番号３１４および３２１）を使用して、Ｐ_ｇａｐ−ＡＭおよびＡＭｘｙｌＡ断片からＰ_ｇａｐ−ＡＭｘｙｌＡ断片が合成され；プライマーａｒａ９８およびａｒａ１１７（配列番号３１４および３２３）を使用して、Ｐ_ｇａｐ−ＥＣおよびＥＣｘｙｌＡ断片からＰ_ｇａｐ−ＥＣｘｙｌＡ断片が合成され；プライマーａｒａ９８およびａｒａ１１９（配列番号３１４および３２５）を使用して、Ｐ_ｇａｐ−ＬＢおよびＬＢｘｙｌＡ断片からＰ_ｇａｐ−ＬＢｘｙｌＡ断片が合成された。これらのＰ_ｇａｐ−ｘｙｌＡ断片は、５μＬの各ＰＣＲサンプルをアガロースゲル上で泳動し、次にＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを使用して精製して確認された。

【0132】

第２の重複ＰＣＲを上と同様に構築した。それは、５０μＬのＡｃｃｕＰｒｉｍｅ ＰｆｘＳｕｐｅｒＭｉｘ、１μＬの２０ｎｇ／μＬ ａｒａＤ３’ＵＴＲ重複断片、２μＬの１０ｎｇ／μＬ Ｐ_ｇａｐ−ｘｙｌＡ断片、１μＬの１０μＭプライマーａｒａ９７（配列番号３１９）、および１μＬの１０μＭプライマーａｒａ９８（配列番号３１８）を含んだ。反応は、３０サイクルの９５℃で３０秒間の変性／５６℃で３０秒間のアニーリング／６８℃で２．５分間の伸長で実施された。得られたＰＣＲ産物の５μＬをアガロースゲル上で検査した。Ｐ_ｇａｐ−ＡＭｘｙｌＡおよびＰ_ｇａｐ−ＬＢｘｙｌＡを含有する反応は、それぞれ１，７１４ｂｐのキメラＡＭｘｙｌＡオペロン断片（Ｐ_ｇａｐ−ＡＭｘｙｌＡ−ａｒａＤ３’ＵＴＲ）および１，８７９ｂｐのキメラＬＢｘｙｌＡオペロン断片（Ｐ_ｇａｐ−ＬＢｘｙｌＡ−ａｒａＤ３’ＵＴＲ）を生成した。双方のキメラ遺伝子断片中で、最初の１７ヌクレオチドがＳｔｕＩおよびＳｐｅＩ部位を提供するのに対し、最後の３５ヌクレオチドはＦｅｓＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、およびＥｃｏＩ部位を含有する。Ｐ_ｇａｐ−ＥＣｘｙｌＡを含有するＰＣＲ反応は、キメラＥＣｘｙｌＡ断片（Ｐ_ｇａｐ−ＥＣｘｙｌＡ−ａｒａＤ３’ＵＴＲ）を生成できなかった。

【0133】

ＡＭｘｙｌＡおよびＬＢｘｙｌＡを含有するキメラ遺伝子は、同一譲受人同時係属米国特許出願第１２／７９６０２５号明細書に記載されるｐＡＲＡ３５４（配列番号３１３）と称される二重交叉（ＤＣＯ）ベクターに、それぞれライゲートされた。ｐＡＲＡ３５４は、ｐＢＳ ＳＫ（＋）誘導プラスミド（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）であり、ｐＢＳベクターはザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）中で自己複製できないので自殺ベクターとして使用され、上述したようなＰ_ｇａｐ−ａｒａＢＡＤオペロンと、ＤＣＯ相同的組換え断片を含有して、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）ゲノムのｌｄｈＡ遺伝子座中への境界のある断片（ｂｏｕｎｄｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ）の組み込みを誘導する。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＤＮＡをテンプレートとして使用し、ＤＣＯ、ＬＤＨ−Ｌ、およびＬＤＨ−Ｒのための２つのｌｄｈＡ ＤＮＡ断片をＰＣＲによって合成した。反応はＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｍｉｘを使用して、標準ＰＣＲ手順に従った。ＬＤＨ−Ｌ ＤＮＡ断片は、順方向プライマーａｒａ２０（配列番号３２６）および逆方向プライマーａｒａ２１（配列番号３２７）を使用して合成された。得られた生成物は、ｌｄｈＡコード領域に対して５’の配列、およびｌｄｈＡコード領域のヌクレオチド１〜４９３を含む８９５ｂｐのＤＮＡ断片であり、５’ＳａｃＩ部位および３’ＳｐｅＩ部位があった（配列番号３２８）。ＬＤＨ−Ｒ ＤＮＡ断片は、順方向プライマーａｒａ２２（配列番号３２９）および逆方向プライマーａｒａ２３（配列番号３３０）を使用して合成された。得られた生成物は、ｌｄｈＡコード領域のヌクレオチド４９４〜９９６、およびｌｄｈＡコード領域に対して３’の配列を含む１１６９ｂｐの断片であり、５’ＥｃｏＲＩ部位および３’ＮｏｔＩ部位があった（配列番号３３１）。ＬＤＨ−ＬおよびＬＤＨ−Ｒは、それぞれｌｄｈＡコード配列の最初の４９３塩基対と残りの５０３塩基対を含有したので、交叉型組み換えによって、ヌクレオチド＃４９３と＃４９４の間でＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のｌｄｈＡコード配列にＤＮＡ断片を直接挿入するために、ｐＡＲＡ３５４がデザインされた。

【0134】

ｐＡＲＡ３５４は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のプラスミド増殖のためのｆ１（＋）ｏｒｉｇｉｎと、アンピシリン耐性遺伝子とを有する。これに加えて、ｐＡＲＡ３５４中のＬＤＨ−ＬおよびＬＤＨ−Ｒ相同的組換え断片の間には、野性型ＬｏｘＰ部位（ＬｏｘＰｗ−ａａｄＡ−ＬｏｘＰｗ断片；配列番号３０７）およびＰ_ｇａｐ−ａｒａＢＡＤオペロンと境を接する（スペクチノマイシン耐性のための）ａａｄＡマーカーがある。

【0135】

ＡＭｘｙｌＡおよびＬＢｘｙｌＡキメラ遺伝子を含有するＰＣＲ断片をそれぞれＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化して、アガロースゲル電気泳動を実施し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。同時に、ｐＡＲＡ３５４もまたＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化して、Ｐ_ｇａｐａｒａＢＡＤオペロンを脱落させた。アガロースゲル電気泳動によってＥｃｏＲＩ−ｐＡＲＡ３５４−ＳｐｅＩプラスミド主鎖（６，０２３ｂｐ）を単離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル精製キットを使用して精製した。キメラＡＭｘｙｌＡおよびＬＢｘｙｌＡ遺伝子は、５μＬの消化ＡＭｘｙｌＡまたはＬＢｘｙｌＡキメラ遺伝子断片、２μＬの消化ｐＡＲＡ３５４主鎖、３μＬの５×リガーゼ緩衝液、および１μＬのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む１５μＬの標準連結反応中で、それぞれｐＡＲＡ３５４主鎖に構築され、７，７１４ｂｐのＤＣＯプラスミドｐＡＲＡ３５５および７，８７９ｂｐのＤＣＯプラスミドｐＡＲＡ３５６がそれぞれもたらされた。双方のプラスミドをＤＨ５α大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞中で増殖させて、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して調製した。

【0136】

ＤＣＯベクター中でキメラＥＣｘｙｌＡ遺伝子を構築するために、第１の重複ＰＣＲ中で生成されたＰ_ｇａｐ−ＥＣｘｙｌＡ重複断片をＳｐｅＩおよびＸｂａＩで消化してアガロースゲル電気泳動を実施し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル精製キットを使用して精製した。同時に、ｐＡＲＡ３５５をＳｐｅｃＩおよびＸｂａＩで消化した。ＸｂａＩ−ｐＡＲＡ３５５−ＳｐｅＩプラスミド主鎖（６，２２０ｂｐ）をアガロースゲル電気泳動によって単離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル精製キットを使用して精製した。５μＬの消化Ｐ_ｇａｐ−ＥＣｘｙｌＡ断片および２μＬの消化ｐＡＲＡ３５５主鎖断片を含む、上述したような１５μＬ標準連結反応中で、Ｐ_ｇａｐ−ＥＣｘｙｌＡ断片をｐＡＲＡ３５５主鎖に組み立てた。得られた７，８５２ｂｐのＤＣＯプラスミドｐＡＲＡ３５７をＤＨ５α大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞中で増殖させて、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを使用して調製した。

【0137】

実施例２
キメラＡＭｘｙｌＡ、ＬＢｘｙｌＡ、およびＥＣｘｙｌＡ遺伝子のザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ６４１株への組み込み
ＺＷ６４１株を使用して、キシロース利用ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）中における、Ａ．ミズーリエンシス（Ａ．ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）、Ｌ．ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＩの発現の効果をアッセイした。ＺＷ６４１株の調製は、参照によって本明細書に援用する、米国特許第７，７４１，１１９号明細書の実施例１に記載される。その中に記載されるＸ１３Ｌ３株は、後にＺＷ６４１と改称された。ＺＷ６４１は、クロラムフェニコール耐性選択可能マーカーと共に、２つのオペロンＰ_ｇａｐｘｙｌＡＢおよびＰ_ｇａｐｔａｌｔｋｔをザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）をＺＷ１（ＡＴＣＣ＃３１８２１）ゲノムに逐次組み込むことで、調製された。キシロース含有培地中で成長させることで、形質転換体をキシロース利用にさらに適応させた。

【0138】

ＺＷ６４１中で、組み込まれたＰ_ｇａｐｘｙｌＡＢおよびＰ_ｇａｐｔａｌｔｋｔオペロン、ｘｙｌＡ、ｘｙｌＢ、ｔａｌ、およびｔｋｔコード領域は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）遺伝子からのものであった。ＺＷ６４１は、キシロース代謝に必要な４つの遺伝子を全て有したが、キシロース利用は最適でない。したがってＺＷ６４１中のキシロース利用のバックグラウンドレベルは、さらなるＸＩ遺伝子の発現によって潜在的に改善され得る。

【0139】

種細胞をＭＲＭ３Ｇ５（１％の酵母抽出物、１５ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４、４ｍＭのＭｇＳＯ_４、および５０ｇ／Ｌのグルコース）中で、１５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で一晩、ＯＤ_６００値が５に近くなるまで成長させて、ＺＷ６４１−１Ａ株（ＺＷ６４１分離株）のコンピテント細胞を調製した。ＯＤ_６００値は、島津ＵＶ−１２００分光光度計（日本国京都市）を使用して測定した。細胞を収集して、新鮮培地に０．０５のＯＤ_６００値に再懸濁した。初期から中期対数期（０．５に近いＯＤ_６００）と同一条件下で、細胞を培養した。細胞を収集して、氷冷水で２回、次に氷冷１０％グリセロールで１回洗浄した。得られたコンピテント細胞を収集し、氷冷１０％グリセロールにＯＤ_６００値１００近くに再懸濁した。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の形質転換には、非メチル化ＤＮＡが必要であるため、ＤＣＯプラスミドｐＡＲＡ３５５、ｐＡＲＡ３５６、およびｐＡＲＡ３５７を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＣＳ１１０コンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）にそれぞれ形質転換した。各形質転換では、１個の形質転換細胞コロニーを１０ｍＬのＬＢ−Ａｍｐ１００（１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含有するＬＢブロス）中で一晩３７℃で培養した。ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ ＤＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、１０ｍＬの培養物からＤＮＡを調製した。

【0140】

１ＭＭ電気穿孔キュベット（ＶＷＲ，Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）内で、およそ１μｇの非メチル化プラスミドＤＮＡを５０μＬのＺＷ６４１−１Ａコンピテント細胞と混合した。ＢＴ７２０ Ｔｒａｎｓｐｏｒａｔｅｒ Ｐｌｕｓ（ＢＴＸ−Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して、プラスミドＤＮＡを２．０ＫＶで細胞中に電気穿孔した。１ｍＬのＭＭＧ５培地（１０ｇ／Ｌのグルコース、１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、５ｇ／Ｌのトリプトン、２．５ｇ／Ｌの（ＮＨ_４） _２ＳＯ_４、２ｇ／ＬのＫ_２ＨＰＯ_４、および１ｍＭのＭｇＳＯ_４）中で、４時間にわたり３０℃で形質転換細胞を回収し、嫌気ジャー内でＡｎａｅｒｏＰａｃｋ（ＭｉｔｓｕｂｉｓｈｉＧａｓＣｈｅｍｉｃａｌ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ）と共に、ＭＭＧ５−Ｓｐｅｃ２５０プレート（２５０ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシンおよび１５ｇ／Ｌの寒天添加ＭＭＧ５）上で３日間にわたり３０℃で培養した。各形質転換で、約２０個のスペクチノマイシン耐性コロニーが得られた。これらのコロニーは新鮮ＭＭＧ５−Ｓｐｅｃ２５０プレート上に画線塗抹され、上述したのと同一条件下でのそれらの成長は、キメラｘｙｌＡ遺伝子／Ｓｐｅｃ−ＲコンストラクトがＺＷ６４１のゲノムに組み込まれたことを示唆した。組み込みはＰＣＲによって分析した。１つの反応は、２５μＬのＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、（下で指定されるような）０．５μＬの１０μＭ順方向プライマーおよび逆方向プライマー、およびコロニーからの少量のＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）細胞を含んだ。反応は、エッペンドルフＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ上で、３５サイクルの９４℃で４５秒間の変性／５５℃で４５秒間のアニーリング／７２℃で１．５分間の伸長のハードスタートＰＣＲプログラムに従って実施された。５μＬをアガロースゲル上で泳動して、反応を検査した。ａｒａ４６およびａｒａ４３プライマー（配列番号３３２および３３３）を第１の検査で使用すると、１，５２１ｂｐのＰＣＲ産物がほとんどのコロニーから増幅された。この生成物は、プラスミド中のＳｐｅｃ−ＲマーカーのａａｄＡコーディング領域から、ＬＤＨ−Ｒ断片下流のＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノム配列に及び、ＬＤＨ−Ｒ断片によって媒介される組み込み事象が実証される。第２の検査中で、順方向−逆方向プライマー対が、ａｒａ４５−ａｒａ１２０（配列番号３３４および３１５）、ａｒａ４５−ａｒａ１２２（配列番号３３４および３１７）、およびａｒａ４５−ａｒａ１２１（配列番号３３４および３１６）である場合、１，２８９ｂｐのＰＣＲ産物が、ＺＷ６４１−ａｒａ３５５、ＺＷ６４１−ａｒａ３５６、およびＺＷ６４１−ａｒａ３５７のコロニーからそれぞれ増幅された。これらの生成物は、ＬＤＨ−Ｌ断片上流のＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノム配列から、ｐＡＲＡ３５５中のＡＭｘｙｌＡ、ｐＡＲＡ３５６中のＬＢｘｙｌＡ、またはｐＡＲＡ３５７中のＥＣｘｙｌＡに及ぶ。これらは、ＬＤＨ−Ｌ断片によって媒介される組み込み事象を実証した。したがって、ＰＣＲの証拠は、キメラｘｙｌＡオペロン／Ｓｐｅｃ−ＲコンストラクトがＺＷ６４１−１Ａのゲノムに組み込まれたことを立証した。ｐＡＲＡ３５５、ｐＡＲＡ３５６、およびｐＡＲＡ３５７で形質転換されたＺＷ６４１−１Ａ細胞は、それぞれＺＷ６４１−ａｒａ３５５、ＺＷ６４１−ａｒａ３５６、およびＺＷ６４１−ａｒａ３５７と命名された。

【0141】

実施例３
ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ６４１株中のＡＭｘｙｌＡ、ＬＢｘｙｌＡ、およびＥＣｘｙｌＡ発現の特性解析
ＺＷ６４１は、低レベルで発現される天然大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｘｙｌＡコーディング領域のコピーを有する。ＺＷ６４１株−ａｒａ３５５、ＺＷ６４１−ａｒａ３５６、およびＺＷ６４１−ａｒａ３５７は、コドン最適化ｘｙｌＡコーディング領域、すなわちＡＭｘｙｌＡ、ＬＢｘｙｌＡ、およびＥＣｘｙｌＡの追加的コピーをそれぞれ含有する。株について、キシロース中におけるキシロース利用、エタノール産生、および成長の改善をアッセイした。

【0142】

キシロース含有培地中におけるこれらの新しい株の成長を調べ、それらを親株ＺＷ６４１−１Ａ株と比較するために、先の実施例に記載されるＭＭＧ５−Ｓｐｅｃ２５０プレートからのＺＷ６４１−ａｒａ３５５、ＺＷ６４１−ａｒａ３５６、およびＺＷ６４１−ａｒａ３５７のそれぞれの２つの株（＃１および＃２）をＭＭＸ５プレート上に再度画線塗抹した（グルコースをキシロースで置き換えたこと以外は同一培地）。ＺＷ６４１もまた、対照としてプレート上に画線塗抹した。プレート上の細胞は、嫌気ジャー内でＡｎａｅｒｏＰａｃｋと共に３０℃で６日間培養した。３組の新しい株の全てで成長が観察されたが、ＺＷ６４１対照では観察されなかった。ＡＭｘｙｌＡの追加的なコピーを含有する、ＺＷ６４１−ａｒａ３５５の＃１および＃２株は、キシロース培地上で、ＺＷ６４１−ａｒａ３５６およびＺＷ６４１−ａｒａ３５７株よりも顕著により高い成長を示した。

【0143】

キシロース中の成長を定量的に測定するために、これらの７株に９６時間成長アッセイを実施した。アッセイでは、各株からの細胞を３０℃の１５０ｒｐｍ振盪機内において、３ｍＬのＭＲＭ３Ｇ５中で一晩培養した。細胞を収集して、ＭＲＭ３Ｘ１０（ＭＲＭ３Ｇ５と同一であるが、５０ｇ／Ｌグルコースを１００ｇ／Ｌキシロースで置き換えた）で洗浄し、ＭＲＭ３Ｘ１０に再懸濁して出発ＯＤ_６００値を０．１近くにした。２５ｍＬの懸濁液を５０ｍＬねじ蓋付きＶＷＲ遠心管に入れて１５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で９６時間にわたって培養した。時間経過中、０、４、２４、４８、７２、および９６時間目にＯＤ_６００値を測定した。図４に成長曲線としてプロットされた結果は、ｘｙｌＡの第２のコピーが、キシロース含有培地中における遺伝子改変株の成長を実際改善することを示す。ｘｙｌＡの第２のコピーを含有する株間で比較すると、ＺＷ６４１−ａｒａ３５５は、ＺＷ６４１−ａｒａ３５７よりも顕著により早く成長した。それは９６時間の成長後に、ＺＷ６４１−ａｒａ３５７のほぼ２倍の細胞密度を有した。この結果は、ＡＭｘｙｌＡによってコードされるキシロースイソメラーゼが、ＥＣｘｙｌＡによってコードされるキシロースイソメラーゼよりもはるかに良好に機能し得ることを示す。ＺＷ６４１−ａｒａ３５６は、ＺＷ６４１−ａｒａ３５７と同様にまたはわずかにより遅く成長し、ＬＢｘｙｌＡによってコードされるキシロースイソメラーゼが、ＥＣｘｙｌＡによってコードされるキシロースイソメラーゼよりも良好に機能し得ないことを示唆する。

【0144】

時間経過中、ＺＷ６４１、ＺＷ６４１−ａｒａ３５５−１、ＺＷ６４１−ａｒａ３５６−２、およびＺＷ６４１−ａｒａ３５７−２培養物の１ｍＬのサンプルを７２時間目に収集した。それらを１０，０００×ｇで遠心分離して、細胞を除去した。０．２２μｍのＣｏｓｔａｒ Ｓｐｉｎ−Ｘ遠心管フィルターを通して上清を濾過し、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣシステム上で、０．０１ＮのＨ_２ＳＯ_４と共に、５５℃速度０．６ｍＬ／分でＢｉｏＲａｄ Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−Ａ７Ｈイオン排除カラムを通過させて分析し、エタノールおよびキシロース濃度を判定した。表５に示す結果は、ＺＷ６４１における基底レベルのキシロース利用およびエタノール産生と比較して、ＺＷ６４１−ａｒａ３５５中のＡＭｘｙｌＡがキシロース消費を顕著に促進し、エタノール産生を３．５倍以上増大させたことを示す。ＺＷ６４１−ａｒａ３５７中のＥＣｘｙｌＡが、キシロース代謝およびエタノール産生をわずかに増大させたのに対し、ＺＷ６４１−ａｒａ３５６中のＬＢｘｙｌＡはキシロース利用の最も小さい増大を提供し、エタノール産生に検出可能な変化を引き起こさなかった。これらの結果は、以前の成長の観察と一致し、株間の成長の差違が、キシロースイソメラーゼ活性の差違から帰結してもよい、キシロース代謝の差違によって引き起こされたことを示唆する。

【0145】

【表11】

【0146】

ＡＭｘｙｌＡ、ＬＢｘｙｌＡ、およびＥＣｘｙｌＡによってコードされるキシロースイソメラーゼ酵素が、異なる活性を有するかどうかを判定するために、ＺＷ６４１、ＺＷ６４１−ａｒａ３５５−１、ＺＷ６４１−ａｒａ３５６−２、およびＺＷ６４１−ａｒａ３５７−２を３０℃の１５０ｒｐｍ振盪機上において、ＭＲＭ３Ｇ５中で一晩培養した。細胞を１０，０００×ｇの遠心分離によって２ｍＬの培養物から収集し、氷冷タンパク質抽出緩衝液（１０ｍＭのトリエタノールアミン塩酸塩、ｐＨ８．０、１０ｍＭのＭｇＳＯ_４、１ｍＭのＤＴＴ、および５％のグリセロール）で洗浄して、５００μＬの氷冷タンパク質抽出緩衝液に再懸濁し、マイクロプレートホーン付きＭｉｓｏｎｉｘ超音波処理器４０００（Ｑｓｏｎｉｃａ，Ｎｅｗｔｏｗｎ，ＣＴ）を使用して、設定７で３分間の超音波処理に３回曝露させた。１０，０００×ｇの遠心分離によって、細胞残骸を除去した。上清をタンパク質抽出物として保存した。クーマシープラスタンパク質アッセイ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用してそれらのタンパク質濃度を測定し、キシロースイソメラーゼ活性は修正システイン−カルバゾール法によって測定した。１００μＬのシステイン−カルバゾールアッセイ反応は、１０ｍＭのトリエタノールアミン塩酸塩緩衝液、ｐＨ７．０、１０ｍＭのＭｇＳＯ_４、２５ｍＭのＤ−キシロース、および３０μｇの抽出タンパク質を含有した。３２℃で１５分間の培養後、２５μｌの５０％トリクロロ酢酸の添加によって反応を停止した。次に、３ｍｌの氷冷７５％硫酸、１００μｌの２．４％システイン塩酸塩溶液、および１００μｌの０．１２％カルバゾールエタノール溶液を逐次反応に添加した。混合物を室温に１０分間保った。ＯＤ_５４０値を島津ＵＶ−１２００分光光度計上で測定した。Ｄ−キシルロース濃度対ＯＤ_５４０値の標準曲線に基づいて、対応するＤ−キシルロース濃度を判定した。標準曲線は、様々な量のＤ−キシルロースを含有するがＤ−キシロースおよびタンパク質は含有しない、システイン−カルバゾールアッセイを実行して開発された。最終的に、１単位のキシロースイソメラーゼ酵素は、反応中で１マイクロモルのＤ−キシルロースを生じるのに必要な活性として定義された。比活性度は、タンパク質１ミリグラムあたりの単位として計算した。アッセイでは、タンパク質なしのブランク反応中で、Ｄ−キシロースのバックグラウンドＯＤ_５４０を測定した。活性計算に先だって、このバックグラウンドを最初のＯＤ_５４０読み取りから差し引いた。各アッセイを３回繰り返した。システイン−カルバゾールアッセイの結果は図５にグラフ表示され、ＺＷ６４１、ＺＷ６４１−ａｒａ３５５−１、ＺＷ６４１−ａｒａ３５６−２、およびＺＷ６４１−ａｒａ３５７−２のタンパク質抽出物中のキシロースイソメラーゼの比活性が示される。各活性バーは３つの平行反応の平均に相当し、標準偏差はそれらに基づいて計算される。この結果はＺＷ６４１中のｘｙｌＡの第２のコピーの発現が、追加的なキシロースイソメラーゼ活性を細胞に導入することを実証する。ＺＷ６４１−ａｒａ３５５中のＡＭｘｙｌＡ、ＺＷ６４１−ａｒａ３５６中のＬＢｘｙｌＡ、およびＺＷ６４１−ａｒａ３５７中のＥＣｘｙｌＡは、ＸＩ活性をそれぞれおよそ２０倍、３倍、および４倍に増大させた。これらの３つのｘｙｌＡ遺伝子は同一アプローチによってＺＷ６４１中で構築されたので、細胞抽出物中のキシロースイソメラーゼ比活性の差違は、Ａ．ミズーリエンシス（Ａ．ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ） からのキシロースイソメラーゼが、Ｌ．ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からのキシロースイソメラーゼよりもはるかに良好に機能することを提案する。事実上、Ａ．ミズーリエンシス（Ａ．ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）ＸＩは約２．３の比活性を提示し、これはＬ．ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）ＸＩの６倍、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＩの５倍である。したがって、細胞成長、キシロース代謝、およびＸＩ活性を調べることで、本実施例は、キシロース利用Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株中のキシロース利用を改善する優れたキシロースイソメラーゼとして、Ａ．ミズーリエンシス（Ａ．ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）ＸＩを同定した。

【0147】

実施例４
キシロースイソメラーゼ酵素の構造的解析
キシロースイソメラーゼ（ＸＩ）活性を有することが知られているシード配列セットを最初に同定することで、潜在的キシロースイソメラーゼである、利用できるタンパク質配列のコレクションを作成した。シード配列は、高信頼度機能注解を有するタンパク質配列を含有する、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴデータベースからのキシロースイソメラーゼとして取得した。ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ（Ｓｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）から取得された１８０個のＸＩシード配列、配列番号２、２４、３２、３４、４２、５４、６６、６８、７８、９６、１００、１０６、１０８、１２２、１２６、１２８、１３０、１３２、１３５、１３７、１４２、および１４８〜３０６があった。次に、ＢＬＡＳＴのｂｌａｓｔａｌｌラッパー中の１群の複数クエリー配列として、これらのシード配列を使用してＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）非重複性（ｎｒ）包括的タンパク質データベースを検索した。合計４４４配列が、ＸＩ活性タンパク質の配列空間として記載し得るセットを形成すると同定された。

【0148】

配列同一性に基づくクラスター形成、および（ＰＨＹＬＩＰ（Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ Ｐａｃｋａｇｅ）バージョン３．５ｃに実装されるような（Ｆｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ（１９８９） Ｃｌａｄｉｓｔｉｃｓ ５：１６４−１６６）ＰＨＹＬＩＰ近隣結合アルゴリズムを使用した分子系統学的解析は、上で作成されたＸＩ活性のための配列空間が、図２に示されるようなＩ群およびＩＩ群と称される２群に分離されることを示した。Ｉ群セットは、８２個の配列（２〜１３０の偶数および１３１〜１４７の配列番号）からなり、その内２１個がシードであった（配列番号２、２４、３２、３４、４２、５４、６６、６８、７８、９６、１００、１０６、１０８、１２２、１２６、１２８、１３０、１３２、１３５、１３７、および１４２）。同様に、Ｉ群セットは３５１個のメンバーからなり、その内１５９個がシードであった（配列番号１４８〜３０６）。図２に示されるように、Ｌ．ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＩタンパク質がＩＩ群に属するのに対し、Ａ．ミズーリエンシス（Ａ．ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）ＸＩタンパク質はＩ群に属する。

【0149】

系統学的グループの形成に際しては、以下のプロセスに従った。
４４４個のＸＩ配列から出発する：
ステップ１ ７０％同一性群を確立する：
４４４個の配列からの最長配列を第１のマスターと称した。第１のマスターと７０％以上の配列同一性を有する４４４個の配列のその他の配列をグループ分けして、第１のｒｅｆ７０クラスター（Ａ）を形成した。残りの配列から、最長配列を第２のマスターに指定して使用し、同様に第２のｒｅｆ７０クラスターを作り出した（Ｂ）。全ての配列がクラスターに入るまで、分類過程を継続した。クラスターのいくつかは、単集合であった。

【0150】

ステップ２ ７０％閾値でのマージ：
クラスターＡとＢの全ての対で、Ａの配列の３分の１が７０％以上の配列同一性でＢの配列に関連している場合、そして逆の場合も、クラスターＡとＢをマージさせた。７０％の一致度の閾値を使用してマージし得る対がなくなるまで、この過程を継続した。

【0151】

ステップ３ ５０％閾値でのマージ：
ステップ２と同一過程に従ったが、５０％の配列一致度の閾値を使用した。

【0152】

ステップ４ ３０％閾値でのマージ：
ステップ２と同一過程に従ったが、３０％の配列一致度の閾値を使用した。

【0153】

Ｉ群は、５０％の一致度の閾値クラスターに相当する。ＩＩ群は、別個の５０％の一致度の閾値クラスターに相当する。

【0154】

５０％の同一性の閾値で、どちらの群ともクラスターしなかったため、Ｉ群またはＩＩ群に明白に割り当てられなかった１１個の配列があった。

【0155】

図３は、特定の属が標識されたＩ群ＸＩの系統樹を示す。Ｉ群は、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、サーモバキュラム（Ｔｈｅｒｍｏｂａｃｕｌｕｍ）、ヘルペトシフォン（Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ）、アシドバクテリア（Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ロゼイフレクサス（Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ）、メイオサーマス（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ）、デイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、メイオサーマス（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ）、スタッケブランドチア（Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔｉａ）、クリベラ（Ｋｒｉｂｂｅｌｌａ）、キシラニモナス（Ｘｙｌａｎｉｍｏｎａｓ）、ノカルジオプシス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ）、カテヌリスポラ（Ｃａｔｅｎｕｌｉｓｐｏｒａ）、ストレプトスポランギウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ）、ゲオデルマトフィルス（Ｇｅｏｄｅｒｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ）、アクチノシネマ（Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ）、サッカロモノスポラ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）、アシドサーマス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ）、サーモビフィダ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ）、ノカルジオイデス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ）、ジャニバクター（Ｊａｎｉｂａｃｔｅｒ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、レイフソニア（Ｌｅｉｆｓｏｎｉａ）、クラビバクター（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ）、ミクロモノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）、サリニスポラ（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ）、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）、ジョネシア（Ｊｏｎｅｓｉａ）、ナカムレラ（Ｎａｋａｍｕｒｅｌｌａ）、アクチノミセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）、モビルンカス（Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ）、ブラキバクテリウム（Ｂｒａｃｈｙｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ボイテンベルギア（Ｂｅｕｔｅｎｂｅｒｇｉａ）、フランキア（Ｆｒａｎｋｉａ）、およびアクチノバクテリウム（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）からのＸＩタンパク質を含む。

【0156】

Ｉ群とＩＩ群を区別する：
方法１
ＧｒｏｕｐＳｉｍ分析（Ｃａｐｒａ ａｎｄ Ｓｉｎｇｈ（２００８）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２４：１４７３−１４８０）によって、Ｉ群メンバーとＩＩ群メンバーの区別を実施した。ＧｒｏｕｐＳｉｍ法は、タンパク質の機能的特異性を決定するアミノ酸残基を同定する。その配列が複数群に分けられる、タンパク質ファミリーの複数配列アラインメント（ＭＳＡ）において、配列の官能基を区別するアミノ酸残基を同定し得る。方法は、複数配列アラインメント（ＭＳＡ）を採用し、公知の特異性分類を入力して、ＭＳＡ中の各アミノ酸位置にスコアを割り当てる。より高いスコアは、アミノ酸位置が特異性決定位置（ＳＤＰ）であるより大きな可能性を示唆する。

【0157】

上の系統学的解析によってＩ群とＩＩ群に分けられたＸＩ配列のＭＳＡ上で実施されたＧｒｏｕｐＳｉｍ分析は、高度に判別的な位置を同定した。表６に列挙されるのは、０．９以上のスコアを有する位置（Ｐｏｓ）であり、１．０の完全スコアは、群内の全てのタンパク質が指定位置で列挙されるアミノ酸を有し、群間ではアミノ酸が常に異なることを示す。「残基」の列は、Ｉ群タンパク質とＩＩ群タンパク質中の位置（縦線｜で区切られる）で対比させて、一文字コードでアミノ酸を示す。２列目のアミノ酸位置番号は、アクチノプラネス・ミズーリエンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）からのＸＩである代表的Ｉ群タンパク質Ｐ１２５８１のものである。３列目のアミノ酸位置番号は、ＸＩサーモアナエロバクテリウム・サーモスルフリゲネス（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓｕｌｆｕｒｉｇｅｎｅｓ）（配列番号２６７）である代表的ＩＩ群タンパク質Ｐ１９１４８のものである。

【0158】

【表12】

【0159】

Ｉ群とＩＩ群を区別する：
方法２
酵素のキシロースイソメラーゼファミリー群の代案の構造／機能特性解析は、ＨＭＭＥＲ（Ｊａｎｅｌｉａ Ｆａｒｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃａｍｐｕｓ，Ａｓｈｂｕｒｎ，ＶＡ）から入手できる利用者用ガイドに従って、ＨＭＭＥＲソフトウェアパッケージを使用して実施された（プロファイルＨＭＭの背後にある理論は、Ｒ．Ｄｕｒｂｉｎ，Ｓ．Ｅｄｄｙ，Ａ．Ｋｒｏｇｈ，ａｎｄ Ｇ．Ｍｉｔｃｈｉｓｏｎ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ：ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９８；Ｋｒｏｇｈ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３５：１５０１−１５３１に記載される）。

【0160】

Ｉ群中の２１個のシード配列（配列番号２、２４、３２、３４、４２、５４、６６、６８、７８、９６、１００、１０６、１０８、１２２、１２６、１２８、１３０、１３２、１３５、１３７、および１４２）の多配列アラインメントを使用して、Ｉ群メンバーを表すためのプロファイル隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を作成した。利用者用ガイドに述べられるように、プロファイルＨＭＭは多配列アラインメントの統計学的モデルである。それらは、配列比較の各カラムがどの程度保存されているか、そして各位置でどのアミノ酸残基が現れる見込みが高いかに関する、位置特異的情報を捕捉する。したがってＨＭＭは、形式的確率論的基準を有する。ＰＦＡＭデータベース（Ｊａｎｅｌｉａ Ｆａｒｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃａｍｐｕｓ，Ａｓｈｂｕｒｎ，ＶＡ）において、多数のタンパク質ファミリーのためのプロファイルＨＭＭが公的に入手可能である。

【0161】

プロファイルＨＭＭは以下のように構築された：
ステップ１．配列アラインメントを構築する
Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗをデフォルトパラメータで使用して、Ｉ群中の２１個のシード配列（高信頼度注釈がある配列）を配列比較した。
ステップ２．プロファイルＨＭＭを構築する
整合配列セット上で、デフォルトパラメータを使用してｈｍｍｂｕｉｌｄプログラムを実行した。ｈｍｍｂｕｉｌｄは複数配列アラインメントファイルを読み取って、新しいプロファイルＨＭＭを構築し、プロファイルＨＭＭをファイルに保存する。このプログラムを使用して、上述のシード配列セットのために、多重アラインメントから未較正プロファイルを作成した。

【0162】

ＨＭＭＥＲソフトウェアの利用者用ガイドに基づく以下の情報は、ｈｍｍｂｕｉｌｄプログラムがプロファイルＨＭＭを作成する方法のいくらかの説明を与える。プロファイルＨＭＭは、例えば挿入および欠失を含むギャップありアラインメントをモデル化でき、それはソフトウェアが（単なる小さなギャップなしモチーフでなく）完全保存ドメインを記述できるようにする。挿入および欠失は、挿入（Ｉ）状態および欠失（Ｄ）状態を使用してモデル化される。ギャップ文字が特定割合ｘを上回る全てのカラムは、挿入カラムとして割り当てられる。デフォルトで、ｘは０．５に設定される。各一致状態は、それに関連付けられているＩおよびＤ状態を有する。ＨＭＭＥＲでは、配列比較中の同一コンセンサス位置にある１群の３つの状態（Ｍ／Ｄ／Ｉ）を「ノード」と称する。これらの状態は、状態遷移確率と称される矢印で相互連結される。ＭおよびＩ状態がエミッターであるのに対し、Ｄ状態はサイレントである。遷移は、各ノードで、Ｍ状態が使用され（そして残基が整列されスコアされる）、またはＤ状態が使用される（そして整列される残基はなく、欠失ギャップ文字「−」がもたらされる）ように、アレンジされる。挿入はノード間で起きて、Ｉ状態は自己遷移を有して、コンセンサスカラムの間で、１つまたは複数の挿入残基が発生できるようにする。

【0163】

一致状態（すなわち一致状態エミッションスコア）にある、または挿入状態（すなわち挿入状態エミッションスコア）にある残基のスコアは、Ｌｏｇ＿２（ｐ＿ｘ）／（ｎｕｌｌ＿ｘ）に比例する。ｐ＿ｘは、プロファイルＨＭＭに準じた、配列比較における特定位置のアミノ酸残基の確率であり、Ｎｕｌｌ＿ｘはＮｕｌｌモデルに準じた確率である。Ｎｕｌｌモデルは、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴリリース２４のアミノ酸分布から誘導された、２０個の各アミノ酸の事前に計算されたエミッション確率セットを有する単純な１状態確率モデルである。

【0164】

状態遷移スコアは対数オッズパラメータとしても計算され、Ｌｏｇ＿２（ｔ＿ｘ）に比例する。＿ｘは、エミッターまたは非エミッター状態に遷移する確率である。

【0165】

ステップ３．プロファイルＨＭＭを較正する
プロファイル（使用される合成配列のデフォルト数は５，０００である）を有する多数の合成ランダム配列をスコアするｈｍｍｃａｌｉｂｒａｔｅを使用して、プロファイルＨＭＭを読み取り、これらのスコアに対するヒストグラムに極値分布（ＥＶＤ）を適合させ、この時点でＥＶＤパラメータを含むＨＭＭファイルを再度保存する。タンパク質配列データベースに対してプロファイルを検索する際に、これらのＥＶＤパラメータ（μおよびλ）を使用して、ビットスコアのＥ値が計算される。ｈｍｍｃａｌｉｂｒａｔｅは、ＨＭＭファイル中の「ＥＶＤ」と標識された行に、２つのパラメータを書き出す。これらのパラメータは、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴとほぼ同じ長さおよび残基組成の無作為に生成された配列に対して計算されたスコアのヒストグラムに最も適合する、極値分布（ＥＶＤ）のμ（位置）およびλ（尺度）パラメータである。この較正を各プロファイルＨＭＭに対して１回行った。

【0166】

Ｉ群セットの較正プロファイルＨＭＭは、Ｉ群プロファイルＨＭＭエクセルチャートとして、添付の表１に提供される。プロファイルＨＭＭは、アミノ酸配列の各位置に現れる各アミノ酸の確率を与える、チャート内に提供される。最高確率は、各位置で強調表示される。表７は、Ｉ群プロファイルＨＭＭの数行を示す。

【0167】

【表13】

【0168】

各位置の１行目は、一致エミッションスコア、すなわち各アミノ酸がその状態にある確率を報告する（最高スコアが強調表示される）。２行目は挿入エミッションスコアを報告し、３行目は状態遷移スコア、すなわちＭ→Ｍ、Ｍ→Ｉ、Ｍ→Ｄ；Ｉ→Ｍ、Ｉ→Ｉ；Ｄ→Ｍ、Ｄ→Ｄ；Ｂ→Ｍ；Ｍ→Ｅを報告する。表７はＩ群プロファイルＨＭＭ中で、メチオニンが最高確率で第１の位置に存在する、４６２０の確率を有することを示す。

【0169】

ステップ４．構築したプロファイルＨＭＭの特異性および感度を試験する
Ｚパラメータを１０億に設定したｈｍｍｓｅａｒｃｈを使用して、ＩＩ群からＩ群メンバーを識別する能力について、Ｉ群プロファイルＨＭＭを評価した。ｈｍｍｓｅａｒｃｈプログラムは、Ｉ群プロファイルＨＭＭのためのｈｍｍファイル、および双方の群からの全配列を取って、各配列にＥ値スコアを割り当てる。このＥ値スコアはプロファイルＨＭＭの適合の尺度であり、スコアが低いほどより良く適合する。得られたスコア割り当て一覧は、添付中で表２として提供される。最悪得点のＩ群メンバー（２．２ｅ−１８１）と最良得点のＩＩ群メンバー（１．５ｅ−０７）の間に、Ｅ値の差違の大きなマージンがあったので、プロファイルＨＭＭはＩＩ群メンバーからＩ群メンバーを明らかに区別する。

【0170】

この分析は、Ｉ群ＸＩタンパク質のために作成されたプロファイルＨＭＭが、Ｉ群ＸＩタンパク質をＩＩ群から区別することを示す。Ｉ群プロファイルＨＭＭは、Ａ．ミズーリエンシス（Ａ．ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）ＸＩと機能的に類似した、ＸＩタンパク質に関連する構造を提供する。

【0171】

実施例５
１群ＸＩのキメラＰ_ｇａｐＳ−ｘｙｌＡ遺伝子の構築および二重交叉自殺ベクターのアセンブリー
ゲオデルマトフィルス・オブスクルス（Ｇｅｏｄｅｒｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ ｏｂｓｃｕｒｕｓ）ＤＳＭ４３１６０（ＧＯｘｙｌＡ；配列番号６４）、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ｓｔｒ．ＭＣ２１５５（ＭＳｘｙｌＡ；配列番号１０）、サリニスポラ・アレニコーラ（Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ａｒｅｎｉｃｏｌａ）ＣＮＳ−２０５（ＳＡｘｙｌＡ；配列番号１８）、およびキシラニモナス・セルシリティカ（Ｘｙｌａｎｉｍｏｎａｓ ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃａ）ＤＳＭ１５８９４（ＸＣｘｙｌＡ；配列番号４０）からのキシロースイソメラーゼは全て、実施例４に記載されるアミノ酸配列分析に基づいて、１群キシロースイソメラーゼに属する。これらのタンパク質をコードする配列（それぞれ配列番号３３５、３３６、３３７、および３３８）は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＭ４のコドンバイアスに従って、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）中での発現のためにそれぞれ最適化され、ＳｐｅＩおよびＸｈｏＩ部位と境を接するＤＮＡ断片として新規に合成されて、コーディング領域は変異Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター（Ｐ_ｇａｐＳ；配列番号３３９）に隣接する。Ｐ_ｇａｐＳは、米国特許出願公開第２００９−０２４６８７６号明細書で開示されるように、プロモーターからの発現を増大させる、天然プロモーター断片（Ｐ_ｇａｐ）の位置１１６における「Ｇ」から「Ｔ」への変化の突然変異がある、改善されたＰ_ｇａｐである。ＳｐｅＩ−Ｐ_ｇａｐＳ−ｘｙｌＡ−ＸｈｏＩ断片は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によってＥｃｏＲＶ部位でｐＵＣ５７にクローンされた。得られた中間体プラスミドは、ｐＵＣ５７−Ｐ_ｇａｐＳＧＯｘｙｌＡ、ｐＵＣ５７−Ｐ_ｇａｐＳＭＳｘｙｌＡ、ｐＵＣ５７−Ｐ_ｇａｐＳＳＡｘｙｌＡ、およびｐＵＣ５７−Ｐ_ｇａｐＳＸＣｘｙｌＡと称された。最適化ｘｙｌＡコード配列は、ＧＯｘｙｌＡ（配列番号３３５）、ＭＳｘｙｌＡ（配列番号３３６）、ＳＡｘｙｌＡ（配列番号３３７）、およびＸＣｘｙｌＡ（配列番号３３８）である。

【0172】

一般的分子クローニング法を使用して、ＤＣＯ自殺ベクターを構築した。最初に、次のようにして、プラスミドｐＡＲＡ３５６（実施例１に記載される）を改変してＬＢｘｙｌＡとａｒａＤ３’ＵＴＲ配列の間にＸｈｏＩ部位を付加した。最初に、順方向プライマーａｒａ３６８（配列番号３４５）および逆方向プライマーａｒａ９７（配列番号３１９）を使用して、ｐＡＲＡ３５６からａｒａＤ３’ＵＴＲ断片をＰＣＲ増幅した。ａｒａ３６８プライマーはａｒａＤ３’ＵＴＲの５’末端にＳｐｅＩおよびＸｈｏＩ部位を付加し、ａｒａ９７はａｒａＤ３’ＵＴＲの３’末端にＨｉｎｄＩＩＩ、ＦｓｅＩ、およびＥｃｏＲＩ部位を付加した。ＰＣＲ産物をＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。ｐＡＲＡ３５６中のＰｇａｐ−ＬＢｘｙｌＡ−ａｒａＤ３’ＵＴＲ断片は、５’ＳｐｅＩ部位および３’ＥｃｏＲＩ部位を有する。この断片をＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化にして除去し、上記のＳｐｅＩ−ＸｈｏＩ−ａｒａＤ３’ＵＴＲ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＦｓｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ ＰＣＲ産物によって置き換えた。得られた中間体プラスミドｐＡＲＡ３５６Ｄは、Ｐ_ｇａｐ−ＬＢｘｙｌＡがＸｈｏＩ部位によって置き換えられていること以外は、ｐＡＲＡ３５６と同じ配列を有する。

【0173】

上述の４つのＰ_ｇａｐＳ−ｘｙｌＡ断片は、ＳｐｅＩおよびＸｈｏＩ消化に続いてｐＵＣ５７ベースのプラスミドから単離され、ＳｐｅＩとＸｈｏＩ部位の間でＸｈｏＩ−改変ｐＡＲＡ３５６Ｄにクローンされて、Ｐ_ｇａｐ−ＬＢｘｙｌＡ断片を置き換えた。得られた４つのＤＣＯ自殺ベクターは、ｐＡＲＡ３５６−ＧＯｘｙｌＡ、ｐＡＲＡ３５６−ＭＳｘｙｌＡ、ｐＡＲＡ３５６−ＳＡｘｙｌＡ、およびｐＡＲＡ３５６−ＸＣｘｙｌＡであった。これらのベクターは、それらのキメラｘｙｌＡ遺伝子がＰ_ｇａｐＳから発現されたこと以外は、ｐＡＲＡ３５６と同一である。

【0174】

対照として、ｐＡＲＡ３５５中のＡＭｘｙｌＡおよびｐＡＲＡ３５７中のＥＣｘｙｌＡをそれぞれＩ群およびＩＩ群ｘｙｌＡｓの代表として使用した。しかし、４つの新しい１群ｘｙｌＡ遺伝子を発現させるのにＰ_ｇａｐＳを用いたので、ｐＡＲＡ３５５中のＡＭｘｙｌＡおよびｐＡＲＡ３５７中のＥＣｘｙｌＡを制御するＰ_ｇａｐプロモーターをＰ_ｇａｐＳに変更した。この目的で、順方向プライマーａｒａ１０（配列番号３４０）および逆方向プライマーａｒａ４０１（配列番号３４１）を使用して、ＰＣＲによってｐＡＲＡ３５６−ＸＣｘｙｌＡから３１９ｂｐのＰ_ｇａｐＳＯＬＥ−ＰＣＲ断片を合成し；順方向プライマーａｒａ４０２（配列番号３４２）および逆方向プライマーａｒａ４０３（配列番号３４３）を使用して、ＰＣＲによってｐＡＲＡ３５５から１，２２９ｂｐのＰ_ｇａｐＳ−ＡＭｘｙｌＡ ＯＬＥ−ＰＣＲ断片を合成し；順方向プライマーａｒａ４０２および逆方向プライマーａｒａ４０４（配列番号３４４）を使用して、ＰＣＲによってｐＡＲＡ３５７から１，３６７ｂｐのＰ_ｇａｐＳ−ＥＣｘｙｌＡ ＯＬＥ−ＰＣＲ断片を合成した。１つのＰＣＲ反応は、５０μＬのＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｐｆｘ ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、１μＬの４０ｎｇ／μＬ ＤＮＡテンプレート、および１μＬの１０μＭ順方向および逆方向プライマーからなった。反応は、エッペンドルフＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ（Ｈｅｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上で、３５サイクルの９４℃で１分間の変性／５６℃で１分間のアニーリング／７２℃で２分間の伸長のホットスタートＰＣＲプログラムに従って実施された。Ｐ_ｇａｐＳＯＬＥ−ＰＣＲ断片は、Ｐ_ｇａｐＳ全体、５’ＳｐｅＩ部位、および３’開始コドンを含んだ。Ｐ_ｇａｐＳ−ＡＭｘｙｌＡおよびＰ_ｇａｐＳ−ＥＣｘｙｌＡ ＯＬＥ−ＰＣＲ断片は、それぞれＡＭｘｙｌＡおよびＥＣｘｙｌＡコード配列を含有した。それぞれＰ_ｇａｐＳの最後の３６ｎｔと一致する３６ｎｔの５’配列と、３’ＸｈｏＩ部位とを有した。さらに、重複ＰＣＲ（ＯＬＥ−ＰＣＲ）によって、ＳｐｅＩ−Ｐ_ｇａｐＳ−ＡＭｘｙｌＡ−ＸｈｏＩおよびＳｐｅＩ−Ｐ_ｇａｐＳ−ＥＣｘｙｌＡ−ＸｈｏＩ断片を合成した。ＰＣＲ反応を上述したように設定したが、２つのテンプレートが含まれた。ＳｐｅＩ−Ｐ_ｇａｐＳ−ＡＭｘｙｌＡ−ＸｈｏＩが、順方向プライマーａｒａ１０および逆方向プライマーａｒａ４０３を使用して、Ｐ_ｇａｐＳおよびＰ_ｇａｐＳ−ＡＭｘｙｌＡ ＯＬＥ−ＰＣＲ断片から増幅されたのに対し、ＳｐｅＩ−Ｐ_ｇａｐＳ−ＥＣｘｙｌＡ−ＸｈｏＩは、順方向プライマーａｒａ１０および逆方向プライマーａｒａ４０４を使用して、Ｐ_ｇａｐＳおよびＰ_ｇａｐＳ−ＥＣｘｙｌＡ ＯＬＥ−ＰＣＲ断片から増幅された。ＳｐｅＩ−Ｐ_ｇａｐＳ−ＡＭｘｙｌＡ−ＸｈｏＩおよびＳｐｅＩ−Ｐ_ｇａｐＳ−ＥＣｘｙｌＡ−ＸｈｏＩの双方をＳｐｅＩおよびＸｈｏＩで消化して、アガロースゲル電気泳動を実施してＱＩＡｑｕｉｃｋゲル精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。ＤＮＡ断片をＳｐｅＩとＸｈｏＩ部位の間で改変ｐＡＲＡ３５６（上述）にクローンして、Ｐ_ｇａｐ−ＬＢｘｙｌＡ断片を置き換えた。得られた２つのＤＣＯ自殺ベクターは、ｐＡＲＡ３５６−ＡＭｘｙｌＡおよびｐＡＲＡ３５６−ＥＣｘｙｌＡと称された。全てのベクターをＤＨ５α大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞中で増殖させ、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを使用して調製した。

【0175】

実施例６
ＺＷ６４１へのキメラＰ_ｇａｐＳ−ｘｙｌＡ遺伝子の組み込みおよびそれらの発現の特性解析
本実施例は、実施例２に記載されるＺＷ６４１株中のＰ_ｇａｐＳ−ｘｙｌＡキメラ遺伝子の組み込みおよび発現について記載し、４つの試験されたＩ群ＸＩが、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）中でＩＩ群ＸＩよりも実際により良く機能することを実証する。

【0176】

ｐＡＲＡ３５６−ＡＭｘｙｌＡ、ｐＡＲＡ３５６−ＥＣｘｙｌＡ、ｐＡＲＡ３５６−ＧＯｘｙｌＡ、ｐＡＲＡ３５６−ＭＳｘｙｌＡ、ｐＡＲＡ３５６−ＳＡｘｙｌＡ、またはｐＡＲＡ３５６−ＸＣｘｙｌＡを用いて、ＺＷ６４１−１Ａ株のコンピテント細胞を別々に作成して形質転換した。先に記載されているようにして（実施例２参照）、形質転換体をＭＭＧ５−Ｓｐｅｃ２５０プレート上で選択し、導入Ｐ_ｇａｐＳ−ｘｙｌＡ遺伝子の組み込みについてＰＣＲによって分析した。得られた株をＺＷ６４１−ａｒａ３５６−ＡＭｘｙｌＡ、ＺＷ６４１−ａｒａ３５６−ＥＣｘｙｌＡ、ＺＷ６４１−ａｒａ３５６−ＧＯｘｙｌＡ、ＺＷ６４１−ａｒａ３５６−ＭＳｘｙｌＡ、ＺＷ６４１−ａｒａ３５６−ＡＳｘｙｌＡ、およびＺＷ６４１−ａｒａ３５６−ＸＣｘｙｌＡ株と命名した。実施例３によって、ＡＭｘｙｌＡ １群キシロースイソメラーゼがＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）中で高度に活性であることが実証された一方、２つの試験されたＩＩ群キシロースイソメラーゼの中でＥＣｘｙｌＡがより良い酵素であったので、これらの株の内、ＺＷ６４１−ａｒａ３５６−ＡＭｘｙｌＡおよびＺＷ６４１−ａｒａ３５６−ＥＣｘｙｌＡを対照株にした。

【0177】

キシロース中のこれらの６つの新しい株の成長を調べて、それらを親株ＺＷ６４１−１Ａと比較するために、全ての株をキシロース中で９６時間振盪フラスコ発酵させた。アッセイでは、各株を３ｍＬのＭＲＭ３Ｇ５中で１５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で一晩培養した。細胞を収集して、ＭＲＭ３Ｘ１０（ＭＲＭ３Ｇ５と同一であるが、５０ｇ／Ｌグルコースを１００ｇ／Ｌキシロースで置き換えた）で洗浄し、約０．１のＯＤ_６００でＭＲＭ３Ｘ１０に再懸濁した。２５ｍＬの懸濁液を５０ｍＬねじ蓋付きＶＷＲ遠心管に入れて、１５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で９６時間にわたって培養した。時間経過中、０、２４、４８、７２、および９６時間目にＯＤ_６００を測定した。得られた成長曲線を図６に示す。実施例３で分析されたＺＷ１−ａｒａ３５５およびＺＷ１−ａｒａ３５７株と同様に、ＺＷ６４１−ａｒａ３５６−ＡＭｘｙｌＡは、発酵終了時にＺＷ６４１−ａｒａ３５６−ＥＣｘｙｌＡのおよそ３倍の細胞密度に成長することが示される。ＺＷ６４１−ａｒａ３５６−ＡＭｘｙｌＡが３．４３のＯＤ_６００を有したのに対し、ＺＷ６４１−ａｒａ３５６−ＥＣｘｙｌＡは１．１８に達した。どちらの株もＺＷ６４１より早く成長した。他の４つの株は、全てＺＷ６４１−ａｒａ３５６−ＥＣｘｙｌＡよりも早く成長した。発酵終了時におけるそれらの細胞密度は、ＺＷ６４１−ａｒａ３５６−ＡＭｘｙｌＡとＺＷ６４１−ａｒａ３５６−ＥＣｘｙｌＡの間であった。

【0178】

各株の代謝プロファイルを測定するために、各培養物の１ｍＬサンプルを７２時間目に収集した。それらを１０，０００ｘｇで遠心分離して、細胞を除去した。０．２２μｍのＣｏｓｔａｒ Ｓｐｉｎ−Ｘ遠心管フィルターを通して上清を濾過し、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣシステム上で、０．０１ＮのＨ_２ＳＯ_４と共に、５５℃速度０．６ｍＬ／分でＢｉｏＲａｄ Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−Ａ７Ｈイオン排除カラムを通過させて分析し、エタノールおよびキシロース濃度を判定した。表８に示される結果は、より早い成長が、より高いキシロース利用とより多くのエタノール産生に相関することを示す。これらの結果は、成長の差違がＸＩ活性の差違に起因することを示唆する。全ての株が、ＺＷ６４１対照よりもより良い成長、エタノール産生、およびキシロース利用を有し、１群ＸＩがある全ての株は、ＩＩ群大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＩがある株よりもより良く機能した。

【0179】

【表14】

【0180】

これらの６つの株が、それらの成長および代謝プロファイルに対応するＸＩ活性レベルをそれぞれ有することをさらに立証するために、タンパク質抽出物を作成し、実施例３と同様に、タンパク質濃度およびキシロースイソメラーゼ活性についてアッセイした。活性の計算に先だって、Ｄ−キシロースのバックグラウンドＯＤ_５４０を最初のＯＤ_５４０読み取りから差し引いて、比活性度をタンパク質１ミリグラムあたりの単位として計算した。各アッセイを３回繰り返した。図７は、各タンパク質抽出物中の得られた平均ＸＩ比活性を示す。絶対比活性は実施例３よりも低く、これは異なる反応条件に起因する可能性が高い。しかし相対比活性の比較は、ＸＩ活性が、株の増殖率に対応することを明らかに示す。より早い成長は、より高いＸＩ活性によって支援され、ＡＭｘｙｌＡは最高活性を有し、ＥＣｓｙｌＡは最低活性を有する。Ｉ群ＸＩは全てＩＩ群ＥＣｘｙｌＡよりも高い平均活性を有する。

【0181】

【表15】

【0182】

【表16】

【0183】

【表17】

【0184】

【表18】

【0185】

【表19】

【0186】

【表20】

【0187】

【表21】

【0188】

【表22】

【0189】

【表23】

【0190】

【表24】

【0191】

【表25】

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【表26】

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【表27】

【0194】

【表28】

【0195】

【表29】

【0196】

【表30】

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【表31】

【0198】

【表32】

【0199】

【表33】

【0200】

【表34】

【0201】

【表35】

【0202】

【表36】

【0203】

【表37】

【0204】

【表38】

【0205】

【表39】

【0206】

【表40】

【0207】

【表41】

【0208】

【表42】

【0209】

【表43】

【0210】

【表44】

【0211】

【表45】

【0212】

【表46】

【0213】

【表47】

【0214】

【表48】

【0215】

【表49】

【0216】

【表50】

【0217】

【表51】

【0218】

【表52】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]