特許 6068922 Ｅ−カドヘリン結合剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6068922

(24)【登録日】2017年1月6日

(45)【発行日】2017年1月25日

(54)【発明の名称】Ｅ−カドヘリン結合剤

(51)【国際特許分類】

   C12N 9/02 20060101AFI20170116BHJP

   C07K 14/705 20060101ALN20170116BHJP

   A61K 38/00 20060101ALN20170116BHJP

   A61P 35/00 20060101ALN20170116BHJP

   A61P 43/00 20060101ALN20170116BHJP

【ＦＩ】

   C12N9/02

   !C07K14/705ZNA

   !A61K37/02

   !A61P35/00

   !A61P43/00 111

【請求項の数】1

【全頁数】18

(21)【出願番号】特願2012-233432(P2012-233432)

(22)【出願日】2012年10月23日

(65)【公開番号】特開2014-84288(P2014-84288A)

(43)【公開日】2014年5月12日

【審査請求日】2015年4月17日

(73)【特許権者】

【識別番号】000173913

【氏名又は名称】公益財団法人微生物化学研究会

(74)【代理人】

【識別番号】100107515

【弁理士】

【氏名又は名称】廣田 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100107733

【弁理士】

【氏名又は名称】流 良広

(74)【代理人】

【識別番号】100115347

【弁理士】

【氏名又は名称】松田 奈緒子

(72)【発明者】

【氏名】川田 学

(72)【発明者】

【氏名】坂本 修一

【審査官】 長谷川 茜

(56)【参考文献】

【文献】 LEE MN.et al.，Mol.Cell.Biol.,2009 Jul,29(14),p.3991-4001

【文献】 CHIANG G.G.et al.，Trends Mol.Med.,2007 Oct,13(10),p.433-442

【文献】 GUIGON C.J.et al.，Carcinogenesis,2010 Jul,31(7),p.1284-1291

【文献】 ZHENG QY.et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.,2012 Mar 23,419(4),p.741-747

【文献】 DU ZX.et al.，Endocrinology,2007 Sep,148(9),p.4352-4361

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＤＷＰＩ（Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＧＡＰＤＨタンパク質、及びその類似体タンパク質の少なくともいずれかを含み、
前記類似体タンパク質が、下記（ａ）から（ｅ）に記載のタンパク質から選択される少なくともいずれかであり、Ｅ−カドヘリンとの結合性を有することを特徴とするＥ−カドヘリン結合剤。
（ａ）配列番号１に記載のタンパク質との配列同一性が９５％以上であるタンパク質
（ｂ）配列番号２に記載のタンパク質との配列同一性が９５％以上であるタンパク質
（ｃ）前記ＧＡＰＤＨタンパク質を含む融合タンパク質
（ｄ）前記（ａ）のタンパク質を含む融合タンパク質
（ｅ）前記（ｂ）のタンパク質を含む融合タンパク質

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、Ｅ−カドヘリン結合剤、タンパク質合成阻害剤、がん細胞増殖抑制剤、及び抗がん剤に関する。

【背景技術】

【0002】

がんの組織は、がん細胞だけでなく間質と呼ばれる周辺の正常組織が混在する形で成り立っている。前記間質は、血管や細胞外基質、繊維芽様細胞（単に「間質細胞」と称することもある）など様々な因子で構成されており、がんの増殖に密接に関わっていることが明らかになりつつある。前記間質の中でも、特に間質細胞は、接着や分泌因子を介してがん細胞の増殖を正にも負にも制御することが知られている（例えば、非特許文献１参照）。このような状況下、より有用である新たな抗がん剤の探索が行われており、その速やかな提供が強く求められている。

【0003】

ハウスキーピング遺伝子として公知の物質であるＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ， ＥＣ １．２．１．１３；以下、「ＧＡＰＤＨ」と称することがある）は、解糖系の酵素であり、無機リン酸及びニコチンアミドアデノシンジヌクレオチドの存在下において、グリセルアルデヒド３リン酸のリン酸化を触媒する。
これまでに、細胞外に分泌された前記ＧＡＰＤＨには、細胞の形態を変化させる活性があること（例えば、非特許文献２参照）、酸化ストレスによって細胞内の前記ＧＡＰＤＨが凝集し、核内へと移行することで細胞増殖を阻害すること（例えば、非特許文献３参照）が報告されている。しかしながら、細胞外に存在する前記ＧＡＰＤＨが、がん細胞の増殖を抑制することは、知られていない。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Ｋａｗａｄａ， Ｍ．， Ｉｎｏｕｅ， Ｈ．， Ｍａｓｕｄａ， Ｔ．， ａｎｄ Ｉｋｅｄａ， Ｄ． Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−Ｉ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｆｒｏｍ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｔｕｍｏｒ−ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６６， ４４１９−４４２５ （２００６）．

【非特許文献2】Ｙａｍａｊｉ， Ｒ．， Ｃｈａｔａｎｉ， Ｅ．， Ｈａｒａｄａ， Ｎ．， Ｓｕｇｉｍｏｔｏ， Ｋ．， Ｉｎｕｉ， Ｈ．， ａｎｄ Ｎａｋａｎｏ， Ｙ． Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｐａｃｅ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｃｅｌｌ ｓｐｒｅａｄｉｎｇ． Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ１７２６， ２６１−２７１ （２００５）．

【非特許文献3】Ｎａｋａｊｉｍａ， Ｈ．， Ａｍａｎｏ， Ｗ．， Ｋｕｂｏ， Ｔ．， Ｆｕｆｕｈａｒａ， Ａ．， Ｉｈａｒａ， Ｈ．， Ａｚｕｍａ， Ｙ．， Ｔａｊｉｍａ， Ｈ．， Ｉｎｕｉ， Ｔ．， Ｓａｗａ， Ａ．， ａｎｄ Ｔａｋｅｕｃｈｉ， Ｔ． Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎｅｎａｓｅ ａｇｇｒｅｇａｔｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅｓ ｉｎ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２８４， ３４３３１−３４３４１（２００９）．

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明は、上記従来技術に鑑みて行われたものであり、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、様々ながん細胞に対して抗がん作用を有する抗がん剤、前記抗がん剤に用いることができるがん細胞増殖抑制剤、前記がん細胞増殖抑制剤に用いることができるタンパク質合成阻害剤、並びに、前記がん細胞増殖抑制剤及び前記タンパク質合成阻害剤に用いることができるＥ−カドヘリン結合剤を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意検討を行った結果、ハウスキーピング遺伝子として有名なＧＡＰＤＨが、がん細胞の増殖を抑制することを知見し、本発明の完成に至った。

【0007】

本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ ＧＡＰＤＨタンパク質、及びその類似体タンパク質の少なくともいずれかを含み、
前記類似体タンパク質が、下記（ａ）から（ｅ）に記載のタンパク質から選択される少なくともいずれかであることを特徴とするＥ−カドヘリン結合剤である。
（ａ）配列番号１に記載のタンパク質との配列相同性が７０％以上であるタンパク質
（ｂ）配列番号２に記載のタンパク質との配列相同性が７０％以上であるタンパク質
（ｃ）前記ＧＡＰＤＨタンパク質を含む融合タンパク質
（ｄ）前記（ａ）のタンパク質を含む融合タンパク質
（ｅ）前記（ｂ）のタンパク質を含む融合タンパク質
＜２＞ 前記＜１＞に記載のＥ−カドヘリン結合剤を含むことを特徴とするタンパク質合成阻害剤である。
＜３＞ 前記＜１＞に記載のＥ−カドヘリン結合剤、及び前記＜２＞に記載のタンパク質合成阻害剤の少なくともいずれかを含むことを特徴とするがん細胞増殖抑制剤である。
＜４＞ 前記＜３＞に記載のがん細胞増殖抑制剤を含むことを特徴とする抗がん剤である。

【発明の効果】

【0008】

本発明によれば、前記目的を達成することができ、様々ながん細胞に対して抗がん作用を有する抗がん剤、前記抗がん剤に用いることができるがん細胞増殖抑制剤、前記がん細胞増殖抑制剤に用いることができるタンパク質合成阻害剤、並びに、前記がん細胞増殖抑制剤及び前記タンパク質合成阻害剤に用いることができるＥ−カドヘリン結合剤を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1A】図１Ａは、試験例１における（１）ウサギ筋肉から精製したＧＡＰＤＨによる胃がん細胞ＭＫＮ−７の増殖抑制効果を示すグラフである。

【図1B】図１Ｂは、試験例１における（２）ヒト赤血球から精製したＧＡＰＤＨによる胃がん細胞ＭＫＮ−７の増殖抑制効果を示すグラフである。

【図1C】図１Ｃは、試験例１における（３）リコンビナントのヒトＧＡＰＤＨによる胃がん細胞ＭＫＮ−７の増殖抑制効果を示すグラフである。

【図2A】図２Ａは、試験例２−１における（２）ヒト赤血球から精製したＧＡＰＤＨによる各がん細胞株（ＤＵ−１４５、ＭＫＮ−２８、ＤＭＳ１１４、ＤＭＳ２７３）の増殖抑制効果を示すグラフである。

【図2B】図２Ｂは、試験例２−１における（２）ヒト赤血球から精製したＧＡＰＤＨによる各がん細胞株（ＨＣＣ２９９８、ＢｘＰＣ−３、Ｃａｐａｎ−１、ＭＣＦ−７）の増殖抑制効果を示すグラフである。

【図2C】図２Ｃは、試験例２−２における（２）ヒト赤血球から精製したＧＡＰＤＨによる各正常間質細胞（ＮＨＬＦ、ＰｒＳＣ、Ｈｓ７３８、Ｈｓ３７１、ＰＳ）の増殖に与える影響を測定した結果を示すグラフである。

【図3】図３は、試験例３におけるＧＡＰＤＨによるタンパク質合成の阻害を調べた結果を示す図である。

【図4A】図４Ａは、試験例４−１における免疫蛍光染色の結果を示す図である。

【図4B】図４Ｂは、試験例４−２における免疫蛍光染色の結果を示す図である。

【図5A】図５Ａは、試験例５−１における免疫蛍光染色の結果を示す図である。

【図5B】図５Ｂは、試験例５−２における免疫沈降物について、ウエスタンブロットを行った結果を示す図である。

【図5C】図５Ｃは、試験例５−３における免疫蛍光染色の結果を示す図である。

【図5D】図５Ｄは、試験例５−４におけるウエスタンブロットを行った結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0010】

（Ｅ−カドヘリン結合剤）
本発明のＥ−カドヘリン結合剤は、ＧＡＰＤＨタンパク質、及びその類似体タンパク質の少なくともいずれかを含み、必要に応じて、更にその他の成分を含有する。
本発明のＥ−カドヘリン結合剤は、後述する試験例で示されるように、前記Ｅ−カドヘリン結合剤に含まれる前記ＧＡＰＤＨタンパク質、又はその類似体タンパク質と、Ｅ−カドヘリンとが結合する。
前記Ｅ−カドヘリンは、細胞表面に存在するタンパク質であり、細胞間の接着に関与することが知られている。

【0011】

＜ＧＡＰＤＨタンパク質＞
前記ＧＡＰＤＨタンパク質の由来としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、ウサギなどが挙げられる。
前記ヒト由来のＧＡＰＤＨタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１に示される通りである。また、前記ウサギ由来のＧＡＰＤＨタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２に示される通りである。

【0012】

前記ＧＡＰＤＨは、市販品を用いてもよいし、細胞等を用いて製造したものを用いてもよい。
前記市販品としては、例えば、ウサギ筋肉から精製したＧＡＰＤＨ（Ｓｉｇｍａ社製）、ヒト赤血球から精製したＧＡＰＤＨ（Ｓｉｇｍａ社製）、リコンビナントのヒトＧＡＰＤＨ（Ａｂｎｏｖａ社製）などが挙げられる。
前記細胞等を用いてＧＡＰＤＨを製造する方法としては、例えば、ＧＡＰＤＨを発現している細胞のｍＲＮＡを採取し、前記ｍＲＮＡから前記ＧＡＰＤＨのｃＤＮＡを合成し、前記ｃＤＮＡを発現ベクターに挿入し、前記発現ベクターで細胞等を形質転換し、前記細胞等を培養し、前記培養により得られた培養物からＧＡＰＤＨを回収する方法が挙げられる。
前記ＧＡＰＤＨを発現している細胞としては、例えば、ヒト胃由来の正常間質細胞Ｈｓ７３８などが挙げられる。
前記発現ベクターとしては、例えば、ｐＥＴ−１７ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）などが挙げられる。
前記培養する細胞等としては、例えば、大腸菌などが挙げられる。

【0013】

＜ＧＡＰＤＨタンパク質の類似体タンパク質＞
前記ＧＡＰＤＨタンパク質の類似タンパク質とは、下記（ａ）から（ｅ）に記載のタンパク質から選択される少なくともいずれかである。
（ａ）配列番号１に記載のタンパク質との配列相同性が７０％以上であるタンパク質
（ｂ）配列番号２に記載のタンパク質との配列相同性が７０％以上であるタンパク質
（ｃ）前記ＧＡＰＤＨタンパク質を含む融合タンパク質
（ｄ）前記（ａ）のタンパク質を含む融合タンパク質
（ｅ）前記（ｂ）のタンパク質を含む融合タンパク質

【0014】

前記配列番号１に記載のタンパク質は、ヒト由来のＧＡＰＤＨタンパク質であり、前記配列番号２に記載のタンパク質は、ウサギ由来のＧＡＰＤＨタンパク質である。
前記（ａ）及び（ｂ）における配列相同性としては、７０％以上であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、８０％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９５％以上が特に好ましい。
本発明における前記配列相同性は、ＤＮＡＳＩＳ（株式会社日立ソリューションズ製）により測定することができる。

【0015】

前記（ａ）及び（ｂ）のタンパク質としては、前記配列相同性が７０％以上であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記配列番号１に記載のタンパク質又は前記配列番号２に記載のタンパク質において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたタンパク質が挙げられる。前記数個とは、例えば、２個から１０個が挙げられる。
前記アミノ酸の置換、欠失、挿入若しくは付加の位置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記（ａ）及び（ｂ）のタンパク質の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ＧＡＰＤＨタンパク質をコードするＤＮＡに、ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法により変異を導入し、該ＤＮＡを含む発現ベクターで前記細胞等を形質転換し、前記細胞等を培養し、前記培養により得られた培養物から回収する方法が挙げられる。

【0016】

前記（ｃ）から（ｅ）における融合タンパク質とは、前記ＧＡＰＤＨタンパク質、前記（ａ）のタンパク質、又は前記（ｂ）のタンパク質と、ペプチド等とを融合させたタンパク質である。
前記ペプチド等としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＦＬＡＧタグ（アミノ酸配列：ＤＹＫＤＤＤＤＫ、配列番号６）、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、ＧＳＴタグなどが挙げられる。

【0017】

前記（ｃ）から（ｅ）における融合タンパク質の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ＧＡＰＤＨタンパク質、前記（ａ）のタンパク質、又は前記（ｂ）のタンパク質に融合させるペプチド等をコードするＤＮＡを含む発現ベクターに、前記ＧＡＰＤＨタンパク質、前記（ａ）のタンパク質、又は前記（ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡを挿入し、前記発現ベクターで前記細胞等を形質転換し、前記細胞等を培養し、前記培養により得られた培養物から回収する方法が挙げられる。

【0018】

前記Ｅ−カドヘリン結合剤における前記ＧＡＰＤＨタンパク質、及びその類似体タンパク質は、前記ＧＡＰＤＨの通常の酵素活性を有していてもよいし、有していなくてもよい。
前記Ｅ−カドヘリン結合剤における前記ＧＡＰＤＨタンパク質、及びその類似体タンパク質の少なくともいずれかの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記Ｅ−カドヘリン結合剤は、前記ＧＡＰＤＨタンパク質そのものであってもよいし、前記ＧＡＰＤＨタンパク質の類似体タンパク質そのものであってもよいし、前記ＧＡＰＤＨタンパク質、及びその類似体タンパク質からなるものであってもよい。

【0019】

＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、特に制限はなく、例えば、薬理学的に許容され得る担体の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、添加剤、補助剤、水などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。

【0020】

前記添加剤又は前記補助剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、殺菌剤、保存剤、粘結剤、増粘剤、固着剤、結合剤、着色剤、安定化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、等張化剤、溶剤、酸化防止剤、紫外線防止剤、結晶析出防止剤、消泡剤、物性向上剤、防腐剤などが挙げられる。

【0021】

前記殺菌剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム等のカチオン性界面活性剤などが挙げられる。

【0022】

前記保存剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、クレゾールなどが挙げられる。

【0023】

前記粘結剤、前記増粘剤、又は前記固着剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、デンプン、デキストリン、セルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルデンプン、プルラン、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸アンモニウム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、グアーガム、ローカストビーンガム、アラビアゴム、キサンタンガム、ゼラチン、カゼイン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキサイド、ポリエチレングリコール、エチレン・プロピレンブロックポリマー、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。

【0024】

前記結合剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。

【0025】

前記着色剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酸化チタン、酸化鉄などが挙げられる。

【0026】

前記安定化剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチン、ピロ亜硫酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。

【0027】

前記ｐＨ調整剤、又は前記緩衝剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。

【0028】

前記等張化剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。

【0029】

前記Ｅ−カドヘリン結合剤における前記その他の成分の含有量としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。

【0030】

前記Ｅ−カドヘリン結合剤は、１種単独で使用してもよいし、他の成分を有効成分とする医薬や薬剤と併せて使用してもよい。また、前記Ｅ−カドヘリン結合剤は、他の成分を有効成分とする医薬や薬剤中に配合された状態で使用してもよい。

【0031】

＜用途＞
前記Ｅ−カドヘリン結合剤は、後述する本発明のタンパク質合成阻害剤、がん細胞増殖抑制剤、抗がん剤などに好適に利用可能である。

【0032】

（タンパク質合成阻害剤）
本発明のタンパク質合成阻害剤は、本発明の前記Ｅ−カドヘリン結合剤を少なくとも含み、必要に応じて、更にその他の成分を含有する。

【0033】

＜Ｅ−カドヘリン結合剤の含有量＞
前記タンパク質合成阻害剤における前記Ｅ−カドヘリン結合剤の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記タンパク質合成阻害剤は、前記Ｅ−カドヘリン結合剤そのものであってもよい。

【0034】

＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、特に制限はなく、例えば、前記Ｅ−カドヘリン結合剤におけるその他の成分と同様のものなどが挙げられる。
前記タンパク質合成阻害剤における前記その他の成分の含有量としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。

【0035】

前記タンパク質合成阻害剤は、１種単独で使用してもよいし、他の成分を有効成分とする医薬や薬剤と併せて使用してもよい。また、前記タンパク質合成阻害剤は、他の成分を有効成分とする医薬や薬剤中に配合された状態で使用してもよい。

【0036】

＜用途＞
前記タンパク質合成阻害剤は、後述する本発明のがん細胞増殖抑制剤、抗がん剤などに好適に利用可能である。

【0037】

（がん細胞増殖抑制剤）
本発明のがん細胞増殖抑制剤は、本発明の前記Ｅ−カドヘリン結合剤、及び前記タンパク質合成阻害剤の少なくともいずれかを少なくとも含み、必要に応じて、更にその他の成分を含有する。

【0038】

＜Ｅ−カドヘリン結合剤、及びタンパク質合成阻害剤の少なくともいずれかの含有量＞
前記がん細胞増殖抑制剤における前記Ｅ−カドヘリン結合剤、及び前記タンパク質合成阻害剤の少なくともいずれかの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記タンパク質合成阻害剤は、前記Ｅ−カドヘリン結合剤そのものであってもよいし、前記タンパク質合成阻害剤そのものであってもよいし、前記Ｅ−カドヘリン結合剤及び前記タンパク質合成阻害剤からなるものであってもよい。

【0039】

＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、特に制限はなく、例えば、前記Ｅ−カドヘリン結合剤におけるその他の成分と同様のものなどが挙げられる。
前記がん細胞増殖抑制剤における前記その他の成分の含有量としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。

【0040】

前記がん細胞増殖抑制剤は、１種単独で使用してもよいし、他の成分を有効成分とする医薬や薬剤と併せて使用してもよい。また、前記がん細胞増殖抑制剤は、他の成分を有効成分とする医薬や薬剤中に配合された状態で使用してもよい。

【0041】

＜用途＞
前記がん細胞増殖抑制剤は、後述する試験例で示すように、胃がん細胞、前立腺がん細胞、肺がん細胞、大腸がん細胞、膵がん細胞、乳がん細胞などの様々ながん細胞の増殖を抑制することができ、また、がん細胞を選択的に抑制することができるので、後述する本発明の抗がん剤などに好適に利用可能である。

【0042】

（抗がん剤）
本発明の抗がん剤は、本発明の前記がん細胞増殖抑制剤を少なくとも含み、必要に応じて、更にその他の成分を含有する。

【0043】

＜がん細胞増殖抑制剤の含有量＞
前記抗がん剤における前記がん細胞増殖抑制剤の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記抗がん剤は、前記がん細胞増殖抑制剤そのものであってもよい。

【0044】

＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、特に制限はなく、例えば、前記Ｅ−カドヘリン結合剤におけるその他の成分と同様のものなどが挙げられる。
前記抗がん剤における前記その他の成分の含有量としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。

【0045】

前記抗がん剤は、１種単独で使用してもよいし、他の成分を有効成分とする医薬や薬剤と併せて使用してもよい。また、前記抗がん剤は、他の成分を有効成分とする医薬や薬剤中に配合された状態で使用してもよい。

【0046】

＜用途＞
前記抗がん剤は、優れた抗がん作用を有し、様々ながん細胞の増殖を選択的に抑制することができ、安全性が高いため、胃がん、前立腺がん、肺がん、大腸がん、膵がん、乳がんなどの幅広いがんの予防剤又は治療剤として好適に利用可能である。

【0047】

（Ｅ−カドヘリン結合剤、タンパク質合成阻害剤、がん細胞増殖抑制剤、及び抗がん剤の剤型、投与）
＜剤型＞
前記Ｅ−カドヘリン結合剤、前記タンパク質合成阻害剤、前記がん細胞増殖抑制剤、及び前記抗がん剤の剤型としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、固形剤、半固形剤、液剤などが挙げられる。

【0048】

−固形剤−
前記固形剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、内用剤として用いられる場合、例えば、錠剤、チュアブル錠、発泡錠、口腔内崩壊錠、トローチ剤、ドロップ剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、ドライシロップ剤、浸剤などが挙げられる。
前記固形剤が、外用剤として用いられる場合、例えば、坐剤、パップ剤、プラスター剤などが挙げられる。

【0049】

−半固形剤−
前記半固形剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、内用剤として用いられる場合、例えば、舐剤、チューインガム剤、ホイップ剤、ゼリー剤などが挙げられる。
前記半固形剤が、外用剤として用いられる場合、例えば、軟膏剤、クリーム剤、ムース剤、インヘラー剤、ナザールジェル剤などが挙げられる。

【0050】

−液剤−
前記液剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、内用剤として用いられる場合、例えば、シロップ剤、ドリンク剤、懸濁剤、酒精剤などが挙げられる。
前記液剤が、外用剤として用いられる場合、例えば、液剤、点眼剤、エアゾール剤、噴霧剤などが挙げられる。

【0051】

＜投与＞
前記Ｅ−カドヘリン結合剤、前記タンパク質合成阻害剤、前記がん細胞増殖抑制剤、及び前記抗がん剤の投与方法、投与量、投与時期、及び投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記投与方法としては、例えば、局所投与法、経腸投与法、非経口投与法などが挙げられる。
前記投与量としては、例えば、投与対象個体の年齢、体重、体質、症状、他の成分を有効成分とする医薬や薬剤の投与の有無など、様々な要因を考慮して適宜選択することができる。
前記投与対象となる動物種としては、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、トリなどが挙げられるが、これらの中でもヒトに好適に用いられる。

【実施例】

【0052】

以下に本発明の試験例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの試験例に何ら限定されるものではない。

【0053】

（試験例１：胃がん細胞ＭＫＮ−７の増殖抑制）
ＧＡＰＤＨとして、（１）ウサギ筋肉から精製したＧＡＰＤＨ（Ｓｉｇｍａ社製）、（２）ヒト赤血球から精製したＧＡＰＤＨ（Ｓｉｇｍａ社製）、（３）リコンビナントのヒトＧＡＰＤＨ（Ａｂｎｏｖａ社製、Ｐ４５４７）を用いて、ヒト胃がん細胞ＭＫＮ−７（理研セルバンク）の増殖に与える各ＧＡＰＤＨの影響を調べた。
なお、前記（１）ウサギ筋肉から精製したＧＡＰＤＨのアミノ酸配列は、配列番号２で示されるものであり、前記（２）ヒト赤血球から精製したＧＡＰＤＨのアミノ酸配列は、配列番号１で示されるものであり、前記（３）リコンビナントのヒトＧＡＰＤＨのアミノ酸配列は、配列番号１で示されるものである。

【0054】

−細胞増殖試験−
前記ヒト胃がん細胞ＭＫＮ−７を、１％透析血清、５μｇ／ｍＬ インスリン、５μｇ／ｍＬ トランスフェリン、１．４μＭ ヒドロコルチゾンを含むＤＭＥＭで５×１０^４個／ｍＬに分散させ、９６ウェルプレートに０．１ｍＬ／ウェルずつ撒き、前記各ＧＡＰＤＨを各濃度で加え、３７℃、５％ ＣＯ_２で３日間培養した。
前記３日間培養した後の細胞数をＭＴＴ法（３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ；Ｓｉｇｍａ社製）により測定した。
前記ＭＴＴ法は、ＭＴＴ溶液（ＭＴＴを５ｍｇ／ｍＬの濃度で含有するＰＢＳ）１０μＬを各ウェルに加え４時間培養し、産生されたフォルマザン産物を１０ｍＭ ＨＣｌを含む２０％ＳＤＳ溶液１００μＬを各ウェルに添加して溶解し、５７０ｎｍの吸光度をラボシステムズ マルチスキャンＭＳ（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）で測定することにより行った。結果を図１Ａから図１Ｃに示す。図１Ａは、前記（１）ウサギ筋肉から精製したＧＡＰＤＨによる胃がん細胞ＭＫＮ−７の増殖抑制効果を示し、図１Ｂは、前記（２）ヒト赤血球から精製したＧＡＰＤＨによる胃がん細胞ＭＫＮ−７の増殖抑制効果を示し、図１Ｃは、前記（３）リコンビナントのヒトＧＡＰＤＨによる胃がん細胞ＭＫＮ−７の増殖抑制効果を示す。

【0055】

図１Ａから図１Ｃの結果から、前記（１）ウサギ筋肉から精製したＧＡＰＤＨ、前記（２）ヒト赤血球から精製したＧＡＰＤＨ、及び前記（３）リコンビナントのヒトＧＡＰＤＨのいずれも、数Ｕ／ｍＬ〜数十Ｕ／ｍＬの濃度で細胞の増殖を５０％以上抑制することが示された。なお、図１Ａから図１Ｃにおける値は、同様な結果が得られた３回の独立した実験の代表的なもの測定値の平均値±ＳＤである。統計解析には、スチューデントのｔ検定を用いた。

【0056】

（試験例２−１：がん細胞の増殖抑制）
試験例１において、ＧＡＰＤＨとして、前記（２）ヒト赤血球から精製したＧＡＰＤＨを用い、がん細胞として、以下の８種類のがん細胞を用いた以外は、試験例１と同様にして、細胞増殖試験を行った。結果を図２Ａ及び図２Ｂに示す。
・ ヒト胃がん細胞ＭＫＮ−２８（理研セルバンク）
・ ヒト前立腺がん細胞ＤＵ−１４５（ＡＴＣＣ）
・ ヒト肺がん細胞ＤＭＳ１１４（ＡＴＣＣ）
・ ヒト肺がん細胞ＤＭＳ２７３（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社）
・ ヒト大腸がん細胞ＨＣＣ２９９８（ＡＴＣＣ）
・ ヒト膵がん細胞ＢｘＰＣ−３（ＡＴＣＣ）
・ ヒト膵がん細胞Ｃａｐａｎ−１（ＡＴＣＣ）
・ ヒト乳がん細胞ＭＣＦ−７（ＡＴＣＣ）
図２Ａ及び図２Ｂの結果から、前記試験例１と異なるいずれのがん細胞株に対しても５Ｕ／ｍＬで４０％以上増殖を阻害することが示された。

【0057】

（試験例２−２：正常間質細胞の増殖に与える影響）
試験例１において、ＧＡＰＤＨとして、前記（２）ヒト赤血球から精製したＧＡＰＤＨを用い、がん細胞に代えて以下の５種類の正常間質細胞を用いた以外は、試験例１と同様にして、細胞増殖試験を行った。結果を図２Ｃに示す。
・ ヒト正常肺繊維芽細胞ＮＨＬＦ（タカラバイオ株式会社）
・ ヒト正常前立腺間質細胞ＰｒＳＣ（タカラバイオ株式会社）
・ ヒト正常胃間質細胞Ｈｓ７３８（ＡＴＣＣ）
・ ヒト正常乳腺間質細胞Ｈｓ３７１（ＡＴＣＣ）
・ ヒト正常膵間質細胞（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社）
図２Ｃの結果から、ＧＡＰＤＨが５Ｕ／ｍＬでも、いずれの正常間質細胞の増殖をほとんど阻害しなかった。そのため、ＧＡＰＤＨは、がん細胞の増殖を選択的に抑制することができると考えられる。なお、図２Ｃ中、「ＰＳ」は、前記ヒト正常膵間質細胞を表す。

【0058】

（試験例３：タンパク質合成阻害）
前記試験例１及び２の結果を受け、ＧＡＰＤＨによるがん細胞増殖抑制のメカニズムを調べるため、タンパク質合成の阻害について以下のようにして検討した。
前記ヒト胃がん細胞ＭＫＮ−７を、１％透析血清、５μｇ／ｍＬ インスリン、５μｇ／ｍＬ トランスフェリン、１．４μＭ ヒドロコルチゾンを含むＤＭＥＭで５×１０^４個／ｍＬに分散させ、１ｍＬずつ３５ｍｍディッシュに撒き、前記（２）ヒト赤血球から精製したＧＡＰＤＨを５Ｕ／ｍＬで加えて、３７℃、５％ ＣＯ_２で１日間培養した。
Ｋａｗａｄａ， Ｍ．， Ｍａｓｕｄａ， Ｔ．， Ｉｓｈｉｚｕｋａ， Ｍ．， ａｎｄ Ｔａｋｅｕｃｈｉ， Ｔ． １５−Ｄｅｏｘｙｓｐｅｒｇｕａｌｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｓ Ａｋｔ ｋｉｎａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２７７， ２７７６５−２７７７１ （２００２）．に記載の方法により、前記培養した細胞の溶解液を調製し、リン酸化型ｐ７０Ｓ６Ｋ（以下、「Ｐ−ｐ７０Ｓ６Ｋ」と称することがある）、ｐ７０Ｓ６Ｋ、リン酸化型Ｐ−Ｓ２３５／２３６ ＲＰＳ６（以下、「Ｐ−Ｓ２３５／２３６ ＲＰＳ６」と称することがある）、リン酸化型Ｐ−Ｓ２４０／２４４ ＲＰＳ６（以下、Ｐ−Ｓ２４０／２４４ ＲＰＳ６と称することがある）、及びＲＰＳ６に対する抗体（いずれもＣｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を用いてウエスタンブロットを行った。結果を図３に示す。前記図３中、「−」は、ＧＡＰＤＨを用いなかった場合（コントロール）を示し、「＋」は、ＧＡＰＤＨを用いた場合を示す。
なお、前記ｐ７０Ｓ６Ｋは、タンパク質合成の指標であるｐ７０Ｓ６キナーゼであり、前記ＲＰＳ６は、前記ｐ７０Ｓ６Ｋの基質であるＳ６リボゾームタンパクであり、前記Ｐ−Ｓ２３５／２３６ ＲＰＳ６及び前記Ｐ−Ｓ２４０／２４４ ＲＰＳ６は、前記ＲＰＳのリン酸化型である。
図３の結果から、ＧＡＰＤＨを用いた場合には、タンパク質合成の指標であるｐ７０Ｓ６Ｋのリン酸化型が減少し、またその基質であるＲＰＳ６のＰ−Ｓ２３５／２３６ ＲＰＳ６及びＰ−Ｓ２４０／２４４ ＲＰＳ６が減少することが分かった。これらの結果から、ＧＡＰＤＨ処理によってタンパク質の合成が阻害されることが分かった。

【0059】

（試験例４−１：ＧＡＰＤＨの細胞への結合−１）
ヒト胃がん細胞ＭＫＮ−７に、Ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）発現ベクターであるｐＥＧＦＰ−Ｃ１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を、Ｌｉｐｆｅｃｔａｍｉｎｅ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて遺伝子導入し、安定的にＧＦＰを発現した細胞をクローニングした。

【0060】

前記クローニングした細胞を１％透析血清、５μｇ／ｍＬ インスリン、５μｇ／ｍＬ トランスフェリン、１．４μＭ ヒドロコルチゾンを含むＤＭＥＭで５×１０^４個／ｍＬに分散させ、２ｍＬずつカバーグラスを敷いた６ウェルプレートに撒き、５Ｕ／ｍＬの前記（２）ヒト赤血球から精製したＧＡＰＤＨを加えて、３７℃、５％ ＣＯ_２で１日間培養した。
なお、コントロールとして、ＧＡＰＤＨを加えなかった細胞についても同様に培養した。

【0061】

前記培養した細胞を、４％ホルムアルデヒドを含むＰＢＳで固定した後、ＦＢＳで細胞をブロッキングし、１次抗体（抗ＧＡＰＤＨ抗体（マウスＩｇＧ１、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製））及び蛍光標識した２次抗体（Ａｌｅｘａ ５４６抗マウスＩｇＧ１抗体、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ社製）で処理して免疫蛍光染色し、スライドグラスにマウントして蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＤＭ ＩＲＢ、Ｌｅｉｃａ社製）で観察した。結果を図４Ａに示す。
図４Ａの結果から、前記ＭＫＮ−７の細胞に発現するＧＦＰの蛍光パターン（図４Ａにおける「Ｎｏｎｅ」：ＧＡＰＤＨを用いていない）との比較から、外部から加えたＧＡＰＤＨは細胞の表面、特に細胞と細胞が接着する面などに結合していると考えられた（図４Ａにおける「ＧＡＰＤＨ ５Ｕ／ｍｌ」）。

【0062】

（試験例４−２：ＧＡＰＤＨの細胞への結合−２）
細胞外から加えたＧＡＰＤＨが細胞内に入るかどうかを、以下のようにして作製した（４）ＦＬＡＧタグを融合したヒトＧＡＰＤＨ（アミノ酸配列は、配列番号５で示されるものである。）を用い、以下のようにして検討した。

【0063】

＜（４）ＦＬＡＧタグを融合したヒトＧＡＰＤＨの作製＞
Ｈｓ７３８細胞（ＡＴＣＣ）のｍＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて調製し、ｃＤＮＡ合成キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。
前記ｃＤＮＡ、下記配列番号３及び４で表されるプライマー、及びＰｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてＰＣＲを行った。
ｓｅｎｓｅ ｐｒｉｍｅｒ １（制限酵素ＮｈｅＩサイトを含む）：
５’−ＴＡＴＧＣＴＡＧＣＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＡＴＧＧＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧ−３’（配列番号３）
ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ２（制限酵素ＸｈｏＩサイトを含む）：
５’−ＴＡＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＴＣＣＴＴＧＧＡＧＧＣＣＡＴＧＴＧＧＧ−３’（配列番号４）
前記ＰＣＲ産物を制限酵素ＮｈｅＩ及びＸｈｏＩで処理し、ｐＥＴ−１７ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に挿入し、Ｎ末にＦＬＡＧタグを融合したヒトＧＡＰＤＨの発現ベクターを作製した。
前記作製した発現ベクターで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質変換し、１ｍＭ ＩＰＴＧ存在下で培養した後、遠心にて大腸菌を回収し、５倍量のｂｕｆｆｅｒ Ａ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、０．１％ ＮＰ−４０、２ｍＭ メルカプトエタノール）を加えて超音波処理して大腸菌を破砕した。
前記大腸菌を破砕した液に、抗ＦＬＡＧ Ｍ２アガロース（Ｓｉｇｍａ社製）を１ｍＬ加えて、４℃で２時間撹拌した。次いで、アガロースのゲルをｂｕｆｆｅｒ Ａで遠心洗浄した後、３ｍＬのｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、０．１％ ＮＰ−４０、２ｍＭ メルカプトエタノール、８０μｇ／ｍＬ ＦＬＡＧ ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ社製））を加えて、４℃で３０分間撹拌した後、遠心して上清を回収した。前記上清をＰＢＳ中にて４℃で一晩透析し、タンパク質量を定量後、（４）ＦＬＡＧタグを融合したヒトＧＡＰＤＨとした。

【0064】

＜検討＞
前記試験例４−１と同様にして、安定的にＧＦＰを発現したヒト胃がん細胞ＭＫＮ−７をクローニングした。

【0065】

前記クローニングした細胞を１％透析血清、５μｇ／ｍＬ インスリン、５μｇ／ｍＬ トランスフェリン、１．４μＭ ヒドロコルチゾンを含むＤＭＥＭで５×１０^４個／ｍＬに分散させ、２ｍＬずつカバーグラスを敷いた６ウェルプレートに撒き、１μｇ／ｍＬの前記（４）ＦＬＡＧタグを融合したヒトＧＡＰＤＨを加えて、３７℃、５％ ＣＯ_２で１日間培養した。

【0066】

前記培養した細胞を、４％ホルムアルデヒドを含むＰＢＳで固定した後、冷メタノールで更に固定して、細胞膜の透過性を上げた後、ＦＢＳで細胞をブロッキングし、１次抗体（抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（マウスＩｇＧ１）、Ｓｉｇｍａ社製）及び蛍光標識した２次抗体（Ａｌｅｘａ ５４６抗マウスＩｇＧ１抗体、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ社製）で処理して免疫蛍光染色し、スライドグラスにマウントして蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＤＭ ＩＲＢ、Ｌｅｉｃａ社製）で観察した。結果を図４Ｂに示す。
図４Ｂの結果から、ＭＫＮ−７の細胞内のＧＦＰの蛍光とは重ならず、前記（４）ＦＬＡＧタグを融合したヒトＧＡＰＤＨは細胞内に取り込まれていないことが分かった。

【0067】

（試験例５−１：ＧＡＰＤＨとＥ−カドヘリンとの結合−１）
前記試験例４−１と同様にして、安定的にＧＦＰを発現したヒト胃がん細胞ＭＫＮ−７をクローニングした。

【0068】

前記クローニングした細胞を１％透析血清、５μｇ／ｍＬ インスリン、５μｇ／ｍＬ トランスフェリン、１．４μＭ ヒドロコルチゾンを含むＤＭＥＭで５×１０^４個／ｍＬに分散させ、２ｍＬずつカバーグラスを敷いた６ウェルプレートに撒き、５Ｕ／ｍＬの前記（２）ヒト赤血球から精製したＧＡＰＤＨを加えて、３７℃、５％ ＣＯ_２で１日間培養した。

【0069】

前記培養した細胞を、４％ホルムアルデヒドを含むＰＢＳで固定した後、ＦＢＳで細胞をブロッキングし、１次抗体（抗ＧＡＰＤＨ抗体（マウスＩｇＧ１、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製））及び蛍光標識した２次抗体（Ａｌｅｘａ ５４６抗マウスＩｇＧ１抗体、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ社製）による処理、又は、１次抗体（抗Ｅ−カドヘリン抗体（マウスＩｇＧ２ａ、Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製））及び蛍光標識した２次抗体（Ａｌｅｘａ ５４６抗マウスＩｇＧ２ａ抗体、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ社製）による処理によって免疫蛍光染色し、スライドグラスにマウントして蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＤＭ ＩＲＢ、Ｌｅｉｃａ社製）で観察した。結果を図５Ａに示す。
図５Ａ中、左側は、１次抗体として、抗ＧＡＰＤＨ抗体を用いた場合の結果を示し、右側は、１次抗体として、抗Ｅ−カドヘリン抗体を用いた場合の結果を示す。
図５Ａの結果から、一部のＥ−カドヘリンとＧＡＰＤＨの結合部位が類似している可能性が示された。

【0070】

（試験例５−２：ＧＡＰＤＨとＥ−カドヘリンとの結合−２）
ＧＡＰＤＨとＥ−カドヘリンとが結合しているかについて、以下のようにして検討した。

【0071】

−細胞膜画分の調製−
ヒト胃がん細胞ＭＫＮ−７細胞を、１％透析血清、５μｇ／ｍＬ インスリン、５μｇ／ｍＬ トランスフェリン、１．４μＭ ヒドロコルチゾンを含むＤＭＥＭで、３７℃、５％ ＣＯ_２でコンフルエントになるくらいまで培養した後、ＰｒｏｔｅｏＥｘｔｒａｃｔキット（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）を用いて、細胞膜画分を調製した。

【0072】

前記調製した細胞膜画分と、（ｉ）５Ｕ／ｍＬの前記（２）ヒト赤血球から精製したＧＡＰＤＨ、又は（ｉｉ）５μｇ／ｍＬの前記（４）ＦＬＡＧタグを融合したヒトＧＡＰＤＨとを、２時間室温で混ぜた。
次いで、前記細胞膜画分と、前記（ｉ）（２）ヒト赤血球から精製したＧＡＰＤＨとを混ぜたものに対しては、抗ＧＡＰＤＨ抗体（マウスＩｇＧ１、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製）とｐｒｏｔｅｉｎ Ｇアガロースの複合体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製）を加え、前記細胞膜画分と、前記（ｉｉ）前記（４）ＦＬＡＧタグを融合したヒトＧＡＰＤＨとを混ぜたものに対しては、抗ＦＬＡＧ Ｍ２アガロース（Ｓｉｇｍａ社製）を加え、１時間室温で混ぜ、免疫沈降した。

【0073】

前記免疫沈降物をＰＢＳで４回遠心洗浄し、抗Ｅ−カドヘリン抗体（マウスＩｇＧ２ａ、Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて、ウエスタンブロットを行った結果を図５Ｂに示す。図５Ｂ中、上段は、前記（ｉｉ）前記（４）ＦＬＡＧタグを融合したヒトＧＡＰＤＨを用いた免疫沈降物についての結果を示し、下段は、前記（ｉ）（２）ヒト赤血球から精製したＧＡＰＤＨを用いた免疫沈降物についての結果を示す。なお、図５Ｂ中、「−」は、ＧＡＰＤＨを用いなかった場合（コントロール）を示し、「＋」は、ＧＡＰＤＨを用いた場合を示す。
図５Ｂの結果から、ＧＡＰＤＨを用いた免疫沈降物中にＥ−カドヘリンが検出されることが分かった

【0074】

（試験例５−３：ＧＡＰＤＨとＥ−カドヘリンとの結合−３）
前記試験例４−１と同様にして、安定的にＧＦＰを発現したヒト胃がん細胞ＭＫＮ−７をクローニングした。

【0075】

前記クローニングした細胞を１％透析血清、５μｇ／ｍＬ インスリン、５μｇ／ｍＬ トランスフェリン、１．４μＭ ヒドロコルチゾンを含むＤＭＥＭで５×１０^４個／ｍＬに分散させ、２ｍＬずつカバーグラスを敷いた６ウェルプレートに撒き、５Ｕ／ｍＬの前記（２）ヒト赤血球から精製したＧＡＰＤＨを加えて、３７℃、５％ ＣＯ_２で１日間培養した。

【0076】

前記培養した細胞を、４％ホルムアルデヒドを含むＰＢＳで固定した後、ＦＢＳでブロッキングし、抗ＧＡＰＤＨ抗体（マウスＩｇＧ１、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製）及びＡｌｅｘａ ３５０抗マウスＩｇＧ１抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ社製）、続いて、抗Ｅ−カドヘリン抗体（マウスＩｇＧ２ａ、Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）及びＡｌｅｘａ ５４６抗マウスＩｇＧ２ａ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ社製）により、二重免疫蛍光染色し、スライドグラスにマウントして蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＤＭ ＩＲＢ、Ｌｅｉｃａ社製）で観察した。結果を図５Ｃに示す。
図５Ｃ中、左側は、抗ＧＡＰＤＨ抗体及びＡｌｅｘａ ３５０抗マウスＩｇＧ１抗体で免疫染色した結果を示し、中央は、抗Ｅ−カドヘリン抗体及びＡｌｅｘａ ５４６抗マウスＩｇＧ２ａ抗体で免疫染色した結果を示し、右側は、左側と中央とを重ね合わせた結果を示す。
図５Ｃの結果から、ＧＡＰＤＨの局在がＥ−カドヘリンと重なることが分かった。従って、ＧＡＰＤＨは細胞膜上のＥ−カドヘリンに結合することが示された。

【0077】

（試験例５−４：ＧＡＰＤＨとＥ−カドヘリンとの結合−４）
ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ部分が融合したヒトリコンビナントＥ−カドヘリン（以下、「Ｅ−カドヘリン Ｆｃ Ｃｈｉｍｅｒａ」と称することがある。）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を１．５μｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳに溶かしたものを１００μＬ／ウェルで９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ社製）に加え、３７℃で１時間静置し、プレートをＥ−カドヘリン Ｆｃ Ｃｈｉｍｅｒａでコートした。
前記プレートをＰＢＳで４回洗浄した後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳを１００μＬ／ウェルで加えて、３７℃で３０分間静置し、ブロッキングした。前記ブロッキングしたプレートをＰＢＳで４回洗浄した後、（２）ヒト赤血球から精製したＧＡＰＤＨ（Ｓｉｇｍａ社製）を０Ｕ／ｍＬ、２．５Ｕ／ｍＬ、５Ｕ／ｍＬとなるようにＰＢＳに溶かしたものを１００μＬ／ウェルで加え、３７℃で１時間静置した。
前記プレートをＰＢＳで４回洗浄した後、各ウェルにウエスタンブロット用のＳＤＳサンプルバッファーを加え、ウエスタンブロットによってウェルに結合したＧＡＰＤＨを抗ＧＡＰＤＨ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製）によって検出した。結果を図５Ｄに示す。
図５Ｄの結果から、Ｅ−カドヘリン Ｆｃ Ｃｈｉｍｅｒａをコートしたプレート（図５中、「＋」）からは、コートしなかったプレート（図５中、「−」）に比べて顕著にＧＡＰＤＨが検出された。従って、Ｅ−カドヘリンと、ＧＡＰＤＨとが結合することが確かめられた。

【0078】

以上の試験例の結果から、ＧＡＰＤＨは、Ｅ−カドヘリンに結合することで細胞間の接着に影響をおよぼし、その結果としてタンパク質の合成阻害、そして細胞増殖の阻害に至ると考えられる。

【産業上の利用可能性】

【0079】

本発明のＥ−カドヘリン結合剤は、タンパク質合成阻害剤、がん細胞増殖抑制剤、抗がん剤などに好適に利用可能である。
本発明のタンパク質合成阻害剤は、がん細胞増殖抑制剤、抗がん剤などに好適に利用可能である。
本発明のがん細胞増殖抑制剤は、抗がん剤などに好適に利用可能である。
本発明の抗がん剤は、優れた抗がん作用を有し、様々ながん細胞の増殖を選択的に抑制することができ、安全性が高いため、胃がん、前立腺がん、肺がん、大腸がん、膵がん、乳がんなどの幅広いがんの予防剤又は治療剤として好適に利用可能である。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]