特許 6069212 ペプチド骨格設計

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6069212

(24)【登録日】2017年1月6日

(45)【発行日】2017年2月1日

(54)【発明の名称】ペプチド骨格設計

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20170123BHJP

   C07K 14/18 20060101ALI20170123BHJP

   C07K 14/045 20060101ALI20170123BHJP

   C07K 14/025 20060101ALI20170123BHJP

   C07K 14/11 20060101ALI20170123BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20170123BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20170123BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20170123BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20170123BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20170123BHJP

   A61K 39/29 20060101ALI20170123BHJP

   A61K 39/245 20060101ALI20170123BHJP

   A61K 39/12 20060101ALI20170123BHJP

   A61K 39/145 20060101ALI20170123BHJP

   A61K 39/295 20060101ALI20170123BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20170123BHJP

   A61P 31/16 20060101ALI20170123BHJP

   A61P 31/20 20060101ALI20170123BHJP

   A61P 31/22 20060101ALI20170123BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20170123BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C07K14/18

   C07K14/045

   C07K14/025

   C07K14/11

   C07K19/00

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   A61K39/29

   A61K39/245

   A61K39/12

   A61K39/145

   A61K39/295

   A61P31/14

   A61P31/16

   A61P31/20

   A61P31/22

   A61K48/00

【請求項の数】21

【全頁数】57

(21)【出願番号】特願2013-541211(P2013-541211)

(86)(22)【出願日】2011年12月2日

(65)【公表番号】特表2014-502156(P2014-502156A)

(43)【公表日】2014年1月30日

(86)【国際出願番号】DK2011050460

(87)【国際公開番号】WO2012072088

(87)【国際公開日】20120607

【審査請求日】2014年10月30日

(31)【優先権主張番号】61/475,965

(32)【優先日】2011年4月15日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】10193479.2

(32)【優先日】2010年12月2日

(33)【優先権主張国】EP

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】512003825

【氏名又は名称】ビオノール イミュノ エーエス

【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＮＯＲ ＩＭＭＵＮＯ ＡＳ

(74)【代理人】

【識別番号】100065248

【弁理士】

【氏名又は名称】野河 信太郎

(74)【代理人】

【識別番号】100159385

【弁理士】

【氏名又は名称】甲斐 伸二

(74)【代理人】

【識別番号】100163407

【弁理士】

【氏名又は名称】金子 裕輔

(74)【代理人】

【識別番号】100166936

【弁理士】

【氏名又は名称】稲本 潔

(74)【代理人】

【識別番号】100174883

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 雅己

(72)【発明者】

【氏名】ランゲ，エイナー トネス

(72)【発明者】

【氏名】グロンヴォルド，マハ ソメルフェルト

(72)【発明者】

【氏名】ホルンバーグ，イェンス オロフ

(72)【発明者】

【氏名】ソレンセン，ビージャー

【審査官】 西 賢二

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００８／１０７４００（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 FOURNILLIER, A. et al.，"Primary and memory T cell responses induced by hepatitis C virus multiepitope long peptides"，Vaccine，２００６年，Vol. 24，pp. 3153-3164

【文献】 SUNDARAM, Roshni et al.，"A novel multivalent human CTL peptide construct elicits robust cellular immune responses in HLA-A*0201 transgenic mice: implications for HTLV-1 vaccine design"，Vaccine，２００３年，Vol. 21，p. 2767-2781

【文献】 KHAN, Naeem et al.，"T cell recognition patterns of immunodominant cytomegalovirus antigens in primary and persistent infection"，J. Immunol. ，２００７年，Vol. 178，p. 4455-4465

【文献】 CHEN, Hsin-Wei et al.，"Identification of HLA-A11-restricted CTL epitopes derived from HPV type 18 using DNA immunization"，Cancer Biol. Ther. ，２００９年，Vol. 8，p. 2025-2032

【文献】 ASSARSSON, Erika et al.，"Immunomic analysis of the repertoire of T-cell specificities for influenza A virus in humans"，J. Virol.，２００８年，Vol. 82，p. 12241-12251

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

Ｃ１２Ｎ １／００−７／０８

Ａ６１Ｋ ３８／００−３８／５８

Ａ６１Ｋ ４１／００−４５／０８

Ａ６１Ｋ ４８／００

Ａ６１Ｋ ３９／００−３９／４４

Ａ６１Ｋ ４９／００−４９／０４

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記の構造：
X¹-X²-X³-X⁴-X⁵ (式Ｉ)
(式中、X¹及びX³は、独立して、１、２又は３つのアルギニンの直鎖配列を意味し；X²及びX⁴はHCV、CMV、HPV若しくはインフルエンザウイルスの同じ抗原又は該抗原の変異型配列であって、該抗原と比較して１つの置換、付加若しくは欠失を含み、その天然型配列と少なくとも90％の配列同一性を有する変異型配列からの８〜15アミノ酸の直鎖配列を意味し；X⁴はX²とは異なり；X⁵は、随意に存在してもよいアルギニンである。ただし、式Ｉにより規定されるアミノ酸配列は、前記抗原の天然型配列中に見出されるものではない。)
からなる単離された細胞透過性ペプチド。

【請求項2】

１以上のシステインを含んでなる、請求項１に記載のペプチド。

【請求項3】

X²中のＮ-及び/又はＣ-末端アミノ酸が親水性又は極性アミノ酸である、請求項１又は２に記載のペプチド。

【請求項4】

X⁴中のＮ-末端アミノ酸が親水性又は極性アミノ酸である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチド。

【請求項5】

X¹及び/又はX³が２又は３アミノ酸からなる、請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチド。

【請求項6】

X¹がRRからなる、請求項５に記載のペプチド。

【請求項7】

X³がRRからなる、請求項５又は６に記載のペプチド。

【請求項8】

X²及び/又はX⁴が12アミノ酸未満の直鎖配列である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチド。

【請求項9】

各ペプチド単量体が請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチドである２つのペプチド単量体を含んでなる二量体ペプチド。

【請求項10】

請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチドを２以上含んでなるペプチドの組合せ。

【請求項11】

請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチドをコードする単離された核酸又はポリヌクレオチド。

【請求項12】

請求項１１に記載の核酸若しくはポリヌクレオチドを含んでなるベクター。

【請求項13】

請求項１２に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。

【請求項14】

少なくとも、請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチド、請求項９に記載の二量体ペプチド、請求項１０に記載のペプチドの組合せ、請求項１１に記載の核酸若しくはポリヌクレオチド又は請求項１２に記載のベクターを、医薬的に許容され得る希釈剤若しくはビヒクル及び随意に免疫学的アジュバントと組み合わせて含んでなる免疫原性組成物。

【請求項15】

ワクチン組成物の形態である請求項１４に記載の免疫原性組成物。

【請求項16】

対象者において抗原に対する免疫応答を誘導する方法での使用のための、請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチド、請求項９に記載の二量体ペプチド、請求項１０に記載のペプチドの組合せ、請求項１１に記載の核酸若しくはポリヌクレオチド又は請求項１２に記載のベクター又は請求項１４若しくは１５に記載の組成物。

【請求項17】

対象者においてウイルスの病理学的効果を減少させ及び/又は遅延させる方法での使用のための、請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチド、請求項９に記載の二量体ペプチド、請求項１０に記載のペプチドの組合せ、請求項１１に記載の核酸若しくはポリヌクレオチド又は請求項１２に記載のベクター又は請求項１４若しくは１５に記載の組成物。

【請求項18】

医薬に使用するための、請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチド。

【請求項19】

対象者においてウイルスの病理学的効果を治療する方法での使用のための請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチド。

【請求項20】

請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチド、請求項９に記載の二量体ペプチド、請求項１０に記載のペプチドの組合せ、請求項１１に記載の核酸若しくはポリヌクレオチド又は請求項１２に記載のベクターの、対象者において抗原に対する免疫応答を誘導する組成物の製造における使用。

【請求項21】

請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチド、請求項９に記載の二量体ペプチド、請求項１０に記載のペプチドの組合せ、請求項１１に記載の核酸若しくはポリヌクレオチド又は請求項１２に記載のベクターの、対象者においてウイルスの病理学的効果を減少させ及び/又は遅延させるための組成物の製造における使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

発明の分野
本発明は、HCV、HIV、CMV及びインフルエンザ感染を含むウイルス感染の治療、診断及び予後のための新規ペプチド及び方法に関する。本発明は更に、治療及び診断に有用なペプチドを同定し提供する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

発明の背景
ワクチン開発への従来アプローチは、減弱化された完全複製可能ウイルス(whole replication competent virus)(例えば、セービンポリオワクチン、麻疹、おたふく風邪、風疹(MMR))又は複製能のない不活性化ビリオンのいずれかで行われている。場合によっては、不活化ウイルスワクチは、ウイルス粒子が分解されているスプリットワクチン(split vaccine)を含み得る。分子技法も、Ｂ型肝炎ウイルスの表面糖タンパク質のみからなるサブユニットワクチン(例えば、Ｂ型肝炎ワクチン)を開発するために使用されている。不活化ウイルスワクチンは、主に、問題のウイルスに対する抗体応答を誘導する傾向にある一方、減弱化生ワクチンは、一過性の感染を誘導するので、細胞媒介免疫及び抗体応答の両方を誘導する。

【0003】

成功したワクチン接種キャンペーンのおかげで消滅した唯一の疾患は、天然痘である。ポリオ撲滅キャンペーンが現在進行中である。ワクチン接種により消滅させることができるウイルス感染の特徴は、安定なウイルス抗原を有する(すなわち、変異頻度が非常に低く、サブタイプがほとんどない)ウイルスであって、他の動物種に感染貯蔵庫がなく、一旦感染が終了した身体で生き残れず、ワクチン接種が長期持続性免疫を導くウイルスにより引き起こされる感染である。ポリオ及び麻疹のようなウイルスはこれらの基準を満たす一方、タンパク質配列を変化させるインフルエンザウイルス(Flu)、HCV及びHIVのようなウイルスは満たさない。これら疾患用のワクチンの開発に新たな代替のアプローチが必要とされるのはこの理由からである。

【0004】

ワクチン接種は、感染の前に、特定病原体に対する免疫応答を刺激することを目的とする。個体が当該病原体に曝されると、感染の確立を防止するメモリー応答が誘引される。したがって、ワクチンは、生得免疫とは異なり、長期持続性であり記憶を有する適応免疫応答を刺激する。適応免疫系には２つの主要な武器が存在する。ウイルス粒子に結合することができる抗体及び感染を中和することができる特定種の抗体の発生が関与する体液性免疫。ヒト白血球抗原(HLA)クラスＩと関連してウイルスエピトープを露出する感染細胞を殺傷し、こうして感染細胞を消滅させる細胞傷害性Ｔ-細胞の発生を導く細胞媒介免疫。

【0005】

適応免疫系の刺激に適切なワクチンを提供することの難題は、ペプチドエピトープが抗原提示細胞によって取り込まれる必要があることである。
幾つかのペプチドは、外見的にはエネルギー非依存性経路により真核生物細胞の形質膜を横切って転位することが証明されている。これらペプチドは細胞透過性ペプチド(CPP)として定義される。これら細胞透過性ペプチドを用いる細胞送達は、従来技法を超える幾つかの利点を提供する。これは、非侵襲性であり、エネルギー非依存性であり、広範囲の細胞タイプに効率的であり、細胞に一纏めに適用することができる。

【0006】

肝炎は、毒素、或る種の薬物、幾つかの疾患、頻繁なアルコール摂取及び細菌・ウイルス感染を含む種々の因子により引き起こされ得る肝臓の炎症を意味する。肝炎はまた、肝臓が罹患するウイルス感染のファミリーの名称である；先進国世界で最も一般的なタイプは、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎及びＣ型肝炎である。
Ｃ型肝炎は、Ｃ型肝炎ウイルス(HCV)感染から生じる肝臓疾患である。この疾患は、重篤度が、数週間持続する軽度の病的状態から生涯にわたる重度の病的状態までの範囲であり得る。Ｃ型肝炎は血液を介して伝播する；伝染の最も一般的な形態は、薬剤の注入に使用した注射針その他の装置の共有による。感染は「急性」又は「慢性」であり得る。急性HCV感染は、Ｃ型肝炎ウイルスへの曝露後最初の６ヶ月以内に生じる無症状性で短期の病的状態である。ほとんどの人々について、急性感染は、長期の合併症及び死さえももたらすことがある慢性感染に至る。

【0007】

HCVは、感染細胞の細胞質で複製する、フラビウイルス科ヘパシウイルス属に属する、直径約50nmの、エンベロープを有するプラス鎖リボ核酸(RNA)ウイルスである。HCVについて唯一の既知の感染貯蔵庫はヒトであるが、実験的にはこのウイルスはチンパンジーに伝染している。HCVの天然の標的は肝細胞及び多分Ｂ-リンパ球である。2008年時点で、６つの異なる遺伝子型及び100を超えるウイルスサブタイプが知られている。複製は、較正機能を欠くRNA-依存性RNAポリメラーゼにより起こり、このことにより非常に高率の変異が生じる。エンベロープタンパク質をコードする、HCVゲノムの超可変領域における急速な変異により、ウイルスは、宿主による免疫監視から逃れることができる。結果として、ほとんどのHCV-感染者は慢性感染に進行する。
世界中で、世界人口の約３％に相当する170百万人がHCVに感染していると推定される。毎年約３〜４百万人が感染する；これら新たな感染患者の80％が慢性感染に進行すると推定される。

【0008】

６つのHCV遺伝子型は異なる地形学的分布を有する。初期ステージの疾患は、一般に、無症状である；慢性感染患者の多数は、最終的に、肝線維症及び肝硬変のような合併症に進行し、１〜５％の症例では、肝細胞ガンに進行する。
HCVは、世界中の非Ａ非Ｂ型肝炎の主要な原因である。急性HCV感染は、頻繁に、慢性肝炎及び末期の肝硬変に至る。HCV慢性キャリアの20％までが約20年の期間にわたって肝硬変を発症し得、肝硬変を有するHCV慢性キャリアの１〜４％が肝臓ガンを発症するリスクにあると推定される。
HCVウイルスの約9.6kbの単鎖RNAゲノムは、5'-及び3'-非コーディング領域(NCR)と、これらNCRの間に、約3000アミノ酸のHCVポリタンパク質をコードする約９kbの１つの長いオープンリーディングフレームとを含んでなる。

【0009】

HCVポリペプチドは、オープンリーディングフレームからの翻訳及び翻訳と同時のタンパク質分解プロセシングにより産生される。構造タンパク質は、コーディング領域のアミノ末端側４分の１に由来し、キャプシド又はコアタンパク質(約21kDa)、E1エンベロープ糖タンパク質(約35kDa)及びE2エンベロープ糖タンパク質(約70kDa、以前にはNS1と呼ばれていた)及びp7(約７kDa)を含む。E2タンパク質は、p7タンパク質のＣ-末端融合を伴って又は伴わずに生じ得る(Shimotohnoら，1995)。Ｆ(フレームシフト)タンパク質と呼ばれる約17kDaのタンパク質をコードし発現する別のオープンリーディングフレームがコア領域中に見出された(Xuら，2001；米国特許出願公開第US2002/0076415号のOu及びXu)。同領域中に、他の14〜17kDaのARFP(代替リーディングフレームタンパク質)、A1〜A4のORFが発見され、少なくともA1、A2及びA3に対する抗体が慢性感染患者の血清中で検出された(Walewskiら，2001)。残りのHCVコーディング領域に、NS2(約23kDa)、NS3(約70kDa)、NS4A(約８kDa)、NS4B(約27kDa)、NS5A(約58kDa)及びNS5B(約68kDa)を含む非構造HCVタンパク質は由来する(Grakouiら，1993)。

【0010】

インフルエンザは、世界中の死亡及び罹患の重要な原因のままである。世界保健機関(WHO)は、年に３〜５百万人が季節的流行性疾患に重篤状態で罹患し、250,000〜500,000人が死亡していると推定している。インフルエンザは、マイナス鎖RNAウイルスであるオルソミクソウイルス科のウイルスにより引き起こされる。インフルエンザウイルスは３つのタイプ、Ａ型、Ｂ型及びＣ型として存在し、そのうちＡ型のみがパンデミックに関係する。Ａ型ウイルスはヒト及び動物(特にトリであるがブタのような他の哺乳動物でも)において見出される。Ａ型ウイルスは、更に、ウイルス表面タンパク質の種類及び組合せに応じてサブタイプに分けられる。2009年には、多くのサブタイプのうち、インフルエンザＡ(H1N1)及びＡ(H3N2)サブタイプがヒトに広まった。インフルエンザＡ及びＢは季節ワクチンに含まれる一方、インフルエンザＣは稀にしか発生しないので季節ワクチンには含まれない。Ｂ型ウイルスはヒト特異的であり、Ｃ型ウイルスは非常に軽度の疾患を引き起こす。オルソミクソウイルスのゲノムはセグメント化されている。Ａ型及びＢ型インフルエンザウイルスは８つのセグメントを有する一方、Ｃ型は７つのセグメントを有する。パンデミックは、２つの異なるＡ型ウイルスが同じ細胞に感染したときの遺伝子セグメントの再結合(re-assortment)の結果として起こり得る。この新規の再結合ウイルスに対する免疫は人々にはない。20世紀には３回のパンデミックが発生した：1918年の「スペインインフルエンザ」、1957年の「アジアインフルエンザ」、及び1968年の「香港インフルエンザ」。1918年のパンデミックでは、世界中で40〜50百万人が死亡したと推定されている。その後のパンデミックは、遥かにより軽度であり、1957年には２百万人が死亡し、1968年には１百万人が死亡したと推定されている。2009年６月に、WHOは、インフルエンザウイルスH1N1(ブタインフルエンザ)によるパンデミックを宣言し、2010年８月に終結したと宣言した。

【0011】

ヒトパピローマウイルスは、皮膚及び粘膜に感染する、パピローマウイルス科のDNAウイルス群で構成されている。100を超える種々の同定されたサブタイプに由来する２つの群は、医学的関心事の主要な原因である：いぼ(良性及び性器いぼの両方)を引き起こすものと、子宮頸部ガンを生じることがある第12群「高リスク」サブタイプ。後者の群は、ほとんど全てのタイプの子宮頸部ガンの発症における一要因と考えられている。世界中で、子宮頸部ガンは、女性において２番目に多い悪性腫瘍のままであり、発展途上国において女性のガン関連死亡の主原因である。HPV 16及び18が、主に、子宮頸部ガンと関連付けられているが、このウイルスはまた、男性及び女性の両方における咽喉ガンの原因でもある。HPVは接触により伝染し、擦過傷を通して皮膚に侵入する。初期タンパク質のみが発現する不稔感染は、ガン発症に関連する。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

発明の目的
対象者において適応免疫応答を刺激する免疫原として使用し得るペプチドを提供することが本発明の実施形態の１つの目的である。
特に、抗原提示細胞(マクロファージ及び樹状細胞)により取り込まれ、その結果、効果的な免疫応答を刺激するように、ペプチド内のエピトープが正確にプロセシングされてＴ-リンパ球に提示され得るペプチドを提供することが本発明の実施形態の１つの目的である。
更に、抗原として使用し得るペプチドを提供すること、対象者において抗原に対する免疫応答を誘導するための免疫原性組成物及び方法を提供することが本発明の実施形態の１つの目的である。

【課題を解決するための手段】

【0013】

発明の概要
本発明は、抗原提示細胞(マクロファージ及び樹状細胞)によるペプチドエピトープの取込みを容易にし、その結果、CD4+及びCD8+ Ｔ-リンパ球の両方を刺激するように、エピトープが正確にプロセシングされ、HLAクラスＩ及びIIとの関連で提示されるペプチド設計に関する。細胞傷害能力を有するCD8+ Ｔ-リンパ球は、興味対象のエピトープを有する感染細胞を殺傷する。CD4+ Ｔ-リンパ球は、効果的なCD8+ Ｔ-リンパ球応答を維持するための「援助」を提供する。
ペプチド構築物−特定のパターン又は骨格(scaffold)設計を有するアミノ酸配列−は細胞膜を効果的に透過する能力を有することが本発明者(ら)により見出された。したがって、本発明によるペプチド構築物は、マクロファージ及び樹状細胞により提示され得る免疫原的有効量のペプチド又はそのフラグメントを細胞に搭載(load)させるために使用し得る。したがって、これらペプチド構築物は、細胞傷害性Ｔ-リンパ球(CTL)免疫応答及び/又は体液性免疫応答を誘発し得る。

【0014】

そうであるので、第１の観点において、本発明は、下記の構造：
X¹-X²-X³-X⁴-X⁵ (式Ｉ)
(式中、X¹及びX³は、独立して、任意の塩基性アミノ酸、シトルリン、トリプトファン又はそれらの誘導体から独立して選択される１、２、３又は４アミノ酸の直鎖配列を規定し；X²は抗原に由来する８〜30アミノ酸の直鎖配列を規定し；X⁴は、前記抗原に由来する８〜30アミノ酸の直鎖配列であって、X²とは異なる配列を規定し；X⁵は、随意に存在してもよい、塩基性アミノ酸、シトルリン、トリプトファン又はそれらの誘導体から選択される任意の１つのアミノ酸である)
を有する、60アミノ酸を超えない単離された細胞透過性ペプチドに関する。

【0015】

式Ｉのアミノ酸配列は、標準的なＮ-末端→Ｃ-末端方向で、言及される最初のアミノ酸がアミノ(-NH₂)基を有していても-NH₃+基を有していてもよいＮ-末端アミノ酸であり、言及される最後のアミノ酸が遊離カルボキシ基(-COOH)を有していてもカルボキシレート基を有していてもよいＣ-末端であるペプチド配列をいうと理解すべきである。幾つかの実施形態において、Ｎ-及び/又はＣ-末端アミノ酸は、(例えばＮ-末端アセチル化又はＣ-末端アミド化により)修飾されている。式Ｉで使用する記号「−」は、「X¹-X²」中X¹とX²との間の標準的なペプチド結合のような、標準的なペプチド結合をいう。

【0016】

更に、本発明によるペプチドは、主に、合成ペプチドの合成用に意図されると理解されるべきである。しかし、このペプチドは、組換え手段により製造される場合、60アミノ酸より長くてもよい。したがって、別の第１の観点において、本発明は、下記の構造：
X¹-X²-X³-X⁴-X⁵ (式Ｉ)
(式中、X¹及びX³は、独立して、任意の塩基性アミノ酸、シトルリン、トリプトファン又はそれらの誘導体から独立して選択される１、２、３又は４アミノ酸の直鎖配列を規定し；X²は抗原に由来する８〜30アミノ酸の直鎖配列を規定し；X⁴は、前記抗原に由来する８〜30アミノ酸の直鎖配列であって、X²とは異なる配列を規定し；X⁵は、随意に存在してもよい、塩基性アミノ酸、シトルリン、トリプトファン又はそれらの誘導体から選択される任意の１つのアミノ酸である)
を有するペプチド配列を含んでなる単離された細胞透過性ペプチドに関する。

【0017】

第２の観点において、本発明は、表１又は表２に独立して規定されるX²及び/又はX⁴の配列を含んでなる60アミノ酸を超えない単離ペプチドに関する。
第３の観点において、本発明は、対象者において免疫応答を誘導するための、表１又は表２に独立して規定されるX²又はX⁴の配列を含んでなるペプチドの使用に関する。
更なる観点において、本発明は、表１又は表２に規定されるX¹〜X⁵からなる単離ペプチドに関する。
更なる観点において、本発明は、各ペプチド単量体が本発明による２つのペプチド単量体を含んでなる二量体ペプチドに関する。
更なる観点において、本発明は、本発明によるペプチドを２以上含んでなるペプチドの組合せに関する。

【0018】

更なる観点において、本発明は、本発明によるペプチドをコードする単離された核酸又はポリヌクレオチドに関する。
更なる観点において、本発明は、本発明によるペプチドをコードする核酸又はポリヌクレオチドを含んでなるベクターに関する。
更なる観点において、本発明は、本発明によるペプチドをコードする核酸又はポリヌクレオチドを含むベクターを含んでなる宿主細胞に関する。

【0019】

更なる観点において、本発明は、本発明によるペプチド、各ペプチド単量体が本発明による２つのペプチド単量体を含んでなる二量体ペプチド、本発明によるペプチドを２以上含んでなるペプチドの組合せ、本発明によるペプチドをコードする核酸若しくはポリヌクレオチド又は本発明によるペプチドをコードする核酸若しくはポリヌクレオチドを含んでなるベクターを少なくとも１つ、医薬的に許容され得る希釈剤若しくはビヒクルと、随意に免疫学的アジュバントとも組み合わせて含んでなる免疫原性組成物に関する。

【0020】

更なる観点において、本発明は、本発明によるペプチド；各ペプチド単量体が本発明による２つのペプチド単量体を含んでなる二量体ペプチド；本発明によるペプチドを２以上含んでなるペプチドの組合せ；本発明によるペプチドをコードする核酸若しくはポリヌクレオチド；本発明によるペプチドをコードする核酸若しくはポリヌクレオチドを含んでなるベクター；又は本発明による組成物を少なくとも１つ投与することを含んでなる、対象者において抗原に対する免疫応答を誘導する方法に関する。

【0021】

更なる観点において、本発明は、有効量の、本発明によるペプチド；各ペプチド単量体が本発明による２つのペプチド単量体を含んでなる二量体ペプチド；本発明によるペプチドを２以上含んでなるペプチドの組合せ；本発明によるペプチドをコードする核酸若しくはポリヌクレオチド；本発明によるペプチドをコードする核酸若しくはポリヌクレオチドを含んでなるベクター；又は本発明による組成物を少なくとも１つ投与することを含んでなる、ウイルスに感染した対象者において該ウイルスの病理学的効果を減少及び/又は遅延させる方法に関する。

【0022】

更なる観点において、本発明は、医薬として使用するための本発明によるペプチドに関する。
更なる観点において、本発明は、ウイルスに感染した対象者において該ウイルスの病理学的効果を治療するための本発明によるペプチドに関する。

【発明を実施するための形態】

【0023】

発明の詳細な開示
定義
「１(つ)の(one)」、「a」又は「an」のような用語を本開示で使用する場合、それらは、特に示さない限り、「少なくとも１つ」又は「１以上」を意味する。更に、用語「含んでなる」は「含む」を意味するものとし、よって明示されたもの以外のその他の構成要素、特徴、条件又は工程の存在を許容する。

【0024】

「HIV」は、一般には、ヒト免疫不全ウイルスＩを指称する。
「HIV疾患」は、しばしばインフルエンザ様感染として顕在化する急性HIV感染並びに早期及び中間期ステージの症候性疾患(皮疹、疲労、寝汗、若干の体重減少、口の潰瘍並びに皮膚及び爪の真菌感染のような幾つかの非特徴的症状を有する)を含む幾つかのステージから構成される。ほとんどのHIV感染者は、これらのような軽度症状を、より重篤な病的状態を発症する前に経験する。一般には、最初の軽度症状が現れるには５〜７年かかると考えられている。HIV疾患が進行するにつれ、未だAIDSと診断されなくとも病的状態になり得る個体もある(下記参照；HIV疾患の後期ステージ)。典型的な問題として、口又は膣の慢性鵞口瘡(真菌発疹又は斑)、口(口唇ヘルペス)又は生殖器の再発性ヘルペス水疱、持続的発熱、持続性下痢及び顕著な体重減少が挙げられる。「AIDS」は、後期ステージのHIV疾患であり、免疫系の有効性を進行性に低下させ、個体を日和見感染及び腫瘍に感染し易くする状態である。

【0025】

本明細書で使用する用語「細胞透過性ペプチド」とは、外見上エネルギー非依存的に、真核生物及び/又は原核生物細胞の形質膜を横切って、細胞質、核、リソソーム、小胞体、ゴルジ装置、ミトコンドリア及び/又は葉緑体のような細胞質区画及び/又は核区画中に転位する能力を有する任意のペプチドをいう。形質膜を横切って転位する本発明による「細胞透過性ペプチド」のこの能力は、非侵襲性、エネルギー非依存性、非飽和性及び/又はレセプター非依存性であり得る。１つの実施形態では、用語「細胞透過性ペプチド」とは、実施例１のアッセイによって決定されるように、形質膜を横切って転位することが証明されているペプチドをいう。本発明による細胞透過性ペプチドは、完全でインタクトである配列で、或いは部分的に破壊されているが当該ペプチドに含まれる抗原が細胞内で提示されて免疫応答を刺激できるような形態で、膜を横切って転位し得ることを理解すべきである。したがって、本発明による細胞透過性ペプチドは、実施例１のアッセイによって決定されるように、形質膜を横切って転位することが証明されていてもよく、効果的な免疫応答を刺激することが証明されていてもよいペプチドである。

【0026】

本明細書で使用する(ウイルスなどのような)供給源に由来するペプチドに言及する場合、用語「抗原に由来する」は、当該供給源から得られた(例えば、単離された、精製された、など)ペプチドをいうものとする。好ましくは、ペプチドは、当該供給源の天然型ペプチドと本質的に同一であるように遺伝子操作及び/又は化学合成されていてもよい。この用語には、既知の天然型ペプチド配列のバリアント(例えば、天然型ペプチド配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９又は10アミノ酸が他の任意のアミノ酸で置換されている(例えば保存的に置換されている)ペプチド配列)の使用が含まれる。或いは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は10アミノ酸が、天然型ペプチド配列から除去されているか又は天然型ペプチド配列に付加されている。したがって、幾つかの実施形態において、本発明によるペプチドは、抗原に由来する８〜30アミノ酸(例えば、８〜20アミノ酸)の配列として規定される配列X²及び/又はX⁴を含んでなり、ここで、抗原のペプチド配列は、抗原に対して１、２、３、４、５、６、７、８、９又は10の置換、付加又は欠失、例えば、X²及び/又はX⁴のアミノ酸配列のＮ-又はＣ-末端におけるアルギニンの付加を含んでなる。本発明によるアミノ酸配列に使用するアミノ酸は、Ｌ-型及び/又はＤ-型の両方であり得る。Ｌ-型及びＤ-型の両方とも同じペプチド配列内で異なるアミノ酸について使用し得ると理解すべきである。幾つかの実施形態において、ペプチド配列内のアミノ酸は、天然アミノ酸のようなＬ-型である。任意の既知の抗原を本発明による構築物で使用し得ると理解されるべきである。

【0027】

幾つかの具体的実施形態では、本発明によるアミノ酸配列のＮ-末端における最初の１、２又は３アミノ酸はＤ-型である。Ｎ-末端切り取り(trimming)及びそれによるペプチドの分解は、これら細胞透過性ペプチドのＮ-末端にＤ-型のアミノ酸を有することにより幾らか遅延すると推定される。或いは、又は幾つかの実施形態では、本発明によるアミノ酸配列のＮ-末端における最初の１、２又は３アミノ酸は、β又はγ型のアミノ酸である。βアミノ酸は、20の標準的な天然アミノ酸中のようなα炭素ではなく、むしろβ炭素に結合したアミノ基を有する。
或いは、本発明によるアミノ酸配列のＮ-末端における最初の１、２又は３アミノ酸は、フッ素の組込みにより改変され得る。或いは、環状アミノ酸又は他の適切な非天然アミノ酸が使用される。
ペプチドの「バリアント」又は「アナログ」とは、参照ペプチドと、代表的には天然型又は「親」ポリペプチドと実質的に同一であるアミノ酸配列を有するペプチドをいう。ペプチドバリアントは、天然型アミノ酸配列内の或る位置に１以上のアミノ酸置換、欠失及び/又は挿入を有していてもよい。

【0028】

「保存的」アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の物理化学的性質の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該分野において公知であり、塩基性側鎖を有するアミノ酸(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、非極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、β分枝側鎖を有するアミノ酸(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)及び芳香族側鎖を有するアミノ酸(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を含む。保存的アミノ酸置換の特定の形態は、遺伝子コードによってコードされる通常の20アミノ酸ではないアミノ酸での置換を含む。本発明の好適な実施形態は合成ペプチドの使用を包含するので、本明細書中に開示されたペプチドにおいてこのような「天然に存在しない」アミノ酸残基を提供することに問題はなく、よってアミノ酸残基の側鎖中の天然の飽和炭素鎖を、より短い又はより長い飽和炭素鎖と交換することが可能である−例えば、リジンは側鎖-(CH₂)_nNH₃(式中、ｎは４ではない)を有するアミノ酸で置換し得、アルギニンは側鎖(CH₂)_nNHC(=NH₂)NH₂(式中、ｎは３ではない)を有するアミノ酸で置換し得る、など。同様に、酸性アミノ酸であるアスパラギン酸及びグルタミン酸は側鎖-(CH₂)_nCOOH(式中、ｎ＞２)を有するアミノ酸残基で置換し得る。

【0029】

２つのアミノ酸配列に関して、用語「実質的に同一」は、該両配列が、最適に整列されたとき(例えばデフォルトのギャップウェイトを用いるプログラムGAP又はBESTFITにより)、少なくとも約50、少なくとも約60、少なくとも約70、少なくとも約80、少なくとも約90、少なくとも約95、少なくとも約98又は少なくとも約99パーセントの配列同一性を有することを意味する。１つの実施形態において、同一でない残基位置は保存的アミノ酸置換で異なる。配列同一性は、代表的には、配列分析ソフトウェアを使用して測定する。タンパク質分析ソフトウェアは、種々の置換、欠失及びその他の改変(保存的アミノ酸置換を含む)に割り当てられた類似性の尺度を使用して類似する配列を適合させる。例えば、公衆に利用可能なGCGソフトウェアは、デフォルトのパラメータで使用して、密接に関連するポリペプチド(例えば、異なる生物種からの相同ポリペプチド)間又は野生型タンパク質とそのムテインとの間の配列相同性又は配列同一性を決定することができる「Gap」及び「BestFit」のようなプログラムを含む。例えば、GCG Version 6.1を参照。ポリペプチド配列はまた、デフォルト又は推奨されるパラメータを適用してFASTA又はClustalWを用いて比較することができる。GCG Version 6.1.中のプログラムFASTA(例えば、FASTA2及びFASTA3)は、クエリー配列とサーチ配列との間で最良のオーバーラップ領域の整列(alignment)及びパーセント配列同一性を提供する(Pearson, Methods Enzymol. 1990;183:63-98；Pearson, Methods Mol. Biol. 2000;132:185-219)。配列を種々の生物からの多数の配列を含むデータベースと比較するとき又は推論するときに好適な別のアルゴリズムは、デフォルトパラメータを用いるコンピュータプログラムBLAST、特にblastpである。例えば、Altschulら，J. Mol. Biol. 1990;215:403-410；Altschulら，Nucleic Acids Res. 1997;25:3389-402(1997)(参照により本明細書中に組み込む)を参照。２つの実質的に同一のアミノ酸配列中の「対応する」アミノ酸位置は、本明細書中で言及したタンパク質分析ソフトウェアのいずれかにより(代表的には、デフォルトパラメータを用いて)整列させたときの位置である。

【0030】

「単離(した)」分子は、それが見出される組成物中で、それが属する分子クラスに関して優勢な種である分子である(すなわち、該分子は、該組成物中で分子タイプの少なくとも約50％を構成し、代表的には該組成物中の分子種(例えばペプチド)の少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％又はそれ以上を構成する)。通常、ペプチド分子の組成物は、該組成物中に存在する全てのペプチド種との関連ではペプチド分子に関して又は提案する使用との関連では少なくとも実質的に活性なペプチド種に関して、98％〜99％の同質性を示す。
本明細書中で使用する場合、用語「直鎖配列」とは、標準的なＮ-末端→Ｃ-末端方向で、標準的なペプチド結合により接続されたアミノ酸の具体的配列をいう。ペプチドはペプチド結合のみを含み得る。しかし、この用語は、配列内(例えばX³内)のアミノ酸が、ペプチド配列内の遠位(例えばX³内の遠位)の別のアミノ酸と、例えば側鎖により、接続されている可能性を排除しない。

【0031】

本発明に関して、「治療」又は「治療する(こと)」とは、文脈と矛盾しない限り、疾患又は障害の１以上の症状又は臨床的に関連する症状発現を予防し、緩和させ、管理し(managing)、治癒させ又は減少させることをいう。例えば、疾患又は障害の症状も臨床的に関連する症状発現も同定されていない患者の「治療」は、予防治療である一方、疾患又は障害の症状又は臨床的に関連する症状発現が同定されている患者の「治療」は、一般的には、予防治療を構成しない。
用語「抗原」は、免疫系の特異的に認識する成分(抗体、Ｔ細胞)によって認識される物質を指称する。
用語「免疫原」は、本発明に関しては、該免疫原を標的する適応免疫応答を個体において誘導し得る物質を指称するものとする。本発明との関連では、免疫原は、体液性及び/又は細胞媒介免疫応答を誘導する。換言すれば、免疫原は、免疫を誘導し得る抗原である。

【0032】

用語「エピトープ」、「抗原決定基」及び「抗原部位」は、本明細書中で互換可能に使用され、抗原又は免疫原中の、抗体によって認識される領域(抗体結合性エピトープの場合には、「Ｂ細胞エピトープ」として知られる)又はエピトープが主要組織適合複合体(MHC)分子と複合体化している場合にはＴ細胞レセプターにより認識される領域(Ｔ細胞レセプター結合性エピトープの場合には、すなわち「Ｔ細胞エピトープ」)を指称する。
用語「免疫原的有効量」は、当該分野における通常の意味を有する。すなわち、免疫原と免疫学的特徴を共有する病原因子と顕著に戦う(engage)免疫応答を誘導し得る該免疫原の量を意味する。
用語「ワクチン」は、免疫原を含んでなり、病的状態の発症リスクを減少させ得るか又は病的状態の治癒(又は少なくともその症状の緩和)に役立つ治療的に有効な免疫応答を誘導し得る免疫応答を誘導することができる組成物に使用される。

【0033】

用語「医薬的に許容され得る」は当該分野における通常の意味を有する。すなわち、この用語は、問題の疾患の治療時にヒトに使用される医薬の一部として受容され得る物質に使用される。よって、この用語は、事実上、治療対象者の状態を改善するというよりむしろ悪化させる高度に毒性の物質の使用を排除する。
「Ｔヘルパーリンパ球エピトープ」(T_Hエピトープ)は、MHCクラスII分子に結合し、該MHCクラスII分子に結合した抗原提示細胞(APC)の表面に提示され得るペプチドである。「免疫学的キャリア」は、一般には、１つ又は多くのT_Hエピトープを含み、それと組み合わされる抗原に対する免疫応答を、Ｔヘルパーリンパ球を確実に活性化し増殖させることによって増大させる物質である。公知の免疫学的キャリアの例は、破傷風及びジフテリア毒素並びにキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)である。

【0034】

本発明による骨格設計において、X²及びX⁴は、抗原に由来する８〜20アミノ酸のような８〜30アミノ酸の配列を規定する。抗原に由来するアミノ酸のこの配列は、本明細書中でエピトープと呼ばれ得る。
好ましくは、本発明による骨格で使用するエピトープはCTLエピトープである。「CTL誘導性ペプチド」は、CTL応答を誘導し得るHLAクラスＩ結合性ペプチドである。他の実施形態において、本発明による骨格設計で使用するエピトープはHTL誘導性ペプチドである。「HTL誘導性ペプチド」はHTL応答を誘導し得るHLAクラスII結合性ペプチドである。

【0035】

本明細書中で使用する場合、用語「塩基性アミノ酸」とは、Kice及びMarvell「Modern Principles of organic Chemsitry」(Macmillan, 1974)又はMatthews及びvan Holde「Biochemistry」Cummings Publishing Company, 1996に従って測定するときに6.3を超える(例えば7.4を超える)等電点を有する天然及び非天然の両方のアミノ酸を含む任意のアミノ酸をいう。この定義には、アルギニン、リジン、ホモアルギニン(Har)及びヒスチジン、並びにそれらの誘導体が含まれる。適切な非天然の塩基性アミノ酸は、例えば、米国特許第6,858,396号に記載されているとおりである。適切な正荷電アミノ酸には、Bachem AGから入手可能な非天然αアミノ酸が含まれ、α-アミノ-グリシン、α,γ-ジアミノ酪酸、オルニチン、α,β-ジアミノプロピオン酸、α-ジフルオロメチル-オルニチン、4-アミノ-ピペリジン-4-カルボン酸、2,6-ジアミノ-4-ヘキサン酸、β-(1-ピペラジニル)-アラニン、4,5-デヒドロ-リジン、δ-ヒドロキシ-リジン、ω-ヒドロキシ-ノルアルギニン、ホモアルギニン、ω-アミノ-アルギニン、ω-メチル-アルギニン、α-メチル-ヒスチジン、2,5-ジヨード-ヒスチジン、1-メチル-ヒスチジン、3-メチル-ヒスチジン、β-(2-ピリジル)-アラニン、β-(3-ピリジル)-アラニン、β-(2-キノリル)-アラニン、3-アミノ-チロシン、4-アミノ-フェニルアラニン及びスピナシン(spinacine)が挙げられる。更に、任意のモノ又はジカルボキシリックアミノ酸は適切な正荷電アミノ酸である。

【0036】

用語「中性アミノ酸」とは、本明細書で使用する場合、Kice及びMarvell「Modern Principles of organic Chemsitry」(Macmillan, 1974)に従って測定するときに4.8〜6.3の等電点を有するアミノ酸をいう。用語「酸性アミノ酸」とは、本明細書で使用する場合、Kice及びMarvell「Modern Principles of organic Chemsitry」(Macmillan, 1974)に従って測定するときに4.8を下回る等電点を有するアミノ酸をいう。
特に示さない限り、アミノ酸は当業者に公知の標準的な命名法により、例えば国際純正・応用化学連合(IUPAC)による「nomenclature and symbolism for amino acids and peptides」(www.iupac.org)に準拠して、略号化され、言及される。
シトルリン(本明細書では一文字表記で「Ｂ」とされる)及び/又はホモシトルリンは、周知の非天然アミノ酸であり、幾つかの実施形態において、X¹、X³又はX⁵により規定される配列で使用し得る。

【0037】

別の代替の実施形態において、トリプトファン又はトリプトファン誘導体が、X¹、X³又はX⁵により規定される配列で使用される。任意の適切なトリプトファン誘導体を使用し得る。本明細書中で使用する場合、「トリプトファン誘導体」は、トリtert.-ブチルトリプトファン、ジ-tert-ブチルトリプトファン、7-ベンジルオキシトリプトファン、ホモトリプトファン、5'-アミノエチルトリプトファン(RSP Amino Acids Analogues Inc, Boston, Mass., USAから側鎖Boc及びN-α FMOC誘導体として入手可能)、N-アセチルホモトリプトファン(Toronto Research)、7-ベンジルオキシトリプトファン(Toronto Research)、ホモトリプトファン(Toronto Research)及びインドール環の１-位、２-位、５-位及び/又は７-位(１-位又は２-位が好適である)で置換されたトリプトファン残基(例えば、5'ヒドロキシトリプトファン)のような米国特許第7,232,803号に開示のものを含む非天然の修飾トリプトファンアミノ酸残基を意味する。
用語「抗体応答」とは、興味対象の抗原に結合する抗体(例えば、IgM、IgA、IgG)の産生をいう。この応答は、例えば、抗原ELISAにより血清をアッセイすることにより測定される。

【0038】

用語「アジュバント」とは、本明細書で使用する場合、抗原と一緒に又は同時に送達されるとき、当該抗原に対する免疫応答を非特異的に増強する任意の化合物をいう。例示のアジュバントとしては、水中油及び油中水アジュバント、アルミナ-ベースのアジュバント(例えば、AIOH、AIPO4など)及びMontanide ISA 720が挙げられるが、これらに限定されない。
用語「患者」及び「対象者」とは、本発明の方法を使用して治療し得る哺乳動物をいう。
本明細書で使用する場合、用語「免疫応答」とは、抗原に応答する、生物の免疫系の反応性をいう。脊椎動物では、これには、抗体産生、細胞媒介免疫の誘導及び/又は補体活性化(例えば、微生物による感染の脊椎動物免疫系による予防及び解決に関係する現象)が含まれ得る。好適な実施形態において、用語 免疫応答は、「リンパ球増殖応答」、「サイトカイン応答」及び「抗体応答」の１つ以上を包含するが、これらに限定されない。

【0039】

ペプチド配列に言及して本明細書で使用する用語「正味電荷」は、ペプチド配列中の各個のアミノ酸の電荷の総和により表されるペプチド配列の総電荷をいう。各塩基性アミノ酸には＋１の電荷が与えられ、各酸性アミノ酸には−１の電荷が与えられ、各中性アミノ酸には０の電荷が与えられる。したがって、正味電荷は荷電アミノ酸の数及び正体(identity)に依存する。

【0040】

【表1-1】

【0041】

【表1-2】

【0042】

【表1-3】

【0043】

【表1-4】

【0044】

本明細書中で使用する場合、１文字表記「Ｚ」とは非天然アミノ酸ノルロイシンをいう。

【0045】

【表2】

本明細書中で使用する場合、１文字表記「Ｚ」とは非天然アミノ酸ノルロイシンをいう。

【0046】

抗原
本発明での使用のためのウイルス抗原の例としては、例えば、HIV、HCV、CMV、HPV、インフルエンザ、アデノウイルス、レトロウイルス、ピコルナウイルスなどが挙げられるが、これらに限定されない。レトロウイルス抗原の非限定例としては、例えば、gag、pol及びenv遺伝子の遺伝子産物、Nefタンパク質、逆転写酵素及び他のHIV成分のようなヒト免疫不全ウイルス(HIV)抗原に由来するレトロウイルス抗原；Ｂ型肝炎ウイルスのＳ、Ｍ及びＬタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスのプレ-Ｓ抗原及び他の肝炎ウイルス成分、例えば、Ａ型、Ｂ型及びＣ型肝炎ウイルス成分(例えばＣ型肝炎ウイルスRNA)のような肝炎ウイルス抗原に由来するレトロウイルス抗原；ヘマグルチニン及びノイラミニダーゼ並びに他のインフルエンザウイルス成分のようなインフルエンザウイルス抗原に由来するレトロウイルス抗原；麻疹ウイルス融合タンパク質及び他の麻疹ウイルス成分のような麻疹ウイルス抗原に由来するレトロウイルス抗原；タンパク質El及びE2並びに他の風疹ウイルス成分のような風疹ウイルス抗原に由来するレトロウイルス抗原；VP7sc及び他のロタウイルス成分のようなロタウイルス抗原に由来するレトロウイルス抗原；エンベロープ糖タンパク質Ｂ及び他のサイトメガロウイルス抗原成分のようなサイトメガロウイルス抗原に由来するレトロウイルス抗原；RSV融合タンパク質、M2タンパク質及び他の呼吸器合胞体ウイルス抗原成分のような呼吸器合胞体ウイルス抗原に由来するレトロウイルス抗原；前初期タンパク質、糖タンパク質Ｄ及び他の単純ヘルペスウイルス抗原成分のような単純ヘルペスウイルス抗原に由来するレトロウイルス抗原；gpl、gpll及び他の水痘帯状疱疹ウイルス抗原成分のような水痘帯状疱疹ウイルス抗原に由来するレトロウイルス抗原；タンパク質Ｅ、M-E、M-E-NSl、NSl、NS1-NS2A、80%E及び他の日本脳炎ウイルス抗原成分のような日本脳炎ウイルス抗原に由来するレトロウイルス抗原；狂犬病糖タンパク質、狂犬病核タンパク質及び他の狂犬病ウイルス抗原成分のような狂犬病ウイルス抗原に由来するレトロウイルス抗原が挙げられる。ウイルス抗原の更なる例については、Fundamental Virology、第２版、Fields, B. N.及びKnipe, D. M.編(Raven Press、New York、1991)を参照。

【0047】

本発明による骨格設計に組み込まれるべきエピトープは、アデノウイルス、レトロウイルス、ピコルナウイルス、ヘルペスウイルス、ロタウイルス、ハンタウイルス、コロナウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、オルソミクソウイルス、ブンヤウイルス、アレナウイルス、レオウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス、ポックスウイルス、ヘパドナウイルス、又は海綿状ウイルスに由来し得る。或る特定の非制限例において、ウイルス抗原は、HIV、CMV、Ａ型、Ｂ型及びＣ型肝炎、インフルエンザ、麻疹、ポリオ、天然痘、風疹；呼吸器合胞体、単純ヘルペス、水痘帯状疱疹、エプスタイン-バー、日本脳炎、狂犬病、インフルエンザ及び/又は風邪ウイルスの少なくとも１つから得られるペプチドである。

【0048】

HCV：
本発明によるペプチドは既知の抗原を含んでなり得る。HCVに由来する抗原については、これら抗原は、Ｃ型肝炎ウイルス(HCV)のコア、E1、E2、P7、NS2、NS3、NS4(NS4A及びNS4B)及びNS5(NS5A及びNS5B)タンパク質に由来し得る。エピトープは、免疫した宿主においてHLAクラスＩ及び/又はクラスII制限Ｔリンパ球応答を誘発するものである。本発明のより具体的なHLAクラスＩ制限ペプチドは、以下のHLAクラスＩ群：HLA-A^*01、HLA-A^*02、HLA-A^*03、HLA-A^*11、HLA-A^*24、HLA-B^*07、HLA-B^*08、HLA-B^*35、HLA-B^*40、HLA-B^*44、HLA-Cw3、HLA-Cw4、HLA-Cw6又はHLA-Cw7の少なくとも１つのHLA分子に結合し得る。本発明のHLAクラスII制限ペプチドは、以下のHLAクラスII群：HLA-DRB1、-DRB2、-DRB3、-DRB4、-DRB5、-DRB6、-DRB7、-DRB8又は-DRB9の少なくとも１つのHLA分子に結合し得る。

【0049】

本発明に従ってエピトープとして使用し得るMHC結合性HCVペプチドは、例えば、WO02/34770(Imperial College Innovations Ltd)、WO01/21189及びWO02/20035(Epimmune)、WO04/024182(Intercell)、WO95/25122(The Scripps Research Institute)、WO95/27733(Government of the USA、Department of Health and Human Services)、EP 0935662(Chiron)、WO02/26785(Immusystems GmbH)、WO95/12677(Innogenetics N.V)、WO97/34621(Cytel Corp)及びEP 1652858(Innogenetics N.V.)に開示されている。
他の実施形態において、本発明による骨格設計は、PADREペプチド、例えばWO95/07707(Epimmune)(この内容は参照により本明細書に取り込まれる)に開示されているPADREと呼ばれるユニバーサルＴ細胞エピトープを含んでなる。「PanDR結合性ペプチド又はPADREペプチド」は、１より多いHLAクラスII DR分子に結合する分子ファミリーのメンバーである。PADREはほとんどのHLA-DR分子に結合し、インビトロ及びインビボでヒトヘルパーＴリンパ球(HTL)応答を刺激する。或いは、破傷風毒素のような、普遍的に使用されるワクチンからのＴ-ヘルパーエピトープが使用され得る。

【0050】

更なる実施形態において、組成物中のペプチド又はポリエピトープ性ペプチドは、HCVタンパク質に由来すること、より特定的にはコア、E1、E2/NS1、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A及びNS5Bからなる群より選択される少なくとも１つのHCV領域に由来することを特徴とする。ペプチドは遺伝子型１a、1b及び/又は3aのHCVコンセンサス配列に存在することを特徴とすることが、尚更に好適である。
本発明に従ってエピトープとして使用し得る他のHLAクラスＩ及びII結合性ペプチドは、WO03/105058(Algonomics)に記載の方法、WO01/21189においてEpimmuneにより記載された方法及び/又は３つの公開データベース予知サービスSyfpeithi、BIMAS及びnHLAPredにより同定され得る。各ペプチドを、多反復のように同一ペプチド又は任意の他のペプチド若しくはエピトープとの組合せで本発明の骨格設計で使用し得ることもまた本発明の１つの観点である。

【0051】

CMV：
本発明による骨格設計に組み込むべきエピトープは、サイトメガロウイルス(CMV)に由来し得、CMV糖タンパク質gB及びgHを含み得る。

【0052】

インフルエンザ：
本発明による骨格設計に組み込むべきエピトープは、H1N1、H2N2又はH3N2のようなサブグループの各々についてのインフルエンザヘマグルチニン(HA)又はインフルエンザノイラミニダーゼ(NA)、核タンパク質(NP)、M1、M2、NS1、NEP、PA、PB1、PB1-F2、PB2のフラグメント又は一部分に由来し得る。

【0053】

適切なエピトープは、１以上のサブタイプのHAタンパク質(H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15又はH16を含む)又はそれらのフラグメント若しくは一部分に由来し得る。このようなHAタンパク質を含むサブタイプの例としては、A/New Caledonia/20/99(H1N1)、A/Indonesia/5/2006(H5N1)、A/chicken/New York/1995、A/herring gull/DE/677/88(H2N8)、A/Texas/32/2003、A/mallard/MN/33/00、A/duck/Shanghai/1/2000、A/northern pintail/TX/828189/02、A/Turkey/Ontario/6118/68(H8N4)、A/shoveler/Iran/G54/03、A/chicken/Germany/N/1949(H10N7)、A/duck/England/56(H11N6)、A/duck/Alberta/60/76(H12N5)、A/Gull/Maryland/704/77(H13N6)、A/Mallard/Gurjev/263/82、A/duck/Australia/341/83(H15N8)、A/black-headed gull/Sweden/5/99(H16N3)、B/Lee/40、C/Johannesburg/66、A/PuertoRico/8/34(H1N1)、A/Brisbane/59/2007(H1N1)、A/Solomon Islands 3/2006(H1N1)、A/Brisbane 10/2007(H3N2)、A/Wisconsin/67/2005(H3N2)、B/Malaysia/2506/2004、B/Florida/4/2006、A/Singapore/1/57(H2N2)、A/Anhui/1/2005(H5N1)、A/Vietnam/1194/2004(H5N1)、A/Teal/HongKong/W312/97(H6N1)、A/Equine/Prague/56(H7N7)、A/HongKong/1073/99(H9N2))が挙げられる。

【0054】

本発明の幾つかの実施形態において、HAタンパク質は、H1、H2、H3、H5、H6、H7又はH9サブタイプであり得る。他の実施形態において、H1タンパク質は、A/New Caledonia/20/99(H1N1)、A/PuertoRico/8/34(H1N1)、A/Brisbane/59/2007(H1N1)又はA/Solomon Islands 3/2006(H1N1)系統に由来し得る。H3タンパク質はまた、A/Brisbane 10/2007(H3N2)又はA/Wisconsin/67/2005(H3N2)系統に由来し得る。他の実施形態において、H2タンパク質は、A/Singapore/1/57(H2N2)系統に由来し得る。H5タンパク質は、A/Anhui/1/2005(H5N1)、A/Vietnam/1194/2004(H5N1)又はA/Indonesia/5/2005系統に由来し得る。他の実施形態において、H6タンパク質はA/Teal/HongKong/W312/97(H6N1)系統に由来し得る。H7タンパク質はA/Equine/Prague/56(H7N7)系統に由来し得る。他の実施形態において、H9タンパク質はA/HongKong/1073/99(H9N2)系統に由来する。他の実施形態において、HAタンパク質は、B/Malaysia/2506/2004又はB/Florida/4/2006を含むＢ型ウイルスであり得るインフルエンザウイルスに由来し得る。インフルエンザウイルスHAタンパク質はH5 Indonesiaであり得る。

【0055】

ヒト免疫不全ウイルス(HIV)：
HIVについて、本発明による骨格設計に組み込むべきエピトープは、種々の遺伝子サブタイプのメンバーを含むHIVに由来するgp120、gp160、gp41、p24gag又はp55gagからなる群に由来し得る。

【0056】

ヒトパピローマウイルス(HPV)：
HPVについて、本発明による骨格設計に組み込むべきエピトープは、E1、E2、E3、E4、E6及びE7、L1及びL2タンパク質からなる群に由来し得る。エピトープは、タイプ８、11、16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58及び59を含む任意のタイプに由来し得る。

【0057】

キャリア、アジュバント及びビヒクル − 送達
本発明による単離された細胞透過性ペプチドは、種々の手段により、種々の組成物(これらは、本明細書中で、「組成物」、「ワクチン組成物」又は「医薬組成物」と呼ぶ)中で送達され得る。本発明のペプチド並びに本発明の医薬及びワクチン組成物は、ウイルス感染の治療及び/又は予防のための、哺乳動物、特にヒトへの投与に有用である。本発明のペプチドを含むワクチン組成物は、特定の抗原に対する免疫応答を惹起することによって当該患者自身の免疫応答能力を増強するために、問題のウイルスに感染した患者、又はウイルス感染に罹患し易いかそうでなければウイルス感染のリスクにある個体に投与される。
当該分野において認識されている種々の送達システムが、適切な細胞へペプチドを送達するために使用され得る。ペプチドは、医薬的に許容され得るキャリア中又はコロイド懸濁物として、又は粉体として、希釈剤を伴って又は伴わずに送達することができる。これらは、「裸(naked)」であるか又は送達ビヒクルとの組合せであり得、当該分野で公知の送達システムを用いて送達され得る。

【0058】

「医薬的に許容され得るキャリア」又は「医薬的に許容され得るアジュバント」は、それ自体は該組成物を投与される個体に対して有害な抗体の産生を誘導せず、保護も惹起しない任意の適切な賦形剤、希釈剤、キャリア及び/又はアジュバントである。好ましくは、医薬的に許容され得るキャリア又はアジュバントは、抗原により惹起された免疫応答を増強する。適切なキャリア又はアジュバントは、代表的には、以下の不完全なリストに挙げられる１以上の化合物を含んでなる：タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー及び不活性ウイルス粒子のような、緩徐に代謝される大きな高分子；水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム(国際特許出願公開第WO93/24148を参照)、ミョウバン(KAl(SO4)2.12H2O)又はこれらの１つと3-0-脱アシル化モノホスホリルリピドＡ(国際特許出願公開第WO93/19780号を参照)との組合せ；N-アセチル-ムラミル-L-スレオニル-D-イソグルタミン(米国特許第4,606,918号を参照)、N-アセチル-ノルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミン、N-アセチルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミル-L-アラニン2-(1',2'-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ヒドロキシホスホリルオキシ)エチルアミン；RIBI(ImmunoChem Research Inc.、Hamilton、MT、USA)、これは、２％スクアレン/Tween 80エマルジョン中にモノホスホリルリピドＡ(すなわち、無毒化エンドトキシン)、トレハロース-6,6-ジミコレート及び細胞壁骨格(MPL＋TDM＋CWS)を含む。３成分MPL、TDM又はCWSは単独でも、２つずつの組合せでも用い得る；Stimulon(Cambridge Bioscience、Worcester、MA、USA)、SAF-1(Syntex)のようなアジュバント；QS21と3-デ-O-アセチル化モノホスホリルリピドＡとの組合せ(国際出願第WO94/00153号を参照)(これは更に、代謝可能油及びサポニン又は代謝可能油、サポニン及びステロールを含んでなる油中水エマルジョン(例えば、国際出願第WO95/17210号、同第WO97/01640号及び同第WO9856414号を参照)又はサイトカイン(国際出願第WO98/57659号を参照)を補充され得る)のようなアジュバント；MF-59(Chiron)又はポリ[ジ(カルボキシラトフェノキシ)ホスファゼン]ベースのアジュバント(Virus Research Institute)のようなアジュバント；Optivax(Vaxcel、Cytrx)のようなブロックコポリマーベースのアジュバント、又はAlgammulin及びGammalnulin(Anutech)のようなイヌリンベースのアジュバント；完全又は不完全フロイントアジュバント(それぞれCFA又はIFA)又はGerbu調製物(Gerbu Biotechnik)；QuilAのようなサポニン、QS21、QS7又はQS17、エスシン又はジギトニンのような精製サポニン；[プリン-プリン-CG-ピリミジン-ピリミジン]オリゴヌクレオチドのような非メチル化CpGジヌクレオチドを含んでなる免疫刺激性オリゴヌクレオチド。これら免疫刺激性オリゴヌクレオチドには、CpGクラスＡ、Ｂ及びＣ分子(Coley Pharmaceuticals)、ISS(Dynavax)、Immunomers(Hybridon)が含まれる。免疫刺激性オリゴヌクレオチドはまた、例えばRiedlら(2002)；Immune Stimulating Complexes comprising saponinsにより記載されるようなカチオン性ペプチド、例えば、Quil A(ISCOMS)と組み合わせ得る；水、生理食塩水、グリセロール、エタノール、イソプロピルアルコール、DMSO、湿潤剤又は乳化剤、pH緩衝化物質、防腐剤などのような本来的に非毒性及び非治療性である、賦形剤及び希釈剤；例えば１〜10％又は2,5〜５％の濃度のスクアラン、スクアレン、エイコサン、テトラテトラコンタン、グリセロール、ピーナッツ油、植物油のような生分解性及び/又は生体適合性の油；ビタミンＣ(アスコルビン酸又はその塩若しくはエステル)、ビタミンＥ(トコフェロール)又はビタミンＡのようなビタミン；カロテノイド、又は天然若しくは合成のフラバノイド；セレンのような微量元素；Barton及びMedzhitov(2002)で概説されるような任意のToll-様レセプターリガンド。

【0059】

3-デ-O-アセチル化モノホスホリルリピドＡを含んでなる任意の前記アジュバントにおいて、該3-デ-O-アセチル化モノホスホリルリピドＡは、小粒子を形成していてもよい(国際出願第WO94/21292号を参照)。
任意の前記アジュバントにおいて、MPL又は3-デ-O-アセチル化モノホスホリルリピドＡは、RC-529と呼ばれる合成アナログ又は他の任意のアミノ-アルキルグルコサミニド4-ホスフェート(Johnsonら，1999、Persingら，2002)で置き換えることができる。或いは、OM-197(Bylら，2003)のような他のリピドＡアナログで置き換えることができる。

【0060】

「医薬的に許容され得るビヒクル」は、水、生理食塩水、生理学的な塩溶液、グリセロール、エタノールなどのようなビヒクルを含む。湿潤剤又は乳化剤、pH緩衝化物質、防腐剤のような補助的な物質を、そのようなビヒクルに含ませ得る。当該分野で公知の送達システムは、例えばリポペプチド、ポリ-DL-ラクチド-コ-グリコリド(「PLG」)中にカプセル化されたペプチド組成物、ミクロスフェア、免疫刺激複合体(ISCOMS)に含まれるペプチド組成物、多抗原ペプチドシステム(MAPs)、ウイルス送達ベクター、ウイルス又は合成起源の粒子、アジュバント、リポソーム、脂質、微粒子又は微小カプセル、金粒子、ナノ粒子、ポリマー、縮合剤、多糖、ポリアミノ酸、デンドリマー、サポニン、QS21、吸着増強材、脂肪酸、又は裸若しくは粒子に吸着させたcDNAである。
代表的には、ワクチン又はワクチン組成物は、液体溶液又は懸濁液としての注射液として調製される。注射は、皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内、髄腔内、皮内又は表皮内であり得る。他のタイプの投与は、エレクトロポレーション、移植、坐剤、経口摂取、腸管適用、吸入、エーロゾル適用又は鼻スプレー又は点鼻を含む。注射前に液体ビヒクルに溶解又は懸濁するに適切な固体形態でも調製され得る。調製物はまた、アジュバント効果を増強するために、リポソーム中にカプセル化されるか又は乳化され得る。

【0061】

液体製剤は、油、ポリマー、ビタミン、炭水化物、アミノ酸、塩、緩衝剤、アルブミン、界面活性剤又は充填剤を含み得る。好ましくは、炭水化物としては、単糖、二糖、三糖、オリゴ糖若しくは多糖のような糖若しくは糖アルコール又は水溶性グルカンが挙げられる。糖又はグルカンは、フルクトース、デキストロース、ラクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、スクロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、α及びβシクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプン及びカルボキシメチルセルロース又はそれらの混合物を含むことができる。スクロースが最も好ましい。「糖アルコール」は、-OH基を有するC4〜C8炭化水素として定義され、ガラクティトール、イノシトール、マンニトール、キシリトール、ソルビトール、グリセロール及びアラビトールを含む。マンニトールが最も好ましい。これら上記糖又は糖アルコールは、個々に又は組合せで使用し得る。糖又は糖アルコールが水性調製物に可溶である限り、使用する量に定められた限度はない。好ましくは、糖又は糖アルコールの濃度は、1,0％(w/v)〜7,0％(w/v)、より好ましくは2,0〜6,0％(w/v)である。好ましくは、アミノ酸には、左旋(Ｌ)型のカルニチン、アルギニン及びベタインが含まれる；しかし、他のアミノ酸も加え得る。好適なポリマーには、平均分子量2,000〜3,000のポリビニルピロリドン(PVP)又は平均分子量3,000〜5,000のポリエチレングリコール(PEG)が含まれる。凍結乾燥前又は再構成後に溶液中のpH変化を最小化するために組成物中に緩衝剤を使用することもまた好適である。任意の生理学的緩衝剤を使用し得るが、シトレート、ホスフェート、スクシネート及びグルタメート緩衝剤又はそれらの混合物が好ましい。最も好適な緩衝剤はシトレート緩衝剤である。好ましくは、濃度は0,01〜0,3モルである。製剤に添加し得る界面活性剤は、欧州特許出願EP 0 270 799及びEP 0 268 110に示されている。

【0062】

追加的に、ポリペプチドは、ポリマーとの共有接合により、例えば循環半減期を増大させるように、化学的に改変することができる。それらをペプチドに付着させるための好適なポリマー及び方法は、米国特許第4,766,106号；同第4,179,337号；同第4,495,285号；及び同第4,609,546号に示されている。好適なポリマーはポリオキシエチル化ポリオール及びポリエチレングリコール(PEG)である。PEGは室温で水に可溶であり、下記の一般式を有する：
R(O-CH2-CH2)nO-R
(式中、Ｒは、水素、又はアルキル若しくはアルカノール基のような保護基で有り得る。好ましくは、保護基は１〜８炭素を有し、より好ましくはメチルである。記号ｎは正の整数であり、好ましくは１〜1.000、より好ましくは２〜500である。PEGは、好適な平均分子量1000〜40.000、より好ましくは2000〜20.000、最も好ましくは3.000〜12.000を有する。好ましくは、PEGは少なくとも１つのヒドロキシ基を有し、ヒドロキシ基はより好ましくは末端ヒドロキシ基である。このヒドロキシ基が好ましくは活性化されている。しかし、反応基のタイプ及び量は共有結合PEG/ポリ本発明のペプチドを達成するように変化させ得ることが理解される。

【0063】

水溶性ポリオキシエチル化ポリオールもまた本発明において有用である。これらには、ポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、ポリオキシエチル化グリセロール(POG)などが含まれる。POGが好ましい。１つの理由は、ポリオキシエチル化グリセロールのグリセロール骨格が、モノ-、ジ-、トリ-グリセリドにおいて、例えば動物及びヒトで天然に存在する骨格と同じであるからである。したがって、この分岐分子は、身体において必ずしも外来因子として見られない。POGは、PEGと同じ範囲の好適な分子量を有する。POGの構造はKnaufら，1988に示されており、POG/IL-2接合体の議論は米国特許第4,766,106号に見出される。

【0064】

循環半減期を増大させる別の薬物送達システムはリポソームである。本発明のペプチド及び核酸はまた、ペプチド及び核酸組成物の半減期を増大させると共に、リンパ組織のような特定の組織を標的するか又は感染細胞を選択的に標的するために働くリポソームを介して投与され得る。リポソームとしては、エマルジョン、フォーム、ミセル、不溶性単分子膜、液晶、リン脂質分散物、ラメラ層などが挙げられる。これらの調製物において、送達すべきペプチド又は核酸は、リポソームの一部として組み込まれるか、或いは単独で又はリンパ様細胞で優勢なレセプターに結合する分子(例えば、CD45抗原に結合するモノクローナル抗体)若しくは他の治療若しくは免疫原性組成物との組合せで埋め込まれる。よって、本発明の所望のペプチド又は核酸を充填されるか又はこれらで装飾されたリポソームは、リンパ球様細胞の部位(ここに、リポソームはペプチド及び核酸組成物を送達する)に指向させ得る。本発明による使用のためのリポソームは、標準的なベシクル形成性脂質(一般には中性及び負に荷電したリン脂質及びコレステロールのようなステロールが含まれる)から形成される。脂質の選択は、一般には、例えば、リポソームサイズ、酸不安定性及び血流中でのリポソームの安定性の考慮を指針にする。例えば、Szokaら，1980、及び米国特許第4,235,871号、同第4,501,728号、同第4,837,028号及び同第5,019,369号に記載のような種々の方法がリポソームの調製に利用可能である。

【0065】

免疫系の細胞を標的するためには、リポソームに組み込むべきリガンドとしては、例えば、所望の免疫系細胞の細胞表面決定基に特異的な抗体又はそのフラグメントを挙げることができる。ペプチドを含有するリポソーム懸濁液は、静脈内に、局所的に、局部的になどで、とりわけ投与様式、送達されるペプチド及び治療される疾患のステージに従って変化する用量にて投与され得る。例えば、免疫原性ポリペプチドを有するリポソームは、インビボでCTL応答を惹起することが知られている(Reddyら，1992；Collinsら，1992；Friesら，1992；Nabelら，1992)。
液体医薬組成物は、調製後、好ましくは凍結乾燥して、分解を予防し、無菌性を保存する。液体組成物を凍結乾燥する方法は当業者に公知である。使用の直前に、組成物は、追加の成分を含んでいてもよい滅菌希釈剤(例えば、リンゲル液、蒸留水又は滅菌生理食塩水)で再構成され得る。再構成に際して、組成物は、好ましくは、当業者に公知である方法を用いて、対象者に投与され得る。

【0066】

免疫応答を評価するためのペプチドの使用
本発明によるペプチドは診断試薬として使用し得る。例えば、本発明のペプチドは、ペプチド又は関連ペプチドを用いる治療レジメンに対する特定個体の感受性を決定するために使用し得、よって罹患個体について現行の治療プロトコールの改変又は予後の決定の助けとなり得る。加えて、ペプチドはまた、どの個体が慢性ウイルス感染を発症する実質的リスクを生じるかを予知するために使用し得る。
したがって、本発明は、対象者が１以上の本発明によるペプチドに対する免疫応答を有するかどうかを決定する工程を含んでなる、ウイルスに曝された対象者に関する転帰を決定する方法に関する。

【0067】

本発明の好適な実施形態において、本明細書に記載のようなペプチドは、免疫応答を評価する試薬として使用することができる。評価すべき免疫応答は、免疫原として、前記試薬として用いるペプチドを認識しこれに結合する抗原-特異的CTL又はHTLの産生をもたらし得る任意の因子を使用することによって誘導することができる。ペプチド試薬は、免疫原として使用される必要はない。このような分析に使用することができるアッセイ系には、テトラマー、細胞内リンホカイン用の染色及びインターフェロン放出アッセイ又はELISPOTアッセイのような比較的最近の技術開発品が含まれる。

【0068】

例えば、本発明のペプチドは、抗原又は免疫原の曝露後の抗原-特異的CTLの存在に関して末梢血単核細胞を評価するテトラマー染色アッセイにおいて使用し得る。HLA-四量体複合体は、抗原-特異的CTLを直接可視化するため(例えば、Oggら，1998；及びAltmanら，1996を参照)及び末梢血単核細胞サンプル中の抗原-特異的CTL集団の頻度を決定するために使用される。本発明のペプチドを用いるテトラマー試薬は、以下のように作製され得る：HLA分子に結合するペプチドは、対応するHLA重鎖及びβ2-ミクログロブリンの存在下でリフォールドして三分子複合体を生じる。この複合体は、事前に遺伝子工学的操作によりタンパク質中に組み込まれた部位にて重鎖のカルボキシ末端部でビオチン化される。その後、ストレプトアビジンの添加によりテトラマー形成が誘導される。蛍光標識したストレプトアビジンを用いて、テトラマーを、抗原-特異的細胞を染色するために使用する。次いで、例えばフローサイトメトリにより、細胞を同定し得る。このような分析は、診断又は予後目的に使用し得る。この手順により同定された細胞はまた、治療目的にも使用することができる。テトラマーの代替物として、ペンタマー又はダイマーも使用することができる(Current Protocols in Immunology(2000) unit 17.2 supplement 35)。

【0069】

本発明のペプチドはまた、免疫リコール応答を評価する試薬として使用し得る(例えば、Bertoniら，1997及びPermaら，1991を参照)。例えば、特異ペプチドを用いて、HCV感染個体からの患者PBMCサンプルを抗原-特異的CTL又はHTLの存在について分析し得る。PBMCを培養し、本発明のペプチドで細胞を刺激することにより単核細胞を含む血液サンプルを評価し得る。適切な培養期間後、拡大した細胞集団を、例えば細胞傷害(CTL)活性又はHTL活性について分析し得る。
ペプチドはまた、ワクチンの効力を評価する試薬として使用し得る。

【0070】

免疫原をワクチン接種した患者から得たPBMCを、例えば上記方法のいずれかを用いて分析し得る。患者はHLAタイプを決定され、当該患者に存在する対立遺伝子-特異的分子を認識するペプチドエピトープ試薬が、この分析のために選択される。ワクチンの免疫原性は、PBMCサンプル中のエピトープ-特異的CTL及び/又はHTLの存在によって示される。
本発明のペプチドはまた、当該分野において周知の技法を用いて、抗体を作製するために使用され得る(例えば、CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY、Wiley/Greene、NY；及びAntibodies A Laboratory Manual、Harlow and Lane、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989を参照)。このような抗体には、HLA分子との関連でペプチドを認識するもの、すなわちペプチド-MHC複合体に結合する抗体が含まれる。

【0071】

本発明の具体的実施形態
本発明は、下記の構造：
X¹-X²-X³-X⁴-X⁵ (式Ｉ)
(式中、X¹及びX³は、独立して、任意の塩基性アミノ酸、シトルリン、トリプトファン又はそれらの誘導体から独立して選択される１、２、３又は４アミノ酸の直鎖配列を規定し；X²は抗原に由来する８〜30アミノ酸の直鎖配列を規定し；X⁴は、前記抗原に由来する８〜30アミノ酸の直鎖配列であって、X²とは異なる配列を規定し；X⁵は、随意に存在してもよい、塩基性アミノ酸、シトルリン、トリプトファン又はそれらの誘導体から選択される任意の１つのアミノ酸である)
を含んでなる単離された細胞透過性ペプチドに関する。

【0072】

幾つかの具体的実施形態において、X⁴の配列はX²の配列と同一である。
幾つかの実施形態において、単離された細胞透過性ペプチドは合計で60を超えないアミノ酸を有する。
幾つかの実施形態において、X¹は、任意の塩基性アミノ酸、トリプトファン又はそれらの誘導体から独立して選択される１、２、３又は４アミノ酸の直鎖配列を規定する。
幾つかの実施形態において、X¹は、１つのシトルリンと、任意の塩基性アミノ酸、トリプトファン又はそれらの誘導体から独立して選択される１、２又は３アミノ酸との任意の順序での直鎖配列を規定する。
幾つかの実施形態において、X³は、任意の塩基性アミノ酸から独立して選択される１、２、３又は４アミノ酸の直鎖配列を規定する。

【0073】

幾つかの実施形態において、X¹は、任意の塩基性アミノ酸から独立して選択される１、２、３又は４アミノ酸の直鎖配列を規定する。
幾つかの実施形態において、X³は、１つのシトルリンと、任意の塩基性アミノ酸から独立して選択される１、２又は３アミノ酸との任意の順序での直鎖配列を規定する。
幾つかの実施形態において、請求項１に規定される式ＩのX²-X³-X⁴により規定されるアミノ酸配列は、前記抗原の天然型配列中に見出されない。
幾つかの実施形態において、請求項１に規定される式ＩのX¹-X²-X³-X⁴により規定されるアミノ酸配列は、前記抗原の天然型配列中に見出されない。
幾つかの実施形態において、請求項１に規定される式ＩのX¹-X²-X³-X⁴-X⁵により規定されるアミノ酸配列は、前記抗原の天然型配列中に見出されない。

【0074】

幾つかの実施形態において、ペプチドは、実施例１に記載されるペプチドのビオチン化に基づくアッセイにおいて、形質膜を横切って転位することが証明される。
幾つかの実施形態において、任意の塩基性アミノ酸、シトルリン、トリプトファン又はそれらの誘導体から独立して選択される１、２、３又は４アミノ酸は、塩基性アミノ酸である。
幾つかの実施形態において、任意の塩基性アミノ酸、シトルリン、トリプトファン又はそれらの誘導体から独立して選択される１、２、３又は４アミノ酸は、トリプトファン又はその誘導体である。
幾つかの実施形態において、任意の塩基性アミノ酸、シトルリン、トリプトファン又はそれらの誘導体から独立して選択される１、２、３又は４アミノ酸は、シトルリン又はその誘導体である。

【0075】

幾つかの実施形態において、塩基性アミノ酸、シトルリン、トリプトファン又はそれらの誘導体から選択される随意に存在してもよい１つのアミノ酸は、Arg、Lys及びHis.B)から選択される。
幾つかの実施形態において、塩基性アミノ酸、シトルリン、トリプトファン又はそれらの誘導体から選択される随意に存在してもよい１つのアミノ酸は、トリプトファン又はその誘導体である。
幾つかの実施形態において、塩基性アミノ酸、シトルリン、トリプトファン又はそれらの誘導体から選択される随意に存在してもよい１つのアミノ酸は、シトルリン又はその誘導体である。
幾つかの実施形態において、X²及び/又はX⁴は、前記抗原の天然型配列と同一の配列を規定する。

【0076】

幾つかの実施形態において、ペプチドはＴリンパ球応答を誘導し得る。
幾つかの実施形態において、ペプチドは、CD4+及び/又はCD8+ Ｔリンパ球応答を誘導し得る。
幾つかの実施形態において、抗原は、キャプシドタンパク質のようなウイルスタンパク質である。
幾つかの実施形態において、ウイルスタンパク質は、コアタンパク質のようなＣ型肝炎ウイルスのタンパク質；M2タンパク質のようなインフルエンザウイルスのタンパク質から選択される。
幾つかの実施形態において、Ｃ型肝炎ウイルスのウイルスタンパク質は、サブタイプ1a及び1bのような遺伝子型１、サブタイプ2a及び2bのような遺伝子型２並びにサブタイプ3aのような遺伝子型３のHCVコンセンサス配列から選択される。

【0077】

幾つかの実施形態において、細胞透過性ペプチドは、20〜60アミノ酸のような、21〜60アミノ酸のような、22〜60アミノ酸のような、23〜60アミノ酸のような、24〜60アミノ酸のような、25〜60アミノ酸のような、26〜60アミノ酸のような、27〜60アミノ酸のような、28〜60アミノ酸のような、29〜60アミノ酸のような、30〜60アミノ酸のような、31〜60アミノ酸のような、32〜60アミノ酸のような、33〜60アミノ酸のような、34〜60アミノ酸のような、35〜60アミノ酸のような、19〜60アミノ酸である。

【0078】

幾つかの実施形態において、細胞透過性ペプチドは、18〜59アミノ酸のような、18〜58アミノ酸のような、18〜57アミノ酸のような、18〜56アミノ酸のような、18〜55アミノ酸のような、18〜54アミノ酸のような、18〜53アミノ酸のような、18〜52アミノ酸のような、18〜51アミノ酸のような、18〜50アミノ酸のような、18〜49アミノ酸のような、18〜48アミノ酸のような、18〜47アミノ酸のような、18〜46アミノ酸のような、18〜45アミノ酸のような、18〜44アミノ酸のような、18〜43アミノ酸のような、18〜42アミノ酸のような、18〜41アミノ酸のような、18〜40アミノ酸のような、18〜39アミノ酸のような、18〜38アミノ酸のような、18〜37アミノ酸のような、18〜35アミノ酸のような、18〜34アミノ酸のような、18〜33アミノ酸のような、18〜32アミノ酸のような、18〜31アミノ酸のような、18〜30アミノ酸のような、18〜29アミノ酸のような、18〜28アミノ酸のような、18〜27アミノ酸のような、18〜26アミノ酸のような、18〜25アミノ酸のような、18〜24アミノ酸のような、18〜23アミノ酸のような、18〜22アミノ酸のような、18〜21アミノ酸のような、18〜20アミノ酸のような、18〜19アミノ酸のような、18〜60アミノ酸である。

【0079】

幾つかの実施形態において、X²の正味電荷は０以下である。
幾つかの実施形態において、X²の正味電荷は０以下であり；X¹及びX³は、任意の塩基性アミノ酸、シトルリン、トリプトファン又はそれらの誘導体から独立して選択される２、３又は４アミノ酸の配列を規定する。
幾つかの実施形態において、X²の正味電荷は０以下であり；X⁴の正味電荷は１以上である。
幾つかの実施形態において、X²の正味電荷は０以下であり；X⁴の正味電荷は１以上であり；X¹及びX³は、任意の塩基性アミノ酸、シトルリン、トリプトファン又はそれらの誘導体から独立して選択される２、３又は４アミノ酸の配列を規定する。

【0080】

幾つかの実施形態において、X²及びX⁴の正味電荷は０以下である。
幾つかの実施形態において、X²及びX⁴の正味電荷は０以下であり；X¹及びX³は、任意の塩基性アミノ酸、シトルリン、トリプトファン又はそれらの誘導体から独立して選択される２、３又は４アミノ酸の配列を規定する。
幾つかの実施形態において、X²及びX⁴の正味電荷は１以上である。
幾つかの実施形態において、X²及びX⁴の正味電荷は１以上であり、X¹及びX³は、任意の塩基性アミノ酸、シトルリン、トリプトファン又はそれらの誘導体から独立して選択される１又は２つのアミノ酸の配列を規定する。
幾つかの実施形態において、X²の正味電荷は１以上であり；X⁴の正味電荷は０以下である。

【0081】

幾つかの実施形態において、X²の正味電荷は１以上であり；X⁴の正味電荷は０以下であり；X¹は正電荷を有する１又は２アミノ酸の配列を規定し；X³は、任意の塩基性アミノ酸、シトルリン、トリプトファン又はそれらの誘導体から独立して選択される２、３又は４アミノ酸の配列を規定する。
幾つかの実施形態において、塩基性アミノ酸はArg、Lys及びHisから独立して選択される。
幾つかの実施形態において、X²及び/又はX⁴は、配列番号３の135位〜157位により規定されるアミノ酸配列又はそのフラグメント若しくはバリアントを含んでなる。

【0082】

幾つかの実施形態において、X²及び/又はX⁴は、GYIPLVGAPLG、GYLPAVGAPIG、GYLPAVGAPI、NYVTGNIPG、NYATGNLPG、NYATGNLPG、VTGNIPGSTYS、IRNLGRVIETLTG、SRNLGKVIDTLTC、IRNLGRVIETLT、GGGQIIGGNYLIP、GGGQIVGGVYLLP、LIFLARSALIV、LIFLARSALIL、LIFLARSALIL、SAYERMCNIL、SAYERZVNIL、TAYERZCNIL、IAYERMCNIL、IAYERMCNIL、LFFKCIYRLFKHGL、LFFKTITRLFBHGL、GLEPLVIAGILA、GSDPLVVAASIV、NLVPMVATV、NLVPMVATV、NIVPZVVTA、PEVIPMFSALS、FIIPXFTALSG、ALGPAATL、GPVVHLTL、LECVYCKQQLL、GVYDFAFRDLC、GVFDYAFRDIN、GATPVDLLGA、GVTPAGLIGV、VARALAHGVRV、VIRVIAHGLRL、GITFSIFLIVS、CSFSIFLLAL、GCSFSIFLLAL、GITFSIYLIVS、LZGYIPLIGA、LMGYIPLVGA、LZGYIPLIGA、PBIGVRATB、GPRLGVRATR、GPRLGVRAT、RGSVAHKS、SALILRGSVAHK、FQTAAQRAMM、FQTAAQRAVZ、FQTVVQBA、FQTAAQRA、GPSTEGVPESM、LLSTEGVPNSZ、GSLVGLLHIVL、ASIVGILHLIL、NLVPMVATV、NIVPZVVTA、TPQDLNTMLN、ALLYGATPYAIG、MMTACQGVG、GQAGDDFS、EVYDFAFRDLC、GFAFRDLCIVY、GFAYRDINLAY、GALNLCLPM、及びGALQIBLPL、IRNLGRVIETLTLZGYIPLIGAから選択される配列、又はそのフラグメント若しくはバリアントからなる。

【0083】

幾つかの実施形態において、X²及び/又はX⁴は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号126、及び配列番号198から選択されるアミノ酸配列に由来する配列、又はそのフラグメント若しくはバリアントからなる。

【0084】

幾つかの実施形態において、本発明によるペプチドは、RRGYIPLVGAPLGBGRVARALAHGVRV、RGYIPLVGAPLGRRVARALAHGVRV、RGYIPLVGAPLGRRRVARALAHGVRVR、RRGYIPLVGAPLGRRVARALAHGVRV、RRGYIPLVGAPLGRRRVARALAHGVRV、BRGYIPLVGAPLGRRVARALAHGVRV、RRRGYIPLVGAPLGBRVARALAHGVRV、RGYIPLVGAPLGKKKVARALAHGVRV、RGYIPLVGAPLGRRRVARALAHGVRV、KKGYIPLVGAPLGKKVARALAHGVRV、WGYIPLVGAPLGRRVARALAHGVRV、WWGYIPLVGAPLGRRVARALAHGVRV、EEGYIPLVGAPLGEEVARALAHGVRV、GGGYIPLVGAPLGGGVARALAHGVRV、EEGYIPLVGAPLGRRVARALAHGVRV、RRGYIPLVGAPLGLRRVARALAHGVRV、WWGYIPLVGAPLGRRVARALAHGVRV、WWGYIPLVGAPLGRRRVARALAHGVRV、WWGYIPLVGAPLGRVARALAHGVRV、RGYIPLVGAPLGRRVARALAHGVRV、RRGYLPAVGAPIGBRVIRVIAHGLRL、RRGYIPLVGAPLGBRVARALAHGVRV、GYIPLVGAPLGGVARALAHGVRV、WWGYLPAVGAPIRRVIRVIAHGLRL、GYIPLVGAPLGGVARALAHGVRV、RRGYIPLVGAPLGBGRVARALAHGVRV、RGYIPLVGAPLGRRVARALAHGVRV、RGYIPLVGAPLGRRRVARALAHGVRV、RRGYIPLVGAPLGRRVARALAHGVRV、RRGYIPLVGAPLGRRRVARALAHGVRV、BRGYIPLVGAPLGRRVARALAHGVRV、RRRGYIPLVGAPLGBRVARALAHGVRV、RGYIPLVGAPLGKKKVARALAHGVRV、RGYIPLVGAPLGRRRVARALAHGVRV、KKGYIPLVGAPLGKKVARALAHGVRV、WGYIPLVGAPLGRRVARALAHGVRV、WWGYIPLVGAPLGRRVARALAHGVRV、RRGYIPLVGAPLGLRRVARALAHGVRV、RRNYVTGNIPGBRGITFSIFLIVS、WWNYATGNLPGRRCSFSIFLLAL、WWNYVTGNIPGBRGITFSIFLIVS、WWNYVTGNIPGRRGITFSIFLIVS、RRNYATGNLPGRRGCSFSIFLLAL、RRVTGNIPGSTYSGBRGITFSIYLIVS、RRIRNLGRVIETLTGBRLZGYIPLIGA、RRSRNLGKVIDTLTCBRLMGYIPLVGA、SRNLGKVIDTLTCGFADLMGYIPLVGA、WWIRNLGRVIETLTRRLZGYIPLIGA、WWSRNLGKVIDTLTCRRLMGYIPLVGA、RRGGGQIIGGNYLIPRBPBIGVRATB、GGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATR、RRGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATR、WWGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRAT、BRLIFLARSALIVRGSVAHKS、EDLIFLARSALILRGSVAHKS、BRLIFLARSALILBGRSALILRGSVAHK、SAYERMCNILKGKFQTAAQRAMM、SAYERZVNILKGKFQTAAQRAVZ、BRTAYERZCNILBRGRFQTVVQBA、BRIAYERMCNILLBRGKFQTAAQRA、IAYERMCNILKGKFQTAAQRA、LFFKCIYRLFKHGLKRGPSTEGVPESM、BRRLFFKTITRLFBHGLRRLLSTEGVPNSZ、BRGLEPLVIAGILARRGSLVGLLHIVL、BRGSDPLVVAASIVRRASIVGILHLIL、RNLVPMVATVRRNLVPMVATVB、RNLVPMVATVBRRNLVPMVATVB、RNIVPZVVTARRNIVPZVVTAB、PEVIPMFSALSEGATPQDLNTMLN、RFIIPXFTALSGGRRALLYGATPYAIG、KALGPAATLEEMMTACQGVG、RRGPVVHLTLRRRGQAGDDFS、RRGPVVHLTLRRRGQAGDDFS、RRGPVVHLTLRGRRGQAGDDFS、RRLECVYCKQQLLRREVYDFAFRDLC、RRGVYDFAFRDLCRRGFAFRDLCIVYR、RRGVFDYAFRDINRRGFAYRDINLAYR、RRGATPVDLLGARRGALNLCLPMR、RRGVTPAGLIGVRRGALQIBLPLR、RGYLPAVGAPIGRRRVIRVIAHGLRLR、RRSRNLGKVIDTLTCRRLMGYIPLVGA、RRIRNLGRVIETLTLZGYIPLIGARRIRNLGRVIETLTLZGYIPLIGAR、又はそのフラグメント若しくはバリアントから選択される。

【0085】

幾つかの実施形態において、ペプチドは、
随意にＣ-末端にX⁵を有していてもよい、X¹-NYVTGNIPG-X³-GITFSIYLIVS、X¹-IRNLGRVIETLT-X³-LZGYIPLIGA、X¹-GYLPAVGAPI-X³-VIRVIAHGLRL、X¹-GGGQIIGGNYLIP-X³-PBIGVRATB、X¹-NYATGNLPG-X³-GCSFSIFLLAL、X¹-SRNLGKVIDTLTC-X³-LMGYIPLVGA、X¹-GYIPLVGAPL-X³-VARALAHGVRV、X¹-GGGQIVGGVYLLP-X³-PRLGVRATR、X¹-LTFLVRSVLLI-X³-GSVLIVRGSLVH、X¹-TAYERZCNIL-X³-GRFQTVVQBA、X¹-SDPLVVAASIV-X³-ASIVGILHLIL、X¹-LIFLARSALIL-X³-SALILRGSVAH、X¹-IAYERMCNIL-X³-GKFQTAAQRA、X¹-LEPLVIAGILA-X³-GSLVGLLHIVL、X¹-NLVPMVATV-X³-NLVPMATV、X¹-GYLPAVGAPIG-X³-VIRVIAHGLRL、X¹-IRNLGRVIETLTG-X³-LZGYIPLIGA、X¹-GVYDFAFRDLC-X³-GFAFRDLCIVYR、X¹-GVFDYAFRDIN-X³-GFAYRDINLAYR、X¹-GATPVDLLGA-X³-GALNLCLPMR、X¹-GVTPAGLIGV-X³-GALQIBLPLR及びX¹-IRNLGRVIETLTLZGYIPLIGA-X³-IRNLGRVIETLTLZGYIPLIGA(式中、X¹及びX³及びX⁵は式ＩのX¹及びX³及びX⁵をいう)から選択される配列からなる。

【0086】

幾つかの実施形態において、ペプチドは１以上のシステインを含んでなる。
幾つかの実施形態において、ペプチドは、２つのcys残基間の分子内ジスルフィド(S-S)結合のような分子内結合を含有する。
他の実施形態において、ペプチドは、アシラール部分(COO-CH2-OOC、COO-CHR-OOC又はCOO-CR2-OOC)の形態にあるような分子内結合を含有する。
幾つかの実施形態において、X²中のＮ-及び/又はＣ-末端アミノ酸は親水性又は極性アミノ酸である。
幾つかの実施形態において、X⁴中のＮ-末端アミノ酸は親水性又は極性アミノ酸である。

【0087】

幾つかの実施形態において、本発明によるペプチドは、
56、54、52、50、48、46、44、42、40、38、36、34、32、30、28、26、24、22、20、18アミノ酸残基を超えないように、58アミノ酸を超えない。
幾つかの実施形態において、X¹は２又は３アミノ酸からなる。
幾つかの実施形態において、X¹はWW、BR又はRRからなる。
幾つかの実施形態において、X¹はR又はWからなる。
幾つかの実施形態において、X³は２又は３アミノ酸からなる。

【0088】

幾つかの実施形態において、X³はWW、BR又はRRからなる。
幾つかの実施形態において、X³はRRR、BRR又はBRGRからなる。
幾つかの実施形態において、本発明による単離ペプチドは、表１又は表２に規定されるX²又はX⁴の配列からなる。
幾つかの実施形態において、本発明による単離ペプチドは、表１又は表２に規定されるX²及び/又はX⁴の配列又はそのフラグメントを含んでなる。
幾つかの実施形態において、X²は、８〜20アミノ酸のような、８〜15アミノ酸のような、８〜11アミノ酸のような、８〜25アミノ酸の配列を規定する。

【0089】

幾つかの実施形態において、X²は、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、９、８、７又は６アミノ酸未満のような、25アミノ酸未満の配列を規定する。
幾つかの実施形態において、X²は、９、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29アミノ酸より多いような、８アミノ酸より多い配列を規定する。
幾つかの実施形態において、X⁴は、８〜20アミノ酸のような、８〜15アミノ酸のような、８〜11アミノ酸のような、８〜25アミノ酸の配列を規定する。
幾つかの実施形態において、X⁴は、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、９、８、７又は６アミノ酸未満のような、25アミノ酸未満の配列を規定する。

【0090】

幾つかの実施形態において、X⁴は、９、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29アミノ酸より多いような、８アミノ酸より多い配列を規定する。
幾つかの実施形態において、本発明による二量体ペプチドは、２つの同一ペプチド単量体からなる。
幾つかの実施形態において、本発明による免疫原性組成物は、ワクチン組成物の形態である。

【0091】

幾つかの実施形態において、本発明の細胞透過性ペプチドは、最大で60、最大で59、最大で58、最大で57、最大で56、最大で55、最大で54、最大で53、最大で52、最大で51、最大で50、最大で49、最大で48、最大で47、最大で46、最大で45、最大で44、最大で43、最大で42、最大で41、最大で40、最大で39、最大で38、最大で37、最大で36、最大で35、最大で34、最大で33、最大で32、最大で31、最大で30、最大で29、最大で28、最大で27、最大で26、最大で25、最大で24、最大で23、最大で22、最大で21、最大で20、最大で19、最大で18アミノ酸を含んでなる。

【0092】

幾つかの実施形態において、本発明の細胞透過性ペプチドは、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、少なくとも27、少なくとも28、少なくとも29、少なくとも30、少なくとも31、少なくとも32、少なくとも33、少なくとも34、少なくとも35、少なくとも36、少なくとも37、少なくとも38、少なくとも39、少なくとも40、少なくとも41、少なくとも42、少なくとも43、少なくとも44、少なくとも45、少なくとも46、少なくとも47、少なくとも48、少なくとも49、少なくとも50、少なくとも51、少なくとも52、少なくとも53、少なくとも54、少なくとも55、少なくとも56、少なくとも57、少なくとも58、少なくとも59、少なくとも60アミノ酸残基を含んでなる。

【0093】

幾つかの実施形態において、本発明の細胞透過性ペプチドは、18アミノ酸残基又は19アミノ酸残基又は20アミノ酸残基又は21アミノ酸残基又は22アミノ酸残基又は23アミノ酸残基又は24アミノ酸残基又は25アミノ酸残基又は26アミノ酸残基又は27アミノ酸残基又は28アミノ酸残基又は29アミノ酸残基又は30アミノ酸残基又は31アミノ酸残基又は32アミノ酸残基又は33アミノ酸残基又は34アミノ酸残基又は35アミノ酸残基又は36アミノ酸残基又は37アミノ酸残基又は38アミノ酸残基又は39アミノ酸残基又は40アミノ酸残基又は41アミノ酸残基又は42アミノ酸残基又は43アミノ酸残基又は44アミノ酸残基又は45アミノ酸残基又は46アミノ酸残基又は47アミノ酸残基又は48アミノ酸残基又は49アミノ酸残基又は50アミノ酸残基又は51アミノ酸残基又は52アミノ酸残基又は53アミノ酸残基又は54アミノ酸残基又は55アミノ酸残基又は56アミノ酸残基又は57アミノ酸残基又は58アミノ酸残基又は59アミノ酸残基又は60アミノ酸残基からなる。

【0094】

幾つかの実施形態において、本発明の細胞透過性ペプチドは、以下の配列RFIIP[Nle]FTALSGGRRALLYGATPYAIG(式中、Nleはノルロイシンを意味する)からなるものではない。
幾つかの実施形態において、X²及び/又はX⁴はHIVに由来しない。
幾つかの実施形態において、X⁴は12アミノ酸未満の直鎖配列である。
幾つかの実施形態において、X²は12アミノ酸未満の直鎖配列である。
幾つかの実施形態において、X²及び/又はX⁴はノルロイシンを含有しない。

【0095】

幾つかの実施形態において、X²はノルロイシンを含有しない。
幾つかの実施形態において、X²及び/又はX⁴は天然アミノ酸のみを含有する。
幾つかの実施形態において、X²は天然アミノ酸のみを含有する。
幾つかの実施形態において、X²は、HIVに由来する場合には天然アミノ酸のみを含有する。
幾つかの実施形態において、
X²及び/又はX⁴は、HCV、CMV、HPV、インフルエンザ、アデノウイルス又はピコルナウイルスに由来する。

【0096】

番号を付した本発明による実施形態：
１．下記の構造：
X¹-X²-X³-X⁴-X⁵ (式Ｉ)
(式中、X¹及びX³は、独立して、任意の塩基性アミノ酸、シトルリン、トリプトファン又はそれらの誘導体から独立して選択される１、２、３又は４アミノ酸の直鎖配列を規定し；X²は抗原に由来する８〜30アミノ酸の直鎖配列を規定し；X⁴は、前記抗原に由来する８〜30アミノ酸の直鎖配列であって、X²とは異なる配列を規定し；X⁵は、随意に存在してもよい、塩基性アミノ酸、シトルリン、トリプトファン又はそれらの誘導体から選択される任意の１つのアミノ酸である)を含んでなる単離された細胞透過性ペプチド。

【0097】

２．X¹が任意の塩基性アミノ酸、トリプトファン又はそれらの誘導体から独立して選択される１、２、３又は４アミノ酸の直鎖配列を規定する、実施形態１に記載の単離ペプチド。
３．X¹が、１つのシトルリンと、任意の塩基性アミノ酸、トリプトファン又はそれらの誘導体から独立して選択される１、２又は３アミノ酸との任意の順序での直鎖配列を規定する、実施形態１に記載の単離ペプチド。
４．X³が、任意の塩基性アミノ酸から独立して選択される１、２、３又は４アミノ酸の直鎖配列を規定する、実施形態１〜３のいずれか１項に記載の単離ペプチド。

【0098】

５．X³が、１つのシトルリンと、任意の塩基性アミノ酸から独立して選択される１、２又は３アミノ酸との任意の順序での直鎖配列を規定する、実施形態１〜３のいずれか１項に記載の単離ペプチド。
６．実施形態１に規定される式ＩのX²-X³-X⁴により規定されるアミノ酸配列が前記抗原の天然型配列中に見出されない、実施形態１〜５のいずれか１項に記載の単離ペプチド。
７．前記ペプチドが、実施例１に記載されるペプチドのビオチン化に基づくアッセイにおいて、形質膜を横切って転位することが証明される、実施形態１〜６のいずれか１項に記載の単離ペプチド。

【0099】

８．塩基性アミノ酸、シトルリン、トリプトファン又はそれらの誘導体から選択される前記随意に存在してもよい１つのアミノ酸がArg、Lys及びHisから選択される、実施形態１〜７のいずれか１項に記載の単離ペプチド。
９．X²及び/又はX⁴が前記抗原の天然型配列と同一の配列を規定する、実施形態１〜８のいずれか１項に記載の単離ペプチド。
１０．前記ペプチドがＴリンパ球応答を誘導し得る、実施形態１〜９のいずれか１項に記載の単離ペプチド。

【0100】

１１．前記抗原がキャプシドタンパク質のようなウイルスタンパク質である、実施形態１〜１０のいずれか１項に記載の単離ペプチド。
１２．前記ウイルスタンパク質がコアタンパク質のようなＣ型肝炎ウイルスのタンパク質；M2タンパク質のようなインフルエンザウイルスのタンパク質から選択される、実施形態１１に記載の単離ペプチド。
１３．前記ウイルスＣ型肝炎ウイルスのタンパク質が、サブタイプ1a及び1bのような遺伝子型１、サブタイプ2a及び2bのような遺伝子型２並びにサブタイプ3aのような遺伝子型３のHCVコンセンサス配列から選択される、実施形態１１に記載の単離ペプチド。

【0101】

１４．細胞透過性ペプチドが、20〜60アミノ酸のような、21〜60アミノ酸のような、22〜60アミノ酸のような、23〜60アミノ酸のような、24〜60アミノ酸のような、25〜60アミノ酸のような、26〜60アミノ酸のような、27〜60アミノ酸のような、28〜60アミノ酸のような、29〜60アミノ酸のような、30〜60アミノ酸のような、31〜60アミノ酸のような、32〜60アミノ酸のような、33〜60アミノ酸のような、34〜60アミノ酸のような、35〜60アミノ酸のような、19〜60アミノ酸である、実施形態１〜１３のいずれか１項に記載の単離ペプチド。

【0102】

１５．細胞透過性ペプチドが、18〜59のような、18〜58のような、18〜57のような、18〜56のような、18〜55のような、18〜54のような、18〜53のような、18〜52のような、18〜51のような、18〜50のような、18〜49のような、18〜48のような、18〜47のような、18〜46のような、18〜45のような、18〜44のような、18〜43のような、18〜42のような、18〜41のような、18〜40のような、18〜39のような、18〜38のような、18〜37のような、18〜35アミノ酸のような、18〜34アミノ酸のような、18〜33アミノ酸のような、18〜32アミノ酸のような、18〜31アミノ酸のような、18〜30アミノ酸のような、18〜29アミノ酸のような、18〜28アミノ酸のような、18〜27アミノ酸のような、18〜26アミノ酸のような、18〜25アミノ酸のような、18〜24アミノ酸のような、18〜23アミノ酸のような、18〜22アミノ酸のような、18〜21アミノ酸のような、18〜20アミノ酸のような、18〜19アミノ酸のような、18〜60である、実施形態１〜１４のいずれか１項に記載の単離ペプチド。
１６．X²の正味電荷が０以下であり；X¹及びX³が、任意の塩基性アミノ酸、シトルリン、トリプトファン又はそれらの誘導体から独立して選択される２、３又は４アミノ酸の配列を規定する、実施形態１〜１５のいずれか１項に記載の単離ペプチド。

【0103】

１７．X²の正味電荷が０以下であり；X⁴の正味電荷が１以上であり；X¹及びX³が、任意の塩基性アミノ酸、シトルリン、トリプトファン又はそれらの誘導体から独立して選択される２、３又は４アミノ酸の配列を規定する、実施形態１〜１６のいずれか１項に記載の単離ペプチド。
１８．X²及びX⁴の正味電荷が０以下であり、X¹及びX³が、任意の塩基性アミノ酸、シトルリン、トリプトファン又はそれらの誘導体から独立して選択される２、３又は４アミノ酸の配列を規定する、実施形態１〜１７のいずれか１項に記載の単離ペプチド。
１９．X²及びX⁴の正味電荷が１以上であり、X¹及びX³が、任意の塩基性アミノ酸、シトルリン、トリプトファン又はそれらの誘導体から独立して選択される１又は２アミノ酸の配列を規定する、実施形態１〜１８のいずれか１項に記載の単離ペプチド。

【0104】

２０．X²の正味電荷が１以上であり；X⁴の正味電荷が０以下であり；X¹が正電荷を有する１又は２アミノ酸の配列を規定し；X³が、任意の塩基性アミノ酸、シトルリン、トリプトファン又はそれらの誘導体から独立して選択される２、３又は４アミノ酸の配列を規定する、実施形態１〜１９のいずれか１項に記載の単離ペプチド。
２１．前記塩基性アミノ酸がArg、Lys及びHisから独立して選択される、実施形態１〜２０のいずれか１項に記載の単離ペプチド。
２２．X²及び/又はX⁴が配列番号３の135位〜157位により規定されるアミノ酸配列又はそのフラグメント若しくはバリアントを含んでなる、実施形態１〜２１のいずれか１項に記載の単離ペプチド。

【0105】

２３．X²及び/又はX⁴が、GYIPLVGAPLG、GYLPAVGAPIG、GYLPAVGAPI、NYVTGNIPG、NYATGNLPG、NYATGNLPG、VTGNIPGSTYS、IRNLGRVIETLTG、SRNLGKVIDTLTC、IRNLGRVIETLT、GGGQIIGGNYLIP、GGGQIVGGVYLLP、LIFLARSALIV、LIFLARSALIL、LIFLARSALIL、SAYERMCNIL、SAYERZVNIL、TAYERZCNIL、IAYERMCNIL、IAYERMCNIL、LFFKCIYRLFKHGL、LFFKTITRLFBHGL、GLEPLVIAGILA、GSDPLVVAASIV、NLVPMVATV、NLVPMVATV、NIVPZVVTA、PEVIPMFSALS、FIIPXFTALSG、ALGPAATL、GPVVHLTL、LECVYCKQQLL、GVYDFAFRDLC、GVFDYAFRDIN、GATPVDLLGA、GVTPAGLIGV、VARALAHGVRV、VIRVIAHGLRL、GITFSIFLIVS、CSFSIFLLAL、GCSFSIFLLAL、GITFSIYLIVS、LZGYIPLIGA、LMGYIPLVGA、LZGYIPLIGA、PBIGVRATB、GPRLGVRATR、GPRLGVRAT、RGSVAHKS、SALILRGSVAHK、FQTAAQRAMM、FQTAAQRAVZ、FQTVVQBA、FQTAAQRA、GPSTEGVPESM、LLSTEGVPNSZ、GSLVGLLHIVL、ASIVGILHLIL、NLVPMVATV、NIVPZVVTA、TPQDLNTMLN、ALLYGATPYAIG、MMTACQGVG、GQAGDDFS、EVYDFAFRDLC、GFAFRDLCIVY、GFAYRDINLAY、GALNLCLPM、GALQIBLPL、及びIRNLGRVIETLTLZGYIPLIGAから選択される配列、又はそのフラグメント若しくはバリアントからなる、実施形態１〜２２のいずれか１項に記載の単離ペプチド。

【0106】

２４．X²及び/又はX⁴が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号126、及び配列番号198から選択されるアミノ酸配列に由来する配列、又はそのフラグメント若しくはバリアントからなる、実施形態１〜２３のいずれか１項に記載の単離ペプチド。

【0107】

２５．前記ペプチドが、RRGYIPLVGAPLGBGRVARALAHGVRV(配列番号47)、RGYIPLVGAPLGRRVARALAHGVRV(配列番号48)、RGYIPLVGAPLGRRRVARALAHGVRVR(配列番号49)、RRGYIPLVGAPLGRRVARALAHGVRV(配列番号50)、RRGYIPLVGAPLGRRRVARALAHGVRV(配列番号51)、BRGYIPLVGAPLGRRVARALAHGVRV(配列番号52)、RRRGYIPLVGAPLGBRVARALAHGVRV(配列番号53)、RGYIPLVGAPLGKKKVARALAHGVRV(配列番号54)、RGYIPLVGAPLGRRRVARALAHGVRV(配列番号55)、KKGYIPLVGAPLGKKVARALAHGVRV(配列番号56)、WGYIPLVGAPLGRRVARALAHGVRV(配列番号57)、WWGYIPLVGAPLGRRVARALAHGVRV(配列番号58)、EEGYIPLVGAPLGEEVARALAHGVRV(配列番号59)、GGGYIPLVGAPLGGGVARALAHGVRV(配列番号60)、EEGYIPLVGAPLGRRVARALAHGVRV(配列番号61)、RRGYIPLVGAPLGLRRVARALAHGVRV(配列番号62)、WWGYIPLVGAPLGRRVARALAHGVRV(配列番号63)、WWGYIPLVGAPLGRRRVARALAHGVRV(配列番号64)、WWGYIPLVGAPLGRVARALAHGVRV(配列番号65)、RGYIPLVGAPLGRRVARALAHGVRV(配列番号66)、RRGYLPAVGAPIGBRVIRVIAHGLRL(配列番号67)、RRGYIPLVGAPLGBRVARALAHGVRV(配列番号68)、GYIPLVGAPLGGVARALAHGVRV(配列番号69)、WWGYLPAVGAPIRRVIRVIAHGLRL(配列番号70)、GYIPLVGAPLGGVARALAHGVRV(配列番号71)、RRGYIPLVGAPLGBGRVARALAHGVRV(配列番号72)、RGYIPLVGAPLGRRVARALAHGVRV(配列番号73)、RGYIPLVGAPLGRRRVARALAHGVRV(配列番号74)、RRGYIPLVGAPLGRRVARALAHGVRV(配列番号75)、RRGYIPLVGAPLGRRRVARALAHGVRV(配列番号76)、BRGYIPLVGAPLGRRVARALAHGVRV(配列番号77)、RRRGYIPLVGAPLGBRVARALAHGVRV(配列番号78)、RGYIPLVGAPLGKKKVARALAHGVRV(配列番号79)、RGYIPLVGAPLGRRRVARALAHGVRV(配列番号80)、KKGYIPLVGAPLGKKVARALAHGVRV(配列番号81)、WGYIPLVGAPLGRRVARALAHGVRV(配列番号82)、WWGYIPLVGAPLGRRVARALAHGVRV(配列番号83)、RRGYIPLVGAPLGLRRVARALAHGVRV(配列番号84)、RRNYVTGNIPGBRGITFSIFLIVS(配列番号85)、WWNYATGNLPGRRCSFSIFLLAL(配列番号86)、WWNYVTGNIPGBRGITFSIFLIVS(配列番号87)、WWNYVTGNIPGRRGITFSIFLIVS(配列番号88)、RRNYATGNLPGRRGCSFSIFLLAL(配列番号89)、RRVTGNIPGSTYSGBRGITFSIYLIVS(配列番号90)、RRIRNLGRVIETLTGBRLZGYIPLIGA(配列番号91)、RRSRNLGKVIDTLTCBRLMGYIPLVGA(配列番号92)、SRNLGKVIDTLTCGFADLMGYIPLVGA(配列番号93)、WWIRNLGRVIETLTRRLZGYIPLIGA(配列番号94)、WWSRNLGKVIDTLTCRRLMGYIPLVGA(配列番号95)、RRGGGQIIGGNYLIPRBPBIGVRATB(配列番号96)、GGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATR(配列番号97)、RRGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATR(配列番号98)、WWGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRAT(配列番号99)、BRLIFLARSALIVRGSVAHKS(配列番号100)、EDLIFLARSALILRGSVAHKS(配列番号101)、BRLIFLARSALILBGRSALILRGSVAHK(配列番号102)、SAYERMCNILKGKFQTAAQRAMM(配列番号103)、SAYERZVNILKGKFQTAAQRAVZ(配列番号104)、BRTAYERZCNILBRGRFQTVVQBA(配列番号105)、BRIAYERMCNILLBRGKFQTAAQRA(配列番号106)、IAYERMCNILKGKFQTAAQRA(配列番号107)、LFFKCIYRLFKHGLKRGPSTEGVPESM(配列番号108)、BRRLFFKTITRLFBHGLRRLLSTEGVPNSZ(配列番号109)、BRGLEPLVIAGILARRGSLVGLLHIVL(配列番号110)、BRGSDPLVVAASIVRRASIVGILHLIL(配列番号111)、RNLVPMVATVRRNLVPMVATVB(配列番号112)、RNLVPMVATVBRRNLVPMVATVB(配列番号113)、RNIVPZVVTARRNIVPZVVTAB(配列番号114)、PEVIPMFSALSEGATPQDLNTMLN(配列番号115)、RFIIPXFTALSGGRRALLYGATPYAIG(配列番号116)、KALGPAATLEEMMTACQGVG(配列番号117)、RRGPVVHLTLRRRGQAGDDFS(配列番号118)、RRGPVVHLTLRRRGQAGDDFS(配列番号119)、RRGPVVHLTLRGRRGQAGDDFS(配列番号120)、RRLECVYCKQQLLRREVYDFAFRDLC(配列番号121)、RRGVYDFAFRDLCRRGFAFRDLCIVYR(配列番号122)、RRGVFDYAFRDINRRGFAYRDINLAYR(配列番号123)、RRGATPVDLLGARRGALNLCLPMR(配列番号124)、RRGVTPAGLIGVRRGALQIBLPLR(配列番号125)、RGYLPAVGAPIGRRRVIRVIAHGLRLR(配列番号196)、RRSRNLGKVIDTLTCRRLMGYIPLVGA(配列番号197)、及びRRIRNLGRVIETLTLZGYIPLIGARRIRNLGRVIETLTLZGYIPLIGAR(配列番号199)、又はそのフラグメント若しくはバリアントから選択される、実施形態１〜２４のいずれか１項に記載の単離ペプチド。

【0108】

２６．前記ペプチドが、随意にＣ-末端にX⁵を有していてもよい、X¹-NYVTGNIPG-X³-GITFSIYLIVS、X¹-IRNLGRVIETLT-X³-LZGYIPLIGA、X¹-GYLPAVGAPI-X³-VIRVIAHGLRL、X¹-GGGQIIGGNYLIP-X³-PBIGVRATB、X¹-NYATGNLPG-X³-GCSFSIFLLAL、X¹-SRNLGKVIDTLTC-X³-LMGYIPLVGA、X¹-GYIPLVGAPL-X³-VARALAHGVRV、X¹-GGGQIVGGVYLLP-X³-PRLGVRATR、X¹-LTFLVRSVLLI-X³-GSVLIVRGSLVH、X¹-TAYERZCNIL-X³-GRFQTVVQBA、X¹-SDPLVVAASIV-X³-ASIVGILHLIL、X¹-LIFLARSALIL-X³-SALILRGSVAH、X¹-IAYERMCNIL-X³-GKFQTAAQRA、X¹-LEPLVIAGILA-X³-GSLVGLLHIVL、X¹-NLVPMVATV-X³-NLVPMATV、X¹-GYLPAVGAPIG-X³-VIRVIAHGLRL、X¹-IRNLGRVIETLTG-X³-LZGYIPLIGA、X¹-GVYDFAFRDLC-X³-GFAFRDLCIVYR、X¹-GVFDYAFRDIN-X³-GFAYRDINLAYR、X¹-GATPVDLLGA-X³-GALNLCLPMR、X¹-GVTPAGLIGV-X³-GALQIBLPLR及びX¹-IRNLGRVIETLTLZGYIPLIGA-X³-IRNLGRVIETLTLZGYIPLIGA(式中、X¹及びX³及びX⁵は式ＩのX¹及びX³及びX⁵をいう)から選択される配列からなる、実施形態１〜２５のいずれか１項に記載の単離ペプチド。

【0109】

２７．１以上のシステインを含んでなる、実施形態１〜２６のいずれか１項に記載の単離ペプチド。
２８．２つのcys残基間の分子内ジスルフィド(S-S)結合又はアシラールのような分子内結合を含有する、実施形態１〜２７のいずれか１項に記載の単離ペプチド。
２９．X²中のＮ-及び/又はＣ-末端アミノ酸が親水性又は極性アミノ酸である、実施形態１〜２８のいずれか１項に記載の単離ペプチド。
３０．X⁴中のＮ-末端アミノ酸が親水性又は極性アミノ酸である、実施形態１〜２９のいずれか１項に記載の単離ペプチド。

【0110】

３１．56、54、52、50、48、46、44、42、40、38、36、34、32、30、28、26、24、22、20、18アミノ酸残基を超えないように、58アミノ酸を超えない、実施形態１〜３０のいずれか１項に記載の単離ペプチド。
３２．X¹が２又は３アミノ酸からなる、実施形態１〜３１のいずれか１項に記載の単離ペプチド。
３３．X¹がWW、BR又はRRからなる、実施形態３２に記載の単離ペプチド。
３４．X³が２又は３アミノ酸からなる、実施形態１〜３３のいずれか１項に記載の単離ペプチド。
３５．X³がWW、BR又はRRからなる、実施形態３４に記載の単離ペプチド。

【0111】

３６．表１又は表２に独立して規定されるX²及び/又はX⁴の配列を含んでなる60アミノ酸を超えない単離ペプチド。
３７．表１又は表２に独立して規定されるX²又はX⁴の配列からなる、実施形態３６に記載の単離ペプチド。
３８．X²が、８〜20アミノ酸のような、８〜15アミノ酸のような、８〜25アミノ酸の配列を規定する、実施形態１〜３７のいずれか１項に記載の単離ペプチド。
３９．X⁴が、８〜20アミノ酸のような、８〜15アミノ酸のような８〜25アミノ酸の配列を規定する、実施形態１〜３８のいずれか１項に記載の単離ペプチド。
４０．X²が、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、９、８、７又は６アミノ酸未満のような、25アミノ酸未満の配列を規定する、実施形態１〜３９のいずれか１項に記載の単離ペプチド。

【0112】

４１．X²が、９、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29アミノ酸より多いような、８アミノ酸より多い配列を規定する、実施形態１〜４０のいずれか１項に記載の単離ペプチド。
４２．X⁴が、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、９、８、７又は６アミノ酸未満のような、25アミノ酸未満の配列を規定する、実施形態１〜４１のいずれか１項に記載の単離ペプチド。
４３．X⁴が、９、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29アミノ酸より多いような、８アミノ酸より多い配列を規定する、実施形態１〜４２のいずれか１項に記載の単離ペプチド。
４４．本発明の細胞透過性ペプチドが、次の配列RFIIP[Nle]FTALSGGRRALLYGATPYAIG(式中、Nleはノルロイシンを意味する)からなるものではない、実施形態１〜４３のいずれか１項に記載の単離ペプチド。

【0113】

４５．X²及び/又はX⁴がHIVに由来しない、実施形態１〜４４のいずれか１項に記載の単離ペプチド。
４６．X⁴が12アミノ酸未満の直鎖配列である、実施形態１〜４５のいずれか１項に記載の単離ペプチド。
４７．X²が12アミノ酸未満の直鎖配列である、実施形態１〜４６のいずれか１項に記載の単離ペプチド。
４８．X²及び/又はX⁴がノルロイシンを含有しない、実施形態１〜４７のいずれか１項に記載の単離ペプチド。
４９．X²がノルロイシンを含有しない、実施形態１〜４８のいずれか１項に記載の単離ペプチド。

【0114】

５０．X²及び/又はX⁴が天然アミノ酸のみを含有する、実施形態１〜４９のいずれか１項に記載の単離ペプチド。
５１．X²が天然アミノ酸のみを含有する、実施形態１〜５０のいずれか１項に記載の単離ペプチド。
５２．X²が、HIVに由来する場合には天然アミノ酸のみを含有する、実施形態１〜５１のいずれか１項に記載の単離ペプチド。
５３．X²及び/又はX⁴が、HCV、CMV、HPV、インフルエンザ、アデノウイルス又はピコルナウイルスに由来する、実施形態１〜５２のいずれか１項に記載の単離ペプチド。
５４．対象者において免疫応答を誘導するための、表１又は表２に独立して規定されるX²又はX⁴の配列を含んでなるペプチドの使用。

【0115】

５５．各ペプチド単量体が実施形態１〜５３のいずれか１項に規定されているペプチドである２つのペプチド単量体を含んでなる二量体ペプチド。
５６．前記２つのペプチド単量体が同一である、実施形態５５に記載の二量体ペプチド。
５７．実施形態１〜５３のいずれか１項に記載のペプチドを２以上含んでなるペプチドの組合せ。
５８．実施形態１〜５３のいずれか１項に記載のペプチドをコードする単離された核酸又はポリヌクレオチド。
５９．実施形態５８に記載の核酸又はポリヌクレオチドを含んでなるベクター。

【0116】

６０．実施形態５９に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
６１．少なくとも、実施形態１〜５３のいずれか１項に記載のペプチド、実施形態５５若しくは５６に記載の二量体ペプチド、実施形態５７に記載のペプチドの組合せ、実施形態５８に記載の核酸若しくはポリヌクレオチド又は実施形態５９に記載のベクターを、医薬的に許容され得る希釈剤若しくはビヒクル及び随意に免疫学的アジュバントと組み合わせて含んでなる免疫原性組成物。
６２．ワクチン組成物の形態である実施形態６１に記載の免疫原性組成物。
６３．少なくとも、実施形態１〜５３のいずれか１項に記載のペプチド、実施形態５５若しくは５６に記載の二量体ペプチド、実施形態５７に記載のペプチドの組合せ、実施形態５８に記載の核酸若しくはポリヌクレオチド又は実施形態５９に記載のベクター又は実施形態６１若しくは６２に記載の組成物の投与を含んでなる、対象者において抗原に対する免疫応答を誘導する方法。

【0117】

６４．少なくとも、実施形態１〜５３のいずれか１項に記載のペプチド、実施形態５５若しくは５６に記載の二量体ペプチド、実施形態５７に記載のペプチドの組合せ、実施形態５８に記載の核酸若しくはポリヌクレオチド又は実施形態５９に記載のベクター又は実施形態６１若しくは６２に記載の組成物を有効量で投与することを含んでなる、ウイルスに感染した対象者において、該ウイルスの病理学的効果を減少させ及び/又は遅延させる方法。
６５．医薬に使用するための、実施形態１〜５３のいずれか１項に記載のペプチド。
６６．ウイルスに感染した対象者において、該ウイルスの病理学的効果を治療するための実施形態１〜５３のいずれか１項に記載のペプチド。

【0118】

配列表(太字のアミノ酸は、本発明の式Ｉにおいて規定されるX²及び/又はX⁴のいずれかとして使用し得る適切な抗原性配列を表す。)

【化1-1】

【0119】

【化1-2】

【0120】

【化1-3】

【0121】

【化1-4】

【0122】

【化1-5】

【0123】

【化1-6】

【0124】

【化1-7】

【0125】

【化1-8】

【0126】

【化1-9】

【0127】

【化1-10】

【0128】

【化1-11】

【実施例】

【0129】

実施例1
以下の実施例で使用する本発明によるペプチドは、Sheppard(1978)(J.Chem.Soc., Chem. Commun., 539)のFmoc-ストラテジを使用して、Ｃ-末端アミドとしてのSchafer-Nにより合成した。

細胞透過アッセイ
１セットのペプチドをＮ-末端でビオチン化し、(長さ及びタイプに関して)種々のアミノ酸の組合せを、下記の図式に説明するようなペプチド中の配列ボックスX¹、X³及びX⁴に付加した。１人の供血者からの増殖細胞でペプチドを試験した。

【0130】

本発明によるペプチドのアミノ酸配列の概略図(各Ｘはアミノ酸配列を規定する)：

【化2】

SP_2〜SP_17は、HCVコアタンパク質上の特定の天然型ドメインに由来する51n_Biotinのバリアントである。

【0131】

ビオチン化ペプチドの細胞内染色
96-ウェルＵ底ポリスチレンプレート(NUNC, cat no: 163320)をヒトPBMCの染色に使用した。簡潔には、８μlの、表１又は表２によるＮ-又はＣ-末端ビオチン化ペプチド(すなわち、各ペプチドについて５mM、2.5mM及び1.25mMで試験)を、37℃にて２時間、40μlの供血者PBMC(12.5×106細胞/ml)とインキュベートした。次いで、細胞を150μlのCellwash(BD, cat no: 349524)で３回洗浄し、続いて各細胞ペレットを100μlのトリプシン-EDTA(Sigma, cat no: T4424)で再懸濁後、37℃にて５分間インキュベートした。次いで、トリプシン処理細胞を150μlのCellwash(BD, cat no: 349524)で３回洗浄し、続いて、製造業者の指示に従って、BD Cytofix/Cytoperm^TM plus(BD, cat no: 554715)で再懸濁後、４℃にて20分間インキュベートした。その後、細胞を150μlのPermWash(BD, cat no: 554715)で２回洗浄した。次いで、ビオチン化ペプチド及び樹状細胞を可視化する目的で、細胞をそれぞれストレプトアビジン-APC(BD, cat no: 554067)及び抗-hCD11c(eBioscience, cat no: 12-0116)で製造業者の指示に従って４℃にて30分間染色した。次いで、細胞を150μlのPermWashで３回洗浄し、続いて染色緩衝液(BD, cat no: 554656)中に再懸濁後、フローサイトメトリに供した。樹状細胞をリンパ球領域の外側でのCD11c+事象(すなわち、リンパ球より高いFSC及びSSCシグナル)としてゲーティングした。合計200,000細胞を、HTSローダーを備えるFACSCanto IIフローサイトメータで獲得し、ペプチド-蛍光(すなわち、GeoMean)に関する総細胞及び樹状細胞の両方のヒストグラムを作成した。

【0132】

ビオチン化ペプチドの細胞外染色
96-ウェルＵ底ポリスチレンプレート(NUNC, cat no: 163320)をヒトPBMCの染色に使用した。簡潔には、８μlの、表１又は表２によるＮ-又はＣ-末端ビオチン化ペプチド(すなわち、各ペプチドについて５mM、2.5mM及び1.25mMで試験；全てのペプチドはSchaferが製造)を、37℃にて２時間、40μlの供血者PBMC(12.5×106細胞/ml)とインキュベートした。次いで、細胞を150μlのCellwash(BD, cat no: 349524)で３回洗浄した後、ビオチン化ペプチド及び樹状細胞を可視化する目的で、細胞をそれぞれストレプトアビジン-APC(BD, cat no: 554067)及び抗-hCD11c(eBioscience, cat no: 12-0116)で製造業者の指示に従って４℃にて30分間染色した。次いで、細胞を150μlのCellwash(BD, cat no: 349524)で３回洗浄し、続いて染色緩衝液(BD, cat no: 554656)中に再懸濁後、フローサイトメトリに供した。樹状細胞をリンパ球領域の外側でのCD11c+事象(すなわち、リンパ球より高いFSC及びSSCシグナル)としてゲーティングした。合計200,000細胞を、HTSローダーを備えるFACSCanto IIフローサイトメータで獲得し、ペプチド-蛍光(すなわち、GeoMean)に関する総細胞及び樹状細胞の両方のヒストグラムを作成した。

【0133】

先頭、中間及び末尾に付加したアルギニンが細胞に進入する能力を向上させることが明らかに理解された。アルギニンのバリエーションが細胞に進入する能力を決定し、先頭に２つ及び中間に２つで最良の結果が得られる−が、しかし種々の量のアルギニンのバリエーションが全て良好な結果を示すことが認められた。
下記の表に示すデータは、FACS Duvaソフトウェアにより算出される各試験ペプチドの相乗平均値(geomean-value)である。トリプシン処理/Cytofix/Cytopermによる相乗平均値は以下のとおりである：

【0134】

【表3】

【0135】

表４に示されるように、本発明によるペプチドは、細胞膜を通って転位する能力を有していた。

【0136】

【表4-1】

【0137】

【表4-2】

【0138】

実施例２
陽性CTL応答は、代替的に、ELISPOTアッセイにより評価されてもよい。

ELISPOTアッセイによるヒトIFN-γ細胞傷害性Ｔ-細胞(CTL)応答
簡潔には、１日目に、HCV患者からのPBMCサンプルを、フラスコにおいて(430,000 PBMC/cm2)、L-グルタミン(MedProbe Cat. No. 13E17-605E)、10％胎仔ウシ血清(FBS)(Fisher Scientific Cat. No. A15-101)及びペニシリン/ストレプトマイシン(Fisher Acientific Cat. No. P11-010)を補充した被覆量の培養培地(RPMI 1640 Fisher Scientific；Cat No. PAAE15-039)中、37℃、５％ CO2にて２時間インキュベートして、単球を接着させた。非接着性細胞を単離し、洗浄して、更なる使用までFBS中10％ V/V DMSOに凍結させた。接着性細胞を培養培地で注意深く洗浄し、続いて２μg/ml最終濃度のhrGM-CSF(Xiamen amoytop biotech co, cat no: 3004.9090.90)及び１μg/mlのhrIL-4(Invitrogen, Cat no: PHC0043)を含む培養培地中で37℃にて３日目までインキュベートした。その後、６日目に、この手順を繰り返した。７日目に、培養樹状細胞(5 000〜10 000/ウェル)を、解凍した自家非接着性細胞(200 000/ウェル)、抗原サンプル(ペプチド抗原については１〜８μg/mlの最終濃度；コンカナバリンＡ(Sigma, Cat no: C7275)又はPHA(Sigma, Cat no: L2769)については５μg/ml最終濃度)及び抗-アネルギー抗体(抗-PD-1(eBioscience, cat no: 16-9989-82)及び抗-PD-L1(eBioscience, cat no: 16-5983-82)の両方について0.03〜0.05μg/mlの最終濃度)と共に、0.5μg/ウェルの抗-ヒトγインターフェロンでコートしたELISPOT(Millipore multiscreen HTS)プレートに添加した。プレートを一晩インキュベートし、スポットを製造業者に従って発色させた。スポットをELISPOTリーダー(CTL-ImmunoSpot(登録商標) S5 UV Analyzer)で読み取った。

【0139】

【表5】

【0140】

ペプチドは、概して、ペプチドなし及び無関係のコントロールペプチドと比較して、より高量のＴ-細胞スポットを示した。このことは、ペプチドがHCV-患者において肯定的な免疫学的効果を有することを明確に示している。

【0141】

実施例３
REVEAL & ProVE(登録商標) Rapid Epitope Discovery Systemの詳細

表６に列挙した九量体についてのHLAに対する結合特性を以下のHLA-クラスについて試験した：
HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A11、HLA-A24、HLA-A29、HLA-B7、HLA-B8、HLA-B14、HLA-B15、HLA-B27、HLA-B35、HLA-B40。
ペプチドは、Prospector PEPscreen(登録商標)：カスタムペプチドライブラリとして合成した。８〜15アミノ酸長のペプチドを0.5〜２mgの量で、高い平均純度で合成した。MALDI-TOF質量分析による品質管理を100％のサンプルについて実施した。

【0142】

REVEAL^TM結合アッセイにより、各候補ペプチドの１以上のMHCクラスＩ対立遺伝子に結合する能力及びMHC-ペプチド複合体を安定化する能力を決定した。この結合を高及び中親和性Ｔ細胞エピトープの結合と比較することにより、タンパク質配列中の可能性の最も高い免疫原性ペプチドを同定することができる。検出は、天然型コンホメーションのMHC-ペプチド複合体の存否に基づく。
各ペプチドに、既知のＴ細胞エピトープである陽性コントロールペプチドとの比較でスコアを与える。試験ペプチドのスコアは、陽性コントロールペプチドにより生じたシグナルのパーセンテージとして定量的に示す。ペプチドは、推定の合格又は不合格結果を有すると表わされる。アッセイ性能は、試験対象の対立遺伝子により弱い親和性で結合することが知られている中間コントロールペプチドを含ませることによって確認する。

【0143】

表６

【表6-1】

【0144】

【表6-2】

【0145】

【表6-3】

【0146】

【表6-4】

【0147】

実施例４
細胞内染色：
HCV、インフルエンザ又はCMVに由来するX²及びX⁴を有する本発明によるペプチドを調製し、上記「細胞透過アッセイ」に記載される実験で細胞内染色について試験した。

【0148】

【表7】

【0149】

【表8】

【0150】

結果：骨格フォーム上のペプチドが、天然型ペプチド又はX¹、X³及びX⁵に他のアミノ酸を有するペプチドと比較して、取込みが向上することが観察された。

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]