特許 6069334 皮膚美白物質スクリーニング構造体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6069334

(24)【登録日】2017年1月6日

(45)【発行日】2017年2月1日

(54)【発明の名称】皮膚美白物質スクリーニング構造体

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/071 20100101AFI20170123BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20170123BHJP

   G01N 33/15 20060101ALI20170123BHJP

   C12Q 1/68 20060101ALI20170123BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20170123BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20170123BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/071

   C12Q1/02

   G01N33/15 Z

   C12Q1/68 A

   G01N33/53 D

   !C12N15/00 A

【請求項の数】9

【全頁数】18

(21)【出願番号】特願2014-536989(P2014-536989)

(86)(22)【出願日】2012年10月18日

(65)【公表番号】特表2015-501152(P2015-501152A)

(43)【公表日】2015年1月15日

(86)【国際出願番号】KR2012008555

(87)【国際公開番号】WO2013058578

(87)【国際公開日】20130425

【審査請求日】2015年10月8日

(31)【優先権主張番号】10-2011-0106614

(32)【優先日】2011年10月18日

(33)【優先権主張国】KR

(31)【優先権主張番号】10-2012-0114965

(32)【優先日】2012年10月16日

(33)【優先権主張国】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】506213681

【氏名又は名称】株式会社アモーレパシフィック

【氏名又は名称原語表記】ＡＭＯＲＥＰＡＣＩＦＩＣ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ

(73)【特許権者】

【識別番号】514083281

【氏名又は名称】ドングク ユニバーシティ インダストリー−アカデミック コーポレイション ファウンデーション

(74)【代理人】

【識別番号】110000556

【氏名又は名称】特許業務法人 有古特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】イ， エ ヨン

(72)【発明者】

【氏名】イ， テ リョン

(72)【発明者】

【氏名】チョイ， ヒョン ジョン

【審査官】 北村 悠美子

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００９−２１９４９１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１１−０９２１７９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００７−２８９０６３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Journal of Investigative Dermatology，２０１２年 ９月 ６日，Vol.133，p.191-200

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ ５／００−５／２８

Ｃ１２Ｑ １／００−１／７０

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）を含む線維芽細胞層と、
ケラチノサイト（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）およびメラノサイト（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ）を含む層とが積層された皮膚美白物質スクリーニング構造体であって、
線維芽細胞、ケラチノサイトおよびメラノサイトのうち一つ以上の細胞は、正常皮膚組織と比べて、
ＷＩＦ１（Ｗｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ １）の発現が抑制され、
ＷＮＴ１またはＷＮＴ５ａの発現が増加されるか、ＮＦＡＴＣ２（ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ，ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ２）が脱リン酸化された細胞である、
皮膚美白物質スクリーニング構造体。

【請求項2】

線維芽細胞層は、コラーゲンに線維芽細胞が含まれている層である、請求項１に記載の皮膚美白物質スクリーニング構造体。

【請求項3】

コラーゲンは、皮膚美白物質スクリーニング構造体の重量全体を基に、０．００１質量％〜３０質量％含まれる、請求項２に記載の皮膚美白物質スクリーニング構造体。

【請求項4】

線維芽細胞、ケラチノサイトおよびメラノサイトのうち一つ以上の細胞は、ヒト、マウス、ギニアピッグ、ニワトリおよびブタの中から選択された一つ以上に由来した細胞である、請求項１に記載の皮膚美白物質スクリーニング構造体。

【請求項5】

皮膚美白物質は、皮膚の過色素沈着症を改善する皮膚美白物質を含む、請求項１に記載の皮膚美白物質スクリーニング構造体。

【請求項6】

候補物質を処理した請求項１〜５のいずれか一項による皮膚美白物質スクリーニング構造体において、線維芽細胞、ケラチノサイトおよびメラノサイトのうち一つ以上の細胞のＷＩＦ１、ＷＮＴ１およびＷＮＴ５ａのうち一つ以上の発現の程度、またはＮＦＡＴＣ２の脱リン酸化の程度を確認するステップを含む、皮膚美白物質スクリーニング方法。

【請求項7】

発現の程度またはリン酸化の程度を確認するステップ以降に、正常皮膚組織と比べてＷＩＦ１の発現の程度を増加させる物質を皮膚美白物質と判断するステップをさらに含む、請求項６に記載の皮膚美白物質スクリーニング方法。

【請求項8】

発現の程度またはリン酸化の程度を確認するステップ以降に、正常皮膚組織と比べてＷＮＴ１またはＷＮＴ５ａの発現の程度を減少させる物質を皮膚美白物質と判断するステップをさらに含む、請求項６に記載の皮膚美白物質スクリーニング方法。

【請求項9】

発現の程度またはリン酸化の程度を確認するステップ以降に、正常皮膚組織と比べてＮＦＡＴＣ２のリン酸化の程度を増加させる物質を皮膚美白物質と判断するステップをさらに含む、請求項６に記載の皮膚美白物質スクリーニング方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、皮膚美白物質スクリーニングシステムおよび皮膚美白物質スクリーニング方法に関する。

【背景技術】

【0002】

これまで、新規皮膚美白物質を開発するにあたっては、候補物質をメラニン生成細胞であるメラノサイト（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ）に直接処理した後、メラニンの生成を抑制するかどうかを確認したり、メラノサイトに紫外線を照射し、候補物質がその際に発生するメラニン生成信号を遮断するかどうかを確認したりする方法を使用してきた。しかし、実際、皮膚においてメラノサイトは、単独で存在せずに、他の周辺の細胞や微細環境から直接または間接的に物理的または化学的な影響を受けてメラニンを生成することになるが、メラノサイトだけでは、こうした実際の皮膚組織の状態を再現することができない。

【0003】

また、シミ、斑点、ホクロといった皮膚過色素沈着症は、その発生要因や機序が紫外線によるメラニン生成の増加と異なり、紫外線によってその症状が悪化するという傾向はあるものの、紫外線等による刺激がない場合にも、メラニンの生成と分散が継続的に増加する。したがって、既存の紫外線照射方法を基に開発した皮膚美白物質の場合、実際の臨床においては、人間の皮膚過色素沈着症抑制の効果を示さない場合が多い。さらに、皮膚の過色素沈着症を研究するために、被検者の過色素沈着部位の皮膚を生検して使用することは、その費用と労力が非常にかかり、人間の皮膚組織を得ることも容易でないだけでなく、紫外線照射モデルと異なり、皮膚過色素沈着症の動物モデルも手に入れることが困難である。

【0004】

そこで、人間の皮膚組織構造、特に、皮膚過色素沈着症を示す人間の皮膚組織の構造と非常に類似しながらも、簡便に皮膚美白物質をスクリーニングすることのできるシステムおよびスクリーニング方法に対する要求が存在している。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】韓国登録特許第１０‐０８４０１４４号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明の一側面は、効果的でありながらも簡便に、臨床的に有用な皮膚美白物質をスクリーニングすることができる皮膚美白物質スクリーニングシステムおよびこれを利用した皮膚美白物質スクリーニング方法を提供しようとするものである。

【0007】

本発明の他の一側面は、前記皮膚美白物質スクリーニング方法によりスクリーニングされた物質を有効成分として含み、優れた美白効果を示す皮膚美白用組成物を提供しようとするものである。

【0008】

また、本発明の他の一側面は、皮膚のメラニン生成関与遺伝子自体を有効成分として含む、皮膚美白用組成物または皮膚外用剤組成物を提供しようとするものである。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明の一側面は、線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）、ケラチノサイト（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）およびメラノサイト（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ）のうち一つ以上の細胞を含む一つ以上の層を含む皮膚美白物質スクリーニングシステムを提供する。

【0010】

本発明の他の一側面は、候補物質を処理した前記皮膚美白物質スクリーニングシステムにおいて、線維芽細胞、ケラチノサイトおよびメラノサイトのうち一つ以上の細胞のＷＩＦ１、ＷＮＴ１、ＷＮＴ５ａおよびＮＦＡＴＣ２のうち一つ以上の発現の程度またはリン酸化の程度を確認するステップを含む、皮膚美白物質スクリーニング方法を提供する。

【0011】

本発明のまた他の一側面は、前記皮膚美白物質スクリーニング方法によりスクリーニングされた物質を有効成分として含む皮膚美白用組成物、または、ＷＩＦ１自体を有効成分として含む皮膚美白用組成物および皮膚外用剤組成物を提供する。

【発明の効果】

【0012】

本発明に係る皮膚美白物質スクリーニングシステムは、実際の皮膚組織に近く設計されるため、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいても、臨床的に美白効果のある物質を少ない時間と費用で簡便にスクリーニングすることができる。特に、メラノサイトに候補物質を処理した後、紫外線を照射することにより美白物質をスクリーニングしていた既存の方法と異なり、本発明に係る皮膚美白物質スクリーニングシステムは、過色素沈着症を示す実際の皮膚組織の遺伝子発現の程度および信号伝達因子のリン酸化の程度と類似した条件を有するので、これを利用する場合、皮膚美白物質、特に、過色素沈着症の改善に効果的な物質を簡便にスクリーニングすることができる。これは、過色素沈着症研究のための人間および動物モデルを手に入れることが困難であるという点において、新規な皮膚美白物質、具体的に、過色素沈着症改善物質を開発するための有用なシステムまたはキットとなり得るものである。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】被験者の正常皮膚（Ｎ）と皮膚過色素沈着部位（Ｌ）との、ＷＩＦ１遺伝子の発現程度の差を比較したグラフである。

【図2】被験者の正常皮膚（Ｎ）と皮膚過色素沈着部位（Ｌ）との、ＷＮＴ１およびＷＮＴ５ａの発現程度の差を比較したグラフである。

【図3】メラノサイト（ＭＣ）、ケラチノサイト（ＫＣ）および線維芽細胞（ＦＢ）における、ＷＩＦ１遺伝子の発現程度の差を比較したグラフである。

【図4】ＷＩＦ１の発現を抑制させた線維芽細胞を含む美白スクリーニングシステムにおいて、チロシナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）の発現が増加することを示す結果である。

【図5】ＷＩＦ１の発現を抑制させた線維芽細胞を含む美白スクリーニングシステムにおいて、メラノソームの移動が増加したことを示す結果である。

【図6】ＷＩＦ１の発現を抑制させた線維芽細胞を含む美白スクリーニングシステムにおいて、ＮＦＡＴＣ２が脱リン酸化されることを示す結果である。

【図7】ＷＩＦ１の発現を抑制させたケラチノサイトを含む美白スクリーニングシステムにおいて、チロシナーゼの発現が増加することを示す実験結果である。

【図8】ＷＩＦ１の発現を抑制させたケラチノサイトを含む美白スクリーニングシステムにおいて、メラノソームの移動が増加したことを示す結果である。

【図9】ＷＩＦ１の発現を抑制させたケラチノサイトを含む美白スクリーニングシステムにおいて、ＮＦＡＴＣ２が脱リン酸化されることを示す結果である。

【図10】遺伝子組換え技術により作られたヒトＷＩＦ１をメラノサイトに処理したときに、メラノサイトのＷＩＦ１発現が増加することを示す結果である。

【図11】図１０のようにＷＩＦ１の発現を誘導したメラノサイトにおいて、チロシナーゼの発現が減少することを示す結果である。

【図12】遺伝子組換え技術により作られたヒトＷＩＦ１を、メラノサイトを含む美白スクリーニングシステムにおいて処理したときに、メラノソームの移動が減少したことを示す結果である。

【図13】図１０のようにＷＩＦ１の発現を誘導したメラノサイトにおいて、ＮＦＡＴＣ２がリン酸化されることを示す結果である。

【発明を実施するための形態】

【0014】

本明細書において、“皮膚”とは、動物の体表を覆う組織を意味するものであって、顔またはボディ等の体表を覆う組織だけでなく、頭皮や毛髪を含む最広義の概念である。

【0015】

皮膚のメラノサイト（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ）は、皮膚色を決定するメラニン（ｍｅｌａｎｉｎ）を作る細胞であって、皮膚の真皮と表皮の境界線の役割をする基底膜の上に位置する。発生学的に、メラノサイトは、ニューラルクレスト細胞（ｎｅｕｒａｌ‐ｃｒｅｓｔ ｃｅｌｌｓ）から出発して、メラノサイト幹細胞（Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、前駆細胞であるメラノブラスト（ｍｅｌａｎｏｂｌａｓｔ）を経て皮膚へと移動しながら、最終的にメラニンを生成することができる色素細胞であるメラノサイトへと分化するものと知られている。

【0016】

このように分化したメラノサイトは、皮膚内において単独で存在するのでなく、その上方に位置する角質形成細胞であるケラチノサイトとの結合および下方に位置する真皮にある線維芽細胞の影響を受けてメラニンを生成することになる。メラノサイトで作られたメラニンは、細胞突起（ｄｅｎｄｒｉｔｅ）を介して周辺にあるケラチノサイトへ移動して、皮膚表面に広く分散されることにより、紫外線といった有害因子から皮膚を保護し、皮膚色を現わす。正常皮膚は、紫外線のような刺激が来たときに、平素よりも多くのメラニンを生成し、メラニンの分散を増加させた後、そうした刺激が消滅すると、メラニンの生成と分散を再び低い水準に戻す。

【0017】

先に述べたように、メラノサイトが皮膚内において他の細胞たちや周囲微細環境の物理的、化学的要因から複合的な影響を受けてメラニンを生成するという、実際の皮膚条件を反映できていない既存の方法によって開発された美白物質、その中でも特に紫外線照射方法によって開発された皮膚美白物質は、皮膚の過色素沈着症改善において、臨床的に低い効果を示す場合が多い。皮膚過色素沈着症は、多様な発生原因と特異的な機作による皮膚の黒化であるため、これを効果的に改善することのできる美白物質を開発するためには、実際の皮膚と類似した実験モデルを作り、これを利用して、美白物質を開発することが必要である。

【0018】

以下、本発明について詳細に説明する。

【0019】

本発明の一側面は、線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）、ケラチノサイト（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）およびメラノサイト（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ）のうち一つ以上の細胞を含む一つ以上の層を含む皮膚美白物質スクリーニングシステムを提供する。本発明の他の一面は、線維芽細胞を含む線維芽細胞層；ケラチノサイトを含むケラチノサイト層およびメラノサイトを含むメラノサイト層を含む皮膚美白物質スクリーニングシステムを提供する。このとき、実際の皮膚条件と類似するように、線維芽細胞層が最も下に積層され、その上にメラノサイト層が積層され、その上にケラチノサイト層が積層されてよい。

【0020】

本発明のまた他の一側面に係る皮膚美白物質スクリーニングシステムは、線維芽細胞を含む線維芽細胞層；および、ケラチノサイトおよびメラノサイトのうち一つ以上を含む層を含んで、ケラチノサイトおよびメラノサイトを同一の層に含めてよい。このとき、線維芽細胞層が下に積層され、その上にメラノサイトとケラチノサイトを含む層が積層されてよい。前記皮膚美白物質スクリーニングシステムは、皮膚細胞層が積層された３次元立体構造のシステムであって、メラノサイトだけでなく周辺にある細胞を含めることにより、実際の皮膚状態を正しく反映することができる。本発明の他の一側面に係る皮膚美白物質スクリーニングシステムは、線維芽細胞層を除き、メラニンの生成により重要な役割をするものと知られているメラノサイトとケラチノサイトを含む層を含んでよい。

【0021】

本発明の一側面に係る皮膚美白物質スクリーニングシステムの線維芽細胞層は、真皮層を再現したものであって、コラーゲンに線維芽細胞が含まれている層を含む。具体的に、前記線維芽細胞層は、コラーゲン液に線維芽細胞を入れ、固めて製造した層であってよい。

【0022】

本発明の他の一側面において、前記コラーゲンは、皮膚美白物質スクリーニングシステムの重量全体を基に、０．００１質量％〜３０質量％、具体的に０．０１質量％〜２０質量％、より具体的に０．１質量％〜１０質量％含まれてよい。前記範囲で含む場合、本発明の意図した効果を示すのに適し、費用対効果の側面においても、前記範囲で使用することが適切であり得る。

【0023】

本発明の一側面に係る皮膚美白物質スクリーニングシステムにおいて、線維芽細胞、ケラチノサイトおよびメラノサイトのうち一つ以上の細胞は、ヒト、マウス、ギニアピッグ、ニワトリといった鳥類およびブタの中から選択された一つ以上から由来した細胞を含む。

【0024】

本発明の一側面による皮膚美白物質スクリーニングシステムは、皮膚美白効果のある物質、具体的に、紫外線による皮膚黒化改善効果のある物質だけでなく、特に、シミ、斑点、ホクロといった皮膚過色素沈着症改善効果のある物質を効果的にスクリーニングしてよい。

【0025】

本発明者らは、過色素沈着症を示す皮膚において、胚成長調節と関連のある細胞外信号伝達分子であるＷＩＦ１（Ｗｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ １，ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＮＰ＿００９１２２，ＶＥＲＳＩＯＮ ＮＰ＿００９１２２．２ ＧＩ：１１１１２５０１１）遺伝子の発現が減少し、具体的に、ＷＩＦ１遺伝子の発現は、皮膚細胞の中でも、メラニン生成細胞であるメラノサイトでなく、ケラチノサイトと線維芽細胞において減少することにより、メラノサイトのメラニン生成に影響を与えるということを明らかにした。また、ＷＩＦ１遺伝子の発現が減少した皮膚において、メラニンの生成に関与するチロシナーゼの発現が増加すると同時に、ケラチノサイトへのメラニン拡散が増加することを明らかにして、ＷＩＦ１と皮膚過色素沈着症の間に密接な関連があることを確認した。このとき、ＷＩＦ１遺伝子の発現は、ＧＳＫ‐３β（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ‐３β）とβ‐カテニン（β‐ｃａｔｅｎｉｎ）のリン酸化、ＭＩＴＦ（ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｍｉａ‐ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）の発現に関与して、皮膚過色素沈着に影響を与えるということも確認した。

【0026】

そこで、本発明の一側面は、線維芽細胞、ケラチノサイトおよびメラノサイトのうち一つ以上の細胞のＷＩＦ１発現が抑制された皮膚美白物質スクリーニングシステム、具体的に、ケラチノサイトまたは線維芽細胞のＷＩＦ１発現が抑制された皮膚美白物質スクリーニングシステムを提供する。本発明の他の一側面において、前記皮膚美白物質スクリーニングシステムは、ｓｉＲＮＡを利用してＷＩＦ１の発現が抑制された細胞を含む。前記スクリーニングシステムは、ケラチノサイトまたは線維芽細胞のＷＩＦ１発現が減少した過色素沈着症の皮膚状態を反映したものであって、過色素沈着症を示す皮膚状態を実際とほぼ類似に再現してよい。したがって、前記スクリーニングシステムを利用する場合、皮膚美白効能のある物質、特に、皮膚過色素沈着症の改善に効能のある物質を効果的に選別してよい。

【0027】

また、本発明者らは、過色素沈着症を示す皮膚において、癌原遺伝子（ｐｒｏｔｏ‐ｏｎｃｏｇｅｎｅ）前駆体ＷＮＴ１（Ｗｉｎｇｌｅｓｓ‐ｔｙｐｅ ＭＭＴＶ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ ｆａｍｉｌｙ，ｍｅｍｂｅｒ １，ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＮＰ＿００５４２１，ＶＥＲＳＩＯＮ ＮＰ＿００５４２１．１ ＧＩ：４８８５６５５）およびタンパク質ＷＮＴ５ａ（Ｗｉｎｇｌｅｓｓ‐ｔｙｐｅ ＭＭＴＶ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ ｆａｍｉｌｙ，ｍｅｍｂｅｒ ５ａ，ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＮＰ＿００１２４３０３４，ＶＥＲＳＩＯＮ ＮＰ＿００１２４３０３４．１ ＧＩ：３７１５０２０８７）遺伝子の発現が増加し、信号伝達因子であるＮＦＡＴＣ２（ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ，ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ，ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ‐ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ２）が脱リン酸化されることを明らかにし、そこで、本発明の一側面は、線維芽細胞、ケラチノサイトおよびメラノサイトのうち一つ以上の細胞がＷＮＴ１およびＷＮＴ５ａの発現が増加された細胞またはＮＦＡＴＣ２が脱リン酸化された細胞である皮膚美白物質スクリーニングシステムを提供する。前記スクリーニングシステムは、過色素沈着層を示す皮膚状態を実際に近く再現することができるので、皮膚美白効能のある物質、特に、皮膚過色素沈着症改善に効能のある物質を効果的に選別してよい。

【0028】

従来には、天然物、その抽出物または化学合成物質といった候補物質を、メラノサイトにのみ処理して美白効能の有無を評価していた。こうした既存の方法による場合、細胞培養液に希釈した候補物質を細胞に直接処理しなければならず、また、クリームやローションのように、実際に使用される剤形に候補物質を適用した状態では、メラノサイトに処理することができない。したがって、既存の方法では、臨床試験を実施して初めて、候補美白物質を含む剤形に、臨床的に実際に美白効果があるのかを確認することができる。

【0029】

これに対し、本発明に係る皮膚美白物質スクリーニングシステムは、既存の方法のように、候補物質を培養液に希釈して使用することによってその美白効果の有無を評価することができるのはもちろん、候補物質を含有するクリームやローションといった剤形を使用してその美白効果の有無を評価することもできる。このとき、剤形に対して美白効果の有無を評価するための皮膚美白物質スクリーニングシステムは、線維芽細胞、メラノサイトおよびケラチノサイトのうち一つ以上を含む複数の層を積層した後、空気に露出させて人工皮膚として製造したものであってよい。

【0030】

このように、本発明に係る皮膚美白スクリーニングシステムは、実際の皮膚と類似した生理的、化学的特徴を有し、実際に使用する剤形を使用してもその美白効果の評価が可能であるため、実際に臨床的に美白効果のある物質をより短い時間内に、少ない費用で効率的かつ勘弁に選別することを可能にする。

【0031】

本発明の一側面は、候補物質を処理した前記皮膚美白物質スクリーニングシステムにおいて、線維芽細胞、ケラチノサイトおよびメラノサイトのうち一つ以上の細胞の、ＷＩＦ１、ＷＮＴ１、ＷＮＴ５ａおよびＮＦＡＴＣ２のうち一つ以上の発現の程度、またはリン酸化の程度を確認するステップを含む、皮膚美白物質スクリーニング方法を提供する。先に述べたように、ＷＩＦ１、ＷＮＴ１、ＷＮＴ５ａおよびＮＦＡＴＣ２は、いずれも皮膚のメラニン色素の発現および拡散の程度と関連がある。具体的に、ＷＩＦ１の発現が減少したり、ＷＮＴ１またはＷＮＴ５ａの発現が増加したり、あるいはＮＦＡＴＣ２の脱リン酸化の程度が増加することは、メラニン生成に関与する酵素であるチロシナーゼの発現が増加し、ケラチノサイトへのメラニン拡散が増加することを意味する。したがって、候補物質がＷＩＦ１、ＷＮＴ１、ＷＮＴ５ａおよびＮＦＡＴＣ２のうち一つ以上の発現の程度またはリン酸化の程度にどのような影響を与えるかを確認することにより、前記候補物質に皮膚美白効果があるかどうかを評価することができる。

【0032】

本発明の一側面に係る皮膚美白物質スクリーニング方法は、ＷＩＦ１の発現の程度を確認するステップ以降に、ＷＩＦ１の発現の程度を増加させる物質を皮膚美白物質と判断するステップをさらに含んでよい。本発明の他の一側面に係る皮膚美白物質スクリーニング方法は、ＷＮＴ１またはＷＮＴ５ａの発現の程度を確認するステップ以降に、ＷＮＴ１またはＷＮＴ５ａの発現の程度を減少させる物質を皮膚美白物質と判断するステップをさらに含んでよい。

【0033】

本発明の他の一側面に係る皮膚美白物質スクリーニング方法は、ＮＦＡＴＣ２のリン酸化の程度を確認するステップ以降に、ＮＦＡＴＣ２のリン酸化の程度を増加させる物質を皮膚美白物質と判断するステップをさらに含んでよい。特に、ＷＩＦ１の発現が減少したり、ＷＮＴ１またはＷＮＴ５ａの発現が増加したり、ＮＦＡＴＣ２の脱リン酸化が行われたりした線維芽細胞、メラノサイトおよびケラチノサイトのうち一つ以上の細胞を含む皮膚美白物質スクリーニングシステムは、皮膚黒化がなされた実際の皮膚条件を再現しているものであるので、候補物質が前記のように調節されたシステムのＷＩＦ１、ＷＮＴ１またはＷＮＴ５ａ遺伝子の発現の程度または信号伝達因子ＮＦＡＴＣ２のリン酸化の程度をどのように変化させるのかを評価することにより、候補物質が美白効果のある物質であるかどうか、特に、皮膚過色素沈着症を改善し得る物質であるかどうかを確認することができる。

【0034】

本発明の一側面は、前記皮膚美白物質スクリーニング方法によりスクリーニングされた物質を有効成分として含む皮膚美白用組成物を提供する。先に述べたように、線維芽細胞、ケラチノサイトおよびメラノサイトのうち一つ以上の細胞において、ＷＩＦ１の発現を増加させたり、ＷＮＴ１またはＷＮＴ５ａの発現を減少させたり、あるいはＮＦＡＴＣ２の脱リン酸化の程度を増加させる物質は、皮膚美白効果、具体的に、皮膚過色素沈着症改善効果のある物質であると判断することができるので、これを有効成分として含む組成物は、皮膚美白効果、具体的に、皮膚過色素沈着症改善効果を示し得る。

【0035】

本発明の他の一側面は、前記のような本発明に係る遺伝子であるＷＩＦ１自体を含む美白用組成物または皮膚外用剤組成物を提供することにより、ＷＩＦ１のチロシナーゼの発現を抑制し、ケラチノサイトへのメラニン拡散を抑制することによる皮膚美白および皮膚過色素沈着症改善効果を示し得る。

【0036】

本発明の他の一側面に係る美白用組成物は、化粧品組成物、薬学組成物または食品組成物を含む。

【0037】

本発明の一側面に係る組成物の剤形例について以下説明するが、他の様々な剤形にも応用可能であり、これらは、本発明を限定しようとするものでなく、単に具体的に説明するためのものである。

【0038】

［製剤例１］栄養化粧水
下記表１に記載の組成に従い、通常の方法で栄養化粧水を製造してよい。

【0039】

【表1】

【0040】

［製剤例２］栄養ローション
下記表２に記載の組成に従い、通常の方法で栄養ローションを製造してよい。

【0041】

【表2】

【0042】

［製剤例３］栄養クリーム
下記表３に記載の組成に従い、通常の方法で栄養クリームを製造してよい。

【0043】

【表3】

【0044】

［製剤例４］パック
下記表４に記載の組成に従い、通常の方法でパックを製造してよい。

【0045】

【表4】

【0046】

［製剤例５］軟膏
下記表５に記載の組成に従い、通常の方法で軟膏を製造してよい。

【0047】

【表5】

【0048】

以下、実験例、実施例および比較例を挙げつつ、本発明の構成および効果についてより具体的に説明する。しかし、以下の実験例、実施例および比較例は、本発明に対する理解を助けるための例示の目的のためにのみ提供されるものであるにすぎず、本発明の範疇および範囲がそれによって制限されるものではない。

【0049】

［実験例１］皮膚過色素沈着部位におけるＷＩＦ１遺伝子の発現変化
被験者１３人の正常皮膚組織（Ｎ）と過色素沈着部位の皮膚組織（Ｌ）を生検（ｂｉｏｐｓｙ）して組織内ＲＮＡを抽出し、これを利用して、リアルタイム（ｒｅａｌ‐ｔｉｍｅ）ＰＣＲ方法により遺伝子の発現変化を調査した。その結果を図１に示した。

【0050】

図１に示されるように、過色素沈着部位の皮膚組織において、ＷＩＦ１の発現は、正常皮膚組織に比べて減少している。このことを通じて、ＷＩＦ１が皮膚過色素沈着と関連があることを確認することができる。

【0051】

［実験例２］皮膚過色素沈着部位におけるＷＮＴ１とＷＮＴ５ａの発現変化
被験者１３人の正常皮膚組織（Ｎ）と過色素沈着部位の皮膚組織（Ｌ）を生検して組織内ＲＮＡを抽出し、これを利用して、リアルタイムＰＣＲ方法でＷＮＴ１とＷＮＴ５ａ遺伝子の発現変化を調査した。その結果を図２に示した。

【0052】

図２に示されるように、過色素沈着部位の皮膚組織において、ＷＮＴ１とＷＮＴ５ａの発現は、正常皮膚組織に比べて増加している。このことを通じて、ＷＮＴ１とＷＮＴ５ａが皮膚過色素沈着と関連があることを確認することができる。

【0053】

［実験例３］皮膚細胞におけるＷＩＦ１遺伝子発現
カスケードバイオロジクス（Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）社から入手したミディアム２５４（Ｍｅｄｉｕｍ ２５４）に、ホルボール１２‐ミリスタート１３‐アセタート（ＰＭＡ，ｐｈｏｒｂｏｌ １２‐ｍｙｒｉｓｔａｔｅ １３‐ａｃｅｔａｔｅ）１０ｎｇ／ｍｌを含有したヒトメラノサイト増殖サプリメント（ＨＭＧｓ，ｈｕｍａｎ ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を入れ、これを培地として使用して、新生児の表皮から分離したヒト皮膚メラノサイトを、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターにおいて培養した。また、カスケードバイオロジクス社から入手したミディアムＥｐｉＬｉｆｅ（＃Ｍ‐ＥＰＩ‐５００‐ＣＡ）に、ヒトケラチノサイト増殖サプリメント（ＨＫＧＳ，ｈｕｍａｎ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を入れ、これを培地として使用して、新生児の表皮から分離したヒト皮膚ケラチノサイトを、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターにおいて培養した。ウシ胎児血清が１０％入ったＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ ｍｅｄｉｕｍ）に、新生児の表皮から分離したヒト皮膚線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）を入れ、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で培養した。上記のように培養した各皮膚細胞からＲＮＡを分離して、リアルタイムＰＣＲによりＷＩＦ１の遺伝子発現を調査し、その結果を図３に示した。

【0054】

図３に示されるように、線維芽細胞（ＦＢ）とケラチノサイト（ＫＣ）においてはＷＩＦ１が発現され、メラノサイト（ＭＣ）においては発現されなかった。このことを通じて、皮膚細胞においてＷＩＦ１は、メラノサイトでなく、線維芽細胞とケラチノサイトにおいて発現されることを知ることができる。

【0055】

［実施例１〜３および比較例１〜２］システムの製造
真皮の重要な構成成分であるコラーゲン１（ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｉ、１ｍｇ／ｍｌ）溶液に２．５×１０^５／ｍｌの線維芽細胞を入れ、これを６ウェルプレートにウェル当たり２ｍｌずつ入れた後、３７℃の培養器において１時間以上固めて、３次元人工真皮を作製した。その上に、１：１で混ぜた合計２．５×１０^５個のメラノサイトおよびケラチノサイト層を載せて、３次元システムを製造した。このとき、ｓｉＲＮＡを処理して、ＷＩＦ１の発現を抑制させた線維芽細胞を使用したシステムを実施例１とし、ヒトの皮膚の正常線維芽細胞を使用したシステムを比較例１とした。

【0056】

また、実施例１と実質的に同一の方法でｓｉＲＮＡを処理してＷＩＦ１の発現を抑制させたケラチノサイトとメラノサイトを利用して作製した３次元システムを実施例２とし、正常ケラチノサイトとメラノサイトを利用して作製されたシステムを比較例２とした。

【0057】

そして、ヒト組換え遺伝子を使用して作られたＷＩＦ１を５０ｎｇ／ｍｌで培養培地に処理してＷＩＦ１の発現を増加させたメラノサイトにケラチノサイトを混ぜた後、実施例１と実質的に同じ方法で作製した人工真皮上に載せて作製したシステムを、実施例３とした。

【0058】

［実験例４］ＷＩＦ１の発現を抑制させた線維芽細胞を含むシステムに対する評価
本発明に係るシステムである実施例１が実際の皮膚状態を正しく反映しているかどうかについて、次のとおり比較例１と対比しつつ評価した。

【0059】

ＷＩＦ１の発現を抑制させた線維芽細胞を含む実施例１のシステムは、実際の皮膚過色素沈着部位と同様に、メラニンの生成に重要な役割をする酵素であるチロシナーゼの発現が、比較例１に比べて著しく増加していることを、タンパク質電気泳動を通じたウエスタンブロッティング（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）方法により確認した（図４参照）。

【0060】

また、ケラチノサイトにおいてのみ発現されるケラチン１４（ｋｅｒａｔｉｎ １４）を認識する蛍光標識抗体でケラチノサイトを染色し、メラノサイトにおいて発現されるチロシナーゼ関連タンパク質１（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １，ＴＲＰ １）を認識する異なる色の蛍光が結合された抗体でメラノサイトを染色して、２つの蛍光をいずれも有しているケラチノサイトの数をＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ‐ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）を利用して確認した結果、実施例１は、皮膚過色素沈着部位のように、ケラチノサイトへのメラニン拡散が比較例１に比べて増加していた（図５参照）。また、このとき、タンパク質電気泳動を通じたウエスタンブロッティング方法を通じて、実施例１のシステムにおいて信号伝達因子であるＮＦＡＴＣ２（ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ，ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ，ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ‐ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ２）のリン酸化された形態（ｐ‐ＮＦＡＴＣ２）が減少していることを観察することができた（図６参照）。

【0061】

これらのことを基に、線維芽細胞、メラノサイトおよびケラチノサイトを積層して３次元的に製造した本発明に係るシステムは、実際の皮膚状態と類似し、特に、皮膚過色素沈着部位を再現できることを確認することができる。

【0062】

［実験例５］ＷＩＦ１の発現を抑制させたケラチノサイトを含むシステムに対する評価
本発明に係るシステムである実施例２が実際の皮膚状態を正しく反映しているかどうかについて、次のとおり比較例２と対比しつつ評価した。

【0063】

ＷＩＦ１の発現を抑制させたケラチノサイトを含む実施例２のシステムについて、実験例４と実質的に同一の方法で評価した結果、実際の皮膚過色素沈着部位と同様に、メラニンの生成に重要な役割をする酵素であるチロシナーゼの発現が、比較例２に比べて著しく増加していることを確認した（図７参照）。

【0064】

また、実験例４と実質的に同一の方法で評価したところ、実施例２においても、皮膚過色素沈着部位のようにメラニン拡散が増加していることを確認した（図８参照）。そして、このとき、ＮＦＡＴＣ２のリン酸化された形態であるｐ‐ＮＦＡＴＣ２が減少したことを確認して、ＮＦＡＴＣ２が脱リン酸化されていることを確認した（図９参照）。

【0065】

これらのことを通じて、メラノサイト、ケラチノサイトを利用して３次元的に製造した本発明に係るシステムも、実際の皮膚状態と類似し、特に、皮膚過色素沈着部位を再現できることを確認することができる。

【0066】

［実験例６］ヒト組換え遺伝子を利用して作られたＷＩＦ１を直接培養培地に処理して細胞自体のＷＩＦ１発現を増加させたメラノサイトを含むシステムに対する評価
ヒト組換え遺伝子を使用して作ったＷＩＦ１を細胞培養培地に５０ｎｇ／ｍｌとなるように処理したメラノサイトを含む実施例３のシステムについて、タンパク質電気泳動を通じたウエスタンブロッティング方法によりＷＩＦ１の発現が増加したことを確認した（図１０参照）。このとき、実験例４と実質的に同一の方法により、実施例３のシステムにおいてチロシナーゼの発現が減少したことを確認した（図１１参照）。また、比較例１と比較した結果、実施例３においてメラニンの拡散が減少することを確認することができ（図１２参照）、ＮＦＡＴＣ２のリン酸化が増加することも確認した（図１３参照）。

【0067】

これらのことを通じて、ＷＩＦ１とＮＦＡＴＣ２は、メラニン色素の生成と密接な関連性があるため、本発明に係るシステムの候補物質を処理し、その後ＷＩＦ１の発現増加の程度とその下位信号伝達因子であるＮＦＡＴＣ２のリン酸化の程度についての評価を通じて、皮膚美白物質をスクリーニングすることができることを知ることができる。

【0068】

このように、本発明に係る皮膚美白物質スクリーニングシステムは、実際の皮膚を再現することができるので、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいても、臨床的に優れた美白効果を示す物質を効果的にスクリーニング可能にする。さらに、これは、人間の実際の皮膚組織を正しく反映しているので、白斑症または白毛といった色素欠乏症のメカニズムまたは改善方法の研究にも使用され得るものである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】