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特許6070769蛍光標識抗体可変領域含有ポリペプチド複合体を用いた蛍光免疫測定キット
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6070769
(24)【登録日】2017年1月13日
(45)【発行日】2017年2月1日
(54)【発明の名称】蛍光標識抗体可変領域含有ポリペプチド複合体を用いた蛍光免疫測定キット
(51)【国際特許分類】
A61K 49/00 20060101AFI20170123BHJP
【ＦＩ】
A61K49/00 ZZNA
【請求項の数】13
【全頁数】30
(21)【出願番号】特願2015-110229(P2015-110229)
(22)【出願日】2015年5月29日
(62)【分割の表示】特願2013-541635(P2013-541635)の分割
【原出願日】2012年11月1日
(65)【公開番号】特開2015-193631(P2015-193631A)
(43)【公開日】2015年11月5日
【審査請求日】2015年5月29日
(31)【優先権主張番号】特願2011-241402(P2011-241402)
(32)【優先日】2011年11月2日
(33)【優先権主張国】JP
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】000102212
【氏名又は名称】ウシオ電機株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100091096
【弁理士】
【氏名又は名称】平木 祐輔
(74)【代理人】
【識別番号】100118773
【弁理士】
【氏名又は名称】藤田 節
(74)【代理人】
【識別番号】100111741
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 夏夫
(72)【発明者】
【氏名】上田 宏
(72)【発明者】
【氏名】阿部 亮二
(72)【発明者】
【氏名】高木 広明
【審査官】
金田 康平
(56)【参考文献】
【文献】
国際公開第２００９／１５４２８３（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ａ６１Ｋ４９／００−４９／２２
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗体軽鎖可変領域を含むポリペプチドと抗体重鎖可変領域を含むポリペプチドの両方が蛍光色素により標識された、前記抗体軽鎖可変領域を含むポリペプチドと抗体重鎖可変領域を含むポリペプチドからなる複合体を含む、動物生体内に投与され、動物生体内における抗原の位置、抗原の移動、抗原量、又は抗原量の変化を観察するためのキットであって、抗体軽鎖可変領域を含むポリペプチドと抗体重鎖可変領域を含むポリペプチドが、それぞれ異なる種類の蛍光色素により標識されており、前記蛍光色素は蛍光標識複合体を形成した状態で、抗原の非存在下でクエンチされた状態にあり、複合体と抗原が結合したときにクエンチが解消され蛍光強度が増加し、
液相中の抗原濃度と前記蛍光色素の蛍光強度とが正の相関関係にあることを指標として、動物生体内の抗原濃度の測定又は抗原の可視化を可能とすることを特徴とするキット。
液相中の抗原濃度と前記蛍光色素の蛍光強度とが正の相関関係にあることを指標として、動物生体内の抗原濃度の測定又は抗原の可視化を可能とすることを特徴とするキット。
【請求項2】
抗体軽鎖可変領域を含むポリペプチドと抗体重鎖可変領域を含むポリペプチドからなる複合体が、Ｆａｂ抗体（Fragment, antigen binding）、あるいはＦａｂ抗体２つがヒンジを介してジスルフィド結合で結合したＦ（ａｂ´）２抗体、あるいは完全体の抗体のいずれかである、請求項１記載のキット。
【請求項3】
抗体軽鎖可変領域を含むポリペプチドと抗体重鎖可変領域を含むポリペプチドからなる複合体が、Ｆａｂ抗体（Fragment, antigen binding）である、請求項２記載のキット。
【請求項4】
抗体軽鎖可変領域を含むポリペプチドと抗体重鎖可変領域を含むポリペプチドからなる複合体が、Ｆａｂ抗体２つがヒンジを介してジスルフィド結合で結合したＦ（ａｂ´）２抗体である、請求項２記載のキット。
【請求項5】
抗体軽鎖可変領域を含むポリペプチドと抗体重鎖可変領域を含むポリペプチドからなる複合体が、完全体の抗体である、請求項２記載のキット。
【請求項6】
抗体軽鎖可変領域を含むポリペプチドと抗体重鎖可変領域を含むポリペプチドのいずれか一方が蛍光色素、他方が該蛍光色素を消光するクエンチャーにより標識された、前記抗体軽鎖可変領域を含むポリペプチドと抗体重鎖可変領域を含むポリペプチドからなる複合体であって、蛍光色素が抗原の非存在下でクエンチャー及び抗体軽鎖可変領域を含むポリペプチド及び／又は抗体重鎖可変領域を含むポリペプチド中のトリプトファン残基により消光されている複合体を含む、動物生体内に投与され、動物生体内における抗原の位置、抗原の移動、抗原量、又は抗原量の変化を観察するためのキットであって、
液相中の抗原濃度と前記蛍光色素の蛍光強度とが正の相関関係にあることを指標として、動物生体内の抗原濃度の測定又は抗原の可視化を可能とすることを特徴とするキット。
液相中の抗原濃度と前記蛍光色素の蛍光強度とが正の相関関係にあることを指標として、動物生体内の抗原濃度の測定又は抗原の可視化を可能とすることを特徴とするキット。
【請求項7】
抗体軽鎖可変領域を含むポリペプチドと抗体重鎖可変領域を含むポリペプチドからなる複合体が、Ｆａｂ抗体（Fragment, antigen binding）、あるいはＦａｂ抗体２つがヒンジを介してジスルフィド結合で結合したＦ（ａｂ´）２抗体、あるいは完全体の抗体のいずれかである、請求項６記載のキット。
【請求項8】
抗体軽鎖可変領域を含むポリペプチドと抗体重鎖可変領域を含むポリペプチドからなる複合体が、Ｆａｂ抗体（Fragment, antigen binding）である、請求項７記載のキット。
【請求項9】
抗体軽鎖可変領域を含むポリペプチドと抗体重鎖可変領域を含むポリペプチドからなる複合体が、Ｆａｂ抗体２つがヒンジを介してジスルフィド結合で結合したＦ（ａｂ´）２抗体である、請求項７記載のキット。
【請求項10】
抗体軽鎖可変領域を含むポリペプチドと抗体重鎖可変領域を含むポリペプチドからなる複合体が、完全体の抗体である、請求項７記載のキット。
【請求項11】
蛍光色素が、ローダミン系蛍光色素及びオキサジン系蛍光色素から選ばれることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項12】
蛍光色素が、カルボキシローダミン１１０、カルボキシテトラメチルローダミン及びＡＴＴＯ６５５（商標名）から選ばれることを特徴とする請求項１１記載のキット。
【請求項13】
クエンチャーが、７−ニトロベンゾフラザン（ＮＢＤ）であることを特徴とする請求項６〜１０のいずれか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、固相化工程及び洗浄工程を必要とせず高感度で低分子化合物の検出が可能な抗原濃度測定・検出用キットや、抗原濃度測定・検出方法に関する。
【背景技術】
【0002】
抗体と抗原の結合を利用した免疫測定法は、試料中の物質の検出や濃度測定に広く用いられている。これら抗原や抗体の濃度を測定する方法のうち、臨床診断、基礎研究や環境調査などに最も広く用いられている測定方法は、同一の抗原の異なるエピトープを認識する２種類のモノクローナル抗体、あるいはモノクローナル抗体とポリクローナル抗体を使用する、サンドイッチＥＬＩＳＡ法（あるいはサンドイッチＲＩＡ法）と呼ばれる免疫測定法である。サンドイッチ法の詳細は以下に述べる通りである。第一段階として一次抗体と呼ばれるモノクローナル又はポリクローナル抗体を測定用プレートに固定化し、そこに抗原を含む検体を注ぎ、一定時間反応させて抗体と抗原を結合させる。次に、第二段階として、抗体に結合した夾雑物や、プレートに非特異的に結合した抗原を洗浄液で洗浄して取り除く。第三段階として、予め酵素、蛍光色素あるいはラジオアイソトープなどのレポーター分子を結合させた標識二次抗体溶液を注ぎ、一定時間反応させ、一次抗体によって補足された抗原にさらに標識二次抗体を結合させる。反応後に、洗浄液で余分の標識抗体を取り除き、測定用プレートに結合したレポーター分子の量を酵素活性、蛍光あるいはラジオアイソトープなどで測定することにより検体中の抗原量を測定する。
【0003】
前述のように、通常のサンドイッチＥＬＩＳＡ法では、エピトープの異なる２種類の抗体が必要となるが、例えば、低分子化合物などを抗原とする場合には、異なるエピトープを認識する複数の抗体を作製することは困難である。このため、上田らは、１種類の抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖可変領域（ＶＨ）とを用いた、オープンサンドイッチ法と呼ばれる、精度の高い低分子化合物の免疫測定法を確立した（特許文献１及び２、非特許文献１及び２）。この方法は、抗原を特異的に認識する抗体のＶＨ領域ポリペプチド及びＶＬ領域ポリペプチドを調製し、一方のポリペプチドをレポーター分子で標識して標識化ポリペプチドとし、他方のポリペプチドを固相に固定して固定化ポリペプチドとし、抗原含有試料及び標識化ポリペプチドを固定化ポリペプチドに接触させ、固定化ポリペプチドに結合した標識化ポリペプチドのレポーター分子の量を測定する抗原濃度測定方法である。また、低分子化合物を測定するための測定法としては、免疫測定法の他にも液体クロマトグラフ法等があるが、高精度な測定機器が必要な上、被検体の必要量も多く、測定時間もかかり、しかも汎用性が低いという問題があった。
【0004】
また、蛍光色素標識した抗体を用いて抗原の濃度を測定する免疫測定方法としては、抗体と抗原とをそれぞれ異なる蛍光色素により標識し、蛍光色素間で起こる蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）の効率の変化を指標とした免疫測定方法や（非特許文献３及び４）、蛍光標識した抗体にあらかじめ消光物質を混合することにより消光されていた抗体の蛍光が、目的検出物質の導入により増大する現象を用いるクエンチングによる効率の変化を指標とした免疫測定方法や、蛍光色素で標識した抗体を用いて、標識抗体と測定対象物が凝集することにより起こる蛍光強度の減少を測定する免疫測定方法（特許文献３）が知られている。
【0005】
しかしながら、免疫測定方法の多くは、抗体又は抗原を固相化する工程と、非特異的な標識化合物の吸着を除去するための洗浄工程とを必要とするものであった。これらの工程は作業が煩雑で時間が掛かる上に、測定結果のばらつきの原因となることから、固相化工程や洗浄工程を必要としない液相系免疫測定方法の開発が求められていた。そこで、本発明者らは、固相化工程と洗浄工程とを必要としない液相系であって、迅速かつ簡便に目的物質の定量的な測定を可能とし、かつ、抗原を可視化することが可能な免疫測定法である「均一系蛍光免疫測定法（「均一系蛍光免疫アッセイ法」や「Ｑｕｅｎｃｈｂｏｄｙ測定法」や「Ｑ−ｂｏｄｙ測定法」ともいう。）」を開発した（特許文献４、非特許文献５、図１〜３）。
【0006】
前記「均一系蛍光免疫測定法」の免疫測定法は、消光（クエンチング）現象を利用した技術を用いた測定方法であり、（１）抗体軽鎖可変領域（ＶＬと称される領域）ポリペプチドと抗体重鎖可変領域（ＶＨと称される領域）ポリペプチドとを備え、前記抗体軽鎖可変領域ポリペプチドと抗体重鎖可変領域ポリペプチドのいずれか一方が蛍光色素により標識されたキットであって、液相中の抗原濃度と上記蛍光色素の蛍光強度とが正の相関関係にあることを指標として、抗原濃度の測定又は抗原の可視化を可能とする抗原濃度測定・検出用キットや、（２）ＶＬポリペプチドとＶＨポリペプチドとが結合した一本鎖抗体である前記（１）記載の抗原濃度測定・検出用キットに関するものである。すなわち、ＶＬポリペプチドとＶＨポリペプチドのどちらか一方を蛍光標識した２本の抗体断片、又は蛍光標識したＶＬポリペプチドとＶＨポリペプチドとが結合した一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）（これら（１）及び（２）を「Ｑｕｅｎｃｈｂｏｄｙ」又は「Ｑ−ｂｏｄｙ」ともいい、（１）をＶＨ＋ＶＬ型Ｑ−ｂｏｄｙ、（２）をｓｃＦｖ型Ｑ−ｂｏｄｙともいう。）を、抗原が含まれているか否かを検査する被検試料溶液に混合し、上記蛍光色素の蛍光強度と抗原濃度が正の相関関係にあることを指標として、抗原濃度の測定又は抗原の可視化を可能とする蛍光免疫測定方法である（図１〜３）。かかる測定方法の原理は、抗体分子内の保存性の高いトリプトファン残基と蛍光色素が相互作用して蛍光色素を消光し、抗原が加わることによって抗原依存的にかかる消光が解消されることにある。
【0007】
前記Ｑ−ｂｏｄｙを用いた「均一系蛍光免疫測定法」の手法の利点は、１）洗浄工程が不要で、少量のサンプルと混合して蛍光強度を測定するだけで測定が完了する極めて簡便な測定技術であること、２）抗体中に存在する保存性の高いトリプトファンを消光に利用するため、抗体の種類を変えても消光効果が得られ、様々な抗体を用いて種々の物質の検出にも広く適用が可能な点で汎用性に優れていること、３）抗原部位が１ヶ所でよいため、原理的に低分子化合物に対しても適用可能であることなどがあげられる（特許文献４参照、図１）。そして、洗浄工程がなく、簡便な測定方法であることから、測定デバイスを非常にコンパクトに設計し、携帯可能な手のひらサイズまで小型化することが可能であり、専門教育を受けていない一般の人が現場で測定することも可能であると想定される。しかしながら、前述のとおり非常に有用な蛍光免疫測定方法であるが、抗原が存在しないときの蛍光強度と抗原が飽和に達したときの蛍光強度の比は、大きいもので６倍、小さいものでは１．２倍程度であったため、測定結果のダイナミックレンジをより広げて感度を上げ、性能をさらに向上させることが期待されていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】特開平10-78436号公報
【特許文献2】特許第3784111号公報
【特許文献3】特開平10-282098号公報
【特許文献4】WO2011/061944号公報
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】上田宏，薬学雑誌 27：71-80 (2007)
【非特許文献2】Lim SL, et al., Anal Chem. 79(16)：6193-200 (2007)
【非特許文献3】Iijima I. and Hohsaka T., Chembiochem. 17；10(6) ：999-1006 (2009)
【非特許文献4】Kajihara D, et al., Nat Methods. 3(11)：923 (2006)
【非特許文献5】Abe R, et al., J. Am. Chem. Soc. 133(43)：17386-17394 (2011)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本願発明の課題は、固相化工程と洗浄工程とを必要としない、液相において迅速かつ簡便に目的の物質の検出及び／又は定量的な測定を可能とし、かつ、抗原を可視化することが可能な免疫測定法であって、かかる測定結果のダイナミックレンジがさらに広く、感度が高い蛍光免疫測定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0011】
抗原が存在しない溶液中で消光している蛍光標識一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）をグアニジン塩酸で変性させた抗体の蛍光強度と、抗原が飽和に達したときの蛍光強度は、ほぼ同程度であったことから、抗原非存在時の消光効率を高めることがダイナミックレンジを広げる有効な手段であると考え、以下の検討を行なった。
【0012】
すなわち、消光の主たる要因は、ＶＬポリペプチドやＶＨポリペプチドに高度に保存されたトリプトファン残基と、標識した蛍光色素とが接触することによるものであり、抗原結合に伴う可変領域の構造安定化により蛍光色素が抗原結合ポケットから追い出されることで、消光状態が解消され、蛍光強度が増加すると推測した。そして、ＶＬポリペプチドやＶＨポリペプチドが２種類のタンパク質として存在する場合は、ＶＬポリペプチドやＶＨポリペプチドが解離しており相互作用が弱いため、蛍光色素とトリプトファン残基との接触効率が低くそれに伴い消光状態も低いものであったと予想した。また、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）においては、ＶＬポリペプチドとＶＨポリペプチドとを人工的なペプチドリンカーにて一本鎖抗体として結合させたことで、ＶＬポリペプチドとＶＨポリペプチドとの相互作用を高めることができるが、人工的なペプチドリンカーの付加により本来的に有する抗原との結合活性や安定性などの抗体の機能を低下させている可能性が考えられた。抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体軽鎖定常領域からなるポリペプチドと、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）及び抗体重鎖定常領域からなるポリペプチドとが、ジスルフィド結合で結合した１分子のヘテロダイマータンパク質からなるＦａｂ抗体（Fragment, antigen binding ）であれば、本来的に有する抗体の機能を保持していると推測し、Ｆａｂ抗体のＶＨ含有ポリペプチド又はＶＬ含有ポリペプチドのいずれか一方を蛍光標識したところ、抗原非存在下でかかる蛍光色素はより強く消光し、バックグラウンドを下げられることを見いだした。さらに、Ｆａｂ抗体のＶＨ含有ポリペプチド及びＶＬ含有ポリペプチドのそれぞれに同色の蛍光色素を標識したところ、蛍光色素とトリプトファン残基との接触による消光に加え、色素間の消光効果（Ｈ-ｄｉｍｅｒ）が加わりさらに高い検出感度を得られることを見いだした。また、Ｆａｂ抗体のＶＨ含有ポリペプチド及びＶＬ含有ポリペプチドのそれぞれに異色の蛍光色素を標識したところ、蛍光色素とトリプトファン残基との接触による消光と色素間の消光効果に加えてＦＲＥＴ効果による消光効果も得られ、さらに高い検出感度を得られることを見いだした。さらに、Ｆａｂ抗体のＶＨ含有ポリペプチド及びＶＬ含有ポリペプチドのそれぞれに蛍光色素と該蛍光色素を消光するクエンチャーを標識したところ、蛍光色素とトリプトファン残基との接触による消光と蛍光色素とクエンチャー間の消光効果も得られ、高い検出感度を得られることを見いだした。
【0013】
従来の蛍光標識一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）と本発明の蛍光標識Ｆａｂ型複合体の熱安定性を測定したところ、蛍光標識一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）が変性する温度は６１℃であったが、蛍光標識Ｆａｂ型複合体が変性する温度は７３℃と耐熱性に優れ、保存性にも優れていることを見いだした。本発明はこれら知見に基づいて完成するに至ったものである（図４）。
【0014】
すなわち本発明は、〔１〕抗体軽鎖可変領域を含むポリペプチドと抗体重鎖可変領域を含むポリペプチドのいずれか一方又は両方が蛍光色素により標識された、前記抗体軽鎖可変領域を含むポリペプチドと抗体重鎖可変領域を含むポリペプチドからなる複合体を備えたキットであって、液相中の抗原濃度と上記蛍光色素の蛍光強度とが正の相関関係にあることを指標として、抗原濃度の測定又は抗原の可視化を可能とすることを特徴とする抗原濃度測定・検出用キット；
〔２〕抗体軽鎖可変領域を含むポリペプチドと抗体重鎖可変領域を含むポリペプチドが、それぞれが同一の蛍光色素により標識されたことを特徴とする前記〔１〕記載の抗原濃度測定・検出用キット；
〔３〕抗体軽鎖可変領域を含むポリペプチドと抗体重鎖可変領域を含むポリペプチドが、それぞれが異なる種類の蛍光色素により標識されたことを特徴とする前記〔１〕記載の抗原濃度測定・検出用キット；
〔４〕抗体軽鎖可変領域を含むポリペプチドと抗体重鎖可変領域を含むポリペプチドが、一方が蛍光色素、他方が該蛍光色素を消光するクエンチャーにより標識されたことを特徴とする前記〔１〕記載の抗原濃度測定・検出用キット；
〔５〕抗体軽鎖可変領域を含むポリペプチドと抗体重鎖可変領域を含むポリペプチドのいずれか一方が、蛍光色素により標識されたことを特徴とする前記〔１〕記載の抗原濃度測定・検出用キット；
〔６〕抗体軽鎖可変領域を含むポリペプチドと抗体重鎖可変領域を含むポリペプチドからなる複合体が、Ｆａｂ抗体（Fragment, antigen binding）であることを特徴とする前記〔１〕〜〔５〕のいずれか記載の抗原濃度測定・検出用キット；
〔７〕蛍光色素が、ローダミン系蛍光色素及びオキサジン系蛍光色素から選ばれることを特徴とする前記〔１〕〜〔６〕のいずれか記載の抗原濃度測定・検出用キット；
〔８〕蛍光色素が、カルボキシローダミン１１０、カルボキシテトラメチルローダミン及びＡＴＴＯ６５５（商標名）から選ばれることを特徴とする前記〔７〕記載の抗原濃度測定・検出用キット；
〔９〕クエンチャーが、７−ニトロベンゾフラザン（ＮＢＤ）であることを特徴とする前記〔４〕〜〔８〕のいずれか記載の抗原濃度測定・検出用キット；
に関する。
【0015】
また本発明は、〔１０〕以下の工程（ａ）〜（ｃ）、
（ａ）抗体軽鎖可変領域を含むポリペプチドと抗体重鎖可変領域を含むポリペプチドのいずれか一方又は両方が蛍光色素により標識された、前記抗体軽鎖可変領域を含むポリペプチドと抗体重鎖可変領域を含むポリペプチドからなる複合体を、測定用試料中の抗原に接触させる工程；
（ｂ）蛍光色素の蛍光を検出、又は蛍光色素の蛍光強度を測定する工程；
（ｃ）抗原濃度と前記蛍光色素の蛍光強度とが、正の相関関係にあることを指標として、検体に含まれる抗原量を算出、又は抗原を可視化する工程；
を順次備えることを特徴とする抗原濃度測定・検出方法；
〔１１〕抗体軽鎖可変領域を含むポリペプチドと抗体重鎖可変領域を含むポリペプチドが、それぞれが同一の蛍光色素により標識されたことを特徴とする前記〔１０〕記載の抗原濃度測定・検出方法；
〔１２〕抗体軽鎖可変領域を含むポリペプチドと抗体重鎖可変領域を含むポリペプチドが、それぞれが異なる種類の蛍光色素により標識されたことを特徴とする前記〔１０〕記載の抗原濃度測定・検出方法；
〔１３〕抗体軽鎖可変領域を含むポリペプチドと抗体重鎖可変領域を含むポリペプチドが、一方が蛍光色素、他方が該蛍光色素を消光するクエンチャーにより標識されたことを特徴とする前記〔１０〕記載の抗原濃度測定・検出方法；
〔１４〕抗体軽鎖可変領域を含むポリペプチドと抗体重鎖可変領域を含むポリペプチドのいずれか一方が、蛍光色素により標識されたことを特徴とする前記〔１０〕記載の抗原濃度測定・検出方法；
〔１５〕抗体軽鎖可変領域を含むポリペプチドと抗体重鎖可変領域を含むポリペプチドからなる複合体が、Ｆａｂ抗体（Fragment, antigen binding）であることを特徴とする前記〔１０〕〜〔１４〕のいずれか記載の抗原濃度測定・検出方法；
〔１６〕抗原が、低分子化合物であることを特徴とする前記〔１０〕〜〔１５〕のいずれか記載の抗原濃度測定・検出方法；
〔１７〕抗原が、ヒトオステオカルシン、ビスフェノールＡ、血清アルブミン、クレンブテロール、ラクトパミン、コチニン、インフルエンザＡ型ウィルスヘマグルチニン、モルヒネ類、メタンフェタミン類、コカイン、テトラヒドロカンナビノール、ケタミンであることを特徴とする前記〔１０〕〜〔１５〕のいずれか記載の抗原濃度測定・検出方法；
に関する。
【発明の効果】
【0016】
本発明によれば、液相系において迅速かつ簡便に目的物質の検出及び／又は定量的な測定が可能であり、低分子化合物をも測定することができる高感度な免疫測定方法や、該測定方法による抗原の測定を行うためのキットを提供することができる。本発明の測定方法は、いずれか一方又はそれぞれ両方が蛍光色素により標識された抗体軽鎖可変領域を含むポリペプチド（以下、「ＶＬ含有ポリペプチド」ともいう。）と抗体重鎖可変領域を含むポリペプチド（以下、「ＶＨ含有ポリペプチド」ともいう。）からなる複合体（以下、「本発明の蛍光標識複合体」ともいう。）と、抗原との結合を、前記蛍光色素の蛍光強度を指標として検出及び／又は測定することができる。本発明の蛍光標識複合体は抗原と結合していないときは、前記蛍光色素が効果的に消光（クエンチ）された状態にあるため、抗原を感度よく検出及び／又は測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】Ｑ−ｂｏｄｙ測定法の特徴を表す図である。抗体重鎖可変領域ポリペプチドと抗体軽鎖可変領域ポリペプチドのいずれか一方に蛍光標識した２種類のポリペプチド（ＶＨ＋ＶＬ）、又は、抗体重鎖可変領域ポリペプチドと抗体軽鎖可変領域ポリペプチドとを結合した蛍光標識一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、抗原と混ぜるだけで、迅速、高感度に抗原濃度を測定することができる（ＷＯ２０１１／０６１９４４号公報参照）。
【図2】Ｑ−ｂｏｄｙの原理を表す図である。蛍光色素と、抗体可変領域に広く保存されているアミノ酸、すなわち抗体重鎖可変領域のＴｒｐ３３，Ｔｒｐ４７，Ｔｒｐ３６，Ｔｒｐ１０６や抗体軽鎖可変領域のＴｒｐ４０との相互作用により、抗原非存在下では蛍光が消光されているが、抗原濃度依存的に消光が解除され蛍光が増加する。蛍光標識（ＶＨ＋ＶＬ）及び蛍光標識ｓｃＦｖをＱｕｅｎｃｈｂｏｄｙ（Ｑ−ｂｏｄｙ）と呼ぶ。
【図3】Ｑ−ｂｏｄｙを利用して抗原濃度を測定した、均一系蛍光免疫アッセイ法の実施の一例を示す図である。Ｑ−ｂｏｄｙであるＴＡＭＲＡ標識抗ＢＧＰ一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）に抗原濃度を変化させ、蛍光分光光度計（FluoroMax-4）を用いて蛍光スペクトルおよび蛍光イメージアナライザー（ＦＭ−ＢＩＯIII）を用いて蛍光強度を測定した結果を示した。
【図4】抗体軽鎖可変領域を含むポリペプチドと抗体重鎖可変領域を含むポリペプチドのいずれか一方又は両方が蛍光色素により標識された、抗体軽鎖可変領域を含むポリペプチドと抗体重鎖可変領域を含むポリペプチドからなる複合体を模式的に表す図である。すなわち本発明の蛍光ラベル複合体を模式的に示した（上図）。また、実施例に用いたＱ−ｂｏｄｙ、及び、本発明のシングルラベルＦａｂ型複合体、同色ダブルラベルＦａｂ型複合体、異色ダブルラベルＦａｂ型複合体を模式的に表す図である（下図）。
【図5】本発明の蛍光標識Ｆａｂ型複合体の作製方法を模式的に表す図である。本発明のシングルラベルＦａｂ型複合体を作製する場合は、ＰｒｏＸタグ（ＴＡＧ）、ＶＨ、ＣＨ１、Ｃ末端にリンカー及びＨｉｓタグのＤＮＡ配列を付与した遺伝子を含むプラスミドと、ＰｒｏＸタグ（ＴＴＴ）、ＶＬ、Ｃκ、Ｃ末端にリンカー及びＦＬＡＧタグのＤＮＡ配列を付与した遺伝子を含むプラスミドと、ＴＡＭＲＡ−ＡＦ−ｔＲＮＡａｍｂｅｒ（CloverDirect）とを大腸菌無細胞合成キット（ＲＹＴＳ）に加え、２０℃で２時間反応させＴＡＭＲＡ標識ＶＨ含有ポリペプチドとＶＬ含有ポリペプチドを共発現にて合成した。その後、４℃１６時間静置し複合体を形成した。Ｃ末に付与したＦＬＡＧとＨｉｓタグを用いてタンパク質を精製した。同色ダブルラベルとする場合は、ＶＨ含有遺伝子およびＶＬ含有遺伝子のＮ末側にＰｒｏＸタグ（ＴＡＧ）を付与したプラスミドを用いて、シングルラベルＦａｂ型複合体と同様の方法で合成、精製した。また異色ダブルラベルとする場合は、ＰｒｏＸタグ（ＴＡＧ）とＰｒｏＸタグ（ＣＧＧＧ）を、それぞれどちらかの遺伝子のＮ末側に付与したプラスミドを用いて、色素Ａ−ＡＦ−ｔＲＮＡａｍｂｅｒ、色素Ｂ−ＡＦ−ｔＲＮＡＣＧＧＧ（CloverDirect）を添加した上記の方法により合成、精製した。枠欄に４塩基コドンによる蛍光標識アミノ酸導入の模式図を示した。
【図6】本発明のシングルラベルＦａｂ型複合体が、ＶＨ＋ＶＬ型Ｑ−ｂｏｄｙやｓｃＦｖ型Ｑ−ｂｏｄｙよりも高い蛍光強度比でＢＧＰやビスフェノールＡを測定することができたことを示す図である。
【図7】本発明の同色ダブルラベルＦａｂ型複合体が、本発明のシングルラベルＦａｂ型複合体よりも高い蛍光強度比でＢＧＰを測定することができたことを示す図である。
【図8】本発明の同色ダブルラベルＦａｂ型複合体が、本発明のシングルラベルＦａｂ型複合体よりも高い蛍光強度比でＨＳＡを測定することができたことを示す図である。
【図9】本発明の異色ダブルラベルＦａｂ型複合体が、本発明のシングルラベルＦａｂ型複合体よりも高い蛍光強度比でＢＧＰを測定することができたことを示す図である。
【図10】本発明の異色ダブルラベルＦａｂ型複合体が、本発明のシングルラベルＦａｂ型複合体よりも高い蛍光強度比でＨＳＡを測定することができたことを示す図である。
【図11】ＣＲ１１０で標識した抗ＳＡ抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）と抗体重鎖定常領域（ＣＨ１）を含むポリペプチドと、ＴＡＭＲＡで標識した抗ＳＡ抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）と抗体軽鎖定常領域（Ｃκ）を含むポリペプチドからなる、抗ＳＡ抗体の異色ダブルラベルＦａｂ型複合体が、本発明のシングルラベルＦａｂ型複合体よりも高い蛍光強度比でＨＳＡを測定することができたことを示す図である。
【図12】本発明の一方が蛍光色素、他方が該蛍光色素を消光するクエンチャーにより標識されたＦａｂ型複合体が高い蛍光強度比でＢＧＰを測定し得たことを示す図である。いずれも、 Ex/Em= 530/ 580で測定した。
【図13】本発明の蛍光ラベルＦａｂ型複合体の熱変性を起す温度は、蛍光ラベルｓｃＦｖの熱変性を起す温度より１２℃高く、温度安定性に優れていることを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0018】
本発明の抗原濃度測定・検出用キットとしては、抗体軽鎖可変領域を含むポリペプチド（ＶＬ含有ポリペプチド）と抗体重鎖可変領域を含むポリペプチド（ＶＨ含有ポリペプチド）からなる複合体を備え、前記ＶＬ含有ポリペプチドとＶＨ含有ポリペプチドのいずれか一方又は両方が蛍光色素により標識されている、前記複合体を備えたキットであって、液相中の抗原濃度と上記蛍光色素の蛍光強度とが正の相関関係にあることを指標として、抗原濃度の測定又は抗原の可視化を可能とすることを特徴とする抗原濃度測定・検出用キットであれば特に制限されないが、いずれか一方又は両方が蛍光色素により標識されている、ＶＬ含有ポリペプチドとＶＨ含有ポリペプチドからなる複合体を構成要素として含む他は、標準物質として使用できる抗原や、通常この種の免疫測定キットに用いられる試薬等、器具、取扱説明書等を備えていてもよい。
【0019】
上記抗原としては、上記ＶＨ含有ポリペプチドや上記ＶＬ含有ポリペプチド、これらのポリペプチドからなる複合体により特異的に認識される抗原であれば特に制限されず、例えば、タンパク質、ペプチド、糖質、脂質、糖脂質、低分子化合物の他、リン酸化、メチル化等のタンパク質修飾等やこれらの修飾を受けたタンパク質等を挙げることができ、本発明の抗原濃度測定・検出用キットは検出感度に優れることから、低分子化合物の検出において特に有用である。
【0020】
本発明の抗原濃度測定・検出用キットにおける、ＶＬ含有ポリペプチドとＶＨ含有ポリペプチドからなる複合体を構成する、ＶＬ含有ポリペプチドとＶＨ含有ポリペプチドは、そのいずれか一方又は両方が蛍光色素により標識されていればよく、（ｉ）いずれか一方が蛍光色素により標識された複合体、（ii）それぞれが同一の蛍光色素により標識された複合体、（iii）それぞれが異なる種類の蛍光色素により標識された複合体、又は（iv）いずれか一方が蛍光色素、他方が該蛍光色素を消光するクエンチャーにより標識された複合体とすることができる。ＶＨ含有ポリペプチド及びＶＬ含有ポリペプチドのいずれか一方に付加される場合、蛍光色素はいずれのポリペプチドに付加されてもよいが、高い検出感度を得られる方に付加することが好ましい。それぞれが異なる２種の蛍光色素がＶＨ含有ポリペプチド及びＶＬ含有ポリペプチドに付加される場合は、いずれの蛍光色素がどちらのポリペプチドに付加されてもよく、高い検出感度を得られる蛍光色素とポリペプチドの組み合わせとすることが好ましい。ＶＬ含有ポリペプチドとＶＨ含有ポリペプチドは、いずれも前記蛍光色素の発光や検出、クエンチングが阻害されない限りは、任意のアミノ酸配列からなるタンパク質や、ＰｒｏＸタグ（配列番号１）、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、Ｎｉタグ等のペプチドタグ、任意のアミノ酸配列からなるリンカー、安定放射性同位体、酵素、前記蛍光色素と異なる種類の蛍光色素等により標識される他、糖鎖付加やリン酸化、メチル化等の修飾を受けていてもよい。
【0021】
抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）は、抗体軽鎖遺伝子のＶ領域及びＪ領域のエクソンによりコードされる抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）に特異的なアミノ酸配列を含むものであれば特に制限されるものではなく、前記ＶＬ含有ポリペプチド、又は本発明の蛍光標識複合体と抗原との親和性が損なわれない限りは、上記抗体軽鎖可変領域に特異的なアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端側に、さらに任意のアミノ酸配列が付加されたものであっても、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入されていてもよい。かかる抗原との親和性は、ＥＬＩＳＡ法やＦＡＣＳ等の常法により適宜調べることができる。また、上記抗体軽鎖可変領域に特異的なアミノ酸配列としては、カバット（Kabat）の番号付け系で第３５番目のアミノ酸がトリプトファンであるアミノ酸配列であることが好ましい。
【0022】
抗体重鎖可変領域（ＶＨ）は、抗体重鎖遺伝子のＶ領域、Ｄ領域、及びＪ領域のエクソンによりコードされる抗体重鎖可変領域（ＶＨ）に特異的なアミノ酸配列を含むものであれば特に制限されるものではなく、前記ＶＨ含有ポリペプチド又は本発明の蛍光標識複合体と、抗原との親和性が損なわれない限りは、上記抗体重鎖可変領域に特異的なアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端側に、さらに任意のアミノ酸配列が付加されたものであっても、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入されていてもよい。かかる抗原との親和性は、ＥＬＩＳＡ法やＦＡＣＳ等の常法により適宜調べることができる。また、上記抗体重鎖可変領域に特異的なアミノ酸配列としては、カバット（Kabat）の番号付け系で第３６番目、第４７番目、又は第１０３番目のアミノ酸がトリプトファンであるアミノ酸配列であることが好ましい。
【0023】
ＶＬ含有ポリペプチドとしては、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）を含有していればよく、抗体軽鎖や、抗体軽鎖に任意のアミノ酸配列からなるペプチドを含むことができ、例えば、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）に、抗体軽鎖定常領域（Ｃκ）や、さらにヒンジ部分を付与したポリペプチドとすることができ、中でもＶＬにＣκを付与したポリペプチド等が好ましい。前記ＶＬ含有ポリペプチドとして具体的には、配列番号５に配列番号４を付加したもの、配列番号７に配列番号４を付加したもの、配列番号１０に配列番号４を付加したもの、配列番号１５に配列番号４を付加したもの、配列番号１７に配列番号４を付加したもの、配列番号１９に配列番号４を付加したもの、配列番号２１に配列番号４を付加したもの、配列番号２３に配列番号４を付加したもの、配列番号２５に配列番号４を付加したもの、配列番号２７に配列番号４を付加したもの、及び配列番号２９に配列番号４を付加したもので示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを好適に例示することができる他、測定対象の抗原に応じて、抗原を認識しうるＶＬ含有ポリペプチドを適宜作製することができる。
【0024】
ＶＨ含有ポリペプチドとしては、抗体軽重可変領域（ＶＨ）を含有していればよく、抗体重鎖や、抗体重鎖に任意のアミノ酸配列からなるペプチドを含むことができ、例えば、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）に、抗体重鎖定常領域（ＣＨ１）や、さらにヒンジ部分やＦｃ領域を付与したポリペプチドとすることができ、中でもＶＨにＣＨ１を付与したポリペプチド等が好ましい。前記ＶＨ含有ポリペプチドとして具体的には、配列番号３に配列番号６を付加したもの、配列番号９に配列番号６を付加したもの、配列番号１２に配列番号６を付加したもの、配列番号１６に配列番号６を付加したもの、配列番号１８に配列番号６を付加したもの、配列番号２０に配列番号６を付加したもの、配列番号２２に配列番号６を付加したもの、配列番号２４に配列番号６を付加したもの、配列番号２６に配列番号６を付加したもの、配列番号２８に配列番号６を付加したもの、及び配列番号３０に配列番号６を付加したもので示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを好適に例示することができる他、測定対象の抗原に応じて、抗原を認識しうるＶＨ含有ポリペプチドを適宜作製することができる。
【0025】
ＶＬ含有ポリペプチドとＶＨ含有ポリペプチドは、複合体を形成することが好ましく、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）に、それぞれ複合体を形成するアミノ酸配列を含むペプチドが結合されたものであれば特に制限されるものではない。複合体を形成するペプチドとしては、上記抗体定常領域（ＣＨ１やＣκなど）の他、２量体を形成する一方をＶＬに他方をＶＨに付与することもできる。また、相互作用してこれらの複合体形成に寄与する２種類のタンパク質を選択することもできる。
【0026】
本発明の蛍光標識複合体における「複合体」としては、ＶＬ含有ポリペプチドとＶＨ含有ポリペプチドとを構成要素として含み、複合体を形成するものであればよく、本発明の蛍光標識複合体の機能を損なわない限りは、前記ＶＬ含有ポリペプチドとＶＨ含有ポリペプチドに加え、さらにペプチドやタンパク質、脂質、金属その他化合物等を構成要素として含んでもよい。
【0027】
また、本発明の複合体は、前記ポリペプチド同士が組み合わさって一体として機能しうる構造体であればよく、前記ポリペプチド間の化学結合の有無は特に問題とされない。前記結合としては、前記ポリペプチド同士による、ジスルフィド結合や、架橋剤を用いて形成された結合等を挙げることができ、これらの結合は１つの複合体において複数組み合わせて使用されてもよい。これらの中でもジスルフィド結合を好適に例示することができる。本発明の複合体は前記ポリペプチド同士が互いに近い距離となる複合体を形成することが好ましく、このような機能をもつペプチドを含む、ＶＬ含有ポリペプチドやＶＨ含有ポリペプチドからなる複合体が好ましい。抗体分子において抗体軽鎖定常領域と抗体重鎖定常領域はその相互作用により抗体軽鎖可変領域と抗体重鎖可変領域をより近い距離とし、強固な抗原結合ポケットを形成する補助的役割を果たしている。このことから、本発明の複合体としては、抗体軽鎖可変領域と抗体軽鎖定常領域からなるポリペプチドと、抗体重鎖可変領域と抗体重鎖定常領域からなるポリペプチド鎖が、ジスルフィド結合で結合した１分子の抗体タンパク質であるＦａｂ抗体や、Ｆａｂ抗体２つがヒンジを介してジスルフィド結合で結合したＦ（ａｂ’）２抗体や、完全体の抗体が好ましく、中でもＦａｂ抗体が最も好ましい。かかるＶＬ含有ポリペプチド及びＶＨ含有ポリペプチドからなる、Ｆａｂ抗体を形成する本発明の蛍光標識複合体は、「本発明の蛍光標識Ｆａｂ型複合体」ということもある。中でもＶＬ含有ポリペプチド又はＶＨ含有ポリペプチドのいずれか一方が蛍光標識された本発明の蛍光標識Ｆａｂ型複合体は、「本発明のシングルラベルＦａｂ型複合体」ということもある。また、ＶＬ含有ポリペプチド及びＶＨ含有ポリペプチドがいずれも蛍光標識された本発明の蛍光標識Ｆａｂ型複合体は、その２種の蛍光色素が同一の場合は「本発明の同色ダブルラベルＦａｂ型複合体」、２種の蛍光色素が異なる場合は「本発明の異色ダブルラベルＦａｂ型複合体」ということもある。
【0028】
本発明において、ＶＬ含有ポリペプチドや、ＶＨ含有ポリペプチドや、これらのポリペプチドを含む複合体やその構成要素等は、公知の化学合成法、遺伝子組換え技術、抗体分子のタンパク質分解酵素による分解方法等を用いて調製することができるが、中でも、比較的容易な操作でかつ大量に調製することが可能な遺伝子組換え技術により調製することが好ましい。遺伝子組換え技術により前記ポリペプチドを調製する場合には、かかるポリペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡを好適な発現ベクターに導入して組換えベクターを作製し、バクテリア、酵母、昆虫、動植物細胞などを宿主として用いた発現系や、無細胞翻訳系により目的のポリペプチドを発現させることができる（図５）。無細胞翻訳系において目的のポリペプチドの発現を行う場合は、例えば、大腸菌、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球等の無細胞抽出液に、ヌクレオチド３リン酸や各種アミノ酸を加えた反応液中で、目的のポリペプチドを発現させることができる。この際、ＶＬ含有ポリペプチドや、ＶＨ含有ポリペプチドはＰｒｏＸタグやＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ等のタグが付加されていてもよく、これらのタグは蛍光色素の付加や、ポリペプチドの精製等に利用することができる。このようにして得たＶＬ含有ポリペプチドや、ＶＨ含有ポリペプチド同士は、蛍光色素による標識中又は標識の前後に、適当な溶媒中で複合体を形成させることができ、ジスルフィド結合又は架橋剤により結合させ、複合体を形成させる例を挙げることができる。例えば、前記ＶＬ含有ポリペプチド及びＶＨ含有ポリペプチドをコードする遺伝子を、大腸菌無細胞合成系で共発現後、４℃で１６時間インキュベーションすることによりジスルフィド結合を形成させ複合体を形成することができる。また、大腸菌無細胞合成反応系にタンパク質ジスルフィドイソメラーゼやプロリンシストランスイソメラーゼなどの分子シャペロンを添加することによりジスルフィド結合を促進することができる。また、前記架橋剤としては、ポリペプチド同士を架橋し結合させうる化合物であればよく、例えば、アルデヒド類（例えば、グルタルアルデヒド）、カルボジイミド類、イミドエステル類など挙げることができ、適宜市販品を入手し常法により使用することができる。また、本発明の複合体は、抗体を酵素などで切断して作製することもでき、例えばパパインや、ペプシンを用いて抗体を処理することにより、それぞれＦａｂ抗体や、Ｆ（ａｂ’）２抗体を作製することもできる。
【0029】
本発明において、蛍光色素により、ＶＬ含有ポリペプチドやＶＨ含有ポリペプチドを標識する方法は特に制限されず、ポリペプチドの両端又は側鎖の官能基を利用して直接又は架橋剤等を介して間接的に標識する方法や、無細胞翻訳系を利用してポリペプチドを合成しながら部位特異的に標識する手法等を用いることができる。無細胞翻訳系を利用して標識する方法としては、アンバーサプレッション法（Ellman J et al.(1991)Methods Enzymol.202:301-36）、４塩基コドン法（Hohsaka T., et al., J. Am. Chem. Soc., 118, 9778-9779, 1996）、Ｃ末端標識法（特開２０００−１３９４６８号公報）、Ｎ末端標識法（米国特許第５，６４３，７２２号公報、Olejnik et al.(2005)Methods 36:252-260）等が知られており、アンバーサプレッション法では、標識のターゲット部位のアミノ酸をコードするコドンを終止コドンの一つであるアンバーコドンに置き換えたＤＮＡ又はｍＲＮＡを作製し、無細胞翻訳系を用いて該ＤＮＡ又はｍＲＮＡからタンパク質を合成する。その際、タンパク質合成反応液に標識された非天然アミノ酸を結合させたサプレッサーｔＲＮＡを添加することで、アンバーコドンに置換した部位に標識アミノ酸が導入されたタンパク質を合成することができる。４塩基コドン法ではコドンを主にＣＧＧＧに拡張し、アミノ酸をコードするコドンをＣＧＧＧに置き換えたＤＮＡ又はｍＲＮＡを作製し、無細胞翻訳系を用いて該ＤＮＡ又はｍＲＮＡからタンパク質を合成する。その際、タンパク質合成反応液に標識された非天然アミノ酸を結合させたｔＲＮＡＣＧＧＧを添加することで、４塩基コドンに置換した部位に標識アミノ酸が導入されたタンパク質を合成することができる。本発明における異色ダブルラベルには、無細胞翻訳系を用い、アンバーサプレッション法と４塩基コドン法を組み合わせて共発現させることにより、ＶＨ含有ポリペプチド及びＶＬ含有ポリペプチドに異なる蛍光色素で標識を行い、複合体を形成することができる。また、Ｃ末端標識法では、標識したピューロマイシンを最適濃度で添加した無細胞翻訳系において、ＤＮＡ又はｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を行うことにより、Ｃ末端特異的に標識が導入されたタンパク質を合成することができる。
【0030】
また、大腸菌や動物細胞を宿主とする遺伝子組み換え技術により部位特異的に蛍光色素を導入する手法を用いることもできる。アジドチロシンを認識するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素と、サプレッサーアジドチロシル−ｔＲＮＡを導入した大腸菌を宿主として、部位特異的にポリペプチドにアジドチロシンを導入し、導入したアジド基に蛍光色素を結合することができる。また、古細菌由来ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素と、サプレッサーピロリジル−ｔＲＮＡを導入した動物細胞を宿主として、部位特異的にポリペプチドにアジドＺリジンを導入し、導入したアジド基に蛍光色素を結合することができる。
【0031】
本発明において、蛍光標識に用いる蛍光色素としては、ＶＨ含有ポリペプチド及び／又はＶＬ含有ポリペプチドを標識した場合、本発明の蛍光標識複合体を形成した状態で、抗原の非存在下でクエンチ（消光）される蛍光色素であって、かかる複合体と抗原が結合したときには消光機能が解除され蛍光が発せられる蛍光色素であれば特に制限されない。また、同一又は異なる種類の蛍光色素を、ＶＨ含有ポリペプチドとＶＬ含有ポリペプチドのそれぞれに付加する場合は、前記のクエンチングに加え、抗原の非存在下で色素間のクエンチングやＦＲＥＴ効果によるクエンチングが効果的に起こる組み合わせを選択することが好ましい。蛍光標識に用いる蛍光色素としては、ローダミン、クマリン、Ｃｙ、ＥｖｏＢｌｕｅ、オキサジン、Carbopyronin、naphthalene、biphenyl、anthracene、phenenthrene、pyrene、carbazole等を基本骨格として有する蛍光色素やその蛍光色素の誘導体を例示することができ、具体的には、ＣＲ１１０：carboxyrhodamine 110：Rhodamine Green（商標名）、ＴＡＭＲＡ：carbocytetremethlrhodamine：ＴＭＲ、Carboxyrhodamine 6G：ＣＲ６Ｇ、ＡＴＴＯ６５５（商標名）、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（商標名）：4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indancene-3-propionic acid、ＢＯＤＩＰＹ ４９３／５０３（商標名）：4,4-difluoro-1,3,5,7-tetramethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indancene-8-propionicacid、ＢＯＤＩＰＹ Ｒ６Ｇ（商標名）：4,4-difluoro-5-(4-phenyl-1,3-butadienyl)-4-bora-3a,4a-diaza-s-indancene-3-propionic acid、ＢＯＤＩＰＹ ５５８／５６８（商標名）：4,4-difluoro-5-(2-thienyl)-4-bora-3a,4a-diaza-s-indancene-3-propionic acid、ＢＯＤＩＰＹ ５６４／５７０（商標名）：4,4-difluoro-5-styryl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indancene-3-propionic acid、ＢＯＤＩＰＹ ５７６／５８９（商標名）：4,4-difluoro-5-(2-pyrrolyl)-4-bora-3a,4a-diaza-s-indancene-3-propionic acid、ＢＯＤＩＰＹ ５８１／５９１（商標名）：4,4-difluoro-5-(4-phenyl-1, 3-butadienyl)-4-bora-3a,4a-diaza-s-indancene-3-propionic acid、Ｃｙ３（商標名）、Ｃｙ３Ｂ（商標名）、Ｃｙ３．５（商標名）、Ｃｙ５（商標名）、Ｃｙ５．５（商標名）、ＥｖｏＢｌｕｅ１０（商標名）、ＥｖｏＢｌｕｅ３０（商標名）、ＭＲ１２１、ＡＴＴＯ ３９０（商標名）、ＡＴＴＯ ４２５（商標名）、ＡＴＴＯ ４６５（商標名）、ＡＴＴＯ４８８（商標名）、ＡＴＴＯ ４９５（商標名）、ＡＴＴＯ ５２０（商標名）、ＡＴＴＯ ５３２（商標名）、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ６Ｇ（商標名）、ＡＴＴＯ ５５０（商標名）、ＡＴＴＯ ５６５（商標名）、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ３Ｂ（商標名）、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１１（商標名）、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１２（商標名）、ＡＴＴＯ Ｔｈｉｏ１２（商標名）、ＡＴＴＯ ６１０（商標名）、ＡＴＴＯ ６１１Ｘ（商標名）、ＡＴＴＯ ６２０（商標名）、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１４（商標名）、ＡＴＴＯ ６３３（商標名）、ＡＴＴＯ ６４７（商標名）、ＡＴＴＯ ６４７Ｎ（商標名）、ＡＴＴＯ ６５５（商標名）、ＡＴＴＯ Ｏｘａ１２（商標名）、ＡＴＴＯ ７００（商標名）、ＡＴＴＯ ７２５（商標名）、ＡＴＴＯ ７４０（商標名）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０（商標名）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５（商標名）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０（商標名）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（商標名）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２（商標名）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６（商標名）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５（商標名）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８（商標名）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４（商標名）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３（商標名）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（商標名）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０（商標名）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００（商標名）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０（商標名）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７９０（商標名）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ−Ｘ（商標名）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ−Ｘ（商標名）、５（６）−ＴＡＭＲＡ−Ｘ（商標名）、５ＴＡＭＲＡ（商標名）、ＳＦＸ（商標名）を挙げることができるが、中でも、ローダミン系蛍光色素であるＣＲ１１０やＴＡＭＲＡ、及びオキサジン系蛍光色素であるＡＴＴＯ６５５を特に好適に例示することができる。
【0032】
本発明におけるクエンチャーとしては、抗原非存在下の本発明の蛍光標識複合体において、その構成要素であるＶＬ含有ポリペプチドとＶＨ含有ポリペプチドのいずれか一方に標識された蛍光色素の蛍光を、もう一方のペプチドに付加されたクエンチャーが消光することができるクエンチャーであって、かかる複合体と抗原が結合した場合にはかかる消光機能が解除され蛍光が発せられるクエンチャーであれば特に制限されない。かかるクエンチャーは、ＮＢＤ：7-nitrobenzofurazan、ＤＡＢＣＹＬ、ＢＨＱ、ＡＴＴＯ、ＱＸＬ、ＱＳＹ、Ｃｙ、Ｌｏｗａ Ｂｌａｃｋ、ＩＲＤＹＥ等を基本骨格とする消光色素やその消光色素の誘導体を例示することができ、具体的には、ＮＢＤ、ＤＡＢＣＹＬ、ＢＨＱ−１（商標名）、ＢＨＱ−２（商標名）、ＢＨＱ−３（商標名）、ＡＴＴＯ５４０Ｑ（商標名）、ＡＴＴＯ５８０Ｑ（商標名）、ＡＴＴＯ６１２Ｑ（商標名）、ＱＸＬ４９０（商標名）、ＱＸＬ５２０（商標名）、ＱＸＬ５７０（商標名）、ＱＸＬ６１０（商標名）、ＱＸＬ６７０（商標名）、ＱＸＬ６８０（商標名）、ＱＳＹ−３５（商標名）、ＱＳＹ−７（商標名）、ＱＳＹ−９（商標名）、ＱＳＹ−２１（商標名）、Ｃｙ５Ｑ（商標名）、Ｃｙ７Ｑ（商標名）、Ｌｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＦＱ（商標名）、ＬｏｗａＢｌａｃｋ ＲＱ（商標名）、ＩＲＤＹＥ ＱＣ−１（商標名）を挙げることができるが、中でも、ＮＢＤが好ましい。また、本発明の複合体における蛍光色素とクエンチャーの組み合わせは、抗原非存在下でクエンチャーが蛍光色素を効果的に消光し、抗原存在下においては蛍光色素の発光を阻害しない組み合わせを適宜選択することができ、蛍光色素ＴＡＭＲＡとＮＢＤの組み合わせを例示することができる。
【0033】
本発明の蛍光標識複合体、すなわちＶＬ含有ポリペプチドとＶＨ含有ポリペプチドからなる複合体であって、前記ＶＬ含有ポリペプチドとＶＨ含有ポリペプチドのいずれか一方又は両方が蛍光色素により標識されている複合体は、抗原の非存在下では、前述の蛍光色素と抗体可変領域において保存されたトリプトファン残基との相互作用による蛍光色素の消光が起こる。それに加えて、同色の蛍光色素が前記ポリペプチドそれぞれに標識された本発明の蛍光標識複合体では、蛍光色素間のクエンチング効果が得られる。また、異色の蛍光色素が前記ポリペプチドそれぞれに標識された本発明の蛍光標識複合体では、前記トリプトファン残基によるクエンチング、蛍光色素間のクエンチングに加え、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）効果によるクエンチングの効果が得られる。さらに、蛍光色素とその色素を消光するクエンチャーが前記ポリペプチドそれぞれに標識された本発明の蛍光標識複合体では、蛍光色素とクエンチャー間のクエンチング効果により、ダイナミックレンジを増大することができる。
【0034】
本発明の抗原濃度測定・検出方法としては、（ａ）抗体軽鎖可変領域を含むポリペプチドと抗体重鎖可変領域を含むポリペプチドのいずれか一方又は両方が蛍光色素により標識された、前記抗体軽鎖可変領域を含むポリペプチドと抗体重鎖可変領域を含むポリペプチドからなる複合体を、測定用試料中の抗原に接触させる工程；
（ｂ）蛍光色素の蛍光を検出、又は蛍光色素の蛍光強度を測定する工程；
（ｃ）抗原濃度と前記蛍光色素の蛍光強度とが、正の相関関係にあることを指標として、検体に含まれる抗原量を算出、又は抗原を可視化する工程；
の工程（ａ）〜（ｃ）を順次備えることを特徴とする抗原濃度測定及び／又は検出方法であればよく、前記複合体は本発明の蛍光標識複合体であればよく、中でも本発明の蛍光標識Ｆａｂ型複合体、より好ましくは本発明のシングルラベルＦａｂ型複合体、本発明の同色ダブルラベルＦａｂ型複合体、本発明の異色ダブルラベルＦａｂ型複合体を例示することができる。また本発明の抗原濃度測定・検出方法は、本発明の蛍光標識複合体や本発明の抗原濃度測定及び／又は検出用キットを用いて行うことができる。
【0035】
本発明の抗原濃度測定・検出用キットの使用、及び本発明の抗原濃度測定・検出方法は、液相中で本発明の蛍光標識複合体と抗原の接触を行うことが好ましく、そのため測定対象試料である検体は、適宜液体あるいは液体を含む、又は液体に浸された測定用試料として調製して前記工程（ａ）や本発明の抗原濃度測定・検出方法に供することが好ましい。本発明の抗原濃度測定及び／又は検出用キットの使用、及び本発明の抗原濃度測定及び／又は検出方法における検体の由来等は特に制限されず、適宜前処理等を施して前記測定用試料とすることができる。液体の検体は、そのまま測定用試料として測定に供することも、あるいは抗原を損なうことや抗原濃度測定・検出を阻害することもない限り、緩衝液や生理食塩水等で希釈、あるいは濃縮、又はｐＨや塩濃度等を適宜調整して測定用試料とすることもできる。かかる液体の検体としては、例えば測定対象となるターゲット抗原を含む可能性がある血清、血漿、唾液、髄液、尿等の体液、培養上清、細胞抽出液、菌体抽出液、工業廃水等を挙げることができる。
【0036】
固体等の液体以外の検体は、そのまま、あるいは抗原を損なうことや抗原濃度測定・検出を阻害することがない限り、適宜分割、細断、粉砕、すりつぶす、組織切片を作製する、あるいは検体の特定成分のみを除去あるいは抽出する、等の処理を施した上で、緩衝液や生理食塩水等の液体に溶解、懸濁、又は液浸することにより、本発明の蛍光標識複合体が抗原に接触できる状態とし、測定用試料とすることができる。前記組織切片の作製においては、抗原を損なわない範囲でパラホルムアルデヒドやグルタルアルデヒド等を用いて固定処理を施すことができ、さらにＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）やスキムミルク等によりブロッキング処理を行うこともできる。かかる固体等の検体としては、例えば生体より採取された組織、細胞、タンパク質や糖等の成分がブロットされたニトロセルロース膜やＰＶＤＦ膜、食品、土壌等を挙げることができる。また、測定用試料は、抗原を損なうことも抗原濃度測定・検出を阻害することもない限り、適宜防腐剤、防カビ剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、凝固防止剤、キレート剤等を含んでもよい。
【0037】
本発明においては、さらに、生体内の血液や髄液等の体液、組織等をも測定用試料とすることができる。すなわち、実験動物等の非ヒト動物に本発明の蛍光標識複合体を投与することにより、本発明の蛍光標識複合体と生体内の抗原とを接触させることができる。かかる非ヒト動物としては、ヒト以外の動物であればよく、例えば、脊椎動物、中でも哺乳類、魚類、鳥類、爬虫類、両生類等の非ヒト動物を挙げることができ、中でも哺乳類が好ましく、マウス、ラット、ハムスター、サル、ブタ等がより好ましい。また、上記投与方法も特に制限されず、筋肉内注射、腹腔内注射、静脈内注射、皮下注射、埋込み、塗布等の非経口的な局所投与方法や、経口的な投与方法の中から適宜選択することができる。また、本発明の蛍光標識複合体投与と同時、あるいはその前後に他の薬剤等を投与してもよい。非ヒト動物に本発明の蛍光標識複合体を投与することにより、生体内における抗原の位置やその移動、抗原量やその変化を観察することも可能である。かかる観察においては、経時的に体液や組織等の検体を採取して測定用試料を調製し、蛍光強度測定や蛍光の局在観察を行うことも、あるいは生体中の蛍光強度やその変化、蛍光の局在やその移動をリアルタイムに検出し観察することもできる。
【0038】
本発明の蛍光標識複合体と測定用試料中の抗原とを接触させる反応条件としては、測定用試料に本発明の蛍光標識複合体を添加し、抗原抗体反応に一般的に用いることのできる条件でインキュベートするものであれば特に制限されず、温度条件は、例えば１〜３０℃、好ましくは１８〜２５℃、反応時間は、例えば、瞬時〜１８０分、好ましくは１〜９０分とすることができる。また、非ヒト動物体内において反応を行う場合は、投与後例えば５〜１８０分、好ましくは６０〜１２０分インキュベートし、必要に応じて、組織、血液、細胞等を摘出、又は観察対象部位を露出させる等の処理を適宜行うことができる。インキュベート終了後の試料においては、抗原を認識した本発明の蛍光標識複合体におけるクエンチングが解消され、励起光の照射により蛍光が発せられるが、抗原を認識していない本発明の蛍光標識複合体は、クエンチングされたままで、励起光の照射によっても蛍光を発しない。したがって前記蛍光標識複合体を添加した測定用試料は、洗浄などの工程を経ることなく、そのまま抗原濃度測定及び／又は検出に供することができ、このことが本発明の抗原濃度測定・検出用キット及び本発明の抗原濃度測定・検出方法の大きな特徴の一つである。
【0039】
本発明における測定用試料中の蛍光の検出方法は、蛍光色素から発せられる蛍光を検出できる限り特に制限されず、前記反応後の測定用試料に励起光を照射して蛍光色素の蛍光強度を測定及び／又は検出するものであればよい。照射する励起光及び、測定及び／又は検出する蛍光の波長は、使用する蛍光色素の種類に応じて適宜選択することができ、例えば蛍光色素にＣＲ１１０を用いた場合は励起光波長４８０ｎｍと蛍光波長５３０ｎｍ、ＴＡＭＲＡを用いた場合は励起光波長５３０ｎｍと蛍光波長５８０ｎｍ、ＡＴＴＯ６５５を用いた場合は励起光波長６３０ｎｍと蛍光波長６８０ｎｍの組み合わせとすることができる。また、２種類の異なる蛍光色素を用いる場合も、抗原濃度を測定及び／又は抗原を検出することができる、励起光波長及び蛍光波長の組み合わせを適宜選択して使用すればよい。例えば、本発明の蛍光標識複合体と反応させた測定用試料に、前記蛍光標識複合体に含まれる蛍光色素のうちいずれか１つに適した励起波長の光を照射し、蛍光スペクトルを取得することを２種両方の蛍光色素について行うことにより、抗原濃度測定・検出に最適な励起光波長及び蛍光波長の組み合わせを特定することができる。例えば、励起光波長と蛍光波長の組み合わせとして、いずれか一方の蛍光色素に適した励起光波長及び蛍光波長の組み合わせを挙げることができ、より好ましくは、励起光波長及び蛍光波長が短い方の蛍光色素に適した、励起光波長及び蛍光波長の組み合わせを挙げることができる。なお蛍光は、蛍光スペクトルとして検出しても、特定の波長における光強度として検出してもよく、例えば、ＣＲ１１０とＴＡＭＲＡの組み合わせを使用する場合は、励起光波長を４８０ｎｍとし、波長５３０ｎｍの蛍光を検出することも、波長５１５ｎｍ〜６５０ｎｍの蛍光スペクトルとして検出することもできる。２種類の異なる蛍光色素いずれか一方に適した励起光波長及び蛍光波長の組み合わせは、抗原非存在時のＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動：Fluorescence resonance energy transfer）効果によるバックグラウンドの低減を効率よく検出でき、より高感度に測定できる。
【0040】
本発明において蛍光検出に用いる光源や測定装置は適宜選択することができ、光源は励起光波長を照射できるものであればよく、光源としては水銀ランプ、キセノンランプ、ＬＥＤ、レーザー光等を挙げることができ、適当なフィルターを用いて特定の波長の励起光を得ることができる。蛍光測定装置は、蛍光観察に通常用いられるデバイスを用いることができ、励起光の光源及びその照射システム、蛍光画像取得システムを備えた顕微鏡等を適宜利用することができ、MF20／FluoroPoint-Light（オリンパス社製）やFMBIO-III（日立ソフトウェアエンジニアリング社製）等を例示することができる。蛍光強度と抗原の濃度とは正の相関関係にあるので、濃度既知の抗原を含む被検物質を用いたときの蛍光強度を測定して抗原濃度と蛍光強度との関係を示す標準曲線を作成し、この標準曲線から、濃度未知の抗原濃度を算出することができる。かかる抗原濃度の算出は、あらかじめ作成されたに標準曲線に基づいて設定された変換式等により自動的に抗原量を算出することもできる。なお蛍光の検出は、蛍光スペクトルの検出であっても、特定の波長の蛍光強度の検出であってもよい。
【0041】
また、本発明の蛍光標識複合体を非ヒト動物に投与した場合は、その体液や組織等を採取する他、非ヒト動物の検出対象領域に励起光を照射して、蛍光色素の蛍光を２次元又は３次元的に測定及び／又は検出することもでき、この場合、蛍光顕微鏡や蛍光イメージアナライザー、光源を備えた内視鏡等を使用する例を挙げることができる。また、検出の際には、内視鏡、Ｘ線、ＣＴ、ＭＲＩ、超音波、顕微鏡等を用いて、非ヒト動物の個体、組織、又は細胞の構造を示す画像も合わせて取得することが好ましい。測定及び／又は検出された蛍光強度と抗原量とは正の相関関係にあるので、検出された蛍光の２次元又は３次元的画像に基づいて、抗原の局在（位置）及び／又は量を知ることができ、この際前記構造を示す画像と比較することもできる。これらの蛍光の検出に際しては、本発明の蛍光標識複合体を含まない、又は検体を含まない測定用試料等をネガティブコントロールとして調製し、合わせて測定及び／又は検出することが好ましい。また、前記ネガティブコントロールにおける蛍光測定値で、測定用試料における蛍光測定値を除した、蛍光強度比を用いて、抗原量の測定等を行うこともできる。あるいは、本発明において蛍光強度と抗原量とは正の相関関係にあるので、適宜設定した閾値を越える蛍光強度が得られた場合に、測定試料中に抗原が存在すると判定することもできる。
【0042】
以上のように、本発明によると、ＥＬＩＳＡ法、免疫拡散法、ラテックス凝集法、イムノクロマト法、表面プラズモン共鳴法などの免疫測定法で測定することのできるすべての抗原類を検出することができる。例えば、低分子物質に対する免疫測定法は、一般的には競合ＥＬＩＳＡ法が用いられているが、本発明による低分子物質の検出測定は、手法の簡便さ、測定感度やＳＮ比などで競合ＥＬＩＳＡ法より優れており、最もその能力を発することができる。例えば、アンフェタミン、メタンフェタミン、モルヒネ、ヘロイン、コデインなどの覚せい剤や麻薬類、アフラトキシン、ステリグマトシスチン、ネオソラニオール、ニバレノール、フモニシン、オクラトキシン、エンドファイト産生毒素などのカビ毒、テストステロンやエストラジオールなどの性ホルモン、クレンブテロールやラクトパミンなどの飼料に不正に用いられる添加物、ＰＣＢ、ゴシポール、ヒスタミン、ベンツピレン、メラミン、アクリルアミド、ダイオキシンなどの有害物質、アセタミプリド、イミダクロプリド、クロルフェナピル、マラチオン、カルバリル、クロチアニジン、トリフルミゾール、クロロタロニル、スピノサド、ランネート、メタミドホス、クロルピリホスなどの残留農薬、ビスフェノールＡなどの環境モルモンなどを挙げることができる。
【0043】
また本発明によると、測定結果が瞬時に得られる上に、検出方法が単純なため検出機器を小型化かつ低価格化することが可能となる。これらの利点は、低分子物質に限定されず、現場に出向き測定するオンサイト分析に威力を発揮することができる。しかも、測定が容易なため、専門家でなくても測定することができる。たとえば、インフルエンザ、伝染病や感染症などの原因ウイルスや細菌、薬物血中濃度やＰＯＣＴを含む臨床診断分野や職場、学校、保育園や家庭での簡易健康測定分野、炭疸菌、ボツリヌス毒素、サリンやＶＸガスなどテロ対策などの安心安全分野、現場サイドで測定が必要となる環境汚染物質やハウスダストなどの環境分野、免疫測定を必要とする研究開発分野などで、その能力を遺憾なく発揮することができる。
【実施例】
【0044】
以下に示す実施例において、本発明を具体的且つ更に詳細に説明するが、これらの実施例により本発明の技術的範囲が限定されるものではない。
【0045】
［実施例１］１．本発明の蛍光標識複合体を用いた均一系蛍光免疫測定法の確立
（発現ベクターの構築）
１）シングルラベルＦａｂ型複合体
ヒトオステオカルシン（human Bone Gla Protein；ＢＧＰ）に対する抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ；配列番号５）と抗体軽鎖定常領域（Ｃκ；配列番号４）を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に、Ｎ末端にＰｒｏＸ（商標名）タグ（９番目のアミノ酸に対応する塩基配列はＴＴＴであり、翻訳されるとＭＳＫＱＩＥＶＮＦＳＮＥＴ；配列番号１）のＤＮＡ配列を、Ｃ末端にリンカー（配列番号１４）及びＦＬＡＧタグのＤＮＡ配列を付与した遺伝子を、pIVEX2.3dベクター（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）へ組み込んだ。またＢＧＰに対する抗体の重鎖可変領域（ＶＨ；配列番号３）と抗体重鎖定常領域（ＣＨ１；配列番号６）を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に、Ｎ末端にアンバーコドンを含むＰｒｏＸタグ（９番目のアミノ酸に対応する塩基配列はＴＡＧであり、翻訳されるとＭＳＫＱＩＥＶＮＸＳＮＥＴ（Ｘは蛍光標識アミノ酸）；配列番号２）のＤＮＡ配列を、Ｃ末端にリンカー（配列番号１４）及びＨｉｓタグのＤＮＡ配列を付与した遺伝子を、pIVEX2.3dベクター（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）へ組み込んだ（図５）。これらの構築した発現ベクターは、挿入したＶＬ又はＶＨのＮ末端にＰｒｏＸタグ（翻訳されるとＶＨは標識され、ＶＬは非標識）が、Ｃ末端にＨｉｓタグ又はＦＬＡＧタグが、それぞれ付加されるよう設計されている。
【0046】
ビスフェノールＡ（bisphenol A）に対する抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ；配列番号７）と抗体軽鎖定常領域（Ｃκ；配列番号４）を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に、Ｎ末端にＰｒｏＸタグ（配列番号１）及びＧＧＧＳ５スペーサー（ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ；配列番号８）のＤＮＡ配列を、Ｃ末端にリンカー（配列番号１４）及びＦＬＡＧタグのＤＮＡ配列を付与した遺伝子を、pIVEX2.3dベクター（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）へ組み込んだ。またビスフェノールＡに対する抗体の重鎖可変領域（ＶＨ；配列番号９）と抗体重鎖定常領域（ＣＨ１；配列番号６）を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に、Ｎ末端にアンバーコドンを含むＰｒｏＸタグ（配列番号２）及びＧＧＧＳ５スペーサー（配列番号８）のＤＮＡ配列を、Ｃ末端にリンカー（配列番号１４）及びＨｉｓタグのＤＮＡ配列を付与した遺伝子を、pIVEX2.3dベクター（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）へ組み込んだ（図５）。これらの構築した発現ベクターは、挿入したＶＬ又はＶＨのＮ末端にＰｒｏＸタグ（翻訳されるとＶＨは標識され、ＶＬは非標識）が、Ｃ末端にＨｉｓタグ又はＦＬＡＧタグが、それぞれ付加されるよう設計されている。
【0047】
血清アルブミン（ＳＡ）に対する抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ；配列番号１０）と抗体軽鎖定常領域（Ｃκ；配列番号４）を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に、Ｎ末端にＰｒｏＸタグ（配列番号１）及びＧＧＧＳ２スペーサー（ＧＧＧＳＧＧＧＳ；配列番号１１）のＤＮＡ配列を、Ｃ末端にリンカー（配列番号１４）及びＦＬＡＧタグのＤＮＡ配列を付与した遺伝子を、pIVEX2.3dベクター（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）へ組み込んだ。また血清アルブミン（ＳＡ）に対する抗体の重鎖可変領域（ＶＨ；配列番号１２）と抗体重鎖定常領域（ＣＨ１；配列番号６）を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に、Ｎ末端にアンバーコドンを含むＰｒｏＸタグ（配列番号２）及びＧＧＧＳ５スペーサー（配列番号８）のＤＮＡ配列を、Ｃ末端にリンカー（配列番号１４）及びＨｉｓタグのＤＮＡ配列を付与した遺伝子を、pIVEX2.3dベクター（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）へ組み込んだ（図５）。これらの構築した発現ベクターは、挿入したＶＬ又はＶＨのＮ末端にＰｒｏＸタグ（翻訳されるとＶＨは標識され、ＶＬは非標識）が、Ｃ末端にＨｉｓタグ又はＦＬＡＧタグが、それぞれ付加されるよう設計されている。
【0048】
２）同色ダブルラベルＦａｂ型複合体ＢＧＰに対する抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ；配列番号５）と抗体軽鎖定常領域（Ｃκ；配列番号４）を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に、Ｎ末端にアンバーコドンを含むＰｒｏＸタグ（翻訳されると配列番号２）のＤＮＡ配列を、Ｃ末端にリンカー（配列番号１４）及びＦＬＡＧタグのＤＮＡ配列を付与した遺伝子を、pIVEX2.3dベクターへ組み込んだ。またＢＧＰに対する抗体の重鎖可変領域（ＶＨ；配列番号３）と抗体重鎖定常領域（ＣＨ１；配列番号６）を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に、Ｎ末端にアンバーコドンを含むＰｒｏＸタグ（翻訳されると配列番号２）のＤＮＡ配列を、Ｃ末端にリンカー（配列番号１４）及びＨｉｓタグのＤＮＡ配列を付与した遺伝子を、pIVEX2.3dベクターへ組み込んだ。これらの構築した発現ベクターは、挿入したＶＬ又はＶＨのＮ末端にＰｒｏＸタグ（アンバー）が、Ｃ末端にＨｉｓタグ又はＦＬＡＧタグが、それぞれ付加されるよう設計されている。
【0049】
血清アルブミン（ＳＡ）に対する抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ；配列番号１０）と抗体軽鎖定常領域（Ｃκ；配列番号４）を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に、Ｎ末端にアンバーコドンを含むＰｒｏＸタグ（翻訳されると配列番号２）及びＧＧＧＳ２スペーサー（配列番号１１）のＤＮＡ配列を、Ｃ末端にリンカー（配列番号１４）及びＦＬＡＧタグのＤＮＡ配列を付与した遺伝子を、pIVEX2.3dベクター（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）へ組み込んだ。またＳＡに対する抗体の重鎖可変領域（ＶＨ；配列番号１２）と抗体重鎖定常領域（ＣＨ１; 配列番号６）を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に、Ｎ末端にアンバーコドンを含むＰｒｏＸタグ（翻訳されると配列番号２）及びＧＧＧＳ２スペーサー（配列番号１１）のＤＮＡ配列を、Ｃ末端にリンカー（配列番号１４）及びＨｉｓタグのＤＮＡ配列を付与した遺伝子を、pIVEX2.3dベクターへ組み込んだ。これらの構築した発現ベクターは、挿入したＶＬ又はＶＨのＮ末端にＰｒｏＸタグ（アンバー）が、Ｃ末端にＨｉｓタグ又はＦＬＡＧタグが、それぞれ付加されるよう設計されている。
【0050】
３）異色ダブルラベルＦａｂ型複合体ＢＧＰに対する抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ；配列番号５）と抗体軽鎖定常領域（Ｃκ；配列番号４）を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に、Ｎ末端にＣＧＧＧ４塩基コドンを含むＰｒｏＸタグ（９番目のアミノ酸に対応する塩基配列はＣＧＧＧであり、翻訳されると配列番号２）のＤＮＡ配列を、Ｃ末端にリンカー（配列番号１４）及びＦＬＡＧタグのＤＮＡ配列を付与した遺伝子を、pIVEX2.3dベクターへ組み込んだ。またＢＧＰに対する抗体の重鎖可変領域（ＶＨ；配列番号３）と抗体重鎖定常領域（ＣＨ１；配列番号６）を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に、Ｎ末端にアンバーコドンを含むＰｒｏＸタグ（翻訳されると配列番号２）のＤＮＡ配列を、Ｃ末端にリンカー（配列番号１４）及びＨｉｓタグのＤＮＡ配列を付与した遺伝子を、pIVEX2.3dベクターへ組み込んだ（図５）。これらの構築した発現ベクターは、挿入したＶＬ又はＶＨのＮ末端にＰｒｏＸタグが、Ｃ末端にＨｉｓタグ又はＦＬＡＧタグが、それぞれ付加されるよう設計されている。
【0051】
血清アルブミン（ＳＡ）に対する抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ；配列番号１０）と抗体軽鎖定常領域（Ｃκ；配列番号４）を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に、Ｎ末端にＣＧＧＧ４塩基コドンを含むＰｒｏＸタグ（翻訳されると配列番号２）及びＧＧＧＳ２スペーサー（配列番号１１）のＤＮＡ配列を、Ｃ末端にリンカー（配列番号１４）及びＦＬＡＧタグのＤＮＡ配列を付与した遺伝子を、pIVEX2.3dベクター（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）へ組み込んだ。またＳＡに対する抗体の重鎖可変領域（ＶＨ；配列番号１２）と抗体重鎖定常領域（ＣＨ１；配列番号６）を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に、Ｎ末端にアンバーコドンを含むＰｒｏＸタグ（翻訳されると配列番号２）及びＧＧＧＳ２スペーサー（配列番号１１）のＤＮＡ配列を、Ｃ末端にリンカー（配列番号１４）及びＨｉｓタグのＤＮＡ配列を付与した遺伝子を、pIVEX2.3dベクターへ組み込んだ。これらの構築した発現ベクターは、挿入したＶＬ又はＶＨのＮ末端にＰｒｏＸタグが、Ｃ末端にＨｉｓタグ又はＦＬＡＧタグが、それぞれ付加されるよう設計されている。
【0052】
（蛍光標識Ｆａｂ型複合体の合成）ＲＹＴＳ（商品名）大腸菌無細胞合成キット（プロテイン・エクスプレス社製）を用いて、無細胞翻訳系による抗体可変領域含有ペプチド及び／又は抗体可変領域含有ペプチドのＮ末端領域への蛍光標識アミノ酸の導入を行った。
【0053】
１）シングルラベル又は同色ダブルラベルＦａｂ型複合体反応液（６０μＬ）は、３μＬのEnzyme Mix、０．６μＬのMethionine、３０μＬの２×Reaction Mix、２０μＬのE-coli Lysate、２μＬの２種類のplasmid ＤＮＡ（各２００ｎｇ）、３μＬの蛍光標識アミノアシル−ｔＲＮＡａｍｂｅｒ（４８０ｐｍｏｌ）、１．４μＬのNuclease Free Waterを加えた。蛍光標識タンパク質を作製するための蛍光標識アミノアシル−ｔＲＮＡ（ＴＡＭＲＡ−Ｘ−ＡＦ−ｔＲＮＡａｍｂｅｒ、ＣＲ１１０−Ｘ−ＡＦ−ｔＲＮＡａｍｂｅｒ、及びＡＴＴＯ６５５−Ｘ−ＡＦ−ｔＲＮＡａｍｂｅｒ）は、CloverDirect（商標名）tRNA Reagents for Site-Directed Protein Functionalization（プロテイン・エクスプレス社製）を用いた。反応液は、２０℃、２時間で静置して反応させタンパク質合成を行なった後、さらに、４℃、１６時間の反応により複合化形成を完成させた。反応終了後、反応液０．５μＬを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％）を行い、蛍光イメージアナライザー（FMBIO-III；日立ソフトウェアエンジニアリング社製）でタンパク質発現を観察した。さらに、抗Ｈｉｓタグ抗体又は抗ＦＬＡＧタグ抗体を用いてウエスタンブロットを行い、目的の蛍光標識抗体可変領域含有ペプチドが合成されていることを確認した。
【0054】
２）異色ダブルラベルＦａｂ型複合体反応液（６０μＬ）は、３μＬのEnzyme Mix、０．６μＬのMethionine、３０μＬの２ｘReaction Mix、２０μＬのE-coli Lysate、２μＬの２種類のplasmid ＤＮＡ（各２００ｎｇ）、１．５μＬの２種類の蛍光標識アミノアシル−ｔＲＮＡａｍｂｅｒ及びＣＧＧＧ（各々４８０ｎｍｏｌ）、１．４μＬのNuclease Free Waterを加えた。蛍光標識タンパク質を作製するための蛍光標識アミノアシル−ｔＲＮＡ（ＴＡＭＲＡ−Ｘ−ＡＦ−ｔＲＮＡａｍｂｅｒ又はＣＧＧＧ、ＣＲ１１０−Ｘ−ＡＦ−ｔＲＮＡａｍｂｅｒ又はＣＧＧＧ、及びＡＴＴＯ６５５−Ｘ−ＡＦ−ｔＲＮＡａｍｂｅｒ又はＣＧＧＧ）は、CloverDirect（商標名）tRNA Reagents for Site-Directed Protein Functionalization（プロテイン・エクスプレス社製）を用いた。ＶＨ領域含有ポリペプチドやＶＬ領域含有ポリペプチドの標識には、それぞれｔＲＮＡａｍｂｅｒ、ｔＲＮＡＣＧＧＧが使用される。反応液は、２０℃，２時間で静置して反応させタンパク質合成を行なった後、さらに、４℃、１６時間の反応により複合化形成を完成させた。反応終了後、反応液０．５μＬを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％）を行い、蛍光イメージアナライザー（FMBIO-III；日立ソフトウェアエンジニアリング社製）でタンパク質発現を観察した。さらに、抗Ｈｉｓタグ抗体又は抗ＦＬＡＧタグ抗体を用いてウエスタンブロットを行い、目的の蛍光標識抗体可変領域含有ペプチドが合成されていることを確認した。
【0055】
３）一方が蛍光色素、他方が該蛍光色素を消光するクエンチャーにより標識されたＦａｂ型複合体蛍光色素としてＴＡＭＲＡ，クエンチャーとしてＮＢＤ−Ｘ，ＳＥ（Anspec社）を使用した。ＮＢＤ−Ｘ−ＡＦ-ｔＲＮＡＣＧＧＧは阿部らの方法（Abe R, et al., J. Biosci. Bioeng. 110(1)：32-38 (2010)）のＴＡＭＲＡ−Ｘ，ＳＥをそれぞれＮＢＤ−Ｘ，ＳＥ（Anspec社）に変えて合成した。反応液（６０μＬ）は、３μＬのEnzyme Mix、０．６μＬのMethionine、３０μＬの２ｘReaction Mix、２０μＬのE-coli Lysate、２μＬの２種類のplasmid ＤＮＡ（各２００ｎｇ）、１．５μＬのＴＡＭＲＡ−Ｘ−ＡＦ−ｔＲＮＡａｍｂｅｒ及びＮＢＤ−Ｘ−ＡＦ-ｔＲＮＡＣＧＧＧ（各々４８０ｎｍｏｌ）、１．４μＬのNuclease Free Waterを加えた。ＶＨ領域含有ポリペプチドやＶＬ領域含有ポリペプチドの標識には、それぞれｔＲＮＡａｍｂｅｒ、ｔＲＮＡＣＧＧＧが使用される。反応液は、２０℃，２時間で静置して反応させタンパク質合成を行なった後、さらに、４℃、１６時間の反応により複合化形成を完成させた。反応終了後、反応液０．５μＬを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％）を行い、蛍光イメージアナライザー（FMBIO-III；日立ソフトウェアエンジニアリング社製）にてタンパク質発現を観察した。さらに、抗Ｈｉｓタグ抗体又は抗ＦＬＡＧタグ抗体を用いてウエスタンブロットを行い、目的の蛍光標識抗体可変領域含有ペプチドが合成されていることを確認した。
【0056】
（蛍光標識Ｆａｂ型複合体の精製）合成した蛍光標識Ｆａｂ型複合体は、抗ＦＬＡＧ Ｍ２アフィニティーゲル（シグマアルドリッチ社製）やHis-Spin Trap Column（ＧＥヘルスケア社製）により精製を行った。上記反応液（６０μＬ）を、抗ＦＬＡＧ Ｍ２アフィニティーゲルを入れたカラムへアプライし、室温で１５分間インキュベートした後にWash buffer（２０ｍＭ Phosphate buffer（ｐＨ７．４）／０．５Ｍ ＮａＣｌ／０．１％Polyoxyethylene(23)Lauryl Ether）で３回洗浄を行った。次に２００μＬのElute buffer（２０ｍＭ Phosphate buffer（ｐＨ７．４）／０．５Ｍ ＮａＣｌ／１００μｇ ＦＬＡＧ peptide／０．１％Polyoxyethylene(23)Lauryl Ether）で３回溶出させた。次に溶出液は、His-Spin Trap Columnへアプライした。室温で１５分間インキュベートした後にWash buffer（２０ｍＭ Phosphate buffer（ｐＨ７．４）／０．５Ｍ ＮａＣｌ／６０ｍＭ imidazole／０．１％Polyoxyethylene(23)Lauryl Ether）で３回洗浄を行った。次に２００μＬのElute buffer（２０ｍＭ Phosphate buffer（ｐＨ７．４）／０．５Ｍ ＮａＣｌ／０．５Ｍimidazole／０．１％Polyoxyethylene(23)Lauryl Ether）で３回溶出させた。さらに溶出液は、アミコンウルトラ−０．５遠心式フィルター１０ｋＤａ（ミリポア社製）を使用し、ＰＢＳ（＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）でバッファー交換、濃縮を行った。精製後のサンプルの濃度は、蛍光イメージアナライザー（FMBIO-III；日立ソフトウェアエンジニアリング社製）を用いて測定した。
【0057】
（Ｑ−ｂｏｄｙの作製）ＴＡＭＲＡで標識した抗ＢＧＰ抗体のＶＨとＶＬ（ＶＨを標識しＶＬは未標識）、及びＴＡＭＲＡで標識した抗ＢＧＰ抗体と抗ビスフェノールＡ抗体のＶＨとＶＬとをリンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）により結合させた一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）の作製は、国際公開公報ＷＯ２０１１／０６１９４４に記載の方法によった。
【0058】
［実施例２］２．本発明の蛍光標識複合体を用いた均一系蛍光免疫測定法による測定
（シングルラベルＦａｂ型複合体を用いた蛍光スペクトル測定）
実施例１で作製した、ＢＧＰ（ヒトオステオカルシン）に対する抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ；配列番号５）と抗体軽鎖定常領域（Ｃκ；配列番号４）を含むポリペプチドと、ＴＡＭＲＡ蛍光で標識したＢＧＰに対する抗体の重鎖可変領域（ＶＨ；配列番号３）と抗体重鎖定常領域（ＣＨ１；配列番号６）を含むポリペプチドからなる、ＴＡＭＲＡシングルラベル抗ＢＧＰ抗体Ｆａｂ型複合体、又はＴＡＭＲＡ標識抗ＢＧＰ抗体ｓｃＦｖ、又はＴＡＭＲＡ標識抗ＢＧＰ抗体ＶＨ＋抗ＢＧＰ抗体ＶＬを用いて、ＢＧＰ濃度を測定した。ＴＡＭＲＡシングルラベル抗ＢＧＰ抗体Ｆａｂ型複合体、又はＴＡＭＲＡ標識抗ＢＧＰｓｃＦｖ（７０ｎＭ、６．２５μＬ）、又はＴＡＭＲＡ標識抗ＢＧＰ抗体ＶＨ＋抗ＢＧＰ抗体ＶＬ（７０ｎＭ／ｍＬ、６．２５μＬ）と、抗原であるＢＧＰ−Ｃ７（配列番号１３）（０、１、３、１０、２５、１００、又は１，０００ｎＭ）とを、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で計５０μＬになるように調製した。この溶液を２５℃、７０分間放置した後に、蛍光分光光度計（FluoroMax−4；ホリバ・ジョバンイボン社製）を用いて蛍光スペクトル測定を行った。５４３ｎｍのＨｅ−Ｎｅレーザーを用い、励起波長は５３０ｎｍにセットし５８０ｎｍでの蛍光強度を測定した。抗原なしの場合の蛍光強度に対する、各抗原濃度における蛍光強度の比を図６左上のグラフに、ＢＧＰ−Ｃ７が１，０００ｎＭの場合の蛍光強度の比を図６左下の表に示す。同様にして、ＴＡＭＲＡ蛍光で標識したビスフェノールＡに対する抗体のＶＬ（配列番号７）とＣκ（配列番号４）を含むポリペプチドと、ビスフェノールＡに対する抗体のＶＨ（配列番号９)とＣＨ１（配列番号６）を含むポリペプチドからなる、ＴＡＭＲＡシングルラベル抗ビスフェノールＡ抗体Ｆａｂ型複合体又は、ＴＡＭＲＡ標識抗ビスフェノールＡ抗体ｓｃＦｖと、ビスフェノールＡ（０、１、３、１０、３０、１００、又は１，０００ｎＭ）とを反応させ、蛍光強度を測定した。抗原なしの場合の蛍光強度に対する、各抗原濃度における蛍光強度の比を図６右上のグラフに、ビスフェノールＡが１，０００ｎＭの場合の蛍光強度の比を図６右下の表に示す。蛍光色素の種類や抗原濃度によらず、本発明のシングルラベルＦａｂ型複合体は、従来のｓｃＦｖ型Ｑ−ｂｏｄｙやＶＨ＋ＶＬ型Ｑ−ｂｏｄｙと比較して高い蛍光強度比を得ることができ、高感度に低分子化合物及びタンパク質を検出及び定量できることが確認できた。本発明のＦａｂ型複合体は、ｓｃＦｖ型Ｑ−ｂｏｄｙやＶＨ＋ＶＬ型Ｑ−ｂｏｄｙと比較してその構成要素であるポリペプチド同士が互いに近い距離となる複合体を形成するため、抗体の可変領域のトリプトファンによる蛍光色素のクエンチング効果が効果的に起こるものと考えられる。
【0059】
［実施例３］（同色ダブルラベルＦａｂ型複合体を用いた蛍光スペクトル測定）
実施例１で作製した、ＣＲ１１０、ＴＡＭＲＡ、又はＡＴＴＯ６５５の蛍光色素で標識したＢＧＰに対する抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ；配列番号５）と抗体軽鎖定常領域（Ｃκ；配列番号４）を含むポリペプチドと、同じ色素で標識されたＢＧＰに対する抗体の重鎖可変領域（ＶＨ；配列番号３）と抗体重鎖定常領域（ＣＨ１；配列番号６）を含むポリペプチドからなる、同色ダブルラベルＦａｂ型複合体（７０ｎＭ、６．２５μＬ）と、抗原であるＢＧＰ−Ｃ７（０〜１０，０００ｎＭ）とを、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で計５０μＬになるように調製した。コントロールとして、ＢＧＰに対する抗体ＶＬ（配列番号５）とＣκ（配列番号４）を含むポリペプチド又はＢＧＰに対する抗体ＶＨ（配列番号３）とＣＨ１（配列番号６）を含むポリペプチドのいずれか一方が蛍光標識されたシングルラベルＦａｂ型複合体のサンプルを用意した。これらの溶液を２５℃、７０分間放置した後に、蛍光分光光度計（FluoroMax−4；ホリバ・ジョバンイボン社製）を用いて蛍光スペクトル測定を行った。ＣＲ１１０蛍光色素標識同色ダブルラベルＦａｂ型複合体を使用した場合は、励起波長（Ｅｘ）は４８０ｎｍにセットし、蛍光波長（Ｅｍ）５３０ｎｍでの蛍光強度を測定した。ＴＡＭＲＡ蛍光色素標識同色ダブルラベルＦａｂ型複合体を使用した場合は、励起波長は５３０ｎｍにセットし、蛍光波長５８０ｎｍでの蛍光強度を測定した。ＡＴＴＯ６５５蛍光色素標識同色ダブルラベルＦａｂ型複合体を使用した場合は、励起波長は６３０ｎｍにセットし、蛍光波長６８０ｎｍでの蛍光強度を測定した。抗原なしの場合の蛍光強度に対する、各抗原濃度における蛍光強度の比を蛍光強度比とし、図７のグラフに示す。ＢＧＰ−Ｃ７が１，０００ｎＭ、又は１０，０００ｎＭの場合の蛍光強度の比を図７の表に示す。
【0060】
また同様にして、血清アルブミン（ＳＡ）に対する抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ；配列番号１０）と抗体軽鎖定常領域（Ｃκ；配列番号４）を含むポリペプチドと、同じ色素で標識されたＳＡに対する抗体の重鎖可変領域（ＶＨ；配列番号１２）と抗体重鎖定常領域（ＣＨ１；配列番号６）を含むポリペプチドからなる同色ダブルラベルＦａｂ型複合体と、抗原であるＨＳＡ（０〜１００μＭ）を反応させ、蛍光強度を測定した。蛍光強度比を図８のグラフに、ＨＳＡが１００μＭの場合の蛍光強度の比を図８の表に示す。以上の結果から、蛍光色素や抗原の種類によらず、本発明の同色ダブルラベルＦａｂ型複合体は、シングルラベルＦａｂ型複合体よりも高い蛍光強度比で抗原量を測定することができると確認できた。同色ダブルラベルＦａｂ型複合体では、抗体の可変領域のトリプトファンによる蛍光色素のクエンチング効果に加え、蛍光色素間でのクエンチング効果（Ｈ-ｄｉｍｅｒ）が加わることで、バックグラウンドを低減することができ、ダイナミックレンジが増強されると考えられる。
【0061】
［実施例４］（異色ダブルラベルＦａｂ型複合体を用いた蛍光スペクトル測定）
実施例１で作製した、ＣＲ１１０、ＴＡＭＲＡ、又はＡＴＴＯ６５５の蛍光色素で標識したＢＧＰに対する抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ；配列番号５）と抗体軽鎖定常領域（Ｃκ；配列番号４）を含むポリペプチドと、前記と異なる色素で標識したＢＧＰに対する抗体の重鎖可変領域（ＶＨ；配列番号３）と抗体重鎖定常領域（ＣＨ１；配列番号６）を含むポリペプチドからなる、ＢＧＰ抗体の異色ダブルラベルＦａｂ型複合体（７０ｎＭ、６．２５μＬ）と、抗原であるＢＧＰ−Ｃ７（０〜１，０００ｎＭ）とを、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で計５０μＬになるように調製した。コントロールとして、同色ダブルラベルＦａｂ型複合体のサンプルを用意した。実施例３と同様に蛍光強度を想定し、抗原なしの場合の蛍光強度に対する、各抗原濃度における蛍光強度の比を得た。なお、ＣＲ１１０及びＴＡＭＲＡを用いた場合は、励起波長は４８０ｎｍにセットし、蛍光波長５３０ｎｍでの蛍光強度を測定した（図９左グラフ）。ＣＲ１１０、ＴＡＭＲＡ、及びＡＴＴＯ６５５を用いた場合は、励起波長は５３０ｎｍにセットし、蛍光波長５８０ｎｍでの蛍光強度を測定した（図９中央グラフ）。ＴＡＭＲＡ及びＡＴＴＯ６５５を用いた場合は、励起波長は６３０ｎｍにセットし、蛍光波長６８０ｎｍでの蛍光強度を測定した（図９右グラフ）。ＢＧＰ−Ｃ７が１，０００ｎＭの場合の蛍光強度の比を図９の各表に示す。
【0062】
また同様にして、実施例１で作製した、ＣＲ１１０、ＴＡＭＲＡ、又はＡＴＴＯ６５５の蛍光色素で標識したＳＡに対する抗体の重鎖可変領域（ＶＨ；配列番号１２）と抗体重鎖定常領域（ＣＨ１；配列番号６）を含むポリペプチドと、前記と異なる色素で標識されたＳＡに対する抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ；配列番号１０）と抗体軽鎖定常領域（Ｃκ；配列番号４）を含むポリペプチドからなる、ＳＡ抗体の異色ダブルラベルＦａｂ型複合体と、抗原であるＨＳＡ（０〜１００μＭ）とを反応させ、蛍光強度を測定した。抗原なしの場合の蛍光強度に対する、各抗原濃度における蛍光強度の比を蛍光強度比とし、図１０のグラフに示す。ＨＳＡが１００μＭにおける蛍光強度比を図１０の表に示す。
【0063】
さらに、ＣＲ１１０で標識した抗ＳＡ抗体の重鎖可変領域（ＶＨ；配列番号１２）と抗体重鎖定常領域（ＣＨ１；配列番号６）を含むポリペプチドと、ＴＡＭＲＡで標識した抗ＳＡ抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ；配列番号１０）と抗体軽鎖定常領域（Ｃκ；配列番号４）を含むポリペプチドからなる、抗ＳＡ抗体の異色ダブルラベルＦａｂ型複合体（ＣＲ１１０＿ＴＡＭＲＡとも表記する。）と、抗原であるＨＳＡ（１×１０−４、１×１０−５、１×１０−６、１×１０−７Ｍ）とを反応させ、波長４８０ｎｍ（図１１左上グラフ）又は波長５３０ｎｍ（図１１右上グラフ）の励起光を照射し、蛍光スペクトルを測定した。また、ＣＲ１１０で標識した抗ＳＡ抗体ＶＨ（配列番号１２）とＣＨ１（配列番号６）を含むポリペプチドと、抗ＳＡ抗体ＶＬ（配列番号１０）とＣκ（配列番号４）を含むポリペプチドからなる、抗ＳＡ抗体のＣＲ１１０シングルラベルＦａｂ型複合体（ＣＲ１１０＿ｎｏ）と、抗原であるＨＳＡ（１×１０−４、１×１０−５、１×１０−６、１×１０−７Ｍ）とを反応させ、波長４８０ｎｍの励起光を照射し、蛍光スペクトルを測定した（図１１左下グラフ）。抗ＳＡ抗体ＶＨ（配列番号１２）とＣＨ１（配列番号６）を含むポリペプチドと、ＴＡＭＲＡで標識した抗ＳＡ抗体ＶＬ（配列番号１０）とＣκ（配列番号４）を含むポリペプチドからなる、ＳＡ抗体のＴＡＭＲＡシングルラベルＦａｂ型複合体（ｎｏ＿ＴＡＭＲＡ）と、抗原であるＨＳＡ（１×１０−４、１×１０−５、１×１０−６、１×１０−７Ｍ）とを反応させ、波長５３０ｎｍの励起光を照射し、蛍光分光光度計（FluoroMax-4）を用いて蛍光スペクトルを測定した（図１１右下グラフ）。グラフにおける曲線は、上側からＨＳＡ濃度が１×１０−４Ｍ、１×１０−５Ｍ、１×１０−６Ｍ、１×１０−７Ｍ、０Ｍのサンプルのデータである。
【0064】
この結果から、異色ダブルラベルＦａｂ型複合体ＣＲ１１０＿ＴＡＭＲＡでは、波長４８０ｎｍの励起光を照射した場合に抗原非存在下での約５３０ｎｍの波長の蛍光がＦＲＥＴ効果により抑えられており、そのため約５３０ｎｍの波長において高い蛍光強度の比を得られることがわかった。また、波長５３０ｎｍの励起光を照射した場合にも、蛍光色素間でのクエンチング効果により、蛍光波長約５３０ｎｍにおいて、ＣＲ１１０＿ＴＡＭＲＡはｎｏ＿ＴＡＭＲＡと比べて高い蛍光強度の比を得られることがわかった。したがって、抗体の可変領域のトリプトファンによる蛍光色素のクエンチング効果に加え、蛍光色素間でのクエンチング効果、さらにＦＲＥＴ効果が加わることでバックグラウンドを低減することができ、ダイナミックレンジが増強されると考えられる。本実験系においてＣＲ１１０＿ＴＡＭＲＡは最大で７５倍もの蛍光増加により抗原を検出することができ、本発明の有用性が示された。
【0065】
［実施例５］（蛍光標識とクエンチャー標識からなるＦａｂ型複合体を用いた蛍光スペクトル測定）
実施例１で作製した、ＴＡＭＲＡ標識したＢＧＰに対する抗体の重鎖可変領域（ＶＨ；配列番号３）と抗体重鎖定常領域（ＣＨ１；配列番号６）とＮＢＤで標識したＢＧＰに対する抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ；配列番号５）と抗体軽鎖定常領域（Ｃκ；配列番号４）を含むポリペプチドからなるＦａｂ型複合体（７０ｎＭ、６．２５μＬ）と、抗原であるＢＧＰ−Ｃ７（０〜１０，０００ｎＭ）とを、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で計５０μＬになるように調製した。この溶液を２５℃、７０分間放置した後に、蛍光分光光度計（FluoroMax−4；ホリバ・ジョバンイボン社製）を用いて蛍光スペクトル測定を行った。励起波長は５３０ｎｍにセットし、蛍光波長５８０ｎｍでの蛍光強度を測定した。抗原なしの場合の蛍光強度に対する、各抗原濃度における蛍光強度の比を蛍光強度比とし、図１２のグラフに示す。ＢＧＰ−Ｃ７が１，０００ｎＭの場合の蛍光強度の比を図１２の表に示す。
【0066】
この結果から、Ｆａｂ型複合体ＴＡＭＲＡ＿ＮＢＤは、シングルラベルＦａｂ型複合体（ＴＡＭＲＡ＿Ｎｏ）（図７）と同程度の１ｎＭの濃度でＢＧＰを検出でき、かつダブルラベル（ＴＡＭＲＡ＿ＴＡＭＲＡ）（図７）より高い２７倍の蛍光増加により抗原を検出することができ、本発明の有用性が示された。
【0067】
［実施例６］（温度安定性の測定）
実施例１で作製した抗ＢＧＰ＿ＴＡＭＲＡシングルラベルＦａｂ複合体と抗ＢＧＰ＿ＴＡＭＲＡラベルｓｃＦｖの熱安定性を測定するために、サーマルシフトアッセイを行った。StepOne リアルタイムPCRシステム（アプライドバイオシステムズ社）を用いて１分間に１℃ずつ温度を上昇させ、各温度での蛍光強度を測定した。それぞれの抗体が熱変性を起すと、その構造が崩れ消光状態が解消し蛍光強度が増加する原理に基づき、熱安定性を測定した。図１３に示すように、ＴＡＭＲＡラベルｓｃＦｖのＴｍ値（熱変性を起す温度）は６１℃であったが、本発明であるＴＡＭＲＡシングルラベルＦａｂ複合体のＴｍ値は７３℃と１２℃上昇した。この熱安定性は、試薬の長期保存が可能となり流通温度、保存温度、保存期間など産業上のメリットに大きく貢献できる。
【0068】
［実施例７］（蛍光ラベルＦａｂ型複合体によるクレンブテロールの測定）
実施例１に示した方法で合成したクレンブテロールに対する抗体のＣＲ１１０で標識された軽鎖可変領域（ＶＬ；配列番１５）と抗体軽鎖定常領域（Ｃκ；配列番号４）を含むポリペプチドと、ＴＡＭＲＡで標識されたクレンブテロールに対する抗体の重鎖可変領域（ＶＨ；配列番号１６）と抗体重鎖定常領域（ＣＨ１；配列番号６）を含むポリペプチドからなる異色ダブルラベルＦａｂ型複合体と、抗原であるクレンブテロール（０〜１６μｇ／ｍＬ）を反応させ、実施例４の方法で蛍光強度を測定した。クレンブテロールが１６μｇ/ｍＬの場合の蛍光強度の比を表１に示す。この結果、１６μｇ/ｍＬのクレンブテロールを測定することができた。
【0069】
【表1】
【0070】
［実施例８］（蛍光ラベルＦａｂ型複合体によるラクトパミン、コチニンの測定）
実施例１に示した方法で、ラクトパミンに対する抗体のＴＡＭＲＡで標識された軽鎖可変領域（ＶＬ；配列番号１７）と抗体軽鎖定常領域（Ｃκ；配列番号４）を含むポリペプチドと、ＴＡＭＲＡで標識されたラクトパミンに対する抗体の重鎖可変領域（ＶＨ；配列番号１８）と抗体重鎖定常領域（ＣＨ１；配列番号６）を含むポリペプチドからなる同色ダブルラベルＦａｂ型複合体を合成した。また、コチニンに対する抗体のＴＡＭＲＡで標識された軽鎖可変領域（ＶＬ；配列番号１９）と抗体軽鎖定常領域（Ｃκ；配列番号４）を含むポリペプチドと、ＴＡＭＲＡで標識されたコチニンに対する抗体の重鎖可変領域（ＶＨ；配列番号２０）と抗体重鎖定常領域（ＣＨ１；配列番号６）を含むポリペプチドからなる同色ダブルラベルＦａｂ型複合体を合成した。次いで、それぞれ抗原であるラクトパミン３．４μｇ/ｍＬまたはコチニン３．５μｇ/ｍＬを反応させ、実施例４の方法で蛍光強度を測定した。その結果を表２に示す。表２に示すように、蛍光増加比蛍光強度比を２．３および１．９で測定することができた。
【0071】
【表2】
【0072】
［実施例９］（蛍光ラベルＦａｂ型複合体によるインフルエンザＡ型ウィルスヘマグルチニン（ＨＡ）の測定）
実施例１に示した方法で合成したインフルエンザＡ型Ｈ５Ｎ１，Ｈ１Ｎ１のヘマグルチニン（ＨＡ）に対する抗体のＣＲ１１０で標識された軽鎖可変領域（ＶＬ；配列番号２１）と抗体軽鎖定常領域（Ｃκ；配列番号４）を含むポリペプチドと、ＴＡＭＲＡで標識されたインフルエンザＡ型Ｈ５Ｎ１，Ｈ１Ｎ１のヘマグルチニン（ＨＡ）に対する抗体の重鎖可変領域（ＶＨ；配列番号２２）と抗体重鎖定常領域（ＣＨ１；配列番号６）を含むポリペプチドからなる異色ダブルラベルＦａｂ型複合体と、それぞれの抗原３０μｇ/ｍＬを反応させ、実施例４の方法で蛍光強度を測定した。その結果を表３に示す。表３に示すように、Ｈ５Ｎ１ ＨＡ、及びＨ１Ｎ１ ＨＡそれぞれの抗原に対し、蛍光増加比はそれぞれ６．１及び７．１で測定することができた。
【0073】
【表3】
【0074】
［実施例１０］（蛍光ラベルＦａｂ型複合体によるモルヒネ類、メタンフェタミン類、コカインの測定）
実施例１に示した方法で合成したモルヒネに対する抗体のＴＡＭＲＡで標識された軽鎖可変領域（ＶＬ；配列番号２３）と抗体軽鎖定常領域（Ｃκ；配列番号４）を含むポリペプチドと、ＴＡＭＲＡで標識されたモルヒネに対する抗体の重鎖可変領域（ＶＨ；配列番号２４）と抗体重鎖定常領域（ＣＨ１；配列番号６）を含むポリペプチドからなる同色ダブルラベルＦａｂ型複合体を合成した。同様に、メタンフェタミンに対する抗体のＴＡＭＲＡで標識された軽鎖可変領域（ＶＬ；配列番号２５）と抗体軽鎖定常領域（Ｃκ；配列番号４）を含むポリペプチドと、ＴＡＭＲＡで標識されたメタンフェタミンに対する抗体の重鎖可変領域（ＶＨ；配列番号２６）と抗体重鎖定常領域（ＣＨ１；配列番号６）を含むポリペプチドからなる同色ダブルラベルＦａｂ型複合体、コカインに対する抗体のＴＡＭＲＡで標識された軽鎖可変領域（ＶＬ；配列番号２７）と抗体軽鎖定常領域（Ｃκ；配列番号４）を含むポリペプチドと、ＴＡＭＲＡで標識されたコカインに対する抗体の重鎖可変領域（ＶＨ；配列番号２８）と抗体重鎖定常領域（ＣＨ１；配列番号６）を含むポリペプチドからなる同色ダブルラベルＦａｂ型複合体を合成した。また、実施例１に従い、ＴＡＭＲＡで標識した抗モルヒネ抗体のＶＬとＶＨとをリンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）により結合させた一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）と、抗メタンフェタミン抗体のＶＨとＶＬとをリンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）により結合させた一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を作製した。構築したＴＡＭＲＡダブルラベルＦａｂ複合体およびＴＡＭＲＡラベルｓｃＦｖと種々のモルヒネ類、メタンフェタミン類、コカイン、ケタミンを反応させ、実施例３または実施例１の方法で蛍光強度を測定した。その結果を表４に示す。３種類の蛍光標識Ｆａｂ複合体は特異的にそれぞれの抗原を認識し、かつ蛍光標識モルヒネＦａｂ複合体とｓｃＦｖの比較、蛍光標識メタンフェタミンＦａｂ複合体とｓｃＦｖの蛍光増加比は、いずれもＦａｂ複合体が高く、ダイナミックレンジが大きく増大した。
【0075】
【表4】
【0076】
［実施例１１］（蛍光ラベルＦａｂ型複合体による大麻成分ＴＨＣとケタミンの測定）
実施例１に示した方法で、大麻成分ＴＨＣに対する抗体のＴＡＭＲＡで標識された軽鎖可変領域（ＶＬ；配列番号２９）と抗体軽鎖定常領域（Ｃκ；配列番号４）を含むポリペプチドと、ＴＡＭＲＡで標識された大麻成分ＴＨＣに対する抗体の重鎖可変領域（ＶＨ；配列番号３０）と抗体重鎖定常領域（ＣＨ１；配列番号６）を含むポリペプチドからなる同色ダブルラベルＦａｂ型複合体を合成した。同様に、ケタミンに対する抗体のＴＡＭＲＡで標識された軽鎖可変領域（ＶＬ；配列番号３１）と抗体軽鎖定常領域（Ｃκ；配列番号４）を含むポリペプチドと、ＴＡＭＲＡで標識されたケタミンに対する抗体の重鎖可変領域（ＶＨ；配列番号３２）と抗体重鎖定常領域（ＣＨ１；配列番号６）を含むポリペプチドからなる同色ダブルラベルＦａｂ型複合体を合成した。次いで、それぞれ抗原であるＴＨＣ（１００μｇ/ｍＬ）またはケタミン（１.０ｍｇ/ｍＬ）を反応させ、実施例４の方法で蛍光強度を測定した。表５に示すように、蛍光増加比蛍光強度比を１．３および２．０で測定することができた。
【0077】
【表5】
【産業上の利用可能性】
【0078】
本発明は、試料分析や薬物検査の分野や、携帯型試料分析キットの分野等において有用に利用することができる。
【配列表フリーテキスト】
【0079】
１〜３２ 合成
【配列表】
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