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特許6072772変異体キャプシドを有するアデノ関連ウイルスビリオンおよびその使用方法

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6072772

(24)【登録日】2017年1月13日

(45)【発行日】2017年2月1日

(54)【発明の名称】変異体キャプシドを有するアデノ関連ウイルスビリオンおよびその使用方法

(51)【国際特許分類】

C12N 15/09 20060101AFI20170123BHJP

C12N 7/00 20060101ALI20170123BHJP

A61K 38/00 20060101ALI20170123BHJP

A61P 27/00 20060101ALI20170123BHJP

A61P 27/06 20060101ALI20170123BHJP

A61K 31/713 20060101ALI20170123BHJP

A61K 31/7088 20060101ALI20170123BHJP

A61K 48/00 20060101ALI20170123BHJP

A61K 35/76 20150101ALI20170123BHJP

A61P 9/00 20060101ALI20170123BHJP

A61P 43/00 20060101ALI20170123BHJP

C12N 1/15 20060101ALI20170123BHJP

C12N 1/19 20060101ALI20170123BHJP

C12N 1/21 20060101ALI20170123BHJP

C12N 5/10 20060101ALI20170123BHJP

C07K 19/00 20060101ALI20170123BHJP

C07K 7/06 20060101ALN20170123BHJP

【ＦＩ】

C12N15/00 AZNA

C12N7/00

A61K37/02

A61P27/00

A61P27/06

A61K31/713

A61K31/7088

A61K48/00

A61K35/76

A61P9/00

A61P43/00 105

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C07K19/00

!C07K7/06

【請求項の数】21

【全頁数】45

(21)【出願番号】特願2014-506568(P2014-506568)

(86)(22)【出願日】2012年4月20日

(65)【公表番号】特表2014-518614(P2014-518614A)

(43)【公表日】2014年8月7日

(86)【国際出願番号】US2012034413

(87)【国際公開番号】WO2012145601

(87)【国際公開日】20121026

【審査請求日】2015年3月27日

(31)【優先権主張番号】61/478,355

(32)【優先日】2011年4月22日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】506115514

【氏名又は名称】ザリージェンツオブザユニバーシティオブカリフォルニア

(74)【代理人】

【識別番号】100149294

【弁理士】

【氏名又は名称】内田直人

(72)【発明者】

【氏名】シェーファー，デイビッドブイ．

(72)【発明者】

【氏名】クリムチャク，ライアンアール．

(72)【発明者】

【氏名】ケルバー，ジェームズティー．

(72)【発明者】

【氏名】フラナリー，ジョンジー．

(72)【発明者】

【氏名】ダルカラムーロ，デニズ．

(72)【発明者】

【氏名】ヴィーセル，マイケ

(72)【発明者】

【氏名】バーン，リアシー．ティー．

【審査官】大久保智之

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１０／０９３７８４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２００８−５２３８１３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１４−５０７１４５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００７−５０３８４３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００６−５１０３６０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 PNAS，２００２年，99, 16，10405-10410

【文献】 Human Gene Therapy，２００８年，19，1407-1414

【文献】 Journal of Molecular and Cellular Cardiology，２０１０年１０月２６日，50，793-802

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ１５／００

Ｃ１２Ｎ１／００

Ｃ１２Ｎ５／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

必要とする個体の眼疾患を治療するための薬学的組成物であって、
組換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンと、薬学的に許容される賦形剤とを含有し、
前記組換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンが、
ａ）変異体ＡＡＶキャプシドタンパク質であって、前記変異体ＡＡＶキャプシドタンパク質は、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質と比べてキャプシドタンパク質ＧＨループにペプチドの挿入を含み、前記挿入が、ＬＧＥＴＴＲＰ（配列番号１３）、ＮＥＴＩＴＲＰ（配列番号１４）、ＫＡＧＱＡＮＮ（配列番号１５）、ＫＤＰＫＴＴＮ（配列番号１６）、ＫＤＴＤＴＴＲ（配列番号５７）、ＲＡＧＧＳＶＧ（配列番号５８）、ＡＶＤＴＴＫＦ（配列番号５９）、およびＳＴＧＫＶＰＮ（配列番号６０）から選択されるアミノ酸配列を含む、変異体ＡＡＶキャプシドタンパク質と、
ｂ）遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸と
を含み、前記変異体キャプシドタンパク質が、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染性と比較して、増加した網膜細胞の感染性を付与する、薬学的組成物。

【請求項2】

挿入部位が、配列番号１に示すＡＡＶ２キャプシドタンパク質のアミノ酸５７０〜６１１内であるか、あるいは別のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質内の対応する位置にある、請求項１に記載の薬学的組成物。

【請求項3】

前記網膜細胞が、光受容体、網膜神経節細胞、ミュラー細胞、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞、または網膜色素上皮細胞である、請求項１または２に記載の薬学的組成物。

【請求項4】

前記治療が、眼内注入による、請求項１から３のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項5】

前記治療が、硝子体内注入による、請求項１から４のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項6】

前記遺伝子産物が、短干渉ＲＮＡまたはアプタマーである、請求項１から５のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項7】

前記遺伝子産物が、ポリペプチドである、請求項１から５のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項8】

前記ポリペプチドが、神経保護因子、抗血管新生ポリペプチド、抗アポトーシス因子、または網膜細胞の機能を高めるポリペプチドである、請求項７に記載の薬学的組成物。

【請求項9】

前記ポリペプチドが、グリア由来神経栄養因子、線維芽細胞成長因子２、ニュールツリン、毛様体神経栄養因子、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、上皮細胞成長因子、ロドプシン、アポトーシスのＸ連鎖阻害剤、レチノスキシン、ＲＰＥ６５、網膜色素変性ＧＴＰａｓｅ相互作用タンパク質−１、ペリフェリン、ペリフェリン−２、またはソニックヘッジホッグである、請求項７に記載の薬学的組成物。

【請求項10】

前記眼疾患が、緑内障、網膜色素変性症、黄斑変性症、網膜分離症、レーバー先天黒内障、糖尿病性網膜症、赤緑色盲、または色覚異常である、請求項１から９のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項11】

以下を含む、組換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオン：
ａ）変異体ＡＡＶキャプシドタンパク質であって、前記変異体ＡＡＶキャプシドタンパク質は、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質と比べてキャプシドタンパク質ＧＨループにペプチドの挿入を含み、前記挿入が、ＬＧＥＴＴＲＰ（配列番号１３）、ＮＥＴＩＴＲＰ（配列番号１４）、ＫＡＧＱＡＮＮ（配列番号１５）、ＫＤＰＫＴＴＮ（配列番号１６）、ＫＤＴＤＴＴＲ（配列番号５７）、ＲＡＧＧＳＶＧ（配列番号５８）、ＡＶＤＴＴＫＦ（配列番号５９）、およびＳＴＧＫＶＰＮ（配列番号６０）から選択されるアミノ酸配列を含み、前記変異体キャプシドタンパク質は、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染性と比較して、増加した網膜細胞の感染性を付与する、変異体ＡＡＶキャプシドタンパク質と、
ｂ）遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸。

【請求項12】

挿入部位が、配列番号１に示すＡＡＶ２キャプシドタンパク質のアミノ酸５７０〜６１１内であるか、あるいは別のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質内の対応する位置にある、請求項１１に記載の組換えアデノ関連ウイルスビリオン。

【請求項13】

前記網膜細胞が、光受容体、網膜神経節細胞、ミュラー細胞、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞、または網膜色素上皮細胞である、請求項１１又は１２に記載の組換えアデノ関連ウイルスビリオン。

【請求項14】

前記ｒＡＡＶビリオンが、前記対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染性と比較して、少なくとも１０倍の網膜細胞の感染性の増加を呈する、請求項１１から１３のいずれか一項に記載の組換えアデノ関連ウイルスビリオン。

【請求項15】

前記遺伝子産物が、干渉ＲＮＡまたはアプタマーである、請求項１１から１４のいずれか一項に記載の組換えアデノ関連ウイルスビリオン。

【請求項16】

前記遺伝子産物が、ポリペプチドである、請求項１１から１４のいずれか一項に記載の組換えアデノ関連ウイルスビリオン。

【請求項17】

前記ポリペプチドが、神経保護ポリペプチド、抗血管新生ポリペプチド、または網膜細胞の機能を高めるポリペプチドである、請求項１６に記載の組換えアデノ関連ウイルスビリオン。

【請求項18】

前記ポリペプチドが、グリア由来神経栄養因子、線維芽細胞成長因子２、ニュールツリン、毛様体神経栄養因子、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、上皮細胞成長因子、ロドプシン、アポトーシスのＸ連鎖阻害剤、レチノスキシン、ＲＰＥ６５、網膜色素変性ＧＴＰａｓｅ相互作用タンパク質−１、ペリフェリン、ペリフェリン−２、ロドプシン、およびソニックヘッジホッグからなる群から選択される、請求項１６に記載の組換えアデノ関連ウイルスビリオン。

【請求項19】

以下を含む、薬学的組成物：
ａ）請求項１１から１８のいずれか一項に記載の組換えアデノ関連ウイルスビリオンと、
ｂ）薬学的に許容される賦形剤。

【請求項20】

変異体アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸であって、前記変異体ＡＡＶキャプシドタンパク質が請求項１１から１８のいずれか一項に記載の組換えアデノ関連ウイルスビリオンのものである、単離核酸。

【請求項21】

請求項２０に記載の核酸を含む、単離された遺伝子改変宿主細胞。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

相互参照
本出願は、２０１１年４月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／４７８，３５５号の利益を主張するものであり、この出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

連邦政府支援の研究に関する声明文
本発明は、アメリカ国立衛生研究所の国立眼研究所によって授与された助成金番号ＥＹ０１６９９４−０２およびＥＹ１０１８２４１の政府支援下で行われた。アメリカ政府は、本発明においてある特定の権利を有する。

【背景技術】

【0003】

光受容体は、視覚情報を受信および処理するための網膜中の第１のニューロンであり、可視的な電磁放射線を光情報伝達を介して過分極応答に変換する。圧倒的大多数の遺伝性網膜疾患は、例えば、ロドプシンタンパク質フォールディングに影響を与える優性変異において直接的に、または例えば、網膜色素上皮（ＲＰＥ）における網膜再利用経路に影響を与える劣性変異において間接的にのいずれかで、これらの細胞の喪失につながる。

【0004】

ＡＡＶは、パルボウイルス科ファミリーおよびディペンドウイルス属に属しており、それらのメンバーは、複製を促進するためにアデノウイルス等のヘルパーウイルスとの共感染を必要とし、ＡＡＶは、ヘルパーの不在下で潜伏感染を確立する。ビリオンは、２つのオープンリーディングフレームであるｒｅｐおよびｃａｐを有する４．９ｋｂの１本鎖ＤＮＡゲノムを包含する２５ｎｍの２０面体キャプシドから成る。非構造ｒｅｐ遺伝子が、ウイルス複製に不可欠な４つの調節タンパク質をコードする一方で、ｃａｐは、６０ｍｅｒのキャプシドシェルに組み立てられる３つの構造タンパク質（ＶＰ１〜３）をコードする。このウイルスキャプシドは、細胞表面受容体結合、エンドサイトーシス、細胞内移動、および核内アンパッケージングを含むウイルス形質導入の生物学的障壁の多くを克服するＡＡＶベクターの能力を媒介する。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】米国特許公開第２００５／００５３９２２号

【特許文献2】米国特許公開第２００９／０２０２４９０号

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ａｌｌｏｃｃａｅｔａｌ．（２００７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８１：１１３７２

【非特許文献2】Ｂｏｕｃａｓｅｔａｌ．（２００９）Ｊ．ＧｅｎｅＭｅｄ．１１：１１０３

【発明の概要】

【0007】

本開示は、改変キャプシドタンパク質を有するアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ビリオンを提供し、該ＡＡＶビリオンは、硝子体内注入を介して投与されるときに、野生型ＡＡＶと比較してより高い網膜細胞の感染性を呈する。本開示は、遺伝子産物を個体の網膜細胞に送達する方法、および眼疾患を治療する方法をさらに提供する。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】アミノ酸５８７の後にランダム７量体を含有するＡＡＶ２の代表的な３次元モデルを提供する。

【図2】ＡＡＶ２（左）と比較して、ＡＡＶ２７Ｍ８変異体（右）によるより大きなレベルの硝子体内形質導入を示す。

【図3】ユビキタスＣＡＧプロモーター（左）または光受容体特異的Ｒｈｏプロモーター（右）の制御下でＧＦＰ遺伝子を担持する７Ｍ８に起因する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現を示す網膜冷凍スライスの代表的な蛍光画像を提供する。

【図4】７Ｍ８または４チロシン変異を担持する７Ｍ８（７ｍ８．４ＹＦ）による形質導入後のフローサイトメトリーによって計数された１００万個の網膜細胞当たりのＧＦＰ^＋光受容体細胞を示す。

【図5】ＡＡＶ２ＶＰ１（配列番号１）のアミノ酸配列を提供する。

【図6】様々なＡＡＶ血清型のＡＡＶキャプシドタンパク質ＶＰ１のＡＡＶ２（図５）のアミノ酸５７０〜６１０に対応するアミノ酸配列を提供する。

【図7】Ａ−Ｉは、遺伝子導入後のＲｓｌｈ−／−マウスの網膜における構造的改善を示す。

【図8】Ａ−Ｄは、ＲＳ１遺伝子送達後の網膜電図Ａ波およびＢ波の機能的救済を示す。

【図9】Ａ−Ｅは、７ｍ８−ｒｈｏ−ＲＳ１での処理後１０ヶ月時点で測定された網膜厚の持続的改善を示す。

【図10】レチノスキシンのアミノ酸配列を提供する。

【図11】脳由来神経栄養因子のアミノ酸配列を提供する。

【図12】ＲＰＥ６５のアミノ酸配列を提供する。

【図13】Ａ−Ｃは、７ｍ８−ｒｈｏ−ＲＳ１構築物のヌクレオチド配列を提供する。

【図14】ペリフェリン−２のアミノ酸配列を提供する。

【図15】ペリフェリンのアミノ酸配列を提供する。

【図16】網膜色素変性ＧＴＰａｓｅ調節因子相互作用タンパク質−１のアミノ酸配列を提供する。

【図17】Ａ−Ｃは、ＡＡＶキャプシドタンパク質ループＩＶ（ＧＨループ）領域のアミノ酸配列のアラインメントを提供する。挿入部位は、太字および下線で示される。

【図18】Ａ−Ｃは、異種ペプチドが挿入されたＡＡＶキャプシドタンパク質ＧＨループ領域のアミノ酸配列のアラインメントを提供する。

【図19】コネキシン３６プロモーターの制御下でＧＦＰを担持する７ｍ８の投与から９週間後の霊長類の中心網膜におけるＧＦＰ発現を示す蛍光眼底画像を提供する。

【発明を実施するための形態】

【0009】

定義
「網膜細胞」という用語は、本明細書において、網膜神経節細胞、アマクリン細胞、水平細胞、双極細胞、ならびに桿体および錐体を含む光受容体細胞、ミュラーグリア細胞、および網膜色素上皮等の網膜を含む細胞型のうちのいずれかを指し得る。

【0010】

「ＡＡＶ」は、アデノ関連ウイルスの略語であり、ウイルス自体またはその誘導体を指すために使用されてもよい。本用語は、別に要求される場合を除いて、すべてのサブタイプ、ならびに天然に存在する形態および組換え形態の両方を包含する。「ｒＡＡＶ」という略語は、組換えアデノ関連ウイルスを指し、組換えＡＡＶベクター（または「ｒＡＡＶベクター」）とも称される。「ＡＡＶ」という用語には、ＡＡＶ型１（ＡＡＶ−１）、ＡＡＶ型２（ＡＡＶ−２）、ＡＡＶ型３（ＡＡＶ−３）、ＡＡＶ型４（ＡＡＶ−４）、ＡＡＶ型５（ＡＡＶ−５）、ＡＡＶ型６（ＡＡＶ−６）、ＡＡＶ型７（ＡＡＶ−７）、ＡＡＶ型８（ＡＡＶ−８）、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、およびヒツジＡＡＶが含まれる。「霊長類ＡＡＶ」は、霊長類に感染するＡＡＶを指し、「非霊長類ＡＡＶ」は、非霊長類哺乳動物に感染するＡＡＶを指し、「ウシＡＡＶ」は、ウシ哺乳動物に感染するＡＡＶを指す、等である。

【0011】

ＡＡＶの様々な血清型のゲノム配列、ならびに天然末端反復（ＴＲ）の配列、Ｒｅｐタンパク質、およびキャプシドサブユニットは、当技術分野で既知である。このような配列は、文献またはＧｅｎＢａｎｋ等の公開データベースで見つけることができる。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００２０７７（ＡＡＶ−１）、ＡＦ０６３４９７（ＡＡＶ−１）、ＮＣ＿００１４０１（ＡＡＶ−２）、ＡＦ０４３３０３（ＡＡＶ−２）、ＮＣ＿００１７２９（ＡＡＶ−３）、ＮＣ＿００１８２９（ＡＡＶ−４）、Ｕ８９７９０（ＡＡＶ−４）、ＮＣ＿００６１５２（ＡＡＶ−５）、ＡＦ５１３８５１（ＡＡＶ−７）、ＡＦ５１３８５２（ＡＡＶ−８）、およびＮＣ＿００６２６１（ＡＡＶ−８）を参照されたく、これらの開示は、ＡＡＶ核酸およびアミノ酸配列を教示するために、参照により本明細書に組み込まれる。例えば、Ｓｒｉｖｉｓｔａｖａｅｔａｌ．（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ４５：５５５、Ｃｈｉｏｒｉｎｉｅｔａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ７１：６８２３、Ｃｈｉｏｒｉｎｉｅｔａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ７３：１３０９、Ｂａｎｔｅｌ−Ｓｃｈａａｌｅｔａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ７３：９３９、Ｘｉａｏｅｔａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ７３：３９９４、Ｍｕｒａｍａｔｓｕｅｔａｌ．（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２２１：２０８、Ｓｈａｄｅｅｔａｌ．，（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５８：９２１、Ｇａｏｅｔａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９９：１１８５４、Ｍｏｒｉｓｅｔａｌ．（２００４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ３３：３７５−３８３、国際特許公開第ＷＯ００／２８０６１号、同第ＷＯ９９／６１６０１号、同第ＷＯ９８／１１２４４号、および米国特許第６，１５６，３０３号も参照されたい。

【0012】

本明細書で使用される「ｒＡＡＶベクター」は、ＡＡＶ由来ではないポリヌクレオチド（すなわち、ＡＡＶと異種のポリヌクレオチド）配列、典型的には、細胞の遺伝子形質転換のための目的とする配列を含むＡＡＶベクターを指す。概して、異種ポリヌクレオチドは、少なくとも１つ、一般的には２つのＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）によって隣接される。ｒＡＡＶベクターという用語は、ｒＡＡＶベクター粒子およびｒＡＡＶベクタープラスミドの両方を包含する。ｒＡＡＶベクターは、一本鎖（ｓｓＡＡＶ）または自己相補的（ｓｃＡＡＶ）のいずれかであり得る。

【0013】

「ＡＡＶウイルス」または「ＡＡＶウイルス粒子」または「ｒＡＡＶベクター粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶキャプシドタンパク質からなるウイルス粒子（典型的には、野生型ＡＡＶのキャプシドタンパク質のすべてによる）およびキャプシド形成されたポリヌクレオチドｒＡＡＶベクターを指す。粒子が異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳類細胞に送達される導入遺伝子等の野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合、これは、典型的には、「ｒＡＡＶベクター粒子」または単に「ｒＡＡＶベクター」と称される。したがって、ｒＡＡＶ粒子の生成は、ｒＡＡＶベクターの生成を必然的に含み、例えば、このようなベクターは、ｒＡＡＶ粒子内に含有される。

【0014】

「パッケージング」は、ＡＡＶ粒子の組み立ておよびキャプシド形成をもたらす一連の細胞内事象を指す。

【0015】

ＡＡＶ「ｒｅｐ」および「ｃａｐ」遺伝子は、アデノ関連ウイルスの複製およびキャプシド形成タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を指す。ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐは、本明細書において、ＡＡＶ「パッケージング遺伝子」と称される。

【0016】

ＡＡＶの「ヘルパーウイルス」は、ＡＡＶ（例えば、野生型ＡＡＶ）が哺乳類細胞によって複製およびパッケージングされることを可能にするウイルスを指す。様々なそのようなＡＡＶのヘルパーウイルスは、当技術分野で既知であり、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、およびワクシニア等のポックスウイルスを含む。アデノウイルスは、いくつかの異なるサブグループを包含するが、サブグループＣのアデノウイルス５型が最も一般的に使用される。ヒト、非ヒト哺乳類、および鳥類由来の多数のアデノウイルスが知られており、ＡＴＣＣ等の受託者から入手可能である。ヘルペスファミリーのウイルスには、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）およびエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、ならびにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）および仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）が含まれ、これらもＡＴＣＣ等の受託者から入手可能である。

【0017】

「ヘルパーウイルス機能（複数を含む）」は、（本明細書に記載の複製およびパッケージングの他の要件と併せて）ＡＡＶ複製およびパッケージングを可能にするヘルパーウイルスゲノムにおいてコードされた機能（複数を含む）を指す。本明細書に記載される「ヘルパーウイルス機能」は、ヘルパーウイルスを提供すること、または例えば、必要な機能（複数を含む）をコードするポリヌクレオチド配列をトランスにおいて産生細胞に提供することを含む、いくつかの方法で提供され得る。例えば、１つ以上アデノウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドまたは他の発現ベクターは、ｒＡＡＶベクターとともに産生細胞にトランスフェクトされる。

【0018】

「感染性」ウイルスまたはウイルス粒子は、コンピテントに組み立てられたウイルスキャプシドを含み、かつそのウイルス種が指向性である細胞にポリヌクレオチド構成成分を送達することができるものである。本用語は、必ずしもそのウイルスの任意の複製能力を暗示しない。感染性ウイルス粒子を計数するためのアッセイは、本開示の別の箇所および当技術分野において説明される。ウイルス感染性を、全ウイルス粒子に対する感染性ウイルス粒子の比率で表すことができる。全ウイルス粒子に対する感染性ウイルス粒子の比率を決定する方法は、当技術分野において既知である。例えば、Ｇｒａｉｎｇｅｒｅｔａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１１：Ｓ３３７（ＴＣＩＤ５０感染力価アッセイを説明する）、およびＺｏｌｏｔｕｋｈｉｎｅｔａｌ．（１９９９）ＧｅｎｅＴｈｅｒ．６：９７３を参照されたい。実施例も参照されたい。

【0019】

「複製コンピテント」ウイルス（例えば、複製コンピテントＡＡＶ）は、感染性であり、かつ感染細胞内で複製されることもできる（すなわち、ヘルパーウイルスまたはヘルパーウイルス機能の存在下で）表現型的に野生型のウイルスを指す。ＡＡＶの場合、複製コンピテンスは、概して、機能的ＡＡＶパッケージング遺伝子の存在を必要とする。概して、本明細書に記載のｒＡＡＶベクターは、１つ以上のＡＡＶパッケージング遺伝子の欠失のため、哺乳類細胞（特にヒト細胞）において複製非コンピテントである。典型的には、そのようなｒＡＡＶベクターは、複製コンピテントＡＡＶがＡＡＶパッケージング遺伝子と入ってくるｒＡＡＶベクターとの間の組換えによって生成される可能性を最小限に抑えるために、任意のＡＡＶパッケージング遺伝子配列を欠失する。多くの実施形態において、本明細書に記載のｒＡＡＶベクター調製物は、例えあったとしてもわずかな複製コンピテントＡＡＶ（ｒｃＡＡＶ、ＲＣＡとも称される）を含有するものである（例えば、１０^２ｒＡＡＶ粒子当たり約１ｒｃＡＡＶ未満、１０^４ｒＡＡＶ粒子当たり約１ｒｃＡＡＶ未満、１０^８ｒＡＡＶ粒子当たり約１ｒｃＡＡＶ未満、１０^１２ｒＡＡＶ粒子当たり約１ｒｃＡＡＶ未満、またはｒｃＡＡＶなし）。

【0020】

「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはそれらの類似体を含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体等の修飾ヌクレオチドを有し得、非ヌクレオチド構成成分によって妨害され得る。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーの組み立て前または後に付与され得る。本明細書で使用される際、ポリヌクレオチドという用語は、同義に、二本鎖および一本鎖分子を指す。別途明記または要求されない限り、ポリヌクレオチドである本明細書に記載の本発明の任意の実施形態は、二本鎖形態とその二本鎖形態を構成することで知られているか、または構成すると予想される２つの相補的な一本鎖形態のそれぞれの両方を包含する。

【0021】

核酸ハイブリダイゼーション反応は、異なる「ストリンジェンシー」の条件下で行われてもよい。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーを高める条件は周知であり、当技術分野において公開されている。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２ｎｄＥｄ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９を参照されたい。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋらのページ７．５２を参照されたい。関連条件の例には、（ストリンジェンシーを高める順に）２５℃、３７℃、５０℃、６８℃のインキュベーション温度；１０倍ＳＳＣ、６倍ＳＳＣ、１倍ＳＳＣ、０．１倍ＳＳＣ（１倍ＳＳＣが、０．１５ＭのＮａＣｌおよび１５ｍＭのクエン酸緩衝液である）の緩衝液濃度および他の緩衝液システムを用いたそれらの等価物；０％、２５％、５０％、および７５％のホルムアミド濃度；５分〜２４時間のインキュベーション時間；１回、２回、またはそれ以上の洗浄ステップ、１、２、１５分の洗浄インキュベーション時間；６倍ＳＳＣ、１倍ＳＳＣ、０．１倍ＳＳＣの洗浄液または脱イオン水が含まれる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、５０℃以上および０．１倍ＳＳＣ（１５ｍＭの塩化ナトリウム／１．５ｍＭのクエン酸ナトリウム）でのハイブリダイゼーションである。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の別の例は、５０％ホルムアミド、１倍ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５倍デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性かつ剪断されたサケ精子ＤＮＡの溶液中で一晩４２℃でのインキュベーションであり、その後、約６５℃の０．１倍ＳＳＣでフィルタを洗浄する。別の例として、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６倍単一強度クエン酸（ＳＳＣ）（１倍ＳＳＣは、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム；ｐＨ７．０）、５倍デンハート液、０．０５％のピロリン酸ナトリウム、および１００μｇ／ｍＬのニシン精子ＤＮＡを含む溶液中で６５℃で８時間〜一晩のプレハイブリダイゼーション；６倍ＳＳＣ、１倍デンハート液、１００μｇ／ｍＬの酵母ｔＲＮＡ、および０．０５％のピロリン酸ナトリウムを含有する溶液内で６５℃で１８〜２０時間のハイブリダイゼーション；ならびに０．２倍ＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を含有する溶液内で６５℃で１時間のフィルタ洗浄を含む。

【0022】

ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、上述の代表的な条件と少なくとも同程度ストリンジェントであるハイブリダイゼーション条件である。他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、当技術分野で既知であり、本発明のこの特定の実施形態の核酸を識別するためにも用いられ得る。

【0023】

「Ｔ_ｍ」は、ワトソン・クリック塩基対合によって逆平行方向に水素結合された相補的な鎖で作成されたポリヌクレオチド二本鎖の５０％が、この実験の条件下で分離して一本鎖になる摂氏温度である。Ｔ_ｍを、以下のような標準の式に従って予測することができる。

【0024】

（数１）
Ｔ_ｍ＝８１．５＋１６．６ｌｏｇ［Ｘ^＋］＋０．４１（％Ｇ／Ｃ）−０．６１（％Ｆ）−６００／Ｌ

【0025】

式中、［Ｘ^＋］は、ｍｏｌ／Ｌ単位のカチオン濃度（通常、ナトリウムイオン、Ｎａ^＋）であり、（％Ｇ／Ｃ）は、二本鎖中の全残基の割合としてのＧおよびＣ残基の数であり、（％Ｆ）は、溶液中のホルムアミドの割合であり（重量／体積）、Ｌは、二本鎖の各鎖中のヌクレオチドの数である。

【0026】

ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、別のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対してある特定の割合の「配列同一性」を有し、整列したときに、塩基またはアミノ酸の割合が、それら２つの配列を比較したときに同一であることを意味する。配列類似性をいくつかの異なる様式で決定することができる。配列類似性を決定するために、配列は、ワールドワイドウェブのｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／上で利用可能なＢＬＡＳＴを含む方法およびコンピュータプログラムを用いて整列することができる。別の整列アルゴリズムは、ＯｘｆｏｒｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｒｏｕｐ，Ｉｎｃの完全所有子会社であるＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｉｎｇＧｒｏｕｐ（ＧＣＧ）のパッケージ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）から入手可能なＦＡＳＴＡである。整列の他の技法は、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２６６：ＣｏｍｐｕｔｅｒＭｅｔｈｏｄｓｆｏｒＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓ（１９９６），ｅｄ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（ＨａｒｃｏｕｒｔＢｒａｃｅ＆Ｃｏ．の一部門），ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡに記載されている。配列間のギャップを許容する整列プログラムが特に興味深い。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎは、配列整列におけるギャップを許容する一種のアルゴリズムである。Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７０：１７３−１８７（１９９７）を参照されたい。また、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ整列方法を用いたＧＡＰプログラムを利用して、配列を整列させることができる。Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）を参照されたい。

【0027】

配列同一性を決定するためのＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎのローカルホモロジーアルゴリズム（ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＡｐｐｌｉｅｄＭａｔｈｅｍａｔｉｃｓ２：４８２−４８９（１９８１））を用いたＢｅｓｔＦｉｔプログラムが興味深い。ギャップ生成ペナルティは、概して、１〜５、通常２〜４の範囲であり、多くの実施形態においては３である。ギャップ伸長ペナルティは、概して、約０．０１〜０．２０の範囲であり、多くの場合、０．１０である。このプログラムは、比較するために入力された配列によって決定されるデフォルトパラメータを有する。好ましくは、配列同一性は、このプログラムによって決定されるデフォルトパラメータを用いて決定される。このプログラムは、ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｉｎｇＧｒｏｕｐ（ＧＣＧ）パッケージ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）からも入手可能である。

【0028】

興味深い別のプログラムは、ＦａｓｔＤＢアルゴリズムである。ＦａｓｔＤＢは、ＣｕｒｒｅｎｔＭｅｔｈｏｄｓｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅＣｏｍｐａｒｉｓｏｎａｎｄＡｎａｌｙｓｉｓ，ＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇａｎｄＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＳｅｌｅｃｔｅｄＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．１２７−１４９，１９８８，ＡｌａｎＲ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．で説明されている。配列同一性パーセントは、以下のパラメータに基づいてＦａｓｔＤＢによって計算される。
ミスマッチペナルティ：１．００、
ギャップペナルティ：１．００、
ギャップサイズペナルティ：０．３３、
接合ペナルティ：３０．０。

【0029】

「遺伝子」は、転写および翻訳された後に特定のタンパク質をコードすることができる少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含有するポリヌクレオチドを指す。

【0030】

「遺伝子産物」は、特定の遺伝子の発現に由来する分子である。遺伝子産物は、例えば、ポリペプチド、アプタマー、干渉ＲＮＡ、ｍＲＮＡ等を含む。

【0031】

「低分子干渉」もしくは「短干渉ＲＮＡ」またはｓｉＲＮＡは、目的とする遺伝子（「標的遺伝子」）を標的とするヌクレオチドのＲＮＡ二本鎖である。「ＲＮＡ二本鎖」は、ＲＮＡ分子の２つの領域間の相補的対合によって形成される構造を指す。ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡの二本鎖部分のヌクレオチド配列がその標的化された遺伝子のヌクレオチド配列に対して相補的であるという点で遺伝子を「標的とする」。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡの二本鎖は、３０ヌクレオチド長未満である。いくつかの実施形態において、二本鎖は、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、または１０ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態において、二本鎖の長さは、１９〜２５ヌクレオチド長である。ｓｉＲＮＡのＲＮＡ二本鎖部分は、ヘアピン構造の一部であり得る。二本鎖部分に加えて、ヘアピン構造は、その二本鎖を形成する２つの配列間に位置するループ部分を含有し得る。ループの長さは変化し得る。いくつかの実施形態において、ループは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３ヌクレオチド長である。ヘアピン構造は、３’または５’オーバーハング部分も含有し得る。いくつかの実施形態において、オーバーハングは、３’または５’オーバーハングであり、０、１、２、３、４、または５ヌクレオチド長である。

【0032】

「短ヘアピンＲＮＡ」またはｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ等の干渉ＲＮＡを発現するように作成され得るポリヌクレオチド構築物である。

【0033】

ポリヌクレオチドに適用される「組換え」は、ポリヌクレオチドが、クローニング、制限、またはライゲーションステップの様々なf組み合わせ、および自然界に見られるポリヌクレオチドとは異なる構築物をもたらす他の手順の産物であるということを意味する。組換えウイルスは、組換えポリヌクレオチドを含むウイルス粒子である。これらの用語は、それぞれ、初代のポリヌクレオチド構築物の複製および最初のウイルス構築物の子孫を含む。

【0034】

「制御因子」または「制御配列」は、ポリヌクレオチドの複製、重複、転写、スプライシング、翻訳、または分解を含む、ポリヌクレオチドの機能調節に寄与する分子の相互作用に関与するヌクレオチド配列である。この調節は、プロセスの頻度、速度、または特異性に影響を与え得、本来、促進的または阻害的であり得る。当技術分野で既知の制御因子は、例えば、プロモーターおよびエンハンサー等の転写制御配列である。プロモーターは、ある特定の条件下でＲＮＡポリメラーゼを結合し、かつ通常プロモーターから（３’の方向に）下流に位置するコード領域の転写を開始することができるＤＮＡ領域である。

【0035】

「動作的に結合される」または「動作可能に結合される」は、遺伝要素の並列を指し、これらの要素は、それらが予想される様式で動作することを可能にする関係にある。例えば、プロモーターは、プロモーターがコード配列の転写を開始する助けとなる場合、コード領域に動作的に結合される。この機能的関係が維持される限り、プロモーターとコード領域との間に介在残基が存在し得る。

【0036】

「発現ベクター」は、目的とするポリペプチドをコードする領域を含むベクターであり、対象とする標的細胞におけるタンパク質の発現をもたらすために使用される。発現ベクターは、その標的におけるタンパク質の発現を促進するためにコード領域に動作的に結合される制御因子も含む。制御因子とそれらが発現のために動作可能に結合される１つの遺伝子もしくは複数の遺伝子との組み合わせは、「発現カセット」と称されることもあり、その多くは、当技術分野で既知であり、かつ入手可能であるか、または当技術分野で入手可能な構成成分から容易に構築され得る。

【0037】

「異種」とは、比較される実体の残りのものとは遺伝子型が異なる実体に由来することを意味する。例えば、遺伝子工学技術によって異なる種に由来するプラスミドまたはベクターに導入されるポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドである。その天然コード配列から除去され、かつ自然には結合されていないコード配列に動作的に結合されるプロモーターは、異種プロモーターである。したがって、例えば、異種遺伝子産物をコードする異種核酸を含むｒＡＡＶは、天然に存在する野生型ＡＡＶに通常は含まれない核酸を含むｒＡＡＶであり、コードされた異種遺伝子産物は、天然に存在する野生型ＡＡＶによって通常コードされない遺伝子産物である。

【0038】

「遺伝子改変」および「遺伝子修飾」（ならびにそれらの文法的変形）は、本明細書において、遺伝因子（例えば、ポリヌクレオチド）が、有糸分裂または減数分裂以外により、細胞に導入されるプロセスを指すために同義に使用される。この因子は、その細胞に対して異種であり得るか、または、その細胞中にすでに存在する因子のさらなるコピーもしくは改良型であり得る。遺伝子改変は、例えば、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、またはポリヌクレオチドリポソーム複合体との接触等の当技術分野で既知の任意のプロセスを介して細胞を組換えプラスミドまたは他のポリヌクレオチドでトランスフェクトすることによって達成され得る。遺伝子改変は、例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡウイルスまたはウイルスベクターでの形質導入あるいは感染によっても達成され得る。概して、遺伝因子は、細胞内の染色体またはミニ染色体内に導入されるが、その細胞およびその子孫の表現型および／または遺伝子型を変化させる任意の改変がこの用語に包含される。

【0039】

細胞は、遺伝子配列が、生体外でのその細胞の延長培養中にその機能を果たすことができる場合、その遺伝子配列で「安定的に」改変されるか、形質導入されるか、遺伝子修飾されるか、または形質転換されるといわれている。概して、そのような細胞は、「遺伝的に」改変（遺伝子修飾）され、そこで、改変された細胞の子孫によっても遺伝可能な遺伝子改変が導入される。

【0040】

「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書において、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために同義に使用される。本用語は、修飾された（例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、リン酸化、または標識構成成分との接合）アミノ酸ポリマーも包含する。抗血管新生ポリペプチド、神経保護ポリペプチド等のポリペプチドは、遺伝子産物を哺乳類対象に、およびその組成物を送達するという文脈において論じられるとき、無傷のタンパク質の所望の生化学的機能を保持するそれぞれの無傷のポリペプチドまたはその任意の断片もしくは遺伝子操作された誘導体を指す。同様に、抗血管新生ポリペプチドをコードする核酸、神経保護ポリペプチドをコードする核酸、および遺伝子産物の哺乳類対象への送達に用いる他のそのような核酸（これは、受容細胞に送達される「導入遺伝子」と称され得る）への言及は、所望の生化学的機能を保持する無傷のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは任意の断片もしくは遺伝子操作された誘導体を含む。

【0041】

「単離された」プラスミド、核酸、ベクター、ウイルス、ビリオン、宿主細胞、または他の物質は、その物質もしくは類似の物質が、天然に存在するか、あるいは最初に調製される場所に存在し得る他の構成成分のうちの少なくともいくつかを欠く物質の調製物を指す。したがって、例えば、単離された物質は、それを供給源混合物から濃縮するための精製技法を用いて調製され得る。濃縮度を、溶液の体積当たりの重量等の絶対基準で測定することができるか、または供給源混合物中に存在する第２の干渉する可能性のある物質と関連させて測定することができる。本開示の実施形態の増加する濃縮物は、次第により単離される。いくつかの実施形態において、単離されたプラスミド、核酸、ベクター、ウイルス、宿主細胞、または他の物質は精製され、例えば、約８０％〜約９０％純粋であるか、少なくとも約９０％純粋であるか、少なくとも約９５％純粋であるか、少なくとも約９８％純粋であるか、または少なくとも約９９％以上純粋である。

【0042】

本明細書で使用される際、「治療」、「治療する」等の用語は、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを指す。その効果は、疾患またはその症状を完全にまたは部分的に予防するという観点において予防的であり得、かつ／または疾患および／もしくはその疾患に起因する副作用の部分的または完全な治癒という観点において治療的であり得る。本明細書で使用される際、「治療」は、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の任意の治療を包含し、（ａ）その疾患にかかりやすいか、その疾患にかかる危険性を有し得るが、まだそれを有すると診断されていない対象における発病を予防すること、（ｂ）その疾患を阻害すること、すなわち、その発現を阻止すること、および（ｃ）その疾患を軽減すること、すなわち、その疾患の退行を引き起こすことを含む。

【0043】

「個体」、「宿主」、「対象」、および「患者」という用語は、本明細書において同義に使用され、サルおよびヒトを含むヒトおよび非ヒト霊長類、哺乳類スポーツ動物（例えば、ウマ）、哺乳類家畜動物（例えば、ヒツジ、ヤギ等）、哺乳類ペット（例えば、イヌ、ネコ等）、ならびに齧歯類（例えば、マウス、ラット等）を含むが、これらに限定されない哺乳動物を指す。

【0044】

本発明をさらに説明する前に、本発明が、記載される特定の実施形態に限定されず、したがって、言うまでもなく、変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定するよう意図されないことも理解されたい。

【0045】

値の範囲が提供される場合、その範囲の上限値および下限値の間の各介在値（文脈が別途明確に指示しない限り、下限値の単位の１０分の１まで）、ならびにその表示範囲の任意の他の表示値または介在値が本発明に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限値および下限値は、より小さい範囲内に独立して含まれてもよく、表示範囲内の任意の具体的に除外された値に従って本発明内にも包含される。表示範囲がそれらの上限値および下限値のうちの１つまたは両方を含む場合、それらの包含される上限値および下限値のいずれかまたは両方を除外する範囲も本発明に包含される。

【0046】

別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者が一般に理解する意味と同一の意味を有する。本明細書に記載の方法および物質と同様もしくは同等の任意の方法および物質を本発明の実践または試験において使用することもできるが、好ましい方法および物質は、これから説明される。本明細書で言及されるすべての出版物は、それらの出版物が引用される方法および／または物質を開示および説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。

【0047】

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数指示対象を含むことに留意すべきである。したがって、例えば、「組換えＡＡＶビリオン」への言及は、複数のそのようなビリオンを含み、「光受容体細胞」への言及は、１つ以上の光受容体細胞および当業者に既知のそれらの等価物等への言及を含む等である。特許請求の範囲が任意の要素を除外するように作成されてもよいことにさらに留意する。したがって、この記述は、特許請求の範囲の要素の列挙に関連した「単に」、「のみ」等の排他的な専門用語の使用のため、または「否定的な」制限の使用のための先行記述となるよう意図される。

【0048】

明確にするために別個の実施形態の文脈において説明される本発明のある特定の特徴を、単一の実施形態において組み合わせで提供することもできることが理解される。逆に、簡潔にするために単一の実施形態の文脈において説明される本発明の様々な特徴を、別々に、または任意の好適な副組み合わせで提供することもできる。本発明に関連する実施形態のすべての組み合わせは、本発明によって具体的に包含され、ありとあらゆる組み合わせが個別にかつ明確に開示されたかのように本明細書に開示される。加えて、様々な実施形態およびそれらの要素のすべての副組み合わせも本発明によって具体的に包含され、ありとあらゆるそのような副組み合わせが個別にかつ明確に本明細書に開示されたかのように本明細書に開示される。

【0049】

本明細書で論じられる出版物は、本出願の出願日前にそれらを開示するためだけに提供される。本明細書におけるいずれの内容も、本発明が先行発明によりそのような出版物に先行する資格がないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、提供される出版物の日付は、実際の出版日とは異なる場合があり、別々に確認する必要があり得る。

【0050】

詳細な説明
本開示は、改変キャプシドタンパク質を有するアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ビリオンを提供し、ＡＡＶビリオンは、硝子体内注入を介して投与されるときに、野生型ＡＡＶと比較してより高い網膜細胞の感染性を呈する。本開示は、遺伝子産物を個体の網膜細胞に送達する方法、および眼疾患を治療する方法をさらに提供する。

【0051】

網膜細胞は、光受容体（例えば、桿体、錐体）、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）、ミュラー細胞（ミュラーグリア細胞）、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞、または網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞であり得る。

【0052】

変異体ＡＡキャプシドポリペプチド
本開示は、変異体ＡＡＶキャプシドタンパク質を提供し、この変異体ＡＡＶキャプシドタンパク質は、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対するキャプシドタンパク質ＧＨループまたはループＩＶにおける挿入部位での約５個のアミノ酸〜約１１個のアミノ酸の挿入を含み、その変異体キャプシドタンパク質は、ＡＡＶビリオンに存在するとき、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染性と比較して、増加した網膜細胞の感染性を付与する。ある場合には、網膜細胞は、光受容体細胞（例えば、桿体、錐体）である。他の場合には、網膜細胞は、ＲＧＣである。他の場合には、網膜細胞は、ＲＰＥ細胞である。他の場合には、網膜細胞は、ミュラー細胞である。他の網膜細胞には、アマクリン細胞、双極細胞、および水平細胞が含まれる。「約５個のアミノ酸〜約１１個のアミノ酸の挿入」は、本明細書において、「ペプチド挿入」（例えば、異種ペプチド挿入）とも称される。「対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質」は、ペプチド挿入なしの同一のＡＡＶ血清型のＡＡＶキャプシドタンパク質を指す。

【0053】

挿入部位は、ＡＡＶキャプシドタンパク質のＧＨループまたはループＩＶ、例えば、ＡＡＶキャプシドタンパク質のＧＨループまたはループＩＶの溶媒接近可能な部分にある。ＡＡＶキャプシドのＧＨループ／ループＩＶについて、例えば、ｖａｎＶｌｉｅｔｅｔａｌ．（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４：８０９、Ｐａｄｒｏｎｅｔａｌ．（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：５０４７、およびＳｈｅｎｅｔａｌ．（２００７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５：１９５５を参照されたい。例えば、挿入部位は、図１７Ａおよび１７Ｂに示されるように、ＡＡＶキャプシドタンパク質のアミノ酸４１１〜６５０内にあり得る。例えば、挿入部位は、図６に示されるように、ＡＡＶ２のアミノ酸５７０〜６１１内、ＡＡＶ１のアミノ酸５７１〜６１２内、ＡＡＶ５のアミノ酸５６０〜６０１内、ＡＡＶ６のアミノ酸５７１〜６１２内、ＡＡＶ７のアミノ酸５７２〜６１３内、ＡＡＶ８のアミノ酸５７３〜６１４内、ＡＡＶ９のアミノ酸５７１〜６１２内、またはＡＡＶ１０のアミノ酸５７３〜６１４内にあり得る。

【0054】

ある場合には、約５個のアミノ酸〜約１１個のアミノ酸は、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対してキャプシドタンパク質のＧＨループまたはループＩＶにおける挿入部位に挿入される。例えば、挿入部位は、ＡＡＶ２のアミノ酸５８７と５８８との間、または別のＡＡＶ血清型のキャプシドサブユニットの対応する位置にあり得る。挿入部位５８７／５８８は、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質に基づくことに留意されたい。約５個のアミノ酸〜約１１個のアミノ酸は、ＡＡＶ２以外（例えば、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９等）のＡＡＶ血清型における対応する部位に挿入され得る。当業者であれば、様々なＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質のアミノ酸配列の比較に基づいて、「ＡＡＶ２のアミノ酸５８７〜５８８に対応する」挿入部位が、任意の所与のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質のどこにあるかを理解するであろう。様々なＡＡＶ血清型のＡＡＶ２のキャプシドタンパク質ＶＰ１のアミノ酸５７０〜６１１に対応する配列（図５を参照のこと）は、図６に示される。例えば、ＡＡＶ１についてはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０４９５４２、ＡＡＶ５についてはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＤ１３７５６、ＡＡＶ６についてはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＢ９５４５９、ＡＡＶ７についてはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＹＰ＿０７７１７８、ＡＡＶ８についてはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＹＰ＿０７７１８０、ＡＡＶ９についてはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＳ９９２６４、およびＡＡＶ１０についてはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＴ４６３３７を参照されたい。

【0055】

いくつかの実施形態において、挿入部位は、任意のＡＡＶ血清型のＶＰ１のアミノ酸５７０〜６１４の間に位置する２つの隣接アミノ酸の間の単一挿入部位であり、例えば、挿入部位は、任意のＡＡＶ血清型または変異体のＶＰ１のアミノ酸５７０〜６１０、アミノ酸５８０〜６００、アミノ酸５７０〜５７５、アミノ酸５７５〜５８０、アミノ酸５８０〜５８５、アミノ酸５８５〜５９０、アミノ酸５９０〜６００、またはアミノ酸６００〜６１４に位置する２つの隣接アミノ酸の間にある。例えば、挿入部位は、アミノ酸５８０と５８１との間、アミノ酸５８１と５８２との間、アミノ酸５８３と５８４との間、アミノ酸５８４と５８５との間、アミノ酸５８５と５８６との間、アミノ酸５８６と５８７との間、アミノ酸５８７と５８８との間、アミノ酸５８８と５８９との間、またはアミノ酸５８９と５９０との間にあり得る。挿入部位は、アミノ酸５７５と５７６との間、アミノ酸５７６と５７７との間、アミノ酸５７７と５７８との間、アミノ酸５７８と５７９との間、またはアミノ酸５７９と５８０との間にあり得る。挿入部位は、アミノ酸５９０と５９１との間、アミノ酸５９１と５９２との間、アミノ酸５９２と５９３との間、アミノ酸５９３と５９４との間、アミノ酸５９４と５９５との間、アミノ酸５９５と５９６との間、アミノ酸５９６と５９７との間、アミノ酸５９７と５９８との間、アミノ酸５９８と５９９との間、またはアミノ酸５９９と６００との間にあり得る。

【0056】

例えば、挿入部位は、ＡＡＶ２のアミノ酸５８７と５８８との間、ＡＡＶ１のアミノ酸５９０と５９１との間、ＡＡＶ５のアミノ酸５７５と５７６との間、ＡＡＶ６のアミノ酸５９０と５９１との間、ＡＡＶ７のアミノ酸５８９と５９０との間、ＡＡＶ８のアミノ酸５９０と５９１との間、ＡＡＶ９のアミノ酸５８８と５８９との間、またはＡＡＶ１０のアミノ酸５８８と５８９との間にあり得る。

【0057】

別の例として、挿入部位は、図１７Ａに示されるように、ＡＡＶキャプシドタンパク質のアミノ酸４５０〜４６０の間にあり得る。例えば、挿入部位は、図１７Ａに示されるように、（例えば、Ｎ末端直近の）ＡＡＶ２のアミノ酸４５３、ＡＡＶ１のアミノ酸４５４、ＡＡＶ６のアミノ酸４５４、ＡＡＶ７のアミノ酸４５６、ＡＡＶ８のアミノ酸４５６、ＡＡＶ９のアミノ酸４５４、またはＡＡＶ１０のアミノ酸４５６にあり得る。

【0058】

いくつかの実施形態において、主題のキャプシドタンパク質は、図１８Ａ〜Ｃに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＧＨループを含む。

【0059】

挿入ペプチド
上述のように、約５アミノ酸長〜約１１アミノ酸長のペプチドは、ＡＡＶキャプシドのＧＨループに挿入される。挿入ペプチドは、５アミノ酸長、６アミノ酸長、７アミノ酸長、８アミノ酸長、９アミノ酸長、１０アミノ酸長、または１１アミノ酸長である。

【0060】

挿入ペプチドは、以下に記載の式のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含み得る。

【0061】

例えば、挿入ペプチドは、５アミノ酸長〜１１アミノ酸長のペプチドであってもよく、この挿入ペプチドは、以下の式Ｉのものであり、
Ｙ_１Ｙ_２Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｙ_３Ｙ_４
式中、
Ｙ_１〜Ｙ_４はそれぞれ、存在する場合、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、およびＴｈｒから独立して選択され、
Ｘ_１は、存在する場合、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、およびＬｙｓから選択され、
Ｘ_２は、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、およびＡｓｐから選択され、
Ｘ_３は、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、およびＰｒｏから選択され、
Ｘ_４は、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｇｌｎ、およびＬｙｓから選択され、
Ｘ_５は、ＴｈｒおよびＡｌａから選択され、
Ｘ_６は、Ａｒｇ、Ａｓｎ、およびＴｈｒから選択され、
Ｘ_７は、存在する場合、ＰｒｏおよびＡｓｎから選択される。

【0062】

別の例として、挿入ペプチドは、５〜１１アミノ酸長のペプチドであってもよく、この挿入ペプチドは、以下の式ＩＩａのものであり、

【0063】

Ｙ_１Ｙ_２Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｙ_３Ｙ_４

【0064】

式中、
Ｙ_１〜Ｙ_４はそれぞれ、存在する場合、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、およびＴｈｒから独立して選択され、
Ｘ₁〜Ｘ_４はそれぞれ、任意のアミノ酸であり、
Ｘ_５は、Ｔｈｒであり、
Ｘ_６は、Ａｒｇであり、
Ｘ_７は、Ｐｒｏである。

【0065】

別の例として、挿入ペプチドは、５〜１１アミノ酸長のペプチドであってもよく、この挿入ペプチドは、以下の式ＩＩbのものであり、

【0066】

Ｙ_１Ｙ_２Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｙ_３Ｙ_４

【0067】

式中、
Ｙ_１〜Ｙ_４はそれぞれ、存在する場合、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、およびＴｈｒから独立して選択され、
Ｘ_１は、存在する場合、ＬｅｕおよびＡｓｎから選択され、
Ｘ_２は、存在する場合、ＧｌｙおよびＧｌｕから選択され、
Ｘ_３は、ＧｌｕおよびＴｈｒから選択され、
Ｘ_４は、ＴｈｒおよびＩｌｅから選択され、
Ｘ_５は、Ｔｈｒであり、
Ｘ_６は、Ａｒｇであり、
Ｘ_７は、Ｐｒｏである。

【0068】

別の例として、挿入ペプチドは、５〜１１アミノ酸長のペプチドであってもよく、この挿入ペプチドは、以下の式ＩＩＩのものであり、

【0069】

Ｙ_１Ｙ_２Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｙ_３Ｙ_４

【0070】

式中、
Ｙ_１〜Ｙ_４はそれぞれ、存在する場合、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、およびＴｈｒから独立して選択され、
Ｘ_１は、存在する場合、Ｌｙｓであり、
Ｘ_２は、ＡｌａおよびＡｓｐから選択され、
Ｘ_３は、ＧｌｙおよびＰｒｏから選択され、
Ｘ_４は、ＧｌｎおよびＬｙｓから選択され、
Ｘ_５は、ＴｈｒおよびＡｌａから選択され、
Ｘ_６は、ＡｓｎおよびＴｈｒから選択され、
Ｘ_７は、存在する場合、Ａｓｎである。

【0071】

別の例として、挿入ペプチドは、５〜１１アミノ酸長のペプチドであってもよく、この挿入ペプチドは、以下の式ＩＶのものであり、

【0072】

Ｙ_１Ｙ_２Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｙ_３Ｙ_４

【0073】

式中、
Ｙ_１〜Ｙ_４はそれぞれ、存在する場合、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、およびＴｈｒから独立して選択され、
Ｘ_１は、存在する場合、正に荷電したアミノ酸もしくは荷電していないアミノ酸であるか、またはＬｅｕ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、およびＬｙｓから選択され、
Ｘ_２は、負に荷電したアミノ酸もしくは荷電していないアミノ酸であるか、またはＧｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、およびＡｓｐから選択され、
Ｘ_３は、負に荷電したアミノ酸もしくは荷電していないアミノ酸であるか、またはＧｌｕ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、もしくはＰｒｏから選択され、
Ｘ_４は、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、およびＧｌｎから選択され、
Ｘ_５は、極性アミノ酸、アルコール（遊離ヒドロキシル基を有するアミノ酸）、もしくは疎水性アミノ酸であるか、または、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、およびＡｌａから選択され、
Ｘ_６は、正に荷電したアミノ酸もしくは荷電していないアミノ酸であるか、またはＡｒｇ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、およびＡｓｎから選択され、
Ｘ_７は、存在する場合、正に荷電したアミノ酸もしくは荷電していないアミノ酸であるか、またはＰｒｏ、Ｇｌｙ、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、およびＡｒｇから選択される。

【0074】

非限定的な例として、挿入ペプチドは、ＬＧＥＴＴＲＰ（配列番号１３）、ＮＥＴＩＴＲＰ（配列番号１４）、ＫＡＧＱＡＮＮ（配列番号１５）、ＫＤＰＫＴＴＮ（配列番号１６）、ＫＤＴＤＴＴＲ（配列番号５７）、ＲＡＧＧＳＶＧ（配列番号５８）、ＡＶＤＴＴＫＦ（配列番号５９）、およびＳＴＧＫＶＰＮ（配列番号６０）から選択されるアミノ酸配列を含み得る。

【0075】

ある場合には、挿入ペプチドは、ＬＧＥＴＴＲＰ（配列番号１３）、ＮＥＴＩＴＲＰ（配列番号１４）、ＫＡＧＱＡＮＮ（配列番号１５）、ＫＤＰＫＴＴＮ（配列番号１６）、ＫＤＴＤＴＴＲ（配列番号５７）、ＲＡＧＧＳＶＧ（配列番号５８）、ＡＶＤＴＴＫＦ（配列番号５９）、およびＳＴＧＫＶＰＮ（配列番号６０）のうちのいずれか１つのアミノ末端および／またはカルボキシル末端で１〜４個のスペーサーアミノ酸（Ｙ_１〜Ｙ_４）を有する。好適なスペーサーアミノ酸は、ロイシン、アラニン、グリシン、セリンを含むが、これらに限定されない。

【0076】

例えば、ある場合には、挿入ペプチドは、以下のアミノ酸配列のうちの１つを有する：ＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号４５）、ＬＡＮＥＴＩＴＲＰＡ（配列番号４６）、ＬＡＫＡＧＱＡＮＮＡ（配列番号４７）、ＬＡＫＤＰＫＴＴＮＡ（配列番号４８）、ＬＡＫＤＴＤＴＴＲＡ（配列番号６１）、ＬＡＲＡＧＧＳＶＧＡ（配列番号６２）、ＬＡＡＶＤＴＴＫＦＡ（配列番号６３）、およびＬＡＳＴＧＫＶＰＮＡ（配列番号６４）。別の例として、ある場合には、挿入ペプチドは、以下のアミノ酸配列のうちの１つを有する：ＡＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号４９）、ＡＡＮＥＴＩＴＲＰＡ（配列番号５０）、ＡＡＫＡＧＱＡＮＮＡ（配列番号５１）、およびＡＡＫＤＰＫＴＴＮＡ（配列番号５２）。さらに別の例として、ある場合には、挿入ペプチドは、以下のアミノ酸配列のうちの１つを有する：ＧＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号５３）、ＧＮＥＴＩＴＲＰＡ（配列番号５４）、ＧＫＡＧＱＡＮＮＡ（配列番号５５）、およびＧＫＤＰＫＴＴＮＡ（配列番号５６）。別の例として、ある場合には、挿入ペプチドは、ＡＡによってＣ末端上に、かつＡによってＮ末端上に隣接されるＫＤＴＤＴＴＲ（配列番号５７）、ＲＡＧＧＳＶＧ（配列番号５８）、ＡＶＤＴＴＫＦ（配列番号５９）、およびＳＴＧＫＶＰＮ（配列番号６０）のうちの１つを含むか、またはＧによってＣ末端上に、かつＡによってＮ末端上に隣接されるＫＤＴＤＴＴＲ（配列番号５７）、ＲＡＧＧＳＶＧ（配列番号５８）、ＡＶＤＴＴＫＦ（配列番号５９）、およびＳＴＧＫＶＰＮ（配列番号６０）のうちの１つを含む。

【0077】

いくつかの実施形態において、主題の変異ＡＡＶキャプシドは、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対するＧＨループまたはループＩＶにおける約５個のアミノ酸〜約１１個のアミノ酸の挿入以外に、任意の他のアミノ酸置換、挿入、または欠失を含んでいない。他の実施形態において、主題の変異体ＡＡＶキャプシドは、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対するＧＨループまたはループＩＶにおける約５個のアミノ酸〜約１１個のアミノ酸の挿入に加えて、親ＡＡＶキャプシドタンパク質と比較して、１〜約２５個のアミノ酸挿入、欠失、または置換を含む。例えば、いくつかの実施形態において、主題の変異体ＡＡＶキャプシドは、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対するＧＨループまたはループＩＶにおける約５個のアミノ酸〜約１１個のアミノ酸の挿入に加えて、親ＡＡＶキャプシドタンパク質と比較して、１〜約５個、約５〜約１０個、約１０〜約１５個、約１５〜約２０個、または約２０〜約２５個のアミノ酸挿入、欠失、または置換を含む。

【0078】

いくつかの実施形態において、主題の変異体キャプシドポリペプチドは、以下のアミノ酸置換のうちの１つ、２つ、３つ、または４つを含まない：Ｙ２７３Ｆ、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、およびＹ７３０Ｆ。

【0079】

いくつかの実施形態において、主題の変異体キャプシドポリペプチドは、上述の挿入ペプチドに加えて、以下のアミノ酸置換のうちの１つ、２つ、３つ、または４つを含む：Ｙ２７３Ｆ、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、およびＹ７３０Ｆ。

【0080】

いくつかの実施形態において、変異体ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、キメラキャプシドであり、例えば、そのキャプシドは、第１のＡＡＶ血清型のＡＡＶキャプシドの一部および第２の血清型のＡＡＶキャプシドの一部を含み、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対するＧＨループまたはループＩＶにおける約５個のアミノ酸〜約１１個のアミノ酸の挿入を含む。

【0081】

いくつかの実施形態において、主題の変異体キャプシドタンパク質は、図５に提供されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、および対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対するＧＨループまたはループＩＶにおける約５個のアミノ酸〜約１１個のアミノ酸の挿入を含む。

【0082】

いくつかの実施形態において、主題の変異体キャプシドタンパク質は、単離される、例えば、精製される。ある場合には、主題の変異体キャプシドタンパク質は、ＡＡＶベクターに含まれ、これも提供される。以下に詳細に説明されるように、主題の変異体キャプシドタンパク質は、組換えＡＡＶビリオンに含まれる。

【0083】

組換えＡＡＶビリオン
本開示は、組換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを提供し、ａ）変異体ＡＡＶキャプシドタンパク質であって、該変異体ＡＡＶキャプシドタンパク質は、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対するキャプシドタンパク質ＧＨループまたはループＩＶにおける挿入部位において約５個のアミノ酸〜約１１個のアミノ酸の挿入を含み、該変異体キャプシドタンパク質は、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染性と比較して、増加した網膜細胞の感染性を付与する、変異体ＡＡＶキャプシドタンパク質、およびｂ）遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む。ある場合には、網膜細胞は、光受容体細胞（例えば、桿体および／または錐体）である。他の場合には、網膜細胞は、ＲＧＣ細胞である。他の場合には、網膜細胞は、ＲＰＥ細胞である。他の場合には、網膜細胞は、ミュラー細胞である。他の場合には、網膜細胞は、アマクリン細胞、双極細胞、および水平細胞を含み得る。「約５個のアミノ酸〜約１１個のアミノ酸の挿入」は、本明細書において、「ペプチド挿入」（例えば、異種ペプチド挿入）とも称される。「対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質」は、ペプチド挿入なしの同一のＡＡＶ血清型のＡＡＶキャプシドタンパク質を指す。

【0084】

挿入部位は、ＡＡＶキャプシドタンパク質のＧＨループまたはループＩＶ、例えば、ＡＡＶキャプシドタンパク質のＧＨループまたはループＩＶの媒接近可能な部分にある。ＧＨループについて、例えば、ｖａｎＶｌｉｅｔｅｔａｌ．（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４：８０９、Ｐａｄｒｏｎｅｔａｌ．（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：５０４７、およびＳｈｅｎｅｔａｌ．（２００７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５：１９５５を参照されたい。例えば、挿入部位は、ＡＡＶ２のアミノ酸５７０〜６１１内、ＡＡＶ１のアミノ酸５７１〜６１２内、ＡＡＶ５のアミノ酸５６０〜６０１内、ＡＡＶ６のアミノ酸５７１〜６１２内、ＡＡＶ７のアミノ酸５７２〜６１３内、ＡＡＶ８のアミノ酸５７３〜６１４内、ＡＡＶ９のアミノ酸５７１〜６１２内、またはＡＡＶ１０のアミノ酸５７３〜６１４内にある。

【0085】

約５個のアミノ酸〜約１１個のアミノ酸は、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対してキャプシドタンパク質のＧＨループまたはループＩＶにおける挿入部位に挿入される。例えば、挿入部位は、ＡＡＶ２のアミノ酸５８７と５８８との間、または別のＡＡＶ血清型のキャプシドサブユニットの対応する位置にあり得る。挿入部位５８７／５８８は、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質に基づくことに留意されたい。約５個のアミノ酸〜約１１個のアミノ酸は、ＡＡＶ２以外（例えば、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９等）のＡＡＶ血清型における対応する部位に挿入され得る。当業者であれば、様々なＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質のアミノ酸配列の比較に基づいて、「ＡＡＶ２のアミノ酸５８７〜５８８に対応する」挿入部位が、任意の所与のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質のどこにあるかを理解するであろう。様々なＡＡＶ血清型のＡＡＶ２のキャプシドタンパク質ＶＰ１のアミノ酸５７０〜６１１に対応する配列（図５を参照のこと）は、図６に示される。

【0086】

いくつかの実施形態において、挿入部位は、任意のＡＡＶ血清型のＶＰ１のアミノ酸５７０〜６１４の間に位置する２つの隣接アミノ酸の間の単一挿入部位であり、例えば、挿入部位は、任意のＡＡＶ血清型または変異体のＶＰ１のアミノ酸５７０〜６１４、アミノ酸５８０〜６００、アミノ酸５７０〜５７５、アミノ酸５７５〜５８０、アミノ酸５８０〜５８５、アミノ酸５８５〜５９０、アミノ酸５９０〜６００、またはアミノ酸６００〜６１０に位置する２つの隣接アミノ酸の間にある。例えば、挿入部位は、アミノ酸５８０と５８１との間、アミノ酸５８１と５８２との間、アミノ酸５８３と５８４との間、アミノ酸５８４と５８５との間、アミノ酸５８５と５８６との間、アミノ酸５８６と５８７との間、アミノ酸５８７と５８８との間、アミノ酸５８８と５８９との間、またはアミノ酸５８９と５９０との間にあり得る。挿入部位は、アミノ酸５７５と５７６との間、アミノ酸５７６と５７７との間、アミノ酸５７７と５７８との間、アミノ酸５７８と５７９との間、またはアミノ酸５７９と５８０との間にあり得る。挿入部位は、アミノ酸５９０と５９１との間、アミノ酸５９１と５９２との間、アミノ酸５９２と５９３との間、アミノ酸５９３と５９４との間、アミノ酸５９４と５９５との間、アミノ酸５９５と５９６との間、アミノ酸５９６と５９７との間、アミノ酸５９７と５９８との間、アミノ酸５９８と５９９との間、またはアミノ酸５９９と６００との間にあり得る。

【0087】

【0088】

挿入ペプチド
上述のように、主題のｒＡＡＶビリオンは、ＡＡＶキャプシドのＧＨループに挿入される約５アミノ酸長〜約１１アミノ酸長のペプチドを含む。挿入ペプチドは、５アミノ酸長、６アミノ酸長、７アミノ酸長、８アミノ酸長、９アミノ酸長、１０アミノ酸長、または１１アミノ酸長である。

【0089】

挿入ペプチドは、以下に説明される式のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含み得る。

【0090】

例えば、挿入ペプチドは、５アミノ酸長〜１１アミノ酸長のペプチドであってもよく、この挿入ペプチドは、以下の式Ｉのものであり、

【0091】

Ｙ_１Ｙ_２Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｙ_３Ｙ_４

【0092】

式中、
Ｙ_１〜Ｙ_４はそれぞれ、存在する場合、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、およびＴｈｒから独立して選択され、
Ｘ_１は、存在する場合、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、およびＬｙｓから選択され、
Ｘ_２は、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、およびＡｓｐから選択され、
Ｘ_３は、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、およびＰｒｏから選択され、
Ｘ_４は、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｇｌｎ、およびＬｙｓから選択され、
Ｘ_５は、ＴｈｒおよびＡｌａから選択され、
Ｘ_６は、Ａｒｇ、Ａｓｎ、およびＴｈｒから選択され、
Ｘ_７は、存在する場合、ＰｒｏおよびＡｓｎから選択される。

【0093】

別の例として、挿入ペプチドは、５アミノ酸長〜１１アミノ酸長のペプチドであってもよく、この挿入ペプチドは、以下の式ＩＩａのものであり、

【0094】

Ｙ_１Ｙ_２Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｙ_３Ｙ_４

【0095】

【0096】

別の例として、挿入ペプチドは、５アミノ酸長〜１１アミノ酸長のペプチドであってもよく、この挿入ペプチドは、以下の式ＩＩｂのものであり、

【0097】

Ｙ_１Ｙ_２Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｙ_３Ｙ_４

【0098】

【0099】

別の例として、挿入ペプチドは、５アミノ酸長〜１１アミノ酸長のペプチドであってもよく、この挿入ペプチドは、以下の式ＩＩＩのものであり、

【0100】

Ｙ_１Ｙ_２Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｙ_３Ｙ_４

【0101】

式中、
Ｙ_１〜Ｙ_４はそれぞれ、存在する場合、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、およびＴｈｒから独立して選択され、
Ｘ_１は、存在する場合、Ｌｙｓであり、
Ｘ_２は、ＡｌａおよびＡｓｐから選択され、
Ｘ_３は、存在する場合、ＧｌｙおよびＰｒｏから選択され、
Ｘ_４は、ＧｌｎおよびＬｙｓから選択され、
Ｘ_５は、ＴｈｒおよびＡｌａから選択され、
Ｘ_６は、ＡｓｎおよびＴｈｒから選択され、
Ｘ_７は、存在する場合、Ａｓｎである。

【0102】

別の例として、挿入ペプチドは、５アミノ酸長〜１１アミノ酸長のペプチドであってもよく、この挿入ペプチドは、以下の式ＩＶのものであり、

【0103】

Ｙ_１Ｙ_２Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｙ_３Ｙ_４

【0104】

式中、
Ｙ_１〜Ｙ_４はそれぞれ、存在する場合、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、およびＴｈｒから独立して選択され、
Ｘ_１は、存在する場合、正に荷電したアミノ酸もしくは荷電していないアミノ酸であるか、またはＬｅｕ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、およびＬｙｓから選択され、
Ｘ_２は、負に荷電したアミノ酸もしくは荷電していないアミノ酸であるか、またはＧｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、およびＡｓｐから選択され、
Ｘ_３は、負に荷電したアミノ酸もしくは荷電していないアミノ酸であるか、またはＧｌｕ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、もしくはＰｒｏから選択され、
Ｘ_４は、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、およびＧｌｎから選択され、
Ｘ_５は、極性アミノ酸、アルコール（遊離ヒドロキシル基を有するアミノ酸）、または疎水性アミノ酸であるか、または、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、およびＡｌａから選択され、
Ｘ_６は、正に荷電したアミノ酸もしくは荷電していないアミノ酸であるか、またはＡｒｇ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、およびＡｓｎから選択され、
Ｘ_７は、存在する場合、正に荷電したアミノ酸もしくは荷電していないアミノ酸であるか、またはＰｒｏ、Ｇｌｙ、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、およびＡｒｇから選択される。

【0105】

【0106】

ある場合には、挿入ペプチドは、ＬＧＥＴＴＲＰ（配列番号１３）、ＮＥＴＩＴＲＰ（配列番号１４）、ＫＡＧＱＡＮＮ（配列番号１５）、ＫＤＰＫＴＴＮ（配列番号１６）、ＫＤＴＤＴＴＲ（配列番号５７）、ＲＡＧＧＳＶＧ（配列番号５８）、ＡＶＤＴＴＫＦ（配列番号５９）、およびＳＴＧＫＶＰＮ（配列番号６０）のうちのいずれか１つのアミノ末端および／またはカルボキシル末端に１〜４個のスペーサーアミノ酸（Ｙ_１〜Ｙ_４）を有する。好適なスペーサーアミノ酸は、ロイシン、アラニン、グリシン、セリンを含むが、これらに限定されない。

【0107】

【0108】

いくつかの実施形態において、主題のｒＡＡＶビリオンキャプシドは、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対するＧＨループまたはループＩＶにおける約７個のアミノ酸〜約１０個のアミノ酸の挿入以外に、任意の他のアミノ酸置換、挿入、または欠失を含んでいない。他の実施形態において、主題のｒＡＡＶビリオンキャプシドは、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対するＧＨループまたはループＩＶにおける約７個のアミノ酸〜約１０個のアミノ酸の挿入に加えて、親ＡＡＶキャプシドタンパク質と比較して１〜約２５個のアミノ酸挿入、欠失、または置換を含む。例えば、いくつかの実施形態において、主題のｒＡＡＶビリオンキャプシドは、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対するＧＨループまたはループＩＶにおける約７個のアミノ酸〜約１０個のアミノ酸の挿入に加えて、親ＡＡＶキャプシドタンパク質と比較して１〜約５個、約５〜約１０個、約１０〜約１５個、約１５〜約２０個、もしくは約２０〜約２５個のアミノ酸挿入、欠失、または置換を含む。

【0109】

いくつかの実施形態において、主題のｒＡＡＶビリオンキャプシドは、以下のアミノ酸置換のうちの１つ、２つ、３つ、または４つを含まない：Ｙ２７３Ｆ、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、およびＹ７３０Ｆ。

【0110】

【0111】

いくつかの実施形態において、主題のｒＡＡＶビリオンキャプシドは、キメラキャプシドであり、例えば、そのキャプシドは、第１のＡＡＶ血清型のＡＡＶキャプシドの一部および第２の血清型のＡＡＶキャプシドの一部を含み、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対するＧＨループまたはループＩＶにおける約５個のアミノ酸〜約１１個のアミノ酸の挿入を含む。

【0112】

いくつかの実施形態において、主題のｒＡＡＶビリオンは、図５に提供されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、および対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対するＧＨループまたはループＩＶにおける約５個のアミノ酸〜約１１個のアミノ酸の挿入を含むキャプシドタンパク質を含む。

【0113】

いくつかの実施形態において、主題のｒＡＡＶビリオンは、図１８Ａ〜Ｃに記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＧＨループを含むキャプシドタンパク質を含む。

【0114】

主題のｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染性と比較して、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上増加した網膜細胞の感染性を呈する。

【0115】

ある場合には、主題のｒＡＡＶビリオンは、硝子体内注入を介して投与されるときに、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染性と比較して、硝子体内注入を介して投与されるときに、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上増加した網膜細胞の感染性を呈する。

【0116】

いくつかの実施形態において、主題のｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる光受容体細胞の感染性と比較して、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上の光受容体（桿体または錐体）細胞の感染性の増加を呈する。

【0117】

いくつかの実施形態において、主題のｒＡＡＶビリオンは、硝子体内注入を介して投与されるときに、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる光受容体細胞の感染性と比較して、硝子体内注入を介して投与されるときに、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上の光受容体（桿体または錐体）細胞の感染性の増加を呈する。

【0118】

いくつかの実施形態において、主題のｒＡＡＶビリオンは、硝子体内注入を介して投与されるときに、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによるＲＧＣの感染性と比較して、硝子体内注入を介して投与されるときに、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上のＲＧＣの感染性の増加を呈する。

【0119】

【0120】

いくつかの実施形態において、主題のｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによるＲＰＥ細胞の感染性と比較して、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上のＲＰＥ細胞の感染性の増加を呈する。

【0121】

いくつかの実施形態において、主題のｒＡＡＶビリオンは、硝子体内注入を介して投与されるときに、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによるＲＰＥ細胞の感染性と比較して、硝子体内注入を介して投与されるときに、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上のＲＰＥ細胞の感染性の増加を呈する。

【0122】

いくつかの実施形態において、主題のｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによるミュラー細胞の感染性と比較して、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上のミュラー細胞の感染性の増加を呈する。

【0123】

いくつかの実施形態において、主題のｒＡＡＶビリオンは、硝子体内注入を介して投与されるときに、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによるミュラー細胞の感染性と比較して、硝子体内注入を介して投与されるときに、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上のミュラー細胞の感染性の増加を呈する。

【0124】

いくつかの実施形態において、主題のｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる双極細胞の感染性と比較して、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上の双極細胞の感染性の増加を呈する。

【0125】

いくつかの実施形態において、主題のｒＡＡＶビリオンは、硝子体内注入を介して投与されるときに、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる双極細胞の感染性と比較して、硝子体内注入を介して投与されるときに、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上の双極細胞の感染性の増加を呈する。

【0126】

いくつかの実施形態において、主題のｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによるアマクリン細胞の感染性と比較して、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上のアマクリン細胞の感染性の増加を呈する。

【0127】

いくつかの実施形態において、主題のｒＡＡＶビリオンは、硝子体内注入を介して投与されるときに、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによるアマクリン細胞の感染性と比較して、硝子体内注入を介して投与されるときに、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上のアマクリン細胞の感染性の増加を呈する。

【0128】

いくつかの実施形態において、主題のｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる水平細胞の感染性と比較して、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上の水平細胞の感染性の増加を呈する。

【0129】

いくつかの実施形態において、主題のｒＡＡＶビリオンは、硝子体内注入を介して投与されるときに、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる水平細胞の感染性と比較して、硝子体内注入を介して投与されるときに、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上の水平細胞の感染性の増加を呈する。

【0130】

ある場合には、主題のｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンのＩＬＭを通過する能力と比較して、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上の内境界膜（ＩＬＭ）を通過する能力の増加を呈する。

【0131】

ある場合には、主題のｒＡＡＶビリオンは、硝子体内注入を介して投与されるときに、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンのＩＬＭを通過する能力と比較して、硝子体内注入を介して投与されるときに、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍以上の内境界膜（ＩＬＭ）を通過する能力の増加を呈する。

【0132】

主題のｒＡＡＶビリオンは、ＩＬＭを通過することができ、ミュラー細胞、アマクリン細胞等を含む細胞層を横断して、光受容体細胞および／またはＲＰＥ細胞に到達することもできる。例えば、主題のｒＡＡＶビリオンは、硝子体内注入を介して投与されるときに、ＩＬＭを通過することができ、ミュラー細胞、アマクリン細胞等を含む細胞層を横断して、光受容体細胞および／またはＲＰＥ細胞に到達することもできる。

【0133】

いくつかの実施形態において、主題のｒＡＡＶビリオンは、網膜細胞を選択的に感染させ、例えば、主題のｒＡＡＶビリオンは、非網膜細胞、例えば、眼の外側の細胞よりも１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、５０倍、または５０倍以上の特異性で網膜細胞を感染させる。例えば、いくつかの実施形態において、主題のｒＡＡＶビリオンは、網膜細胞を選択的に感染させ、例えば、主題のｒＡＡＶビリオンは、非網膜細胞、例えば、眼の外側の細胞よりも１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、５０倍、または５０倍以上の特異性で光受容体細胞を感染させる。

【0134】

いくつかの実施形態において、主題のｒＡＡＶビリオンは、光受容体細胞を選択的に感染させ、例えば、主題のｒＡＡＶビリオンは、眼内に存在する非光受容体細胞、例えば、網膜神経節細胞、ミュラー細胞等よりも１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、５０倍、または５０倍以上の特異性で光受容体細胞を感染させる。

【0135】

【0136】

遺伝子産物
主題のｒＡＡＶビリオンは、遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む。いくつかの実施形態において、遺伝子産物は、干渉ＲＮＡである。いくつかの実施形態において、遺伝子産物は、アプタマーである。いくつかの実施形態において、遺伝子産物は、ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、遺伝子産物は、遺伝子機能の部位特異的ノックダウンをもたらす部位特異的ヌクレアーゼである。

【0137】

干渉ＲＮＡ
遺伝子産物が干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）である場合、好適なＲＮＡｉは、細胞中のアポトーシス因子または血管新生因子のレベルを低下させるＲＮＡｉである。例えば、ＲＮＡｉは、細胞におけるアポトーシスを誘導または促進する遺伝子産物のレベルを低減させるｓｈＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡであり得る。遺伝子であって、その遺伝子産物がアポトーシスを誘導または促進する遺伝子は、本明細書で「プロアポトーシス遺伝子」と称され、それらの遺伝子の産物（ｍＲＮＡ、タンパク質）は、「プロアポトーシス遺伝子産物」と称される。プロアポトーシス遺伝子産物は、例えば、Ｂａｘ、Ｂｉｄ、Ｂａｋ、およびＢａｄ遺伝子産物を含む。例えば、米国特許第７，８４６，７３０号を参照されたい。

【0138】

干渉ＲＮＡは、血管新生産物、例えば、ＶＥＧＦ（例えば、Ｃａｎｄ５、例えば、米国特許公開第２０１１／０１４３４００号、米国特許公開第２００８／０１８８４３７号、およびＲｅｉｃｈｅｔａｌ．（２００３）Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．９：２１０を参照のこと）、ＶＥＧＦＲｌ（例えば、Ｓｉｒｎａ−０２７、例えば、Ｋａｉｓｅｒｅｔａｌ．（２０１０）Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１５０：３３、およびＳｈｅｎｅｔａｌ．（２００６）ＧｅｎｅＴｈｅｒ．１３：２２５を参照のこと）、またはＶＥＧＦＲ２（Ｋｏｕｅｔａｌ．（２００５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．４４：１５０６４）にも対抗し得る。米国特許第６，６４９，５９６号、同第６，３９９，５８６号、同第５，６６１，１３５号、同第５，６３９，８７２号、および同第５，６３９，７３６号、ならびに米国特許第７，９４７，６５９号および同７，９１９，４７３号も参照されたい。

【0139】

アプタマー
遺伝子産物がアプタマーである場合、目的とする例示のアプタマーは、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）に対するアプタマーを含む。例えば、Ｎｇｅｔａｌ．（２００６）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．ＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖｅｒｙ５：１２３、およびＬｅｅｅｔａｌ．（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０２：１８９０２を参照されたい。例えば、ＶＥＧＦアプタマーは、ヌクレオチド配列５’−ｃｇｃａａｕｃａｇｕｇａａｕｇｃｕｕａｕａｃａｕｃｃｇ−３’（配列番号１７）を含み得る。ＰＤＧＦ特異的アプタマー、例えば、Ｅ１００３０も使用に好適であり、例えば、ＮｉａｎｄＨｕｉ（２００９）Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｉｃａ２２３：４０１、およびＡｋｉｙａｍａｅｔａｌ．（２００６）Ｊ．ＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ．２０７：４０７）を参照されたい。

【0140】

ポリペプチド
遺伝子産物がポリペプチドである場合、ポリペプチドは、概して、網膜細胞の機能、例えば、桿体もしくは錐体光受容体細胞、網膜神経節細胞、ミュラー細胞、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞、網膜色素上皮細胞の機能を高めるポリペプチドである。例示のポリペプチドは、神経保護ポリペプチド（例えば、ＧＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＴ４、ＮＧＦ、およびＮＴＮ）、抗血管新生ポリペプチド（例えば、可溶性血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）受容体、ＶＥＧＦ結合抗体、ＶＥＧＦ結合抗体断片（例えば、一本鎖抗ＶＥＧＦ抗体）、エンドスタチン、タムスタチン、アンギオスタチン、可溶性Ｆｌｔポリペプチド（Ｌａｉｅｔａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１２：６５９）、可溶性Ｆｌｔポリペプチドを含むＦｃ融合タンパク質（例えば、Ｐｅｃｈａｎｅｔａｌ．（２００９）ＧｅｎｅＴｈｅｒ．１６：１０を参照のこと）、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、可溶性Ｔｉｅ−２受容体等）、メタロプロテイナーゼ−３（ＴＩＭＰ−３）の組織阻害剤、光応答性オプシン、例えば、ロドプシン、抗アポトーシスポリペプチド（例えば、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−Ｘｌ）等を含む。好適なポリペプチドには、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、線維芽細胞増殖因子２、ニュールツリン（ＮＴＮ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−４（ＮＴ４）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ、例えば、図１１に示されるアミノ酸配列（配列番号１１）の一続きの約２００個のアミノ酸〜２４７個のアミノ酸に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド）、上皮成長因子、ロドプシン、アポトーシスのＸ結合阻害剤、およびソニックヘッジホッグが含まれるが、これらに限定されない。

【0141】

好適な光応答性オプシンには、米国特許公開第２００７／０２６１１２７号（例えば、ＣｈＲ２、Ｃｈｏｐ２）、米国特許公開第２００１／００８６４２１号、米国特許公開第２０１０／００１５０９５号、およびＤｉｅｓｔｅｒｅｔａｌ．（２０１１）Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１４：３８７に記載される、例えば、光応答性オプシンが含まれる。

【0142】

好適なポリペプチドには、レチノスキシン（例えば、図１０に示されるアミノ酸配列（配列番号１０）の一続きの約２００個のアミノ酸〜２２４個のアミノ酸に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド）も含まれる。好適なポリペプチドには、例えば、網膜色素変性ＧＴＰａｓｅ調節因子（ＲＧＰＲ）相互作用タンパク質−１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｑ９６ＫＮ７、Ｑ９ＥＰＱ２、およびＱ９ＧＬＭ３を参照のこと）（例えば、図１６に示されるアミノ酸配列（配列番号２１）の一続きの約１１５０個のアミノ酸〜約１２００個のアミノ酸、または約１２００個のアミノ酸〜１２８６個のアミノ酸に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；ペリフェリン−２（Ｐｒｐｈ２）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００３１３を参照のこと）（例えば、図１４に示されるアミノ酸配列（配列番号１９）の一続きの約３００個のアミノ酸〜３４６個のアミノ酸に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；ならびにＴｒａｖｉｓｅｔａｌ．（１９９１）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ１０：７３３）；ペリフェリン（例えば、図１５に示されるアミノ酸配列（配列番号２０）の一続きの約４００個のアミノ酸〜約４７０個のアミノ酸に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；網膜色素上皮特異的タンパク質（ＲＰＥ６５）（例えば、図１２に示されるアミノ酸配列（配列番号１２）の一続きの約２００個のアミノ酸〜２４７個のアミノ酸に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋＡＡＣ３９６６０、およびＭｏｒｉｍｕｒａｅｔａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：３０８８を参照のこと）等が含まれる。

【0143】

好適なポリペプチドには、欠陥があるか、または欠損しているときに先天性脈絡膜欠如を引き起こすポリペプチドである、ＣＨＭ（先天性脈絡膜欠如（Ｒａｂエスコートタンパク質１））（例えば、Ｄｏｎｎｅｌｌｙｅｔａｌ．（１９９４）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．３：１０１７、およびｖａｎＢｏｋｈｏｖｅｎｅｔａｌ．（１９９４）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．３：１０４１を参照のこと）、ならびに欠陥があるか、または欠損しているときにレーバー先天黒内障および網膜色素変性症を引き起こすポリペプチドである、クラムスホモログ１（ＣＲＢ１）（例えば、ｄｅｎＨｏｌｌａｎｄｅｒｅｔａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２３：２１７、およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＭ２３３２８を参照のこと）も含まれる。

【0144】

好適なポリペプチドには、欠陥があるか、または欠損しているときに色覚異常をもたらすポリペプチドも含まれ、このようなポリペプチドには、例えば、錐体光受容体ｃＧＭＰゲートチャネルサブユニットα（ＣＮＧＡ３）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１２８９、およびＢｏｏｉｊｅｔａｌ．（２０１１）Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ１１８：１６０−１６７を参照のこと）、錐体光受容体ゲートカチオンチャネルβサブユニット（ＣＮＧＢ３）（例えば、Ｋｏｈｌｅｔａｌ．（２００５）ＥｕｒＪＨｕｍＧｅｎｅｔ．１３（３）：３０２を参照のこと）、グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）、α形質導入活性ポリペプチド２（ＧＮＡＴ２）（ＡＣＨＭ４）、およびＡＣＨＭ５、ならびに欠陥があるか、または欠損しているときに様々な形態の色覚異常をもたらすポリペプチド（例えば、Ｌ−オプシン、Ｍ−オプシン、およびＳ−オプシン）が含まれる。Ｍａｎｃｕｓｏｅｔａｌ．（２００９）Ｎａｔｕｒｅ４６１（７２６５）：７８４−７８７を参照されたい。

【0145】

部位特異的エンドヌクレアーゼ
ある場合には、目的とする遺伝子産物は、例えば、エンドヌクレアーゼが網膜疾患に関連する対立遺伝子をノックアウトする場合、遺伝子機能の部位特異的ノックダウンをもたらす部位特異的エンドヌクレアーゼである。例えば、優性対立遺伝子が、網膜構造タンパク質であり、かつ／または正常な網膜機能を提供する遺伝子（野生型の場合）の欠陥のあるコピーをコードする場合、部位特異的エンドヌクレアーゼは、欠陥のある対立遺伝子を標的とし、かつその欠陥のある対立遺伝子をノックアウトすることができる。

【0146】

欠陥のある対立遺伝子をノックアウトすることに加えて、部位特異的ヌクレアーゼを用いて、その欠陥のある対立遺伝子によってコードされるタンパク質の機能的コピーをコードするドナーＤＮＡで相同組換えを刺激することもできる。したがって、例えば、主題のｒＡＡＶビリオンを用いて、欠陥のある対立遺伝子をノックアウトする部位特異的エンドヌクレアーゼを送達することができ、その欠陥のある対立遺伝子の機能的コピーも送達することができ、その欠陥のある対立遺伝子の修復をもたらし、それによって、機能的網膜タンパク質（例えば、機能的レチノスキシン、機能的ＲＰＥ６５、機能的ペリフェリン等）の産生をもたらす。例えば、Ｌｉｅｔａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ４７５：２１７を参照されたい。いくつかの実施形態において、主題のｒＡＡＶビリオンは、部位特異的エンドヌクレアーゼをコードする異種ヌクレオチド配列、および欠陥のある対立遺伝子の機能的コピーをコードする異種ヌクレオチド配列を含み、この機能的コピーは、機能的網膜タンパク質をコードする。機能的網膜タンパク質は、例えば、レチノスキシン、ＲＰＥ６５、網膜色素変性ＧＴＰａｓｅ調節因子（ＲＧＰＲ）相互作用タンパク質−１、ペリフェリン、ペリフェリン−２等を含む。

【0147】

使用に好適な部位特異的エンドヌクレアーゼには、例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）が含まれ、そのような部位特異的エンドヌクレアーゼは、天然に存在せず、特定の遺伝子を標的化するように修飾される。そのような部位特異的エンドヌクレアーゼを操作して、ゲノム内の特定の位置を切断することができ、その後、非相同末端結合は、いくつかのヌクレオチドを挿入または欠失しながらその破損を修復することができる。その後、そのような部位特異的エンドヌクレアーゼ（「ＩＮＤＥＬ」とも称される）は、タンパク質を骨組みから追放し、遺伝子を効果的にノックアウトする。例えば、米国特許公開第２０１１／０３０１０７３号を参照されたい。

【0148】

調節配列
いくつかの実施形態において、目的とする遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーターに動作可能に結合される。他の実施形態において、目的とする遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーターに動作可能に結合される。ある場合には、目的とする遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、組織特異的または細胞型特異的調節因子に動作可能に結合される。例えば、ある場合には、目的とする遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、光受容体特異的調節因子（例えば、光受容体特異的プロモーター）、例えば、光受容体細胞における動作可能に結合された遺伝子の選択的発現をもたらす調節因子に動作可能に結合される。好適な光受容体特異的調節因子には、例えば、ロドプシンプロモーター、ロドプシンキナーゼプロモーター（Ｙｏｕｎｇｅｔａｌ．（２００３）Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４４：４０７６）、βホスホジエステラーゼ遺伝子プロモーター（Ｎｉｃｏｕｄｅｔａｌ．（２００７）Ｊ．ＧｅｎｅＭｅｄ．９：１０１５）、網膜色素変性遺伝子プロモーター（Ｎｉｃｏｕｄｅｔａｌ．（２００７）上記参照）光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）遺伝子エンハンサー（Ｎｉｃｏｕｄｅｔａｌ．（２００７）上記参照）、ＩＲＢＰ遺伝子プロモーター（Ｙｏｋｏｙａｍａｅｔａｌ．（１９９２）ＥｘｐＥｙｅＲｅｓ．５５：２２５）が含まれる。

【0149】

薬学的組成物
本開示は、ａ）上述の主題のｒＡＡＶビリオン、およびｂ）薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、または緩衝液を含む薬学的組成物を提供する。いくつかの実施形態において、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、または緩衝液は、ヒトにおける使用に好適である。

【0150】

そのような賦形剤、担体、希釈剤、および緩衝液は、過度の毒性を伴うことなく投与することができる任意の薬学的作用物質を含む。薬学的に許容される賦形剤には、水、生理食塩水、グリセロール、およびエタノール等の液体を含むが、これらに限定されない。薬学的に許容される塩、例えば、塩酸塩、水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩等の鉱酸塩、および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩等の有機酸塩をその中に含んでもよい。さらに、湿潤剤または乳化剤等の補助剤、ｐＨ緩衝物質等は、そのようなビヒクルに存在し得る。多種多様の薬学的に許容される賦形剤が当技術分野で既知であり、本明細書で詳細に説明される必要はない。薬学的に許容される賦形剤は、様々な出版物、例えば、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，”２０ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＤｏｓａｇｅＦｏｒｍｓａｎｄＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＳｙｓｔｅｍｓ（１９９９）Ｈ．Ｃ．Ａｎｓｅｌｅｔａｌ．，ｅｄｓ．，７^ｔｈｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、およびＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＥｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（２０００）Ａ．Ｈ．Ｋｉｂｂｅｅｔａｌ．，ｅｄｓ．，３ｒｄｅｄ．Ａｍｅｒ．ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＡｓｓｏｃ．において十分に説明されている。

【0151】

遺伝子産物を網膜細胞に送達する方法および治療方法
本開示は、遺伝子産物を個体の網膜細胞に送達する方法を提供し、該方法は、個体に、上述の主題のｒＡＡＶビリオンを投与することを含む。この遺伝子産物は、上に記載されるように、ポリペプチドもしくは干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ等）、アプタマー、または、部位特異的エンドヌクレアーゼであり得る。遺伝子産物を網膜細胞に送達することで、網膜疾患の治療をもたらし得る。網膜細胞は、光受容体、網膜神経節細胞、ミュラー細胞、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞、網膜色素上皮細胞であり得る。ある場合には、網膜細胞は、光受容体細胞、例えば、桿体または錐体細胞である。

【0152】

本開示は、網膜疾患を治療する方法を提供し、該方法は、それを必要とする個体に、有効な量の上述の主題のｒＡＡＶビリオンを投与することを含む。主題のｒＡＡＶビリオンを、眼内注入を介して、硝子体内注入によって、または任意の他の好都合な投与モードもしくは経路によって投与することができる。他の好都合な投与モードまたは経路には、例えば、静脈内、鼻腔内等が含まれる。

【0153】

「治療的に有効な量」は、実験および／または臨床試験を通じて決定され得る比較的広い範囲に入る。例えば、生体内注入の場合、すなわち、眼内への直接注入の場合、治療的に有効な用量は、約１０^６〜約１０^１５のｒＡＡＶビリオン、例えば、約１０^８〜１０^１２のｒＡＡＶビリオンである。生体外での形質導入の場合、細胞に送達されるべき有効な量のｒＡＡＶビリオンは、約１０^８〜約１０^１３のｒＡＡＶビリオンである。他の有効な投与量は、用量反応曲線を確立する日常的な試験を通じて、当業者によって容易に確立され得る。

【0154】

いくつかの実施形態において、２回以上の投与（例えば、２回、３回、４回、またはそれ以上の投与）を用いて、例えば、１日１回、週１回、月１回、年１回等の様々な間隔にわたって所望のレベルの遺伝子発現を達成することができる。

【0155】

主題の方法を用いて治療することのできる眼疾患には、急性黄斑視神経網膜症；ベーチェット病；脈絡膜血管新生；糖尿病性ブドウ膜炎；ヒストプラスマ症；黄斑変性症、例えば、急性黄斑変性症、加齢に関連した非滲出性黄斑変性症、および加齢に関連した滲出性黄斑変性症；浮腫、例えば黄斑浮腫、類嚢胞黄斑浮腫、および糖尿病性黄斑浮腫；多巣性脈絡膜炎；後眼部位または位置に影響を及ぼす眼外傷；眼腫瘍；網膜障害、例えば、網膜中心静脈閉塞症、糖尿病性網膜症（増殖性糖尿病網膜症を含む）、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、網膜動脈閉塞性疾患、網膜剥離、ブドウ膜炎網膜疾患；交感性眼炎；フォークト・小柳・原田（ＶＫＨ）症候群；ブドウ膜拡散；眼レーザー治療によって引き起こされるか、または影響を受ける後眼疾患；光線力学療法によって引き起こされるか、または影響を受ける後眼疾患；光凝固；放射線網膜症；網膜上膜障害；網膜静脈分枝閉塞症；前部虚血性視神経症；非網膜症糖尿病性網膜機能不全；網膜分離症；網膜色素変性症；緑内障；アッシャー症候群；錐体桿体ジストロフィ；シュタルガルト病（黄色斑眼底）；遺伝性黄斑変性症；脈絡網膜変性；レーバー先天性黒内障；先天性固定夜盲症；先天性脈絡膜欠如；バルデー・ビードル症候群；黄斑毛細血管拡張症；レーベル遺伝性視神経症；未熟児網膜症；ならびに色覚異常、赤色覚異常、緑色覚異常、および第三色覚異常を含む色覚障害が含まれるが、これらに限定されない。

【0156】

核酸および宿主細胞
本開示は、上述の主題の変異体アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸を提供し、この変異体ＡＡＶキャプシドタンパク質は、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対するそのＧＨループまたはループＩＶにおける約５個のアミノ酸〜約１１個のアミノ酸挿入を含み、変異体キャプシドタンパク質は、ＡＡＶビリオンに存在するとき、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染性と比較して、増加した網膜細胞の感染性をもたらす。主題の単離核酸は、ＡＡＶベクター、例えば、組換えＡＡＶベクターであり得る。

【0157】

挿入ペプチド
主題の核酸によってコードされる変異体ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶキャプシドのＧＨループに挿入される約５アミノ酸長〜約１１アミノ酸長の挿入ペプチドを有する。挿入ペプチドは、５アミノ酸長、６アミノ酸長、７アミノ酸長、８アミノ酸長、９アミノ酸長、１０アミノ酸長、または１１アミノ酸長である。

【0158】

挿入ペプチドは、以下の式のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含み得る。

【0159】

例えば、挿入ペプチドは、５〜１１アミノ酸長のペプチドであってもよく、この挿入ペプチドは、以下の式Ｉのものであり、

【0160】

Ｙ_１Ｙ_２Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｙ_３Ｙ_４

【0161】

【0162】

例えば、挿入ペプチドは、５〜１１アミノ酸長のペプチドであってもよく、この挿入ペプチドは、以下の式ＩＩａのものであり、

【0163】

Ｙ_１Ｙ_２Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｙ_３Ｙ_４

【0164】

式中、
Ｙ_１〜Ｙ_４はそれぞれ、存在する場合、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、およびＴｈｒから独立して選択され、
Ｘ_１〜Ｘ_４はそれぞれ、アミノ酸であり、
Ｘ_５は、Ｔｈｒであり、
Ｘ_６は、Ａｒｇであり、
Ｘ_７は、Ｐｒｏである。

【0165】

別の例として、挿入ペプチドは、５〜１１アミノ酸長のペプチドであってもよく、この挿入ペプチドは、以下の式ＩＩｂのものであり、

【0166】

Ｙ_１Ｙ_２Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｙ_３Ｙ_４

【0167】

【0168】

別の例として、挿入ペプチドは、５〜１１アミノ酸長のペプチドであってもよく、この挿入ペプチドは、以下の式ＩＩＩのものであり、

【0169】

Ｙ_１Ｙ_２Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｙ_３Ｙ_４

【0170】

【0171】

別の例として、挿入ペプチドは、５〜１１アミノ酸長のペプチドであってもよく、この挿入ペプチドは、以下の式ＩＶのものであり、

【0172】

Ｙ_１Ｙ_２Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｙ_３Ｙ_４

【0173】

【0174】

【0175】

ある場合には、挿入ペプチドは、ＬＧＥＴＴＲＰ（配列番号１３）、ＮＥＴＩＴＲＰ（配列番号１４）、ＫＡＧＱＡＮＮ（配列番号１５）、ＫＤＰＫＴＴＮ（配列番号１６）、ＫＤＴＤＴＴＲ（配列番号５７）、ＲＡＧＧＳＶＧ（配列番号５８）、ＡＶＤＴＴＫＦ（配列番号５９）、およびＳＴＧＫＶＰＮ（配列番号６０）のうちのいずれか１つのアミノ末端および／またカルボキシル末端で１〜４個のスペーサーアミノ酸（Ｙ_１〜Ｙ_４）を有する。好適なスペーサーアミノ酸は、ロイシン、アラニン、グリシン、セリンを含むが、これらに限定されない。

【0176】

【0177】

主題の組換えＡＡＶベクターを用いて、上述の主題の組換えＡＡＶビリオンを生成することができる。したがって、本開示は、好適な細胞に導入されるときに、主題の組換えＡＡＶビリオンの産生をもたらし得る組換えＡＡＶベクターを提供する。

【0178】

本発明は、主題の核酸を含む宿主細胞、例えば、単離された（遺伝子修飾された）宿主細胞をさらに提供する。主題の宿主細胞は、単離細胞、例えば、生体外培養物中の細胞であり得る。主題の宿主細胞は、以下に記載の主題のｒＡＡＶビリオンの産生に有用である。主題の宿主細胞を用いて主題のｒＡＡＶビリオンを生成する場合、「パッケージング細胞」と称される。いくつかの実施形態において、主題の宿主細胞は、主題の核酸で安定的に遺伝子修飾される。他の実施形態において、主題の宿主細胞は、主題の核酸で一時的に遺伝子修飾される。

【0179】

主題の核酸は、電気穿孔法、リン酸カルシウム沈殿、リポソーム媒介トランスフェクション等を含むが、これらに限定されない確立された技法を用いて、安定的または一時的に宿主細胞に導入される。安定的な変換の場合、主題の核酸は、概して、選択可能なマーカー、例えば、ネオマイシン耐性等のいくつかの周知の選択可能なマーカーのうちのいずれかをさらに含む。

【0180】

主題の宿主細胞は、主題の核酸を様々な細胞、例えば、例えば、マウス細胞および霊長類細胞（例えば、ヒト細胞）を含む哺乳類細胞のうちのいずれかに導入することによって生成される。好適な哺乳類細胞には、初代細胞および細胞株が含まれるが、これらに限定されず、好適な細胞株には、２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、３Ｔ３マウス線維芽細胞、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２線維芽細胞、ＣＨＯ細胞等が含まれるが、これらに限定されない。好適な宿主細胞の非限定的な例には、例えば、ＨｅＬａ細胞（例えば、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）番号ＣＣＬ−２）、ＣＨＯ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ９６１８、ＣＣＬ６１、ＣＲＬ９０９６）、２９３細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５７３）、Ｖｅｒｏ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１６５８）、Ｈｕｈ−７細胞、ＢＨＫ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ１０）、ＰＣ１２細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１７２１）、ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５１）、ＲＡＴ１細胞、マウスＬ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬＩ．３）、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）、ＨＬＨｅｐＧ２細胞等が挙げられる。主題の宿主細胞を、ＡＡＶを産生するＳｆ９細胞等の昆虫細胞を感染させるバキュロウイルスを用いて作成することができる（例えば、米国特許第７，２７１，００２号、米国特許出願第１２／２９７，９５８号を参照されたい）。

【0181】

いくつかの実施形態において、主題の遺伝子修飾宿主細胞は、上述の変異体ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸に加えて、１つ以上のＡＡＶｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む。他の実施形態において、主題の宿主細胞は、ｒＡＡＶベクターをさらに含む。ｒＡＡＶビリオンを主題の宿主細胞を用いて生成することができる。ｒＡＡＶビリオンを生成する方法は、米国特許公開第２００５／００５３９２２号および米国特許公開第２００９／０２０２４９０号に記載されている。

【実施例】

【0182】

以下の実施例は、当業者に本発明をどのように作製および使用するかの完全なる開示および説明を提供するように提示され、本発明者が自身の発明とみなすものの範囲を限定するようには意図されておらず、以下の実験が全てまたは唯一の実行される実験であると示すようにも意図されていない。使用される数値（例えば、量、温度等）に対する正確さを確保する努力がなされているが、いくつかの実験によるエラーおよび偏差が計上されるはずである。別途示されない限り、部は、重量部であり、分子量は、重量平均分子量であり、温度は、摂氏温度であり、圧力は、大気圧であるか、またはそれに近い。例えば、ｂｐは塩基対（複数を含む）、ｋｂはキロベース（複数を含む）、ｐｌはピコリットル（複数を含む）、ｓまたはｓｅｃは秒（複数を含む）、ｍｉｎは分（複数を含む）、ｈまたはｈｒは時間（複数を含む）、ａａはアミノ酸（複数を含む）、ｋｂはキロベース（複数を含む）、ｂｐは塩基対（複数を含む）、ｎｔはヌクレオチド（複数を含む）、ｉ．ｍ．は筋肉内の（に）、ｉ．ｐ．は腹腔内の（に）、ｓ．ｃは皮下の（に）等の標準的な略語を使用してもよい。

【0183】

実施例１
網膜細胞の形質導入が改善されたＡＡＶ変異体
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）突然変異誘発により、一意のＡｖｒＩＩ部位をアミノ酸５８７と５８８との間の野生型ＡＡＶ２ゲノムに導入することによってペプチド表示ライブラリを作製する手段を用いた。アンチセンスプライマー７ｍｅｒＲｅｖに加えて、ランダム２１ヌクレオチド挿入物７ｍｅｒＦｏｒを用いて、ｄｓＤＮＡ挿入物を合成した。結果として生じたｄｓＤＮＡ挿入物を、ＮｈｅＩでの消化後にゲノムのＡｖｒＩＩ部位にクローニングし、様々な７ｍｅｒ表示ライブラリを産生し、その後、これをパッケージングした（Ｐｅｒａｂｏｅｔａｌ．，２００３、Ｍｕｌｌｅｒｅｔａｌ．，２００３）。ウイルスを、それぞれのウイルスゲノムがそのゲノムがコードしたキャプシドタンパク質変異体内にパッケージングまたはキャプシド形成されるように生成した。この点において、選択を介して識別された機能改善を、ウイルスキャプシド内に含有されたこの改善された機能をコードするゲノム配列に結合することができる。

【0184】

このライブラリをｒｈｏ−ＧＦＰマウス（Ｗｅｎｓｅｌｅｔａｌ．（２００５）ＶｉｓｉｏｎＲｅｓ．４５：３４４５）内の正の選択に供した。簡潔に、１ラウンドの選択において、成人ｒｈｏ−ＧＦＰマウスに、２μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を硝子体内注入し、透析し、ライブラリを約１×１０^１２ウイルスゲノム（ｖｇ）／ｍＬのゲノム力価でイオジキサノール精製した。極細の３０１／２ゲージの使い捨て針をマウスの眼の赤道部であり、縁に隣接する強膜に通して、硝子体腔に入れた。針を硝子体腔の中心になるよう直接観察しながら２μＬのウイルス注入を行った。注入から１週間後、眼を摘出し、光パパインプロテアーゼ処理で網膜を解離し、その後、光受容体集団を蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）で単離した。次に、成功したビリオンをその後のゲノム抽出からＰＣＲ増幅し、さらにクローニングし、注入のために再パッケージングした。

【0185】

この選択をさらに繰り返し、変異体のプールを最も認可的な変異を有するサブセットに絞り込んだ。３回繰り返した後に、エラーを起こしやすいＰＣＲのラウンドを行い、選択的変異体のさらなる生成をもたらした。合計で、このプロセスを２世代繰り返した。この点において、この指向進化プロセスは、自然進化のプロセスと同様に、正の選択を適用して光受容体許容的ＡＡＶ変異体を生成し、変異生成を誘導した。

【0186】

その後、５０個の変異体のｃａｐ遺伝子を配列決定して、硝子体内光受容体形質導入のために許容的変異を有する最も卓越した成功を収めた変異体を決定した。５０個のクローンのうち４６個が、７ｍｅｒ挿入の可読配列をもたらした。注目すべきことに、約３分の２のクローンが同一のはっきりと異なる７ｍｅｒモチーフ（〜^５８８ＬＧＥＴＴＲＰ〜、配列番号１３）を含有した。興味深いことに、次の最も卓越した変異（〜^５８８ＮＥＴＩＴＲＰ〜、配列番号１４）も、極性トレオニンと無極性プロリン残基（ＴＲＰ）との間の正に荷電したアルギニン残基からなる同様の隣接モチーフを含有した。

【表1】

【0187】

表１指向進化からの単離された変異体の配列決定が、ウイルスライブラリにおける高度の収束を明らかにする。すべての変異体は、ＡＡＶ２７ｍｅｒライブラリに由来しており、約６４％の変異体が同一の７ｍｅｒモチーフ（〜^５８８ＬＧＥＴＴＲＰ〜（配列番号１３））を含有した。

【0188】

７ｍｅｒ挿入配列のうち、適度の選好が特定の位置、例えば、正に荷電した１位のアミノ酸、負に荷電した２位のアミノ酸、５位のアルコール（例えば、ＴｈｒまたはＳｅｒ等のアルコール基（遊離ヒドロキシル基）を有するアミノ酸）で存在した。

【0189】

７ｍｅｒ挿入物を、表２に示されるように、スペーサーによって隣接した。

【表2】

【0190】

図１。アミノ酸５８７の後にランダム７量体（オレンジ色で示される）を含有するＡＡＶ２の代表的な３次元キャプシドモデル。ＡＡＶ２キャプシドのこの領域は、細胞表面受容体結合に関与する可能性が高い。

【0191】

上述の選択からの高度のライブラリ収束の観点から、組換え形態のＡＡＶ２〜^５８８ＬＧＥＴＴＲＰ〜（配列番号１３、７Ｍ８の異名をとる）をクローニングし、ベクターをｓｃＣＡＧ−ＧＦＰ導入遺伝子でパッケージングして、その形質導入特性を可視化した。成人マウスへの硝子体内注入から３週間後、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）およびミュラー細胞を含む多数の細胞型におけるロバスト発現が観察された。重要なことに、外核層（ＯＮＬ）核（赤色の矢印）および外側部分（図２、青色の矢印）におけるＧＦＰ発現によって見られる７Ｍ８を注入した網膜における光受容体の形質導入が観察された一方で、ＡＡＶ２は、識別可能な光受容体発現を示さなかった。

【0192】

図２。ＡＡＶ２７Ｍ８変異体（右）は、ＡＡＶ２（左）と比較して、より高いレベルの硝子体内光受容体形質導入を示す。成人マウスへの２μＬの１×１０^１２ｖｇ／ｍＬのＡＡＶ２７Ｍ８およびＡＡＶ２ｓｃＣＡＧＧＦＰの硝子体内注入から３週間後の網膜横部分の共焦点顕微鏡検査。赤色の矢印（上）は、光受容体核を示し、青色の矢印（上）は、光受容体外側部分を示す。

【0193】

網膜細胞形質導入におけるこれらの利益の観点から、光受容体特異的ロドプシンプロモーターを含有するｓｓＲｈｏ−ｅＧＦＰ導入遺伝子を用いて発現特異性の増大を試みて、特に光受容体における形質導入効率をより良好に解明した（図３）。実際には、光受容体特異的Ｒｈｏプロモーターの使用は、その光受容体に対するＧＦＰ発現を制限した。合理的な設計手段と先の指向進化手段を組み合わせることにより、７Ｍ８形質導入効率の向上を試みた。したがって、４つの表面が露出したチロシン残基は、７Ｍ８キャプシド上のフェニルアラニンに変異させられ（Ｙ２７３Ｆ、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、およびＹ７３０Ｆ）、これらは、光受容体感染性を増加させると以前に示されている（Ｐｅｔｒｓ−Ｓｉｌｖａｅｔａｌ．，２００９）。興味深いことに、変異の付加は、７ｍ８または７ｍ８−４ＹＦ感染網膜由来のＧＦＰ（＋）光受容体のＦＡＣ選別によって示される初期のウイルスと比較して、形質導入された光受容体の数を減少させた（図４）。

【0194】

図３。ユビキタスＣＡＧプロモーター（左）または光受容体特異的Ｒｈｏプロモーター（右）の制御下でＧＦＰ遺伝子を担持する７ｍ８に起因するＧＦＰ発現を示す網膜冷凍スライスの代表的な蛍光画像。

【0195】

図４。フローサイトメトリーで計数された１００万個の網膜細胞当たりのＧＦＰ（＋）光受容体細胞。７ｍ８は、４チロシン変異を担持する７ｍ８（上）と比較して、２倍以上の量の光受容体を形質導入する。

【0196】

実施例２
網膜分離症の治療
発現構築物７ｍ８−ｒｈｏ−ＲＳ１を用いて、機能的レチノスキシン（ＲＳ１）タンパク質をレチノスキシン欠損マウス（Ｒｓ１ｈ欠損マウス、Ｒｓ１ｈは、ヒトＲＳ１のマウスホモログである）に送達した。ベクターは、ロドプシンプロモーターの転写制御下で機能的レチノスキシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。図１３Ａ〜Ｃを参照して、太字および下線を引いたヌクレオチド配列（ヌクレオチド４０１３〜４８５１）は、ロドプシンプロモーターであり、ヌクレオチド４８６６〜５５４０（太字で示される開始ａｔｇおよび終止ｔｇａ配列）は、ヒトＲＳ１タンパク質をコードする。

【0197】

７ｍ８−ｒｈｏ−ＲＳ１構築物をＰ１５でＲｓ１ｈ−／−マウスに硝子体内投与した。説明されるように、Ｒｓ１ｈ遺伝子のエクソン３を標的破壊してＲｓ１ｈ−／−マウスを生成した（Ｗｅｂｅｒｅｔａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９９：６２２２）。Ｒｓ１ｈ−／−マウスは、Ｒｓ１ｈタンパク質産物が不足しており、電気陰性ＥＲＧ（例えば、ａ波の相対保存により減少したｂ波）および網膜層の分裂を有し、ヒト網膜分離症患者において見られるものと類似している。７ｍ８−ｒｈｏ−ＲＳ１ベクターをＲｓ１ｈ−／−に注入することにより、網膜中の光受容体からの高レベルの汎網膜ＲＳ１発現をもたらした。ＲＳ１発現は、スペクトル領域光コヒーレンストモグラフィー（ＳＤ−ＯＣＴ）イメージング（図７Ａ〜Ｉ）、ＥＲＧｂ波の救済（図８Ａ〜Ｄ）、網膜の長期間の構造保持（図９Ａ〜Ｅ）において見られるように、網膜内の空洞の数および大きさの低減により網膜形態の改善をもたらした。

【0198】

図７Ａ〜Ｉ。７ｍ８−ｒｈｏ−ＧＦＰを注入した網膜（左列）、７ｍ８−ｒｈｏ−ＲＳ１を注入した網膜（中央列）、または注入されていない野生型動物の網膜（右列）の代表的な高解像度ＳＤ−ＯＣＴ画像。上網膜の内顆粒層を介して眼底画像を撮り、他の層（ａ〜ｃ）を除外した。視神経頭を目印として用いて、上（ｄ〜ｆ）および下（ｇ〜ｉ）の網膜の横断画像を撮った。

【0199】

内網膜を分裂するスキーシスの結果、病状が進行するため、内境界膜（ＩＬＭ）から光受容体まで測定するときに、未処理のＲＳ１網膜の全体の厚さが増加する。このプロセスは、スキーシスを形成しないが、ＩＮＬにおける進行性の光受容体細胞死および同時に起こる菲薄化、ならびにＥＲＧ振幅の損失を呈する大半の網膜変性疾患（ＲＤＤ）において観察されるものとは異なる。ＲＳ１において、ＯＮＬは、その疾患が原因で光受容体が死亡するときに菲薄化するが、これは、全体の網膜厚変化とは異なる。ＲＳ１の功を奏する治療が、全体の網膜厚を野生型の厚さに戻し、ＯＮＬにおける光受容体の喪失を改善すると一般に考えられている。ＲＳ１以外の大半のＲＤＤにおいて、ＯＮＬ菲薄化を特徴とする光受容体の喪失は、ＥＲＧ振幅によって測定される生理学的網膜産出量の減少を伴う。ＲＳ１は、網膜疾患の病状が同時に起こるＥＲＧ振幅損失を伴って網膜厚を増加させる網膜疾患のごく少数の例のうちの１つである。要約すれば、ＲＳ１遺伝子産物を回復させることにより、細胞外網膜「接着剤」は、網膜を菲薄化して野生型の厚さに戻し、ＥＲＧ振幅は、スキーシスが分解するときに正常に近いレベルに戻る。

【0200】

図８ａは、注入から１ヶ月後（左）および４ヶ月後（右）のＡＡＶ２−ｒｈｏ−ＲＳ１、７ｍ８−ｒｈｏ−ＧＦＰ、および７ｍ８−ｒｈｏ−ＲＳ１を注入した眼と、未処理のＲＳ１−／−眼の機能的救済との比較を示す。注入から１ヶ月後、７ｍ８−ｒｈｏ−ＲＳ１がＥＲＧｂ波振幅の著しい救済をもたらした一方で、ＡＡＶ２−ｒｈｏ−ＲＳ１は、未処理の眼とは統計的に区別できなかった。

【0201】

４ヶ月後、７ｍ８−ｒｈｏ−ＲＳ１振幅は、野生型振幅（右）に向かってさらに増加した。図８ｂは、７ｍ８−ｒｈｏ−ＧＦＰを注入した眼と比較して、ａ波およびｂ波ならびに野生型の眼により近い波形の振幅の改善を示す７ｍ８−ｒｈｏ−ＲＳ１を注入した眼の代表的なＥＲＧトレースを示す。図８ｃは、それぞれの条件においてＰ１５で注入の１ヶ月後から月１回の頻度で記録を開始した、高強度（１ｌｏｇｃｄ×ｓ／ｍ２）の刺激に起因する全界磁暗順応ｂ波の振幅を示す。３つの応答を記録し、それぞれの時点でそれぞれの眼を平均化した。

【0202】

平均ＥＲＧｂ波振幅を注入後の時間の関数としてプロットした。ｎ＝７を両方の条件に用いた。図８ｄは、暗順応条件（上のトレース、−３〜１ｌｏｇｃｄ×ｓ／ｍ２の刺激範囲）下および明順応条件（下のトレース、−０．９〜１．４ｌｏｇｃｄ×ｓ／ｍ２の範囲）下のＥＲＧ応答の分析が、刺激強度の範囲にわたって桿体および錐体機能の改善を示すことを示す。

【0203】

図９Ａ〜Ｅ。７ｍ８−ｒｈｏ−ＲＳ１での処理後１０ヶ月時点で測定された網膜厚の持続的改善。視神経頭の中心への注入から１０ヶ月後のａ）７ｍ８−ｒｈｏ−ＲＳ１またはｂ）７ｍ８−ｒｈｏ−ＧＦＰで処理した網膜の代表的なＳＤ−ＯＣＴ横断画像。ｃ）網膜の厚さ、ｄ）ＯＮＬの厚さ、ならびにｅ）内側部分および外側部分の厚さの測定結果を、視神経頭からの距離の関数としてプロットする。

【0204】

実施例３
タンパク質をマカクにおける網膜細胞に送達するために使用されるＡＡＶ変異体
組換えＡＡＶ２ビリオン（コネキシン３６プロモーターの制御下でＧＦＰを担持する７ｍ８）を生成した。組換えＡＡＶ２ビリオンは、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７とアミノ酸５８８との間にＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡペプチドが挿入されたＡＡＶ２キャプシド変異体、および介在ニューロンにおいて発現するコネキシン３６プロモーターの転写制御下のＧＦＰを含んだ。このｒＡＡＶ２ビリオンをマカクの眼内に硝子体内注入した。データが図１８に示される。

【0205】

図１８は、コネキシン３６プロモーターの制御下でＧＦＰを担持する７ｍ８の投与から９週間後の網膜の後部でＧＦＰ発現を示す蛍光眼底画像を提供する。親ＡＡＶ２血清型（Ｙｉｎｅｔａｌ，ＩＯＶＳ５２（５）；２７７５）と比較して、より高いレベルの発現が中心窩リングにおいて見られ、可視蛍光が中心窩の外側の中心網膜において見られた。

【0206】

参考文献
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【0207】

本発明は、その特定の実施形態を参照して説明されているが、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更を行い、かつ等価物を代用することができることを当業者は理解するべきである。加えて、多くの修正を行って、特定の状態、材料、物質の組成物、プロセス、１つのプロセスステップ、または複数のプロセスステップを本発明の目的、精神、および範囲に適応することができる。すべてのそのような修正は、本明細書に添付される特許請求の範囲内であるよう意図されている。

【図1】