特許 6072945 核酸の精製方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6072945

(24)【登録日】2017年1月13日

(45)【発行日】2017年2月1日

(54)【発明の名称】核酸の精製方法

(51)【国際特許分類】

   C07H 21/00 20060101AFI20170123BHJP

   C07H 21/04 20060101ALI20170123BHJP

   B01J 20/22 20060101ALI20170123BHJP

   B01J 20/30 20060101ALI20170123BHJP

   B01D 15/00 20060101ALI20170123BHJP

   G01N 30/88 20060101ALI20170123BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20170123BHJP

【ＦＩ】

   C07H21/00

   C07H21/04 A

   B01J20/22 C

   B01J20/30

   B01D15/00 G

   G01N30/88 D

   !C12N15/00 A

【請求項の数】5

【全頁数】39

(21)【出願番号】特願2016-12103(P2016-12103)

(22)【出願日】2016年1月26日

(62)【分割の表示】特願2011-541520(P2011-541520)の分割

【原出願日】2009年12月23日

(65)【公開番号】特開2016-135784(P2016-135784A)

(43)【公開日】2016年7月28日

【審査請求日】2016年1月26日

(31)【優先権主張番号】102008063001.2

(32)【優先日】2008年12月23日

(33)【優先権主張国】DE

(73)【特許権者】

【識別番号】507214038

【氏名又は名称】キアゲン ゲーエムベーハー

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】クリストフ エルバッハー

(72)【発明者】

【氏名】ローラント ファビス

【審査官】 中村 勇介

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００４−５２１８８１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００３−１０４９９６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表平１０−５０２０５２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表平１０−５０６９８７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開昭６４−００６７５５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００２−５４３９７９（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００

Ｇ０１Ｎ ３０／８８

Ｂ０１Ｄ １５／００−１５／４２

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

核酸結合相を用いて結合と溶出によって核酸を精製する方法であって、該核酸結合相が：
（ｉ）核酸結合性のＡ基であって、アミノ基であり、かつ２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）およびジエチルアミノプロピルトリメトキシシラン（ＤＥＡＰＳ）から選択される化合物の一部分である、Ａ基と、
（ｉｉ）電荷中性のＮ基であって、ヒドロキシル基であり、かつアクリレートおよび反応性シランから選択される化合物の一部分であり、Ａ基と相互作用しない、Ｎ基と
を有すること；
該核酸結合相が修飾支持材であり、該修飾が：
（ｉ）リガンドＩが少なくとも１つのＡ基を有し、リガンドＩＩが少なくとも１つのＮ基を有する、少なくとも該リガンドＩと該リガンドＩＩとを有する混合物での該支持材の修飾；
（ｉｉ）該Ａ基が、少なくとも１つのＮ基を有する化合物によって立体遮蔽される、該Ａ基および該Ｎ基での該支持材の修飾；および
（ｉｉｉ）該実施形態（ｉ）〜（ｉｉ）の組合せによる該支持材の修飾
からなる群より選択されること；および
該方法が、少なくとも以下の工程：
（ａ）４〜７．５のｐＨ（結合ｐＨ）で、該核酸を該核酸結合相に結合させる工程と、
（ｂ）該結合ｐＨよりも大きいｐＨ（溶出ｐＨ）で、該核酸を溶出させる工程と
を有すること
を特徴とする方法。

【請求項2】

前記支持材が、Ａ基を有するシランでコートされたシリカ表面を有することを特徴とする、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記シランの量が、０．１〜５０μｍｏｌである、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記シランの量が、０．１〜１０μｍｏｌである、請求項２に記載の方法。

【請求項5】

請求項１〜２のいずれか１項による支持材を有することを特徴とする、核酸を精製するためのキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、核酸結合支持材を用いて核酸を精製するための方法およびキットに関する。また、適切な支持材を精製する好適な方法を記載する。

【背景技術】

【0002】

核酸を精製および単離する種々の方法、例えば、フェノールクロロホルムの使用、塩析法、イオン交換体およびシリカ粒子の使用が先行技術において開示されている。

【0003】

既知の核酸精製方法の一例は、「電荷スイッチ切り替え（ｃｈａｒｇｅ−ｓｗｉｔｃｈ）法」である。これは、主に弱塩基性のポリマー、例えば、ポリＢｉｓ−Ｔｒｉｓ、ポリＴｒｉｓ、ポリヒスチジン、ポリヒドロキシル化アミン、キトサンまたはトリエタノールアミンなどを含む核酸結合相を、第１のｐＨで核酸含有試料と接触させることを伴い、この接触中、核酸結合相は正電荷を有する。これにより、負電荷を有する核酸の前記相に対する結合が促進される。核酸を放出／溶出させるため、正電荷を逆転または中和するために、電荷スイッチ切り替え原理に従って、核酸結合相のｐＫａよりも大きい第２のｐＨが設定される。このｐＨを該固相の核酸結合基のｐＫａよりも大きく設定することにより、核酸結合相からの結合核酸の分離が促進される。

【0004】

先行技術には、可溶性相（例えば特許文献１参照）と固相（例えば特許文献２参照）の両方が開示されている。種々の溶液、例えば、非常に高いｐＨを有する溶液あるいは生物学的バッファー、特に、例えばＴｒｉｓバッファーなどの低塩バッファーが溶出に使用されている。

【0005】

精製核酸は、通常、このほかにも処理される。前記の処理は、例えば、増幅（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）など）、酵素反応（制限、ライゲーション、リン酸化、脱リン酸化またはＲＮＡ転写など）、ハイブリッド捕捉アッセイおよび電気泳動を含む。このような「下流」反応は、多くの場合、比較的高い塩濃度に対する耐性がほとんどなく、したがって、核酸のさらなる処理過程を行なう前に、しばしば脱塩工程を行なわれなければならない。

【0006】

したがって、含まれる塩があまり多過ぎず、さらに、あまり塩基性が高過ぎない溶出バッファーは、さらなるバッファー交換または脱塩工程なしでの、精製核酸の直接後続する使用に望ましい。

【0007】

しかしながら、アニオン交換体の溶出能は、溶出バッファーのｐＨと塩濃度の増大の関数として増大する。したがって、クロマトグラフィーの要件は、ＤＮＡの処理過程の実施に関する要件と相反する。このため、先行技術において、適当な核酸結合基とｐＨ条件を選択することにより、核酸の溶出を特異的に促進させることが試みられている。

【0008】

このような核酸精製方法が知られているにもかかわらず、既存の方法改善する必要性、より詳しくは、直後に試料の処理過程も行なうことができるような様式で核酸を精製する必要性がある。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】欧州特許第０７０７０７７号明細書

【特許文献2】国際公開第９９／２９７０３号

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0010】

したがって、本発明の目的は、直後に試料の処理過程を行なうことが可能な核酸の精製方法を提供することである。より詳しくは、本発明は、低塩濃度で溶出が可能な方法を利用可能にすることを意図するものである。

【0011】

この目的は、本発明により、特別な核酸結合相を用いる核酸精製方法によって達成される。

【0012】

第１の実施形態によれば、核酸結合相は、８〜１３のｐＫａを有する核酸結合性のＡ基と、結合を減弱させ、かつ使用される結合ｐＨにおいて中性電荷を有するＮ基も有する。

【0013】

この核酸結合相を用いた精製方法は、以下の工程：
（ａ）核酸結合性のＡ基のｐＫよりも小さいｐＨ（結合ｐＨ）で、核酸を核酸結合相に結合させる工程；
（ｂ）結合ｐＨよりも大きいｐＨ（溶出ｐＨ）で、該核酸を溶出させる工程
を有する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
核酸結合相を用いて結合と溶出によって核酸を精製する方法であって、該核酸結合相が：
（ｉ）８〜１３のｐＫを有する核酸結合性のＡ基と、
（ｉｉ）使用される結合ｐＨにおいて中性電荷を有する電荷中性のＮ基と
を有すること；および
該方法が、少なくとも以下の工程：
（ａ）該核酸結合性のＡ基のｐＫよりも小さいｐＨ（結合ｐＨ）で、該核酸を該核酸結合相に結合させる工程と、
（ｂ）該結合ｐＨよりも大きいｐＨ（溶出ｐＨ）で、該核酸を溶出させる工程と
を有すること
を特徴とする方法。
（項目２）
前記核酸結合相が修飾支持材であり、前記修飾が：
（ｉ）リガンドＩが少なくとも１つのＡ基を有し、リガンドＩＩが少なくとも１つのＮ基を有する、少なくとも該リガンドＩと該リガンドＩＩとを有する混合物での該支持材の修飾；
（ｉｉ）核酸結合リガンドでの該支持材の修飾であって、該リガンドのそれぞれが該リガンド内に１つ以上のＡ基と１つ以上のＮ基とを有する、修飾；
（ｉｉｉ）該Ａ基が、少なくとも１つのＮ基を有する化合物によって立体遮蔽される、該Ａ基および該Ｎ基での該支持材の修飾；および
（ｉｖ）該実施形態（ｉ）〜（ｉｉｉ）の少なくとも２つの組合せによる該支持材の修飾
からなる群より選択されることを特徴とする、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記支持材が核酸結合性のＡ基で修飾されており、該支持材の一部だけがＡ基で占有されていることを特徴とする、核酸結合支持材を用いて結合と溶出によって核酸を精製する方法。
（項目４）
前記支持材が、以下の特徴：
（ｉ）該支持材が、Ａ基を有するシランでコートされたシリカ表面を有し、シランの量が０．１〜５０μｍｏｌ、好ましくは０．１〜１０μｍｏｌであること；および／または
（ｉｉ）該支持材が、さらに、項目１によるＮ基を有すること；および／または
（ｉｉｉ）該支持材が、項目２において規定される１つ以上の修飾を有すること
の１つ以上を有することを特徴とする、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記核酸結合相が、以下の特徴：
（ｉ）前記支持材が酸化物材料であること；および／または
（ｉｉ）該支持材が、Ａｌ_２Ｏ_３、ＴｉＯ_２、ＺｒＯ_２、Ｔａ_２Ｏ_５、ＳｉＯ_２およびポリケイ酸からなる群より選択されること；および／または
（ｉｉｉ）該支持材がＳｉＯ_２もしくはポリケイ酸であること；および／または
（ｉｖ）該支持材が、特に、ポリスチレンおよびその誘導体、ポリアクリレートおよびポリメタクリレート、ならびにその誘導体、ポリウレタン、ナイロン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリブチリデン、ならびにこれらの材料のコポリマーからなる群より選択される有機ポリマーであること；および／または
（ｖ）該支持材が多糖、特に、ヒドロゲル、例えば、アガロース、セルロース、デキストラン、セファデックス、セファクリルもしくはキトサンであること；および／または
（ｖｉ）該支持材がガラスもしくは金属であること；および／または
（ｖｉｉ）該支持材が磁性であること
の１つ以上を満たす支持材を有することを特徴とする、項目１〜４の１つ以上に記載の方法。
（項目６）
前記核酸結合相が、以下の特徴：
（ｉ）前記Ａ基が、９〜１３、好ましくは１０〜１２、特に好ましくは１０〜１１のｐＫを有すること；および／または
（ｉｉ）該Ａ基が、第３級、第２級もしくは第１級アミノ基であること；および／または
（ｉｉｉ）該Ａ基が、重合性モノマーの一部であること；および／または
（ｉｖ）該Ａ基が、事前に反応性シランとして適用しておいた開始剤分子に結合されていること；および／または
（ｖ）該Ａ基が、反応性シラン基の一部として導入したものであること；および／または
（ｖｉ）該Ａ基が：

【化7】

（式中
ｎは、１〜５であり、
Ｒは、Ｃ１〜Ｃ６、好ましくはＣ１〜Ｃ３アルキル基であり、
^＊は、アミノ、アミノメチル、アミノエチル、アミノプロピル、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジイソプロピルアミノ、ジプロピルアミノ、ジエタノールアミノ、ジプロパノールアミノ、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、エーテルアミン、ポリエーテルアミン、４−ジイソブチルアミノ−１−ブタン、６−ジプロピルアミノ−１−ヘキサンである）
からなる群より選択される化合物の一部として導入したものであること；および／または
（ｖｉ）該Ａ基が、ジエチルアミノプロピルトリメトキシシラン、ジメチルアミノプロピルトリメトキシシランおよびＮ，Ｎ−ジイソプロピルアミノプロピルトリメトキシシランからなる群より選択される化合物の一部として導入したものであること
の１つ以上を満たすＡ基を有することを特徴とする、項目１〜５の１つ以上に記載の方法。
（項目７）
前記結合させる工程（ａ）および／または前記溶出させる工程（ｂ）が、以下の特徴：
（ｉ）該溶出させる工程（ｂ）において、前記溶出ｐＨはＡ基の前記ｐＫよりも小さいこと；および／または
（ｉｉ）結合バッファーおよび／または溶出バッファーの塩濃度が１ｍＭ〜１０００ｍＭ、１ｍＭ〜５００ｍＭ、１ｍＭ〜２５０ｍＭまたは１ｍＭ〜１００ｍＭであること；および／または
（ｉｉｉ）該塩濃度を、該結合させる工程（ａ）および／または該溶出させる工程（ｂ）で変更しないか、あるいは溶出中で上昇させること；および／または
（ｉｖ）該結合バッファーのｐＨがｐＨ２〜ｐＨ８、ｐＨ２〜ｐＨ７．５、ｐＨ４〜ｐＨ８またはｐＨ４〜ｐＨ７．５であること、および／または
（ｖ）該溶出バッファーのｐＨがｐＨ２〜ｐＨ１０、ｐＨ４〜ｐＨ１０、ｐＨ７〜ｐＨ１０またはｐＨ８〜ｐＨ９であること；および／または
（ｖｉ）温度を、該結合させる工程（ａ）および／または該溶出させる工程（ｂ）で変更しないか、あるいは溶出中で上昇させること；および／または
（ｖｉｉ）該溶出させる工程の温度が２℃〜９５℃または２１℃〜６０℃であること
の１つ以上を満たす条件下で行なわれることを特徴とする、項目１〜６の１つ以上に記載の方法。
（項目８）
前記Ｎ基が、以下の特徴：
（ｉ）該Ｎ基が、ヒドロキシル基、ジオール基、トリオール基、ポリオール基、糖類、エポキシド基、ハライド、アルキル基、好ましくは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、アルケン基、アルキレン基、イミド基、エーテル基、もしくはポリエーテル基からなる群より選択されること、および／または
（ｉｉ）該Ｎ基が、２＜ｐＨ＜１２のｐＨ範囲の電荷中性であること；および／または
（ｉｉｉ）該Ｎ基が、使用される前記溶出ｐＨにおいて中性電荷を有すること；および／または
（ｉｖ）該Ｎ基が、重合性モノマーの一部として導入したものであること；および／または
（ｖ）該Ｎ基が、事前に反応性シランとして適用しておいた開始剤分子に結合されていること；および／または
（ｖｉ）該Ｎ基が、反応性シラン基の一部として導入したものであること；および／または
（ｖｉｉ）該Ｎ基が、

【化8】

（式中
ｎは、１〜５であり、
Ｒは、Ｃ１〜Ｃ６、好ましくはＣ１〜Ｃ３アルキル基、特に、メチル、エチル、プロピル、イソプロピルであり；
^＊は、アミノ、アミノメチル、アミノエチル、アミノプロピル、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジイソプロピルアミノ、ジプロピルアミノ、ジエタノールアミノ、ジプロパノールアミノ、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、エーテルアミン、ポリエーテルアミン、４−ジイソブチルアミノ−１−ブタン、６−ジプロピルアミノ−１−ヘキサン、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシプロピル、エタンジオール、プロパンジオール、プロパントリオール、ブタントリオール、３−グリシドオキシプロピル、エチルグリシジルエーテル、アルキル原子団、特に、Ｃ１〜Ｃ４アルキル原子団、特に、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ハライドまたは水素である）
からなる群より選択される化合物の一部として導入したものであること
の１つ以上を満たすことを特徴とする、項目１〜７の１つ以上に記載の方法。
（項目９）
以下の特徴：
（ｉ）前記支持材が、シラン処理によって前記Ａ基と前記Ｎ基とを備えたものであること；および／または
（ｉｉ）該Ａ基および／または該Ｎ基および／またはＴ基が、反応性シランによって導入されたものであること；および／または
（ｉｉｉ）該Ａ基および／または該Ｎ基が、単官能性、二官能性もしくは三官能性の反応性シランまたは異なる官能基を有する少なくとも２つの反応性シランの混合物によって導入されたものであること；および／または
（ｉｖ）該Ａ基および／または該Ｎ基が、アミノシラン、ジシラザン、クロロシランもしくはアルコキシシランからなる群より選択される反応性シランによって導入されたものであること；および／または
（ｖ）該Ｎ基に対する該Ａ基の比率が１％〜９９％、１〜５０％、好ましくは１％〜２５％であること
の１つ以上を満たすことを特徴とする、項目１〜８の１つ以上に記載の方法。
（項目１０）
以下の特徴：
（ｉ）前記支持材が、開始剤分子Ｔで修飾し、続いてモノマーの形態で導入された前記Ａ基および／または前記Ｎ基で修飾したものであること；および／または
（ｉｉ）該支持材が、以下の特徴：
（ａａ）該開始剤分子が反応性シランであること；および／または
（ｂｂ）該開始剤分子が、

【化9】

（式中、Ｘは、ハロゲン、特にＣｌ、Ｂｒ、Ｉであり、
Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３またはＹ４は、互いに独立して、Ｒ、ＯＲ、ＯＨまたはＨであり、
Ｒは、Ｃ１−Ｃ３アルキルである）
からなる群より選択されることの１つ以上を有する該開始剤分子Ｔで修飾したものであること、
（ｉｉｉ）該開始剤分子が２−（クロロメチル）アリルトリメトキシシランであること；
（ｉｖ）該開始剤分子が［３−（２−ブロモイソブチリル）プロピル］エトキシジメチルシランであること、
（ｖ）該Ａ基が、
Ｎ−（３−アミノメチル）メタクリルアミド、Ｎ−（３−アミノエチル）メタクリルアミド、Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド、Ｎ−（３−アミノイソプロピル）メタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−（ジメチルアミノ）エチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−（ジメチルアミノ）エチルアクリレート、Ｎ，Ｎ−（ジメチルアミノ）エチルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−（ジメチルアミノ）プロピルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−（ジメチルアミノ）プロピルアクリレート、Ｎ，Ｎ−（ジメチルアミノ）プロピルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−（ジメチルアミノ）プロピルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−（ジエチルアミノ）エチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−（ジエチルアミノ）エチルアクリレート、Ｎ，Ｎ−（ジエチルアミノ）エチルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−（ジエチルアミノ）エチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−（ジエチルアミノ）プロピルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−（ジエチルアミノ）プロピルアクリレート、Ｎ，Ｎ−（ジエチルアミノ）プロピルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−（ジエチルアミノ）プロピルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−（ジイソプロピルアミノ）エチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−（ジイソプロピルアミノ）エチルアクリレート、Ｎ，Ｎ−（ジイソプロピルアミノ）エチルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−（ジイソプロピルアミノ）エチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−（ジイソプロピルアミノ）プロピルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−（ジイソプロピルアミノ）プロピルアクリレート、Ｎ，Ｎ−（ジメチルアミノ）プロピルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−（ジメチルアミノ）プロピルメタクリレート、２−（ジイソプロピルアミノ）エチルメタクリレート
からなる群より選択されるモノマーによって導入されたものであること、および／または
（ｖｉ）該Ｎ基が、
アクリル酸ブチル、アクリル酸プロピル、アクリル酸エチル、アクリル酸メチル、メタクリル酸グリシジル、メタクリル酸ヒドロキシエチル（ＨＥＭＡ）、メタクリル酸グリシドオキシプロピル、グリセロールモノメタクリレート（異性体混合物）、グリコールモノメタクリレート、アクリル酸グリシジル、アクリル酸ヒドロキシエチル、アクリル酸グリシドオキシプロピル、グリセロールモノアクリレート（異性体混合物）、グリコールモノアクリレートおよびＮ−アクリルオキシスクシンイミド
からなる群より選択されるモノマーによって導入されたものであること
の１つ以上を特徴とする、項目２〜９の１つ以上に記載の方法。
（項目１１）
前記支持材が、Ａ基を有する化合物で少なくとも一部が官能性付与されている開始剤基Ｔを有し、該Ａ基がＮ基によって立体遮蔽されており、該立体遮蔽が、以下の修飾：
（ｉ）該Ｎ基が、該Ａ基を立体遮蔽する分枝鎖もしくは非分枝鎖のオリゴマーもしくはポリマーの形態であること；および／または
（ｉｉ）該Ｎ基が、ｎ＝１０〜１０００、好ましくはｎ＝１０〜１００の鎖長を有するモノマーで構成されたオリゴマーもしくはポリマーの形態であること；および／または
（ｉｉｉ）該Ｎ基が、好ましくは、下記式：

【化10】

によるポリアクリレートとして存在していること、
（ｉｖ）該Ｎ基が、例えば、イソプロピル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチルもしくはｎ−ヘキシル原子団などの空間的に広がった基を有すること、あるいは該基であること
の１つ以上によってもたらされることを特徴とする、項目１〜１０の１つ以上に記載の方法。
（項目１２）
以下の代替法（Ａ）〜（Ｆ）：
代替法（Ａ）：前記リガンドＩが少なくとも１つのＡ基を有し、前記リガンドＩＩが少なくとも１つのＮ基を有する、少なくとも該リガンドＩと該リガンドＩＩとを有する混合物での前記支持材の官能性付与；および／または
代替法（Ｂ）：
（ａ）開始剤分子Ｔと少なくとも１つのＡ基を有するリガンドとの混合物での該支持材の官能性付与ならびに、（ｂ）少なくとも１つのＮ基を有する化合物の添加ならびに該開始剤分子Ｔへの該化合物の結合；および／または
代替法（Ｃ）：核酸結合リガンドでの該支持材の官能性付与であって、該リガンドのそれぞれが該リガンド内に１つ以上のＡ基と１つ以上のＮ基とを有する官能性付与；および／または
代替法（Ｄ）：該Ａ基が、少なくとも１つのＮ基を有する化合物によって立体遮蔽される、該Ａ基および該Ｎ基での該支持材の官能性付与；および／または
代替法（Ｅ）：準化学量論量のＡ基での該支持材の官能性付与；および／または
代替法（Ｆ）：代替法（Ａ）〜（Ｅ）の少なくとも２つの組合せによる該支持材の官能性付与
の少なくとも１つに従って行なわれる、項目１〜６および８〜１１の１つ以上において規定される核酸結合支持材の調製方法。
（項目１３）
以下の特徴：
（ｉ）前記Ａ基が、第３級、第２級もしくは第１級アミノ基であること；および／または
（ｉｉ）前記Ｎ基が、ヒドロキシル基、ジオール基、トリオール基、ポリオール基、糖類、エポキシド基、ハライド、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、アルケン基、アルキレン基、イミド基、エーテル基、もしくはポリエーテル基からなる群より選択されること、および／または
（ｉｉｉ）該Ｎ基が、前記溶出ｐＨにおいて、好ましくは２＜ｐＨ＜１２の特定のｐＨ範囲において電荷中性であること；および／または
（ｉｖ）該Ａ基および／または該Ｎ基がモノマーによって導入されること；および／または
（ｖ）該Ａ基および／または該Ｎ基がシラン処理によって導入されること；および／または
（ｖｉ）該Ａ基および／または該Ｎ基が反応性シランによって導入されること；および／または
（ｖｉｉ）該Ａ基および／または該Ｎ基が、単官能性または二官能性および／または三官能性の反応性シランの使用によって導入されること；および／または
（ｖｉｉｉ）該Ａ基および／または該Ｎ基が、アミノシラン、ジシラザン、クロロシランもしくはアルコキシシランからなる群より選択される反応性シランの使用によって導入されること；および／または
（ｉｘ）該Ａ基および／または該Ｎ基が：

【化11】

（式中
ｎは、１〜５であり、
Ｒは、Ｃ１〜Ｃ６、好ましくはＣ１〜Ｃ３アルキル基、特に、メチル、エチル、プロピル、イソプロピルであり；
^＊は、アミノ、アミノメチル、アミノエチル、アミノプロピル、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジイソプロピルアミノ、ジプロピルアミノ、ジエタノールアミノ、ジプロパノールアミノ、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、エーテルアミン、ポリエーテルアミン、４−ジイソブチルアミノ−１−ブタン、６−ジプロピルアミノ−１−ヘキサン、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシプロピル、エタンジオール、プロパンジオール、プロパントリオール、ブタントリオール、３−グリシドオキシプロピル、エチルグリシジルエーテル、アルキル原子団、特に、Ｃ１〜Ｃ４アルキル原子団、特に、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ハライドまたは水素である）
からなる群より選択される反応性シランによって導入されること、
（ｘ）該Ａ基および該Ｎ基が、該Ａ基の比率が１％〜９９％、１〜５０％、好ましくは１％〜２５％となるような比で導入されること；および／または
（ｘｉ）該支持材が、以下の特徴：
（ａａ）該開始剤分子がシラン処理によって適用されること；および／または
（ｂｂ）該開始剤分子がシランであること；および／または
（ｃｃ）該開始剤分子が、

【化12】

【化13】

（式中、Ｘは、ハロゲン、特にＣｌ、Ｂｒ、Ｉであり、
Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３またはＹ４は、互いに独立して、Ｒ、ＯＲ、ＯＨまたはＨであり、
Ｒは、Ｃ１〜Ｃ３アルキルである）
からなる群より選択されること
の１つ以上を有する開始剤分子Ｔで修飾されること、
（ｘｉｉ）使用される該開始剤分子が、２−（クロロメチル）アリルトリメトキシシランであること；
（ｘｉｉｉ）使用される該開始剤分子が、［３−（２−ブロモイソブチリル）プロピル］エトキシジメチルシランであること；および／または
（ｘｉｖ）該Ａ基が、
２−（ジイソプロピルアミノ）エチルメタクリレート、
Ｎ−（３−アミノメチル）メタクリルアミド、Ｎ−（３−アミノエチル）メタクリルアミド、
Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド、Ｎ−（３−アミノイソプロピル）メタクリルアミド、
Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアクリルアミド、
Ｎ，Ｎ−（ジメチルアミノ）エチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−（ジメチルアミノ）エチルアクリレート、
Ｎ，Ｎ−（ジメチルアミノ）エチルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート、
Ｎ，Ｎ−（ジメチルアミノ）プロピルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−（ジメチルアミノ）プロピルアクリレート、
Ｎ，Ｎ−（ジメチルアミノ）プロピルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−（ジメチルアミノ）プロピルメタクリレート、
Ｎ，Ｎ−（ジエチルアミノ）エチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−（ジエチルアミノ）エチルアクリレート、
Ｎ，Ｎ−（ジエチルアミノ）エチルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−（ジエチルアミノ）エチルメタクリレート、
Ｎ，Ｎ−（ジエチルアミノ）プロピルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−（ジエチルアミノ）プロピルアクリレート、
Ｎ，Ｎ−（ジエチルアミノ）プロピルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−（ジエチルアミノ）プロピルメタクリレート、
Ｎ，Ｎ−（ジイソプロピルアミノ）エチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−（ジイソプロピルアミノ）エチルアクリレート、
Ｎ，Ｎ−（ジイソプロピルアミノ）エチルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−（ジイソプロピルアミノ）エチルメタクリレート、
Ｎ，Ｎ−（ジイソプロピルアミノ）プロピルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−（ジイソプロピルアミノ）プロピルアクリレート、
Ｎ，Ｎ−（ジメチルアミノ）プロピルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−（ジメチルアミノ）プロピルメタクリレート
からなる群より選択されるモノマーによって導入されること、および／または
（ｘｉｖ）Ｎ基が、アクリル酸ブチル、アクリル酸プロピル、アクリル酸エチル、アクリル酸メチル、メタクリル酸ヒドロキシエチル（ＨＥＭＡ）、メタクリル酸グリシジル、メタクリル酸グリシドオキシプロピル、グリセロールモノメタクリレート（異性体混合物）、Ｎ−アクリルオキシスクシンイミドおよびグリコールモノメタクリレート
からなる群より選択されるモノマーによって導入されること
の少なくとも１つを満たすことを特徴とする、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
核酸を精製するための、項目１〜６および８〜１１の１つ以上において規定される、または項目１２と１３のいずれかにより得られ得る、核酸結合支持材の使用。
（項目１５）
項目１〜６および８〜１１の１つ以上による支持材、または項目１２もしくは１３により得られ得る支持材を有することを特徴とする、核酸を精製するためのキット。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】図１は、核酸結合性のＡ基と結合減弱性のＮ基を備えており、前記の基が別々のリガンドに存在している支持材の模式的概略図を示す（請求項２（ｉ）も参照のこと）。

【図2】図２は、核酸結合性のＡ基と結合阻害性のＮ基を備えており、前記の基が単一のリガンド内に混合物として存在している支持材の模式的概略図を示す（請求項２（ｉｉ）も参照のこと）。（Ａ）は、最初にＡ基を備え、次いでＮ基を備えた支持材を示す；（Ｂ）は、単一のリガンド内のＡとＮの交互配列を示す。

【図3】図３は、核酸結合性のＡ基と立体遮蔽性のＮ基を備えており、前記の基を、図１および２に示したスキームによる核酸結合性のＡ基と組み合わせることが可能な支持材の模式的概略図を示す。請求項２（ｉｉｉ）参照。

【図4】図４は、一例として核酸結合性のＡ基と、結合阻害性および／または立体遮蔽性のＮ基とを備えており、前記の基が、図１〜３に示したスキームの組合せによって形成されている支持材の模式的概略図を示す。請求項２（ｉｖ）参照。

【図5】図５は、準化学量論量の核酸結合性のＡ基を備えた支持材の模式的概略図を示す。請求項３（ｉｖ）参照。

【図6】図６は、異なるｐＨ値での実施例Ａ３ａ）による溶出プロフィールを示す。

【図7】図７は、異なるｐＨ値での実施例Ａ３ｂ）による溶出プロフィールを示す。

【図8】図８は、実施例Ｃ．１）に従って調製したシリカゲルの溶出図を示す。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本発明は、核酸結合性のＡ基に加えて結合減弱性のＮ基も有する核酸結合相によって核酸の精製に関する。本発明によれば、核酸結合性のＡ基は８〜１３のｐＫａを有する。核酸は、前記Ａ基の少なくとも１つのｐＫａよりも下のｐＨで結合させる。したがって、Ａ基はプロトンを取り込み、その結果、正電荷を有する状態になり、核酸結合相が、負電荷を有する核酸に結合することが可能になる。溶出は結合ｐＨより大きいｐＨで行ない、それにより、核酸結合相の正電荷を減少させる。

【0016】

さらなる基のＮ基は、結合ｐＨで、好ましくは溶出ｐＨでも電荷中性である。したがって、Ｎ基は、いくつかの態様において、Ａ基の結合強度に影響を及ぼす：（１．）Ａ基の配置に割り込み、したがって、Ａ基の密度が低下するため、核酸結合相に対する核酸の結合強度に影響を及ぼす。（２．）弱い相互作用に参与し（例えば、ファンデルワールス相互作用によって）、中間強度の相互作用まで参与し得る（例えば、水素結合によって）官能基によって、結合強度を特異的にモジュレートし得る。（３．）Ｎ基は、大きさおよび／または数が増大すると核酸結合性のＡ基を立体遮蔽することがあり得、それにより結合強度を低下させる。したがって、Ｎ基は、核酸結合強度の一様でｐＨ非依存性の低下を引き起こす。この結果として、結合される核酸が少なくなり、そのうえ、より容易に核酸結合相から分離され得る。Ｎ基の機能は、特異的かつ制御された様式で、Ａ基の結合強度および／または数を減少させ、それにより、本発明による核酸結合相において所望の頻度を設定することである。Ｎ基の比率が高いほど、Ａ基の比率が低く、電荷密度が低く、核酸結合相に対する核酸の結合が弱い。Ｎ基に対するＡ基の比率は、対応する核酸結合相の調製方法（例えば、重合、（重）縮合によって、特に、支持材のコーティングによって）において、または該方法によって、所望の強度の核酸結合が事前に確立されることを可能にするための調製プロセスによって特異的に調整され得る。

【0017】

このことの大きな利点は、溶出させた核酸を、精製直後に、さらに処理することが可能な条件下で溶出を実施できることである。多くの生物生体工学的方法、例えば、核酸の増幅（特に、ＰＣＲによるもの）、配列決定、逆転写、制限解析、およびその他（上記参照）などは、溶出液中の夾雑物に対して、特に、高い塩濃度に対して敏感である。本発明による精製方法では、好都合には、低塩濃度または低イオン強度での溶出が可能となり、それにより、後続の生物生体工学的方法、特にＰＣＲ反応において、さらなる処理過程を直接行なうことが可能になる。

【0018】

Ｎ基を用いることにより核酸の結合を減弱させるという概念により、驚くべき良好な結果がもたらされる。先行技術では、方法の最適化のために核酸の最適な結合を想定し、次いで、結合条件、特に溶出の最適化に注力する。対照的に、結合強度の減弱は、例えば、核酸が、結合させる工程において不充分にしか核酸結合相に結合しないか、または洗浄中に溶出されることがあり得るため、予測される収率に関して不都合であると考えられていた。このことに鑑みると、Ｎ基の存在により結合強度が低下するにもかかわらず成功裡で緩徐な核酸精製という本発明による概念は、極めて驚くべきこととみなされるはずである。

【0019】

Ｎ基に対するＡ基の比率は、１％〜９９％、１〜５０％、好ましくは１％〜２５％であり得る。

【0020】

好ましい一実施形態によれば、核酸結合相は、Ａ基とＮ基を導入するために修飾される。本発明によれば、これは、以下により詳細に説明する種々の実施形態を包含する。

【0021】

一実施形態によれば、核酸結合相は異なるリガンド（リガンドＩとリガンドＩＩ）を備えており、リガンドＩは少なくとも１つのＡ基を有し、リガンドＩＩは少なくとも１つのＮ基を有する。この実施形態を図１Ａに図解する。このとき、Ａ基とＮ基は直接近接しており、また、ポリマーコーティングを形成させてもよい。Ｎ基担持リガンドＩＩの存在のため、Ａ基の数は減少し、それにより、特に支持材が使用されている場合、核酸の結合の強固さが低下する。したがって、Ｎ基のため、該支持体表面上のＡ基の密度は低下し、結果として、核酸に対する結合親和性が低下する。その結果、核酸は、より容易に溶出され得る。用語「リガンド（１つまたは複数）」は、特に、好ましくは、少なくとも１つのＡ基および／または１つのＮ基を有する支持材が、本発明による核酸結合相を提供するために修飾される表面の官能基をいう。リガンドＩとＩＩは、好ましくは支持材に結合させており、例えば、反応性の個々の分子のモノマー、ダイマー、オリゴマーまたはポリマーであり得る。変形例の一例において、支持材と反応する化合物の一部としてのＡ基またはＮ基は、直接またはリンカーもしくはスペーサーを介して支持材に結合させる。好ましい一実施形態によれば、この修飾は、支持材を、異なるリガンドＩとＩＩを有する混合物と接触させることによりなされる。リガンドＩに対するリガンドＩＩの比率が高いほど、核酸に対する結合強度が低い。この比は、単に、コーティングプロセスにおけるリガンドＩ反応体とリガンドＩＩ反応体の対応する比によって制御され得る。詳細を、以下に、対応する支持材の合成または調製方法に関して説明する。また、リガンドは、ポリマーコーティングを形成していてもよい。また、支持材は、Ａ基と開始剤分子Ｔ（Ｉｎｉｔｉａｔｏｒｍｏｌｅｋｕｅｌｅｎ）を備えたものであってもよく、１つ以上のＮ基を前記開始剤分子に結合させる。この実施形態を図１Ｂ）に示す。Ｎ基は、この場合、支持材の表面に対してＡ基の「上部」に存在する。また、Ａ基も開始剤分子を介して結合させることも可能である。

【0022】

本発明のさらなる一実施形態によれば、支持材は、１つ以上のＡ基と１つ以上のＮ基とが単一のリガンド内に存在する核酸結合リガンドで修飾される。
この実施形態を図２により詳細に示す。この概念の実現には種々の可能性がある。

【0023】

変形例の一例によれば、支持材は、Ｎ基を含む１つ以上の化合物を担持しているＡ基（直接または例えば開始剤分子Ｔを介してのいずれかにより結合）を備えている（図２Ａも参照のこと）。複数のＮ基が存在する場合、これらはまた、非分枝鎖の形態であってもよく、分枝型樹状構造としての形態であってもよく、対応する混合物としての形態であってもよい。これには、リガンド１つあたり例えば、１〜１００個のＮ基、１〜２０、好ましくは１〜１０、特に好ましくは１〜５個のＮ基が含まれ得る。また、所望により、なおさらなるＡ基とＮ基を導入してもよい。この連結ストラテジーでは、実質的に純粋にＡ基で占有された比較的均一な結合面と、突出部と隣接し、Ｎ基による占有のためＡ基の結合強度が低下した１つ以上の面とがもたらされる。

【0024】

この実施形態の変形例のさらなる一例によれば、支持材は、Ｎ基とＡ基の混合物を担持しているＡ基（直接または例えば開始剤分子Ｔを介してのいずれかにより結合）を備えている（図２Ｂも参照のこと）。これは、最初に１つ以上のＡ基を支持材に結合させることを伴い得る。この後、このようなＡ含有主リガンドに、少なくとも１つ以上のＮ基を導入する化合物を結合させる。反応条件の制御により、各場合において、リガンド内にＡ基とＮ基を１つだけ存在させることが可能になる；しかしながら、リガンドはまた、オリゴマーまたはポリマーの形態であってもよい。オリゴマーおよびポリマーとして設計されるリガンドは、Ｎ基がランダムな分布（例えば図２Ｂ、右側の図参照）、交互配列（例えば図２Ｂ、左側の図参照）、または他の配置のブロックコポリマーを有するものであり得る。また、組合せも可能である。適切なＡ含有およびＮ含有官能基／リガンドの好適な設計方法を以下に詳細に説明する。

【0025】

さらなる実施形態によれば、支持材は、Ａ基が、少なくとも１つ、好ましくは多数のＮ基を有する化合物によって立体遮蔽されたＡ基とＮ基で修飾されている。この実施形態にも、種々の変形例が存在する。

【0026】

変形例の一例によれば、立体遮蔽は、好ましくは、Ｎ基を有するオリゴマーまたはポリマーによって行なう。前記オリゴマーまたはポリマーは、例えば、Ａ基（１つまたは複数）を有するリガンドに結合させてもよい（図３Ｂも参照のこと）。しかしながら、立体遮蔽が確保される限り、前記オリゴマーまたはポリマーはＡ基に隣接して配置するのがよい（図３Ａも参照のこと）。Ｎ基を有するオリゴマー／ポリマーはＡ基を、多かれ少なかれ規則的な二次構造（例えば、「ランダムコイル」またはらせん）を形成することにより、周囲環境から、いわば蓋をすることによって遮蔽し、したがって、核酸の結合を減弱させることが可能である。また、該オリゴマー／ポリマーは、Ｎ基から調製したものであってもよく、また、ブロックコポリマーによって導入されたものであってもよい。

【0027】

この変形例は、例えば、第１の工程において開始剤基Ｔを支持材に、例えばシラン処理によって適用することにより調製され得る。次いで、第２の工程において、Ａ基を含むモノマーが、例えばＡＴＲＰ（原子移動ラジカル重合）によってグラフト化され得る。このモノマーを充分反応させた後、中性のＮ基を有する第２のモノマーが導入され得る。これにより、アニオン交換体基を担持している第１のホモポリマーと、第１のホモポリマーに連結され、中性のＮ基を担持している第２のホモポリマーからなるコポリマーが、該支持体上に得られる。発生期ポリマー鎖の長さ、したがって、立体遮蔽の強度は、Ｎ基を担持している第２のモノマーの量によって制御され得る。

【0028】

したがって、立体遮蔽の程度は、鎖長およびモノマー置換によって制御され得る。Ｎ基を有するオリゴマー／ポリマーの好ましい鎖長は、ｎ＝１０〜１０００、ｎ＝１０〜５００、特に好ましくは、ｎ＝１０〜１００である。Ｎ基を担持しているオリゴマー／ポリマーは、本出願書類に記載のモノマーを用いて設計してもよく、これを詳細に説明する。ポリアクリレートが特に好適である。

【0029】

使用される好ましいポリマーは、下記式：

【0030】

【化1】

によるポリアクリレートである。

【0031】

立体遮蔽がなされるのに特に好適な試薬は、加水分解後に中性のジオールＮ基が生成されるメタクリル酸グリシジルである。この目的のため、開始剤分子Ｔは、例えばシラン処理によって適用され得る。この後、第１のモノマー、例えば、メタクリル酸Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルを支持体上で、例えばＡＴＲＰによって重合させる。第２の重合工程では、次いで、この基を立体遮蔽する。これは、例えば、モノマーを充分反応させた後、第２のモノマー、例えば、加水分解後に中性のジオールＮ基が生成されるメタクリル酸グリシジルを導入することによりなされ得る。該立体効果により、核酸とＡ基の密接な接触が抑制され、その結果、後者はあまり強く結合されず、低イオン強度で、したがって低塩濃度で核酸結合相から溶出され得る。

【0032】

また、Ｎ基の立体遮蔽は、「バルキー」な置換基によってもなされ得、挙げられる得る該置換基の一例は、分枝アルキル原子団、例えば、イソプロピル、ジイソプロピル、第３級ブチル、脂肪族または芳香族環（炭素環として、もしくは複素環としてのいずれも）である。また、このような立体阻害性のＮ基も、オリゴマー／ポリマーの形態で使用され得る。

【0033】

したがって、立体遮蔽は、特に、（ｉ）さらに導入されるＮ基の比率；（ｉｉ）Ｎ基を担持する化合物の合成；（ｉｉｉ）Ｎ基の選択および構造、ならびに（ｉｖ）Ｎ基を有するオリゴマー／ポリマーの鎖長によって制御され得る。

【0034】

したがって、Ａ基（１つまたは複数）は、同じリガンド内に存在しているか、または近接して配置されたＮ基によって特に良好に遮蔽され得る。また、Ａ基に結合させることも可能である。立体遮蔽は、Ｎ基（１つまたは複数）を有する化合物の大きさの増大、また、Ｎ基の大きさの増大の関数として増大し、鎖長の増大および炭素鎖の高い分枝性または環状基の環の大きさの増大は、ともに立体遮蔽を増大させる。

【0035】

特定の一実施形態では、支持材を、上記のすべての連結ストラテジーの組合せを用いて修飾する。一例を図４に示す。したがって、支持材は、Ａ基、立体遮蔽性のＮ基および開始剤分子Ｔが互いに直接連結されたものであり得、前記開始剤分子は、さらなる立体遮蔽性のＮ基を備えている（例えば、図４Ａを参照のこと）。この型の連結は、例えば、通常のＮ基を用いて行なわれ得る（例えば、図４Ｂを参照のこと）。さらに、支持材は、例えば、Ａ基を備えており（直接または開始剤分子Ｔを介して結合）、Ｎ基とＡ基が連結された混合物を担持しており、Ｎ基の全部または一部が立体阻害性基であるものであってもよい（図４Ｄおよび４Ｅを参照のこと）。

【0036】

本出願書類のさらなる一態様によれば、該方法は、支持材を有し、かつＡ基で修飾された核酸結合相を用いて行なわれ、該支持材は、一部のみがＡ基で占有されており、これは、提供される核酸結合基が通常よりも相当少ないことを意味する。したがって、支持材の単位面積あたり、および／または支持材の１グラムあたりに存在する核酸結合性のＡ基が少なくなることにより、核酸の結合強度が先の連結ストラテジーと同程度に低減される。図５は、この概念の一実施形態を示す。
したがって、この実施形態でも、特に、核酸結合相からの核酸の溶出に低塩濃度が使用され得るため、前記核酸のさらなる処理過程を直接行なうことが可能な条件下で核酸を溶出させることが可能である。

【0037】

支持材上のＡ基の本発明による準化学量論量は、支持材に対して準化学量論量のＡ基導入化合物を用いることにより得られ得る。また、支持材が有するＡ基を結合させ得る潜在的結合部位の量を少なくすることも考えられ得る。さらなる一実施形態としては、結合部位の減少または前記結合部位の反応性の低減を引き起こす支持材の化学的または物理的前処理が挙げられる。可能な択一的ストラテジーは、Ａ基担持化合物を、同様にその支持材に結合する別の化合物との混合物にて適用することである。この競合性結合により、支持材の表面上のＡ基の比率が低減される。

【0038】

準化学量論量のＡ基に基づく実施形態を、さらに、Ａ基とＮ基での支持材修飾のために上記の１つ以上の実施形態と組み合わせてもよい。

【0039】

準化学量論量のＡ基を有する支持体を提供することは、シリカ支持材が使用される場合、後者がシラノール基を有するため特に好都合である。Ａ基は、好ましくはシランまたはシラン混合物によって導入する。支持体の完全な被覆に必要とされるシランは最小量である。この最小量は、支持材の具体的な表面によって規定される。シラン（１種類または複数種）の量が支持体表面の占有に不充分な場合、電荷密度を下げるとよい。したがって、Ａ基の量、結果として核酸結合相の結合強度は、適用されるシランの量によって調整され得る。

【0040】

一実施形態によれば、支持材は、Ａ基を有するシランでコートされたシリカ表面を有し、シランの量は０．１〜５０μｍｏｌ（マイクロモル、本明細書ではｕｍｏｌとも称する）、好ましくは０．１〜１０ｕｍｏｌである。シランの量を、溶出が比較的低いイオン強度または比較的低い（所望の）塩濃度で可能であるほど大きく低減させることは重要である。これは、例えば、実験によって試験し、クロマトグラムによって確認することができる。したがって、シランの量は、好ましくは、所望の結合特性／溶出特性を得るために、使用される支持材に応じて最適化され得る。

【0041】

核酸結合相は、好ましくは固相である。これは、例えば、Ａ基、結合減弱性のＮ基、および開始剤分子Ｔ（存在する場合）を固相支持材に結合させることにより調製され得る。詳細を以下に説明する。固相を用いると、結合された核酸を試料から除去することが容易になる。したがって、一実施形態によれば、核酸の結合の後に、固相または未結合浮遊物を除去する。

【0042】

該核酸結合基に適した支持体の例は、酸化物材料である。これは、特に、Ａｌ_２Ｏ_３、ＴｉＯ_２、ＺｒＯ_２、Ｔａ_２Ｏ_５、ＳｉＯ_２およびポリケイ酸などの酸化物であり、好ましい支持材はＳｉＯ_２またはポリケイ酸である。また、ポリスチレンおよびその誘導体、ポリアクリレートおよびポリメタクリレート、ならびにその誘導体、またはポリウレタン、ナイロン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリブチリデン、ならびにこれらの材料のコポリマーなどの有機ポリマーも好適な支持体である。また、このような核酸結合基を、多糖類、特に、ヒドロゲル、例えば、アガロース、セルロース、デキストラン、セファデックス、セファクリルおよびキトサンに連結させてもよい。さらに、核酸結合基を、無機系支持体（例えば、ガラスなど）または金属表面（例えば、金など）に結合させてもよい。磁性粒子の使用は特に好都合である。核酸結合性のＡ基および／またはＮ基は、このような支持体に、直接結合させてもよく、あるいは他の化学分子（例えば、開始剤分子もしくはリンカー）を介して結合させてもよい。また、大きな分子の一部分であってもよく、支持材が結合部位としての適当な官能基を有していない場合、それ自体は既知の様式にて導入され得る。

【0043】

支持材のさらなる実施形態は、非磁性および磁性の粒子、カラム材料、膜、ならびに表面コーティングを含む。また、官能性付与したチューブ、膜、不織布、紙、反応槽（ＰＣＲ槽など）、「エッペンドルフチューブ」、マルチプレート、チップおよびマイクロアレイなどの支持体も挙げられよう。

【0044】

一実施形態によれば、該核酸結合相は、結合中および溶出中、どちらも正電荷を有する。

【0045】

本発明のさらなる一実施形態は、核酸に、本発明による原理に従って可逆的に結合する可溶性核酸結合相に関する。可溶性ポリマーは、Ａ基とＮ基を、例えば、交互またはランダムに有するものであり得る（例えば図２Ｂ参照）。また、Ａ基の側鎖をＮ基、特にアルキル原子団（挙げられ得る一例は、窒素上のジイソプロピル原子団である）によって遮蔽することも可能である。支持材に関する記載内容は、相応して可溶性核酸結合相に適用される。

【0046】

一実施形態によれば、核酸結合性のＡ基はイオン交換体、好ましくはアニオン交換体である。核酸の結合において実証された好ましいＡ基はアミノ基であり、第１級、第２級および第３級アミノ基が好ましい。これらは、置換されていても非置換であってもよい。また、環状アミン、芳香族アミンまたはアミノ官能性付与された複素環も使用され得る。該アミンは、置換基、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニルまたは芳香族置換基を有するものであってもよく、また、該炭化水素鎖は、環状になった閉鎖型であってもよい。また、該炭化水素鎖は、ヘテロ原子（酸素、窒素、イオウもしくはケイ素など）、または分枝構造を有するものであってもよい。記載のように、Ａ基としてのアミノ基は、８〜１３、好ましくは９〜１３、特に好ましくは１０〜１２のｐＫａを有する。

【0047】

Ａ基は、重合または縮合によってオリゴマーまたはポリマーを形成し、したがって、リガンドの形成に特に好適な化合物の一部分であってもよい。かかる鎖形成性化合物の例は、アミノ基を含むアクリレート、例えば、
Ｎ−（３−アミノメチル）メタクリルアミド、Ｎ−（３−アミノエチル）メタクリルアミド、
Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド、Ｎ−（３−アミノイソプロピル）メタクリルアミド、
Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアクリルアミド、
Ｎ，Ｎ−（ジメチルアミノ）エチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−（ジメチルアミノ）エチルアクリレート、
Ｎ，Ｎ−（ジメチルアミノ）エチルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート、
Ｎ，Ｎ−（ジメチルアミノ）プロピルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−（ジメチルアミノ）プロピルアクリレート、
Ｎ，Ｎ−（ジメチルアミノ）プロピルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−（ジメチルアミノ）プロピルメタクリレート、
Ｎ，Ｎ−（ジエチルアミノ）エチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−（ジエチルアミノ）エチルアクリレート、
Ｎ，Ｎ−（ジエチルアミノ）エチルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−（ジエチルアミノ）エチルメタクリレート、
Ｎ，Ｎ−（ジエチルアミノ）プロピルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−（ジエチルアミノ）プロピルアクリレート、
Ｎ，Ｎ−（ジエチルアミノ）プロピルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−（ジエチルアミノ）プロピルメタクリレート、
Ｎ，Ｎ−（ジイソプロピルアミノ）エチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−（ジイソプロピルアミノ）エチルアクリレート、
Ｎ，Ｎ−（ジイソプロピルアミノ）エチルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−（ジイソプロピルアミノ）エチルメタクリレート、
Ｎ，Ｎ−（ジイソプロピルアミノ）プロピルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−（ジイソプロピルアミノ）プロピルアクリレート、
Ｎ，Ｎ−（ジメチルアミノ）プロピルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−（ジメチルアミノ）プロピルメタクリレート、２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）および２−（ジイソプロピルアミノ）エチルメタクリレート
などである。

【0048】

これらのうち、Ｎ，Ｎ−（ジメチルアミノ）プロピルメタクリレートが特に好ましい。

【0049】

Ａ基は、シラン内、好ましくは反応性シラン内に存在するものであり得る。反応性シランは、加水分解不安定性のＳｉ結合、例えば、Ｓｉ−ＮまたはＳｉ−Ｏ結合を有する化合物をいう。少なくとも１つのＡ基を含む反応性シランの例は：

【0050】

【化2】

（式中
ｎは、１〜５であり、
Ｒは、Ｃ１〜Ｃ６、好ましくはＣ１〜Ｃ３アルキル基であり、
^＊は、アミノ、アミノメチル、アミノエチル、アミノプロピル、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジイソプロピルアミノ、ジプロピルアミノ、ジエタノールアミノ、ジプロパノールアミノ、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、エーテルアミン、ポリエーテルアミン、４−ジイソブチルアミノ−１−ブタン、６−ジプロピルアミノ−１−ヘキサンである）
である。

【0051】

対応する反応性シランが、Ａ基の導入に使用され得る。特に好ましいものは、ジエチルアミノプロピルトリメトキシシラン（ＤＥＡＰＳ）、ジメチルアミノプロピルトリメトキシシランおよびＮ，Ｎ−ジイソプロピルアミノプロピルトリメトキシシランである。

【0052】

本発明の一実施形態によれば、核酸は、２〜８、好ましくは４〜７．５のｐＨで結合させる。これは、結合中、したがって試料中のｐＨをいう。したがって、核酸結合相の設計によるが、本発明による方法はまた、非常に穏やかな条件下で、実質的に中性の範囲で行なわれ得る。核酸結合相のプロトン化性基が８〜１３、好ましくは９〜１３、特に好ましくは１０〜１２のｐＫａを有することにより、該相は、比較的中性のｐＨであっても、有効な核酸結合を可能にするための充分な正電荷を有する。その結果、結合は、所望により非常に穏やかな条件下で行なわれ得る。

【0053】

出発材料によるが、核酸を放出させるための少なくとも１回の通常の溶解工程が結合させる工程の前に行なわれ得る。

【0054】

核酸の溶出は、本発明の方法の別の重要な工程である。記載のように、核酸は、結合ｐＨより高いｐＨで放出させる。この結果として、溶出中、Ａ基が有する正電荷が少なくなり、これは核酸の放出に有利である。慣用的なアニオン交換体と比べ、Ａ基の低比率および／または結合減弱性のＮ基の存在により、支持材に対する核酸の結合の低減がもたらされる。この結果として、上記のように、溶出も低塩濃度で行なうことが可能である。

【0055】

溶出ｐＨは、好ましくはＡ基のｐＫより低い。使用される核酸結合性のＡ基または核酸結合相によるが、溶出は、好ましくは８〜１１、８〜１０のｐＨで、好ましくは８．０〜９、特に好ましくは８．５〜９のｐＨで行なわれる。しかしながら、原理的には、より高いｐＨ値を使用することも可能である。しかしながら、低塩濃度にもかかわらず核酸が放出され得、さらに条件が穏やかであるため、好ましい低ｐＨ値により特に好都合な結果が得られる。

【0056】

単離された核酸の処理過程を、引き続いて直接、溶出バッファー中で行なうことを可能にするため、後者は、記載のように、好ましくは低塩濃度を有するものである。これは、本発明による核酸結合相の設計によって可能になる。したがって、一実施形態によれば、塩濃度は１ｍＭ〜１０００ｍＭ、特に好ましくは１ｍＭ〜２００ｍＭ、１ｍＭ〜２５０ｍＭ、または１ｍＭ〜１００ｍＭである。好適な塩は、アルカリ金属およびアルカリ土類金属またはアンモニアの塩化物、無機酸の他の塩、酢酸塩、ホウ酸塩、ならびにＴｒｉｓ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓおよび有機バッファー（例えば、ＭＩＳ、ＣＨＡＰＳ、ＨＥＰＥＳなど）などの化合物などであり得る。同じものが結合バッファーに適用される。さらに、溶出のための好適な物質は先行技術において知られている。塩濃度は結合させる工程と溶出させる工程で変更しないか、または溶出中でわずかに上昇させる。しかしながら、好ましくは、該濃度は、後続する反応を障害するような様式では増大させない。さらに、結合中と溶出中の温度は同じであってもよく、あるいは溶出中で上昇させる。

【0057】

精製を助長するため、好ましくは、核酸の結合後、溶出の前に少なくとも１回の洗浄工程を行なう。低塩濃度を有する水溶液での洗浄が好ましいが、水での洗浄も好ましい。洗浄バッファー中に存在させる塩は、好ましくは１ｍＭ〜１０００ｍＭ、特に好ましくは１ｍＭ〜２００ｍＭ、１ｍＭ〜２５０ｍＭ、または１ｍＭ〜１００ｍＭの濃度である。バッファーは、有機化合物（糖質など）、好ましくは、有機溶媒（例えば、アルコール、ポリオール、ポリエチレングリコール、エーテル、ポリエーテル、ジメチルスルホキシド、アセトンまたはアセトニトリルなど）を含むものであり得る。しかしながら、下流での適用が障害されないようにするため、洗浄バッファーは、干渉量の対応有機成分を有しないものであるのがよい。

【0058】

使用され得る結合減弱性のＮ基は、電荷中性基、例えば、ヒドロキシル基、ジオール基、トリオール基、糖類、エポキシド基、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アルケンもしくはアルキン基、ポリオール基、エーテル、ポリエーテル、ハライドまたはイミドなどである。親水性のＮ基の使用により、水性バッファーでのイオン交換体の継続的に良好なぬれ性が確保される。Ｎ基は、重合または縮合によってオリゴマーまたはポリマーを形成する化合物の一部分であってもよい。Ｎ基を導入し得る化合物の例は、アクリレート、例えば、アクリル酸ブチル、アクリル酸プロピル、アクリル酸エチル、アクリル酸メチル、メタクリル酸グリシジル、メタクリル酸ヒドロキシエチル（ＨＥＭＡ）、メタクリル酸グリシドキシプロピル、グリセロールモノメタクリレート（異性体混合物）、グリコールモノメタクリレートおよびＮ−アクリルオキシスクシンイミドなどである。

【0059】

また、Ｎ基はシラン内、好ましくは反応性シラン内に存在するものであってもよい。Ｎ基を含む反応性シランの例は：

【0060】

【化3】

（式中
ｎは、１〜５であり、
Ｒは、Ｃ１〜Ｃ６、好ましくはＣ１〜Ｃ３アルキル基であり；
^＊は、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシプロピル、エタンジオール、プロパンジオール、プロパントリオール、ブタントリオール、３−グリシドオキシプロピル、エチルグリシジルエーテル、アルキル原子団、特に、Ｃ１〜Ｃ４アルキル原子団、ハライドまたは水素である）
である。

【0061】

一実施形態によれば、支持材は、少なくとも一部が、Ａ基および／またはＮ基を有する化合物で官能性付与された開始剤基Ｔを有する。好適な例は、本明細書において以下に詳細に説明する。

【0062】

さらに、本発明は、対応する核酸結合支持材の合成またはその調製方法に関する。この目的のためには、種々の実施形態がある。

【0063】

代替法（Ａ）：この方法は、少なくとも２種類の異なるリガンドＩとＩＩの混合物を用いて支持材に官能性付与することを含み、リガンドＩは少なくとも１つのＡ基を有し、リガンドＩＩは、少なくとも１つのＮ基を有するか、または少なくとも１つのＮ基である。この実施形態に関する詳細は、上記において既に説明した。上記の開示内容を参照されたい。

【0064】

代替法（Ｂ）：この方法は、第１の工程において、開始剤分子Ｔと、少なくとも１つのＡ基を有するリガンドとの混合物を用いて支持材に官能性付与することを含む。ここで、Ａ基を有する化合物は、さらなる分子は結合され得ないような様式で選択されたもの、または修飾されたものである。第２の工程では、次いで、少なくとも１つのＮ基を有し、開始剤分子Ｔに結合する化合物が添加される。

【0065】

代替法（Ｃ）：核酸結合リガンドでの支持材の官能性付与。前記のリガンドのそれぞれは、１つ以上のＡ基と１つ以上のＮ基とを有する。詳細は、本発明による方法に関して上記において説明している。第１の工程において、開始剤分子Ｔを支持材に結合させ、該分子を、少なくとも１つのＡ基および／または少なくとも１つのＮ基を有する化合物を添加し、前記化合物を開始剤分子Ｔに結合させてコポリマー鎖を伸長させるための開始点として使用することが好ましい。該ポリマー鎖は、少なくとも１つのＡ基および／または少なくとも１つのＮ基を有する化合物をさらに添加することにより伸長される。

【0066】

これに関連して、該重合工程はまた、Ａ基とＮ基の両方をオリゴマーによって組み込み、したがってブロックコポリマーが得られるような様式で制御してもよい。本発明に従って使用され得る重合反応の制御の一例は、例えば、「原子移動ラジカル重合」（ＡＴＲＰ）である。ＡＴＲＰは、遷移金属錯体を添加すること、およびオルガノハライドを伴う原子転移プロセスとの組合せにより、フリーラジカルの濃度を、不均衡または組換えなどの連鎖停止反応が大幅に抑制されるような程度まで低減させることを特徴とする。

【0067】

代替法（Ｄ）：Ａ基が、少なくとも１つのＮ基を有する化合物によって立体遮蔽されるＡ基とＮ基での支持材の官能性付与。この変形例の一実施形態によれば、支持材は、第１の工程において、開始剤基Ｔで官能性付与される。この後、少なくとも１つのＡ基を有する化合物を添加し、これを開始剤分子Ｔに結合させる。さらなる工程において、少なくとも１つのＮ基を有する少なくとも１種類の化合物が結合することにより、Ａ基が遮蔽される。Ｎ基は、その３次元構造によってＡ基を立体遮蔽するオリゴマー／ポリマー（上記参照）であることが好ましい。詳細は、本発明による方法に関して上記において説明している。

【0068】

代替法（Ｅ）：この実施形態によれば、支持材は、準化学量論量のＡ基で官能性付与される。この変形例は、上記において詳細に説明した。上記の開示内容を参照されたい。

【0069】

また、代替法Ａ〜Ｅは任意の組合せで使用され得る。核酸結合性のＡ基、Ｎ基および開始剤分子Ｔに関する詳細は、上記において詳細に説明しており、また、本明細書に示した支持体の修飾方法に関しても適用され、その場合に使用される成分の特徴を示す。上記の開示内容を参照されたい。

【0070】

Ａ基とＮ基で支持材に官能性付与する方法の一実施形態によれば、前記の基は、単官能性、二官能性もしくは三官能性の反応性シランによって、または異なる官能基を有する少なくとも２種類の反応性シランの混合物によって導入される。使用され得る反応性シランは、例えば、アミノシラン、ジシラザン、クロロシランまたはアルコキシシランである。Ｎ基に対するＡ基の比率は１％〜９９％、１〜５０％、好ましくは１％〜２５％である。

【0071】

三官能性および二官能性の反応性シランは、支持体上で、重縮合によって架橋された厚い層を形成する傾向にある。対照的に、単官能性の反応性シランは、例えば、支持材のシラノール基と反応してシロキサン（Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ）結合を形成し、支持体上に、むしろ単分子層をもたらす。支持材を反応性シランと、気相中または溶媒中での懸濁状態で反応させてもよく、後者においては、反応性シランの化学的性質に応じて有機溶媒、好ましくは水性溶媒を使用することが可能である。

【0072】

好適で好ましい支持材は、上記において詳細に説明した。該方法の一実施形態によれば、支持材を、まず開始剤分子Ｔで修飾した後、次の工程で、Ａ基および／またはＮ基をモノマーの形態で導入する。開始剤分子Ｔは、例えば、（重）縮合または重合、特に、フリーラジカル重合（特に、ＡＴＲＰ（原子移動ラジカル重合）など）によって導入されるさらなる化合物の結合部位として使用してもよい。開始剤分子Ｔの例は：

【0073】

【化4】

【0074】

【化5】

（式中、Ｘは、ハロゲン、特にＣｌ、Ｂｒ、Ｉであり、
Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３またはＹ４は、互いに独立して、Ｒ、ＯＲ、ＯＨまたはＨであり、
Ｒは、Ｃ１〜Ｃ３アルキルである）
である。

【0075】

２−（クロロメチル）アリルトリメトキシシランまたは［３−（２−ブロモイソブチリル）プロピル］エトキシジメチルシラン（ＢＰＤＳ）を開始剤分子として使用することが好ましい。

【0076】

本発明による方法に従ってＡ基および／またはＮ基を導入し得る反応性シランの例を以下に示す：

【0077】

【化6】

式中
ｎは、１〜５であり、
Ｒは、Ｃ１〜Ｃ６、好ましくはＣ１〜Ｃ３アルキル基、特に、メチル、エチル、プロピル、イソプロピルであり；
^＊は、アミノ、アミノメチル、アミノエチル、アミノプロピル、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジイソプロピルアミノ、ジプロピルアミノ、ジエタノールアミノ、ジプロパノールアミノ、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、エーテルアミン、ポリエーテルアミン、４−ジイソブチルアミノ−１−ブタン、６−ジプロピルアミノ−１−ヘキサン、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシプロピル、エタンジオール、プロパンジオール、プロパントリオール、ブタントリオール、３−グリシドオキシプロピル、エチルグリシジルエーテル、アルキル原子団、特に、Ｃ１〜Ｃ４アルキル原子団、特に、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ハライドまたは水素である。

【0078】

詳細に説明したシラン処理と準化学量論でのシラン処理の混合型の方法に加え、支持材上のＡ基の密度を規定の様式で調整できる可能性が他にもある。記載のように、例えば、支持材上で「表面開始グラフト重合（ｇｒａｆｔｉｎｇ−ｆｒｏｍ）」プロセスを行なうことが可能である。これは、例えば、上記に記載した原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）法によって行なわれ得る。この方法は、まず、開始剤基Ｔ、Ｎ基および／またはＡ基を支持体に、シラン処理によって適用することを含む。開始剤基Ｔは、この基によって表面開始グラフト重合プロセスが開始されるため（連鎖開始）、このプロセスには重要である。

【0079】

例えば、ハライド含有シランを使用し、ＡＴＲＰ（原子移動ラジカル重合）によって、ホモポリマー、コポリマーおよびブロックコポリマーを伸長させることができる。ＡＴＲＰは、リビング／制御フリーラジカル重合（ＬＦＲＰ）の特別な形態であり、これは、遷移金属錯体を添加すること、およびオルガノハライドを伴う原子転移プロセスとの組合せにより、フリーラジカルの濃度を、不均衡または組換えなどの連鎖停止反応が大幅に抑制されるような程度まで低減させることを含む。この方法により、支持体表面の電荷密度を、モノマーおよびモノマー混合物の使用によって特異的に調整し、それにより、核酸の結合強度に影響を及ぼすことが可能になる。Ａ基および／またはＮ基は、モノマーの適切な選択によって特異的に適用され得る。

【0080】

このようにして作製される核酸結合支持材は、特に、本発明による精製方法に使用され得る。

【0081】

さらに、本発明は、核酸を精製するための本発明による核酸結合相の使用に関する。本発明によれば、核酸は、特に、ＤＮＡおよびＲＮＡ、特にゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ならびにＰＣＲ断片、ｃＤＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、また、オリゴヌクレオチドおよび修飾核酸（例えば、ＰＭＡまたはＬＭＡなど）を含む。また、ウイルスもしくは細菌のＲＮＡおよびＤＮＡ、またはヒト、動物もしくは植物源由来の核酸を精製することも可能である。さらに、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドおよび修飾核酸も本発明による精製に適している。

【0082】

また、本発明は、少なくとも１つのプロトン化性基を有し、かつ８〜１３、好ましくは９〜１３、特に好ましくは１０〜１２のｐＫａを有する核酸結合性のＡ基を有する本発明による核酸結合支持材を有することを特徴とする、核酸を精製するためのキットを提供する。本発明による支持材およびその官能基に関する詳細は上記に記載している；上記の記載内容を参照されたい。

【0083】

また、キットは、例えば、精製方法に関して上記に記載の結合バッファー、洗浄バッファーおよび／または溶出バッファーを有するものであってもよい。また、溶解バッファーおよび中和バッファーを有するものであってもよい。

【0084】

一実施形態によれば、キットは、好ましくは以下の特徴：
（ａ）１〜１３のｐＨ；および／または
（ｂ）１ｍＭ〜１０００ｍＭ、特に好ましくは１ｍＭ〜２００ｍＭ、１ｍＭ〜２５０ｍＭ、または１ｍＭ〜１００ｍＭの塩濃度
の少なくとも１つを有する結合バッファーを有する。

【0085】

対応する特徴の利点は、方法に関して上記に説明しており、上記の開示内容を参照されたい。

【0086】

また、一実施形態によれば、キットは、好ましくは以下の特徴：
（ａ）２〜７、好ましくは４〜７のｐＨ；
および／または
（ｂ）１ｍＭ〜１０００ｍＭ、特に好ましくは１ｍＭ〜８００ｍＭ、１ｍＭ〜６００ｍＭの塩濃度；および／または
（ｃ）水、生物学的バッファー、有機バッファー、特に、Ｔｒｉｓ、Ｔｒｉｓ−Ｂｉｓ、ＭＩＳ、ＭＯＰＳ、ＣＨＡＰＳおよびＨＥＰＥＳからなる群より選択されること
の少なくとも１つを有する洗浄バッファーを有する。

【0087】

また、さらなる実施形態によれば、キットは、好ましくは以下の特徴：
（ａ）８〜１０、好ましくは８〜９のｐＨ
および／または
（ｂ）１ｍＭ〜１０００ｍＭ、特に好ましくは１ｍＭ〜２００ｍＭ、１ｍＭ〜２５０ｍＭ、または１ｍＭ〜１００ｍＭの塩濃度；および／または
（ｃ）水、生物学的バッファー、有機バッファー、特に、Ｔｒｉｓ、Ｔｒｉｓ−Ｂｉｓ、ＭＩＳ、ＭＯＰＳ、ＣＨＡＰＳおよびＨＥＰＥＳからなる群より選択されること
の少なくとも１つを有する溶出バッファーを有する。

【0088】

核酸結合相および溶出条件に関する詳細は上記に記載しており、本発明によるキットに関しても適用され、その場合に使用される成分／バッファーの特徴を示す。上記の開示内容を参照されたい。

【0089】

本発明によるキットは、特に、本発明による方法の枠内で適用され得る。本発明の方法、キットおよび核酸結合固相は、特に、分子生物学、分子診断、法医学、食品分析、および応用試験の分野において使用され得る。本発明によるキットの適用により、精製核酸を、「下流」適用、特にＰＣＲ反応において、さらに直接処理することが可能になる。

【0090】

記載のパラメータ、特に、溶出促進性結合減弱性のＮ基と核酸結合基の低減を選択／組み合わせることにより、核酸結合相のｐＨが溶出条件に関して最適化され得る。相応して、核酸結合相の溶出プロフィール、特に、塩濃度と溶出ｐＨが制御または調整され得る。

【0091】

本発明による系によって精製され得る核酸は、体液中（血液、尿、大便、唾液など）、生体源中、例えば、組織、細胞（特に、動物細胞、ヒト細胞、植物細胞、細菌細胞など）、器官（肝臓、腎臓または肺など）に存在するものであり得、また、核酸を、支持材（綿棒など）、ＰａｐＳｍｅａｒｓ、および安定化媒体（ＰｒｅＳｅｒｖＣｙｔもしくはＳｕｒｅｐａｔｈなど）、または他の液状物（例えば、搾汁、水性試料もしくは食品一般など）に由来する他のものから入手することも可能である。また、核酸は、植物材料、細菌溶解物、パラフィン包埋組織、水溶液またはゲルから得られるものであってもよい。

【0092】

溶出された核酸は、好ましくは、さらなる処理過程が直接行なわれるものであり得、したがって、例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、制限消化または転写に使用され得るものである。溶出バッファーが上記のように設計されている限り、好ましくは低塩濃度を有する限り、さらなる精製は必要とされない。

【実施例】

【0093】

本発明を、いくつかの実施例に基づいて以下に説明する。前記実施例は、本発明の限定ではなく、好ましい実施形態である。また、参考文献はすべて、本開示の主題に関して本明細書に挙げたものである。

【0094】

実施例
本実験では、プラスミドＤＮＡを核酸モデル系として使用した。

【0095】

Ａ） 隣接するＡ基とＮ基での支持材の修飾
Ａ．１） １：１のモル比２−（クロロメチル）アリルトリメトキシシランおよびＤＥＡＰＳでのシリカゲルのシラン処理（ＡＡＫ０１−１０）
材料
支持材：ほぼ１５０ｎｍの孔径を有するシリカ／シリカゲル。比表面積は、ほぼ２５ｍ^２／ｇである。

【0096】

コーティング試薬：２−（クロロメチル）アリルトリメトキシシラン、ＤＥＡＰＳ；ＱＳＰ１バッファー（酸性酢酸バッファー）。

【0097】

調製プロトコル
三つ口フラスコに、７０ｍｌの水、２．５ｍｌのＱＳＰ１バッファー（ＱＩＡＧＥＮ）、３２２μｌの２−（クロロメチル）アリルトリメトキシシランおよび４１３μｌのＤＥＡＰＳを仕込み（ｐＨは５．３となった）、次いで、１８ｇのシリカゲルを添加した。混合物を攪拌しながら９５℃まで２０分間以内で加熱し、この温度でさらに４時間攪拌し、次いで、攪拌しながら１時間冷却した。シリカゲルをＰ３ガラスフリットによって除去し、逐次、３２．３ｇのＴｒｉｓ／ＮａＣｌバッファー、３０ｍｌの脱イオン水で２回、３５ｍｌのメタノールで２回、最後に３０ｍｌのメタノールで洗浄した。最終支持材ＡＡＫ０１−１０を１２５℃で一晩乾燥させた。

【0098】

比較のため、同じ支持材を、Ａ基を有する化合物ＤＥＡＰＳのみで修飾した。三つ口フラスコに、７０ｍｌの水、２．５ｍｌのＱＳＰ１バッファー、８２５μｌのＤＥＡＰＳを仕込み（ｐＨは５．５となった）、次いで、１８ｇのシリカゲルを添加した。混合物を攪拌しながら９５℃まで２０分間以内で加熱し、この温度でさらに４時間攪拌し、次いで、攪拌しながら１時間冷却した。シリカゲルをＰ３ガラスフリットによって除去し、逐次、３２．３ｇのＴｒｉｓ／ＮａＣｌバッファー、３０ｍｌの脱イオン水で２回、３５ｍｌのメタノールで２回、最後に３０ｍｌのメタノールでで洗浄した。最終支持材ＡＡＫ０１−３０を１２５℃で一晩乾燥させた。

【0099】

溶出点の測定を伴う修飾支持材ＡＡＫ０１−１０を用いたプラスミドＤＮＡの精製
結合は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１５％エタノールのバッファー中で行なった。溶出は、バッファーＢ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０），１５％エタノール，２Ｍ ＮａＣｌ）の０％〜１００％の段階的勾配の２３分間にわたる流動、およびＵＶ分光法による連続的な溶出ＤＮＡの量の測定を伴った。有意な量のＤＮＡが最初に溶出されたＮａＣｌ濃度を溶出点として記録した。ここでは、Ｎ基の導入により、溶出点が有意に低下することが示された。

【0100】

プロトン化性のＡ基（ＤＥＡＰＳ）のみでコートした支持材（ＡＡＫ０１−３０）は、ｐＨ７．０で１６００ｍＭ ＮａＣｌに溶出点を示す。したがって、核酸の溶出には、かなり高い塩濃度が必要とされる。混合型Ａ／Ｎ修飾シリカゲルＡＡＫ０１−１０の溶出点は、約７００ｍＭ ＮａＣｌである。したがって、溶出に必要とされるイオン強度は５０％より大きく低下した。

【0101】

Ａ．２）メタクリル酸ヒドロキシエチル（ＨＥＭＡ）でのＡ／Ｎ修飾シリカゲルシラン処理（ＡＡＫ０１−１１）
材料
出発材料：修飾シリカゲルＡＡＫ０１−１０（プロトコルＡ．１を参照のこと）
コーティング試薬：メタクリル酸ヒドロキシエチル（ＨＥＭＡ）
調製プロトコル
ＨＥＭＡオリゴマーを、Ｃｕ（Ｉ）触媒型原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）の補助により、事前に結合させたクロロシラン上で合成する。

【0102】

反応フラスコ内で、先にＡｌ_２Ｏ_３によって活性化させておいた２０ｍｌのＨＥＭＡと、２０ｍｌの脱イオン水を、アルゴンで３０分間リンス処理し、次いで、６８ｍｇのＣｕＣｌ_２、４６ｍｇのＣｕＢｒ_２および３１３ｍｇのビスピリジンと混合し、混合後、１０ｇのＡＡＫ０１−２０を添加する。混合物を室温で４時間攪拌し、その直後、Ｐ３ガラスフリットによって吸引しながら濾別する。ガラスフリット上の物質を、まず、１００ｍＭ
ＮａＣｌ／１００ｍＭ ＥＤＴＡバッファーで数回洗浄し、次いで、ＶＥ水で数回洗浄し、８ｍｌのメタノールで１回、７ｍｌのメタノールで２回洗浄する。最終支持材ＡＡＫ０１−１１を６０℃で１４時間乾燥させた。

【0103】

比較のため、ＤＥＡＰＳ修飾支持材ＡＡＫ０１−３０をＨＥＭＡと反応させ、同様に処理した。この反応の最終生成物をＡＡＫ０１−３１と命名した。官能基としてＤＥＡＰＳは第３級アミンのみを有し、重合性アリル基は有しないため、ＨＥＭＡカップリングはないはずである。

【0104】

溶出点の測定を伴う修飾支持材ＡＡＫ０１−１１を用いたプラスミドＤＮＡの精製
実験は、Ａ．１に記載のようにして行なった。プロトン化性基（ＤＥＡＰＳ）のみでコートした支持材ＡＡＫ０１−３１は、ｐＨ７．０で１５００ｍＭ ＮａＣｌに溶出点を示す。したがって、核酸の溶出には、かなり高い塩濃度が必要とされる。ＨＥＭＡ修飾シリカゲルＡＫ０１−１１の溶出点は約４００ｍＭ ＮａＣｌである。したがって、溶出に必要とされるイオン強度は、ほぼ７５％低下した。

【0105】

Ａ．３）種々のモル比のシランでのシリカビーズのシラン処理
ａ）ＦＦシリカビーズ
以下の実験設定を選択した。使用した支持材はＦＦシリカビーズであった。

【0106】

【表1】

^＊：溶出バッファーの組成：２０ｍＭ 塩化カリウム；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ水溶液，ｐＨＸに調整；
^＊＊：ＱＮバッファーの組成：１６００ｍＭ 塩化ナトリウム；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ１５％エタノール水溶液，ｐＨ７に調整
結果を図６に示す。
ｂ）ＭａｇＡｔｔｒａｃｔ Ｂｅａｄｓ Ｇ（ＱＩＡＧＥＮ）
以下の実験設定を選択した。使用した支持材は、磁性シリカビーズであるＭａｇＡｔｔｒａｃｔ Ｂｅａｄｓ Ｇ（ＱＩＡＧＥＮ製）であった。

【0107】

【表2】

^＊：溶出バッファーの組成：２０ｍＭ 塩化カリウム；水中５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨＸに調整；
^＊＊：ＱＮバッファーの組成：１６００ｍＭ 塩化ナトリウム；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ１５％エタノール水溶液，ｐＨ７に調整．
結果を図７に示す。

【0108】

Ｂ） 開始剤分子での支持材の修飾
本発明によるランダムおよび／またはブロック（コ）ポリマーは、まず、開始剤基Ｔを適切な支持材に、本明細書において以下に一例として示すようにして適用することにより調製する。次いで、前記開始剤基を、後続の工程においてＡ基および／またはＮ基のリガンド／ポリマー鎖を適用する開始点として使用する。

【0109】

Ｂ．１）シリカゲル上での［３−（２−ブロモイソブチリル）プロピル］エトキシジメチルシランのシラン処理
材料
支持材：シリカゲル（Ｆｕｊｉ ＭＢ １５００−４０／７５／ロット：ＨＴ７０５９４）
コーティング試薬：［３−（２−ブロモイソブチリル）プロピル］エトキシジメチルシラン（ＢＰＤＳ）
シランの量：８００μｍｏｌ／ｇの支持材
調製プロトコル
還流冷却器および排水器を備えた２５０ｍｌ容ＫＰＧ攪拌器（乾燥）に、まず、１０．０ｇの支持材、２００ｍｌの乾燥シクロヘキサンおよび２４９０ｍｇの［３−（２−ブロモイソブチリル）プロピル］エトキシジメチルシランを仕込んだ。

【0110】

混合物を、攪拌しながら（１００ｌ／分）８５℃（油浴温度）で一晩（１６時間）反応させた。次いで油浴を除き、懸濁液を、攪拌しながら１／２時間以内で冷却した。修飾支持材／シリカゲル開始剤（ＫＩ０４）をＰ３フリットによって除去し、その上面を７×２０ｍｌのヘキサンで洗浄した。次いで、修飾支持材を、４０℃の真空乾燥キャビネット内で、一晩（ほぼ１２時間）乾燥させた。

【0111】

５つのロットのシリカゲル開始剤（ＫＩ ０４ ａ〜ｅ）を、上記の調製プロトコルに従って調製し、後続の工程で本発明の弱いイオン交換体を調製するための開始点として使用した。

【0112】

Ｃ）ＡＴＲＰによる弱いイオン交換体の調製
本発明の弱いイオン交換体は、Ａ基および／またはＮ基のランダムポリマー鎖を、出発材料である開始剤基Ｔ（ＫＩ０４）担持修飾支持材上で伸長させることにより調製した。

【0113】

Ｃ．１）Ｂ．１に記載の修飾支持材／シリカゲル開始剤上へのＡ基／Ｎのランダムポリマーのグラフト化
この実験の組の出発材料は、開始剤としてＢＰＤＳを有するシリカゲル開始剤（ＫＩ０４ｄ）とした。

【0114】

このために、モノマーＤＭＡＥＭＡ（２−ジメチルアミノ）エチルメタクリレート／Ａ基）およびＨＥＭＡ（メタクリル酸ヒドロキシエチル／Ｎ基）を、互いに以下の比で適用した：
ＤＭＡＥＭＡ：ＨＥＭＡ
１００：０ T １６．０ｍｍｏｌ：０．０ｍｍｏｌ（ＫＩ０４ｄ−０１）
５０：５０ T ８．０ｍｍｏｌ：８．０ｍｍｏｌ（ＫＩ０４ｄ−０３）
３０：７０ T ４．８ｍｍｏｌ：１１．２ｍｍｏｌ（ＫＩ０４ｄ−０４）
２０：８０ T ３．２ｍｍｏｌ：１２．８ｍｍｏｌ（ＫＩ０４ｄ−０５）
１０：９０ T １．６ｍｍｏｌ：１４．４ｍｍｏｌ（ＫＩ０４ｄ−０７）
材料
シリカゲル開始剤：ＫＩ０４ｄ
モノマー：ＤＭＡＥＭＡおよびＨＥＭＡ
リガンド：０．９６ｍｍｏｌの２，２’−ビピリジル（ｂｄｙ）
銅塩：０．４８ｍｍｏｌの臭化銅Ｉ（精製済）
溶媒：３６ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）
開始剤：Ｃｕ（Ｉ）：リガンド比＝１：４：８
開始剤：モノマー（１種類または複数種）比＝１：１３３
調製プロトコル
ＫＰＧ攪拌器（ガラス製ガイドスリーブ）、アルゴン接続口および計泡器（またはダイヤフラムポンプへの接続口）を備えた１００ｍｌ容三つ口フラスコに、まず、１５０ｍｇのｂｄｙと６８．８ｍｇの臭化銅Ｉを仕込んだ。

【0115】

装置内を、ダイヤフラムポンプによって１分間真空にし、次いでアルゴンで満たした。この手順を３回行なった。続いて、空気中の酸素が入るのを抑制するために、緩徐なアルゴン流を装置内に永続的に通した。

【0116】

並行して、３６ｍｌのＤＭＦ（リガンド）およびモノマーを脱気した。

【0117】

次いで、これらの液体を、調製物に応じて以下の初期重量比を有するモノマーと共に、排水器を備えた二つ口フラスコ内に導入した。

【0118】

ＫＩ０４ｄ−０１＝２７００μｌのＤＭＡＥＭＡ：０．０μｌのＨＥＭＡ
ＫＩ０４ｄ−０３＝１３５０μｌのＤＭＡＥＭＡ：９７２μｌのＨＥＭＡ
ＫＩ０４ｄ−０４＝８１０μｌのＤＭＡＥＭＡ：１３６０μｌのＨＥＭＡ
ＫＩ０４ｄ−０５＝５４０μｌのＤＭＡＥＭＡ：１５５５μｌのＨＥＭＡ
ＫＩ０４ｄ−０７＝２７０μｌのＤＭＡＥＭＡ：１７５０μｌのＨＥＭＡ
リガンドとモノマー（１種類または複数種）の混合物を、まず、超音波浴内で５分間処理した後、ガス空間を高真空下で５分間真空にした。

【0119】

リガンド−モノマー混合物をピペット使用により、先で導入したｂｄｙ／臭化銅Ｉに添加した。装置内をダイヤフラムポンプによって１分間真空にし、次いでアルゴンで満たした。この手順を３回行なった。この後、装置内に永続的に緩徐なアルゴン流を通した。

【0120】

銅リガンド錯体を、攪拌しながら（２００ｌ／分）１５分間以内で溶解させた。この後、１．２ｇのＫＩ ０４ｄシリカゲル開始剤を添加した。

【0121】

装置内をダイヤフラムポンプによって１分間真空にし、次いでアルゴンで満たした。この手順を３回行なった。続いて、装置内に緩徐なアルゴン流を永続的に通した。

【0122】

混合物を４０℃（油浴温度）で４時間攪拌した（２００ｌ／分）。

【0123】

上面に該基が伸長した支持材（以下、本明細書において単にシリカゲルと記載する）を、Ｐ３フリットによって直ちに取り出し、続いて、逐次、
５×８ｍｌのＤＭＦ
５×８ｍｌのＴＨＦ
５×８ｍｌの０．１Ｍ ＥＤＴＡ／酢酸バッファー（ｐＨ３．６）（氷酢酸を含む０．２Ｍ酢酸ナトリウム）
２×８ｍｌのＴｒｉｓ／ＮａＣｌバッファー（ｐＨ７．０）
３×８ｍｌの水および
３×８ｍｌのメタノール
で洗浄した。

【0124】

次いで、シリカゲルを、重量が一定になるまで、真空乾燥キャビネット内で４０℃にて乾燥させた。

【0125】

収率：
ＫＩ０４ｄ−０１＝１．３１ｇ
ＫＩ０４ｄ−０３＝１．２０ｇ
ＫＩ０４ｄ−０４＝１．２３ｇ
ＫＩ０４ｄ−０５＝１．２９ｇ
ＫＩ０４ｄ−０７＝１．２１ｇ
得られたアニオン交換体（修飾支持材、すなわちシリカゲル）および出発材料（シリカゲル開始剤）を、そのｐＤＮＡ結合能に関して試験し（これは、本明細書において以下により詳細に説明する）、対応する溶出プロフィールを記録した。

【0126】

また、アニオン交換体をＣＨＮの含有量について試験し、このポリマー鎖長から、Ｎに対するＡの比を求めた。使用したモノマーの（モル）質量比は、得られるシリカゲルに反映されることを示すことができた。

【0127】

溶出点の測定を伴う、修飾支持材ＫＩ０４ｄ−０１〜ＫＩ０４ｄ−０７を用いたプラスミドＤＮＡの精製

【0128】

【表3】

手順
単独の測定を、シリカゲル毎、および２種類の溶出バッファーのいずれかについて行なった。

【0129】

このために、各場合において、５０．００ｍｇ（±５ｍｇ）のシリカゲルを、エッペンドルフの２ｍｌ容Ｓａｆｅ Ｌｏｃｋ反応チューブ（以下、本明細書においてエッペンドルフチューブという）内に計り入れ、ＤＮＡ溶液のため、計量した各シリカゲルに対して１００μｇのｐｃｍｖｂを結合バッファーと混合して１ｍｌにした。

【0130】

続いて、１ｍｌのＤＮＡ溶液を、計量したシリカゲルの入った各エッペンドルフチューブに添加し、エッペンドルフチューブを密封し、短時間ボルテックスした。

【0131】

次いで、エッペンドルフチューブを、回転式（ｅｎｄ−ｏｖｅｒ−ｅｎｄ）振盪機内に中速度で５分間載置した。振盪後、エッペンドルフチューブを短時間遠心分離した。

【0132】

次いで、シリカゲル−ＤＮＡ懸濁液を、ピペットにより、切断先端を用いて、ボトムフリットを有する調製Ｔｉｐ ２０ブロック（以下、本明細書において、Ｔｉｐという）内に移した。Ｔｉｐの下方には、上清み収集のための２ｍｌ容エッペンドルフチューブを準備した。

【0133】

エッペンドルフチューブ内に生じ得る残留物質を捕捉するため、各場合において、該チューブを０．９ｍｌの結合バッファーでリンス処理し、該バッファーは、対応するＴｉｐにも同様に適用した。

【0134】

液体内部からの滴下が停止したら、残留液状物をすべて内部で押圧し、新たなエッペンドルフ収集チューブをＴｉｐカラムの下方に配置した。

【0135】

続いて、１ｍｌの洗浄バッファーを、洗浄のためにピペットで各Ｔｉｐ内に移した。液状物が内部から滴下しなくなったら、残留液状物をすべて内部で押圧し、エッペンドルフ収集チューブ（洗浄液が入っている）を脇に置き、新たなエッペンドルフ収集チューブをＴｉｐカラムの下方に配置した。

【0136】

続いて、１ｍｌの適切な溶出バッファーをピペットで各Ｔｉｐ内に移した。この場合も、液状物が内部から滴下しなくなったら、残留液状物をすべて内部で押圧し、エッペンドルフ収集チューブ（溶出液が入っている）を脇に置き、新たなエッペンドルフ収集チューブをＴｉｐカラムの下方に配置した。

【0137】

残留結合ＤＮＡを分離させるため、１ｍｌのＴｒｉｓ−ＮａＣｌバッファーをピペットで各Ｔｉｐ内に移した。液状物が内部から滴下しなくなったら、残留液状物をすべて内部で押圧し、エッペンドルフ収集チューブ（Ｔｒｉｓ−ＮａＣｌ溶液が入っている）を脇に置き、Ｔｉｐカラムを処分した。

【0138】

ＤＮＡ濃度をＳｐｅｃｔｒａＭａｘによって測定するため、各場合において、採取した１００μｌの溶液をＵＶプレートに移した。

【0139】

上清みのブランクを、１０μｌのＥＢバッファーと１８０μｌの結合バッファーを混合することにより調製した。１００μｌのこの溶液をＵＶプレート内に導入した。使用したＤＮＡの量の参照として、１００μｌのＤＮＡ溶液を９０μｌの結合バッファーと混合し、１００μｌのこの溶液をＵＶプレート内に導入した。

【0140】

溶出液に対して使用したブランクは、１００μｌの対応する溶出バッファーとした。

【0141】

１００μｌのＴｒｉｓ−ＮａＣｌバッファーを、Ｔｒｉｓ−ＮａＣｌ溶液ブランクとして使用した。

【0142】

有意な量のＤＮＡが最初に溶出されたＮａＣｌ濃度を溶出点として記録した。

【0143】

【表4】

この場合も、結果（上記の表に示し、図８に示したもの）により、Ｎ基の導入により溶出点が有意に低下することが示された。

【0144】

ｐＨ８．５では、Ａ基（ＤＭＡＥＭＡ）のみでコートした支持材／シリカゲル（ＫＩ０４ｄ−０１）での溶出点は、１０３２ｍＭ ＮａＣｌであった。したがって、核酸を溶出させるためには、かなり高い塩濃度が必要であった。混合型Ａ／Ｎ修飾シリカゲルＫＩ０４ｄ−０５の溶出点は、約５８０ｍＭ ＮａＣｌであった。したがって、溶出に必要とされるイオン強度はほぼ５０％低下した。

【0145】

Ｃ．２）Ｂ．１に記載の修飾支持材／シリカゲル開始剤上へのＡ基／Ｎ基のブロックポリマーのグラフティング
この実験の組の出発材料は、ＢＰＤＳを開始剤とするシリカゲル開始剤（ＫＩ０４ｅ）とした。

【0146】

この後、Ａ基の少なくとも１種類のモノマーのアミノポリマー鎖をグラフティングする第１の工程を行なった。そして、この後、このようにして調製したシリカゲルに、Ｎ基の少なくとも１種類のモノマー（好ましくは、ＨＥＭＡ）のポリマー鎖を適用する第２の工程を行なった。

【0147】

Ｃ．２．１）工程１
材料
シリカゲル開始剤：ＫＩ０４ｅ
モノマー：ＤＭＡＥＭＡ
リガンド：７．２ｍｍｏｌの２，２’−ビピリジル（ｂｄｙ）
銅塩：３．６ｍｍｏｌの臭化銅Ｉ（精製済）
溶媒：２７０ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）
開始剤：Ｃｕ（Ｉ）：リガンド比＝１：４：８
開始剤：モノマー比＝１：１３３
調製プロトコル
ＫＰＧ攪拌器（ガラス製ガイドスリーブ）、アルゴン接続口および計泡器（またはダイヤフラムポンプへの接続口）を備えた５００ｍｌ容三つ口フラスコに、まず、１１２５ｍｇのｂｄｙと５１６ｍｇの臭化銅Ｉを仕込んだ。

【0148】

装置内をダイヤフラムポンプによって１分間真空にし、次いでアルゴンで満たした。この手順を３回行なった。続いて、装置内に緩徐なアルゴン流を永続的に通した。

【0149】

並行して、２７０ｍｌのＤＭＦと２０．２５ｍｌのＤＭＡＥＭＡを脱気した。この目的のため、この２種類の液体を、排水器を備えた二つ口フラスコ内に導入した。混合物を、まず、超音波浴内で５分間処理し、この後、ガス空間を高真空下で５分間真空にした。

【0150】

ＤＭＦ−ＤＭＡＥＭＡ混合物を、ピペット使用によりｂｄｙ／臭化銅Ｉに添加した。

【0151】

装置内をダイヤフラムポンプによって１分間真空にし、次いでアルゴンで満たした。この手順を３回行なった。この後、装置内に永続的に緩徐なアルゴン流を通した。

【0152】

銅リガンド錯体を、攪拌しながら（２００ｌ／分）１５分間以内で溶解させた。この後、９ｇのＫＩ０４ｅシリカゲル開始剤を添加した。

【0153】

装置内をダイヤフラムポンプによって１分間真空にし、次いでアルゴンで満たした。この手順を３回行なった。続いて、装置内に緩徐なアルゴン流を永続的に通した。

【0154】

混合物を４０℃（油浴温度）で４時間攪拌した（２００ｌ／分）。

【0155】

上面にＡ基が伸長したＫＩ０４ｅ−０１シリカゲルを、Ｐ３フリットによって直ちに取り出し、続いて、逐次、
５×６０ｍｌのＤＭＦ
５×６０ｍｌのＴＨＦ
５×６０ｍｌの０．１ Ｍ ＥＤＴＡ／酢酸バッファー（ｐＨ３．６）（氷酢酸を含む０．２Ｍ酢酸ナトリウム）
２×６０ｍｌのＴｒｉｓ／ＮａＣｌバッファー（ｐＨ７．０）および
３×６０ｍｌの水
で洗浄した。

【0156】

次いで、ＫＩ０４ｅ−０１シリカゲルを、重量が一定になるまで、真空乾燥キャビネット内で４０℃にて乾燥させた。

【0157】

Ｃ．２．２）工程２
材料
シリカゲル開始剤：ＫＩ０４ｅ−０１
モノマー：ＨＥＭＡ
リガンド：０．９６ｍｍｏｌの２，２’−ビピリジル（ｂｄｙ）
銅塩：０．４８ｍｍｏｌの臭化銅Ｉ（精製済）
溶媒：３６ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）
開始剤：Ｃｕ（Ｉ）：リガンド比＝１：４：８
開始剤：モノマー比＝１：２００
調製プロトコル
ＫＰＧ攪拌器（ガラス製ガイドスリーブ）、アルゴン接続口および計泡器（またはダイヤフラムポンプへの接続口）を備えた１００ｍｌ容三つ口フラスコに、まず、１５０ｍｇのｂｄｙと６８．８ｍｇの臭化銅Ｉを仕込んだ。

【0158】

装置内をダイヤフラムポンプによって１分間真空にし、次いでアルゴンで満たした。この手順を３回行なった。続いて、空気中の酸素が入るのを抑制するために、装置内に緩徐なアルゴン流を永続的に通した。

【0159】

並行して、３６ｍｌのＤＭＦと２９１６μｌのＨＥＭＡを脱気した。この目的のため、この２種類の液体を、排水器を備えた二つ口フラスコ内に導入した。混合物を、まず、超音波浴内で５分間処理し、この後、ガス空間を高真空下で５分間真空にした。

【0160】

ＤＭＦ−ＨＥＭＡ混合物を、ピペット使用によりｂｄｙ／臭化銅Ｉに添加した。

【0161】

装置内をダイヤフラムポンプによって１分間真空にし、次いでアルゴンで満たした。この手順を３回行なった。この後、装置内に永続的に緩徐なアルゴン流を通した。

【0162】

銅リガンド錯体を、攪拌しながら（２００ｌ／分）１５分間以内で溶解させた。この後、１．２ｇのＫＩ０４ｅ−０１シリカゲル開始剤を添加した。

【0163】

装置内をダイヤフラムポンプによって１分間真空にし、次いでアルゴンで満たした。この手順を３回行なった。続いて、装置内に緩徐なアルゴン流を永続的に通した。

【0164】

混合物を、４０℃（油浴温度）で６時間攪拌した（２００ｌ／分）。

【0165】

上面にＡ基が伸長したＫＩ０４ｅ−０１−０１シリカゲルを、Ｐ３フリットによって直ちに取り出し、続いて、逐次、
５×８ｍｌのＤＭＦ
５×８ｍｌのＴＨＦ
５×８ｍｌの０．１ Ｍ ＥＤＴＡ／酢酸バッファー（ｐＨ３．６）（氷酢酸を含む０．２Ｍ酢酸ナトリウム）
２×８ｍｌのＴｒｉｓ／ＮａＣｌバッファー（ｐＨ７．０）
３×８ｍｌの水および
３×８ｍｌのメタノール
で洗浄した。

【0166】

次いで、ＫＩ０４ｅ−０１−０１シリカゲルを、重量が一定になるまで、真空乾燥キャビネット内で４０℃にて乾燥させた。

【0167】

このシリカゲルで行なった溶出実験により、Ｎ基モノマーのグラフトポリマー鎖もまた、核酸（１つまたは複数）の立体遮蔽に有意に寄与し得、それにより、前記核酸（１つまたは複数）の結合強度が有意に低下し得ることが実証され得る。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】