特許 6073775 グリオーマ形成阻害作用を有するｍｉｃｒｏＲＮＡ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6073775

(24)【登録日】2017年1月13日

(45)【発行日】2017年2月1日

(54)【発明の名称】グリオーマ形成阻害作用を有するｍｉｃｒｏＲＮＡ

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/7088 20060101AFI20170123BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20170123BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20170123BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20170123BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20170123BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20170123BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/7088ZNA

   A61K48/00

   C12Q1/02

   A61P35/00

   A61P25/00

   A61P43/00 105

【請求項の数】5

【全頁数】12

(21)【出願番号】特願2013-238279(P2013-238279)

(22)【出願日】2013年11月18日

(65)【公開番号】特開2015-98444(P2015-98444A)

(43)【公開日】2015年5月28日

【審査請求日】2015年12月17日

(73)【特許権者】

【識別番号】501002172

【氏名又は名称】株式会社ＤＮＡチップ研究所

(73)【特許権者】

【識別番号】504147254

【氏名又は名称】国立大学法人愛媛大学

(73)【特許権者】

【識別番号】513290071

【氏名又は名称】近藤 亨

(74)【代理人】

【識別番号】100104411

【弁理士】

【氏名又は名称】矢口 太郎

(72)【発明者】

【氏名】近藤 亨

(72)【発明者】

【氏名】的場 亮

(72)【発明者】

【氏名】大西 丘倫

(72)【発明者】

【氏名】山下 大介

(72)【発明者】

【氏名】大上 史朗

【審査官】 高橋 樹理

(56)【参考文献】

【文献】 Cancer，２０１１年，Vol.117(13)，pp.2842-2852

【文献】 Cancer Biology & Therapy，２０１３年 ９月，Vol.14(9)，pp.796-805

【文献】 Can. J. Neurol. Sci.，１９９７年，Vol.24，pp.3-15

【文献】 International Journal of Oncology，２０１２年，Vol.40，pp.1105-1112

【文献】 Genes & Cancer，２０１２年，Vol.3(1)，pp.3-15

【文献】 Molecular Targets of CNS Tumors，２０１１年，pp.343-362

【文献】 The International Journal of Biochemistry & Cell Biology，２０１２年，Vol.44，pp.1711-1717

【文献】 Journal of Experimental & Clinical Cancer Reserch，２０１２年，Vol.31(97)，pp.1-10

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３１／７０８８

Ａ６１Ｐ ３５／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

哺乳動物におけるＰＬＡＴの発現量を低下させるための医薬組成物であって、ｍｉＲ３４０またはその前駆体、またはそれらを発現するベクターを有するものである、組成物。

【請求項2】

請求項１記載の組成物において、前記ｍｉＲ３４０は配列ＩＤ番号１で示される配列を有するものである、組成物。

【請求項3】

請求項１記載の組成物において、前記ｍｉＲ３４０は配列ＩＤ番号２で示される配列を有するものである、組成物。

【請求項4】

哺乳動物におけるＰＬＡＴの発現量を低下させるための薬剤を製造するための、ｍｉＲ３４０またはその前駆体、またはそれらを発現するベクターの使用。

【請求項5】

グリオーマまたはグリオブラストーマの治療薬を同定する方法であって、
グリオーマまたはグリオブラストーマ細胞に試験剤を接触させる工程と、
前記グリオーマまたはグリオブラストーマ細胞中のＰＬＡＴの発現量を測定する工程と
を有し、対照細胞と比較して、前記グリオーマまたはグリオブラストーマ細胞中のＰＬＡＴの発現量の低下が、前記試験剤がグリオーマまたはグリオブラストーマの治療薬であることを示すものである、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、マイクロＲＮＡを利用した脳腫瘍治療薬に関する。また本発明は、脳腫瘍治療薬を同定するためのマイクロＲＮＡとその利用に関する。

【背景技術】

【0002】

グリオーマ（神経膠腫）は悪性腫瘍の一種であり、日本人における一般的な原発性脳腫瘍である。その中でも悪性グリオーマの治療については、手術での切除を基本とするものの、その悪性度に応じて放射線治療や化学療法を併用している。具体的には、悪性グリオーマはＷＨＯの基準に従って４つの悪性度（グレードＩ〜ＶＩ）に分類され、例えば小児の小脳に発生する毛様性星細胞腫などの最も悪性度の低いＷＨＯグレードＩでは手術のみの治療が選択される。また、ＷＨＯグレードＩＩ以上のグリオーマは手術による切除だけでは再発することが多いため、放射線や抗癌剤による化学療法や免疫療法などが併用される。特にＷＨＯグレードＶＩのグリオーマは膠芽腫と呼ばれ、脳腫瘍の中でも最も悪性度の高い腫瘍のひとつである。膠芽腫は治療が困難な疾患であり、手術だけでは大半が数ヶ月以内に再発するため、術後の放射線療法や化学療法が必須である。

【0003】

ところで、脳以外の他の組織の癌や腫瘍であれば外科的療法、放射線療法、化学療法等の治療により癌や腫瘍を取り除き治癒することが可能である。しかし、グリオーマは脳腫瘍であるため、それらのいずれの療法を適用するにしても、湿潤した腫瘍を完全に取り除こうとすれば、正常な細胞および脳自体の機能に多大な損傷を与えることになる。そのため、手術のみによる平均生存期間は短く、術後の残存腫瘍に対して補助療法として放射線治療や化学療法を併用したとしても、その効果は一過性であることが多い。したがって、グリオーマは治療の極めて困難な癌であるため、脳の機能に悪影響が少なく、且つグリオーマの増殖を抑制する治療薬が求められている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

本発明は、このような状況を鑑みてなされたものであり、脳腫瘍患者における脳の機能に悪影響が少なく、且つ脳腫瘍の増殖を抑制する治療薬を提供することを目的とする。

【0005】

本発明はまた、上記治療薬に用いられるマイクロＲＮＡを提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明者らは、ヒトおよびマウスのＧＩＣ（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ−ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ）、並びにヒト膠芽細胞腫組織において発現抑制されているマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ）が存在しているという知見を得、このマイクロＲＮＡが腫瘍抑制遺伝子として作用している可能性を得た。また、本発明者らは、このマイクロＲＮＡを過剰発現させるとＧＩＣの増殖および運動性を抑制するだけでなく、それらの腫瘍形成を予防するという報告から、このマイクロＲＮＡがグリオーマの増殖を抑制する治療薬となり得る可能性に着目した。

【0007】

そして、本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、このマイクロＲＮＡがその標的タンパク質（ＰＬＡＴ：ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ，ｔｉｓｓｕｅ）の発現を抑制することにより、腫瘍形成を間接的に抑制できることを見出した。

【0008】

具体的には、本発明の第一の主要な観点によれば、ｍｉＲ３４０またはその前駆体、またはそれらを発現するベクターを有する脳腫瘍治療薬が提供される。

【0009】

このような構成によれば、患者の脳機能に悪影響を与えることなく、薬剤を投与するだけで脳腫瘍の増殖を抑えることが可能となる。

【0010】

また、本発明の一実施形態によれば、前記ｍｉＲ３４０は配列ＩＤ番号１で示される配列を有するものである。

【0011】

また、本発明の他の一実施形態によれば、前記ｍｉＲ３４０は配列ＩＤ番号２で示される配列を有するものである。

【0012】

さらに、本発明の一実施形態において、前記脳腫瘍はグリオーマである。

【0013】

また、本発明の他の一実施形態によれば、前記ｍｉＲ３４０はＰＬＡＴの発現量を低下させることによって前記脳腫瘍を治療するものである。

【0014】

また、本発明の第二の主要な観点によれば、上記の治療薬と薬学的に許容可能な担体とを有する、脳腫瘍を治療するための医薬組成物が提供される。

【0015】

また、本発明の第三の主要な観点によれば、哺乳動物における脳腫瘍を治療するための薬剤を製造するための、ｍｉＲ３４０またはその前駆体、またはそれらを発現するベクターの使用が提供される。

【0016】

さらに、本発明の第四の主要な観点によれば、哺乳動物におけるＰＬＡＴの発現量を低下させるための医薬組成物であって、ｍｉＲ３４０またはその前駆体、またはそれらを発現するベクターを有するものである、組成物が提供される。

【0017】

また、本発明の第五の主要な観点によれば、脳腫瘍の治療薬を同定する方法であって、脳腫瘍細胞に試験剤を接触させる工程と、前記脳腫瘍細胞中のｍｉＲ３４０の発現量を測定する工程とを有し、対照細胞と比較して、前記脳腫瘍細胞中のｍｉＲ３４０の発現量の増加が、前記試験剤が脳腫瘍の治療薬であることを示すものである、方法が提供される。

【0018】

本発明の一実施形態によれば、この方法は、さらに、前記脳腫瘍細胞中のＰＬＡＴの発現量を測定する工程を有し、対照細胞と比較して、前記脳腫瘍細胞中のＰＬＡＴの発現量の低下が、前記試験剤が脳腫瘍の治療薬であることを示すものである。

【0019】

なお、上記した以外の本発明の特徴及び顕著な作用・効果は、次の発明の実施形態の項及び図面を参照することで、当業者にとって明確となる。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】図１は、本発明の一実施形態において、ｍｉＲ−３４０の発現がマウスおよびヒトのＧＩＣにおいて減少していることを示すグラフである。

【図2】図２は、本発明の一実施形態において、ｍｉＲ−３４０の過剰発現が細胞増殖、浸潤および遊走を阻害することを示す写真およびグラフである。

【図3】図３は、本発明の一実施形態において、ｍｉＲ−３４０の過剰発現がインビボでの腫瘍形成を阻害することを示す写真およびグラフである。

【図4】図４は、本発明の一実施形態において、ＰＬＡＴがｍｉＲ−３４０の標的であることを示す写真およびグラフである。

【発明を実施するための最良の形態】

【0021】

以下に、本願発明に係る一実施形態および実施例を、図面を参照して説明する。
本願発明に係る一実施形態において、脳腫瘍治療薬にはｍｉＲ３４０またはその前駆体、またはそれらを発現するベクターが用いられる。

【0022】

ここで、本実施形態において、「ｍｉＲ３４０」または「ｍｉＲ−３４０」はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ）の１種を指す。ｍｉＲＮＡは約２０〜約２５塩基のタンパク質非翻訳ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ）であり、ヒトには約１０００種類以上存在することが示唆されている。

【0023】

ｍｉＲＮＡは生体内で様々な遺伝子の発現抑制を行う分子として注目されている。ゲノム上には各ｍｉＲＮＡ遺伝子の領域が存在し、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって転写され、約数百塩基のｍｉＲＮＡ初期転写産物が形成される。ｍｉＲＮＡ初期転写産物は核内でＤｒｏｓｈａ、細胞質内でＤｉｃｅｒと呼ばれる２種類のＲＮａｓｅ ＩＩＩ酵素によってプロセシングされ、成熟ｍｉＲＮＡが形成される。成熟ｍｉＲＮＡは制御タンパク質複合体（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ：ＲＩＳＣ）と協調しつつ、相補的配列をもつ複数のターゲット遺伝子のｍＲＮＡと相互作用し、遺伝子の発現を抑制することが知られている。

【0024】

本願発明に係る治療薬では、「ｍｉＲ３４０」は脳腫瘍疾患、特にグリオーマを検出するバイオマーカとして、配列ＩＤ番号１および２のｍｉＲＮＡを使用することができる。ｍｉＲＮＡによる遺伝子発現調節において、ＲＩＳＣを構成するｍｉＲＮＡの５’側の８ヌクレオチドがｓｅｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅとよばれ、この配列が標的となるｍＲＮＡの３’−ＵＴＲ領域の配列を認識し、結合してタンパク質への翻訳を抑制する。従って、本願発明においては、ｍｉＲ３４０の全長配列である配列ＩＤ番号１および配列ＩＤ番号１の５’側の８ヌクレオチドである配列ＩＤ番号２も同様に使用することが可能となる。

【0025】

本願発明に係る治療薬では、ｍｉＲ３４０は、成熟型（ｍａｔｕｒｅ ｆｏｒｍ）であってもよく、前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）の状態であってもよい。

【0026】

本願発明において、ＰＬＡＴはｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ，ｔｉｓｓｕｅであり、ｐｌａｓｍｉｎを含めた機能因子の活性化を介して細胞外基質（フィブリン等）の分解、細胞運動能や細胞増殖を亢進し、血栓の融解・細胞移動・癌の転移に働く。

【0027】

本願発明における分子メカニズムは以下の通りである。すなわち、腫瘍細胞におけるｍｉＲ３４０は腫瘍形成に関連することが予想され、その機能の一部はＰＬＡＴを介して行われる。具体的には、ｍｉＲ３４０がＰＬＡＴの発現を調整し、このＰＬＡＴが腫瘍形成に関連する。ｍｉＲ３４０の発現が増加することによりＰＬＡＴの発現が低下し、腫瘍形成が抑えられると考えられる。

【0028】

本願発明の薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体と混合された治療薬を含む。また、本発明の薬学的組成物は、リポソームや薬学的に許容される担体によってカプセル化された少なくとも１つの治療薬を含むこともできる。薬学的に許容される担体としては、例えば、水、緩衝用水、生理食塩液、０．４重量％生理食塩水、０．３重量％グリシン、ヒアルロン酸等を挙げることができる。

【0029】

本願発明の薬学的組成物は、従来の薬学的賦形剤および／または添加剤を含んでもよい。賦形剤としては、例えば、安定剤、抗酸化剤、モル浸透圧調整剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤等を挙げることができる。また添加剤としては、例えば、生理的に生体適合性を有する緩衝剤（例えば、塩酸トロメタミン）、キレート剤（例えば、ＤＴＰＡやＤＴＰＡ‐ビスアミド）、カルシウムキレート錯体（例えば、カルシウムＤＴＰＡ、ＣａＮａＤＴＰＡ‐ビスアミド）の添加剤等を挙げることができる。

【0030】

本願発明において、ｍｉＲＮＡの発現を測定するための試料としては、脳腫瘍患者から採取したものであり脳腫瘍細胞を含む可能性がある試料であれば特に限定されない。例えば、血液試料（末梢血、血漿、血清など）、脳脊髄液、尿、リンパ液、唾液、その他の体液を利用することが可能である。また、このような試料はバイオプシーにより採取された病理組織由来の抽出成分も利用することが可能である。また、その試料の採取方法は、試料の種類等に応じて適宜選択することができ、試料からのＲＮＡの調製は、通常の公知の方法により行うことができる。

【0031】

また、ｍｉＲＮＡの発現量は、ｍｉＲＮＡと特異的にハイブリダイズするプローブ又はプライマーを用いて、ｍｉＲＮＡマイクロアレイ法、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法など公知の遺伝子発現量測定法に従い測定することができる。

【0032】

このようなプローブ及びプライマーは、ｍｉＲＮＡの塩基配列内の少なくとも１５塩基長〜全塩基長、好ましくは１８塩基長〜全塩基長の連続した塩基配列と特異的にハイブリダイズするように、公知のプローブまたはプライマー設計方法に従って上記各塩基長を有するポリヌクレオチドとして設計される。

【0033】

当該プローブは、各ｍｉＲＮＡと特異的にハイブリダイズするものであれば、完全に相補的である必要はない。かかるポリヌクレオチドとして、好ましくは各ｍｉＲＮＡの塩基配列において連続する少なくとも１５塩基以上の塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその相補ポリヌクレオチドと比較して、塩基配列において７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するポリヌクレオチドである。

【0034】

また、当該プローブ又はプライマーは、ｍｉＲＮＡを容易に検出できるように、慣用されている放射性物質、蛍光物質、化学発光物質、または酵素で標識されていてもよい。

【0035】

本願発明において、上述のようにして測定されたｍｉＲＮＡの発現量を用いて、脳腫瘍の治療薬を同定することが可能である。この場合、治療薬候補となる試験剤と脳腫瘍細胞とを接触させ、その後ｍｉＲ３４０の発現量を測定し、ｍｉＲ３４０の発現量が通常の状態よりも増加している場合には当該試験剤が脳腫瘍の治療薬として利用できる可能性が高いことを示す。

【0036】

同様に、脳腫瘍細胞のＰＬＡＴの発現量を測定し、ＰＬＡＴの発現量が通常の状態よりも低下している場合には当該試験剤が脳腫瘍の治療薬として利用できる可能性が高いことを示す。

【実施例】

【0037】

以下に、実施例を用いて、本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（実験手法および材料）
以下に、本発明において用いる実験手法および材料について説明する。なお、本実施形態において、以下の実験手法を用いているが、これら以外の実験手法を用いても、同様の結果を得ることができる。

【0038】

１．細胞培養
７つのヒトグリオーマサンプル（膠芽細胞腫株Ｅ１−５、未分化希突起グリオーマ（ＡＯ）株、およびびまん性星細胞腫（ＤＡ）株）を用いた。腫瘍サンプルは、Ｐａｐａｉｎ解離システムを用いて分離され、解離された細胞はヒト塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ；１０ｎＭ）、ヒト上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ；１０ｎＭ）、ヘパリン（５μＭ）、Ｎ２サプリメント（Ｗａｋｏ）、１０μｇ／ｍｌインスリン（Ｗａｋｏ）、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）サプリメント、１００ユニット／ｍｌペニシリンＧ、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシを含む無血清のダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）／Ｈａｍ’ｓＦ−１２（Ｗａｋｏ）において浮遊培養細胞塊として培養した。ＧＩＣをポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ、１５μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）およびフィブロネクチン（１μｇ／ｍｌ）で培養し、免疫染色用の８ウェルチャンバースライド（Ｎｕｎｃ）に播種した。ヒトのグリオーマ細胞株（Ｕ２５１およびＵ８７）、およびマウスＧＩＣ ＮＳＣＬ６１をＨｉｄｅ ａｎｄ Ｋｏｎｄｏ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００９に記載の方法に従って培養した。ヒト神経幹細胞（Ｈ９ヒト胚性幹細胞由来）を培養した。すべての実験において、細胞は３７℃、湿度５％ＣＯ_２／９５％空気に維持した。

【0039】

２．マイクロアレイハイブリダイゼーションおよびデータ処理
ＴＲＩｚｏｌ（登録商標） Ｐｌｕｓ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて細胞株およびグリオーマ組織から全ＲＮＡを抽出した。マイクロＲＮＡマイクロアレイはＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって製造され、ｍｉｃｒｏＲＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｋｉｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌを用いて１００ｎｇの全ＲＮＡにラベルし、ハイブリダイズし、Ｈｕｍａｎ ｍｉＲＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｒｅｌｅａｓｅ １６．０、またはＭｏｕｓｅ ｍｉＲＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｒｅｌｅａｓｅ １６．０に用いた。ハイブリダイゼーションシグナルはＤＮＡマイクロアレイスキャナ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で検出し、スキャンした画像はＡｇｉｌｅｎｔ ｆｅａｔｕｒｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して分析した。遺伝子発現分析のためトータルＲＮＡを増幅し、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｌｏｗ Ｉｎｐｕｔ Ｑｕｉｃｋ Ａｍｐ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ ｏｎｅ−ｃｏｌｏｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＣｙａｎｉｎｅ ３（Ｃｙ３）でラベルした。ラベルしたｃＲＮＡを断片化し、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｈｕｍａｎ ＧＥ ８ｘ６０Ｋ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙにハイブリダイズした。洗浄後、マイクロアレイをＡｇｉｌｅｎｔ ＤＮＡマイクロアレイ・スキャナを用いてスキャンした。スキャンした各特徴の強度を、バックグラウンド除去法を行うＡｇｉｌｅｎｔｆｅａｔｕｒｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて定量化した。Ａｇｉｌｅｎｔ ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸ ｖｅｒｓｉｏｎ １１．０．２を用いてノーマリゼーションした。ノーマリゼーション後、ユークリッド距離および平均結合方法（Ａｇｉｌｅｎｔ ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸ）を用いて、発現遺伝子（ＤＥＧｓ）で、階層的なサンプルのクラスタリングを行った。パスウェイ分析のため、ＧｅｎＭＡＰＰ ２．１（http://www.genmapp.org/）およびＣｏｎＰａｔｈ（登録商標）ナビゲータを使用した。

【0040】

３．リアルタイムＰＣＲ
Ｉｓｏｇｅｎ（Ｎｉｐｐｏｎ ｇｅｎｅ、日本）を用いて細胞株およびグリオーマ組織からトータルＲＮＡを抽出し、ＭＭＬＶ ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて逆転写した。ｍｉＲ−３４０の発現はＭｉｎｉＯｐｔｉｃｏｎ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＩＯ―ＲＡＤ）のＴａｑＭａｎ ｓｍａｌｌ ＲＮＡ ａｓｓａｙｓ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて分析した。ＰＬＡＴの発現はＭｉｎｉＯｐｔｉｃｏｎ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＩＯ―ＲＡＤ）のＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ （Ｒｏｃｈｅ）を用いて分析した。以下のオリゴヌクレオチドＤＮＡプライマを合成した。

【0041】

ｐｌａｔ用
５’プライマ：５’−ＣＣＡＴＴＴＴＧＧＡＡＧＴＴＴＴＣＡＧＧ−３’
３’プライマ：５’−ＧＣＴＴＴＣＡＴＴＴＴＴＧＴＧＧＴＣＣＴ−３’

【0042】

４．トランスフェクション
ｍｉＲ−３４０前駆体または対照ｍｉＲは、ｍｉＲＮＡ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ （ｐＥＺＸ−ＭＲ０３， Ｇｅｎｅｃｏｐｏｅｉａ）を用いてグリオーマ細胞に過剰発現させた。グリオーマ細胞は３７℃で１２時間、組換えウイルスと共に培養し、ピューロマイシン（２μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）の存在下で３日間培養した。感染効率はＧＦＰ発現によって確認した。ｍｉＲ−３４０の発現は選抜後、ＲＴ−ＰＣＲによって確認した。いくつかの実験では、グリオーマ細胞はＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ｄｅｖｉｃｅ （Ｌｏｎｚａ）を用いてｍｉＲ−３４０発現ベクター（ｐＢＡｐｏＣＭＶ―Ｎｅｏ―ｍｉＲ―３４０、タカラ）でトランスフェクションし、ネオマイシン（３００μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）の存在下で１０日間培養した。選抜後、細胞をヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８（１：５００；分子プローブ）で免疫標識した後に、ウサギ抗ＰＬＡＴ抗体（１：５０、Ｓｉｇｍａ）で免疫標識し、ＤＡＰＩ（１μｇ／ｍｌ）で対比染色した。

【0043】

５．細胞増殖
グリオーマ細胞（１ｘ１０^４細胞／ウェル）を対照またはｍｉＲ−３４０発現ベクターによってトランスフェクションし、７２時間培養した。１日目、２日目および３日目に細胞を収集し、血球計算器で計数した。ＢｒｄＵ染色はＫｏｎｄｏ ａｎｄ Ｒａｆｆ， ＥＭＢＯ Ｊ， ２０００に従って行った。

【0044】

６．細胞浸潤および遊走分析
細胞浸潤および遊走は、それぞれＢｉｏＣｏａｔ Ｍａｔｒｉｇｅｌ Ｉｎｖａｓｉｏｎ Ｃｈａｍｂｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）およびＢｉｏＣｏａｔ Ｔｕｍｏｒ Ｉｎｖａｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して評価した。トランスフェクションされたグリオーマ細胞（５〜１０ｘ１０^４）は、ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１２および１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ； Ｓｉｇｍａ）に再懸濁し、ウェルの上部チャンバに置いた。７５０μｌの１０％ＦＣＳ培地を下部チャンバに置いた。１２時間の培養の後、上側の膜面上の細胞を機械的に除去した。膜の下側に湿潤または移動した細胞を固定し、０．１％クリスタルバイオレットで染色し、５以上のランダムに選択した領域において顕微鏡で計数した。

【0045】

７．ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの脳への頭蓋内細胞移植
対照細胞およびｍｉＲ−３４０発現細胞を、５μｌ（１ｘ１０^５）の培地に懸濁し、１０％ペントバルビタールで麻酔した６〜８週間目の雌のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの脳に注射した。注射部位の定位座標は、ラムダから２ｍｍ前方、矢状縫合から２ｍｍ外側であり、深さ５ｍｍである。

【0046】

８．脳固定および組織病理学
解剖したマウス脳は、一晩、４℃で４％パラホルムアルデヒドに固定した。固定の後、脳は、１２〜１８％スクロース／ＰＢＳで凍結防止し、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ ＯＣＴ化合物（Ｍｉｌｅｓ， Ｅｌｋｈａｒｔ， ＩＮ）に埋め込み、またはパラフィンに埋め込んだ。冠状断面（太さ６〜１０μｍ）を大脳皮質から準備し、標準技術に倣ってヘマトキシリン−エオジン（Ｈ&Ｅ）で染色した。

【0047】

９．ベクター構造
完全長マウスｐｌａｔをＲＴ−ＰＣＲおよびＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２ポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ、日本）を用いてヒトグリオーマｃＤＮＡから増幅し、ｐＣＤＮＡ３−２×ＦＬＡＧ−ｃベクター（ｐＣＤＮＡ３−ｈＰＬＡＴ−２×ＦＬＡＧ−ｃ）およびｐ３×ＦＬＡＧ−ＣＭＶ１０ベクター（ｐ３×ＦＬＡＧ−ＣＭＶ１０−ｈＰＬＡＴ）にクローニングした。以下のオリゴヌクレオチドＤＮＡを完全長ヒトｐｌａｔ用に合成した。
５’プライマ：５’−ＴＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＣＡＧＡＡＴＡＣＡＡＧＣＴＴＧＴＧＧＴＧ−３’
３’プライマ：５’−ＡＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＡＣＡＴＴＴＧＣＡＧ−３’
ヒトｐｌａｔをノックダウンするため、それらのヘアピン配列をｐｓｉＲＮＡ−ｈ７ＳＫｈｙｇｒｏ Ｇ１発現ベクター（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）に挿入し、ｐｓｉＲＮＡ−ｈ７ＳＫｈｙｇｒｏ−ｐｌａｔｓｈを作製した。ｓｉＲＮＡターゲット配列は、５’−ＧＡＡＴＴＣＧＡＴＧＡＴＧＡＣＡＣＴＴ−３’である。ホタルルシフェラーゼ−ヒトＰＬＡＴ ３’ＵＴＲ発現ベクターを構築するため、ヒトｐｌａｔ ３’ゲノムＤＮＡをＫＯＤおよびＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅し、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングした。ｐｌａｔ３’ＵＴＲゲノムＤＮＡおよびホタルルシフェラーゼｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１−ｈｙｇベクターに挿入し、ｐｃＤＮＡ３．１−ｈｙｇ−Ｌｕｃ−ＰＬＡＴ ３’ＵＴＲを得た。以下のオリゴヌクレオチドＤＮＡを完全長ヒトｐｌａｔ３’ＵＴＲ用に合成した。
５’プライマ：５’−ＣＴＣＴＡＧＡＣＣＡＧＧＡＡＣＡＣＣＣＧＡＣＴＣＣＴＣ−３’
３’プライマ：５’−ＡＣＴＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＴＣＡＡＴＴＡＡＧＴＣＣＡＡＡＣ−３’
クローニングしたｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列は、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｋｉｔ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびＡＢＩ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ｍｏｄｅｌ ３１３０ｘｌ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて確認した。

【0048】

１０．ルシフェラーゼアッセイ
Ｅ３はｐＥＦ−Ｒｌｕｃ、ｐｃＤＮＡ３．１−ｈｙｇ−Ｌｕｃ−ＰＬＡＴ３’ＵＴＲ、およびいずれかの対照ベクター、またはｐＢＡｐｏＣＭＶ−Ｎｅｏ−ｍｉＲ−３４０にトランスフェクトされ、それらのルシフェラーゼ活性を測定した。

【0049】

１１．統計分析
各連続変数の分布は、その平均、標準偏差および範囲によってまとめた。各分類変数の分布は、その頻度およびパーセンテージによってまとめた。連続変数は、マン−ホイットニー試験によって治療群との間で比較した。２つの対グループを比較する場合にマン−ホイットニー試験を行う。カプラン−マイアー曲線は、事象変数に対する未調整の時間を推定するために用いた。ログランク検定は、グループ間の各時間と事象の変数を比較するために用いた。Ｐ値０．０５未満（両側）を統計学的に有意であるとみなした。すべての統計分析はＳｔａｔｍａｔｅを使用して実行した。エラーバーはＳＤを示す。

【0050】

（実験結果）
以下に、図面を用いて実験結果について説明する。

【0051】

図１は、ｍｉＲ−３４０の発現がマウスおよびヒトのＧＩＣにおいて減少していることを示すグラフである。（ａ）はマウス（左）およびヒト（右）のＧＩＣ、対照細胞、ＡＯ、ＤＡ、およびヒトグリオーマ細胞株（Ｕ８７およびＵ２５１）において発現するｍｉＲＮＡの階層的クラスタ分析の結果を示す。（ｂ）は通常のＮＳＣと比較した場合のヒトＧＩＣ（Ｅ１−４、Ｅ６）、ＡＯ、ＤＡ、ヒトグリオーマ細胞株、およびＮＳＣＬ６１のｍｉＲ−３４０発現の変化を表す。（ｃ）はＧＢＭ組織と通常の脳組織とのｍｉＲ−３４０発現の相対比率である。３回以上の実験による平均±Ｓ．Ｄ．である。いずれのグラフにおいても＊Ｐ<０．０５である。

【0052】

図２はｍｉＲ−３４０の過剰発現が細胞増殖、浸潤および遊走を阻害することを示すグラフである。（ａ）は対照（上）とｍｉＲ−３４０過剰発現ｈＧＩＣ（下）の蛍光画像である（スケールは２００μｍ）。（ｂ）は対照とｍｉＲ−３４０過剰発現細胞のＢｒｄＵ陽性細胞の比率を示すグラフであり、５回の実験の平均±Ｓ．Ｄ．として示した。
（ｃ）はｍｉＲ−３４０過剰発現細胞と対照細胞との相対的な浸潤比率を示すグラフであり、９回の実験の平均±Ｓ．Ｄ．として示した。（ｄ）はｍｉＲ−３４０過剰発現細胞と対照細胞との相対的な細胞遊走比率を示すグラフであり、９回の実験の平均±Ｓ．Ｄ．として示した。いずれのグラフにおいても、＊＊Ｐ<０．０１、＊＊＊Ｐ<０００１である。

【0053】

図３はｍｉＲ−３４０の過剰発現がインビボでの腫瘍形成を阻害することを示すグラフである。（ａ）はｈＧＩＣ（Ｅ３の対照）およびｍｉＲ−３４０過剰発現細胞（Ｅ３のｍｉＲ−３４０）の注入後５週間で切断した脳全体のスライス（左）および注入領域（右）のＨ&Ｅ染色の写真である。スケールは左の写真は１ｍｍ、右の写真は１００μｍである。（ｂ）および（ｃ）は、ｈＧＩＣが注入されたＨ&Ｅで染色した脳のスライスにおける湿潤領域（ｂ）と有糸分裂細胞（ｃの矢印）を示す写真である。スケールは（ｂ）が５０μｍ、（ｃ）が２０μｍである。（ｄ）はｈＧＩＣ（黒の点線）およびｍｉＲ−３４０発現細胞（赤の実線）を注射されたマウスの生存曲線である。

【0054】

図４はＰＬＡＴがｍｉＲ−３４０の標的であることを示すグラフである。（ａ）はｍｉＲ−３４０過剰発現ＧＩＣおよびそれらの親細胞のＰＬＡＴ（緑）について免疫標識した写真である。すべての核はＤＡＰＩ（青）で対比染色した。スケールは２５μｍである。（ｂ）はｍｉＲ−３４０過剰発現ｈＧＩＣと対照細胞との相対的なルシフェラーゼ活性を示すグラフである。４回の実験の平均±Ｓ．Ｄ．を示す。（ｃ）は対照の脳とＧＢＭにおけるＰＬＡＴ発現を示すグラフである。３回以上の実験の平均±Ｓ．Ｄ．を示す。（ｄ）は対照とｍｉＲ−３４０過剰発現細胞との細胞成長を示すグラフである。４回の実験の平均±Ｓ．Ｄ．として示す。（ｅ）は対照およびＰＬＡＴ ｓｈＲＮＡ発現ＧＩＣのＢｒｄＵ陽性細胞の比率を示すグラフであり、５回の実験の平均±Ｓ．Ｄ．として示す。（ｆ）および（ｇ）は、ＰＬＡＴ ｓｈＲＮＡ発現ＧＩＣと対照細胞との相対的な湿潤（ｆ）および遊走（ｇ）の比率を示すグラフであり、５回の実験の平均±Ｓ．Ｄ．として示す。（ｈ）は、グリオーマ発生におけるｍｉＲ−３４０の機能およびＰＬＡＴの関連を示すスキームである。いずれにおいても、＊Ｐ<０．０５、＊＊Ｐ<０．０１である。

【0055】

その他、本発明は、さまざまに変形可能であることは言うまでもなく、上述した一実施形態に限定されず、発明の要旨を変更しない範囲で種々変形可能である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]