特許 6075892 二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6075892

(24)【登録日】2017年1月20日

(45)【発行日】2017年2月8日

(54)【発明の名称】二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20170130BHJP

   C12N 9/22 20060101ALI20170130BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20170130BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20170130BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20170130BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20170130BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20170130BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C12N9/22

   C12P21/02 C

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

【請求項の数】11

【全頁数】34

(21)【出願番号】特願2014-514835(P2014-514835)

(86)(22)【出願日】2012年6月7日

(65)【公表番号】特表2014-518641(P2014-518641A)

(43)【公表日】2014年8月7日

(86)【国際出願番号】PL2012050020

(87)【国際公開番号】WO2012169917

(87)【国際公開日】20121213

【審査請求日】2014年10月31日

(31)【優先権主張番号】P.395178

(32)【優先日】2011年6月8日

(33)【優先権主張国】PL

(31)【優先権主張番号】61/494,574

(32)【優先日】2011年6月8日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】513263721

【氏名又は名称】ミエドジナロドウィ インスティタット バイオロジーモレキュラーネイ アイ コモルコウェイ

(74)【代理人】

【識別番号】100082072

【弁理士】

【氏名又は名称】清原 義博

(72)【発明者】

【氏名】ブジニキ ヤヌスズ マレク

(72)【発明者】

【氏名】スコウロネク，クリストフ イェルジ

(72)【発明者】

【氏名】ピアンカ，ダリウス

(72)【発明者】

【氏名】スレジ，アガタ アグニエスカ

【審査官】 藤澤 雅樹

(56)【参考文献】

【文献】 MOLECULAR MICROBIOLOGY，２００９年 ３月，V71 N5，P1145-1154

【文献】 MOLECULAR MICROBIOLOGY，２００８年 ６月，V68 N5，P1073-1076

【文献】 MOLECULAR MICROBIOLOGY，２００８年 ６月，V68 N5，P1096-1106

【文献】 Database UniProt [online], Accession No. D5RB71,<http://www.uniprot.org/uniprot/D5RB71> 2010.7.13 uploaded, QIN, X, et al., Definition: Submitted name: RNase3 domain protein，２０１０年 ７月１３日，ＵＲＬ，http://www.uniprot.org/uniprot/D5RB71

【文献】 Database UniProt [online], Accession No. O31418,<http://www.uniprot.org/uniprot/O31418> 1998.1.1 uploaded, KUNST, F, et al., Definition: Mini-ribonuclease 3，１９９８年 １月 １日，ＵＲＬ，http://www.uniprot.org/uniprot/O31418

【文献】 Database UniProt [online], Accession No. Q81J58,<http://www.uniprot.org/uniprot/Q81J58> 2003.6.1 uploaded, OSIPIUK, J, et al., Definition: Mini-ribonuclease 3，２００３年 ６月 １日，ＵＲＬ，http://www.uniprot.org/uniprot/Q81J58

【文献】 Database UniProt [online], Accession No. Q8RIL0,<http://www.uniprot.org/uniprot/Q8RIL0> 2002.6.1 uploaded, FOROUHAR, F, et al., Definition: Mini-ribonuclease 3-like protein，２００２年 ６月 １日，ＵＲＬ，http://www.uniprot.org/uniprot/Q8RIL0

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ ９／００

Ｃ１２Ｎ １５／００

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＣＡｐｌｕｓ／ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

二本鎖ＲＮＡ基質の生体外での配列特異的な切断のための二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼの使用であって、
前記エンドリボヌクレアーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１のアミノ酸配列を含み、および、二本鎖ＲＮＡと複合したエンドリボヌクレアーゼＭｉｎｉ ＩＩＩの構造のモデル中の二本鎖ＲＮＡの主溝にあって主溝に相互に作用するループに一致する、二本鎖ＲＮＡの主溝にあって主溝に相互作用しているループを有し、
前記二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼは、以下の共通配列（Ｈ＝ＡまたはＣまたはＵ； Ｄ＝ＡまたはＧまたはＵ）内で二本鎖ＲＮＡの配列特異的な活性を示し、
５’ＧＡＣＣＵＨＧ ３’
３’ＣＵＧＧＡＤＣ ５’、
あるいは、
前記エンドリボヌクレアーゼは、Ｄ９４Ｒ変異を含むＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１のアミノ酸配列を含み、および、二本鎖ＲＮＡと複合したエンドリボヌクレアーゼＭｉｎｉ ＩＩＩの構造のモデル中の二本鎖ＲＮＡの主溝にあって主溝に相互に作用するループに一致する、二本鎖ＲＮＡの主溝にあって主溝に相互作用しているループを有し、
前記二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼは、以下の共通配列内で二本鎖ＲＮＡの配列特異的な活性を示し、
５’ＧＡＣＣＵＣＧ ３’
３’ＣＵＧＧＡＧＣ ５’、
および、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１のアミノ酸配列を含む前記二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼによって認識される二本鎖ＲＮＡ基質中の特異的な配列は、以下の共通配列（Ｈ＝ＡまたはＣまたはＵ； Ｄ＝ＡまたはＧまたはＵ）であり、
５’ＧＡＣＣＵＨＧ ３’
３’ＣＵＧＧＡＤＣ ５’、
あるいは、Ｄ９４Ｒ変異を含むＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１のアミノ酸配列を含む前記二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼによって認識される二本鎖ＲＮＡ基質中の特異的な配列は、以下の共通配列であり、
５’ＧＡＣＣＵＣＧ ３’
３’ＣＵＧＧＡＧＣ ５’、
および、前記二本鎖ＲＮＡ基質は、認識配列を含み、前記二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼによって認識配列内で切断され、
前記二本鎖ＲＮＡ基質は、２２以上の長さの塩基対を含むことを特徴とする使用。

【請求項2】

前記二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼは、以下の共通配列内で二本鎖ＲＮＡの配列特異的な活性を示し、
５’ＣＧＡＣＣＵＣＧＡＧＧ ３’
３’ＧＣＵＧＧＡＧＣＵＣＣ ５’、
前記二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼによって認識される二本鎖ＲＮＡ基質中の特異的な配列は、以下の共通配列である、
５’ＣＧＡＣＣＵＣＧＡＧＧ ３’
３’ＧＣＵＧＧＡＧＣＵＣＣ ５’、
、ことを特徴とする請求項１記載の使用。

【請求項3】

二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼによる、特異的に認識される共通配列内における二本鎖ＲＮＡ基質の生体外での配列特異的な切断方法であって、
前記方法は、
ａ）混合物中の二本鎖ＲＮＡ基質と、二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼを組み合わせる工程、及び
ｂ）二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼによって、特異的に認識される共通配列における前記二本鎖ＲＮＡ基質を切断する工程を含み、
前記二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１のアミノ酸配列を含み、および、二本鎖ＲＮＡと複合したエンドリボヌクレアーゼＭｉｎｉ ＩＩＩの構造のモデル中の二本鎖ＲＮＡの主溝にあって主溝に相互に作用するループに一致する、二本鎖ＲＮＡの主溝にあって主溝に相互作用しているループを有し、
前記二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼは、以下の特異的に認識される共通配列（Ｈ＝ＡまたはＣまたはＵ； Ｄ＝ＡまたはＧまたはＵ）内で二本鎖ＲＮＡの配列特異的な活性を示し、
５’ＧＡＣＣＵＨＧ ３’
３’ＣＵＧＧＡＤＣ ５’、
あるいは、
前記二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼは、Ｄ９４Ｒ変異を含むＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１のアミノ酸配列を含み、および、二本鎖ＲＮＡと複合したエンドリボヌクレアーゼＭｉｎｉ ＩＩＩの構造のモデル中の二本鎖ＲＮＡの主溝にあって主溝に相互に作用するループに一致する、二本鎖ＲＮＡの主溝にあって主溝に相互作用しているループを有し、
前記二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼは、以下の特異的に認識される共通配列内で二本鎖ＲＮＡの配列特異的な活性を示し、
５’ＧＡＣＣＵＣＧ ３’
３’ＣＵＧＧＡＧＣ ５’、
および、二本鎖ＲＮＡ基質は特異的に認識される共通配列を含み、特異的に認識される共通配列（Ｈ＝ＡまたはＣまたはＵ； Ｄ＝ＡまたはＧまたはＵ）は以下の通りであり、
５’ＧＡＣＣＵＨＧ ３’
３’ＣＵＧＧＡＤＣ ５’、
あるいは、Ｄ９４Ｒ変異を含むＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１のアミノ酸配列を含む前記二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼによって認識される二本鎖ＲＮＡ基質中の特異的な配列は、以下の共通配列であり、
５’ＧＡＣＣＵＣＧ ３’
３’ＣＵＧＧＡＧＣ ５’、
二本鎖ＲＮＡ基質が２２以上の長さの塩基対を含む、ことを特徴とする方法。

【請求項4】

前記二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼは、以下の特異的に認識される共通配列内で二本鎖ＲＮＡの配列特異的な活性を示し、
５’ＣＧＡＣＣＵＣＧＡＧＧ ３’
３’ＧＣＵＧＧＡＧＣＵＣＣ ５’、
前記二本鎖ＲＮＡ基質は特異的に認識される共通配列を含み、特異的に認識される共通配列は以下の通りである、
５’ＣＧＡＣＣＵＣＧＡＧＧ ３’
３’ＧＣＵＧＧＡＧＣＵＣＣ ５’、
、ことを特徴とする、請求項３記載の二本鎖ＲＮＡ基質の生体外での配列特異的な切断方法。

【請求項5】

二本鎖ＲＮＡの切断は、３５°Ｃから４５°Ｃまでの温度で、および／または、５乃至６０ｍＭの塩化ナトリウム濃度で、１乃至２．５ｍＭのＭｇ^２＋濃度で、行われる、ことを特徴とする、請求項３又は４に記載の二本鎖ＲＮＡ基質の生体外での配列特異的な切断方法。

【請求項6】

二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼであって、
前記二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼは、Ｄ９４Ｒ変異を含むＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１のアミノ酸配列を含み、および、二本鎖ＲＮＡと複合したエンドリボヌクレアーゼＭｉｎｉ ＩＩＩの構造のモデル中の二本鎖ＲＮＡの主溝にあって主溝に相互に作用するループに一致する、二本鎖ＲＮＡの主溝にあって主溝に相互作用しているループを有し、
前記二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼによって認識される二本鎖ＲＮＡ基質中の特異的な配列は、以下の共通配列であり、
５’ＧＡＣＣＵＣＧ ３’
３’ＣＵＧＧＡＧＣ ５’
および、前記二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼは、前記共通配列内で二本鎖ＲＮＡの配列特異的な活性を示す、ことを特徴とする二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ。

【請求項7】

前記二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼによって認識される二本鎖ＲＮＡ基質中の特異的な配列が、以下の共通配列である、
５’ＣＧＡＣＣＵＣＧＡＧＧ ３’
３’ＧＣＵＧＧＡＧＣＵＣＣ ５’、
、ことを特徴とする請求項６記載の二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ。

【請求項8】

二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼを生成するための方法であって、
前記方法は、
請求項６又は７の二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼを発現させる工程を含む、ことを特徴とする方法。

【請求項9】

請求項６又は７の二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。

【請求項10】

請求項９の核酸を含む宿主細胞。

【請求項11】

請求項６又は７の二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼを含むキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明の対象は、二本鎖ＲＮＡ配列に特異的な切断活性を示す二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）エンドリボヌクレアーゼ、二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼを得る方法、二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ誘導体（ｅｎｄｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）および／または二本鎖ＲＮＡ切断における変更された配列選択性、遺伝子コンストラクト、宿主細胞、二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼをその創造物にコードする遺伝子の使用、キット、および、二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ活性を示す酵素である。

【背景技術】

【0002】

分子生物学の基本的なツールの１つは、明確に定義された活性を有するタンパク質であり、様々な生成物の製造および処理において、例えば、遺伝子工学、診断法、医学、および産業で使用される。

【0003】

ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼは、二本鎖ＤＮＡの特定の配列を認識して切断する、配列依存性の酵素である。所定の配列中のＲＮＡを切断する酵素も知られているが、しかしながら、そのような酵素はＲＮＡ中の単鎖の部位に作用する。これらの酵素の例としては、配列ＧＧＡＧの中央で一本鎖ＲＮＡを切断するファージ・タンパク質ＲｅｇＢと、ＡまたはＡＵに富む配列中の一本鎖ＲＮＡを切断するリボヌクレアーゼＹを含む。これらの酵素は、ＲＮＡ二次構造などの効率的な切断のための追加の決定因子を必要とし、および、ＲｅｇＢの場合には、リボソームタンパク質Ｓ１との相互作用を必要とする（非特許文献１、非特許文献２、および、非特許文献３）。同様に、リボヌクレアーゼＴ１およびリボヌクレアーゼＭＣ１の特異性を変えようとする試みもあった（非特許文献４、非特許文献５）。これらの２つのケースでは、酵素変異体が作られ、その特異性は１から２つのヌクレオチドに増えた（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７）。しかしながら、これらのリボヌクレアーゼはすべて、非常に限られた配列特異性を依然として有しているため、ＤＮＡ制限酵素の用途に類似する用途では分子生物学的ツールとしてはふさわしくない。

【0004】

リボヌクレアーゼＩＩＩは、二本鎖ＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）を切断するヌクレアーゼの原型であり、進化的に保存された触媒ドメインを共有するタンパク質のリボヌクレアーゼＩＩＩスーパーファミリーの当初のメンバーである。それらは追加のドメインの発生に基づいて４つの種類に分けられる。クラス１、すなわち、正統なリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素は、二本鎖ＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）と、一つのリボヌクレアーゼＩＩＩドメインを有している。クラス２と３の酵素はそれぞれ、ＤｒｏｓｈａおよびＤｉｃｅｒと表わされ、両方とも１つのｄｓＲＢＤに加えて、２つのリボヌクレアーゼＩＩＩドメインを含んでいる。加えて、クラス２に属する酵素は、ポリプロリンドメインなどの追加のドメインを持ち、クラス３に属する酵素は、ＤＥｘＤヘリカーゼ、ＤＵＦ２８３、および、ＰＡＺのドメインを持つ。Ｍｉｎｉ ＩＩＩと呼ばれるクラス４は、リボヌクレアーゼＩＩＩドメインのみからなる酵素を含んでいる。

【0005】

バチルス・サブティリスからのＭｉｎｉ ＩＩＩタンパク質のための天然基質は、２３Ｓ プレリボソームＲＮＡであり、このなかで、分子の３’と５’の末端は、成熟２３Ｓ ｒＲＮＡを生成するために取り除かれる。この酵素の切断部位は知られており、２３ＳプレリボソームＲＮＡの１つのフラグメントは二本鎖のプレリボソームＲＮＡの切断部位に近くにあるが、基質認識に必要だと考えられていた不規則な螺旋を形成する（非特許文献８）。加えて、Ｍｉｎｉ ＩＩＩのインビトロのエンドリボヌクレアーゼ活性は、２３ＳリボソームＲＮＡの３’末端に結合したリボソームタンパク質Ｌ３によって刺激されることが示された。ＲＮＡの立体構造を変えることによって、タンパク質Ｌ３が基質の分裂を促進するという間接的な証拠がある（非特許文献９）。

【0006】

ＤＮＡ制限酵素またはＤＮＡニッカーゼに類似する特性を備えた、特異的かつ定義された二本鎖ＲＮＡ断片化のための既知の酵素はない（特許文献１）二本鎖ＲＮＡは、リボヌクレアーゼＩＩＩファミリーからのエンドリボヌクレアーゼによって切断され得るが、リボヌクレアーゼＩＩＩと二本鎖ＲＮＡの相互作用の詳細は分かっていない（非特許文献１０）。部位特異的な結合および選択的な処理の基準は、不明瞭なままである（非特許文献１１）。しかしながら、非特異的な二本鎖ＲＮＡエンドヌクレアーゼは、短い二本鎖ＲＮＡフラグメントの生成のために使用される（特許文献２）。二本鎖ＲＮＡの切断において配列特異性を示す酵素を得ることで、全領域でのＲＮＡ操作技術を開発することが可能となり、新しい研究方法、そのような酵素の新しい適用、およびそのような技術に由来する新技術を開発することも可能となる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】ＪＰ ５４０５９３９２−Ａ（１２．０５．１９７９）

【特許文献2】米国２００６０５７５９０−Ａ１（１６．０３．２００６、ＮＯＶＡＲＴＩＳ）

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Ｌｅｂａｒｓ， Ｉ．， ｅｔ． ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ （２００１） ２７６， １３２６４−１３２７２

【非特許文献2】Ｓａｉｄａ， Ｆ． ｅｔ． ａｌ．， （２００３） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ， ３１， ２７５１−２７５８

【非特許文献3】Ｓｈａｈｂａｂｉａｎ， Ｋ． ｅｔ． ａｌ．， Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ （２００９） ２８， ３５２３ − ３５３３

【非特許文献4】Ｈｏｓｃｈｌｅｒ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，（１９９９）２９４，１２３１−１２３８

【非特許文献5】Ｎｕｍａｔａ， Ｔ． ｅｔ． ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（２００３）４２，５２７０−５２７８

【非特許文献6】Ｃｚａｊａ， Ｒ． ｅｔ． ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（２００４）４３， ２８５４−２８６２

【非特許文献7】Ｓｔｒｕｈａｌｌａ， Ｍ． ｅｔ． ａｌ． Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ，（２００４）５， ２００−２０５

【非特許文献8】Ｒｅｄｋｏ， Ｙ． ｅｔ．ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，（２００８） ６８ （５），１０９６−１１０６

【非特許文献9】Ｒｅｄｋｏ， Ｙ． ｅｔ． ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， （２００９） ７１ （５）， １１４５−１１５４

【非特許文献10】Ｈｅｒｓｋｏｖｉｔｚ，Ｍ．Ａ．ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，（２０００）３８（５），１０２７−１０３３

【非特許文献11】Ｄａｓｇｕｐｔａ Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，（１９９８）２８（３），６２９−６４０

【発明の開示】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

上記の最先端技術の観点から、提示される本発明の目的は、記載された不利な点を克服し、高配列特異性の認識および切断を含む二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼを実現させることである。本発明の目的はさらに、そのような配列特異的な二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼとその改良された変異体を、決定し、単離、選択、獲得、および、調製する方法を実現させることである。

【0010】

コンピュータによるモデリングによると二本鎖ＲＮＡ螺旋の主溝にあってこの主溝に相互作用するループを含むリボヌクレアーゼＩＩＩスーパーファミリーからの酵素が、特定の二本鎖ＲＮＡヌクレオチド配列を切断する傾向があることに、発明者たちは予期せず気付いた。発明者たちは、そのような傾向が二本鎖ＲＮＡ配列のみに依存し、不規則な二本鎖ＲＮＡ螺旋構造の存在および／または他のタンパク質との相互作用とは無関係であることを知った。発明者たちは、コンピュータによるモデリングにおいて二本鎖ＲＮＡ主溝にありその主溝に相互作用するループを形成するポリペプチド鎖のフラグメントを含むリボヌクレアーゼＩＩＩスーパーファミリーに属する酵素が、ＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼに似た特性を備えた二本鎖ＲＮＡの特定かつ規定された断片化を行うことができるということを発見した。

【課題を解決するための手段】

【0011】

１つの態様において、本発明は、二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼの主溝にあって主溝と相互作用しているループを有する、二本鎖ＲＮＡ中で配列特異的な特徴を示す二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、および／または、その誘導体、および／または、二本鎖ＲＮＡの切断で配列特異性を示す変異体を提供する。

【0012】

好ましい二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、その誘導体および／または変異体では、二本鎖ＲＮＡの主溝にあって主溝に相互作用しているループは、二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼのアミノ酸配列を有しており、該ループは、二本鎖ＲＮＡと複合したエンドリボヌクレアーゼＭｉｎｉ ＩＩＩの構造のモデル中の二本鎖ＲＮＡの主溝にあって主溝に相互に作用するループに一致する。好ましい二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、その誘導体および／または変異体では、二本鎖ＲＮＡの主溝にあって主溝に相互作用するループは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３で示されるフソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）からのエンドリボヌクレアーゼ ＦＮＵのフラグメントによって、および／または、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４で示されるようなバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からのエンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵのフラグメントによって、および／または、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ５で示されるようなバチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）からのエンドリボヌクレアーゼ ＢＣＥのフラグメントによって形成された二本鎖ＲＮＡの主溝にあって主溝に相互作用するループに一致する。

【0013】

二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、その誘導体、または、変異体は、好ましくは、二本鎖ＲＮＡ切断における配列特異性を示すとともに好ましくはアミノ酸置換Ｄ９４Ｒを含む、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１のバチルス・サブティリスからの二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵのアミノ酸配列、または、そのフラグメントを含む。

【0014】

二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、その誘導体、または、変異体は、好ましくは、二本鎖ＲＮＡの切断で配列特異性を示す、フソバクテリウム・ヌクレアタムからのエンドリボヌクレアーゼ ＦＮＵ、または、フソバクテリウム・ヌクレアタムからのエンドリボヌクレアーゼ ＦＮＵのフラグメントを含む。二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、その誘導体、または、変異体は、好ましくは、二本鎖ＲＮＡの切断における配列特異性を示す、バチルス・セレウスからのエンドリボヌクレアーゼ ＢＣＥ、または、バチルス・セレウスからのエンドリボヌクレアーゼ ＢＣＥのフラグメントを含む。

【0015】

次の態様では、本発明は、二本鎖ＲＮＡの切断において配列特異性を示す二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼを得る方法に関し、該方法は以下の工程を含む：
ａ）二本鎖ＲＮＡの主溝にあって主溝に相互作用するループを形成するアミノ酸配列を含む、二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、その機能的な変異体、および／または、誘導体を選択する工程であって、ループは、二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼのアミノ酸配列によって形成され、二本鎖ＲＮＡを含むＭｉｎｉ ＩＩＩ エンドリボヌクレアーゼの複合体の３次元モデルによって決定された二本鎖ＲＮＡの主溝にあるとともに主溝に相互作用するループのモデルに一致する、工程、
ｂ）二本鎖ＲＮＡの主溝にあって主溝に相互作用するループを形成する配列を含む、二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、その機能的な変異体、および／または、誘導体をコードする遺伝子またはそのフラグメントをクローン化する工程を含む。

【0016】

二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼを得る方法はさらに、工程ｂ）の後に、工程ｂ）で得られた遺伝子またはそのフラグメントによってコードされたタンパク質を発現させる次の工程ｃ）を含むことが好ましく、工程ｃ）の後、単離した二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼの配列特異性を測定する工程ｄ）も続くことが好ましい。

【0017】

二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼを得る好ましい方法では、二本鎖ＲＮＡの主溝にあって主溝に相互作用するループは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３で示されるフソバクテリウム・ヌクレアタムからの二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ ＦＮＵのフラグメントによって、および／または、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４で示されるようなバチルス・サブティリスからのエンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵのフラグメントによって、および／または、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ５で示されるようなバチルス・セレウスからのエンドリボヌクレアーゼ ＢＣＥのフラグメントによって、形成された二本鎖ＲＮＡの主溝にあって主溝に相互作用するループを形成するアミノ酸配列に一致する。

【0018】

さらに、次の態様では、本発明は、二本鎖ＲＮＡの配列特異的な切断のために変化させた配列特異性を含む二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、誘導体、および／または変異体を得る方法に関し、該方法は以下の工程を含む：
ａ） 二本鎖ＲＮＡの切断において配列特異性を示す本発明の二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼを得る方法で得られた二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼの二本鎖ＲＮＡの主溝にあるループに一致するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に変化を導入する工程；
ｂ）工程ａ）で得られたヌクレオチド配列から、二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼの誘導体および／または変異体を発現させる工程、および、
ｃ）二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼの誘導体および／または変異体の変化させた配列特異性を特定する工程、を含む。

【0019】

そのような好ましい方法では、二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼの誘導体および／または変異体の選択性の変化は、二本鎖ＲＮＡの切断におけるヌクレオチド配列への選択性が増加した誘導体および／または変異体をもたらす。

【0020】

本発明はさらに、二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼを生成するための方法に関し、該方法は、二本鎖ＲＮＡの切断において配列特異性を示す本発明の二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、その誘導体、および／または、変異体を発現する工程を含む。

【0021】

本発明は、二本鎖ＲＮＡの切断において配列特異性を示す本発明の二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、その誘導体、および／または、変異体をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子コンストラクトにも関する。

【0022】

本発明の遺伝子コンストラクトを含む宿主細胞も本発明に従うものとする。

【0023】

次の態様では、本発明は、配列特異的な二本鎖ＲＮＡ切断を示す二本鎖エンドリボヌクレアーゼを生成するために、フソバクテリウム・ヌクレアタムからの二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ ＦＮＵまたはそのフラグメント、および／または、その機能的な変異体および／または誘導体をコードする遺伝子の使用に関する。有益な適用では、フソバクテリウム・ヌクレアタムからの二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ ＦＮＵ、その誘導体、および／または、変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３で示されるアミノ酸配列を含む。

【0024】

本発明は、配列特異的な二本鎖ＲＮＡ切断を示す二本鎖エンドリボヌクレアーゼを生成するために、バチルス・セレウスからの二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ ＢＣＥまたはそのフラグメント、および／または、その機能的な変異体および／または誘導体をコードする遺伝子の使用にも関する。好ましくは、バチルス・セレウスからの二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ ＢＣＥ、その誘導体、および／または、変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ５のアミノ酸配列を含む。

【0025】

次の態様では、配列特異的な二本鎖ＲＮＡ切断を示す二本鎖エンドリボヌクレアーゼを生成するために、バチルス・サブティリスからの二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵまたはそのフラグメント、および／または、その機能的な変異体および／または誘導体をコードする遺伝子の使用にも関する。好ましくは、バチルス・サブティリスからの二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵ、その誘導体、および／または、変異体をコードする遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１で示されるアミノ酸配列を含み、さらにより好ましくは、バチルス・サブティリスからの二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵをコードする遺伝子はＤ９４Ｒ置換を含む。

【0026】

本発明は、二本鎖ＲＮＡの切断で配列特異性を示す本発明の二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、その誘導体、および／または変異体を含むキットにも関する。キットは、フソバクテリウム・ヌクレアタムからの二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ ＦＮＵ、および／または、バチルス・セレウスからの二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ ＢＣＥ、および／または、バチルス・サブティリスからの二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵあるいはＤ９４Ｒを含むこの変異体、および／または、二本鎖ＲＮＡの切断で配列特異性を示すそれらの誘導体ならびに変異体を含む。

【0027】

本発明は、配列特異性を示し、以下の共通配列（Ｈ＝ＡまたはCまたはＵ；Ｄ＝ＡまたはＧまたはＵ）内の二本鎖ＲＮＡを切断する、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１で示されるバチルス・サブティリスからのアミノ酸配列、または、そのフラグメント、および、配列特異性を保持するその誘導体ならびに／あるいは変異体を含む、二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ活性を持つ酵素にも関する。

【0028】

【化1】

【0029】

好ましい酵素、および、その誘導体および／または変異体は、二本鎖ＲＮＡ切断における配列特異性を保持し、以下の共通配列（Ｙ＝ＣまたはＵ；Ｒ＝ＡまたはＧ；Ｎ＝ＧまたはＡまたはＵまたはＣ）内の二本鎖ＲＮＡを切断する。

【0030】

【化2】

【0031】

配列特異性を保持する好ましい酵素、および、その誘導体および／または変異体では、アミノ酸配列は、配列特異性を保持するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１で表されたアミノ酸残基９４の置換Ｄ９４Ｒ、その誘導体、および／または変異体を含む。

【0032】

二本鎖ＲＮＡ切断の配列特異性とは、１つまたは両方の鎖の二本鎖ＲＮＡにおける不規則ならせん構造の存在や、他の補助タンパク質の相互作用ではなく、その配列のみに依存して、二本鎖ＲＮＡを認識して切断する二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼの能力のことを意味する。

【0033】

本明細書に記載されているような二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ誘導体、および／または、変異体との用語は、二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼの特徴的な活性および配列優先性を保持する二本鎖ＲＮＡの主溝にあって主溝に相互作用しているループを有する、配列に特異的な二本鎖ＲＮＡの切断を示す、二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ誘導体のアミノ酸配列に同一のまたは非常によく似たアミノ酸配列を含んでいる、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、あるいは、組換え型のタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドを意味する。該構造のモデルの誘導体および変異体のそのような例は、二本鎖ＲＮＡを含むエンドリボヌクレアーゼＭｉｎｉ ＩＩＩの複合体の構造モデル中の二本鎖ＲＮＡの主溝にあって主溝に相互作用するループに一致するループを有している。二本鎖ＲＮＡの切断において配列特異性を示す二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ誘導体および／または変異体では、コード配列は、最初の配列に関して、置換、交換、欠失または挿入、あるいは、他の手段によって補正されてもよい。そのような用語は、そのような特徴を備えた二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼをコードする遺伝子、および／または、その誘導体および／または変異体に関して、類似性によって同様に理解されなければならない。

【0034】

配列特異性を示す二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、本発明のその誘導体および／または変異体、ならびに、それらの使用は、新しい研究方法、そのような酵素の新しい用途、それに由来する新しい技術を開発するのと同様に、核酸を操作する技術のまったく新しい分野の進歩を可能にする。二本鎖ＲＮＡの配列特異的なエンドリボヌクレアーゼ、その誘導体および／または変異体は、例えば、ＲＮＡ分子の構造および／またはその修飾を理解するためのＲＮＡの構造研究や、ＲＮＡｉ分子の発生（とりわけ、ｓｉＲＮＡ）、動植物のウイルス性疾患の診断および処置、および、いわゆる「ＲＮＡ ｔｅｃｔｏｎｉｃｓ」に基づいたナノテクノロジー用途で使用される。

【0035】

本発明の二本鎖ＲＮＡの新しい配列特異的なエンドリボヌクレアーゼ、その誘導体および／または変異体は、新しい生物工学的な用途に使用される。配列に依存したやり方で一本鎖ＲＮＡを切断する酵素が知られているが、その活性は基質の配列だけでなくその二次構造にも依存しているため、実際にはそれらはあまり有用ではない。本発明の二本鎖ＲＮＡの新しい配列特異的な二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、その誘導体および／または変異体は、これらの欠点を有しておらず、分子生物学で使用される制限エンドヌクレアーゼなどの共通の実験用試薬として使用することができる。加えて、配列特異的な二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、その誘導体および／または変異体は、医学、診断学およびナノテクノロジーで使用することができる。例えば、現在のところ、逆転写反応または質量分析法におけるＲＮＡの直接配列決定は、ＲＮＡの構造学的な研究において修飾を特定するために最も頻繁に使用されているが、双方の場合で、大きな分子（例えば、リボソームＲＮＡまたはｍＲＮＡ）の解析は困難である。これらの方法では、ＲＮＡは非特異的なリボヌクレアーゼによって短いＲＮＡ生成物またはリボヌクレオチドに断片化され、多くの生成物は結果の解釈を困難で不可能なものにさえする。新しい配列特異的な二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、その誘導体および／または変異体の適用により、繰り返し発生する小さなフラグメントへのＲＮＡ分子の制御された切断が可能となる。分子量と特性を独立して決定することができるため、以前は不可能であるか非常に困難であったリボヌクレオチドの化学的修飾の解析とＲＮＡの構造学的研究が可能となる。ＲＮＡ分子の修飾と構造に関するそのような研究は、潜在的な治療ターゲット、例えば、抗生物質に対する細菌耐性の機構についての情報を提供する。新しい配列特異的な二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、その誘導体および／または変異体の適用により、短い干渉二本鎖ＲＮＡ分子であるＲＮＡｉに基づく技術の進歩が可能になる。配列特異的な二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、その誘導体および／または変異体は、例えば、癌、代謝疾患、および神経変性疾患を治療する医学における遺伝子発現抑制のためのｓｉＲＮＡ方法および用途で使用されるであろう。現在のところ、短い二本鎖ＲＮＡを得ることにつながる戦略の１つは、大腸菌からリボヌクレアーゼＩＩＩを含むＤＮＡの特定のセグメントから生成される長い二本鎖ＲＮＡを処理することである。この酵素は二本鎖ＲＮＡを非特異的に切断して、１８−２５の塩基対フラグメントを生成する。短いフラグメントは遺伝子発現抑制に使用される。特定のｓｉＲＮＡが生成されるまったく新しく未知なる可能性は、本発明の配列特異的な二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、その誘導体および／または変異体によって使用され、的外れな効果なく特定の遺伝子の発現を効率よく抑制する、規定のプールの二本鎖ＲＮＡフラグメントの生成を可能にする。

【0036】

配列特異的な二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、その誘導体および／または変異体は、二本鎖ＲＮＡウイルスによって引き起こされた疾患の診断および処置に適用することができる。そのようなウイルスは、３つのグループがヒトにとって病原性であるレオウイルス科ファミリーに属する。現在のところ、これらのグループを検知特定するためには、逆転写反応が用いられ、その後ＰＣＲが使用される。本発明の配列特異的な二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、その誘導体および／または変異体を利用できるため、診断を著しく速める二本鎖ＲＮＡの操作が可能となる。現在のところ、ロタウイルスのための処置はほとんど役に立たない。配列特異的な二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、その誘導体および／または変異体は、特定のウィルスゲノムを切断することによってロタウイルス疾患の処置のための薬物に使用され、それによってそのさらなる複製を防ぐ。

【0037】

配列特異的な二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、その誘導体および／または変異体は、ナノテクノロジー、とりわけ、「ＲＮＡ ｔｅｃｔｏｎｉｃｓ」と、所定のＲＮＡ配列および構造に基づいたナノストラクチャーの生成にも用いられるだろう。

【0038】

本明細書で引用される公開公報とその参照物は、参考として本明細書に完全に組み込まれる。

【図面の簡単な説明】

【0039】

本発明をよりよく理解するために、本発明は実施例と添付の図を用いて例証されている。

【0040】

【図1】フソバクテリウム・ヌクレアタムからのエンドリボヌクレアーゼＭｉｎｉ ＩＩＩと二本鎖ＲＮＡの複合体の構造モデル。ループ（Ｌ）は矢印によってマークされた二本鎖ＲＮＡの主溝にある。

【図2】最適な反応条件を決定するために行なわれた、バチルス・サブティリスからのエンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵによるインビトロでの切断を示す。Ａ−２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡの切断に対するｐＨの効果。１−ｐＨ６．８、２−ｐＨ７．０、３−ｐＨ７．５、４−ｐＨ７．８、５−ｐＨ８．０、６−ｐＨ８．２、７−ｐＨ８．５、８−ｐＨ８．８、９−二本鎖ＲＮＡマーカー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｎｏ： Ｎ０３６３Ｓ）Ｂ−２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡの切断に対する温度の効果。１−１５°Ｃ、２−２５°Ｃ、３−３０°Ｃ、４−３５°Ｃ、５−４０°Ｃ、６−４５°Ｃ、７−５０°Ｃ、８−５５°Ｃ。Ｃ−２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡの切断に対するＮａＣｌ濃度の効果。１−５ｍＭ、２−２０ｍＭ、３−４０ｍＭ、４−６０ｍＭ、５−８０ｍＭ、６−１００ｍＭ、７−非切断基質、８−マーカー二本鎖ＲＮＡ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｎｏ： Ｎ０３６３Ｓ）；Ｄ−２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡの切断に対するｍＭでのＭｇ^２＋イオン濃度の効果。１−０．０３、２−０．０５、３−０．０８、４−０．１、５−０．２５、６−０．５、７−１、８−２．５、９−５、１０−７．５、１１−１０、１２−１２．５、１３−１５、１４−１７．５ｍＭＭｇ^２＋

【図3】切断部位の近くのグアノシンでのリボースのメチル化に対するエンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵの感受性を示す。（Ａ）２つの基質の配列：矢印でマークした切断部位、星印でマークしたリボースのメチル化、（Ｂ）リボースのメチル化を含む基質と含まない気質の切断。１−メチル化を含まない３０ｂｐの非切断基質、２−切断部位に隣接するグアノシンのリボースのメチル化を含む３０ｂｐの非切断基質、３−切断部位に隣接する第２のヌクレオチド中のグアノシンのリボースのメチル化を含む３０ｂｐの非切断基質、４−マーカー標識二本鎖ＲＮＡ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｎｏ：Ｎ０３６３Ｓ）５−エンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵで処理されたメチル化を含まない３０ｂｐの基質、６−エンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵで処理された切断部位に隣接するグアノシン残基のリボースのメチル化を含む３０ｂｐの基質、７−切断部位に隣接する第２のヌクレオチド中のグアノシンのリボースのメチル化を含む３０ｂｐの基質。

【図4】エンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵのための最小の基質の長さの測定。１−エンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵで処理された１８ｂｐの基質、２−未処理の１８ｂｐの基質、３−エンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵで処理された２０ｂｐの基質、４−未処理の２０ｂｐの基質、５−エンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵで処理された２２ｂｐの基質、６−ＤＮＡマーカー（極低範囲、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｎｏ：ＳＭ１２１１）。

【図5】エンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵ野生型（エンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵ^ＷＴ）とＤ９５Ｒ変異体（エンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵ^Ｄ９５Ｒ）の配列優先性の比較。１−バクテリオファージΦ６ 二本鎖ＲＮＡゲノム、２−エンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵ^ＷＴで切断されたバクテリオファージΦ６ 二本鎖ＲＮＡゲノム、３−エンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵ Ｄ９４Ｒで切断されたバクテリオファージΦ６ 二本鎖ＲＮＡゲノム、４−２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡ、５−エンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵ^ＷＴで切断された２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡ、６−Ｄ９４Ｒ変異体で切断された２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡ。

【図6】（Ａ）：２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのトップの上鎖のエンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵ切断部位の特定。１−上鎖（ｔｏｐ ｓｔｒａｎｄ）の切断部位のマッピング、２−ｄｄＣＴＰによる鎖停止、３−ｄｄＴＴＰによる鎖停止−、４−ｄｄＡＴＰによる鎖停止、５−ｄｄＧＴＰによる鎖停止。（Ｂ）：２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡの下鎖（ｂｏｔｔｏｍ ｓｔｒａｎｄ）（のエンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵ切断部位の特定。１−下鎖の切断部位のマッピング、２−ｄｄＧＴＰによる鎖停止、３−ｄｄＡＴＰを含む鎖停止、４−ｄｄＴＴＰを含む鎖停止、５−ｄｄＣＴＰを含む鎖停止。

【図7】（Ａ）：２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡの切断部位を囲む配列を含む３０ｂｐの二本鎖ＲＮＡ基質へ中の切断部位の特定。Ｓ−基質、Ｐ−生成物、Ｍ−マーカー、（Ｂ）：エンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵによる二本鎖ＲＮＡ切断の形状を示す。

【図8】３０ｂｐの二本鎖ＲＮＡ基質の切断。１−優先配列を含む３０ｂｐ基質、２−１５分間エンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵで処理した優先配列を含む３０ｂｐ基質、３−３０分間エンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵで処理した優先配列を含む３０ｂｐ基質、４−６０分間エンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵで処理した優先配列を含む３０ｂｐ基質、５−ＤＮＡマーカー（極低範囲、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｎｏ：ＳＭ１２１１）、６−３０ｂｐ基質Ｎ１、７−１５分間エンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵで処理した３０ｂｐ基質Ｎ１、８−３０分間エンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵで処理した３０ｂｐ基質Ｎ１、９−６０分間エンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵで処理した３０ｂｐ基質Ｎ１、１０−３０ｂｐ基質Ｎ２、１１−１５分間エンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵで処理した３０ｂｐ基質Ｎ２、１２−３０分間エンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵで処理した３０ｂｐ基質Ｎ２、１３−６０分間エンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵで処理した３０ｂｐ基質、１４−３０ｂｐ基質Ｎ３、１５−１５分間エンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵで処理した３０ｂｐ基質Ｎ３、１６−３０分間エンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵで処理した３０ｂｐ基質Ｎ３、１７−６０分間エンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵで処理した３０ｂｐ基質Ｎ３。

【発明を実施するための形態】

【0041】

以下の実施例は、本発明を例証し、その様々な態様について説明するために含まれており、本発明を限定するためではなく、および、特許請求の範囲で定義されるその全範囲と同等にみなされてはならない。

【0042】

以下の実施例において、特段明記されない限り、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．らの「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ． １９８９． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ」に記載される標準的な材料および方法が、特定の材料および方法についてのメーカーの推薦に従って用いられ、または、進められる。特段明記されない限り、本明細書では、アミノ酸、ヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのための標準的な略語が使用される。

【0043】

＜実施例１＞配列依存性の二本鎖ＲＮＡ切断活性を含むタンパク質をコードする遺伝子のコンピュータによる同定
酵素を切断する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、リボヌクレアーゼＩＩＩドメインを含有する。このグループはＤｉｃｅｒとＤｒｏｓｈａを含んでおり、これらはこのような酵素の機能に必要な追加のドメインを包含している。ここで、追加の二本鎖ＲＮＡ−結合ドメインと、追加の二本鎖ＲＮＡ結合ドメインを含まない酵素を含む、細菌の二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼも同様に分類される。

【0044】

ＰＤＢデータベース（ＰＤＢデータベースは、タンパク質および核酸およびその複合体の実験的に解明した構造の空間の座標を示している：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｄｂ．ｏｒｇ）で利用可能な数２ＥＺ６、２ＧＳＬ、１Ｕ６１を含む記録は、所望の基質の特異性を含むタンパク質を選択するために使用された。２ＥＺ６は、二本鎖ＲＮＡ基質とともに、二本鎖ＲＮＡ結合ドメインを有するＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓからのリボヌクレアーゼＩＩＩの構造を示す。２ＧＳＬと１Ｕ６１は、フソバクテリウム・ヌクレアタムとバチルス・セレウスそれぞれからのＭｉｎｉ ＩＩＩ エンドリボヌクレアーゼ（二本鎖ＲＮＡ結合ドメインを持っていない）の構造を示している。Ｓｗｉｓｓ−ＰｄｂＶｉｅｗｅｒ（Ｇｕｅｘ，Ｎ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，（１９９７）１８，２７１４−２７２３）を用いて、２ＧＳＬタンパク質の構造は、ＲＮＡ基質を含む複合体中の２ＥＺ６タンパク質の触媒の中心に重ねられた。我々は、一致した２ＧＳＬ エンドリボヌクレアーゼが、二本鎖ＲＮＡの主溝にあるループを有していることを発見した（図１を参照）。主溝にあるポリペプチド鎖のフラグメントは、２ＥＺ６複合体から元々の酵素の除去後、および、２ＧＳＬに由来するタンパク質と２ＥＺ６からのＲＮＡの新しい複合体の形成後に特定された。Ｍｉｎｉ ＩＩＩタンパク質−ＲＮＡ複合体の構造モデルは、ループがフソバクテリウム・ヌクレアタム Ｍｉｎｉ ＩＩＩタンパク質（ＦＮＵ）のための配列ＡＫＮＳＮＩＫＴＦＰＲＳＣＴを含有することを示しており、Ｍｉｎｉ ＩＩＩタンパク質に似ているタンパク質のアミノ酸配列のアライメントは、バチルス・サブティリスＭｉｎｉ ＩＩＩタンパク質（ＢＳＵ）からのループがアミノ酸配列ＧＲＮＡＫＳＧＴＴＰＫＮＴＤを有していることを示している。タンパク質のＭｉｎｉ ＩＩＩファミリーの各メンバーのループは、異なるアミノ酸配列を有しているが、しかしながら、それは二本鎖ＲＮＡの主溝にあることができ、二本鎖ＲＮＡを含むＭｉｎｉ ＩＩＩの配列特異的な相互作用の基盤を提供する。ＲＮＡを含むＭｉｎｉ ＩＩＩタンパク質中のこのループの相互作用は、二本鎖ＲＮＡの切断の経過中のＭｉｎｉ ＩＩＩの配列優先性をもたらすこともある。

【0045】

このことは、とりわけ、二本鎖ＲＮＡ、Ｍｉｎｉ ＩＩＩ、その機能的な変異体、および、「タンパク質のＭｉｎｉ ＩＩＩファミリー」としてまとめて記載される同様の配列を有する他のタンパク質の主溝にある図１のループＬを有している酵素が、不規則な螺旋二本鎖ＲＮＡ構造上での独立した二本鎖ＲＮＡ処理についてのヌクレオチド優先性を有してもよいことを意味しており、これは本発明のさらに記載される実施例で証明されている。

【0046】

したがって、クローン化とさらなる酵素工学のために、遺伝子は、生物体バチルス・サブティリス、フソバクテリウム・ヌクレアタム、および、バチルス・セレウスの細菌ゲノムの配列決定により特定された読み取り枠を用いて選択された。

【0047】

ＰＤＢデータベースでは、ＦＮＵとＢＣＥについて解明された構造が利用可能であり、したがって、それらをコードする遺伝子も同定される。Ｍｉｎｉ ＩＩＩファミリーに属するタンパク質のアミノ酸配列アライメントの結果、別の酵素ＢＳＵも実証研究に選ばれた。Ｍｉｎｉ ＩＩＩファミリーに属するタンパク質はすべて、二本鎖ＲＮＡ中の特定の配列の切断に優先性があってもよい。

【0048】

＜実施例２＞バチルス・サブティリス、フソバクテリウム・ヌクレアタム、および、バチルス・セレウスからの実施例１で指定された遺伝子のクローン化
ａ） 鋳型ＤＮＡの調製
ＡＴＣＣ菌株の採取から得られた冷凍乾燥細胞を、５００μｌのＬＢ中で懸濁し、その後、上記の懸濁液１μｌをＰＣＲ反応に加えた。ＡＴＣＣ ２３８５７として利用可能なバチルス・サブティリス、ＡＴＣＣ ２５５８６として利用可能なフソバクテリウム・ヌクレアタム、および、ＡＴＣＣ １４５７として利用可能なバチルス・セレウスの菌株から鋳型ＤＮＡを得た。

【0049】

ｂ） ベクターの調製
５００ナノグラムのベクターｐＥＴ２８（Ｎｏｖａｇｅｎ）を切断して、制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩを完成させ、生成物をアガロースゲル上で分離した。メーカーのプロトコルに従ってＧｅｌ Ｏｕｔ ｋｉｔ（Ａ＆Ａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて、大きさ５２８９ ｂｐの生成物をゲルから回復させた。

【0050】

ｃ） 二本鎖ＲＮＡの配列依存性の活性を含むタンパク質をコードする遺伝子のクローン化のためのＰＣＲ生成物の単離
適切な菌株から得られた１μｌのＤＮＡ鋳型を用いるＰＣＲ ａ）は５０μｌの反応混合物：５μｌの反応緩衝液、２００μＭのｄＮＴＰ混合物、１Ｕ Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、および、５０ｐｍｏｌの各プライマー：バチルス・サブティリスからのＤＮＡを用いた反応のためのＢｓｕ２８ｆおよびＢｓｕ２８、フソバクテリウム・ヌクレアタムからのＤＮＡを用いた反応のためのＦｎｕ２８ｆおよびＦｎｕ２８ｒ、バチルス・セレウスのＤＮＡを用いた反応のためのＢｃｅ２８ｆおよびＢｃｅ２８ｒ中で、Ｂｉｏｒａｄサーモサイクラー内で行なわれた。対照反応はＤＮＡ鋳型を含まずに行なわれた。

【0051】

【表1】

【0052】

ＰＣＲ反応は標準的な条件下で行なわれた。反応混合物をアガロースゲル上で分離し、予想される大きさ４４７ｂｐ、４０８ｂｐ、および、４２２ｂｐに一致するフラグメントを、Ｇｅｌ Ｏｕｔ ｋｉｔ（Ａ＆Ａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いてゲルから単離し、ＮｄｅＩとＸｈｏＩで切断した。Ｃｌｅａｎ Ｕｐ ｋｉｔ（Ａ＆Ａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて切断生成物を精製し、適切に得られたベクターと連結（ｌｉｇａｔｅｄ）させた。ｂ）ライゲーション反応はＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を用いて行った。１００μの化学的に形質転換受容性の（ｃｈｅｍｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）細菌の大腸菌の菌株Ｔｏｐ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、１０μｌのライゲーション反応混合物で形質転換させ、結果として生じた形質転換体をカナマイシン５０μｇ ｍｌを含むＬＢ固体培地上で選択した。Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ａ＆Ａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含む３ｍｌのＬＢ培地上で育てた選択したコロニーからプラスミドＤＮＡを単離した。組換えプラスミドを含む形質転換体の選択は、制限地図の分析に基づき、その後、サンプルを配列決定してコンストラクト（ＩＢＢ ＰＡＳのＤＮＡ配列決定および合成サービス）の正確さを確認した。

【0053】

このようにして以下のプラスミドを得た：
バチルス・サブティリス（ＢＳＵ エンドリボヌクレアーゼアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２で示される）のｙａｚＣ遺伝子からの野生型の配列特異的な二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼをコードするｐＥＴ２８Ｂｓｕ；
フソバクテリウム・ヌクレアタム（エンドリボヌクレアーゼ ＦＮＵ）からの野生型の配列特異的な二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼをコードするｐＥＴ２８Ｆｎｕ；
バチルス・セレウス（エンドリボヌクレアーゼ ＢＣＥ）からの野生型の配列特異的な二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼをコードするｐＥＴ２８Ｂｃｅ。

【0054】

＜実施例３＞バチルス・サブティリスからの野生型酵素をコードするｐＥＴ２８Ｂｓｕベクターからのタンパク質の発現および精製
大腸菌株ＥＲ２５６６（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を、実施例２で得られたｐＥＴ２８Ｂｓｕプラスミドで形質転換させた。形質転換は実施例２に記載のように行った。５０μｇ／ｍｌのカナマイシンと１％のグルコースを含むＬＢ固体培地上で菌株を選択した。５０μｇ／ｍｌのカナマイシンと１％のグルコースを含む２５ｍｌの液体ＬＢ培地に選択した形質転換体を接種し、３７°Ｃで１６時間インキュベートした。その後、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを補充した５００ｍｌの液体ＬＢに、２５ｍｌの培養物を接種し、３７°ＣでＯＤ６００〜０．６まで揺らしながらインキュベートし、その後、１ｍＭの終末濃度にＩＰＴＧを加えることによって、タンパク質の発現を誘発した。誘発は揺らしながら３７°Ｃで３時間行った。培養物を４°Ｃで１０分間、５０００ｇで遠心分離機にかけ、ＳＴＥ緩衝液中で再懸濁させ、再度遠心分離機にかけた。ペレット剤を２０ｍｌの溶菌液（５０ｍＭ ＮａＰＯ_４ ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、１０％グリセロール、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１０ｍＭ ＢＭＥ、０．１％トリトンＸ−１００）中で懸濁し、次に、細菌細胞を、１３６０気圧下でＣｅｌｌ Ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ（Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＬＴＤ）を介して単一のパスを用いて分解した。２０分間４°Ｃで２００００ｇで超遠心分離機の遠心分離によって溶菌液を浄化した。タンパク質を、ペプチド鎖中にあるポリヒスチジンタグを用いて、親和性クロマトグラフィーによって精製した。

【0055】

細胞溶解物を、４倍分の溶解緩衝液で平衡に保った５ｍｌのＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む７×１．５ｃｍのカラムに塗布した。カラムを以下の緩衝液：溶菌液（５０ｍｌ）、２ＭのＮａＣｌ（５０ｍｌ）を補充した溶菌液、（２０ｍＭ（５０ｍｌ）の濃度までイミダゾールを補充した溶菌液で順次洗浄した。タンパク質を、２５０ｍＭイミダゾールを補充した溶解緩衝液で溶出し、１．５ｍｌの画分を採取した。流速は０．９ｍｌ／分で、温度は４°Ｃであった。タンパク質を含む画分を組み合わせ、緩衝液Ｒ（：３０ｍＭ ＮａＰＯ_４ ｐＨ８．０、３０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１０ｍＭ ＢＭＥ）中で全体積５０ｍｌになるまで希釈した。

【0056】

ポリヒスチジンタグを切り離すために、４ Ｕトロンビン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ｎｏ．Ｃａｔａｌｏｇ Ｔ４６４８）を加え、その混合物を４°Ｃで一晩中インキュベートした。トロンビンとポリヒスチジンタグからタンパク質を精製するために、ＳＰセファロースカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、イオン交換クロマトグラフィーを使用した。タンパク質は、緩衝液Ｒ中で３０ｍＭから１ＭまでＮａＣｌ濃度の直線濃度勾配で溶出させ、１．５ｍｌの画分を採取した。タンパク質を含む画分を組み合わせ、希釈し、−７０°Ｃで冷凍した。

【0057】

＜実施例４＞二本鎖ＲＮＡ基質の調製
発現したタンパク質のエンドリボヌクレアーゼ活性の測定に、以下の基質が用いられた。
ａ）３つのセグメント：２９４８ｂｐ（Ｓ）、４０６３ｂｐ（Ｍ）、および、６３７４ｂｐ（Ｌ）からなるバクテリオファージΦ６ゲノム。この基質は４６の共通の切断配列を含むが、好ましい切断配列を含んでいない。バクテリオファージΦ６の二本鎖ＲＮＡはＦｉｎｎｚｙｍｅｓから購入した。
ｂ）インビトロで合成した二本鎖ＲＮＡ基質（長さ２３４ｂｐ）。この基質は１つの好ましい切断部位を含んでいる。

【0058】

Ｔ７プロモータ部位（修飾されたｐＫＳＩＩの配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２で示される）とプライマーの下流で、修飾したＤＮＡ配列を含む２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡ ｐＫＳＩＩプラスミドの合成のために、
ｂｓｕＲＮＡｆ ５’ＧＣＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１２）と、
ｂｓｕＲＮＡｒ ５’ＧＧＡＡＡＡＡＡＡＴＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＧＴＴＧＴＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１３）が使用された。

【0059】

合成は、Ｒｅｐｌｉｃａｔｅｒ ＲＮＡｉ Ｋｉｔ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ。メーカーのプロトコルに従う）を用いて行なった。

【0060】

ｃ）短い１８、２０、２２、および３０ｂｐの二本鎖ＲＮＡ

【0061】

一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドをＭｅｔａｂｉｏｎで合成した。補足的なオリゴヌクレオチド（それぞれ１．５ｎｍｏｌ）を、１：１の割合で混合した。３０μｌの混合物を９５°Ｃに加熱し、次に、２時間にわたって室温まで冷ました。オリゴヌクレオチド配列は以下に列挙される：
・１８Ｆ−５’ＡＣＣＧＵＣＧＡＣＣＵＣＧＡＧＧＧＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１４）
・１８Ｒ−５’ＣＣＣＣＵＣＧＡＧＧＵＣＧＡＣＧＧＵ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１５）
・２０Ｆ−５’ＡＵＡＣＣＧＵＣＧＡＣＣＵＣＧＡＧＧＧＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１６）
・２０Ｒ−５’ＣＣＣＣＵＣＧＡＧＧＵＣＧＡＣＧＧＵＡＵ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１７）
・２２Ｆ−５’ＡＵＡＣＣＧＵＣＧＡＣＣＵＣＧＡＧＧＧＧＧＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１８）
・２２Ｒ−５’ＣＣＣＣＣＣＵＣＧＡＧＧＵＣＧＡＣＧＧＵＡＵ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１９）
・３０Ｆ−５’ＣＧＡＵＡＣＣＧＵＣＧＡＣＣＵＣＧＡＧＧＧＧＧＧＧＣＣＣＧＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２０）
・３０Ｒ−５’ＣＣＧＧＧＣＣＣＣＣＣＣＵＣＧＵＧＧＵＣＧＡＣＧＧＵＡＵＣＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２１）
・３０Ｎ１Ｆ−５’ＵＣＧＡＧＵＵＧＣＣＧＧＵＵＧＣＵＧＵＧＡＵＧＧＣＣＧＵＵＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２２）
・３０Ｎ１Ｒ−５’ＧＡＡＣＧＧＣＣＡＵＣＡＣＡＧＣＡＡＣＣＧＧＣＡＡＣＵＣＧＡ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２３）
・３０Ｎ２Ｆ−５’ＣＣＡＣＵＣＵＵＡＧＡＵＡＣＣＣＧＡＵＵＣＣＣＣＵＧＵＵＵＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２４）
・３０Ｎ２Ｒ−５’ＧＡＡＡＣＡＧＧＧＧＡＡＵＣＧＧＧＵＡＵＣＵＡＡＧＡＧＵＧＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２５）
・３０Ｎ３Ｆ−５’ＵＣＵＧＡＵＧＧＧＣＧＣＵＡＣＣＧＧＵＵＣＣＧＧＵＡＡＧＵＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２６）
・３０Ｎ３Ｒ−５’ＧＡＣＵＵＡＣＣＧＧＡＡＣＣＧＧＵＡＧＣＧＣＣＣＡＵＣＡＧＡ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２７）

【0062】

＜実施例５＞生成された酵素による二本鎖ＲＮＡ基質の切断
酵素による基質切断の反応を１時間にわたって３７°Ｃで行なった。１５μｌの反応混合物は、実施例３に従って調製された４ｐｍｏｌの対応する酵素、実施例４に従って得られた２ｐｍｏｌの基質、１．５μｌの反応緩衝液（１００ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．５、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）を含んでいた。生成物を、標準的なアガロースゲル電気泳動法、または、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（６％ポリアクリルアミド、ＴＢＥ：１３５ｍＭトリス−ＨＣｌ、４５ｍＭホウ酸、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ）で分離した。電気泳動の後、ゲルを１０分間、臭化エチジウムで染色し、紫外線を用いて生成物を視覚化した。

【0063】

＜実施例６＞二本鎖ＲＮＡ中の切断部位の測定
ａ） プライマーによる標識化
配列５’ＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２８）を含むＲＴｒプライマーと、配列５’ＧＡＴＣＣＣＣＣＡＣＡＡＴＣＣＴＧＴＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２９）を含むＲＴｆプライマーを、［γ−３３Ｐ］ＡＴＰを使用して放射活性物質で標識した。１０ｐｍｏｌのプライマー、１μｌ反応緩衝液、１０μＣｉ［γ−３３Ｐ］ＡＴＰ、および、１Ｕ Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を含む反応（１０μｌ体積）を、３０分間３７°Ｃで行なった。

【0064】

ｂ）２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡ上の切断部位の特定
実施例４ｂで得られた２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡ基質では、エンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵ^ＷＴの１つの切断部位しかないことが示された。２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡを、エンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵ^ＷＴを用いて、実施例５に記載されたように切断した。その後、９０ｂｐおよび１４４ｂｐの生成物をゲルから分離した。切断部位は逆転写反応を使用するので捜し出された。０．１μｇの各生成物を、実施例６ａからの放射活性物質で標識した１ｐｍｏｌのプライマーと混合した。これらの１２．５μｌの混合物を、５分間９５０Ｃでインキュベートした。その後、混合物に、４μｌ反応緩衝液（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、２０ＵリボヌクレアーゼインヒビターＲｉｂｏＬｏｃｋ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、２μｌ １０ｍＭ ｄＮＴＰ、１０Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を補充し、その反応を６０分間４５°Ｃで行った。並行して、反応混合物に加えて、ｄＮＴＰに対して１：１００の割合でｄｄＡＴ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、または、ｄｄＵＴＰを加えた（反応を分離するために）ことを除けば、上記の逆転写反応を用いて、同じプライマーと鋳型で配列決定を行った。反応生成物を、６％変成ポリアクリルアミドゲル（６％のポリアクリルアミド、ＴＢＥ： １３５ｍＭ トリス−ＨＣｌ、４５ｍＭ ホウ酸、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、８Ｍ尿素）上で分離し、貯蔵用蛍光スクリーン（Ｓｔｏｒａｇｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｒ Ｓｃｒｅｅｎ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に１６時間さらし、Ｓｔｏｒｍ ｓｃａｎｎｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて視覚化した。二本鎖ＲＮＡの上鎖のヌクレオチド位置９０と９１（図６Ａと表２を参照）、および、下鎖の位置１４６と１４７（図６Ｂを参照）の間に切断部位を位置付けた。

【0065】

ｃ）二本鎖ＲＮＡの両方の鎖での切断部位の特定
両方の鎖での切断部位を決定するために、ＲＮＡオリゴヌクレオチド３０Ｆと３０Ｒをアニーリングすることによって、３０ｂｐの二本鎖ＲＮＡ基質を調製した。１つの鎖の５’末端を、［γ−３３Ｐ］ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで標識化し、標識化されていない補足的なオリゴヌクレオチドをアニーリングした。２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡに由来する切断部位配列を含む一本鎖ＲＮＡ分子を合成した（Ｍｅｔａｂｉｏｎ）。基質をエンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵ^ＷＴで切断した。生成物を、１５％変成ポリアクリルアミドゲル（１５％のポリアクリルアミド、ＴＢＥ： １３５ｍＭ トリス−ＨＣｌ、４５ｍＭ ホウ酸、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、８Ｍ尿素）上で分離した。実施例６ｂのように、生成物の視覚化を行った。その結果を図７に示す。生成された末端の正確な切断部位と形状を測定した。エンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵ^ＷＴは、２ヌクレオチド３’オーバーハングを生成する（図７ｂ）。

【0066】

【表2】

【0067】

バチルス・サブティリスからのエンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵ^ＷＴは、２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡの１つの部位を特異的に識別し、切断することが明らかになった。

【0068】

＜実施例７＞生成された酵素による二本鎖ＲＮＡ基質のインビトロでの切断の最適な反応条件の決定
ａ）エンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵ^ＷＴの酵素活性に対する条件変化の影響
野生型のエンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵの酵素活性に対する様々な因子の影響を調べた。最適条件を、様々な温度、ｐＨ、ＮａＣｌ濃度、および、マグネシウム２＋イオン濃度下のインビトロの切断で測定した。試験したパラメーターのみを変えることで、実施例５のように切断反応を行った。基質の切断に対するｐＨの効果はｐＨ値：６．８、７．０、７．５、８．０、８．２、８．５、８．８で試験した。２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡ基質の最良の切断がｐＨ６．８、７．０、７．５、７．８（図３Ａ）で得られることがわかる。活性に対する温度の効果は、温度：１５°Ｃ、２５°Ｃ、３０°Ｃ、３５°Ｃ、４０°Ｃ、４５°Ｃ、５０°Ｃ、５５°Ｃで試験した。切断の最適温度は３５°Ｃと４５°Ｃの間であった（図２Ｂ）。この温度範囲以外では、基質はより緩慢な速度で切断される。イオン濃度の効果は、５、２０、４０、６０、８０、１００ｍＭのＮａＣｌ濃度で研究した。酵素活性に最適な条件は、５−６０ｍＭまでの塩化ナトリウムに及ぶ（図２Ｃ）。基質の切断効率は、高濃度の塩で減少する。マグネシウム２＋イオン濃度の効果は、０．０３、０．０５、０．０８、０．１、０．２５、０．５、１、２．５、５、７．５、１０、１２．５、１５、１７．５ｍＭの値で試験した。反応混合物中の最適なＭｇ^２＋イオン濃度は、１−２．５ｍＭである（図２Ｄ）。この範囲外では、基質はより緩慢な速度で切断される。

【0069】

ｂ）エンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵ^ＷＴ切断部位付近でのリボースのメチル化の効果
切断部位付近のリボースのメチル化に対するエンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵ^ＷＴの感受性を解析した。２つのグアノシンのリボースのメチル化を含む３０ｂｐの二本鎖ＲＮＡ基質を試験した（図３Ａ）。実施例５のように切断反応を行った。メチル化されたグアノシンリボースを含む２つの基質は切断されない（図３Ｂ）。酵素は、切断部位に接近している２つのグアノシン残基のリボースのメチル化に高感度である。

【0070】

ｃ）エンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵ^ＷＴによる二本鎖ＲＮＡの切断のための最小長さの基質の同定
エンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵ^ＷＴの最小の二本鎖ＲＮＡ基質を同定した。この目的のために、１８、２０、および２２ｂｐの基質を調べた。エンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵ^ＷＴは、２２の塩基対の長さで二本鎖ＲＮＡを切断することができる（図４）。それよりも短い基質は切断されない。

【0071】

＜実施例８＞置換による基質ライブラリーの構築と二本鎖ＲＮＡ基質の産生
ａ）置換による基質ライブラリーの構築
２３４ｂｐの基質（表２）のための切断部位を含む核酸のフラグメント中に、１４の単一位置置換ライブラリー（ｓｉｎｂｌｅ ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）を構築した。置換を導入するために、対のプライマーを、所定の位置で変異によって設計した。対のプライマーの１つは適切な置換を含んでいる。ＰＣＲのための鋳型は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２で示される修飾したプラスミドｐＫＳＩＩであった。各プライマー対を用いたＰＣＲ反応を、実施例２に記載の方法と条件に従って行なった。置換ライブラリーを生成するために使用されるプライマーの配列を以下の表３に示す。

【0072】

表３は、置換ライブラリー形成で使用されるプライマー対の位置の数、配列、および、名前を示している（Ｈ＝ＡまたはＣまたはＵ；Ｄ＝ＡまたはＧまたはＵ；Ｂ＝ＣまたはＧまたはＵ；Ｖ＝ＡまたはＣまたはＧ）。

【0073】

【表3】

【0074】

実施例２に記載されているように、ＰＣＲ生成物をアガロースゲル上で分離させ、その後、単離した。単離した生成物をリン酸化し、ライゲートした。その反応は１時間３７°Ｃで行なわれた。２０μｌのライゲ―ション反応混合物は、１００ナノグラムのＰＣＲ生成物、２μｌの反応緩衝液、１０ｍＭ ＡＴＰ、１Ｕ Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、および、１Ｕ Ｔ４ＤＮＡリガーゼを含んでいた。大腸菌ＴＯＰ１０細胞を、実施例１に記載されているように、１０μｌのライゲ―ション反応混合物で形質転換させた。その後、細胞を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンとともにＬＢペトリ皿上で蒔いた。導入された置換コンストラクトを含むクローンを探索するために、実施例２に記載されているように配列決定することによって、配列を分析した。導入された適切な置換を含むプラスミドに、ライブラリーとして、１から１４まで番号を振った。これは二本鎖ＲＮＡを合成するために鋳型として役立った。

【0075】

ｂ）ａ）で適切に得られた置換ライブラリーからの二本鎖ＲＮＡ基質のインビトロの合成
１から１４までの数字で特定された置換ライブラリーから選択されたコンストラクトを、実施例４ｂに記載されたプライマーｂｓｕＲＮＡｆおよびｂｓｕＲＮＡｒを用いて、二本鎖ＲＮＡを合成するための鋳型として使用した。

【0076】

＜実施例９＞エンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵＷＴに好ましい切断配列の決定
実施例８ｂで合成された基質を使用して優先配列を決定した。実施例３に従って調製したエンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵ^ＷＴを用いて、実施例５のように切断反応を行った。以下の表４は、エンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵ^ＷＴに対する測定した配列優先性を示す。

【0077】

【表4】

【0078】

二本鎖ＲＮＡの切断中のエンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵ^ＷＴは、配列優先権を示した。表５に以下に示されるように、好ましい切断配列を書くことができる。

【0079】

表５は、エンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵ^ＷＴのための二本鎖ＲＮＡの好ましい切断配列を示す。切断部位を矢印によって示す（Ｙ＝ＣまたはＵ；Ｒ＝ＡまたはＧ；Ｎ＝ＧまたはＡまたはＵまたはＣ）。

【0080】

【表5】

【0081】

しかしながら、エンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵ^ＷＴは、以下の表６に示されるような共通配列を有する二本鎖ＲＮＡ基質を切断することもできる。

【0082】

表６は、エンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵ^ＷＴ 二本鎖ＲＮＡ基質の共通配列を示す。切断部位は矢印によって示される（Ｈ＝ＡまたはＣまたはＵ；Ｄ＝ＡまたはＧまたはＵ）。

【0083】

【表6】

【0084】

エンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵ^ＷＴは、二本鎖ＲＮＡ中の３’２ヌクレオチド・オーバーハングを含む付着末端を生成する。

【0085】

＜実施例１０＞エンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵ変異体の形成
エンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵ^ＷＴのｗｔ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１）をコードする組み換え型は、二本鎖ＲＮＡの主溝にあるループ内に位置する残基をコードする選択されたコドンの置換変異誘発にさらされた（図１）。タンパク質中の置換は、適切に設計されたプライマー対を用いて導入された。ＰＣＲ反応用の鋳型はプラスミドｐＥＴ２８Ｂｓｕ（実施例２）であった。導入された置換を用いてコード配列の変異体を増幅するためのＰＣＲ反応は、以下の表７に列挙されるプライマー対を用いて、実施例２に記載されているように行なわれた。

【0086】

表７は、選択されたアミノ酸位置で異なるエンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵ変異体を得るべく、置換の導入に使用したプライマー対の配列と名前を示す。置換の種類は表８に示される。

【0087】

【表7】

【0088】

リン酸化、ライゲ―ション反応、およびコンストラクトの形質転換の手順は、実施例８のように行なわれた。ｅｘｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓを５０μｇ／μｌカナマイシンを含むＬＢ寒天上に蒔いた。成長したコロニーを実施例２ｂのように接種し、プラスミドを実施例２ｂのように単離した。適切な形質転換体の選択と、所望の置換の配列正確性の確認は、サンプルの配列決定に基づいた（ＳＳＩＳ ＤＮＡ ＩＢＢ ＰＡＳ）。

【0089】

＜実施例１１＞エンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵタンパク質変異体の発現および精製と、エンドヌクレアーゼ活性アッセイ
アミノ酸残基Ｋ７９、Ｒ８０、Ｒ８２、Ｎ８３、Ｋ８５、Ｓ８６、Ｔ８８、Ｋ９１、Ｎ９２、Ｄ９４の位置のアラニンに対する置換を含む１０の変異体を調製した。実施例３のように、変異体の発現および精製を行った。その後、ヌクレオチド活性を調べた。その結果を表８に示す。位置Ｒ８０、Ｒ８２、Ｋ８５、Ｔ８８、Ｋ９１、Ｎ９２、Ｄ９４は、酵素の配列特異性に関係するかもしれない。それらは、恐らく二本鎖ＲＮＡ核酸中の塩基と相互に作用し、したがって、さらなる置換変異誘発については、アラニンに対する置換が酵素を不活性化したか、あるいは、その活性を減少させた位置が選択された。

【0090】

【表8】

【0091】

位置番号９４（Ｄ９４Ｒ）のアルギニンに対する置換変異体を作成した。タンパク質を工程３のように精製し、そのエンドリボヌクレアーゼ活性を２つの基質：バクテリオファージΦ６ゲノム、および、２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡで試験した。好ましい切断部位を有している２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡは、野生型酵素およびＤ９４Ｒ変異体によって同様に切断された。３８の共通な切断部位を有するΦ６二本鎖ＲＮＡは、両方の酵素によって同じ効率では切断されなかった。Ｄ９４Ｒ変異体による切断は、野生型の酵素と比較して、低下した。得られた結果を図５に示す。変異体Ｄ９４Ｒは二本鎖ＲＮＡの優先配列に対する選択性を増加させていることがわかる。酵素の選択性の増加は、二本鎖ＲＮＡの配列認識および切断を狭める結果を招くことになる。上記の結果によって、二本鎖ＲＮＡの主溝にあるループは、二本鎖ＲＮＡの配列によってのみ決定されるとともに不規則な螺旋構造および／または他のタンパク質との協働からは独立している、二本鎖ＲＮＡ切断時の配列特異性を決定することが明らかになった。該方法は、二本鎖ＲＮＡ切断における配列特異性の増加を示す二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼの誘導体および／または変異体につながる選択も実証しており、好ましくは、二本鎖ＲＮＡの配列特異的な切断を含む誘導体および／または変異体を得る上記のような方法で、エンドリボヌクレアーゼ誘導体および／または変異体は、好ましくは、二本鎖ＲＮＡの切断における特異的な配列に対する感受性の変化、増大を伴って生成される。

【0092】

＜実施例１２＞３つの短い３０ｂｐの二本鎖ＲＮＡの切断
３０ｂｐの二本鎖ＲＮＡ基質は、実施例４に記載のＲＮＡオリゴヌクレオチド３０Ｎ１Ｆおよび３０Ｎ１Ｒ、３０Ｎ２Ｆおよび３０Ｎ２Ｒ、３０Ｎ３Ｆおよび３０Ｎ３Ｒをアニーリングすることによって調製された。実施例４からのオリゴヌクレオチド３０Ｆおよび３０Ｒから調製された優先配列を含む３０ｂｐの二本鎖ＲＮＡを、対照として使用した。実施例３に従って調製したエンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵ^ＷＴを用いて、実施例５のように切断反応を行った。調製した基質を、エンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵ^ＷＴによって切断した。１５％変成ポリアクリルアミドゲル（１５％ポリアクリルアミド、ＴＢＥ：１３５ｍＭ トリス−ＨＣｌ、４５ｍＭ ホウ酸、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、８Ｍ）上で生成物を分離した。生成物の視覚化を実施例６ｂで行った。その結果を図８に示す。３つの試験した基質を切断しない。

【0093】

＜記載で同定した配列のリスト＞
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１ − バチルス・サブティリスからの二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵ^ＷＴのアミノ酸配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２ − 修飾されたベクターｐＫＳ ＩＩの配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３ − 二本鎖ＲＮＡの主溝にあって主溝に相互作用するループを形成するフソバクテリウム・ヌクレアタムからのエンドリボヌクレアーゼ ＦＮＵのポリペプチド鎖のフラグメント
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４ − 二本鎖ＲＮＡの主溝にあって主溝に相互作用するループを形成するバチルス・サブティリスからのエンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵのポリペプチド鎖のフラグメント
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ５ − 二本鎖ＲＮＡの主溝にあって主溝に相互作用するループを形成するバチルス・セレウスからのエンドリボヌクレアーゼ ＢＣＥのポリペプチド鎖のフラグメント
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ６ − エンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵ遺伝子増幅用プライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ７ − エンドリボヌクレアーゼ ＢＳＵ遺伝子増幅用プライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ８ − エンドリボヌクレアーゼ ＦＮＵ遺伝子増幅用プライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ９ − エンドリボヌクレアーゼ ＦＮＵ遺伝子増幅用プライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１０ − エンドリボヌクレアーゼ ＢＣＥ遺伝子増幅用プライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１１ − エンドリボヌクレアーゼ ＢＣＥ遺伝子増幅用プライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１２ − ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡ合成用のｂｓｕＲＮＡｆプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１３ − ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡ合成用のｂｓｕＲＮＡｒプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１４ − １８ｂｐの二本鎖ＲＮＡ調製用の１８Ｆのオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１５ − １８ｂｐの二本鎖ＲＮＡ調製用の１８Ｒオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１６ − ２０ｂｐの二本鎖ＲＮＡ調製用の２０Ｆオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１７ − ２０ｂｐの二本鎖ＲＮＡ調製用の２０Ｒオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１８ − ２２ｂｐの二本鎖ＲＮＡ調製用の２２Ｆオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１９ − ２２ｂｐの二本鎖ＲＮＡ調製用の２２Ｒオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２０ − ３０ｂｐの二本鎖ＲＮＡ調製用の３０Ｆオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２１ − ３０ｂｐの二本鎖ＲＮＡ調製用の３０Ｒオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２２ − Ｎ１ ３０ｂｐの二本鎖ＲＮＡ調製用の３０Ｎ１Ｆオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２３ − Ｎ１ ３０ｂｐの二本鎖ＲＮＡ調製用の３０Ｎ１Ｒオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２４ − Ｎ２ ３０ｂｐの二本鎖ＲＮＡ調製用の３０Ｎ２Ｆオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２５ − Ｎ２ ３０ｂｐの二本鎖ＲＮＡ調製用の３０Ｎ２Ｒオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２６ − Ｎ３ ３０ｂｐの二本鎖ＲＮＡ調製用の３０Ｎ３Ｆオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２７ − Ｎ３ ３０ｂｐの二本鎖ＲＮＡ調製用の３０Ｎ３Ｒオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２８ − 逆転写反応用のＲＴｒプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２９ − 逆転写反応用のＲＴｆプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３０ − ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡ基質のヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３１ − ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡの置換ライブラリー生成用のＳｕｂｆプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３２ − ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡの置換ライブラリー生成用のＳｕｂ８３ｒプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３３ − ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡの置換ライブラリー生成用のＳｕｂ８４ｒプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３４ − ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡの置換ライブラリー生成用のＳｕｂ８５ｒプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３５ − ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡの置換ライブラリー生成用のＳｕｂ８６ｒプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３６ − ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡの置換ライブラリー生成用のＳｕｂ８７ｒプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３７ − ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡの置換ライブラリー生成用のＳｕｂ８８ｒプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３８ − ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡの置換ライブラリー生成用のＳｕｂ８９ｒプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３９ − ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡの置換ライブラリー生成用のＳｕｂｒプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４０ − ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡの置換ライブラリー生成用のＳｕｂ９０ｆプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４１ − ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡの置換ライブラリー生成用のＳｕｂ９１ｆプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４２ − ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡの置換ライブラリー生成用のＳｕｂ９２ｆプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４３ − ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡの置換ライブラリー生成用のＳｕｂ９３ｆプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４４ − ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡの置換ライブラリー生成用のＳｕｂ９４ｆプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４５ − ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡの置換ライブラリー生成用のＳｕｂ９５ｆプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４６ − ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡの置換ライブラリー生成用のＳｕｂ９６ｆプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４７ − ８３Ｇ ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４８ − ８３Ａ ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４９ − ８３Ｕ ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ５０ − ８４Ａ ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ５１ − ８４Ｕ ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ５２ − ８４Ｃ ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ５３ − ８５Ｇ ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ５４ − ８５Ａ ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ５５ − ８５Ｃ ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ５６ − ８６Ｇ ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ５７ − ８６Ａ ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ５８ − ８６Ｕ ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ５９ − ８７Ａ ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ６０ − ８７Ｕ ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ６１ − ８７Ｃ ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ６２ − ８８Ｇ ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ６３ − ８８Ｕ ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ６４ − ８８Ｃ ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ６５ − ８９Ｇ ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ６６ − ８９Ａ ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ６７ − ８９Ｕ ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ６８ − ９０Ｇ ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ６９ − ９０Ａ ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ７０ − ９０Ｕ ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ７１ − ９１Ｇ ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ７２ − ９１Ａ ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ７３ − ９１Ｃ ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ７４ − ９２Ｇ ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ７５ − ９２Ａ ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ７６ − ９２Ｕ ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ７７ − ９３Ａ ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ７８ − ９３Ｕ ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ７９ − ９３Ｃ ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ８０ − ９４Ｇ ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ８１ − ９４Ｕ ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ８２ − ９４Ｃ ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ８３ − ９５Ａ ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ８４ − ９５Ｕ ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ８５ − ９５Ｃ ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ８６ − ９６Ａ ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ８７ − ９６Ｕ ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ８８ − ９６Ｃ ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ８９ − Ｋ７９Ａｆプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ９０ − Ｋ７９Ａｒプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ９１ − Ｒ８０Ａｆプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ９２ − Ｒ８２Ａｒプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ９３ − Ｒ８２Ａｆプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ９４ − Ｒ８２Ａｒプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ９５ − Ｎ８３Ａｆプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ９６ − Ｎ８３Ａｒプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ９７ − Ｋ８５Ａｆプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ９８ − Ｋ８５Ａｒプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ９９ − Ｓ８６Ａｆプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１００ − Ｓ８６Ａｒプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１０１ − Ｔ８８Ａｆプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１０２ − Ｔ８８Ａｒプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１０３ − Ｋ９１Ａｆプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１０４ − Ｋ９１Ａｒプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１０５ − Ｎ９２Ａｆプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１０６ − Ｎ９２Ａｒプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１０７ − Ｄ９４Ａｆプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１０８ − Ｄ９４Ａｒプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１０９ − Ｄ９４Ｒｆプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１１０ − Ｄ９４Ｒｒプライマーのヌクレオチド配列

【0094】

【化3】

【0095】

【化4】

【0096】

【化5】

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図8】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]