知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6076968
(24)【登録日】2017年1月20日
(45)【発行日】2017年2月8日
(54)【発明の名称】ポルフィリン−リン脂質コンジュゲートを合成する方法
(51)【国際特許分類】
A61K 47/24 20060101AFI20170130BHJP
A61K 9/127 20060101ALI20170130BHJP
C12P 17/16 20060101ALI20170130BHJP
【ＦＩ】
A61K47/24
A61K9/127
C12P17/16
【請求項の数】6
【全頁数】18
(21)【出願番号】特願2014-513866(P2014-513866)
(86)(22)【出願日】2012年5月25日
(65)【公表番号】特表2014-516057(P2014-516057A)
(43)【公表日】2014年7月7日
(86)【国際出願番号】CA2012000500
(87)【国際公開番号】WO2012167350
(87)【国際公開日】20121213
【審査請求日】2015年5月11日
(31)【優先権主張番号】61/493,538
(32)【優先日】2011年6月6日
(33)【優先権主張国】US
(73)【特許権者】
【識別番号】510166124
【氏名又は名称】ユニバーシティ・ヘルス・ネットワーク
(74)【代理人】
【識別番号】100083806
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 秀和
(74)【代理人】
【識別番号】100095500
【弁理士】
【氏名又は名称】伊藤 正和
(74)【代理人】
【識別番号】100111235
【弁理士】
【氏名又は名称】原 裕子
(72)【発明者】
【氏名】ツェン、 ガン
(72)【発明者】
【氏名】ラヴェル、 ジョナサン
【審査官】
澤田 浩平
(56)【参考文献】
【文献】
国際公開第２０１１／０４４６７１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
国際公開第２００９／１１１４３９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
Nat Mater. 2011 Apr;10(4):324-32
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ａ６１Ｋ９／００−９／７２，４７／００−４７／４８，
Ｃ１２Ｐ１／００−４１／００
ＣＡＰＬＵＳ，ＭＥＤＬＩＮＥ，ＢＩＯＳＩＳ，ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ポルフィリン-リン脂質コンジュゲートのsn-1およびsn-2位置異性体の混合物から、前記ポルフィリン-リン脂質コンジュゲートの二重層を含むナノベシクルに組み入れるためのポルフィリン-リン脂質コンジュゲートの組成物を製造するための方法であって、
前記位置異性体の各々は、1つのリン脂質のsn-1位またはsn-2位のうちの1つにおける脂質側鎖に共有結合した1つのポルフィリン、ポルフィリン誘導体、またはポルフィリン類似体を含み、ここで、前記組成物は、位置異性体的に実質的に純粋であり、
前記方法は、前記位置異性体の混合物を、sn-1またはsn-2位置異性体のうちの1つを選択的に切断する酵素と共にインキュベートすることにより、前記組成物を位置異性体的に実質的に純粋にすることを含み、
前記酵素が、Thermomyces lanuginosus由来のリパーゼおよびミツバチ毒由来のホスホリパーゼA2からなる群より選択される、方法。
前記位置異性体の各々は、1つのリン脂質のsn-1位またはsn-2位のうちの1つにおける脂質側鎖に共有結合した1つのポルフィリン、ポルフィリン誘導体、またはポルフィリン類似体を含み、ここで、前記組成物は、位置異性体的に実質的に純粋であり、
前記方法は、前記位置異性体の混合物を、sn-1またはsn-2位置異性体のうちの1つを選択的に切断する酵素と共にインキュベートすることにより、前記組成物を位置異性体的に実質的に純粋にすることを含み、
前記酵素が、Thermomyces lanuginosus由来のリパーゼおよびミツバチ毒由来のホスホリパーゼA2からなる群より選択される、方法。
【請求項2】
前記ポルフィリン-リン脂質コンジュゲートの純度が>97%である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記組成物は、sn-1ポルフィリン-リン脂質コンジュゲートの位置異性体として実質的に純粋な組成物である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記酵素はThermomyces lanuginosus由来のリパーゼである、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記組成物は、sn-2ポルフィリン-リン脂質コンジュゲートの位置異性体として実質的に純粋な組成物である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項6】
前記酵素はミツバチ毒由来のホスホリパーゼA2である、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明の分野は、ポルフィリン-リン脂質コンジュゲートを合成および精製する方法に関し、より具体的には、規定された異性体純度を有するポルフィリン-リン脂質コンジュゲート組成物の合成および精製に関する。このポルフィリン-リン脂質コンジュゲート組成物はナノベシクルを形成することに特に適している。
【背景技術】
【0002】
最近、国際公開公報WO 11/044671号においてポルフィソームが記述された。これは、バイオフォトニクス画像法および治療のための固有のマルチモード性を有する生体適合性ナノ粒子である、ポルフィリン-リン脂質コンジュゲートから形成されたナノベシクルである（非特許文献1）。修飾化リン脂質は、核酸送達（カチオン性脂質）、画像診断（放射性同位体キレート化脂質）、生物学的現象の研究（蛍光脂質）、ならびに薬物動態（PEG化脂質）および構造（重合可能脂質）の調節を含む、多様なバイオテクノロジー的応用において有用であることが証明されてきた（非特許文献2〜4）。リン脂質は、その頭部基または側鎖上の様々な部位において標識できる（非特許文献5）。頭部基修飾は、ホスファチジルエタノールアミンの一級アミン基を使用して容易に達成され得る。側鎖修飾はそれほど単純ではないが、より疎水性のリガンドを結合させながら両親媒性リン脂質の性質を維持することに適している。近年、コレステロール、レチノイン酸、およびポルフィリンの側鎖で修飾されたリン脂質が開発され、これらは薬物送達、免疫学的応用、およびバイオフォトニクス的応用のための有用な特性を有している（非特許文献1、6〜9）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【特許文献1】国際公開公報WO 11/044671号
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】Lovell, J., F; Jin, C.; Huynh, E.; Jin, H.; Kim, C.; Rubinstein, J.; Chan, W. C. W.; Cao, W.; Wang, L.; Zheng, G. Nat. Materials 2011, 10: 324-332.
【非特許文献2】Sinkeldam, R. W.; Greco, N. J.; Tor, Y. Chemical Reviews 2010, 110, 2579-2619.
【非特許文献3】Torchilin, V. P. Nat Rev Drug Discov 2005, 4, 145-160.
【非特許文献4】Mueller, A.; O’Brien, D. F. Chemical Reviews 2002, 102, 727-758.
【非特許文献5】Rasmussen, J.-A. M.; Hermetter, A. Progress in Lipid Research 2008, 47, 436-460.
【非特許文献6】Huang, Z.; Szoka, F. C. Journal of the American Chemical Society 2008, 130, 15702-15712.
【非特許文献7】Huang, Z.; Jaafari, M. R.; Szoka, F. C. Angew. Chem. Int. Ed. Engl 2009, 48, 4146-4149.
【非特許文献8】Popov, A. V.; Mawn, T. M.; Kim, S.; Zheng, G.; Delikatny, E. J. Bioconjugate Chemistry 2010, 21, 1724-1727.
【非特許文献9】Watson, D. S.; Huang, Z.; Szoka, F. C. Immunol Cell Biol 2009, 87, 630-633.
【非特許文献10】Plueckthun, A.; Dennis, E. A. Biochemistry 1982, 21, 1743-1750.
【非特許文献11】Wichmann, O.; Schultz, C. Chem. Commun. 2001, 2500-2501.
【非特許文献12】Mason, J. T.; Broccoli, A. V.; Huang, C.-H. Analytical Biochemistry 1981, 113, 96-101.
【非特許文献13】Nicholas, A. W.; Khouri, L. G.; Ellington, J. C.; Porter, N. A. Lipids 1983, 18, 434-438.
【非特許文献14】Rosseto, R.; Hajdu, J. Tetrahedron Letters 2005, 46, 2941-2944.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
単一側鎖修飾化リン脂質の合成は、多くの場合、アシル基転位により影響される。得られる位置異性体（図1Aを参照）は類似した構造を有し、従ってそれらの分離を実行することができず、HPLC、NMR、および質量分析のような技術を使用してそれらを検出することが困難または不可能となる（非特許文献10）。いくつかの技術を使用して位置選択的リン脂質側鎖修飾が達成されてきた。修飾化グリセロール骨格を使用して複数工程の反応で修飾化リン脂質の合成が実施され、その場合は時として保護基が必要となった（非特許文献6、9、11）。脂肪酸塩化物、イミダゾール、無水物、およびチオピリジルエステルを用いたリゾリン脂質のアシル化は、方法および触媒によって様々な程度の異性体純度（70%〜99%）および収率（40%〜90%）を達成してきた（非特許文献12、13）。しかしながら、これらの反応性中間体の生成が分解を引き起こし、満足な収率または異性体純度を生じない可能性がある。標準的なカップリング剤を用いてカルボン酸をリゾリン脂質に直接アシル化することは簡便な合成経路であり、アシル基転位を減少させることをねらったプロトコール（ガラスビーズを用いた超音波処理など）が報告されている（非特許文献14）。
【課題を解決するための手段】
【0006】
一側面において、ポルフィリン-リン脂質コンジュゲートの二重層を含むナノベシクルが提供され、ここで、各々のポルフィリン-リン脂質コンジュゲートは、1つのリン脂質のsn-1位またはsn-2位のうちの1つにおける脂質側鎖に共有結合した1つのポルフィリン、ポルフィリン誘導体、またはポルフィリン類似体を含み、このナノベシクルは、規定されたsn-1:sn-2ポルフィリン-リン脂質コンジュゲートの位置異性体比を有する。
【0007】
さらなる側面において、ポルフィリン-リン脂質コンジュゲートの組成物が提供され、ここで、そのポルフィリン-リン脂質コンジュゲートは、1つのリン脂質のsn-1位またはsn-2位のうちの1つにおける脂質側鎖に共有結合した1つのポルフィリン、ポルフィリン誘導体、またはポルフィリン類似体を含み、この組成物は、規定されたsn-1:sn-2ポルフィリン-リン脂質コンジュゲートの位置異性体比を有する。
【0008】
さらなる側面において、ポルフィリン-リン脂質コンジュゲートのsn-1およびsn-2位置異性体の混合物からポルフィリン-リン脂質コンジュゲートの組成物を製造するための方法が提供され、前記位置異性体の各々は、1つのリン脂質のsn-1位またはsn-2位のうちの1つにおける脂質側鎖に共有結合した1つのポルフィリン、ポルフィリン誘導体、またはポルフィリン類似体を含み、ここで、この組成物は、規定されたsn-1:sn-2ポルフィリン-リン脂質コンジュゲートの位置異性体比を有し、この方法は、前記位置異性体の混合物を、前記規定された位置異性体比が達成されるまでsn-1またはsn-2位置異性体のうちの1つを選択的に切断する酵素と共にインキュベートすることを含む。
【0009】
さらなる側面によれば、ポルフィリン-リン脂質コンジュゲートのsn-1およびsn-2位置異性体の混合物を含む組成物から、ポルフィリン-リン脂質コンジュゲートのsn-1およびsn-2位置異性体のうちの1つを除去するための方法が提供され、この方法は、ポルフィリン-リン脂質コンジュゲートのsn-1およびsn-2位置異性体のうちの1つを酵素的に切断することを含む。
【0010】
さらなる側面において、ポルフィリン-リン脂質コンジュゲートのsn-1およびsn-2位置異性体の混合物からポルフィリン-リン脂質コンジュゲートの組成物を製造するための方法が提供され、前記位置異性体の各々は、1つのリン脂質のsn-1位またはsn-2位のうちの1つにおける脂質側鎖に共有結合した1つのポルフィリン、ポルフィリン誘導体、またはポルフィリン類似体を含み、ここで、この組成物は、規定されたsn-1:sn-2ポルフィリン-リン脂質コンジュゲートの位置異性体比を有し、この方法は、ポルフィリンおよびリン脂質のコンジュゲーション反応の出発材料の比を変動させることを含む。
【0011】
さらなる側面において、ポルフィリン-リン脂質コンジュゲートのsn-1およびsn-2位置異性体の混合物からポルフィリン-リン脂質コンジュゲートの組成物を製造するための方法が提供され、前記位置異性体の各々は、1つのリン脂質のsn-1位またはsn-2位のうちの1つにおける脂質側鎖に共有結合した1つのポルフィリン、ポルフィリン誘導体、またはポルフィリン類似体を含み、ここで、この組成物は、規定されたsn-1:sn-2ポルフィリン-リン脂質コンジュゲートの位置異性体比を有し、この方法は、前記混合物を、有機抽出およびそれに続くシリカゲルクロマトグラフィーを使用した精製により精製することを含む。
【0012】
さらなる側面において、ポルフィリン-リン脂質コンジュゲートのsn-1およびsn-2位置異性体の混合物からポルフィリン-リン脂質コンジュゲートの組成物を製造するための方法が提供され、前記位置異性体の各々は、1つのリン脂質のsn-1位またはsn-2位のうちの1つにおける脂質側鎖に共有結合した1つのポルフィリン、ポルフィリン誘導体、またはポルフィリン類似体を含み、ここで、この組成物は、規定されたsn-1:sn-2ポルフィリン-リン脂質コンジュゲートの位置異性体比を有し、この方法は、前記混合物を、有機抽出およびそれに続くジオール-シリカゲルを使用した精製により精製することを含む。
【図面の簡単な説明】
【0013】
本発明の好ましい実施態様のこれらおよびその他の特徴は、下記の詳細な説明においてより明らかとなるであろうが、詳細な説明では添付の図面が参照され、その添付の図面の内容は以下の通りである。
【0014】
【図2】図2は、各々のピロ-脂質位置異性体を選択的に切断した2つの酵素の同定を示す。A) sn-1およびsn-2ピロ-脂質溶液（未処理）を様々な酵素とインキュベートした後の異性体含量。使用された略語は以下の通りである。PL：ホスホリパーゼ；H.B.V：ミツバチ毒；T.L：Thermomyces lanuginosus；R.M：Rhizomucor miehei；P.C.：Pseudomonas cepacia；C.R.：Candida rugosa；LPL, P：シュードモナスのリポタンパク質リパーゼ；PLD, P：ピーナッツのホスホリパーゼD；B.S.：Bacillus stearothermophilus。sn-2およびsn-1異性体の間の量の違いは、それぞれ青および赤で示している。B)酵素スクリーニングにおいて同定された、各々の位置異性体を消化する能力を有する2つのヒットの動態解析。
【図3】図3は、両方のピロ-脂質位置異性体形態のポルフィソームを示す。sn-2またはsn-1ピロ-脂質の示されている比を用いてポルフィソームを形成し、TEMに供した（左）。100 nmのスケールバーを表示している。対応するポルフィソームの蛍光スペクトルを右側に示しており、完全なポルフィソームのスペクトルは破線で、界面活性剤による破壊後のスペクトルは実線で示している。
【図5】図5は、光熱治療のためのsn-2ピロ-脂質ポルフィソームの使用を示す。KB異種移植片を有するヌードマウスに、40 mg/kgのsn-2ピロ-脂質ポルフィソームまたは食塩水を静脈注射し、24時間後、700 mWレーザー（0.8 cm2スポットサイズ）を用いて60秒間、腫瘍をレーザー処置した。腫瘍が1 cmの直径に達したときにマウスを犠牲にした。各群についてN=5。
【発明を実施するための形態】
【0015】
ポルフィリン側鎖を有するリン脂質は、自己会合して、新しい種類の光学活性ナノベシクルであるポルフィソームを形成することができる。リゾリン脂質のsn-2ヒドロキシルのアシル化は、そのような側鎖修飾リン脂質に至る魅力的な経路であるが、問題のリガンドがsn-1位に結合したアシル基転位位置異性体を生じ得る。本明細書では、アシル基転位位置異性体の酵素的選択による、異性体として純粋なポルフィリン-脂質コンジュゲートの調製を報告する。酵素スクリーニングにより、ミツバチ毒由来のホスホリパーゼA2がsn-1ポルフィリンコンジュゲート化脂質を選択的に切断し、Thermomyces lanuginosus由来のリパーゼがsn-2ポルフィリンコンジュゲート化脂質を選択的に切断することが特定された。どちらの純化位置異性体もポルフィソームナノベシクルを生成した。sn-2コンジュゲート化ポルフィソームは容易に調製され、インビボで異種移植腫瘍に対する効果的な光熱剤として作用した。
【0016】
本明細書において「ポルフィソーム」が記述されるが、これはリン脂質-ポルフィリンコンジュゲートのサブユニットから自己会合される有機ナノ粒子であって、リポソーム様の構造および積載能力、構造依存性ナノスケール光伝達特性、優れた生体適合性を示し、多様なバイオフォトニクス的応用のための有望性を有するものである。ポルフィリンサブユニットを組み入れる他のポルフィリンベシクルおよびジブロック共重合体もこれまで記述されてきたが、ポルフィリン密度が低いために消衰係数が劣っており、ポルフィソームの新規特性を生み出す特徴的な著しい蛍光自己消光を欠いていた。
【0017】
いくつかの実施態様では、ポルフィソームは、ポルフィソームあたり約100,000個のポルフィリン分子を含むポルフィリン-脂質コンジュゲート二重層を含む。ポルフィソームはポルフィリンサブユニットにより形成され安定化されるので、広範な細胞標的指向化成分を使用して細胞に標的指向化することができる。ポルフィソームは非常に万能であり、異なる種類のポルフィリンを用いて形成することができ、異なる種類の金属をキレートすることができ、様々なサイズで形成することができる。さらに、ポルフィソームはナノスケールの特性を示し、活性化前に高度な消光および光熱伝達効率を有する。
【0018】
本明細書に記述されるナノベシクルは小さく、典型的には200 nm未満であり、リン脂質またはその誘導体の二重層を含む膜により形成されるベシクル（すなわち泡状物または嚢状物）である。しかしながら、標準的な脂質技術を使用して、当業者は例えば巨大単一膜ベシクルまたは平面状脂質二重層のようなはるかに大きい二重層を生成することもできる。
【0019】
一側面において、ポルフィリン-リン脂質コンジュゲートの二重層を含むナノベシクルが提供され、ここで、各々のポルフィリン-リン脂質コンジュゲートは、1つのリン脂質のsn-1位またはsn-2位のうちの1つにおける脂質側鎖に共有結合した1つのポルフィリン、ポルフィリン誘導体、またはポルフィリン類似体を含み、このナノベシクルは、規定されたsn-1:sn-2ポルフィリン-リン脂質コンジュゲートの位置異性体比を有する。
【0020】
好ましくは、ナノベシクルは位置異性体について実質的に純粋である。さらに好ましくは、ナノベシクルにおけるポルフィリン-リン脂質コンジュゲートの位置異性体としての純度は>97%である。
【0021】
好ましい実施態様において、ナノベシクルは少なくとも15、25、34、45、55、65、75、85、および95モル%のポルフィリン-リン脂質コンジュゲートを含み、この順番で好ましさの度合いが上昇する。
【0022】
本発明のナノベシクルを構成するポルフィリン-リン脂質コンジュゲートは、ポルフィリン、ポルフィリン誘導体、およびポルフィリン類似体を含む。例示的なポルフィリンとしては、ヘマトポルフィリン、プロトポルフィリン、およびテトラフェニルポルフィリンが挙げられる。例示的なポルフィリン誘導体としては、ピロフェオホルビド、バクテリオクロロフィル、クロロフィルa、ベンゾポルフィリン誘導体、テトラヒドロキシフェニルクロリン、プルプリン、ベンゾクロリン、ナフトクロリン、ヴェルディン、ローディン、ケトクロリン、アザクロリン、バクテリオクロリン、トリポルフィリン、およびベンゾバクテリオクロリンが挙げられる。ポルフィリン類似体としては、拡張ポルフィリンファミリーに属するもの（例えばテキサフィリン、サフィリン、およびヘキサフィリン）およびポルフィリン異性体（例えばポルフィセン、反転ポルフィリン、フタロシアニンおよびナフタロシアニン）が挙げられる。
【0023】
好ましくは、拡張ポルフィリンはテキサフィリン、サフィリン、またはヘキサフィリンであり、ポルフィリン異性体はポルフィセン、反転ポルフィリン、フタロシアニン、またはナフタロシアニンである。
【0024】
本明細書で使用される場合、「リン脂質」とは、リン酸基を有する親水性頭部と疎水性の脂質尾部とを有する脂質である。
【0025】
いくつかの実施態様において、ポルフィリン-リン脂質コンジュゲート中のリン脂質には、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、またはホスファチジルイノシトールが含まれる。
【0026】
好ましくは、リン脂質は、炭素数12〜22のアシル側鎖を含む。
【0027】
いくつかの実施態様において、ポルフィリン-リン脂質コンジュゲート中のポルフィリンはピロフェオホルビド-a酸である。別の実施態様において、ポルフィリン-リン脂質コンジュゲート中のポルフィリンはバクテリオクロロフィル誘導体である。
【0028】
いくつかの実施態様において、ポルフィリン-リン脂質コンジュゲート中のリン脂質は1-パルミトイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリンである。
【0029】
いくつかの実施態様において、ポルフィリン-リン脂質コンジュゲートはピロ-脂質である。
【0030】
他の実施態様において、ポルフィリン-リン脂質コンジュゲートはオキシ-バクテリオクロロフィル-脂質である。
【0031】
いくつかの実施態様において、ポルフィリンは、炭素数0〜20の炭素鎖リンカーによってリン脂質上のグリセロール基にコンジュゲート化（結合）している。
【0032】
いくつかの実施態様において、ナノベシクルは、PEGを、好ましくはPEG-脂質を、さらに好ましくはPEG-DSPEを、さらに含む。好ましくは、PEGまたはPEG-脂質は約5モル%の量で存在する。
【0033】
いくつかの実施態様において、ナノベシクルは実質的に球状であり、直径が約30 nm〜約200 nmであり、好ましくは直径が約100 nmまたは約30 nmである。
【0034】
いくつかの実施態様において、ポルフィリン-リン脂質コンジュゲートは、キレートされた金属を、任意で金属の放射性同位体を、好ましくはZn、Cu、Pd、またはPtを含む。
【0035】
多種多様な生体活性薬もしくは治療薬、医薬物質、または薬剤を、ポルフィソームの内部に封入することができる。
【0036】
いくつかの実施態様において、ナノベシクルは封入された活性薬をさらに含み、この活性薬は好ましくは治療薬または診断薬であり、好ましくはドキソルビシンのような化学療法剤である。
【0037】
「治療薬」という用語は、この技術分野で認知されており、生物学的、生理学的、または薬理学的に活性な物質であるあらゆる化学成分を表す。治療薬（「薬剤」ともいう）の例は、Merck Index、The Physicians Desk Reference、およびThe Pharmacological Basis of Therapeuticsのようなよく知られた文献に記述されており、医薬；ビタミン；ミネラルサプリメント；疾患もしくは疾病の治療、予防、診断、治癒、もしくは緩和のために使用される物質；身体の構造もしくは機能に影響を及ぼす物質；または、生理的環境に置かれた後に生物学的活性を得るかもしくは活性を増すプロドラッグを含むが、これらに限定されない。対象に投与されると対象組成物から近隣の組織または体液へと放出されることができる様々な形態の治療薬が使用され得る。
【0038】
「ダイアグノスティック」または「診断薬」とは、診断のために使用し得るあらゆる化学成分である。例えば診断薬には、インジウムもしくはテクネチウムのような放射性同位元素を含有するもののような画像診断薬；ヨウ素もしくはガドリニウムを含有する造影剤；西洋ワサビペルオキシダーゼ、GFP、アルカリホスファターゼ、もしくはβ-ガラクトシダーゼのような酵素；ユーロピウム誘導体のような蛍光物質；N-メチルアクリジウム誘導体のような発光物質等が含まれる。
【0039】
いくつかの実施態様では、ナノベシクルは標的指向化分子をさらに含み、この標的指向化分子は好ましくは抗体、ペプチド、アプタマー、または葉酸である。
【0040】
「標的指向化分子」とは、例えば標的細胞の表面上の受容体その他の分子に結合することにより、ナノベシクルを特定の標的へと向けることができるあらゆる分子である。標的指向化分子はタンパク質、ペプチド、核酸分子、糖類もしくは多糖類、受容体リガンド、または他の小分子であり得る。標的指向化分子の選択を通して特異性の程度を調節することができる。例えば、抗体は通常高度な特異性を示す。これら抗体はポリクローナル、モノクローナル、断片、組換え、または単一鎖のものであり得、それらの多くは市販されているかまたは標準的技術を使用して容易に取得される。
【0041】
いくつかの実施態様では、ナノベシクルの二重層はコレステロールをさらに含み、好ましくは30〜50モル%のコレステロールを含む。
【0042】
さらなる側面において、ポルフィリン-リン脂質コンジュゲートの組成物が提供され、ここで、そのポルフィリン-リン脂質コンジュゲートは、1つのリン脂質のsn-1位またはsn-2位のうちの1つにおける脂質側鎖に共有結合した1つのポルフィリン、ポルフィリン誘導体、またはポルフィリン類似体を含み、この組成物は、規定されたsn-1:sn-2ポルフィリン-リン脂質コンジュゲートの位置異性体比を有する。
【0043】
好ましくは、組成物は位置異性体について実質的に純粋である。さらに好ましくは、組成物中のポルフィリン-リン脂質コンジュゲートの位置異性体としての純度は>97%である。
【0044】
さらなる側面において、ポルフィリン-リン脂質コンジュゲートのsn-1およびsn-2位置異性体の混合物からポルフィリン-リン脂質コンジュゲートの組成物を製造するための方法が提供され、前記位置異性体の各々は、1つのリン脂質のsn-1位またはsn-2位のうちの1つにおける脂質側鎖に共有結合した1つのポルフィリン、ポルフィリン誘導体、またはポルフィリン類似体を含み、ここで、この組成物は、規定されたsn-1:sn-2ポルフィリン-リン脂質コンジュゲートの位置異性体比を有し、この方法は、位置異性体の混合物を、前記規定された位置異性体比が達成されるまでsn-1またはsn-2位置異性体のうちの1つを選択的に切断する酵素と共にインキュベートすることを含む。
【0045】
好ましくは、組成物は位置異性体について実質的に純粋である。
【0046】
さらなる側面によれば、ポルフィリン-リン脂質コンジュゲートのsn-1およびsn-2位置異性体の混合物を含む組成物からポルフィリン-リン脂質コンジュゲートのsn-1およびsn-2位置異性体のうちの1つを除去するための方法が提供され、この方法は、ポルフィリン-リン脂質コンジュゲートのsn-1およびsn-2位置異性体のうちの1つを酵素によって切断することを含む。
【0047】
いくつかの実施態様では、結果として得られる組成物は、位置異性体として実質的に純粋なsn-1ポルフィリン-リン脂質コンジュゲートの組成物であって（すなわちsn-2ポルフィリン-リン脂質コンジュゲートを除去する）、酵素は好ましくはThermomyces lanuginosus由来のリパーゼ（LTL）である。
【0048】
いくつかの実施態様では、結果として得られる組成物は、位置異性体として実質的に純粋なsn-2ポルフィリン-リン脂質コンジュゲートの組成物であって（すなわちsn-1ポルフィリン-リン脂質コンジュゲートを除去する）、酵素は好ましくはミツバチ毒由来のホスホリパーゼA2（PLA2HBV）である。
【0049】
さらなる側面において、ポルフィリン-リン脂質コンジュゲートのsn-1およびsn-2位置異性体の混合物からポルフィリン-リン脂質コンジュゲートの組成物を製造するための方法が提供され、前記位置異性体の各々は、1つのリン脂質のsn-1位またはsn-2位のうちの1つにおける脂質側鎖に共有結合した1つのポルフィリン、ポルフィリン誘導体、またはポルフィリン類似体を含み、ここで、この組成物は、規定されたsn-1:sn-2ポルフィリン-リン脂質コンジュゲートの位置異性体比を有し、この方法は、ポルフィリンおよびリン脂質のコンジュゲーション反応の出発材料の比を変動させることを含む。
【0050】
さらなる側面において、ポルフィリン-リン脂質コンジュゲートのsn-1およびsn-2位置異性体の混合物からポルフィリン-リン脂質コンジュゲートの組成物を製造するための方法が提供され、前記位置異性体の各々は、1つのリン脂質のsn-1位またはsn-2位のうちの1つにおける脂質側鎖に共有結合した1つのポルフィリン、ポルフィリン誘導体、またはポルフィリン類似体を含み、ここで、この組成物は、規定されたsn-1:sn-2ポルフィリン-リン脂質コンジュゲートの位置異性体比を有し、この方法は、前記混合物を、有機抽出およびそれに続くシリカゲルクロマトグラフィーを使用した精製により精製することを含む。
【0051】
さらなる側面において、ポルフィリン-リン脂質コンジュゲートのsn-1およびsn-2位置異性体の混合物からポルフィリン-リン脂質コンジュゲートの組成物を製造するための方法が提供され、前記位置異性体の各々は、1つのリン脂質のsn-1位またはsn-2位のうちの1つにおける脂質側鎖に共有結合した1つのポルフィリン、ポルフィリン誘導体、またはポルフィリン類似体を含み、ここで、この組成物は、規定されたsn-1:sn-2ポルフィリン-リン脂質コンジュゲートの位置異性体比を有し、この方法は、前記混合物を、有機抽出およびそれに続くジオール-シリカゲルを使用した精製により精製することを含む。
【0052】
本発明の有利な点を以下の実施例によってさらに説明する。本明細書に記載する実施例およびそれらの具体的詳細は、説明のためだけに提示するものであり、本発明の特許請求の範囲を限定するものとして解するべきではない。
【実施例】
【0053】
［材料および方法］ピロフェオホルビド-脂質の合成
ピロフェオホルビド（ピロ）は、以前記述されたように（Zheng et al., Bioconjugate Chemistry, 13-392, 2002）、Spirulina pacifica藻類（シアノテック社）から得た。標準的な反応において、107 mgのピロ（200 umol）を、98.7 mgの16:0リゾホスファチジルコリン（1-パルミトイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、アヴァンティ・ポーラー・リピッド社 # 855675）、76.3 mgのEDC（シグマ社）、および48.7 mgのDMAP（シグマ社）と、5 mLのアミレン安定化クロロホルム（シグマ社）中で混合した。反応混合物を、室温にてアルゴン下で24時間撹拌した。得られたピロ-脂質位置異性体産物は、2695 HPLC/MSマイクロマスZQ 2000システム（ウォーターズ社）を用いて、質量分析を伴う逆相HPLCにより分析した。4.6 mm×75 mmの3.5μmサンファイアーC8 HPLCカラム（ウォーターズ社）を、60℃におけるカラム加熱、0.1％TFA中15％アセトニトリルから0.1％TFA中95％アセトニトリルまでの勾配を用いて、流速0.5 mL/分で15分間にわたって使用した。ピロ-脂質位置異性体をさらなる分析に付し、あるいは、40℃の加熱を伴う回転式蒸発器を用いて減圧下でクロロホルムを除去してさらなる酵素的位置異性体選択を実施した。
【0054】
酵素的位置異性体選択およびそれに続くピロ-脂質精製酵素スクリーニングのために、シグマ社から入手した以下の酵素を使用した：Arachis hypogaea（ピーナッツ）由来のホスホリパーゼD-II型（P0515）；Burkholderia由来のリポタンパク質リパーゼ（L9656）；Candida rugosa由来のリパーゼ、VII型（L1754）；Clostridium perfringens由来のホスホリパーゼC、I型（P7633）；ブタ肝臓由来のエステラーゼ（E3019）；ブタ膵臓由来のホスホリパーゼA2（P6534）；ブタ膵臓由来のリパーゼ（L3126）；Thermomyces lanuginosus由来のホスホリパーゼA1（L3295）；Bacillus stearothermophilusの組換えエステラーゼ（69509）；Pseudomonas cepacia由来のリパーゼ（62309）；Rhizomucor miehei由来のリパーゼ（L4277）；Thermomyces lanuginosus由来のリパーゼ（L0777）；ミツバチ毒由来のホスホリパーゼA2（P9279）。酵素スクリーニングのためには、酵素を反応あたり2 nmolのピロ-脂質とともに加え、10 ugの乾燥酵素（ホスホリパーゼD、ホスホリパーゼC、リポタンパク質リパーゼ、Candida rugosa由来リパーゼ、ブタ肝臓由来エステラーゼ、ホスホリパーゼA2、ブタ肝臓リパーゼ）、あるいは液体もしくは懸濁形態で得られた酵素（上記以外の全ての酵素）については1 uLを用いて、50 uLの0.025% Triton（登録商標）X100および5 mM Tris pH 8中で37℃で3時間インキュベートした。インキュベーション後、サンプルを50 uLのDMSOと組み合せ、遠心分離して沈殿タンパク質を除去し、上記のようにHPLC/MSに付した。ミツバチ毒由来のホスホリパーゼA2およびThermomyces lanuginosus由来のリパーゼをそれぞれsn-1およびsn-2コンジュゲート化ピロ-脂質異性体を切断するための最良の酵素として同定した後、反応あたり3 nmolのピロ-脂質を使用して、表示された時間点にてインキュベートして、これらの2つの酵素を再評価した。sn-2位にピロが結合したピロ-脂質の標準的な精製のためには、乾燥した混合ピロ-脂質を、1 mM CaCl2、50 mM Tris pH 8、0.5% Triton（登録商標）X-100、および10% MeOH中に、5 mg/mLのピロ-脂質となるように直接再懸濁した。それからミツバチ毒由来のPLA2を0.1 mg/mLの濃度にて加え、この溶液を37℃にて24時間インキュベートした。sn-1位にピロが結合したピロ-脂質の調製のためには、sn-1およびsn-2ピロ-脂質の位置異性体混合物をまず精製し、それから0.5% Triton（登録商標）X-100および1 mM CaCl2中で2.5 mg/mLのピロ-脂質にてインキュベートし、10 mLのピロ-脂質溶液あたり200 uLのThermomyces lanuginosus由来調製リパーゼ溶液を加えることによって消化を行なった。反応状態はHPLC/MSを用いて調査し、数日間にわたって実行され、1日毎にさらに100 uLのリパーゼを追加した。反応後、HPLC/MSを使用して、望まない位置異性体が消失したことを確認することにより、完了を確証した。さらなる2体積のクロロホルムおよび1.25体積のメタノールを加え、ピロ-脂質を有機相から抽出し、40℃、減圧にて回転式蒸発器を用いて溶媒を除去した。それからピロ-脂質をDCM中に再懸濁し、ジオールシリカ（ソーブテック社、#52570）で充填したフラッシュクロマトグラフィーカラムに適用した（100 mgのピロ-脂質あたり約10 gの乾燥シリカ粉末）。ピロ-脂質に対してソレラ・フラッシュクロマトグラフィー・システム（バイオテージ社）を使用し、DCM中0〜10%のメタノール勾配を用いた。溶出画分をまとめ、減圧にて回転式蒸発器を用いて溶媒を除去した。最後に、ピロ-脂質を10 mLの20%水および80% t-ブタノール中に溶解し、液体窒素中で凍結し、2〜3日間にわたって凍結乾燥した。sn-1ピロ-脂質については、NMR解析結果は以下の通りであった：
【0055】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 9.22 (s, 1 H), 9.06 (s, 1 H), 8.49 (s, 1 H), 7.89 (dd, J =18.0, 11.6 Hz, 1 H), 6.21 (dd, J = 18.0, 1.2 Hz, 1 H), 6.11 (dd, J = 11.6, 1.2 Hz, 1 H), 5.21(m, 1 H), 5.19 (d, J = 19.6 Hz, 1 H), 4.99 (d, J = 19.6 Hz, 1 H), 4.45 (d, J = 17.2 Hz, 1 H), 4.39 (q, J = 7.2 Hz, 1 H), 4.29 (m, 2 H), 4.19-4.11 (m, 2 H), 3.94 (m, 2 H), 3.73 (m, 2 H), 3.45 (q, J = 9.6, 2 H), 3.35 (s, 3 H), 3.30 (s, 3 H), 3.26 (s, 9 H), 3.12 (s, 3 H), 2.66-2.55 (m, 3 H), 2.35-2.27 (m, 1 H) 2.14 (t, J = 7.6 Hz, 3 H), 1.77 (d, J = 7.6 Hz, 3 H), 1.55 (t, J = 7.6, 3 H), 1.33 (m, 2 H), 1.33-0.93 (m, 31 H), 0.85 (t, J = 6.8 Hz, 3 H), 0.23 (br, 1 H), -1.84 (br, 1 H)；
【0056】
13C NMR (CDCl3, 100 MHz): δ 196.1, 173.1, 172.9, 171.3, 160.2, 155.1, 150.6, 148.8, 144.8, 141.4, 137.5, 136.1, 135.9, 135.7, 131.5, 130.1, 129.1, 127.8, 122.4, 105.8, 103.7, 97.0, 93.0, 70.4, 70.3, 68.3, 66.5, 63.5, 63.3, 59.2, 54.5, 51.6, 49.9, 48.0, 34.2, 32.9, 30.9, 29.7, 29.6, 29.6, 29.6, 29.6, 29.5, 29.4, 29.3, 29.1, 28.9, 24.7, 23.1, 22.6, 19.2, 19.0, 17.3, 14.1, 12.0；
【0057】
sn-2ピロ-脂質については、NMR解析結果は以下の通りであった：
【0058】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 9.08 (s, 1 H), 8.89 (s, 1 H), 8.45 (s, 1 H), 7.78 (dd, J = 18.0, 11.6 Hz, 1 H), 6.14 (d, J = 18.0 Hz, 1 H), 6.04 (dd, J = 11.6 Hz, 1 H), 5.31(m, 1 H), 5.13 (d, J = 19.6 Hz, 1 H), 4.97 (d, J = 19.6 Hz, 1 H), 4.41 (m, 3 H), 4.24 (m, 2 H), 4.18 (m, 2 H), 4.00 (t, J = 6.4 Hz, 2 H), 3.66 (m, 2 H), 3.34 (q, J = 7.5 Hz, 2 H), 3.29 (s, 3 H), 3.21 (s, 12 H), 3.03 (s, 3 H), 2.81 (s, 1 H), 2.64 (q, J = 6.8 Hz, 2 H), 2.41 (m, 1 H), 2.16 (t, J = 7.1 Hz, 2 H), 2.05 (m, 1 H), 1.75 (d, J = 7.2 Hz, 3 H), 1.49 (t, J = 7.6 Hz, 3 H), 1.41 (p, J = 6.9 Hz, 2 H), 1.29 - 0.89 (m, 31 H), 0.85 (t, J = 6.8 Hz, 3 H), -0.07 (br, 1 H), -1.97 (br, 1 H)；
【0059】
13C NMR (CDCl3, 100 MHz): δ 196.4, 173.5, 172.6, 171.4, 160.3, 154.9, 150.4, 148.7, 141.4, 137.4, 136.0, 135.8, 135.6, 131.4, 122.3, 105.7, 103.6, 96.9, 93.0, 72.9, 41.2, 41.2, 66.3, 66.2, 63.9, 63.6, 63.5, 62.8, 59.3, 51.5, 49.9, 48.0, 43.0, 39.1, 31.9, 31.1, 29.8, 29.6, 29.6, 29.6, 29.5, 29.4, 29.3, 29.3, 29.1, 29.0, 24.7, 23.1, 22.6, 19.2, 17.3；
【0060】
異性体のアイデンティティを確認するために、0.5 % Triton（登録商標）-X100および1 mM CaCl2中で、sn-1ピロ-脂質はミツバチ毒由来ホスホリパーゼA2により消化し、sn-2ピロ-脂質はThermomyces lanuginosus由来リパーゼを使用して消化した。37℃にて一晩インキュベートした後、2体積のクロロホルムおよび1.25体積のメタノールを使用して、切断産物を抽出した。ロトヴァップにより有機溶媒を除去し、切断断片をDCM中の1% MeOHに再懸濁して小さなジオールシリカカラム上で精製し、ここで、切断断片はピロ-脂質よりも高いMeOH濃度において溶出した（8%付近）。溶媒を乾燥させ、d-DMSO 400 MHz NMRに供した。NMRスペクトルは補足図2に示す。
【0061】
ポルフィソームの形成および解析異性体として純粋なピロ-脂質、コレステロール（アヴァンティ・ポーラー・リピッド社）、およびジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-メトキシ(ポリエチレングリコール)（PEG-2000-PE、アヴァンティ・ポーラー・リピッド社）をクロロホルム中に溶解した。解析研究のために、ホウケイ酸試験管中における分散、窒素流下における乾燥、それに続く真空下における残余クロロホルム除去によって、95%ピロ-脂質（表示された位置異性体組成のもの）および5% PEG-2000-PEの0.5 mgの薄膜を形成した。脂質薄膜をリン酸緩衝食塩水（150 mM NaCl、10 mMリン酸pH 7.4）で再水和させ、液体窒素を用いて凍結させた後に65℃温水槽にて解凍することにより、5回の凍結-解凍サイクルに付した。その後、ミニ押出し機（アヴァンティ・ポーラー・リピッド社）を用いて、100 nmポリカーボネート膜を通して15回、ポルフィソームを押し出した。サイズ測定はナノサイザー（マルバーン社）にて実施した。蛍光自己消光はフルオロマックス蛍光光度計（ホリバジョバンイボン社）を使用して記録した。ポルフィソーム溶液をPBS中で2.5 ug/mLに希釈し、2 nmスリット幅を用いて420 nmにて励起した。発光は1 nmスリット幅を用いて600から800 nmまで測定し積分した。バックグラウンドの減算は、等濃度の100 nm卵ホスファチジルコリン：コレステロール（3:2モル比）リポソームを用いて行なった。透過型電子顕微鏡観察は、H-7000透過型電子顕微鏡（日立製作所）を使用して、1%酢酸ウランでネガティブ染色したポルフィソームを用いて実施した。インビボ光熱研究のためには、65モル%のポルフィリン-脂質を、クロロホルム中に溶解した30モル%コレステロールおよび5モル% PEG-2000-PEと組み合せることにより、5 mgの脂質薄膜を調製し、これを窒素ガスの気流下で穏やかに乾燥させ、真空下で1時間さらに乾燥させた。それからこの脂質薄膜を1 mLのPBS中で再水和させ、5回の凍結-解凍サイクルに付してポルフィソーム懸濁液を得た。この懸濁液を、10 mLのLIPEX（登録商標）サーモバレル押出し機（カタログ番号T.005、ノザンリピッズ社、カリフォルニア州）を使用して、700 psi（4826 kPa）の窒素ガス下で、孔径100 nmのポリカーボネート膜（アヴァンティ・ポーラー・リピッド社）を通して10回押し出した。温度は、循環温水槽を用いて70℃に正確に制御した。
【0062】
光熱治療光熱治療のためには、2x106の細胞をマウスの右側腹部に注射することにより、KB腫瘍をメスのヌードマウス中で増殖させた。腫瘍の直径が4〜5mmに達したとき、30モル%コレステロールおよび5モル% PEG-2000 DSPEを含有する42 mg kg-1のポルフィソームを尾静脈から注射した。注射24時間後に、2% (v/v)イソフルオレンを用いてマウスを麻酔し、671 nmにおける出力700 mW、直径8 mmのスポットサイズを有するレーザー（671 nm 2W DPSSレーザー、レーザーグロー・テクノロジーズ社）で腫瘍を照射し、赤外線カメラ（ミクロスペック社）を用いて腫瘍温度を記録した。腫瘍体積を1日毎に測定し、腫瘍の直径が10 mmに達したらマウスを安楽死させた。
【0063】
［結果と考察］1:1:2:2のピロ:脂質:DMAP:EDCモル比を使用したアシル化反応において、ピロフェオホルビド-a（ピロ）をリゾリン脂質1-パルミトイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリンにコンジュゲート化した。この反応は一晩で完了状態まで進行したが、2つの位置異性体、すなわち1つはピロをsn-2位に有し、1つはピロをsn-1位に有し、それぞれsn-2ピロ-脂質およびsn-1ピロ-脂質と呼ばれるものを産生した（図1A）。これら異性体の存在は、60℃におけるカラム加熱を用いたHPLC-MSを使用して、近接して一緒に溶出する2つのピークとして明らかにされた（図1B）。これらのピークはどちらも、ピロ-コンジュゲート化脂質の同じ予測分子量吸収スペクトルを示した（図7）。異性体のアイデンティティは、酵素切断されたコンジュゲートにおけるグリセロール骨格の中央炭素上の水素の1H化学シフトを調べることによって確認し、この水素はエステルまたは第一級アルコールのどちらかに連結していた（酵素切断は下記において説明し、切断産物および未消化位置異性体のNMRスペクトルは図8に示している）。ピロ対リン脂質の出発比の調節は、得られる位置異性体産物の比の変化をもたらした。1:1の比を使用した場合には、産物の80%超がsn-2ピロ-脂質異性体（すなわち、sn-2ヒドロキシルにピロがコンジュゲート化したもの）であった。1:7に比を上昇させた場合には、sn-2ピロ異性体産物は35%に減少し、sn-1ピロ異性体は65%に増加した。この観察の1つの説明は、リゾリン脂質のわずかな一部が、ピロと反応する前にアシル基転位を受けたということである。アシル基転位リゾリン脂質はより反応性が高い第一級アルコールを含んでいたため、反応において迅速に消費され、従ってリゾリン脂質のより大きな出発比はより多くのsn-1ピロ-脂質の生成をもたらしたのである。従って、反応条件を変化させることによりある程度の位置異性体選択を達成することができたが、より改善された異性体純度を達成するためには他のアプローチが必要であった。
【0064】
リン脂質を調製し、またはリン脂質のアイデンティティを確認するために、酵素が使われてきた。例えばホスホリパーゼA2は、リゾリン脂質の調製または切断産物および側鎖特性の解析のためにsn-2位にてリン脂質の置換基を切断するために使用し得る。しかしながら、本発明者らの知る限り、望まない位置異性体を除去するために酵素を合成的に使用することはなされていない。本発明者らは、ピロの疎水性で平面的な性質が、リン脂質コンジュゲートの酵素認識を異性体特異的な様式で妨害するのではないかという仮説を立てた。この仮説を試験するために、15個の市販されているリパーゼおよびエステラーゼの群を用意して、ほぼ等モル濃度であるsn-1およびsn-2ピロ-脂質の溶液とともにインキュベートした。これら様々な酵素による異性体切断を図2Aに示しており、ここで、sn-1ピロ-脂質の特異的増加は赤で示し、sn-2ピロ-脂質の特異的増加は青で示している。このアッセイ条件下では、ほとんどの酵素はピロ-脂質位置異性体を効率よく切断できなかった。ピロによって導入された嵩高い立体障害を考えればこれは驚くことではなかった。しかしながら、いくつかの酵素は、このスクリーニング条件においてもピロ-脂質に作用することが見出された。Bacillus stearothermophilus由来のエステラーゼは、両方のピロ-脂質位置異性体を、質量電荷比848の産物に効率よく切断し、この質量電荷比はホスホコリン頭部基が切断されたピロ-脂質に相当する。しかしながら、どちらかの位置異性体の優先的切断は検出されなかった。いくつかの酵素は、sn-1またはsn-2ピロ-脂質異性体を選択的に切断した。Rhizomucor mieheiおよびPseudomonas cepacia由来のリパーゼはsn-2ピロ-脂質異性体を優先的に切断したものの、これらの酵素は両方の異性体をかなりの量において切断した。Thermomyces lanuginosus由来リパーゼ（LTL）はsn-2ピロ-脂質位置異性体を選択的に切断し、sn-1異性体の改変は最小限であった。逆に、ミツバチ毒由来ホスホリパーゼA2（PLA2HBV）はsn-1位置異性体を選択的に切断した。これら2つの酵素の再試験により、それぞれ別々のピロ-脂質位置異性体を除去するこれらの特異性が確認された（図2B）。すなわち、このスクリーニング手法により、各位置異性体を選択的に切断できる2つの酵素が同定された。
【0065】
その後、PLA2HBVおよびLTLを使用して、ポルフィソームへと会合させるための位置異性体的に純粋なポルフィリン-脂質を調製した。sn-1およびsn-2位置異性体はどちらもHPLCに基づいて97%を超える位置異性体純度を有していた。各々の純化ピロ-脂質位置異性体およびこれら2つの組合せを、5モルパーセントのPEG-2000-ホスファチジルエタノールアミンとともに薄膜に調製し、リン酸緩衝食塩水中で再水和させ、100 nmポリカーボネート膜を用いて押出しを行なってポルフィソームを形成した。動的光散乱法によりこの調製物のサイズは120 nm付近の単分散であることが示された（図9）。透過型電子顕微鏡により、それぞれの位置異性体の会合について、水性の内部を被包する球状のポルフィリン二重層を含むナノベシクル構造が確認された（図3、左列）。ポルフィソームのもう一つの特性は、ポルフィリン二重層内のピロ-脂質サブユニットの相互作用から生じ、これは構造により促進される自己消光を起こさせる。全てのポルフィソームは高度の消光を示し、完全なポルフィソームにおいて、ピロポルフィリンの通常の蛍光発光の99%超が消光されていた（図3、右列）。これらの結果は、両方のピロ-脂質位置異性体およびそれら2つの組合せが、高度に消光したポルフィリン二重層のナノベシクルを形成することにおいて同様の挙動をすることを実証した。
【0066】
ピロ-脂質位置異性体は、互いに取り替えても生成されるポルフィソームの物理的性質への影響はごく小さいが、ほとんどの応用においては位置異性体として純粋な材料が大いに望まれる。複数の異性体の組合せでは、バッチごとに比が変動するとすれば再現性についての疑問が生じるし、異なる異性体がインビボの状況下で異なる代謝分解産物を示すことが予測される。sn-2ピロ-脂質合成経路はより効率的であったが、これは、その経路がアシル基転位を回避した（すなわち、コンジュゲーションが予測通りにリゾリン脂質のsn-2アルコールにおいて起こった）からだけでなく、その最適化反応が過剰のリゾリン脂質を必要としなかったからでもあり（これはsn-1ピロ-脂質とは異なる。図1Cを参照のこと。）、このことにより下流におけるリゾリン脂質混入の危険性も最小限となった。sn-2ピロ-脂質の合成は容易に100 mg規模まで拡大することができ（図4）、ピロを脂質にコンジュゲート化すること、酵素で消化すること、およびジオールシリカカラム上で精製することという、3つの工程からなるものであった。この単純なプロトコールは効率的であり、異性体として純粋なピロ-脂質を優れた純度にて生成した。それからsn-2ピロ-脂質をポルフィソームに形成し、腫瘍の光熱焼灼術のために使用した。これらは蛍光が消光されているため、吸収された光エネルギーが熱に変換され、ポルフィソームは光熱治療のための効果的な造影剤になることが示されている（非特許文献1）。KB腫瘍を有するヌードマウスにポルフィソームを静脈注射し、24時間後、671 nmレーザーで処置した。レーザー処置の間、腫瘍温度は急速に60℃に達したが、レーザー単独の群では40℃未満にとどまった（図10）。ポルフィソームおよびレーザー処置を受けた腫瘍は表面焼痂を形成し、これは2週間後に消えた。図5に示すように、レーザー処置のみまたはポルフィソーム処置のみを受けたマウスは、腫瘍が成長し続けたため犠牲にしなければならなかった。対照的に、ポルフィソームおよびレーザーの群では、全てのマウスが150日間より長く生存し、全ての腫瘍が恒久的に破壊された。
【0067】
結論として、異性体として純粋なsn-1およびsn-2ポルフィリン-脂質コンジュゲートを生成するために使用される酵素がスクリーニングにおいて同定された（PLA2HBVおよびLTL）。どちらの位置異性体もポルフィソームへと会合することができた。sn-2ピロ-脂質は効果的に合成され、ポルフィソーム光熱治療を用いて腫瘍を焼灼することに使用することができた。この酵素スクリーニングのアプローチ、そしておそらくは上記同定された2つの酵素は、異性体的に純粋な他の種類のリン脂質コンジュゲートを生成するためにも有用であり得る。
【0068】
本発明の好ましい実施態様を本明細書において説明してきたが、発明の趣旨または添付した特許請求の範囲から逸脱することなく実施態様に変形を施し得ることは、当業者によって理解されるであろう。上記一覧に記載したものを含め、本明細書において開示される全ての参考文献は参照により組み入れられる。