特許 6077880 ＴＮＦ−α産生抑制剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6077880

(24)【登録日】2017年1月20日

(45)【発行日】2017年2月8日

(54)【発明の名称】ＴＮＦ−α産生抑制剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/704 20060101AFI20170130BHJP

   A61K 31/355 20060101ALI20170130BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20170130BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20170130BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20170130BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20170130BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/704

   A61K31/355

   A61P43/00 121

   A61P43/00 111

   A61P29/00 101

   A61P19/02

   A61P17/06

【請求項の数】1

【全頁数】8

(21)【出願番号】特願2013-28553(P2013-28553)

(22)【出願日】2013年2月18日

(65)【公開番号】特開2014-156432(P2014-156432A)

(43)【公開日】2014年8月28日

【審査請求日】2015年10月2日

(73)【特許権者】

【識別番号】593106918

【氏名又は名称】株式会社ファンケル

(74)【代理人】

【識別番号】100122954

【弁理士】

【氏名又は名称】長谷部 善太郎

(74)【代理人】

【識別番号】100162396

【弁理士】

【氏名又は名称】山田 泰之

(72)【発明者】

【氏名】櫻田 剛史

【審査官】 井上 明子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００４−５３７５０６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１２−２２９１７９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１１−１５３１３９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開昭５３−１０９９５４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Zhongguo Zhongyao Zazhi，２００７年，Vol.32, No.12，p.1175-1179

【文献】 Zhongcaoyao，２００８年，Vol.39, No.4，p.485-490

【文献】 W Sakamoto et al.，Inhibition of macrophage migration inhibitory factor secretion from macrophages by vitamin E.，Biochimica et Biophysica Acta，１９９８年，1404，427-434

【文献】 Free Radical Biology & Medicine，２００５年，Vol.38，p.1212-1220

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３１／００ − ３３／４４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

β−シトステロールグルコシドパルミテート（β−Sitosterol glucoside palmitate）及びトコフェロールを有効成分として含有し、β−シトステロールグルコシドパルミテート１質量部に対してトコフェロールを等量〜１０倍量を含有するＴＮＦ−α産生抑制剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＴＮＦ−α産生抑制剤に関する。

【背景技術】

【0002】

ＴＮＦ−αはマウスに移植した腫瘍に対して出血性壊死を誘発させる因子として単離された。その後の研究で、アポトーシスの誘導、炎症メディエーターや抗体産生の亢進を行うことにより感染防御や抗腫瘍作用に関与するが、過剰な発現は関節リウマチや乾癬などの疾患の発症を招くことが明らかとなった。特に慢性炎症性疾患である関節リウマチは関節破壊などの臨床症状を有し、ＴＮＦ−αはIL-6などと並んで関節リウマチの病態形成において中心的な役割を果たすサイトカインの一つとして特定されている。わが国の臨床においてもＴＮＦ−αをターゲットとした生物学的製剤が用いられており、sTNFRと免疫グロブリンGの融合タンパク質であるエタネルセプトや抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体であるインフリキシマブおよびアダリムマブが適応となっている。しかしこれらのＴＮＦ−α抑制作用を有する薬剤は副作用も多く、感染症や発癌に対するリスクが高まることが警鐘されている。また脂肪組織は炎症性サイトカインを分泌しており、ＴＮＦ−αにより細胞内へのグルコースの取り込み阻害やインスリンに対する感受性低下が生じ、さらに脂肪細胞や肝細胞における脂肪酸の産生を促進し、主にTNFR1を介して抗グリセリン血症を引き起こすことが知られている。

【0003】

近年生体のＴＮＦ−αの産生を抑制する物質の探索が進められてきた。
特許文献1（特開２０１２−２０７０４３号公報）にはニゲロオリゴ糖を有効成分とするＴＮＦ−α抑制剤が開示されている。特許文献２（特開２０１１−２５１９５０号公報）には、海洋性細菌の一種、クリセオバクテリウム（Chryserobacterium sp.）より単離されたスルホバシン BにＴＮＦ−α産生抑制作用があることが記載されている。特許文献３（特開２００８−１０６０１４号公報）にはカルコンやヒドロキシカルコンなどの天然由来の化合物がＴＮＦ−α抑制作用を有することが記載されている。特許文献５（特開２０１１−１５３１３９号公報）にはビタミンＥ誘導体を有効成分とするＴＮＦ−αに抑制作用を有する薬剤が開示されている。

【0004】

また、ビタミンＥ（トコフェロール）を取り込んだマクロファージはＬＰＳなどの刺激によって分泌するＴＮＦ−αの分泌量が減少することが知られている（非特許文献１）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特開２０１２−２０７０４３号公報

【特許文献2】特開２０１１−２５１９５０号公報

【特許文献3】特開２００８−１０６０１４号公報

【特許文献4】特開２００７−１９７３９２号公報

【特許文献5】特開２０１１−１５３１３９号公報

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Sakamoto, W. et al. Biochim.Biophys.Acta, in press, 1998

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

マクロファージのＴＮＦ−α産生を抑制する剤を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、マクロファージの刺激誘導性ＴＮＦ−αの産生を抑制する方法を研究していたところ、アシル化ステロール配糖体とトコフェロールとの併用による強いＴＮＦ−α産生抑制能力を見出し、本発明を完成させた。

【0009】

本発明の主な構成は、次のとおりである。
（１）β−シトステロールグルコシドパルミテート（β−Sitosterol glucoside palmitate）及びトコフェロールを有効成分として含有し、β−シトステロールグルコシドパルミテート１質量部に対してトコフェロールを等量〜１０倍量を含有するＴＮＦ−α産生抑制剤。

【発明の効果】

【0010】

本発明により新たなＴＮＦ−α産生抑制剤が提供される。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】パルミチン酸で刺激したマクロファージのＴＮＦ−αの分泌を、β−シトステロールグルコシドパルミテート（β−Sitosterol glucoside palmitate）、α-トコフェロール及びそれらを併用した剤が抑制することを確認した試験結果を示すグラフである。

【発明を実施するための最良の形態】

【0012】

本発明に用いるアシル化ステロール配糖体のステロール骨格は、β−シトステロールであることが好ましい。また、アシル化ステロール配糖体の結合する糖は、Ｄ−グルコースであることが好ましい。さらにまた、アシル化ステロール配糖体のアシル基は、パルミチン酸基であることが好ましい。

【0013】

アシル化ステロール配糖体の具体的な化合物として、は、β−シトステロールグルコシドパルミテート（β−Sitosterol glucoside palmitate）であることが最も好ましい。

【0014】

本発明のＴＮＦ−α産生抑制剤はアシル化ステロール配糖体として成人１日１ｍｇ〜１０００ｍｇ摂取できるように処方することが好ましい。
さらに、本発明のＴＮＦ−α産生抑制剤には、α−トコフェロール又はα−トコフェロール誘導体を配合することで、そのＴＮＦ−α抑制効果を増強することができる。α-トコフェロールは、アシル化ステロール配糖体の等量〜１０倍量配合することが好ましい。α-トコフェロール誘導体はビタミンＥとしての作用を有するものであればどのような化合物であっても許容できる。代表的なα−トコフェロール誘導体としてビタミンＥリン酸ナトリウム（ＴＰＮａ：商品名）が例示できる。
なお、アシル化ステロール配糖体、α-トコフェロールもその安全性は熟知されており、極めて低毒性の物質で問題がないことが知られている。

【0015】

本発明の各化合物、及びその薬理上許容される塩は、植物などから単離・精製した天然物であってもよいし、公知の合成方法により合成したものであってもよい。

【0016】

本発明の薬剤を体内投与する際は経口投与が好ましく、飲食品やサプリメントへ添加・配合することによりＴＮＦ−α抑制作用をもった健康食品として利用することも可能である。

【0017】

本発明のＴＮＦ−α産生抑制剤は、これをそのまま、あるいは慣用の医薬製剤担体とともに医薬用組成物となし、動物およびヒトに投与することができる。医薬用組成物の剤形としては特に制限されるものではなく、必要に応じて適宜選択すればよいが、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等の経口剤、注射剤、坐剤等の非経口剤が挙げられる。

【0018】

本発明において錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤としての経口剤は、例えば、デンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を用いて常法に従って製造される。これらの製剤中の本発明の化合物の配合量は特に限定されるものではなく適宜設計できる。この種の製剤には本発明の化合物の他に、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を適宜使用することができる。

【0019】

結合剤としてデンプン、デキストリン、アラビアゴム末、ゼラチン、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、結晶セルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール等を例示できる。崩壊剤としてはデンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロース等を例として挙げることができる。界面活性剤の例としてラウリル硫酸ナトリウム、大豆レシチン、蔗糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル等を挙げることができる。滑沢剤では、タルク、ロウ類、水素添加植物油、蔗糖脂肪酸エステル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウム、ポリエチレングリコール等を例示できる。流動性促進剤では、軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲル、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウム等を例として挙げることができる。また、本発明の化合物は懸濁液、エマルション剤、シロップ剤、エリキシル剤としても投与することができ、これらの各種剤形には、矯味矯臭剤、着色剤を含有させてもよい。

【0020】

また、本発明の効果を損なわない範囲で、必要に応じて他の活性成分を添加することができる。例えば免疫機能を調節するために、生体の免疫反応を調整する物質を添加することができる。

【実施例】

【0021】

以下に、実施例・試験例を示し、本発明をより詳細に説明する。
試験１．α-トコフェロール及びβ−シトステロールグルコシドパルミテートのＴＮＦ−α産生抑制効果確認試験
表１に示す濃度の試料を用いて、パルミチン酸により誘導されるＴＮＦ−αの産生抑制効果を試験した。

【0022】

【表1】

【0023】

（１）試料及び試薬、培地の調製
[GW9508 (Cayman Chemical Company社)]
DMSOで20 mMに調製した。これをDMSOで希釈して所望の濃度に調製した。ＧＷ９５０８はＴＮＦ−α抑制効果が確認されている化合物であり化学名は4−（３−フェノキシベンジルアミノ）フェニルプロピオン酸である。
[Indomethacine ( Sigma-Aldrich社)]
DMSOで10 mMに調製した。これをDMSOで希釈して所望の濃度に調製した。ＴＮＦ−α抑制効果が確認されている化合物である。
［α-トコフェロール( Sigma-Aldrich社)]
DMSOで 4 mg/mLに調製した。これをDMSOで倍希釈して希釈系列を調製した。
［β−シトステロールグルコシドパルミテート（β−Sitosterol glucoside palmitate）フナコシ社］
DMSOで20mMに調製した。これをDMSOで倍希釈して希釈系列を調製した。

【0024】

（２）細胞溶解緩衝液（ＲＩＰＡ）
次の組成の緩衝液を用いた。
50 mM Tris-HCl, pH8.0 (Wako社)、150 mM NaCl( Wako社)、1%(v/v) NP-40 Alternative (CALBIOCHEM社)、0.1%(w/v) SDS(Wako社)、0.5%(w/v)Na-deoxycholate( Wako社)
＋Protease Inhibitor Cocktail（nacalai tesque社）

【0025】

＜増殖用培地＞DMEM-10%FBS-1%P/S
4.5 g/Lグルコース、110 mg/mL ピルビン酸ナトリウム、15 m/Lフェノールレッドを含むDMEM (Gibco社,) 445 mLに牛胎児血清(FBS、171012、NICHIREI BIOSCIENCES INC社) 50 mL、ペニシリン-ストレプトマイシン溶液(Sigma社) 5 mLを加え、ピペッティングにて混合し調製した。

【0026】

＜アッセイ用培地＞DMEM-0.5%FBS-1%P/S
4.5 g/Lグルコース、110 mg/mL ピルビン酸ナトリウム、15 m/Lフェノールレッドを含むDMEM (Gibco社) 495 mLにペニシリン-ストレプトマイシン溶液(Sigma社) 5 mLを加えて混合し、この内39.8 mLを遠沈管に分注し、牛胎児血清(FBS、171012、NICHIREI BIOSCIENCES INC社) 0.2 mLを加えた後、混合し調製した。

【0027】

（３）細胞培養方法
１）凍結保存していた細胞（2×10⁶ cell）を150 mmディッシュ（MS-10150、住友ベークライト社）1枚に播種し、30 mLの増殖用培地中で、3日間培養した。
２）150 mmディッシュで増殖させた細胞を、48ウェルプレートに細胞密度2×10⁵cells/wellで播種し、細胞を完全に接着させるためアッセイ用培地中で9時間培養した。
３）48ウェルプレートの増殖用培地をP200のマイクロピペットで丁寧に取り除いた。
４）1.5 mLマイクロチューブに各サンプルストック溶液14 μL、培地1386 μLを入れ、サンプル添加培地を調製した（サンプル濃度は添加濃度の100分の１、ジメチルスルフォオキサイド（DMSO）濃度は1％）。
５）ボルテックスで良く撹拌した後、各ウェルに400μLずつ入れ、14時間静置した。
６）14時間後、培地をマイクロチューブに回収した。
７）1.5 mLマイクロチューブに200μMのパルミチン酸（PA）7 μL、各サンプルストック溶液7 μL（前処置濃度の2倍濃度）、培地1386μLを入れ、PA＋サンプル添加培地を調製した（サンプルとDMSOの終濃度は前処理時と同じになるように調製した）。
８）調製したサンプルをボルテックスミキサーで撹拌後、各ウェルに400μLずつ入れ24時間培養し、ＴＮＦ−αの分泌を誘導した。
９）24時間後、培地を回収し分析まで-80℃で冷凍保存した。
１０）培地回収後、細胞をPBS（-）で1度洗浄し、各ウェルにRIPAを100 μLずつ入れ超音波破砕を行った。
１１）可溶化したタンパク質をピペットでマイクロチューブに移し、分析まで-80℃で冷凍保存した。

【0028】

（４）細胞タンパク量の定量
１）-80℃で凍結保存していた培地を水中解凍し、4℃、20,400×gで10 分間遠心した。
２）遠心後、上清中のタンパク量をPierce BCA Protein Assay Kit（Thermo SCIENTIFIC社製）を用いて添付のプロトコールに従い測定した。

【0029】

（５）ELISAによるＴＮＦ−α量の測定
１）-80℃で凍結保存していた培地を水中解凍し、1000×ｇで3分間遠心した。
・上清中のＴＮＦ−α量を「Quantikine Mouse TNF-αImmunoassay kit」(R&D Systems社製)を用いてキットに添付のプロトコールに従い測定した。

【0030】

測定結果は各試料とも３ウェルの平均値を求め、パルミチン酸刺激によるＴＮＦ−α産生量を１００とする相対値（％）で図1に示した。なお測定結果はスチューデントのｔ 検定による有意差検定を行い評価した。なお図中の「ＡＳＧ」はβ−シトステロールグルコシドパルミテートを示す。
各化合物はいずれもパルミチン酸刺激によって誘導されるマクロファージのＴＮＦ−α産生を抑制した。

【0031】

試験２．β−シトステロールグルコシドパルミテートとα-トコフェロールの併用効果試験
上記試験１でＴＮＦ−α抑制効果を有することが確認できたβ−シトステロールグルコシドパルミテートとα-トコフェロールを併用したときの効果を確認した。
試験例１と同様の方法でＴＮＦ−α抑制試験を行った。試験試料としてβ−シトステロールグルコシドパルミテート５μｇ/ｍＬにα-トコフェロール２５μＭ併用群、β−シトステロールグルコシドパルミテート２．５μｇ/ｍＬにα-トコフェロール１２．５μＭ併用群を用意し、パルミチン酸刺激によるＴＮＦ−α抑制効果を試験した。
なおα-トコフェロールは次のように調製した。
α-トコフェロール( Sigma-Aldrich社)をDMSOで20mM濃度に調製し、このストック溶液をDMSOで希釈することで所望の濃度溶液を調製した。

【0032】

結果を図1に示す。
β−シトステロールグルコシドパルミテート単独群では、ＴＮＦ-α産生抑制効果が認められるものの、10μＭで頭打ち傾向になり、その効果に限界が見られた。
α-トコフェロール単独群では濃度依存的にＴＮＦ-α産生抑制効果が認められ、100μＭで約32％の産生抑制効果であった。
それらに対し、β−シトステロールグルコシドパルミテートにα-トコフェロールを併用することでＴＮＦ−αは相乗的に抑制され、β−シトステロールグルコシドパルミテート５μｇ/ｍＬにα-トコフェロール２５μＭ併用群では、パルミチン酸無刺激と同等の結果となった。これは、α−トコフェロール100μＭ相当以上の抑制効果である。
したがって、β−シトステロールグルコシドパルミテートにα-トコフェロールを併用するとマクロファージが外部刺激にともなって産生するＴＮＦ−αを完全に抑制できる可能性がある。

【0033】

以上の試験結果から、β−シトステロールグルコシドパルミテートとα-トコフェロールの併用は、ＴＮＦ―α産生を顕著に抑制することが確認された。

【図1】