特許 6082141 ＤＮＡ試料の分類

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6082141

(24)【登録日】2017年1月27日

(45)【発行日】2017年2月15日

(54)【発明の名称】ＤＮＡ試料の分類

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/68 20060101AFI20170206BHJP

   C12Q 1/44 20060101ALI20170206BHJP

   C12Q 1/48 20060101ALI20170206BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20170206BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/68 AZNA

   C12Q1/44

   C12Q1/48 Z

   !C12N15/00 A

【請求項の数】16

【全頁数】47

(21)【出願番号】特願2016-20484(P2016-20484)

(22)【出願日】2016年2月5日

(62)【分割の表示】特願2012-542636(P2012-542636)の分割

【原出願日】2010年12月8日

(65)【公開番号】特開2016-73320(P2016-73320A)

(43)【公開日】2016年5月12日

【審査請求日】2016年2月5日

(31)【優先権主張番号】61/306,201

(32)【優先日】2010年2月19日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/325,977

(32)【優先日】2010年4月20日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/285,758

(32)【優先日】2009年12月11日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】512271240

【氏名又は名称】ニュークレイックス リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＮＵＣＬＥＩＸ ＬＴＤ．

(74)【代理人】

【識別番号】100123788

【弁理士】

【氏名又は名称】宮崎 昭夫

(74)【代理人】

【識別番号】100127454

【弁理士】

【氏名又は名称】緒方 雅昭

(72)【発明者】

【氏名】ワッセルストロム、 アダム

(72)【発明者】

【氏名】フルムキン、 ダン

【審査官】 柴原 直司

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００７−５２２７９５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Epigenetics, (2006), 1, [3], p.146-152

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｑ １／６８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（Ａ）少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼまたは少なくとも１つのメチル化依存性制限エンドヌクレアーゼによりＤＮＡ試料を完全消化すること；
（Ｂ）前記消化されたＤＮＡの少なくとも２つのゲノム遺伝子座を増幅することであって、少なくとも１つの該遺伝子座が、異なるＤＮＡ区分で特異的にメチル化される制限遺伝子座であり、したがって該ＤＮＡ試料中で少なくとも２つのゲノム遺伝子座のそれぞれにおいて増幅産物を生成すること；
（Ｃ）前記各遺伝子座における該増幅産物のシグナル強度を測定すること；
（Ｄ）前記増幅産物の該シグナル強度間のシグナル比を計算すること；
（Ｅ）既知のＤＮＡ区分における該少なくとも２つのゲノム遺伝子座の増幅産物のシグナル強度の比を表す１又は複数の基準値を提供すること；及び
（Ｆ）該シグナル比と該基準値とを比較して、シグナル比と最も近い基準値のＤＮＡ区分が前記ＤＮＡ試料の区分であると決定すること、
を含み、
前記少なくとも２つのゲノム遺伝子座が、可能性のある異なるカテゴリに対し明確なシグナル比を生成し、
ゲノム標的又はアンプリコンの絶対的定量化は必要とせず、標準曲線または標準ＤＮＡは必要とせず、および
任意のゲノム遺伝子座における実際のメチル化度は示さない、
ことを特徴とする、ＤＮＡ試料を分類する方法。

【請求項2】

前記ＤＮＡ区分が、組織型、細胞型、生理学的状態、病的状態、年齢、民族性、性別、メチル化レベル、種、細胞系、天然のＤＮＡ及び人工的に合成したＤＮＡ、病的状態の発症の危険性、胎児の状態、病気の予後、治療効果を示す傾向、細胞系継代培養の影響、および薬剤に対する反応からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記組織型又は前記細胞型が、血液、唾液、精液、表皮、尿、血漿、毛髪、月経血、膣細胞及び／又は分泌物、汗、大便、脳、食道、肺、胃、心臓、十二指腸、肝臓、胆のう、腸、腎臓、副腎、膀胱、尿道、結腸、睾丸、卵巣、子宮、膣、筋肉、腱、靭帯、脂肪、軟骨、骨、内皮細胞、子宮頸部、リンパ、甲状腺、下垂体、小脳及び胸部からなる群から選択され、前記病的状態が、癌、炎症、自己免疫疾患、代謝異常、感染症、変性疾患、ホルモン不均衡、異常なＤＮＡメチル化により特徴づけられる疾患、ＩＣＦの神経発達障害（免疫不全、動原体不安定及び顔面異常）、レット症候群及び脆弱性Ｘ症候群から選択され、前記胎児の状態が、プラダー−ウィリ症候群、アンジェルマン症候群、ベックウィズ・ブィーデマン症候群、脆弱Ｘ症候群、ラッセルシルバー症候群、新生児一過性糖尿病、アルブライト遺伝性骨ジストロフィー、マックーン−オルブライト症候群、遺伝性非クロム親和型パラガングリオーマ、母親性及び父親性ＵＰＤ１４症候群から選択される、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記１または複数の基準値が、１または複数のＤＮＡ区分の存在を表す、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記ＤＮＡ区分が、精液及び非精液の混合物由来である、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼが、ＡａｔＩＩ、Ａｃｃ６５Ｉ、ＡｃｃＩ、ＡｃｉＩ、ＡＣｌＩ、ＡｆｅＩ、ＡｇｅＩ、ＡｐａＩ、ＡｐａＬＩ、ＡｓｃＩ、ＡｓｉＳＩ、ＡｖａＩ、ＡｖａＩＩ、ＢａｅＩ、ＢａｎＩ、ＢｂｅＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｇＩ、ＢｆｕＣＩ、ＢｇｌＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｓａＡＩ、ＢｓａＢＩ、ＢｓａＨＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｅＹＩ、ＢｓｉＥＩ、ＢｓｉＷＩ、ＢｓｌＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＤＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＦＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＢｓｓＫＩ、ＢｓｔＡＰＩ、ＢｓｔＢＩ、ＢｓｔＵＩ、ＢｓｔＺ１７Ｉ、Ｃａｃ８Ｉ、ＣｌａＩ、ＤｐｎＩ、ＤｒｄＩ、ＥａｅＩ、ＥａｇＩ、Ｅａｇｌ−ＨＦ、ＥｃｉＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＩ−ＨＦ、ＦａｕＩ、Ｆｎｕ４ＨＩ、ＦｓｅＩ、ＦｓｐＩ、ＨａｅＩＩ、ＨｇａＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＨｉｎｆＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、ＨｐａＩ、ＨｐａＩＩ、Ｈｐｙ１６６ｉｉ、Ｈｐｙ１８８ｉｉｉ、Ｈｐｙ９９Ｉ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＫａｓＩ、ＭｌｕＩ、ＭｍｅＩ、ＭｓｐＡ１Ｉ、ＭｗｏＩ、ＮａｅＩ、ＮａｒＩ、ＮｇｏＮＩＶ、Ｎｈｅ−ＨＦＩ、ＮｈｅＩ、ＮｌａＩＶ、ＮｏｔＩ、ＮｏｔＩ−ＨＦ、ＮｒｕＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ、ＰａｅＲ７Ｉ、ＰｌｅＩ、ＰｍｅＩ、ＰｍｌＩ、ＰｓｈＡＩ、ＰｓｐＯＭＩ、ＰｖｕＩ、ＲｓａＩ、ＲｓｒＩＩ、ＳａｃＩＩ、ＳａｌＩ、ＳａｌＩ−ＨＦ、Ｓａｕ３ＡＩ、Ｓａｕ９６Ｉ、ＳｃｒＦＩ、ＳｆｉＩ、ＳｆｏＩ、ＳｇｒＡＩ、ＳｍａＩ、ＳｎａＢＩ、ＴｆｉＩ、ＴｓｃＩ、ＴｓｅＩ、ＴｓｐＭＩ及びＺｒａＩからなる群から選択され、前記メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼがＨｈａＩであり、前記メチル化依存性制限エンドヌクレアーゼが、ＭｃｒＢＣ、ＭｃｒＡ及びＭｒｒＡからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

シグナル強度が、キャピラリー電気泳動の際に測定される、増幅産物の蛍光レベルである、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

工程（Ｂ）及び（Ｃ）がリアルタイムＰＣＲより実施される、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記工程（Ｂ）が、蛍光標識されたプライマーを用いて行われ、各遺伝子座の増幅産物のシグナル強度は、各増幅産物の蛍光レベルである、又は
前記工程（Ｂ）が、さらに蛍光標識されたプローブを各遺伝子座の増幅産物とハイブリダイズすることを含み、前記増幅産物のシグナル強度は、前記産物のプローブのハイブリダイゼーション後に測定する蛍光レベルである、
請求項１に記載の方法。

【請求項10】

ＤＮＡの分類とＤＮＡプロファイリングを同時に実施することを更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

前記消化および増幅の工程を、１つの試験管内で同時に実施する、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

請求項１に記載の方法に従ってＤＮＡ試料の区分をするためのキットであって、
（１）少なくとも２つの遺伝子座の増幅のためのプライマー；及び
（２）反応バッファ、（３）対照ＤＮＡ、（４）メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼ又はメチル化依存性制限エンドヌクレアーゼ、および（５）分類を実施するための書面によるプロトコル、を含むキット。

【請求項13】

分類分析を実施するための分析ソフトウェアを更に含む、請求項１２に記載のキット。

【請求項14】

以下を含む、請求項１に記載の方法に従って精液または非精液としてのＤＮＡ試料を分類するためのキット：
（ａ）以下のプライマーを含むプライマー混合物；
ＳＤ１ｆ（ＡＡＧＡＧＣＣＣＡＴＣＡＧＧＣＡＧＧＴＣ）；
ＳＤ１ｒ（ＧＴＴＴＣＴＴＧＴＣＧＡＧＣＡＧＣＡＣＧＴＧＧＡＴＧＡＴＧ）；
ＳＤ２ｆ（ＣＴＣＣＡＧＡＡＣＴＧＧＡＡＣＴＴＣＣＴＧ）；
ＳＤ２ｒ（ＧＴＴＴＣＴＴＡＡＣＴＴＧＧＡＧＡＣＧＡＣＧＧＣＡＴＣ）；
ＳＤ３ｆ（ＴＧＧＡＧＧＡＣＡＡＴＧＣＣＣＴＧＧＴＧ）；
ＳＤ３ｒ（ＧＴＴＴＣＴＴＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＧＣＧＡＣＣＧＴＣＴＣ）；
ＳＤ４ｆ（ＣＣＣＴＣＣＧＡＧＴＧＧＣＣＡＧＣＡＧ）；
ＳＤ４ｒ（ＧＴＴＴＣＴＧＡＣＣＡＣＴＧＣＣＧＴＧＧＧＡＡＴＧ）；
ＳＤ５ｆ（ＣＴＴＣＴＣＡＧＣＣＡＡＴＧＧＧＡＡＧＡＧ）；
ＳＤ５ｒ（ＡＣＧＴＡＧＡＡＧＧＡＣＣＣＧＡＧＧＡＣ）；
ＳＤ６ｆ（ＴＡＣＡＧＡＣＡＡＡＴＣＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣ）；及び
ＳＤ６ｒ（ＧＴＴＴＣＴＴＧＴＣＴＧＡＣＡＣＴＣＧＧＴＴＧＴＡＧＧＴＡＴＴ）
（ｂ）反応バッファ；
（ｃ）ＨｈａＩ制限エンドヌクレアーゼ；
（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ；および
（ｅ）分類を実施するための書面によるプロトコル。

【請求項15】

（１）ＳＤ１ｆ（ＡＡＧＡＧＣＣＣＡＴＣＡＧＧＣＡＧＧＴＣ）及びＳＤ１ｒ（ＧＴＴＴＣＴＴＧＴＣＧＡＧＣＡＧＣＡＣＧＴＧＧＡＴＧＡＴＧ）；
（２）ＳＤ２ｆ（ＣＴＣＣＡＧＡＡＣＴＧＧＡＡＣＴＴＣＣＴＧ）及びＳＤ２ｒ（ＧＴＴＴＣＴＴＡＡＣＴＴＧＧＡＧＡＣＧＡＣＧＧＣＡＴＣ）；
（３）ＳＤ３ｆ（ＴＧＧＡＧＧＡＣＡＡＴＧＣＣＣＴＧＧＴＧ）及びＳＤ３ｒ（ＧＴＴＴＣＴＴＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＧＣＧＡＣＣＧＴＣＴＣ）；
（４）ＳＤ４ｆ（ＣＣＣＴＣＣＧＡＧＴＧＧＣＣＡＧＣＡＧ）及びＳＤ４ｒ（ＧＴＴＴＣＴＧＡＣＣＡＣＴＧＣＣＧＴＧＧＧＡＡＴＧ）；
（５）ＳＤ５ｆ（ＣＴＴＣＴＣＡＧＣＣＡＡＴＧＧＧＡＡＧＡＧ）及びＳＤ５ｒ（ＡＣＧＴＡＧＡＡＧＧＡＣＣＣＧＡＧＧＡＣ）；
（６）ＳＤ６ｆ（ＴＡＣＡＧＡＣＡＡＡＴＣＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣ）及びＳＤ６ｒ（ＧＴＴＴＣＴＴＧＴＣＴＧＡＣＡＣＴＣＧＧＴＴＧＴＡＧＧＴＡＴＴ）からなる群から選択される、少なくとも１つの順方向（ｆ）及び逆方向（ｒ）プライマー対の組合せを含む、請求項１に記載の方法に従って精液又は非精液としてのＤＮＡ試料を分類するためのキット。

【請求項16】

（ａ）以下に示す遺伝子座を増幅するための順方向及び逆方向プライマーを含むプライマー混合物：
１．Ｌ９１７６２（順方向 ＧＣＡＧＣＡＧＧＣＣＧＣＧＧＡＧＡＡＧ（ＦＡＭ）；逆方向 ＡＧＣＡＧＣＴＧＴＧＣＣＧＧＧＣＣＡＧ）
２．Ｌ６８３４６（順方向 ＣＡＧＣＡＡＣＡＧＣＡＣＣＣＡＧＣＴＴＧ（ＪＯＥ）；逆方向 ＣＡＣＡＧＧＣＴＣＡＧＴＣＧＣＧＧＡＴＣ）
３．Ｌ５０４６８（順方向 ＡＧＧＡＡＡＣＣＴＣＡＧＴＡＧＣＡＡＡＡＴＴＧ （ＪＯＥ）；逆方向 ＧＣＧＡＧＡＣＴＴＴＡＧＧＴＧＴＧＣＡＴＣ）
４．Ｌ１４４３２（順方向 ＣＧＴＡＧＧＣＴＧＣＧＧＴＧＡＧＣＴＣ（ＦＡＭ）；逆方向 ＧＡＴＣＣＡＴＧＣＣＣＧＣＴＧＧＧＡＴＧ）
５．Ｌ４６４８（順方向 ＣＡＧＣＣＴＡＧＡＣＧＴＣＡＡＧＴＴＡＣＡＧ（ＪＯＥ）；逆方向 ＡＣＧＡＣＣＴＣＣＧＧＡＴＣＣＡＡＣＴＧ）
６．Ｌ３９６６４（順方向 ＣＣＣＡＧＣＴＧＧＴＴＧＧＡＣＡＴＧＴＴＧ（ＦＡＭ）；逆方向 ＣＡＣＴＴＣＣＴＴＣＧＴＧＧＡＣＧＣＣ）
７．Ｌ３０１３９（順方向 ＧＡＧＡＡＧＣＧＧＧＡＧＧＡＴＧＡＧＡＣ（ＦＡＭ）；逆方向 ＣＣＧＣＡＴＣＴＣＣＴＣＣＧＴＣＣＴＧ）
８．Ｌ５５４２９（順方向 ＧＣＣＴＴＣＡＧＣＡＧＧＡＡＧＴＣＣＡＣ（ＪＯＥ）；逆方向 ＣＣＴＧＴＧＣＣＴＣＡＣＡＣＡＧＡＣＴＣ）
９．Ｌ６２０８６（順方向 ＧＴＧＣＡＴＧＧＴＧＴＣＴＧＧＴＡＣＴＴＣ（ＦＡＭ）；逆方向 ＧＡＡＧＣＴＣＴＣＧＴＧＧＡＣＴＡＣＴＴＧ）
１０．Ｌ７６１３８（順方向 ＣＡＧＣＣＴＧＣＴＣＴＴＣＡＣＴＧＣＡＧ（ＪＯＥ）；逆方向 ＡＧＡＧＧＣＣＧＡＴＧＡＡＧＣＣＧＴＡＧ）
１１．Ｌ１５９５２（順方向 ＣＴＣＣＣＴＧＡＴＴＴＡＣＧＡＣＡＡＧＴＴＣ （ＦＡＭ）；逆方向 ＧＡＣＡＧＴＡＴＧＣＴＧＡＴＧＣＴＴＣＴＴＧ）
１２．Ｌ３６５９９（順方向 ＡＡＧＧＧＣＡＧＡＧＴＴＣＣＧＣＴＧＴＣ（ＦＡＭ）；逆方向 ＣＧＧＡＴＧＣＡＧＧＡＧＧＡＴＣＣＴＡＧ）
１３．Ｌ２６６８８（順方向 ＣＧＧＡＣＣＡＧＡＴＴＧＣＴＧＧＴＣＡＣ（ＪＯＥ）； 逆方向 ＣＧＡＣＣＴＴＧＣＣＡＧＡＴＧＴＴＴＧＡＣ）
１４．Ｌ８１５２８（順方向 ＡＧＣＣＴＣＡＴＣＣＡＣＡＣＴＧＡＣＣＡＧ（ＪＯＥ）；逆方向ＴＣＡＧＡＧＣＴＣＴＣＣＴＡＴＣＴＧＧＡＣ）
１５．Ｌ３６５５６（順方向 ＧＣＣＡＧＧＣＣＧＴＴＧＡＴＧＡＴＧＡＣ（ＪＯＥ）；逆方向 ＧＡＡＴＡＴＧＧＡＧＣＣＣＴＧＧＧＣＡＧ）；
（ｂ）反応バッファ
（ｃ）ＨｈａＩ制限エンドヌクレアーゼ；
（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ；および
（ｅ）分類を実施するための書面によるプロトコル、
を含む、請求項１に記載の方法に従って血液、唾液、精子、又は表皮としてのＤＮＡ試料を分類するためのキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本国際出願は、２００９年１２月１１日に出願された米国特許仮出願第６１／２８５，７５８号、２０１０年２月１９日に出願された同第６１／３０６，２０１号、２０１０年４月２０日に出願した同第６１／３２５，９７７号に基づく優先権を主張するものであり、これらの出願のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

本発明の技術は、ＤＮＡ試料又は混合ＤＮＡ試料の由来源及び同一性を同定するために、正確かつ費用対効果のある分類及びプロファイリングのための方法に関する。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0003】

本発明は、ＤＮＡ試料を正確かつ費用効果的に、種々の型のインビトロで生成したＤＮＡ又は種々の型の天然のＤＮＡ、例えば、種々の組織及び／又は生理学的／病的状態由来のものに分類する方法に関する。本発明は、特定の遺伝子座におけるメチル化レベルの比と関連づけられた「シグナル比」を比較することにより分類を達成し、任意の遺伝子座における実際のメチル化レベルの計算に依存するものではない。従って、本発明の手順には、外部ＤＮＡ種及び／又は対照を必要とせず、その結果、アッセイを簡略化し、精度を向上させる。本発明の技術は、同じ反応において、ＤＮＡの分類をＤＮＡプロファイリングと一緒に実施することができ、その結果、試料の同時分類及び同一性の判定を可能にする。

【課題を解決するための手段】

【0004】

本発明の一態様は、
（Ａ）メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼ及び／又はメチル化依存性制限エンドヌクレアーゼによりＤＮＡ試料を消化すること；
（Ｂ）少なくとも１つが制限遺伝子座である、少なくとも２つのゲノム遺伝子座を増幅する、消化されたＤＮＡ上でＰＣＲを実施すること；
（Ｃ）各増幅産物のシグナル強度を測定すること；
（Ｄ）前記遺伝子座により生成されたシグナル強度間の「シグナル比」を計算すること；
（Ｅ）種々のＤＮＡ区分に対応する基準値に対するシグナル比を比較すること、
を含む、ＤＮＡ試料を分類する方法であって、ここで、基準値が前記シグナル比に最も対応する区分が、ＤＮＡ試料の区分であると判定される。すなわち、例えば、特定のＤＮＡ区分の基準値の値に対するシグナル比の値の近似値は、ＤＮＡ試料の分類上の区分を示す。従って、シグナル比が基準区分の値に近い値を有する場合、−シグナル比及び基準値の間の値における類似性に基づいて−試験を行ったＤＮＡ試料が、特定の型の区分由来である可能性が高い。従って、特定のＤＮＡ区分についての特定の基準値に最も対応し、又は最も近いシグナル比は、そのＤＮＡ試料が特定のＤＮＡの分類上の起源由来であると期待させる。例えば、シグナル比及び区分基準値を比較する方法については、例えば、試験ＤＮＡ試料を１つ以上の基準区分に分類し得る確率分布及び尤度確率の計算方法を説明する、アルゴリズム及びソフトウェアと標題の付いた項を参照されたい。

【0005】

一実施形態においては、ＤＮＡ鋳型、消化及び増幅酵素、バッファ、プライマー及び補助成分を一緒に試験管に入れ、次いで、この試験管を閉じサーマルサイクラー中に配置し、ここで反応を実施する、単一の生化学反応において、ＤＮＡ消化及びＰＣＲが実施される。

【0006】

一実施形態においては、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼは、その認識配列がメチル化されている場合には、ＤＮＡを切断又は消化することができない。一実施形態においては、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼは、ＡａｔＩＩ、Ａｃｃ６５Ｉ、ＡｃｃＩ、ＡｃｉＩ、ＡＣｌＩ、ＡｆｅＩ、ＡｇｅＩ、ＡｐａＩ、ＡｐａＬＩ、ＡｓｃＩ、ＡｓｉＳＩ、ＡｖａＩ、ＡｖａＩＩ、ＢａｅＩ、ＢａｎＩ、ＢｂｅＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｇＩ、ＢｆｕＣＩ、ＢｇｌＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｓａＡＩ、ＢｓａＢＩ、ＢｓａＨＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｅＹＩ、ＢｓｉＥＩ、ＢｓｉＷＩ、ＢｓｌＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＤＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＦＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＢｓｓＫＩ、ＢｓｔＡＰＩ、ＢｓｔＢＩ、ＢｓｔＵＩ、ＢｓｔＺ１７Ｉ、Ｃａｃ８Ｉ、ＣｌａＩ、ＤｐｎＩ、ＤｒｄＩ、ＥａｅＩ、ＥａｇＩ、Ｅａｇｌ−ＨＦ、ＥｃｉＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＩ−ＨＦ、ＦａｕＩ、Ｆｎｕ４ＨＩ、ＦｓｅＩ、ＦｓｐＩ、ＨａｅＩＩ、ＨｇａＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＨｉｎｆＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、ＨｐａＩ、ＨｐａＩＩ、Ｈｐｙ１６６ｉｉ、Ｈｐｙ１８８ｉｉｉ、Ｈｐｙ９９Ｉ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＫａｓＩ、ＭｌｕＩ、ＭｍｅＩ、ＭｓｐＡ１Ｉ、ＭｗｏＩ、ＮａｅＩ、ＮａｒＩ、ＮｇｏＮＩＶ、Ｎｈｅ−ＨＦＩ、ＮｈｅＩ、ＮｌａＩＶ、ＮｏｔＩ、ＮｏｔＩ−ＨＦ、ＮｒｕＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ、ＰａｅＲ７Ｉ、ＰｌｅＩ、ＰｍｅＩ、ＰｍｌＩ、ＰｓｈＡＩ、ＰｓｐＯＭＩ、ＰｖｕＩ、ＲｓａＩ、ＲｓｒＩＩ、ＳａｃＩＩ、ＳａｌＩ、ＳａｌＩ−ＨＦ、Ｓａｕ３ＡＩ、Ｓａｕ９６Ｉ、ＳｃｒＦＩ、ＳｆｉＩ、ＳｆｏＩ、ＳｇｒＡＩ、ＳｍａＩ、ＳｎａＢＩ、ＴｆｉＩ、ＴｓｃＩ、ＴｓｅＩ、ＴｓｐＭＩ及びＺｒａＩからなる群から選択される。

【0007】

他の実施形態においては、メチル化依存性制限酵素は、ＤＮＡ試料を消化するために用いることができる。メチル依存性制限エンドヌクレアーゼは、メチル化されたＤＮＡのみを消化する。このような制限酵素の例には、ＭｃｒＢＣ、ＭｃｒＡ及びＭｒｒＡが含まれるが、これらに限定されない。

【0008】

一実施形態においては、少なくとも１つの制限遺伝子座は、天然のＤＮＡ中でメチル化されていることが知られている。

【0009】

他の実施形態においては、少なくとも１つの制限遺伝子座は、天然のＤＮＡ中でメチル化されていないことが知られている。

【0010】

特定の実施形態においては、少なくとも２つの制限遺伝子座は、天然のＤＮＡ中で別個にメチル化されていることが知られている。

【0011】

他の実施形態においては、少なくとも２つの遺伝子座間のシグナル比は、少なくとも２つの潜在的な区分によって異なることが知られている。

【0012】

他の実施形態においては、遺伝子座を増幅するために用いられるプライマー対は、統合ＤＮＡインデックスシステム（ＣＯＤＩＳ）において同定された、コアショートタンデムリピート（ＳＴＲ）遺伝子座を増幅するために選択される。

【0013】

一実施形態においては、ＣＯＤＩＳ遺伝子座は、Ｄ１６Ｓ５３９（配列番号１）、Ｄ７Ｓ８２０（配列番号２）、Ｄ１３Ｓ３１７（配列番号３）、Ｄ５Ｓ８１８（配列番号４）、ＣＳＦ１ＰＯ（配列番号５）、ＴＰＯＸ（配列番号６）、ＴＨ０１（配列番号７）、ｖＷＡ（配列番号８）、ＦＧＡ（配列番号９）、Ｄ２１Ｓ１１（配列番号１０）、Ｄ８Ｓ１１７９（配列番号１１）、Ｄ１８Ｓ５１（配列番号１２）、及びＤ３Ｓ１３５８（配列番号１３）からなる群から選択される、ヒトの遺伝子座である。

【0014】

特定の実施形態においては、制限及び／又はプロファイル遺伝子座の順方向及び逆方向プライマーは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５とアニーリングするように設計されている。

【0015】

一実施形態においては、遺伝子座の順方向及び逆方向プライマーは、ＰｏｗｅｒＰｌｅｘ（登録商標）１６ ＨＳ（カタログ番号ＤＣ２１００、ＤＣ２１０１）、ＰｏｗｅｒＰｌｅｘ（登録商標）１６（カタログ番号ＤＣ６５３０、ＤＣ６５３１）、ＰｏｗｅｒＰｌｅｘ（登録商標）２．１（カタログ番号ＤＣ６４７０、ＤＣ６４７１）、ＰｏｗｅｒＰｌｅｘ（登録商標）１６ ＢＩＯ（カタログ番号ＤＣ６５４０、ＤＣ６５４１）及びＰｏｗｅｒＰｌｅｘ（登録商標）ＥＳ Ｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ番号ＤＣ６７３０、ＤＣ６７３１）からなる群から選択されるＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの市販キットにより入手できる。

【0016】

一実施形態においては、遺伝子座の順方向及び逆方向プライマーは、ＳＧＭ、ＳＧＭ＋、ＡｍｐＦｌＳＴＲ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｌｅｒ、ＡｍｐＦｌＳＴＲ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ、ＡｍｐＦｌＳＴＲ ＰｒｏｆｉｌｅｒＰｌｕｓ、ＡｍｐＦｌＳＴＲ ＰｒｏｆｉｌｅｒＰｌｕｓＩＤ、ＡｍｐＦｌＳＴＲ ＳＥｆｉｌｅｒ、ＡｍｐＦｌＳＴＲ ＳＥｆｉｌｅｒ Ｐｌｕｓ、ＡｍｐＦｌＳＴＲ Ｃｏｆｉｌｅｒ、ＡｍｐＦｌＳＴＲ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｌｅｒ Ｄｉｒｅｃｔ、ＡｍｐＦｌＳＴＲ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｌｅｒ Ｐｌｕｓ、ＡｍｐＦｌＳＴＲ ＮＧＭ、ＡｍｐＦｌＳＴＲ Ｙ−ｆｉｌｅｒ、ＡｍｐＦｌＳＴＲ Ｍｉｎｉｆｉｌｅｒからなる群から選択される、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｌｉｆｅの市販キットにより入手できる。

【0017】

一実施形態においては、遺伝子座の順方向及び逆方向プライマーは、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ ＥＳＳＰｌｅｘ、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ ＥＳＳＰｌｅｘ ＳＥ、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ Ｎｏｎａｐｌｅｘ ＥＳＳＰｌｅｘ、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ Ｈｅｘａｐｌｅｘ ＥＳＳＰｌｅｘ、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ Ｔｒｉｐｌｅｘ ＡＦＳ ＱＳ、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ Ｔｒｉｐｌｅｘ ＤＳＦ、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ ＩＤｐｌｅｘ、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ Ｄｅｃａｐｌｅｘ ＳＥ、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ ＨＤｐｌｅｘ、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ Ａｒｇｕｓ Ｘ−１２、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ Ｙ−１２ ＱＳ、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ ＤＩＰｐｌｅｘからなる群から選択されるＱｉａｇｅｎの市販キットにより入手できる。

【0018】

他の実施形態においては、制限遺伝子座はＨｐａＩＩ認識配列を含み、ＡＤＤ６、ＡＤＤ１０、ＡＤＤ１７（配列番号２６〜２８）及びＨｙｐｏ２３、Ｈｙｐｏ２８、Ｈｙｐｏ３３（配列番号２９〜３１）からなる群から選択される。一実施形態においては、ＤＮＡ試料は哺乳動物ＤＮＡ又は植物ＤＮＡである。一実施形態においては、哺乳動物ＤＮＡは、ヒト、類人猿、サル、ラット、マウス、ウサギ、ウシ、ブタ、ヒツジ及びウマからなる群から選択される哺乳動物由来である。特定の実施形態においては、哺乳動物ＤＮＡはヒトＤＮＡである。一実施形態においては、ヒトＤＮＡは男性由来である。他の実施形態においては、ヒトＤＮＡは女性由来である。

【0019】

一実施形態においては、ヒトＤＮＡ試料は、異常なＤＮＡメチル化により特徴付けられる疾患を患っている男性又は女性から得られる。一実施形態においては、疾患は、ＩＣＦの神経発達障害（免疫不全、動原体不安定及び顔面異常）、レット症候群及び脆弱性Ｘ症候群である。

【0020】

一実施形態においては、植物ＤＮＡは植物由来のＤＮＡである。一実施形態においては、植物は、コムギ、芝草、穀物、トウモロコシ、米、オート麦、大麦、ソルガム、ラン、アヤメ、ユリ、タマネギ、バナナ、サトウキビ、ソルガム及びヤシからなる群から選択される単子葉植物である。他の実施形態においては、前記植物は、アボカド、ジャガイモ、タバコ、トマト、サトウダイコン、ブロッコリー、カサバ、カンショ、こしょう、ワタ、ポインセチア、マメ、アルファルファ、大豆、ニンジン、イチゴ、レタス、オーク、カエデ、クルミ、バラ、ハッカ、カボチャ、ヒナギク及びサボテンからなる群から選択される双子葉植物である。

【0021】

本発明の一実施形態においては、少なくとも２つの遺伝子座が、蛍光標識されたプライマーを用いてＰＣＲによって増幅され、遺伝子座の各対のシグナル比を計算するために、前記遺伝子座に対応する蛍光シグナルの強度の一対比較が実施される。

【0022】

一実施形態においては、Ｄ３Ｓ１３５８／Ｄ１８Ｓ５１、Ｄ３Ｓ１３５８／Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ３Ｓ１３５８／Ｐｅｎｔａ＿Ｄ、Ｄ３Ｓ１３５８／ＴＰＯＸ、Ｄ３Ｓ１３５８／ＦＧＡ、ＴＨ０１／Ｐｅｎｔａ＿Ｄ、Ｄ２１Ｓ１１／Ｄ１８Ｓ５１、Ｄ２１Ｓ１１／Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ２１Ｓ１１／Ｐｅｎｔａ＿Ｄ、Ｄ２１Ｓ１１／ＡＭＥＬ、Ｄ２１Ｓ１１／ＴＰＯＸ、Ｄ２１Ｓ１１／ＦＧＡ、Ｄ５Ｓ８１８／Ｄ１８Ｓ５１、ｖＷＡ／Ｄ１８Ｓ５１、Ｄ５Ｓ８１８／Ｐｅｎｔａ＿Ｅ、ｖＷＡ／Ｐｅｎｔａ＿Ｅ、Ｄ５Ｓ８１８／Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ５Ｓ８１８／Ｐｅｎｔａ＿Ｄ、Ｄ５Ｓ８１８／ＴＰＯＸ、Ｄ５Ｓ８１８／ＦＧＡ、Ｄ１３Ｓ３１７／Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７／Ｐｅｎｔａ＿Ｄ、Ｄ１３Ｓ３１７／ＴＰＯＸ、Ｄ１３Ｓ３１７／ＦＧＡ、Ｄ１６Ｓ５３９／Ｄ７Ｓ８２０、ＣＳＦ１ＰＯ／Ｄ７Ｓ８２０、ｖＷＡ／Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ８Ｓ１１７９／Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１６Ｓ５３９／ＴＰＯＸ、Ｄ１６Ｓ５３９／ＦＧＡ、ＣＳＦ１ＰＯ／Ｐｅｎｔａ＿Ｄ、ＣＳＦ１ＰＯ／ＴＰＯＸ、ｖＷＡ／Ｐｅｎｔａ＿Ｄ、ＡＭＥＬ／ＴＰＯＸ、ＡＭＥＬ／ＦＧＡ、ｖＷＡ／Ｄ８Ｓ１１７９、ｖＷＡ／ＴＰＯＸ、ｖＷＡ／ＦＧＡ、Ｄ８Ｓ１１７９／ＴＰＯＸ、Ｄ８Ｓ１１７９／ＦＧＡからなる対の群から選択される遺伝子座の対を増幅するためにプライマー対が用いられる。

【0023】

他の実施形態においては、制限遺伝子座のアンプリコンは、ＤＮＡプリファイリングに用いられる最も小さいアンプリコンよりも小さく、約１００塩基対のサイズである。

【0024】

本発明の技術の一態様においては、アンプリコンシグナルの定量が実施され、ＤＮＡ鋳型の量の定量は必ずしも必要でない。アンプリコンシグナルの比を計算することにより、実際のＤＮＡの濃度を計算する必要がないので、標準曲線又は基準ＤＮＡは必要でない。この実施形態においては、アンプリコンシグナルの比を計算する。シグナルは、ＰＣＲ増幅産物を検出するために用いられる、臭化エチジウム染色、サイバーグリーン染色、銀染色又は蛍光のような標識（しかし、これらに限定されない）の任意の種類の標識から検出されるシグナルであってもよい。

【0025】

後者に関し、一実施形態においては、ＰＣＲ反応を蛍光標識したプライマーで実施し、増幅産物のシグナル強度の測定は、キャピラリー電気泳動による増幅産物の分離及び蛍光シグナルの定量により実施する。

【0026】

他の実施形態においては、ＰＣＲはリアルタイムＰＣＲであり、増幅産物のシグナル強度の測定は、蛍光シグナルの定量により実施する。

【0027】

特定の実施形態においては、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼはＨｈａＩである。

【0028】

特定の実施形態においては、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼはＨｈａＩであり、第一の制限遺伝子座はＴＰＯＸ遺伝子座である。

【0029】

特定の実施形態においては、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼはＨｈａＩであり、第一の制限遺伝子座はＦＧＡ遺伝子座である。

【0030】

分類が精液又は非精液による特定の実施形態においては、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼはＨｈａＩであり、制限遺伝子座はＳＤ１、ＳＤ２、ＳＤ３及びＳＤ４（配列番号３３〜３６）であり、消化された制御遺伝子座はＳＤ５（配列番号３７）であり、消化されていない制御遺伝子座はＳＤ６（配列番号３８）である。

【0031】

分類が血液、唾液、精液又は表皮による特定の実施形態においては、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼはＨｈａＩであり、制限遺伝子座は配列番号３９〜５３である。

【0032】

分類をＤＮＡプロファイリングと一緒に実施し、精液又は非精液による特定の実施形態においては、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼはＨｈａＩであり、制限遺伝子座は配列番号４０及び配列番号５４である。

【0033】

一実施形態においては、遺伝子座の対は、一対の遺伝子の一方が、他のものでなく、１つのＤＮＡ区分における対における第二の遺伝子座よりも高いメチル化レベルを有していることが知られているように、少なくとも２つのＤＮＡ区分における公知のメチル化レベルを有する遺伝子から選択される。

【0034】

他の実施形態においては、一対の遺伝子座は、以下のように、メチル化レベルについての知識がなくても選択される：ランダムな遺伝子座の対を選択；各遺伝子座の増幅のための蛍光標識されたプライマーの設計；種々の区分から得られるＤＮＡ試料における両方の遺伝子座の増幅；キャピラリー電気泳動によるアンプリコンの分離；種々のＤＮＡ試料におけるシグナル比の計算；少なくとも１つの区分に対応する試料から計算した比が、少なくとも１つの他の区分に対応する試料から得られた比と著しく異なる場合（例えば、コルモゴロフ−スミルノフの検定により決定するように、ｐ＝０．０５のしきい値）、アッセイにおける使用に、その対を選択する。一実施形態においては、計算した比を天然の試料から得られた比の一組、及び合成した試料から得られた比の一組と比較する。

【0035】

後者に関し、一実施形態において、本明細書で決定した遺伝子座の特定の対についてＨｈａＩで消化した天然及び合成ＤＮＡ試料の各平均シグナル比を以下に示す。

【0036】

【表1】

【0037】

他の実施形態においては、計算した比を種々の組織区分から抽出したＤＮＡ試料から得られた比の一組と比較する。遺伝子座配列、並びに本明細書に開示される本発明の分類方法に従って使用して得られた例示的なシグナル比及び結果の追加例について図７〜１０に示す表１〜４を参照されたい。

【0038】

本発明の一実施形態、又は本明細書に開示される任意の方法においては、同時にＤＮＡ試料をプロファイリングし、ＤＮＡの区分であるかどうかを決定することを更に含む。一実施形態においては、ＤＮＡ試料のプリファイリング工程は、市販のＤＮＡプロファイリングキットにおいて提供される使用説明書に従って実施される。他の実施形態においては、市販のＤＮＡプロファイリングキットは、ＰｏｗｅｒＰｌｅｘ（登録商標）１６プロファイリングキット（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）である。

【0039】

一実施形態においては、後者に関し、ＤＮＡの分類は組織型による。任意の組織型、例えば、血液、唾液、精液、表皮、尿、血漿及び毛髪等を用いることができるが、これらに限定されない。

【0040】

従って、本発明の一態様は、
（Ａ）メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼ及びメチル化依存性制限の少なくとも１つでＤＮＡ試料を消化すること：
（Ｂ）前記消化されたＤＮＡから少なくとも２つの遺伝子を増幅することであって、少なくとも１つの遺伝子座が制限遺伝子座であり；
（Ｃ）各増幅産物のシグナル強度を測定すること；
（Ｄ）増幅産物間のシグナル強度間のシグナル比を計算すること；及び
（Ｅ）種々のＤＮＡ区分の基準値に対するシグナル比を比較すること、
を含むＤＮＡの分類法であって、特定のＤＮＡ区分の基準比の値に対するシグナル比の値の近似値が、ＤＮＡ試料の分類上の起源を示す方法である。

【0041】

一実施形態においては、シグナル比を比較する基準値は、組織型、細胞型、生理学的状態、病的状態、年齢、民族性、性別、メチル化レベル、種、細胞系、天然のＤＮＡ及び人工的に合成したＤＮＡ、病的状態の発症の危険性、胎児の状態、病気の予後、治療効果を示す傾向、細胞系継代培養の影響、薬剤に対する反応からなる群から選択される少なくとも１つのＤＮＡ区分由来である。

【0042】

他の実施形態においては、組織型又は細胞型は、血液、唾液、精液、表皮、尿、血漿、毛髪、月経血、膣細胞及び／又は分泌物、汗、大便、脳、食道、肺、胃、心臓、十二指腸、肝臓、胆のう、腸、腎臓、副腎、膀胱、尿道、結腸、睾丸、卵巣、子宮、膣、筋肉、腱、靭帯、脂肪、軟骨、骨、内皮細胞、子宮頸部、リンパ、甲状腺、下垂体、小脳及び胸部からなる群から選択される。

【0043】

特定の実施形態においては、組織型又は細胞型は、血液、唾液、精液又は表皮である。

【0044】

他の実施形態においては、病的状態は、癌、炎症、自己免疫疾患、代謝異常、感染症、変性疾患、ホルモン不均衡、異常なＤＮＡメチル化により特徴づけられる疾患、ＩＣＦの神経発達障害（免疫不全、動原体不安定及び顔面異常）、レット症候群及び脆弱性Ｘ症候群である。

【0045】

一実施形態においては、胎児の状態は、プラダー−ウィリ症候群、アンジェルマン症候群、ベックウィズ・ブィーデマン症候群、脆弱Ｘ症候群、ラッセルシルバー症候群、新生児一過性糖尿病、アルブライト遺伝性骨ジストロフィー、マックーン−オルブライト症候群、遺伝性非クロム親和型パラガングリオーマ、母親性及び父親性ＵＰＤ１４症候群である。

【0046】

他の実施形態においては、シグナル比を比較する基準値は、他の区分の混合物である区分を表す。

【0047】

他の実施形態においては、前記シグナル比を比較する基準値は、種々の比における精液及び非精液の混合物由来である。

【0048】

一実施形態においては、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼは、ＡａｔＩＩ、Ａｃｃ６５Ｉ、ＡｃｃＩ、ＡｃｉＩ、ＡＣｌＩ、ＡｆｅＩ、ＡｇｅＩ、ＡｐａＩ、ＡｐａＬＩ、ＡｓｃＩ、ＡｓｉＳＩ、ＡｖａＩ、ＡｖａＩＩ、ＢａｅＩ、ＢａｎＩ、ＢｂｅＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｇＩ、ＢｆｕＣＩ、ＢｇｌＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｓａＡＩ、ＢｓａＢＩ、ＢｓａＨＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｅＹＩ、ＢｓｉＥＩ、ＢｓｉＷＩ、ＢｓｌＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＤＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＦＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＢｓｓＫＩ、ＢｓｔＡＰＩ、ＢｓｔＢＩ、ＢｓｔＵＩ、ＢｓｔＺ１７Ｉ、Ｃａｃ８Ｉ、ＣｌａＩ、ＤｐｎＩ、ＤｒｄＩ、ＥａｅＩ、ＥａｇＩ、Ｅａｇｌ−ＨＦ、ＥｃｉＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＩ−ＨＦ、ＦａｕＩ、Ｆｎｕ４ＨＩ、ＦｓｅＩ、ＦｓｐＩ、ＨａｅＩＩ、ＨｇａＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＨｉｎｆＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、ＨｐａＩ、ＨｐａＩＩ、Ｈｐｙ１６６ｉｉ、Ｈｐｙ１８８ｉｉｉ、Ｈｐｙ９９Ｉ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＫａｓＩ、ＭｌｕＩ、ＭｍｅＩ、ＭｓｐＡ１Ｉ、ＭｗｏＩ、ＮａｅＩ、ＮａｒＩ、ＮｇｏＮＩＶ、Ｎｈｅ−ＨＦＩ、ＮｈｅＩ、ＮｌａＩＶ、ＮｏｔＩ、ＮｏｔＩ−ＨＦ、ＮｒｕＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ、ＰａｅＲ７Ｉ、ＰｌｅＩ、ＰｍｅＩ、ＰｍｌＩ、ＰｓｈＡＩ、ＰｓｐＯＭＩ、ＰｖｕＩ、ＲｓａＩ、ＲｓｒＩＩ、ＳａｃＩＩ、ＳａｌＩ、ＳａｌＩ−ＨＦ、Ｓａｕ３ＡＩ、Ｓａｕ９６Ｉ、ＳｃｒＦＩ、ＳｆｉＩ、ＳｆｏＩ、ＳｇｒＡＩ、ＳｍａＩ、ＳｎａＢＩ、ＴｆｉＩ、ＴｓｃＩ、ＴｓｅＩ、ＴｓｐＭＩ及びＺｒａＩからなる群から選択される。

【0049】

特定の実施形態においては、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼはＨｈａＩである。

【0050】

他の実施形態においては、メチル化依存性制限エンドヌクレアーゼは、ＭｃｒＢＣ、ＭｃｒＡ及びＭｒｒＡからなる群から選択される。

【0051】

一実施形態においては、基準ＤＮＡ区分は、天然のＤＮＡ又は人工的に合成したＤＮＡであって、前記天然のＤＮＡ又は人工的に合成したＤＮＡ中の少なくとも１つの遺伝子座は、ＤＮＡプロファイリングに用いられる、コアショートタンデムリピート（ＳＴＲ）遺伝子座を含む。

【0052】

他の実施形態においては、遺伝子座は、Ｄ１６Ｓ５３９（配列番号 １）、Ｄ７Ｓ８２０（配列番号２）、Ｄ１３Ｓ３１７（配列番号３）、Ｄ５Ｓ８１８（配列番号４）、ＣＳＦ１ＰＯ（配列番号５）、ＴＰＯＸ（配列番号６）、ＴＨ０１（配列番号７）、ｖＷＡ（配列番号８）、ＦＧＡ（配列番号９）、Ｄ２１Ｓ１１（配列番号１０）、Ｄ８Ｓ１１７９（配列番号１１）、Ｄ１８Ｓ５１（配列番号１２）、及びＤ３Ｓ１３５８（配列番号１３）、ＰｅｎｔａＤ（配列番号１４）、ＰｅｎｔａＥ（配列番号１５）、及びアメロゲニン（配列番号１６及び１７）、Ｄ２Ｓ１３３８（配列番号１８）、Ｄ１９Ｓ４３３（配列番号１９）、ＡＣＴＢＰ２ＳＥ３３（配列番号２０）、Ｄ１０Ｓ１２４８（配列番号２１）、Ｄ１Ｓ１６５６（配列番号２２）、Ｄ２２Ｓ１０４５（配列番号２３）、Ｄ２Ｓ４４１（配列番号２４）、及びＤ１２Ｓ３９１（配列番号２５）からなる群から選択されるヒト遺伝子座を含む。

【0053】

一実施形態においては、少なくとも１つの遺伝子座の増幅のためのプライマーは、
（１）ＰｏｗｅｒＰｌｅｘ（登録商標）１６ ＨＳ（カタログ番号ＤＣ２１００、ＤＣ２１０１）、ＰｏｗｅｒＰｌｅｘ（登録商標）１６（カタログ番号ＤＣ６５３０、ＤＣ６５３１）、ＰｏｗｅｒＰｌｅｘ（登録商標）２．１（カタログ番号ＤＣ６４７０、ＤＣ６４７１）、ＰｏｗｅｒＰｌｅｘ（登録商標）１６ ＢＩＯ（カタログ番号ＤＣ６５４０、ＤＣ６５４１）及びＰｏｗｅｒＰｌｅｘ（登録商標）ＥＳ Ｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ番号ＤＣ６７３０、ＤＣ６７３１）からなる群から選択されるＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの市販キット；
（２）ＳＧＭ、ＳＧＭ＋、ＡｍｐＦｌＳＴＲ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｌｅｒ、ＡｍｐＦｌＳＴＲ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ、ＡｍｐＦｌＳＴＲ ＰｒｏｆｉｌｅｒＰｌｕｓ、ＡｍｐＦｌＳＴＲ ＰｒｏｆｉｌｅｒＰｌｕｓＩＤ、ＡｍｐＦｌＳＴＲ ＳＥｆｉｌｅｒ、ＡｍｐＦｌＳＴＲ ＳＥｆｉｌｅｒ Ｐｌｕｓ、ＡｍｐＦｌＳＴＲ Ｃｏｆｉｌｅｒ、ＡｍｐＦｌＳＴＲ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｌｅｒ Ｄｉｒｅｃｔ、ＡｍｐＦｌＳＴＲ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｌｅｒ Ｐｌｕｓ、ＡｍｐＦｌＳＴＲ ＮＧＭ、ＡｍｐＦｌＳＴＲ Ｙ−ｆｉｌｅｒ、及びＡｍｐＦｌＳＴＲ Ｍｉｎｉｆｉｌｅｒからなる群から選択される、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの市販キット；又は
（３）Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ ＥＳＳＰｌｅｘ、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ ＥＳＳＰｌｅｘ ＳＥ、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ Ｎｏｎａｐｌｅｘ ＥＳＳＰｌｅｘ、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ Ｈｅｘａｐｌｅｘ ＥＳＳＰｌｅｘ、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ Ｔｒｉｐｌｅｘ ＡＦＳ ＱＳ、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ Ｔｒｉｐｌｅｘ ＤＳＦ、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ ＩＤｐｌｅｘ、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ Ｄｅｃａｐｌｅｘ ＳＥ、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ ＨＤｐｌｅｘ、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ Ａｒｇｕｓ Ｘ−１２、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ Ｙ−１２ ＱＳ、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ ＤＩＰｐｌｅｘにより入手できる。

【0054】

他の実施形態においては、１つの遺伝子座は、天然のＤＮＡの全ての組織においてメチル化されていないことが知られている。一実施形態においては、１つの遺伝子座は、Ｈｙｐｏ２３、Ｈｙｐｏ２８及びＨｙｐｏ３３からなる群から選択される。

【0055】

他の実施形態においては、本発明の方法は、以下の比の少なくとも１つを計算することを更に含む。
（１）Ｄ３Ｓ１３５８／Ｄ１８Ｓ５１、
（２）Ｄ３Ｓ１３５８／Ｄ７Ｓ８２０、
（３）Ｄ３Ｓ１３５８／Ｐｅｎｔａ＿Ｄ、
（４）Ｄ３Ｓ１３５８／ＴＰＯＸ、
（５）Ｄ３Ｓ１３５８／ＦＧＡ、
（６）ＴＨ０１／Ｐｅｎｔａ＿Ｄ、
（７）Ｄ２１Ｓ１１／Ｄ１８Ｓ５１、
（８）Ｄ２１Ｓ１１／Ｄ７Ｓ８２０、
（９）Ｄ２１Ｓ１１／Ｐｅｎｔａ＿Ｄ、
（１０）Ｄ２１Ｓ１１／ＡＭＥＬ、
（１１）Ｄ２１Ｓ１１／ＴＰＯＸ、
（１２）Ｄ２１Ｓ１１／ＦＧＡ、
（１３）Ｄ５Ｓ８１８／Ｄ１８Ｓ５１、
（１４）ｖＷＡ／Ｄ１８Ｓ５１、
（１５）Ｄ５Ｓ８１８／Ｐｅｎｔａ＿Ｅ、
（１６）ｖＷＡ／Ｐｅｎｔａ＿Ｅ、
（１７）Ｄ５Ｓ８１８／Ｄ７Ｓ８２０、
（１８）Ｄ５Ｓ８１８／Ｐｅｎｔａ＿Ｄ、
（１９）Ｄ５Ｓ８１８／ＴＰＯＸ、
（２０）Ｄ５Ｓ８１８／ＦＧＡ、
（２１）Ｄ１３Ｓ３１７／Ｄ７Ｓ８２０、
（２２）Ｄ１３Ｓ３１７／Ｐｅｎｔａ＿Ｄ、
（２３）Ｄ１３Ｓ３１７／ＴＰＯＸ、
（２４）Ｄ１３Ｓ３１７／ＦＧＡ、
（２５）Ｄ１６Ｓ５３９／Ｄ７Ｓ８２０、
（２６）ＣＳＦ１ＰＯ／Ｄ７Ｓ８２０、
（２７）ｖＷＡ／Ｄ７Ｓ８２０、
（２８）Ｄ８Ｓ１１７９／Ｄ７Ｓ８２０、
（２９）Ｄ１６Ｓ５３９／ＴＰＯＸ、
（３０）Ｄ１６Ｓ５３９／ＦＧＡ、
（３１）ＣＳＦ１ＰＯ／Ｐｅｎｔａ＿Ｄ、
（３２）ＣＳＦ１ＰＯ／ＴＰＯＸ、
（３３）ｖＷＡ／Ｐｅｎｔａ＿Ｄ、
（３４）ＡＭＥＬ／ＴＰＯＸ、
（３５）ＡＭＥＬ／ＦＧＡ、
（３６）ｖＷＡ／Ｄ８Ｓ１１７９、
（３７）ｖＷＡ／ＴＰＯＸ、
（３８）ｖＷＡ／ＦＧＡ、
（３９）Ｄ８Ｓ１１７９／ＴＰＯＸ、及び
（４０）Ｄ８Ｓ１１７９／ＦＧＡ。

【0056】

特定の実施形態においては、少なくとも１つの遺伝子座は、ＴＰＯＸ（配列番号６）又はＦＧＡ（配列番号９）である。

【0057】

他の実施形態においては、増幅した遺伝子座は９０塩基対以下のサイズである。

【0058】

一実施形態においては、シグナル強度は、キャピラリー電気泳動の際に測定される、増幅産物の蛍光レベルである。

【0059】

一実施形態においては、上記に開示された方法の工程（Ｂ）及び（Ｃ）はリアルタイムＰＣＴより実施される。すなわち、一実施形態においては、必要な全ての試薬、並びにＤＮＡ消化及びＰＣＲによる増幅に必要なプライマー及び酵素は、同じ試験管又は容器内に一緒に存在する。

【0060】

一実施形態においては、消化されたＤＮＡの選択された遺伝子座をＰＣＲ増幅するために蛍光標識されたプライマーが用いられ、各増幅産物のシグナル強度は、各増幅産物の蛍光レベルである。

【0061】

他の実施形態においては、前記方法は、蛍光標識されたプローブを増幅産物とハイブリダイズすることを更に含み、増幅産物のシグナル強度は、産物のプローブのハイブリダイゼーション後に測定する蛍光レベルである。

【0062】

別の実施形態では、本方法は、ＤＮＡ試料の可能性のあるカテゴリに対する信頼性を割り当てることをさらに含む。この信頼性は、ＤＮＡの特定のカテゴリが、ＤＮＡ試料のカテゴリとしての源を示している可能性を反映しており、その可能性は、以下によって算出される。

【0063】

（Ａ）様々なＤＮＡのカテゴリに対応する参照値に対するシグナル比を比較し、それぞれに対する確率スコアを割り当てる。確率スコアは、（ｉ）可能な各カテゴリの参照値に対するガンマ分布の確立関数を割り当て、ここで、（ｉｉ）確率スコアは、観察されたシグナル比で、ステップ（Ａ）において割り当てられたガンマ分布の確立関数の値と等しい；
（Ｂ）分類毎に、ステップ（Ａ）において得られた確率スコアの結果である、カテゴリ尤度スコアを計算する；及び
（Ｃ）可能性のあるカテゴリ毎のカテゴリ尤度スコアを、全てのカテゴリ尤度スコアの合計値で除算し、尤度スコアを正規化する；
ここで、各カテゴリの信頼性は、正規化されたカテゴリの尤度スコアである。

【0064】

別の実施形態では、本方法は、ＤＮＡプロファイリングとＤＮＡ分類を同時に行うことをさらに含む。

【0065】

１つの実施形態では、ＤＮＡ消化及びポリメラーゼ連鎖反応のステップは、単一のチューブで一緒に行われる。

【0066】

１つの実施形態では、増幅されたゲノム遺伝子座が、可能性のある異なるカテゴリに対し明確なシグナル比を生成するために選ばれる。

【0067】

本発明の別の態様は、（１）特定のゲノム遺伝子座を増幅するためのプライマー；及び、（２）反応バッファ（３）制御ＤＮＡ、（４）メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼ及び／又はメチル化依存性制限エンドヌクレアーゼ、（５）分類実施のためのプロトコルを記載した文書からなる群から選択される少なくとも１つ以上の試薬を含む、ＤＮＡ試料を少なくとも２つの予め定められた分類に分け、関連する分類信頼性を得るためのキットである。本発明の１つの実施形態では、プロトコルを記載した文書には、ＤＮＡプロファイリング法に加え、ＤＮＡ消化パラメータ、ＰＣＲサイクリングパラメータ、シグナル比解析、及び分類解析、並びに増幅された遺伝子座を含むがこれに限定されない、本明細書に開示の任意の方法を行うための指示書が含まれてもよい。

【0068】

別の実施形態では、キットには、分類解析を行うための解析ソフトウェアがさらに含まれる。

【0069】

本発明の別の態様は、ＤＮＡ試料を精液又は非精液に分類し、関連する分類信頼性を得るためのキットであり、以下が含まれる。

【0070】

（ａ）以下のプライマーを含むプライマーミックス：
ＳＤ１ｆ（ＡＡＧＡＧＣＣＣＡＴＣＡＧＧＣＡＧＧＴＣ）；
ＳＤ１ｒ（ＧＴＴＴＣＴＴＧＴＣＧＡＧＣＡＧＣＡＣＧＴＧＧＡＴＧＡＴＧ）；
ＳＤ２ｆ（ＣＴＣＣＡＧＡＡＣＴＧＧＡＡＣＴＴＣＣＴＧ）；
ＳＤ２ｒ（ＧＴＴＴＣＴＴＡＡＣＴＴＧＧＡＧＡＣＧＡＣＧＧＣＡＴＣ）；
ＳＤ３ｆ（ＴＧＧＡＧＧＡＣＡＡＴＧＣＣＣＴＧＧＴＧ）；
ＳＤ３ｒ（ＧＴＴＴＣＴＴＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＧＣＧＡＣＣＧＴＣＴＣ）；
ＳＤ４ｆ（ＣＣＣＴＣＣＧＡＧＴＧＧＣＣＡＧＣＡＧ）；
ＳＤ４ｒ（ＧＴＴＴＣＴＧＡＣＣＡＣＴＧＣＣＧＴＧＧＧＡＡＴＧ）；
ＳＤ５ｆ（ＣＴＴＣＴＣＡＧＣＣＡＡＴＧＧＧＡＡＧＡＧ）；
ＳＤ５ｒ（ＡＣＧＴＡＧＡＡＧＧＡＣＣＣＧＡＧＧＡＣ）；
ＳＤ６ｆ（ＴＡＣＡＧＡＣＡＡＡＴＣＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣ）；及び
ＳＤ６ｒ（ＧＴＴＴＣＴＴＧＴＣＴＧＡＣＡＣＴＣＧＧＴＴＧＴＡＧＧＴＡＴＴ）；
（ｂ）反応バッファ；
（ｃ）Ｈｈａ１制限エンドヌクレアーゼ；
（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ
（ｄ）分類作業のためのプロトコルを記載した書類
別の実施形態では、キットには制御ＤＮＡ試料がさらに含まれる。

【0071】

本発明の別の態様は、ＤＮＡ試料を精液又は非精液として分類し、関連する分類信頼性を得るためのキットであり、以下からなる群から選択される少なくとも１対の順方向（ｆ）及び逆方向（ｒ）を含む
（１）ＳＤ１ｆ（ＡＡＧＡＧＣＣＣＡＴＣＡＧＧＣＡＧＧＴＣ）及びＳＤ１ｒ（ＧＴＴＴＣＴＴＧＴＣＧＡＧＣＡＧＣＡＣＧＴＧＧＡＴＧＡＴＧ）；
（２）ＳＤ２ｆ（ＣＴＣＣＡＧＡＡＣＴＧＧＡＡＣＴＴＣＣＴＧ）及びＳＤ２ｒ（ＧＴＴＴＣＴＴＡＡＣＴＴＧＧＡＧＡＣＧＡＣＧＧＣＡＴＣ）；
（３）ＳＤ３ｆ（ＴＧＧＡＧＧＡＣＡＡＴＧＣＣＣＴＧＧＴＧ）及びＳＤ３ｒ（ＧＴＴＴＣＴＴＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＧＣＧＡＣＣＧＴＣＴＣ）；
（４）ＳＤ４ｆ（ＣＣＣＴＣＣＧＡＧＴＧＧＣＣＡＧＣＡＧ）及びＳＤ４ｒ（ＧＴＴＴＣＴＧＡＣＣＡＣＴＧＣＣＧＴＧＧＧＡＡＴＧ）；
（５）ＳＤ５ｆ（ＣＴＴＣＴＣＡＧＣＣＡＡＴＧＧＧＡＡＧＡＧ）及びＳＤ５ｒ（ＡＣＧＴＡＧＡＡＧＧＡＣＣＣＧＡＧＧＡＣ）；
（６）ＳＤ６ｆ（ＴＡＣＡＧＡＣＡＡＡＴＣＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣ）及びＳＤ６ｒ（ＧＴＴＴＣＴＴＧＴＣＴＧＡＣＡＣＴＣＧＧＴＴＧＴＡＧＧＴＡＴＴ）。

【0072】

１つの実施形態では、プライマーミックスのプライマーの濃度は、０．６μＭのＳＤ１ｆ、０．６μＭのＳＤ１ｒ、１．７５μＭのＳＤ２ｆ、１．７５μＭのＳＤ２ｒ、１．２５μＭのＳＤ３ｆ、１．２５μＭのＳＤ３ｒ、１．７５μＭのＳＤ４ｆ、１．７５μＭのＳＤ４ｒ、１．７５μＭのＳＤ５ｆ、１．７５μＭのＳＤ５ｒ、０．９μＭのＳＤ６ｆ、及び０．９μＭのＳＤ６ｒである。

【0073】

１つの実施形態では、反応バッファには、１５０ｍＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌ、１５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２ｍＭの各ｄｎｔｐ、及び０．１μｇ／μｌのＢＳＡが含まれる。

【0074】

１つの実施形態では、キットにはＤＮＡラダーがさらに含まれる。

【0075】

１つの実施形態では、キットには分類解析を行うための解析ソフトウェアがさらに含まれる。

【0076】

本発明の別の態様は、ＤＮＡ試料を精液又は非精液としてプロファイリングし、分類し、及び関連する分類信頼性を得るためのキットであり、以下を含む：
（ａ）少なくとも１つの精液特異的遺伝子座を増幅するためのプライマー
（ｂ）ＤＮＡプロファイリングに使用される少なくとも１つの遺伝子座を増殖するプライマー
（ｃ）反応バッファ
（ｄ）Ｈｈａ１制限エンドヌクレアーゼ
（ｅ）ＤＮＡポリメラーゼ
（ｆ）分類実施のためのプロトコル文書。

【0077】

１つの実施形態では、キットには制御ＤＮＡ試料がさらに含まれる。

【0078】

本発明の別の態様は、ＤＮＡ試料をプロファイリングし、精液又は非精液として分類し、及び関連する分類信頼性を得るためのキットであり、以下を含む：
（ａ）少なくとも１つの精液特異的遺伝子座を増幅するためのプライマー
（ｂ）ＤＮＡプロファイリングに使用される少なくとも１つの遺伝子座を増幅するためのプライマー。

【0079】

１つの実施形態では、本明細書で開示されるキットにより増幅される精液特異的遺伝子座の少なくとも１つは、Ｌ６８３４６遺伝子座である。１つの実施形態では、Ｌ６８３４６由来の７０ｂｐ精液特異的増幅産物を増幅するためのプライマーは、ＣＡＧＣＡＡＣＡＧＣＡＣＣＣＡＧＣＴＴＧ（ＦＡＭ）配列を含む順方向プライマー及びＣＡＣＡＧＧＣＴＣＡＧＴＣＧＣＧＧＡＴＣ配列を含む逆方向プライマーである。

【0080】

１つの実施形態では、本明細書で開示されるキットにより増幅される精液特異的遺伝子座の少なくとも１つは、Ｌ１６２６４遺伝子座である。１つの実施形態では、Ｌ１６２６４由来の９５ｂｐ精液特異的増幅産物を増幅するためのプライマーは、ＧＧＡＣＧＡＧＴＴＡＡＣＴＴＣＣＴＴＡＡＴＴＴＣ（ＦＡＭ）配列を含む順方向プライマー及びＧＴＴＴＣＴＴＣＧＣＧＧＡＡＣＣＴＧＧＴＴＴＡＡＣＴＴＣを含む逆方向プライマーである。

【0081】

別の実施形態では、反応バッファには、１５０ｍＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌ、１５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２ｍＭの各ｄｎｔｐ、及び０．１μｇ／μｌのＢＳＡが含まれる。

【0082】

別の実施形態では、キットには、（ａ）ＤＮＡラダー、（ｂ）化学物質安全性データシート（ＭＳＤＳ）、及び（ｃ）分類解析を行うための解析ソフトウェアのうち少なくとも１つがさらに含まれる。

【0083】

本発明の別の態様は、ＤＮＡ試料を、血液、唾液、精液、又は皮膚表皮に分類し、関連する分類信頼性を得るためのキットであり、以下を含む：
（ａ）以下の通り表記された遺伝子座を増幅するための順方向プライマー及び逆方向プライマーを含むプライマーミックス
１．Ｌ９１７６２（順方向ＧＣＡＧＣＡＧＧＣＣＧＣＧＧＡＧＡＡＧ（ＦＡＭ）；逆方向ＡＧＣＡＧＣＴＧＴＧＣＣＧＧＧＣＣＡＧ）
２．Ｌ６８３４６（順方向ＣＡＧＣＡＡＣＡＧＣＡＣＣＣＡＧＣＴＴＧ（ＪＯＥ）；逆方向ＣＡＣＡＧＧＣＴＣＡＧＴＣＧＣＧＧＡＴＣ）
３．Ｌ５０４６８（順方向ＡＧＧＡＡＡＣＣＴＣＡＧＴＡＧＣＡＡＡＡＴＴＧ（ＪＯＥ）；逆方向ＧＣＧＡＧＡＣＴＴＴＡＧＧＴＧＴＧＣＡＴＣ）
４．Ｌ１４４３２（順方向ＣＧＴＡＧＧＣＴＧＣＧＧＴＧＡＧＣＴＣ（ＦＡＭ）；逆方向ＧＡＴＣＣＡＴＧＣＣＣＧＣＴＧＧＧＡＴＧ）
５．Ｌ４６４８（順方向ＣＡＧＣＣＴＡＧＡＣＧＴＣＡＡＧＴＴＡＣＡＧ（ＪＯＥ）；逆方向ＡＣＧＡＣＣＴＣＣＧＧＡＴＣＣＡＡＣＴＧ）
６．Ｌ３９６６４（順方向ＣＣＣＡＧＣＴＧＧＴＴＧＧＡＣＡＴＧＴＴＧ（ＦＡＭ）；逆方向ＣＡＣＴＴＣＣＴＴＣＧＴＧＧＡＣＧＣＣ）
７．Ｌ３０１３９（順方向ＧＡＧＡＡＧＣＧＧＧＡＧＧＡＴＧＡＧＡＣ（ＦＡＭ）；逆方向ＣＣＧＣＡＴＣＴＣＣＴＣＣＧＴＣＣＴＧ）
８．Ｌ５５４２９（順方向ＧＣＣＴＴＣＡＧＣＡＧＧＡＡＧＴＣＣＡＣ（ＪＯＥ）；逆方向ＣＣＴＧＴＧＣＣＴＣＡＣＡＣＡＧＡＣＴＣ）
９．Ｌ６２０８６（順方向ＧＴＧＣＡＴＧＧＴＧＴＣＴＧＧＴＡＣＴＴＣ（ＦＡＭ）；逆方向ＧＡＡＧＣＴＣＴＣＧＴＧＧＡＣＴＡＣＴＴＧ）
１０．Ｌ７６１３８（順方向ＣＡＧＣＣＴＧＣＴＣＴＴＣＡＣＴＧＣＡＧ（ＪＯＥ）；逆方向ＡＧＡＧＧＣＣＧＡＴＧＡＡＧＣＣＧＴＡＧ）
１１．Ｌ１５９５２（順方向ＣＴＣＣＣＴＧＡＴＴＴＡＣＧＡＣＡＡＧＴＴＣ（ＦＡＭ）；逆方向ＧＡＣＡＧＴＡＴＧＣＴＧＡＴＧＣＴＴＣＴＴＧ）
１２．Ｌ３６５９９（順方向ＡＡＧＧＧＣＡＧＡＧＴＴＣＣＧＣＴＧＴＣ（ＦＡＭ）；逆方向ＣＧＧＡＴＧＣＡＧＧＡＧＧＡＴＣＣＴＡＧ）
１３．Ｌ２６６８８（順方向ＣＧＧＡＣＣＡＧＡＴＴＧＣＴＧＧＴＣＡＣ（ＪＯＥ）；逆方向ＣＧＡＣＣＴＴＧＣＣＡＧＡＴＧＴＴＴＧＡＣ）
１４．Ｌ８１５２８（順方向ＡＧＣＣＴＣＡＴＣＣＡＣＡＣＴＧＡＣＣＡＧ（ＪＯＥ）；逆方向ＴＣＡＧＡＧＣＴＣＴＣＣＴＡＴＣＴＧＧＡＣ）
１５．Ｌ３６５５６（順方向ＧＣＣＡＧＧＣＣＧＴＴＧＡＴＧＡＴＧＡＣ（ＪＯＥ）；逆方向ＧＡＡＴＡＴＧＧＡＧＣＣＣＴＧＧＧＣＡＧ）
（ｂ）反応バッファ
（ｃ）Ｈｈａ１制限エンドヌクレアーゼ
（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ
（ｅ）分類を行うためのプロトコル文書。

【0084】

別の実施形態では、キットは制御ＤＮＡ試料をさらに含む。

【0085】

１つの実施形態では、反応バッファには、１５０ｍＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌ、１５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２ｍＭの各ｄｎｔｐ、及び０．１μｇ／μｌのＢＳＡが含まれる。

【0086】

別の実施形態では、キットには、（ａ）ＤＮＡラダー、（ｂ）化学物質安全性データシート（ＭＳＤＳ）、及び（ｃ）分類解析を行うための解析ソフトウェアのうち少なくとも１つがさらに含まれる。

【0087】

本明細書で開示する任意の方法における１つの実施形態では、ＤＮＡ試料には、複数のＤＮＡ試料の混合物が含まれる。

【0088】

本発明の別の態様は、ＤＮＡ試料間で異なるメチル化の距離度を算出するための方法であり、以下が含まれる
（Ａ）各ＤＮＡ試料をメチル化感受性及び／又はメチル化依存性制限エンドヌクレアーゼで消化する；
（Ｂ）少なくとも１つが制限遺伝子座である、少なくとも２つのゲノム遺伝子座を増幅する、消化された各ＤＮＡに対しＰＣＲを行う；
（Ｃ）ＤＮＡ試料毎に、各増幅産物のシグナルの強度を決定する；
（Ｄ）ＤＮＡ試料毎に、遺伝子座により生成されるシグナルの強度間の「シグナル比」を算出する；
（Ｅ）対応するシグナル比の定量的比較を行うことによりＤＮＡ試料間の異なるメチル化度を算出する。

【0089】

本方法の１つの実施形態では、距離度は、複数のＤＮＡ試料間のシグナル比間の絶対差の合計である。

【0090】

本方法の別の実施形態では、距離度は、複数のＤＮＡ試料のシグナル比間の差の２乗の合計の平方根である。

【0091】

本方法の１つの実施形態では、対象試料と参照となる健常者の試料との間で測定された距離は、病的状態の治療に必要な医薬品の量を示している。

【0092】

本方法の別の実施形態では、培養細胞から取得したＤＮＡ試料と参照試料との間で測定された距離は、細胞に対する継代培養プロセスの数を示している。

【0093】

本発明の別の態様は、以下からなる群から選択されるプライマーである
１．ＧＣＡＧＣＡＧＧＣＣＧＣＧＧＡＧＡＡＧ；
２．ＡＧＣＡＧＣＴＧＴＧＣＣＧＧＧＣＣＡＧ；
３．ＣＡＧＣＡＡＣＡＧＣＡＣＣＣＡＧＣＴＴＧ；
４．ＣＡＣＡＧＧＣＴＣＡＧＴＣＧＣＧＧＡＴＣ；
５．ＡＧＧＡＡＡＣＣＴＣＡＧＴＡＧＣＡＡＡＡＴＴＧ；
６．ＧＣＧＡＧＡＣＴＴＴＡＧＧＴＧＴＧＣＡＴＣ；
７．ＣＧＴＡＧＧＣＴＧＣＧＧＴＧＡＧＣＴＣ；
８．ＧＡＴＣＣＡＴＧＣＣＣＧＣＴＧＧＧＡＴＧ；
９．ＣＡＧＣＣＴＡＧＡＣＧＴＣＡＡＧＴＴＡＣＡＧ；
１０．ＡＣＧＡＣＣＴＣＣＧＧＡＴＣＣＡＡＣＴＧ；
１１．ＣＣＣＡＧＣＴＧＧＴＴＧＧＡＣＡＴＧＴＴＧ；
１２．ＣＡＣＴＴＣＣＴＴＣＧＴＧＧＡＣＧＣＣ；
１３．ＧＡＧＡＡＧＣＧＧＧＡＧＧＡＴＧＡＧＡＣ；
１４．ＣＣＧＣＡＴＣＴＣＣＴＣＣＧＴＣＣＴＧ；
１５．ＧＣＣＴＴＣＡＧＣＡＧＧＡＡＧＴＣＣＡＣ；
１６．ＣＣＴＧＴＧＣＣＴＣＡＣＡＣＡＧＡＣＴＣ；
１７．ＧＴＧＣＡＴＧＧＴＧＴＣＴＧＧＴＡＣＴＴＣ；
１８．ＧＡＡＧＣＴＣＴＣＧＴＧＧＡＣＴＡＣＴＴＧ；
１９．ＣＡＧＣＣＴＧＣＴＣＴＴＣＡＣＴＧＣＡＧ；
２０．ＡＧＡＧＧＣＣＧＡＴＧＡＡＧＣＣＧＴＡＧ；
２１．ＣＴＣＣＣＴＧＡＴＴＴＡＣＧＡＣＡＡＧＴＴＣ；
２２．ＧＡＣＡＧＴＡＴＧＣＴＧＡＴＧＣＴＴＣＴＴＧ；
２３．ＡＡＧＧＧＣＡＧＡＧＴＴＣＣＧＣＴＧＴＣ；
２４．ＣＧＧＡＴＧＣＡＧＧＡＧＧＡＴＣＣＴＡＧ；
２５．ＣＧＧＡＣＣＡＧＡＴＴＧＣＴＧＧＴＣＡＣ；
２６．ＣＧＡＣＣＴＴＧＣＣＡＧＡＴＧＴＴＴＧＡＣ；
２７．ＡＧＣＣＴＣＡＴＣＣＡＣＡＣＴＧＡＣＣＡＧ；
２８．ＴＣＡＧＡＧＣＴＣＴＣＣＴＡＴＣＴＧＧＡＣ；
２９．ＧＣＣＡＧＧＣＣＧＴＴＧＡＴＧＡＴＧＡＣ； 及び
３０．ＧＡＡＴＡＴＧＧＡＧＣＣＣＴＧＧＧＣＡＧ
３１．ＡＡＧＡＧＣＣＣＡＴＣＡＧＧＣＡＧＧＴＣ
３２．ＧＴＴＴＣＴＴＧＴＣＧＡＧＣＡＧＣＡＣＧＴＧＧＡＴＧＡＴＧ
３３．ＣＴＣＣＡＧＡＡＣＴＧＧＡＡＣＴＴＣＣＴＧ
３４．ＧＴＴＴＣＴＴＡＡＣＴＴＧＧＡＧＡＣＧＡＣＧＧＣＡＴＣ
３５．ＴＧＧＡＧＧＡＣＡＡＴＧＣＣＣＴＧＧＴＧ
３６．ＧＴＴＴＣＴＴＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＧＣＧＡＣＣＧＴＣＴＣ
３７．ＣＣＣＴＣＣＧＡＧＴＧＧＣＣＡＧＣＡＧ
３８．ＧＴＴＴＣＴＧＡＣＣＡＣＴＧＣＣＧＴＧＧＧＡＡＴＧ
３９．ＣＴＴＣＴＣＡＧＣＣＡＡＴＧＧＧＡＡＧＡＧ
４０．ＡＣＧＴＡＧＡＡＧＧＡＣＣＣＧＡＧＧＡＣ
４１．ＴＡＣＡＧＡＣＡＡＡＴＣＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣ
４２．ＧＴＴＴＣＴＴＧＴＣＴＧＡＣＡＣＴＣＧＧＴＴＧＴＡＧＧＴＡＴＴ
４３．ＧＧＡＣＧＡＧＴＴＡＡＣＴＴＣＣＴＴＡＡＴＴＴＣ
４４．ＧＴＴＴＣＴＴＣＧＣＧＧＡＡＣＣＴＧＧＴＴＴＡＡＣＴＴＣ。

【0094】

本発明の別の態様は、以下からなる群から選択される、特定のヒトゲノム遺伝子座を増幅するための１対のプライマーである
１．Ｌ９１７６２（順方向ＧＣＡＧＣＡＧＧＣＣＧＣＧＧＡＧＡＡＧ （ＦＡＭ）；逆方向ＡＧＣＡＧＣＴＧＴＧＣＣＧＧＧＣＣＡＧ）；
２．Ｌ６８３４６（順方向ＣＡＧＣＡＡＣＡＧＣＡＣＣＣＡＧＣＴＴＧ（ＪＯＥ）；逆方向ＣＡＣＡＧＧＣＴＣＡＧＴＣＧＣＧＧＡＴＣ）；
３．Ｌ５０４６８（順方向ＡＧＧＡＡＡＣＣＴＣＡＧＴＡＧＣＡＡＡＡＴＴＧ（ＪＯＥ）；逆方向ＧＣＧＡＧＡＣＴＴＴＡＧＧＴＧＴＧＣＡＴＣ）；
４．Ｌ１４４３２（順方向ＣＧＴＡＧＧＣＴＧＣＧＧＴＧＡＧＣＴＣ（ＦＡＭ）；逆方向ＧＡＴＣＣＡＴＧＣＣＣＧＣＴＧＧＧＡＴＧ）；
５．Ｌ４６４８（順方向ＣＡＧＣＣＴＡＧＡＣＧＴＣＡＡＧＴＴＡＣＡＧ（ＪＯＥ）；逆方向ＡＣＧＡＣＣＴＣＣＧＧＡＴＣＣＡＡＣＴＧ）；
６．Ｌ３９６６４（順方向ＣＣＣＡＧＣＴＧＧＴＴＧＧＡＣＡＴＧＴＴＧ（ＦＡＭ）；逆方向ＣＡＣＴＴＣＣＴＴＣＧＴＧＧＡＣＧＣＣ）；
７．Ｌ３０１３９（順方向ＧＡＧＡＡＧＣＧＧＧＡＧＧＡＴＧＡＧＡＣ（ＦＡＭ）；逆方向ＣＣＧＣＡＴＣＴＣＣＴＣＣＧＴＣＣＴＧ）；
８．Ｌ５５４２９（順方向ＧＣＣＴＴＣＡＧＣＡＧＧＡＡＧＴＣＣＡＣ（ＪＯＥ）；逆方向ＣＣＴＧＴＧＣＣＴＣＡＣＡＣＡＧＡＣＴＣ）；
９．Ｌ６２０８６（順方向ＧＴＧＣＡＴＧＧＴＧＴＣＴＧＧＴＡＣＴＴＣ（ＦＡＭ）；逆方向ＧＡＡＧＣＴＣＴＣＧＴＧＧＡＣＴＡＣＴＴＧ）；
１０．Ｌ７６１３８（順方向ＣＡＧＣＣＴＧＣＴＣＴＴＣＡＣＴＧＣＡＧ（ＪＯＥ）；逆方向ＡＧＡＧＧＣＣＧＡＴＧＡＡＧＣＣＧＴＡＧ）；
１１．Ｌ１５９５２（順方向ＣＴＣＣＣＴＧＡＴＴＴＡＣＧＡＣＡＡＧＴＴＣ（ＦＡＭ）；逆方向ＧＡＣＡＧＴＡＴＧＣＴＧＡＴＧＣＴＴＣＴＴＧ）；
１２．Ｌ３６５９９（順方向ＡＡＧＧＧＣＡＧＡＧＴＴＣＣＧＣＴＧＴＣ（ＦＡＭ）；逆方向ＣＧＧＡＴＧＣＡＧＧＡＧＧＡＴＣＣＴＡＧ）；
１３．Ｌ２６６８８（順方向ＣＧＧＡＣＣＡＧＡＴＴＧＣＴＧＧＴＣＡＣ（ＪＯＥ）；逆方向ＣＧＡＣＣＴＴＧＣＣＡＧＡＴＧＴＴＴＧＡＣ）；
１４．Ｌ８１５２８（順方向ＡＧＣＣＴＣＡＴＣＣＡＣＡＣＴＧＡＣＣＡＧ（ＪＯＥ）；逆方向ＴＣＡＧＡＧＣＴＣＴＣＣＴＡＴＣＴＧＧＡＣ）；
１５．Ｌ３６５５６（順方向ＧＣＣＡＧＧＣＣＧＴＴＧＡＴＧＡＴＧＡＣ（ＪＯＥ）；逆方向ＧＡＡＴＡＴＧＧＡＧＣＣＣＴＧＧＧＣＡＧ）．
１６．ＳＤ１（順方向ＡＡＧＡＧＣＣＣＡＴＣＡＧＧＣＡＧＧＴＣ（ＦＡＭ）；逆方向ＧＴＴＴＣＴＴＧＴＣＧＡＧＣＡＧＣＡＣＧＴＧＧＡＴＧＡＴＧ）；
１７．ＳＤ２（順方向ＣＴＣＣＡＧＡＡＣＴＧＧＡＡＣＴＴＣＣＴＧ（ＦＡＭ）；逆方向ＧＴＴＴＣＴＴＡＡＣＴＴＧＧＡＧＡＣＧＡＣＧＧＣＡＴＣ）；
１８．ＳＤ３（順方向ＴＧＧＡＧＧＡＣＡＡＴＧＣＣＣＴＧＧＴＧ（ＦＡＭ）；逆方向ＧＴＴＴＣＴＴＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＧＣＧＡＣＣＧＴＣＴＣ）；
１９．ＳＤ４（順方向ＣＣＣＴＣＣＧＡＧＴＧＧＣＣＡＧＣＡＧ（ＦＡＭ）；逆方向ＧＴＴＴＣＴＧＡＣＣＡＣＴＧＣＣＧＴＧＧＧＡＡＴＧ）；
２０．ＳＤ５（順方向ＣＴＴＣＴＣＡＧＣＣＡＡＴＧＧＧＡＡＧＡＧ（ＦＡＭ）；逆方向ＡＣＧＴＡＧＡＡＧＧＡＣＣＣＧＡＧＧＡＣ）；
２１．ＳＤ６（順方向ＴＡＣＡＧＡＣＡＡＡＴＣＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣ（ＦＡＭ）；逆方向ＧＴＴＴＣＴＴＧＴＣＴＧＡＣＡＣＴＣＧＧＴＴＧＴＡＧＧＴＡＴＴ）；及び
２２．Ｌ１６２６４（順方向ＧＧＡＣＧＡＧＴＴＡＡＣＴＴＣＣＴＴＡＡＴＴＴＣ（ＦＡＭ）；逆方向ＧＴＴＴＣＴＴＣＧＣＧＧＡＡＣＣＴＧＧＴＴＴＡＡＣＴＴＣ）。

【図面の簡単な説明】

【0095】

【図1】組織を同定するアッセイを示す。（Ａ）アッセイの概略図。（Ｂ）生化学的手順：メチル化遺伝子は、消化中は未変化のままであり、その後、ＰＣＲで効率的に増幅され、強いシグナルを生成する（遺伝子座Ａ）一方で、非メチル化遺伝子座は消化され、その後、ＰＣＲで非効率的に増幅され、弱いシグナルを生成する（遺伝子座Ｂ）。シグナル比（ＳＲ：遺伝子座Ａのｒｆｕ／遺伝子座Ｂのｒｆｕ）は、遺伝子座Ａと遺伝子座Ｂとの間の異なるメチル化度を反映している。（Ｃ）遺伝子座１と遺伝子座２との間シグナル比は、血液、唾液、皮膚、及び精液において異なり、これらの組織の異なるメチル化パターンを反映している。（Ｄ）血液と精液との間のシグナル比（すなわち、シグナル）において観察された差は、異なるＰＣＲ、及び異なる量のインプットＤＮＡ（すなわちノイズ）から取得されたシグナル比において観察された差よりも程度が大きい。

【図2】組織のタイプが異なる組織の同定を示す。８つの試料の電気泳動図（４つの異なる各組織から２つの試料）は、各組織タイプの観察された明確な増幅パターンを示すよう記載されている。

【図3】精液検知及びＤＮＡプロファイリングの組み合わせを示す。（Ａ、Ｂ）同一人物由来の精液（Ａ）及び尿（Ｂ）の試料に対し組み合わせアッセイを行った電気泳動図。試料のＰｒｏｆｉｌｅｒＰｌｕｓによるプロファイルは相同であり、組織源の違いは、２つの精液遺伝子座（矢印）の異なる増幅により示されている。（Ｃ）異なる組織タイプ由来の試料に対し行われた組み合わせアッセイのＦＡＭチャンネルデータ。精液検知遺伝子座（矢印）間のシグナル比は、精液試料で２５．０４であり、その他全ての組織タイプでは０．１未満である。上のパネルには、参考のため未消化ＤＮＡが含まれている。（Ｄ）様々な比率の精液と唾液（異なる個人由来）の混合物に対して行った組み合わせアッセイのＦＡＭチャンネルデータ。シグナル比は、混合物の精液のパーセントに相関している。

【図4】Ｈｈａ１消化の評価を示している。異なる源のＤＮＡ試料に対し、組織同定実験で使用される同じ単一の消化増幅反応を行った。本実験において、遺伝子座のパネルは２つの遺伝子座から成っていた。すなわち、Ｈｈａ１部位が欠落している未消化の制御遺伝子座（Ｌ９８３２８）、及びこれらの組織において非メチル化である消化済み制御遺伝子座（ＳＷ１４）であった。全ての試料は、未消化の制御遺伝子座が存在し、消化済み制御遺伝子座は全く存在しないことを示しており、両遺伝子座の存在を示した未消化試料と対照的に、Ｈｈａ１により完全に消化されたことを示していた。

【図5】加齢試料を示している。２０ヶ月前の血液及び精液のシミから抽出されたＤＮＡ試料に対し、独立型組織同定アッセイを試験した。両試料とも順調に増幅し、それらの新鮮な対応物と類似し、それぞれの源は解析ソフトウェアにより正しく同定された。

【図6】分解された試料のシミュレーションを示している。血液（上部）及び精液（下部）の試料は、ＤＮＡｓｅＩを用いて部分的に消化し、組み合わされた精液検知及びプロファイリングアッセイで解析した。両試料とも得られたのは部分的プロファイルであったが、より小さな組織同定遺伝子座（Ｄ３Ｓ１３５８の上部チャンネルから左にかけて２つの遺伝子座がある）は、期待通りのパターンで順調に増幅し、アルゴリズムにより、これらの試料における精液の有無が正確に同定された。

【図7】表１を示している。

【図8】表２を示している。

【図9】表３を示している。

【図10】表４を示している。

【図11】表５を示している。

【図12】独立型精液検知アッセイを示している。異なる組織タイプ由来の６つのＤＮＡ試料の試料プロットが記載されている。全試料に対し正しい分類（精液対非精液）が行われた。試料毎に最も可能性の低いカテゴリの信頼性が示されている（例えば、「精液」のカテゴリに関しては、非精液のｐ値が示されている）。

【発明を実施するための形態】

【0096】

１．概説
本発明は、遺伝子座特異的プライマーを用いるＤＮＡ源と商業的に利用可能な酵素との区別を可能とする方法及びアッセイに関する。進歩的アッセイの根本的態様は、特定のＤＮＡ源から増幅された少なくとも２つの遺伝子座から生成されるシグナルを比較することであり、それにより、１つの実施形態においては、天然由来であるか又は人工的であるかを示す数的比率が最終的には得られる。本発明のアッセイはまた、例えば、ＤＮＡの生理学的又は病理学的に異なる源を区別するため、及び異なる組織を区別するために使用され得る。

【0097】

アッセイで使用されるシグナル比は、特異的ゲノム遺伝子座におけるメチル化度と相関するが、任意のゲノム遺伝子座における実際のメチル化度は示さない。よって、本発明の仕組みでは、外部ＤＮＡ種及び／又は制御の要件を除き、よって、アッセイの精度を簡素化しかつ向上させる。

【0098】

よって、本明細書に記載の進歩的ＤＮＡ分類アッセイは、高性能、複合的、正確、及び低コストな技術であり、ＤＮＡ試料の分類が求められる任意の場面で適用可能である。よって、進歩的アッセイは、例えば、科学捜査を行う警察による利用、医療産業による診断及び治療目的の利用、保険業界による、遺伝情報差別禁止法（Ｈ．Ｒ．４９３）等、遺伝に関する対差別法に適合する請求であるかどうかを確認するための利用、刑事裁判及び民事裁判及び控訴審において、検察及び弁護人による証拠目的のための利用、及び、農業及び食品産業における、肉、穀物、並びにブドウの木やコーヒー豆の原木等、植物の完全性を確認するための利用等が可能である。本発明は、これらの非排他的だが代表的な用途のリストに限定されない。

【0099】

よって、本明細書で開示される方法の根本原則は、増幅されたゲノム遺伝子座間のシグナル強度の測定であり、増幅された遺伝子座間のシグナル強度の比率を生成するために、その後互いに対して行われるペアワイズ比較ある。例えば、遺伝子座Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤを全て、本明細書に記載の技術に従って増幅すれば、Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤそれぞれのシグナル強度を測定し、記録する。次に、ＡとＢ、ＡとＣ、及びＡとＤのシグナル強度をそれぞれ比較し、Ａ／Ｂ、Ａ／Ｃ、Ａ／Ｄの組み合わせでそれぞれのシグナル強度比を算出する。次に、Ｂ／Ｃ及びＢ／Ｄのシグナル強度比を算出し、以後も同様に続ける。

【0100】

これらの各シグナル強度比の値は、その後、供給源が既知のＤＮＡの、既知の参照シグナル強度比の値と比較する。よって、例えば、供給源がヒトの精液であると判明しているＤＮＡの場合、Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤの図示的遺伝子座のペアワイズ比等、遺伝子座のシグナル強度比についてはすでに知られており、あるいは、試験ＤＮＡ試料の解析時に新たに確立することも容易にできる。よって、ＤＮＡカテゴリは、「精液」であり、及び、それら遺伝子座のシグナル強度比はそれぞれ、試験ＤＮＡ試料の比較対象となり得る参照値である。

【0101】

従って、ＤＮＡ試料由来の遺伝子座Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤの様々なシグナル強度比を確立した後、各比率を、特定の既知のＤＮＡカテゴリの１つ以上の参照値、例えば精液ＤＮＡ比値と比較することができる。特定のＤＮＡカテゴリのシグナル強度比参照値により厳密に近似する、ＤＮＡ試料から取得された任意の遺伝子座組み合わせの比率は、試験されたＤＮＡ試料が、比較時により厳密に近似する又は最も厳密に近似する特定のＤＮＡカテゴリを供給源とする可能性が非常に高いことを意味している。よって、精液由来のＡ／Ｂ遺伝子座のシグナル強度比の値と同じ、又は近似である、Ａ／Ｂ遺伝子座の試験されたＤＮＡ試料から生成されるシグナルの強度比は、試験されたＤＮＡ試料が精液を供給源とする可能性が高いことを示している。多数の異なる遺伝子座において、及び多くの異なる参照カテゴリに対し同じ比較解析を行うことにより、試験されたＤＮＡ試料が特定の生物供給源由来であった可能性、又は特定の生物供給源由来ではなかった可能性が増す。

【0102】

同様に、試料に、唾液と血液、又は、唾液、血液、表皮及び精液等、異なる源由来のＤＮＡの混合物が含まれるかもしれない場合、本明細書で開示する方法を実施することにより、試料内の異なるＤＮＡカテゴリの存在を同定することが可能である。よって、試料に存在する複数の並びに単一のＤＮＡ源の同定は、本明細書で開示する方法及び試薬を用いて達成可能である。

【0103】

従って、本発明の「分類」方法はまた、組織同定アッセイともみなされ得る。１つの実施形態では、以下の段落で説明するように、組織同定アッセイはＤＮＡ試料の最も可能性の高い源組織を決定するために、組織間でメチル化の異なる遺伝子座のパネルを用いる。表１（図７）を参照のこと。アッセイのスキームは、図１Ａに表されている。法医学的試料由来のＤＮＡは、例えば、Ｈｈａ１メチル化感受性制限酵素で消化され、それにより、メチル化されない場合のみ、ＧＣＧＣ配列を認識するとＤＮＡが切断される（但し、メチル化標的は未処理のままである）
その後、組織を同定する遺伝子座のパネルを、蛍光で標識したプライマーを用いて消化されたＤＮＡからＰＣＲにより増幅し、増幅産物の一定分量をキャピラリー電気泳動により分離する。Ｈｈａ１で消化したＤＮＡを伴う状況において、メチル化レベルのより高い遺伝子座はより効率的に増幅される。その理由は、より多くのＤＮＡ分子が消化から保護され、電気泳動で比較的強いシグナルを生成するからである（図１Ｂ、遺伝子座Ａ）。逆に、メチル化度のより低い遺伝子座は、低効率で増幅され、電気泳動で比較的弱いシグナルを生成する（図１Ｂ、遺伝子座Ｂ）。

【0104】

本明細書で開示する自動化シグナル解析ソフトウェアによれば、電気泳動出力の解析が可能であり、組織同定遺伝子座に対応するアンプリコンに（ｒｆｕで）高さを割り当てる。よって、単一の遺伝子座の高さは、そのメチル化度と相関する。そうすると、上記の一般的方法で、共増幅遺された遺伝子座間のメチル化度比率を算出することができる。遺伝子座のペア毎に、第１遺伝子座と第２遺伝子座の高さの比率としてシグナル比を算出し、この比率を、対応する遺伝子座のメチル化度間の比率に反映させる。

【0105】

その後、算出された全てのシグナル比を単一の数値と合わせる。例えば、１５の遺伝子座のパネルから１０５ペアワイズ比を算出することができる（例えば、遺伝子座１と２、遺伝子座１と３として等）。その後、それらを既知の組織源の試料のデータセットから取得された参照値のデータベースと比較することができる。組織同定アルゴリズムは、可能性のある組織源毎に尤度スコアを算出し、ＤＮＡ試料が組織由来であるという可能性を反映し、また、アルゴリズムのアウトプットが組織である可能性が最も高いことを反映する。これらの比率及び比較から導き出す尤度及び確率スコアのアルゴリズム及び特定の計算については、本明細書のいずれかの箇所で開示する。

【0106】

実施例１で示すように、例えば、組織同定アッセイは５０の試料に対して行われた。血液試料が１４、唾液試料が１４、精液試料が１１、及び皮膚表皮試料が１１で、アンプリコンの大きさが６６〜１５０ｂｐｓの範囲である１５の組織同定遺伝子座のパネルを用いた。図２は、これらの８つの試料、すなわち、各組織タイプから２つずつの電気泳動図を示している。各組織タイプは、明確なメチル化プロファイルを有していた。例えば、０．０４〜０．５３の範囲の精液試料中のＬ９１７６２／Ｌ６８３４６の遺伝子座比率は、その他の全ての組織試料（２．１５〜１８．２８；図８の表２を参照のこと）よりも高かった。よって、Ｌ９１７６２／Ｌ６８３４６の比率の低いのは、精液試料の特性であることが判明した。しかし、Ｌ７６１３８／Ｌ２６６８８の遺伝子座比率は、血液及び唾液において低く（０．０８〜１．５４）、精液及び皮膚表皮において高かった（２．０４〜１９．５６；図８の表２を参照のこと）。よって、Ｌ７６１３８／Ｌ２６６８８の高い比率に付随したＬ９１７６２／Ｌ６８３４６の高い比率は、皮膚表皮試料の特性であった。

【0107】

本明細書で開示される組織同定アルゴリズムは、５０の全試料の真の組織源を正しく同定した。さらに、組織同定遺伝子座のサブセットを用いたデータのさらなる解析により、１５の遺伝子座のフルセットには重複があり、１５の遺伝子座のうちわずか７つの遺伝子座を用いて（Ｌ９１７６２、Ｌ６８３４６、Ｌ５０４６８、Ｌ１４４３２、Ｌ３０１３９、Ｌ１５９５２、及びＬ２６６８８）１００％同定を達成することが判明した。

【0108】

従って、例証的な本実施例は、本発明の一般的な進歩的態様を裏付ける。すなわち、シグナル強度比の比較解析により、厳密かつ正確なＤＮＡ試料の同定及び分類を提供する。

【0109】

さらに、本発明の別の重要な態様は、特定の対象ＤＮＡのプロファイルリング以上のことを行うよう、既存の商用ＤＮＡプロファイリングキットの有益性を容易に補充及び拡大し得ることである。本明細書で開示する進歩的アッセイを組み合わせ、例えば、下記に詳細を記すシグナル比アッセイをＰｒｏｍｅｇａ社のＰｏｗｅｒＰｌｅｘ（登録商標）１６キットと組み合わせることで、一個人のＤＮＡ組成物をプロファイリングするだけでなく、プロファイルされたＤＮＡが天然源由来か又は人工的に合成されたものであるかを判断することも可能となる。別の実施形態では、ＤＮＡプロファイリングをＤＮＡ分類と組み合わせることで、ＤＮＡのプロファイリングとＤＮＡ試料の組織源の判断の両方が可能となる。

【0110】

例えば、本明細書に記載の１つのアッセイは、例えばＰｏｗｅｒＰｌｅｘ１６キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）で、ＤＮＡ試料プルに対し従来のプロファイリングを行うことと、ＤＮＡを天然由来か人工合成かに分類することもできる。例えば、以下の実施例６を参照のこと。

【0111】

本明細書に開示するように、分類とプロファイリングの組み合わせがいかに作用するのかを例証するという目的に限定し、ＤＮＡの２つの試料を解析する。すなわち、（１）対象Ａの血液から抽出された天然ＤＮＡ試料、及び（２）対象Ａの実在のＤＮＡをテンプレートとして、商用キット用いて、その少量からｉｎ ｖｉｔｒｏで複数の置換増幅により合成した人工的ＤＮＡ試料である。

【0112】

さらに、本例証により、本発明の方法が既存の任意の方法よりもはるかに優れていることが示される。その理由は、従来のプロファイリングキットでは、天然由来ＤＮＡも人工的ＤＮＡも共に対象Ａから採取したものである故に互いに同一であると同定していたが、本発明では、人工的ＤＮＡ試料と天然ＤＮＡ試料を区別することができるからである。従って、プロファイリングキットにより両試料の同一性が同定されるという事実にもかかわらず、本発明の進歩的シグナル強度比解析により、両試料を容易に分別し、一方を人工的ＤＮＡ由来とし、他方を自然なＤＮＡ由来であるとプロファイリングする。

【0113】

さらに説明するために、最初に２つの試料をＰｏｗｅｒＰｌｅｘ１６でプロファイリングし、ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒＩＤ−Ｘ等の従来のプロファイリングソフトウェアを用いて解析した。本手順のスキームを簡単に記述すると、（１）ＰｏｗｅｒＰｌｅｘ１６プライマーミックスを用いて、ＤＮＡ試料に対し複合的ＰＣＲを行い、（２）キャピラリー電気泳動装置で増幅産物を分離し、その後（３）アウトプットデータを、例えば、ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒＩＤ−Ｘソフトウェアで解析する。本アッセイの最終産物が各試料のプロファイルとなる。２つの試料のプロファイルは同一である。図９Ａ〜Ｂを参照のこと。

【0114】

さらに、ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒＩＤ−Ｘソフトウェアは、両試料が、変異を有しない、単一の供給源（すなわち、同一人物由来である）のプロファイルであると判断した。これは、人工的ＤＮＡ由来のプロファイルが、天然ＤＮＡ由来のプロファイルと同一であり得ることを示している。Ｄ．Ｆｒｕｍｋｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｒｅｎｓｉｃ ＤＮＡ ｓａｍｐｌｅｓ，Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ｓｃｉ．Ｉｎｔ．Ｇｅｎｅｔ．（２００９），ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｆｓｉｇｅｎ．２００９．０６．００９を参照のこと。これは、本明細書に参照により組み込まれる。

【0115】

その後また、ＤＮＡの両試料を、以下のスキームに基づき、プロファイリングと分類アッセイの組み合わせにより解析した。すなわち、ＤＮＡ試料をＨｈａ１で消化させ、ＰｏｗｅｒＰｌｅｘ１６プライマーミックスを用いて、Ｈｙｐｏ２３等の追加遺伝子座を増幅するためのプライマーを追加し、複合的ＰＣＲを行った。キャピラリー電気泳動装置で増幅産物を分離し、本明細書に開示のソフトウェアアルゴリズム等、キャピラリー解析用ソフトウェアでアウトプットデータを解析した。

【0116】

本アッセイの最終産物が各試料のプロファイルとなり、分類が割り当てられる。図９Ｃ及びＤに見られるように、天然のＤＮＡは、「天然」と割り当てられ、一方、人工的試料は「人工的」と割り当てられた。

【0117】

この特定の実施例においては、カテゴリの割り当ては３つのパラメーターの解析により行われた。すなわち、（１）ＳＲ１（ＴＯＰＸ／Ｄ８Ｓ１１７９のシグナル比）、（２）ＳＲ２（Ｄ３Ｓ１３５８／Ｈｙｐｏ２３のシグナル比）、及び（３）ＲＲ（ＯＣＡ２／Ｄ３Ｓ１３５８の代表的な比率）である。

【0118】

これらのパラメーターの閾値は、表６に記載されている。

【0119】

【表2】

【0120】

これらのパラメーターの観察された値、及び割り当てられたカテゴリは、表７に記載されている（天然ＤＮＡの閾値を超える値には色付けをした）

【0121】

【表3】

【0122】

カテゴリの割り当ては、以下のルールに従って行われた。

【0123】

観察されたパラメーター値が全て、天然ＤＮＡの各閾値を超えている場合、「天然」カテゴリに割り当て、そうでなければ「人工的」カテゴリに割り当てる。よって、本発明の進歩的シグナル強度比解析により、例えば、天然源対人工的源由来等、ＤＮＡの源を容易に同定することができ、ＤＮＡプロファイリング技術と合わせて、ゲノム試料の同定のための確実かつ洗練された方法を提供する。

【0124】

本明細書に記載される特定の組成物、方法、又は実施形態は、本明細書に開示される発明を例証することのみを意図している。当業者であれば、本明細書の教示を元に、これらの組成物、方法、又は実施形態の変形が存在することは容易に明らかとなり、よって、それらの変形も、本明細書で開示する本発明の一部として組み入れられることを意図している。

【0125】

本発明の実施において、分子生物分野における従来の多数の技術及びＤＮＡ組換えが使用される。これらの技術については、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ.Ｉ−ＩＩＩ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｅｄ．(１９９７)；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄ.(Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９)； ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｓ.Ｉ ａｎｄ ＩＩ，Ｇｌｏｖｅｒ，Ｅｄ.(１９８５)；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｇａｉｔ，Ｅｄ.(１９８４)；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｈａｍｅｓ ＆ Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ.（１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，Ｈａｍｅｓ ＆ Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ.（１９８４）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，(Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８４)；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ，Ｍｉｌｌｅｒ ＆ Ｃａｌｏｓ，Ｅｄｓ.（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８７）；及びＭｅｔｈ.Ｅｎｚｙｍｏｌ．，Ｖｏｌｓ.１５４ ａｎｄ １５５，Ｗｕ ＆ Ｇｒｏｓｓｍａｎ，ａｎｄ Ｗｕ，Ｅｄｓ.等でそれぞれ説明されている。

【0126】

２．定義
本発明の技術は、本明細書を通じて記載されるいくつかの定義を用いて本明細書に記載される。定義されないものに関しては、本明細書に記載される技術及び科学用語は全て、本発明の属する分野の当業者により一般的に理解されているのと同じ意味を概して有するものとする。本明細書で使用されているように、特に言及されない限りにおいて、単数形の「ａ」「ａｎ」及び「ｔｈｅ」には、複数の言及が含まれる。よって、例えば、「１つの核酸(a nucleic acid)」は、「１つ以上の核酸」について述べている。

【0127】

本明細書で使用される「アレル(allele)」という用語は、ＤＮＡのセグメント、すなわち、同じ遺伝子座を占めるＤＮＡ配列の２つ以上の代替形態のうちの１つと関連する遺伝的変形であることを意図している。

【0128】

本明細書で使用される「人工的ＤＮＡ」又は「人工的に合成されたＤＮＡ」又は「人工的核酸」という用語は、種々のｉｎ ｖｉｔｒｏ手法で合成される核酸のことを指している。本明細書には、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＤＮＡを合成するための異なる方法の特性について開示される。ｉｎ ｖｉｔｒｏで生成される核酸には、以下が含まれるがそれらに限定されない。

【0129】

１．化学的に合成されたオリゴヌクレオチド
２．標的配列のＰＣＲ増幅の産物
３．標的の循環配列のローリングサークル増幅（ＲＣＡ）の産物
４．分子クローンの産物（例えば、大腸菌でクローン化されたプラスミド）
５．１〜４の任意の方法により、又はそれらの組み合わせにより生成された他のＤＮＡ断片から集めたＤＮＡ断片。係る集合体は、以下の任意の方法（又はそれらの組み合わせ）により達成される。すなわち、アニーリング、連結、重合である。集合化の方法にはまた、ＤＮＡ分子の切断のステップ（例えば、制限エンドヌクレアーゼ、機械的せん断等）も含まれる
６．ＰＣＲによるゲノム全体の増幅（ＷＧＡ）、及び／又は、プライマー伸長プレ増幅（ＰＥＰ−ＰＣＲ）、縮重オリゴヌクレオチドをプライマとするＰＣＲ（ＤＯＰ−ＰＣＲ）、Ｔ７ベースのＤＮＡ直線増幅（ＴＬＡＤ）、アダプター連結ＰＣＲを含む、連結仲介ＰＣＲ（ＬＭＲ）ベースのＷＧＡ法による産物
７．複数の置換増幅（ＭＤＡ）、及び制限並びに補助循環式ローリングサークル増幅（ＲＣＡ−ＲＣＡ）によるＷＧＡの産物。Ｒｅｐｌｉ−Ｇ（Ｑｉｇｅｎ社）及びＧｅｎｏｍｉＰｈｉ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）の商用キットが本方法を採用している
８．１〜７の任意の方法による産物の混合物
９．合成（例えば、Ｓｓｓｌメチラーゼ）後に、全産物又は一部産物がｉｎ ｖｉｔｒｏでメチル化される１〜８の任意の方法による産物
１０．天然ＤＮＡと混合される、１〜８の任意の方法による産物
１１．天然ＤＮＡと混合される、９の方法による産物。

【0130】

本明細書で使用される「生物試料」又は「試験試料」は、対象から抽出される、又は取得される任意の生物試料を指しているが、これに限定されない。試料には、ＤＮＡ又はＲＮＡ等の核酸が含まれてもよい。ある実施形態では、試料は対象から直接回収するのではなく、例えば、犯罪現場又は性犯罪の被害者等、環境から回収される。係る試料の実施例には、体液、組織、細胞試料、臓器、バイオプシー等が含まれるが、これに限定されない。最適な試料には、血液、血漿、唾液、尿、精液、髪の毛等が含まれるが、これに限定されない。生物試料にはまた、血液の滴、乾燥した血痕、乾燥した唾液痕、乾燥した下着のシミ（例えば、下着、パッド、タンポン、おむつに残されたシミ）、衣服、デンタルフロス、耳ワックス、電気カミソリに残された髭、ガム、髪の毛、舌で舐めた封筒、爪、パラフィン包理組織、死体組織、カミソリ、歯、歯ブラシ、つまようじ、乾燥したへその緒が含まれる。ゲノムＤＮＡは、当業者に既知の方法により、係る試料から抽出され得る。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９に記載のプロトコルを使用して）。

【0131】

本明細書で使用される「キャピラリー電気泳動ヒストグラム」という用語は、蛍光プライマーでゲノム遺伝子座から増幅したＰＣＲ産物のキャピラリー電気泳動から取得されるヒストグラムを指している。

【0132】

本明細書で使用される「メチル化」という用語は、血液、唾液、精液、皮膚表皮、鼻汁、口腔細胞、髪の毛、切り取った爪、月経性分泌物、膣細胞、尿、及び糞便等の組織の細胞のＤＮＡにおいて、少なくとも８０％のレベルでメチル化されている（すなわち、メチル化されたＤＮＡ分子が少なくとも８０％である）という意味である。

【0133】

本明細書で使用される「部分的にメチル化されている」という用語は、血液、唾液、精液、皮膚表皮、鼻汁、口腔細胞、髪の毛、切り取った爪、月経性分泌物、膣細胞、尿、及び糞便等の組織の細胞のＤＮＡにおいて、少なくとも２０〜８０％の間のレベルでメチル化されている（すなわち、メチル化されたＤＮＡ分子が２０〜８０％の間にある）という意味である。

【0134】

本明細書で使用される「非メチル化」という用語は、血液、唾液、精液、皮膚表皮、鼻汁、口腔細胞、髪の毛、切り取った爪、月経性分泌物、膣細胞、尿、骨及び糞便等の組織の細胞のＤＮＡにおいて、２０％未満のレベルでメチル化されている（すなわち、メチル化されているＤＮＡ分子が２０％未満である）という意味である。本明細書で提供される方法により、血液、唾液、精液、皮膚表皮、鼻汁、口腔細胞、髪の毛、切り取った爪、月経性分泌物、膣細胞、尿、骨及び糞便等の様々な組織及び細胞タイプにおける核酸遺伝子座のメチル化形態と非メチル化形態を区別されることが示された。

【0135】

「判断する」「測定する」「評価する(assessing)」「アッセイする」及び「評価する(evaluating)」は、量的又は質的測定の任意の形式を指すために、また特徴、特性、又は特長の存在の有無を判断することを含むために、同じ意味を表す用語として使用される。「存在を評価する」には、存在するか否かの判断に加えて、存在するものの量の判断も含まれている。

【0136】

本明細書で使用される「法医学」又は「法科学」という用語は、法制度の下、捜査対象となった人物への容疑に対し答えを出すための手法の広範な応用を指している。例えば、犯行現場に残された証拠とＤＮＡが合致するかもしれない容疑者の特定、冤罪被害者の解放、犯罪及び大災害の犠牲者の特定、又は親子及びその他の家族との関係の鑑定等である。

【0137】

「遺伝子座（ｌｏｃｕｓ）」（複数形：ｌｏｃｉ）という用語は、遺伝子又はその他の遺伝要素の染色体上の位置を指している。遺伝子座はまた、場所にあるＤＮＡをも意味する。所与の遺伝子座におけるＤＮＡ配列の異型はアレルと称される。遺伝子座のアレルは、相同の染色体上の同一部位に存在する。制限遺伝子座は、アッセイで使用される制限酵素の認識配列を有する遺伝子座である。本明細書で使用される消化された制御遺伝子座という用語は、可能性のある全ＤＮＡカテゴリにおいて非メチル化であると判明しているゲノム遺伝子座のことを指している。本明細書で使用される未消化の制御遺伝子座という用語は、可能性のある全ＤＮＡカテゴリにおいてメチル化されていると判明しているか、又は、アッセイで使用されるエンドヌクレアーゼの認識配列が欠落しているゲノム遺伝子座のいずれかを指している。

【0138】

本明細書で使用される「天然ＤＮＡ」又は「天然核酸」は、対象の細胞から直接抽出され、修飾も増殖もされていない核酸のことを指しているが、これに限定されない。

【0139】

本明細書で使用される「核酸」は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、切断された核酸、及び、ミトコンドリア等の細胞内の細胞小器官から取得された核酸を指しているが、これに限定されない。さらに、核酸には、合成された核酸又はｉｎ ｖｉｔｒｏで転写された産物も含まれるが、これに限定されない。

【0140】

本明細書で使用される「核酸ベースの解析手順」という用語は、ＤＮＡプロファイリング等、核酸の解析に基づく任意の同定手順のことを指している。

【0141】

本明細書で使用される「ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）スタッター（ｓｔｕｔｔｅｒ）」という用語は、主要ＰＣＲ産物と共に取得されるＰＣＲ副産物のことを指している。これらの「スタッター（ｓｔｕｔｔｅｒ）」副産物は、ＳＴＲ配列のＰＣＲ増幅の間に生成される、複数の反復ユニットにより、通常はより短い。これらの人工産物が形成されるメカニズムは理解できるが、ＰＣＲ技術の本質的限界を示しており、よって、これらの偽性産物を除去するための有効法はいまだ発見されていない（Ｏｌｅｊｎｉｃｚａｋ Ｍ，Ｋｒｚｙｚｏｓｉａｋ ＷＪ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．２００６ Ｏｃｔ；２７（１９）：３７２４−３４）。本明細書で使用される「−１スタッター」という用語は、その関連するアレルよりも小さな、１つの反復ユニットであるスタッター副産物を指している。同様に、「＋１スタッター」は、その関連するアレルよりも大きい、１つの反復ユニットであるスタッター副産物を指している。「−１スタッター断片」という用語は、真のアレルピークの高さ（又は領域）で除算された−１スタッターピークの高さ（又は領域）を指している。同様に、「＋１スタッター断片」は、真のアレルピークの高さ（又は領域）で除算された＋１スタッターピークの高さ（又は領域）を指している。

【0142】

「制限並びに補助循環式ローリングサークル増幅（ＲＣＡ−ＲＣＡ）」という用語は、ほぼ完全にゲノムを網羅しつつ、分解かつ増幅されたゲノム間のアレル的違いをも保持する、ゲノム全体の増殖手順を指している。ＲＣＡ−ＲＣＡは、ローリングサークル増幅に受け入れられるゲノム配列を生成するために、制限消化及びゲノム全体の環状化を利用する。

【0143】

本明細書で使用されている「ＳＴＲプライマー」という用語は、ＰＣＲによる生物試料由来の標的核酸配列を増幅するために使用され得る、購入可能な、又はラボで生成された任意のヌクレオチドプライマーのことを指している。約１５０万個の非ＣＯＤＩＳ ＳＴＲ遺伝子座が存在する。上記の非制限的例として、以下のウェブサイトに記載されており(ｗｗｗ．ｃｓｔｌ．ｎｉｓｔ．ｇｏｖ／ｂｉｏｔｅｃｈ／ｓｔｒｂａｓｅ／ｓｔｒ＿ｒｅｆ.ｈｔｍ)、現在、化学、法医学及びそれ以外の分野で用いられているＳＴＲには３１５６の参照が含まれている。公開されているプライマー配列に加えて、ＳＴＲプライマーは、何百ものＳＴＲ遺伝子座の増幅のための商用キット（例えば、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ Ｌｉｎｋａｇｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｓｅｔ−ＭＤ１０（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社））、及び何千ものＳＮＰ遺伝子座の増幅のための商用キット（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＢｅａｄＡｒｒａｙ ｌｉｎｋａｇｅ ｍａｐｐｉｎｇ ｐａｎｅｌ）から取得してもよい。本明細書で使用されている「ＣＯＤＩＳ ＳＴＲプライマー」という用語は、ＦＢＩの「Ｃｏｍｂｉｎｅｄ ＤＮＡ Ｉｎｄｅｘ Ｓｙｓｔｅｍ」により指定された１３のコアＳＴＲ遺伝子座のうち任意のコアＳＴＲ遺伝子座、特に、ＴＨ０１，ＴＰＯＸ，ＣＳＦ１ＰＯ，ＶＷＡ，ＦＧＡ，Ｄ３Ｓ１３５８，Ｄ５Ｓ８１８，Ｄ７Ｓ８２０，Ｄ１３Ｓ３１７，Ｄ１６Ｓ５３９，Ｄ８Ｓ１１７９，Ｄ１８Ｓ５１，並びにＤ２１Ｓ１１、及びアメロゲニン遺伝子座の反復配列を増幅するよう指定されているＳＴＲプライマーのことを指している。

【0144】

本明細書で使用されている「シグナル比」という用語は、２つの遺伝子座の増幅から得られるシグナルの強度間の比率を指している。

【0145】

３．天然ＤＮＡ試料と人工ＤＮＡ試料とを区別する方法
１つの態様では、本発明は、天然ＤＮＡ試料と人工ＤＮＡ試料とを区別する方法を提供する。本発明の一般的スキームは以下の通りである。本方法では、インプットとしてＤＮＡ試料を受理する。ＤＮＡに対し、１つ以上の生化学的ステップを含む手順を施し、その後シグナル検知を行う。手順の最後のステップにおいて、ＤＮＡが天然か人工的かを判断するために、シグナルを解析する。別の態様では、本発明は、ＤＮＡプロファイルが天然ＤＮＡのものであることを認証するための方法を提供する。本発明の一般的スキームは以下の通りである。本方法は、インプットとして、プロファイリング（例えば、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｌｅｒで）を経たＤＮＡ試料を受理する。ＤＮＡ試料に対し、１つ以上の生化学ステップを含む認証手順を施し、その後シグナル検知を行う。手順の最後のステップで、ＤＮＡ試料のプロファイリングと認証の双方から得たデータを解析する。シグナル解析により、ＤＮＡ試料から得たプロファイルが、天然（ｉｎ ｖｉｖｏ）ＤＮＡを表しているか、又は人工的（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）ＤＮＡを表しているかどうかを判断する。

【0146】

様々な態様において、本発明の方法は、ＤＮＡプロファイルが天然ＤＮＡを表していることを認証することに関する。本方法は、嫌疑のかかったＤＮＡ試料、例えば、犯罪現場で発見された血液試料から採取されたＤＮＡに利用される。核酸（例えばＤＮＡ）の生物試料からの単離は、当業者に周知の様々な方法で達成可能である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，（１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）。天然ＤＮＡと人工的ＤＮＡの区別、又はＤＮＡプロファイルが天然ＤＮＡを表しているかどうかの判断は、以下のセクションで記載されるのを含む、様々な戦略を用いて達成され得る。

【0147】

４．メチル化
ヒトゲノムのメチル化は、５−メチルシトシンの形で起こり、ＣＧ配列の一部であるシトシン残基に限定されている（他の配列の一部であるシトシン残基はメチル化されない）。

【0148】

ヒトゲノムのＣＧジヌクレオチドは一部メチル化されるが、メチル化されない部分もある。さらに、メチル化は、細胞及び組織特異的であり、その結果、特定のＣＧジヌクレオチドは、ある細胞においてメチル化するが、同時に異なる細胞においては非メチル化であり得、又は、ある組織においてメチル化するが、同時に異なる組織においては非メチル化であり得る。特定の遺伝子座におけるメチル化は細胞により異なるため、複数の細胞（例えば、法医学試料）から抽出されたＤＮＡのメチル化状態を解析する時、シグナルが混合し、様々な比率でメチル化シグナル及び非メチル化シグナルの双方が示される可能性がある。本発明者は、あるゲノム領域においては、全てのＣＧ遺伝子座が恒常的にメチル化することを発見した。これらの領域は表１及び本明細書で「配列」と題したセクションに提供されている。本発明者はまた、あるゲノム領域では、全てのＣＧ遺伝子座は部分的にメチル化することを発見した。これらの領域は表１及び本明細書で「配列」と題したセクションに提供されている。本発明者はまた。ある領域では、全てのＣＧ遺伝子座が恒常的に非メチル化であることを発見した。これらの領域は表１及び本明細書で「配列」と題したセクションに提供されている。本発明者はまた、恒常的にメチル化するＣＧ遺伝子座、部分的にメチル化するＣＧ遺伝子座、及び恒常的に非メチル化であるＣＧ遺伝子座を含む、隣接するゲノム領域を発見した。これらの領域は表１及び本明細書で「配列」と題したセクションに提供されている。これらは、ゲノム遺伝子座のメチル化度を判断するための幾つかの異なる方法である。通常使用される方法の実施例は、バイサルファイトシーケンシング法、メチル化特異的ＰＣＲ法、及びメチル化感受性エンドヌクレアーゼ消化である。さらに、ＤＮＡメチル化データの取得又は蓄積のために、様々なデータ源を利用でき、例えばＭｅｔＤＢ(ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ.ｍｅｔｈｄｂ.ｎｅｔ)等により、これらのデータを容易に一般公開できる。

【0149】

核酸のメチル化度を判断するための代表的な方法には以下が含まれるが、これに限定されない。

【0150】

バイサルファイトシーケンシング法：バイサルファイトシーケンシング法は、メチル化のパターンを判断するためのバイサルファイト処理されたＤＮＡのシーケンシングである。本方法は、ソジウムバイサルファイトでＤＮＡを処理すると、非メチル化シトシン残基がウラシルに変換するが、メチル化シトシン残基には影響が及ばないという事実に基づいている。ソジウムバイサルファイトによる変換の後、ＤＮＡの特定の領域がＰＣＲにより増幅され、ＰＣＲ産物が配列する。ポリメラーゼ連鎖反応において、ウラシル残基は、あたかもチミン残基であるかのように増幅されるため、オリジナルＤＮＡの非メチル化シトシン残基は、ＰＣＲ産物配列においてチミン残基として発現し、オリジナルＤＮＡのメチル化シトシン残基は、ＰＣＲ産物配列においてシトシン残基として発現する。

【0151】

５．メチル化特異的ＰＣＲ
メチル化特異的ＰＣＲは、重亜硫酸塩配列決定法と同じように、重亜硫酸塩処理したＤＮＡ上で実施されるが、所望のゲノム領域を配列する必要がないメチル化解析の方法である。代わりに、重亜硫酸塩処理したＤＮＡ中の選択領域が、同一のゲノム標的にアニールするよう設計された２セットのプライマーを使用したＰＣＲによって増幅される。プライマー対は、未変換の５−メチルシトシンのみを補完する配列を含むことにより「メチル化特異的」であるよう、また逆に、メチル化されていないシトシンから転換されたチミンを補完して「非メチル化特異的」であるよう設計される。メチル化は、増幅達成における異なるプライマー対の相対的効率により決定される。

【0152】

本発明との関係において、メチル化特異的ＰＣＲが、ＰＣＲによって増幅されたゲノム領域全体ではなく、プライマー配列中のＣＧジヌクレオチドのみのメチル化レベルを決定するということを理解されるべきである。従って、増幅配列中には存在するが、プライマー配列中には存在しないＣＧジヌクレオチドは、ＣＧ遺伝子座の一部ではない。

【0153】

６．メチル化感受性エンドヌクレアーゼ消化
メチル化感受性エンドヌクレアーゼによるＤＮＡの消化は、重亜硫酸塩転換を実施する必要なく、ゲノムＤＮＡに直接応用し得るメチル化解析の方法である。この方法は、メチル化感受性エンドヌクレアーゼが、メチル化されたＤＮＡを未変化のまま保ちつつ、メチル化されていないＤＮＡのみを消化するという事実に基づいている。消化の後、メチル化レベル、ゲル電気泳動、及び特定の遺伝子座のＰＣＲ増幅を含む、多様な方法によってＤＮＡのメチル化レベルを解析し得る。

【0154】

メチル化感受性エンドヌクレアーゼ消化に基づく方法において、各ＣＧ遺伝子座は、方法に使用されたメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼの認識配列の一部である、１又は複数のＣＧジヌクレオチドからなる。増幅されたゲノム領域中に存在するが、エンドヌクレアーゼの認識配列中には存在しないＣＧジヌクレオチドは、ＣＧ遺伝子座の一部ではない。

【0155】

一実施形態において、検知された１又はつ以上のＣＧ遺伝子座は、天然ＤＮＡにおいて部分的にメチル化されるが、人工ＤＮＡにおいてはメチル化されないだろう。部分的メチル化は、調査されている位置において、ＴとＣの混合物中に起こることが期待されるだろう。ハイブリダイゼーションは、ヘテロ接合性のＳＮＰ検知と同様に、Ｔ特異的プローブ／プライマー、及びＣ特異的プローブ／プライマーの双方に観測されるだろう。相対量のハイブリダイゼーションを使用して、メチル化の相対量を決定してもよい。あるいは、ＣとＴ双方が、重亜硫酸塩配列決定法によって測定されるだろう。あるいは、メチル化された、又は部分的にメチル化された増幅産物に対応する蛍光シグナルを、検知することもできる。

【0156】

７．本シグナル比アッセイの概要
上述のとおり、本発明の１つの特定のアッセイは、制限消化されたＤＮＡにポリメラーゼ連鎖反応を実施することで生成された、一組の遺伝子座特異的な増幅産物からのシグナル強度の定量的比較に関与する。図１Ａ、Ｂ参照。強度の数的比率は、例えばＤＮＡ試料が精液又は非精液組織から採取されたかどうかなど、鋳型ＤＮＡのカテゴリに対応する。例えば、一実施形態において、遺伝子座１及び遺伝子座２は、蛍光標識したプライマーを使用して増幅し、電気泳動により分離することができ、シグナルの強度は、遺伝子座に対応するピークの相対蛍光単位（ｒｆｕ）である。図１Ｂ、Ｃ参照。シグナルの強度は、ソースＤＮＡ鋳型から採取した遺伝子座１及び遺伝子座２の増幅の成功度に対応する。２つの増幅産物間のｒｆｕを比較することにより、増幅産物量の比率を反映する比率である、シグナル比を算出することができる。

【0157】

しかしさらに、本アッセイの１つの態様は、多様なＤＮＡカテゴリからの、期待されるシグナル比の前決定を含む。従って、解析に付される鋳型ＤＮＡは、定量型ＰＣＲ増幅プロトコルに繰り返し付す前に、まずメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼで消化される。もし、多様なＤＮＡカテゴリにおける２つの遺伝子座ペア中の制限認識配列部位でのメチル化レベルが既知であれば、当業者は、それぞれのカテゴリの遺伝子座ペアの増幅産物の期待されるシグナル比を予測し得る。あるいは、メチル化レベルが未知であっても、既知のカテゴリの試料にアッセイを実施することにより、当業者は経験的に、多様なＤＮＡカテゴリにおけるゲノム遺伝子座ペア間のシグナル比を決定し得る。

【0158】

この前提に基づき、本発明のアッセイは、メチル化感受性及び／又はメチル化依存性酵素でＤＮＡ試料を消化すること、消化されたＤＮＡにＰＣＲ増幅反応を実施する事、及び遺伝子座特異的な増幅産物から得たシグナルの強度を決定する事を含む。前述のとおり、シグナルの強度は、蛍光ＰＣＲを使用することにより、定量化又は測定することができる。ＤＮＡ試料のカテゴリ決定は、測定されたシグナル比を既知のカテゴリのＤＮＡ試料から得た参照比率と比較すること、及びどのカテゴリが測定された比率に最もよく対応するかを決定することにより実施される。

【0159】

この特定のシグナル比アッセイは、メチル化の絶対分率、又は選択された遺伝子座のレベルの測定値を、同定又は取得することに依存しない。さらに、この特定のシグナル比アッセイは、使用されたプライマー対の効率に依存せず、プライマー対の両方が同様の効率を有することを必要とせず、鋳型ＤＮＡの入力量に依存せず、特定のサーモサイクラー機器及び反応条件に依存しない。より適切には、前記アッセイは、異なる遺伝子座におけるメチル化レベルの比率に対応する、２つのシグナル間の比率を決定する。このようにして、試料中の出発ＤＮＡ材料の量又は濃度は、解析には無関係であり、出力結果を歪めるものではない。すなわち、ＰＣＲにどれだけのＤＮＡが鋳型として使用されたかにかかわらず、またサーモサイクラー上で実施する増幅サイクルの数にかかわらず、第１遺伝子座と第２遺伝子座間のシグナルレベルの比率は一定となる。例えば、遺伝子座１と２間のシグナル比１０は、入力ＤＮＡが、０．９及び０．０９（遺伝子座１においてメチル化９０％、及び２において９％）のメチル化レベルを示しても、又は０．５及び０．０５（遺伝子座１でメチル化５０％、及び２で５％）のメチル化レベルを示しても、同一のままとなる。別の実施例においては、遺伝子座１と２の間のシグナル比１０は、反応で使用されたＤＮＡ鋳型の量にかかわらず、同一のままとなる。

【0160】

本発明のアッセイが、いかなるゲノム遺伝子座でのメチル化レベルの決定にも依存せず、またいかなる外部制御も必要としないという事実により、アッセイは、より正確で、経費効率が良く、そして少量のＤＮＡ試料にも適用可能となり得る。

【0161】

法医学的組織同定との関係において、本発明のアッセイは、実施されている特定の組織同定の課題に関わらず同一な（パネル特異的なプライマーの使用を除く）、標準化された方法であり、標準的な法医学的方法及び機器のみを必要とし、従ってアッセイの自動化や、法医学研究施設への容易な統合が可能となる。

【0162】

さらに、本発明の構成は、組織同定とＤＮＡ型鑑定を単一のアッセイに複合することを可能にする。

【0163】

本発明のアッセイが、消化及び増幅を同一の反応で実施するという事実は、複雑性（必要とされるチューブ及びアッセイのピペット工程の数）を最小化し、それによって混入及び／エラーのリスクを最小化する。

【0164】

従って本発明のアッセイは、一例としては、天然ＤＮＡと、ＰＣＲ、化学的合成、又は多置換増幅（ＭＤＡ）などによってｉｎ ｖｉｔｒｏで合成された人工ＤＮＡを区別するために使用し得る数的比率の形で、有用な生学的マーカーを提供する。この例証的なアッセイのより具体的な詳細を以下に記す。

【0165】

８．遺伝子座特異的増幅のためのプライマー特性
従って、本発明の１つの態様は、例えば、遺伝子座＃１対遺伝子座＃２；遺伝子座＃１対遺伝子座＃３；遺伝子座＃１対遺伝子座＃４；遺伝子座＃２対遺伝子座＃３、遺伝子座＃２対遺伝子座＃４、などの連続した遺伝子座ペア間の比率を算出するために、蛍光ＰＣＲによって生成された複数のＤＮＡ遺伝子座増幅産物の蛍光強度が互いに比較される「シグナル比」を得ることである。天然に対する人工の性質のＤＮＡ試料を検査するためにこの技術を使用する場合、シグナル比増幅反応で使用されるプライマーは、天然ＤＮＡにおいて異なってメチル化された遺伝子座ペアを増幅するように選択される（例えば、天然ＤＮＡにおいて、第１は９０％メチル化され、第２は３０％メチル化された、など）。

【0166】

（１）と（２）の２つの遺伝子座を増幅するために、どの２組のプライマー（第１ペア及び第２ペア）を使用するかの選択に関する１つの考慮は、ｉｎ ｖｉｖｏＤＮＡにおいて、２つの遺伝子座が異なってメチル化された程度である。従って、遺伝子座（１）が、遺伝子座（２）に比較してよりメチル化されている遺伝子座ペアは、シグナル比増幅アッセイのためのプライマーを設計するために使用し得る遺伝子座の例である。

【0167】

９．ゲノム遺伝子座の選択
１．推定遺伝子座の選択は、３つの様式のうちいずれかにおいて実施することができる。
（ｉ）文献において、適切なカテゴリ（例えば異なる組織など）において異なって発現される（ｍＲＮＡデータ）ことが示された、遺伝子の転写開始部位に最も近い遺伝子座を選択する。
（ｉｉ）文献において、異なるカテゴリ間で（例えば組織など）異なってメチル化されることが示された遺伝子座を選択する。
（ｉｉｉ）ランダムなゲノム遺伝子座を選択する。
２．推定遺伝子座のためのプライマーを設計する。
３．推定遺伝子座の「情報性」を経験的に試験する。それぞれの推定遺伝子座に対し、推定遺伝子座ともう１つの推定遺伝子座の間、あるいは、推定遺伝子座と未消化制御遺伝子座の間のシグナル比を算出する。
４．前記アッセイで使用するために「情報価値のある」遺伝子座（例えば、そのシグナル比が、異なるＤＮＡカテゴリにおいて、有意に異なる遺伝子座）を選択する。

【0168】

１０．メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼ
本発明の方法の第２の考慮は、メチル化の状況によって、メチル化感受性及び／又はメチル化依存性制限エンドヌクレアーゼによって切断又は消化されていない遺伝子座を選択することである。例えば、もしその遺伝子座におけるＤＮＡの認識配列がメチル化されていて、ＤＮＡ鎖を切断することができなければ、エンドヌクレアーゼが選択される。このように、メチル化された遺伝子座（１）と、及びメチル化されていない遺伝子座（２）の関係において、ＨｈａＩ又はＨｐａＩＩのようなエンドヌクレアーゼは、遺伝子座（１）を消化しないが、遺伝子座（２）は消化する。従って、シグナル比アッセイにおける増幅のための遺伝子座の選択は、各遺伝子座内のメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼ認識配列の存在も考慮してよい。

【0169】

次いで順方向及び逆方向プライマーは、遺伝子座の認識配列に隣接するＤＮＡ領域にアニールするよう設計され得る。

【0170】

従って、メチル化感受性酵素の場合、もし遺伝子座がメチル化されていれば、遺伝子座は（Ａ）消化されないが、（Ｂ）増幅される。逆に、もし遺伝子座がメチル化されていなければ、遺伝子座は（Ａ）消化されるが（Ｂ）増幅されない。メチル化依存性酵素の場合、状況はこの逆となる。

【0171】

１１．シグナル比アッセイの優位性
本発明のシグナル比アッセイは、メチル化解析の他のアプローチと比べていくつかの優位性と利点を有し、従って当業者は、このシグナル比アッセイを利用し得る、多様で有利な使用方法を認識するだろう。例えば、アッセイは、鋳型ＤＮＡの濃度、サーモサイクラーの製造元、及びＰＣＲ条件における変化、及び阻害剤の存在の結果として変動するアンプリコンシグナルレベルの絶対強度に依存する場合に固有の、多様な「ノイズ」因子に対して非感受性である。代わりに、アッセイで算出されるメチル化比率は、そのような因子に依存しない。というのは、解析される２つの遺伝子座が同一の反応において共増幅され、従ってそのような不同性の影響を受けやすいからである。このように、本発明の方法は、ゲノム標的又はアンプリコンの絶対的定量化を必要とせず、またアッセイは、検量線又はいかなる外部制御の必要もない、単一の独立型反応である。

【0172】

前記シグナル比アッセイは、単一の生化学反応においてごく少量のＤＮＡで実施し得るため、例えば、試料が天然又は人工ＤＮＡを含有するかどうかなどを証明するための、安価で、迅速で、かつ強力な方法である。本発明の方法の意図の重要な１つの特徴は、ＤＮＡ型鑑定のような、他のＰＣＲベースの方法と、単一の生化学的反応において複合し得るということである。

【0173】

１２．キャピラリー電気泳動及び多重化
前記解析の迅速性は、例えば、標的遺伝子座の複数ペアの増幅により生成された、多数の増幅産物を分離するためのキャピラリー電気泳動の使用などを考慮すると明白である。上記のとおり、本シグナル比アッセイは、複数の遺伝子座で実施し得る、そしてそれぞれの場合において、シグナル比は、各遺伝子座ペアに対して個別に算出される。例えば、もし４つの遺伝子座（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）が反応において共増幅された場合、例えば、Ａ／Ｂ、Ａ／Ｃ、Ａ／Ｄ、Ｂ／Ｃ、Ｂ／Ｄ、Ｃ／Ｄなど、６つの異なるシグナル比が算出され得る。

【0174】

従って、もし「ｎ」個の遺伝子座が共増幅された場合、（ｎ２−ｎ）／２の異なる比率が算出され得る。それ故、本メチル化アッセイで提供される情報量は、解析された遺伝子座の数と指数関数的に上昇する。リアルタイムＰＣＲ増幅法に対して、キャピラリー電気泳動は、単一の実行で多数の遺伝子座を識別し得る。例えば、ＤＮＡ型鑑定のために、特定のＤＮＡ試料から１７のゲノム遺伝子座をルーチン的に共増幅し、一緒に解析する。１７の遺伝子座すべてに本シグナル比アッセイの実施することにより、１３６の独立したシグナル比を得る。リアルタイムＰＣＲは、単一の反応において、１３６の比率を算出するのに必要なこれらの数の別々の増幅産物を、同時に識別することはできない。リアルタイムＰＣＲでは、わずか６つの比率の算出に対応する、約４つの遺伝子座を識別し得る。

【0175】

対照的に、キャピラリー電気泳動は、１７遺伝子座のすべてのペアになった順列から即座に増幅産物を分離し得、それ故、即座にデータを生成し、単一の反応においてすべての１３６のシグナル比を同時に算出することができる。理論的には、一回のキャピラリー電気泳動実行により、何百もの遺伝子座を一緒に処理し、分離することができる。複数の比率の解析を促進するため、これらの比率から、ここで「複合シグナルスコア」（ＣＳＳ）と命名する単一のスコアを算出することは有利であり得る。次いでＣＳＳは、例えば、ソースＤＮＡ試料が天然又は人工であるかどうかを確認するために使用することができる。

【0176】

１３．配列
多様なＣＯＤＩＳ、ＰｏｗｅｒＰｌｅｘ（登録商標）１６、及び鑑定で一般的に使用される他の遺伝子座のために本明細書で提供される配列、例えば、配列番号１〜２５は、ＳＴＲ鑑定で一般的に使用されるゲノム遺伝子座のものであり、本明細書において、（１）あらゆるシトシン−グアニン（ＣＧ）ジヌクレオチドの位置、（２）天然ＤＮＡ中の遺伝子座におけるすべてのＣＧジヌクレオチドのメチル化レベル、及び（３）その特定の遺伝子座に対するメチル化感受性及びメチル化依存性制限酵素プロファイルを決定するために解析された。従って、本出願の本文中に含まれる配列表は、当業者に、本発明の比率を生成するアッセイ方法に基づいて使用し得る、特定のメチル化感受性及びメチル化依存性制限エンドヌクレアーゼの同定に関する指導を提供する。例えば、「ｖＷＡ」ＣＯＤＩＳ及びＰｏｗｅｒＰｌｅｘ（登録商標）１６で増幅された遺伝子座のための７５１長のヌクレオチド配列である、配列番号８は、１つのみのＣＧジヌクレオチドを、位置５７１に含む。そのＣＧ及びそのすぐ隣に接するヌクレオチドは、ＢｓｓＫＩ、ＨｐａＩＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ酵素の認識配列を提供し、配列番号２６〜３２は、本発明者らによって、天然及び人工ＤＮＡ試料間で有意に異なる値を持つシグナル比を生成することが発見されたゲノム遺伝子座である。配列番号３３〜５４は、異なる組織から採取されたＤＮＡ試料間で有意に異なる値を持つシグナル比（ｐ＝０．０５の閾値を使用したＫｏｌｏｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖ試験に基づく）を生成することが、本発明者によって発見されたゲノム遺伝子座である。

【0177】

本明細書において提供される配列情報は、また、当業者がＣＧ及び制限部位に隣接する選択された遺伝子座領域にアニールする、順方向及び逆方向増幅プライマーを設計することを可能にする。このように、本発明の確証アッセイを実行する上で、市販されているプライマーの使用及び有効性は、より便利で価格効率よい選択肢であり得るが、本発明は、市販されているプライマーのみを使用した、例えばＣＯＤＩＳ遺伝子座などの増幅に限定されない。

【0178】

１４．アルゴリズム及びソフトウェア
一実施形態において、シグナル比及び／又は表現率の算出（例えばＤＮＡプロファイルが天然ＤＮＡを表すかどうかを決定するための）は、キャピラリー電気泳動装置上で実行される蛍光ＰＣＲの増幅産物のシグナル強度解析に基づいて実施される。キャピラリー電気泳動装置の出力は、二進法のコンピューターファイルである（例えば、アプライドバイオシステムズ社のキャピラリー電気泳動装置の場合はＦＳＡファイル）。このファイルは、各サンプリング時点（データポイントと呼ぶ）の関数としての、各蛍光体の相対的蛍光単位（ｒｆｕ）であるチャネルデータを含む、キャピラリー電気泳動の実行に関する情報を含む。

【0179】

本発明はまた、入力としてキャピラリー電気泳動装置実行の出力であるファイルを受け入れ、その増幅産物がキャピラリー電気泳動機器にかけられる一組の遺伝子座の蛍光強度を算出するソフトウェアプログラムについても記載している。これらの強度に基づき、ソフトウェアは、その比率を算出するよう定義される前定義された遺伝子座ペア一組を基準として、シグナル比及び／又は表現率（又はこれらの比率に基づく複合スコア）を算出する。最後にソフトウェアは、全定義された閾値と算出された比率の比較に基づいて決定を出力する。

【0180】

以下は、前記ソフトウェアプログラムによって実施されたこの解析のスキームである。
１．各色素チャネルのシグナルから、４００〜５００ｂｐｓの範囲でのそのチャンネルの平均ｒｆｕレベルとして定義されるベースラインレベルを差し引き、キャピラリー電気泳動装置の分光キャリブレーション法で得られたマトリックスに基づいて、蛍光体間の分光重複を除去する。
２．期待される遺伝子座サイズ、−０．５ｂｐ〜＋０．５ｂｐの範囲における最大ｒｆｕレベルとして定義される、解析される遺伝子座それぞれのｒｆｕレベルを得る。
３．遺伝子座ペア中の第１及び第２遺伝子座のｒｆｕレベル間の比率として定義される、遺伝子座ペア一組の間のシグナル比を計算する。（ゼロ除算を回避するため、５０未満のｒｆｕレベルをもつすべての遺伝子座に対し、５０ｒｆｕのレベルを割り当てる）。
４．工程３で算出された各比率、及び各組織型に対して、測定された比率での参照確率関数の値（以下参照）として定義される確率スコアを算出する。
５．各組織型に対し、工程４で得られたその組織に対する個別の確率スコアの積として定義される、複合確率スコアを算出する。（ｎは、シグナル比の数を表す）。
６．各組織型に対し、その組織の複合確率スコアと、すべての組織の複合確率スコアの合計との間の比率として定義される、尤度スコア（ＤＮＡ試料がその組織に由来する尤度を表す）を算出する。最も高い尤度スコアを持つ組織が、その試料の源と考えられる。

【0181】

１５．参照確率関数
ある特定の組織中のある特定の遺伝子座ペアの参照確率関数とは、その組織型の天然ＤＮＡ試料中で測定されたシグナル比のセットに当てはめたガンマ分布関数である。

【0182】

１６．不完全消化の補正
鋳型ＤＮＡの不完全消化は、試料中の阻害因子の存在の結果発生しうるため、実際の消化レベルの解析をアッセイに組み込むことは有用である。これは、少なくとも１つの「消化された制御遺伝子座」と、少なくとも１つの「未消化の制御遺伝子座」を組み込むことにより達成し得る。消化された制御遺伝子座とは、すべての可能性のある組織中の天然ＤＮＡにおいて、メチル化されていないことが知られているゲノム遺伝子座である。未消化の制御遺伝子座とは、すべての可能性のある組織中の天然ＤＮＡにおいて、メチル化されていることが知られている遺伝子座か、又はアッセイに使用されるエンドヌクレアーゼの認識配列を欠く遺伝子座かの、どちらかである。消化された制御遺伝子座と、未消化の制御遺伝子座間のシグナル比は、アッセイにおける実際の消化レベルと相関している。適切な消化が発生したかどうかを調べることにより（もしそうでない場合は、解析を中止する）、また、遺伝子座の実際のｒｆｕレベルを、完全な消化が起こった場合に得られたであろうｒｆｕ値を表す値に変更することにより、前記アルゴリズムはこのような遺伝子座を利用することができる。もし、この変更を実施する場合、シグナル比は、変更されたｒｆｕ値から算出する。

【実施例】

【0183】

材料及び方法
Ａ．生体組織の採取
血液（静脈血／月経血）、唾液、精液、皮膚の表皮、尿、及び腟分泌物を志願者から採取した。実験に勧誘したすべての参加者からインフォームドコンセントを得た。

【0184】

Ｂ．ＤＮＡ採取及び数量化
有機抽出を使用して、ＤＮＡをすべての試料から採取した。回収したＤＮＡ量をＱｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ(商標登録) Ｈｕｍａｎ ＤＮＡ定量キット（アプライドバイオシステムズ社）と、７３００リアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズ社）を使用して決定した。

【0185】

Ｃ．遺伝子座の選択及びプライマー設計
ランダムなＣｐＧ島（ＧＣコンテント＞＝０．５であり、また少なくとも８ＣＧｓである、＞＝２００ｂｐの領域として定義される；測定された／期待されるＣｐＧ比率＞０．６に対応する）を、この作業のために開発されたソフトウェアプログラムを使用して調査した。これらからＨｈａＩ認識配列を含むＣｐＧ島が、最初のスクリーニング用に選択された。ＨｈａＩ認識配列に隣接するプライマー（１８〜２８ｂｐｓ）を、温度６４〜６６℃で、アンプリコンサイズ６６〜１５０ｂｐｓ用に設計した。蛍光標識した順方向プライマー（ＦＡＭ又はＪＯＥ）を、インテグレーテッドＤＮＡテクノロジーズ社（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から購入した。各遺伝子型のプールされたＤＮＡ試料（それぞれが１０個体から採取されたＤＮＡを含む）の増幅により得られたシグナルと比較することにより、遺伝子座の差次的メチル化をペアでスクリーニングした。有意な差次的増幅パターン（すべての組織型において測定された最大のシグナル比が、測定された最小比率の３倍より大きい、として定義される）を示した遺伝子座を、多重化のために選択した。合計で、２０５の遺伝子座をスクリーニングし、そのうち、３８が有意な差次的増幅パターンを示した。これらから、１６の遺伝子座を実験で使用した。独立型の組織同定アッセイには、有意なノイズ無く共増幅され得る１５の遺伝子座を使用した。複合精液検出及び鑑定アッセイには、２つの遺伝子座（独立型アッセイにも使用したＬ６８３４６と、Ｌ１６２６４）を使用した。

【0186】

Ｄ．エンドヌクレアーゼ消化、ＰＣＲ、及びキャピラリー電気泳動
独立型のアッセイ実験において、各ＤＮＡ試料はＨｈａＩにより消化され、同一の反応においてＰＣＲ増幅に付した。反応は、３０Ｕ ＨｈａＩ(ニューイングランドバイオラブス社(New England Biolabs))、２．５Ｕ ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ(アプライドバイオシステムズ社)、２．５μｇ ＢＳＡ(ニューイングランドバイオラブス社）、各０．２ｍＭのｄＮＴＰ、各０．１〜０．３μＭのプライマー、２．５μｌ反応緩衝液(１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２)、及びＤＤＷから成り、総容量２５μｌである。複合型組織同定−鑑定実験における反応化合物は、プライマーを除いて、独立型アッセイにおけるものと同一であり、プライマーは、それぞれの０．２μＭの精液同定プライマーと、ＰｒｏｆｉｌｅｒＰｌｕｓ(アプライドバイオシステムズ社)の５μｌプライマーセットと合わせて使用した。反応（独立型及び複合型アッセイ双方のための）は、ＧｅｎｅＡｍｐ（Ｒ）ＰＣＲシステム９７００(アプライドバイオシステムズ社)中で実施し、使用した熱サイクルプログラムは：３７℃で１５分間、９５℃で１１分間、続いて９４℃で１分を２８サイクル、５９℃で１分間、７２℃で１分間、続いて最終伸長工程の６０℃で４５分であった。１．５μｌの増幅産物、２４．５μｌのＨｉＤｉ ホルムアミド(アプライドバイオシステムズ社)、及び０．５μｌのＲＯＸ ｓｉｚｅ ｓｔａｎｄａｒｄ(アプライドバイオシステムズ社)を含む混合物を、変性させ、(９５℃で３分間、その後即座に３分間氷上で)、製造者の指示に従って、ＡＢＩ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ(アプライドバイオシステムズ社)上で実行した。得られたすべての電気泳動図を、社内で開発されたソフトウェアで解析し、また複合型組織同定−鑑定実験で得られた電気泳動もまた、ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ ＩＤ−Ｘ解析ソフトウェア(アプライドバイオシステムズ社)を使用して解析した。

【0187】

Ｅ．組織同定アッセイ−データ解析
組織同定のためのデータ解析は、入力としてｆｓａファイルを受け入れ、最も可能性が高い源組織を出力する、社内で開発されたソフトウェアにより実施された。混合試料中の精液のパーセンテージの導出は、鑑定遺伝子座（ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｌｏｃｉ）と組織同定遺伝子座に基づいて実施された。鑑定遺伝子座（ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｌｏｃｉ）に基づく導出は、精液の寄与者に対応する対立遺伝子のｒｆｕ値の合計を、４つの遺伝子型付けされた対立遺伝子をもつＳＴＲ遺伝子座中のすべての対立遺伝子のｒｆｕ値の総計で割ることにより実施された。組織同定遺伝子座に基づく導出は、まず混合物のすべての可能なパーセンテージ（未消化のＤＮＡのシグナル比に基づき、１％の増加量で０〜１００％）に対する期待されるシグナル比を計算することにより実施され、そして前記アルゴリズムにより、期待されるシグナル比が測定されたシグナル比に最も近い、精液のパーセンテージが提供される。

【0188】

Ｆ．劣化した試料のシミュレーション
各試料２０ナノグラムを、総反応容積２０μｌ中の、０．０１Ｕ ＤＮＡｓｅＩ(アンビオン社(Ambion))、２μｌ １０Ｘ ＤＮＡｓｅＩ緩衝液(アンビオン社)により３７℃で１０分間消化し、続いて７５℃で１０分間、熱失活した。それぞれの消化されたＤＮＡ試料１ナノグラムを、次いで複合型組織同定−鑑定アッセイに付した。

【0189】

実施例１
組織型によるＤＮＡ分類−独立型アッセイ
本実施例では、本分類方法を「組織同定アッセイ」と命名する。組織同定アッセイは、組織間で異なってメチル化された遺伝子座のパネルを使用し、表１（図７）に示されるように、ＤＮＡ試料の最も可能性の高い源組織を特定する。アッセイのスキームのひとつを図１Ａに示す。問題とする法医学的な試料から得たＤＮＡ１ナノグラムを、ＤＮＡを認識配列ＧＣＧＣにおいて、それがメチル化されていない場合のみ切断する（メチル化された目標を未変化に保ったまま）ＨｈａＩメチル化感受性制限酵素で消化する。次いで組織同定遺伝子座のパネルを、蛍光標識したプライマーを使用して、消化されたＤＮＡからＰＣＲによって増幅し、一定分量の増幅生成物をキャピラリー電気泳動によって分離する。より高いメチル化レベルをもつ遺伝子座はより高い効率で増幅され（より多くのＤＮＡ分子が消化から保護されるからである。）、電気泳動図（図１Ｂ、遺伝子座Ａ）において、比較的強力なシグナルを生成する。逆に、より低いメチル化レベルをもつ遺伝子座はより低い効率で増幅され、電気泳動図（図１Ｂ、遺伝子座Ｂ）において、比較的弱いシグナルを生成する。

【0190】

自動シグナル解析ソフトウェアは、電気泳動図の出力解析を可能にし、組織同定遺伝子座に対応するアンプリコンに高さ（ｒｆｕによる）を割り当てる。単一遺伝子座の高さは、そのメチル化レベルに対応しているが、実際のメチル化レベルを導き出すことはできない。なぜなら、そのレベルは正確な鋳型の濃度と特定のＰＣＲ条件にも依存するからである。代わりに、すべての遺伝子座は同一の鋳型濃度と特定の反応条件に付されているため、共増幅された遺伝子座間のメチル化レベルの比率は算出することができる。従って、遺伝子座の各ペアに対して、第１及び第２遺伝子座の高さ間の比率として定義されるシグナル比が算出され、この比率は、対応する遺伝子座のメチル化レベル間の比率を反映する。すべての算出されたシグナル比を、単一のベクターにまとめ（例えば、１５−遺伝子座のパネルにおいてベクターは、遺伝子座１と２の間、遺伝子座１と３の間に、１０５比率を含むとすれば、など）、次いで既知の組織起源をもつ試料のデータセットから得た参照ベクターのデータベースと比較する。組織同定アルゴリズムは、可能性のあるそれぞれの組織起源に対して、ＤＮＡ試料がその組織に由来する可能性を反映する、尤度スコアを算出する。そして前記アルゴリズムの出力が、最も可能性のある組織である。

【0191】

独立型の組織同定アッセイを、５０の試料：血液１４試料、唾液１４試料、精液１１試料、及び皮膚表皮１１試料において、アンプリコンサイズ６６〜１５０ｂｐｓの範囲の、１５の組織同定遺伝子座のパネルを使用して実施した。図２は、これらの試料のうち８つ−各組織型の２つずつ、の電気泳動図を示す。異なる個体から得た同一組織型の試料は、完全に同一ではなかったが（メチル化レベルの自然な変異性及び確率的なＰＣＲ効果の結果として）、それにもかかわらず、各組織型が別個のメチル化特性を持つことは明白であった。例えば、精液試料中のＬ９１７６２／Ｌ６８３４６の比率は０．０４〜０．５３の範囲であり、すべての他の組織試料においてはより高く（２．１５〜１８．２８；図８の表２）、従って、低いＬ９１７６２／Ｌ６８３４６の比率は、精液試料に特有であった。Ｌ７６１３８／Ｌ２６６８８の比率は、血液及び唾液（０．０８〜１．５４）においては低く、精液及び皮膚の表皮においてはより高かった（２．０４〜１９．５６；図８中の表２）。従って、Ｌ９１７６２／Ｌ６８３４６の高比率とＬ７６１３８／Ｌ２６６８８の高比率が随伴する場合は、皮膚の表皮試料に特有であった。組織同定アルゴリズムは、５０試料すべての真の組織起源を正確に同定した。さらに、組織同定遺伝子座のサブセットを使用したデータ解析では、１５遺伝子座の全セットが重複しており、１５遺伝子座のうちの７つ（Ｌ９１７６２、Ｌ６８３４６、Ｌ５０４６８、Ｌ１４４３２、Ｌ３０１３９、Ｌ１５９５２、及びＬ２６６８８）のみの使用により、１００％の同定を達成したことが明らかになった。組織同定は、効率的な消化に依存するため、ＨｈａＩによる鋳型ＤＮＡの完全消化は、単一の消化増幅反応の構成において評価された。５０のＤＮＡ試料を同一の方法に付したが、表３（図９）に示すとおり、２つの異なる遺伝子座のパネルを使用した。２つの異なる遺伝子座とは、ＨｈａＩ部位を欠く制御遺伝子座（Ｌ９８３２８）と、これらの組織の中で全くメチル化されていないことが先に示された遺伝子座（参照により本明細書に組み入れられた、ＳＷ１４； Ｄ.Ｆｒｕｍｋｉｎら、Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｒｅｎｓｉｃ ＤＮＡ ｓａｍｐｌｅｓ、Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ｓｃｉ.Ｉｎｔ.Ｇｅｎｅｔ．２００９、ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ.ｆｓｉｇｅｎ.２００９.０６.００９を参照のこと）である。すべての試料が、ＨｈａＩによる完全消化を示す、参照遺伝子座の存在と、ＳＷ１４の完全な不存在を示し、対照的に、未消化の試料においては、両遺伝子座の存在を示した(実施例を図４に示す)。

【0192】

実施例２
シグナル比に影響を及ぼすノイズ因子の解析
実施例１に記載されたアッセイは、組織間で異なってメチル化された遺伝子座の利用に基づいており、それに対するシグナル比の値は一般的に組織特異的である（図１Ｃ）。しかし、異なる個体間におけるメチル化レベルの自然な変異性、及び／又はＤＮＡ鋳型濃度の差などのＰＣＲに関連する人為的現象の結果として（例えば、ピペット操作エラー及び確率的影響の結果として）、異なってメチル化された組織においても、測定されたシグナル比にはいくらかの重複がある可能性がある。これらの「ノイズ」因子それぞれの影響は、組織間の平均シグナル比の差である「シグナル」との関係において解析された。精液と血液間のシグナル比の値の差が平均１０倍である２つの遺伝子座を選択した。１ｎｇ及び２ｎｇのＤＮＡを鋳型として用い、異なるＰＣＲを同一の精液試料に実施した。これらの増幅により得られた比率を、互いに、及び異なる血液試料の増幅により得られた比率と比較した。異なるＰＣＲと、異なる量の入力ＤＮＡを使用して得られた比率間の差は、異なる組織から得られた比率間の差よりも、一桁以上もより小さかった（図１Ｄ）。

【0193】

実施例３
複合精液検出及びＤＮＡ型鑑定
本実施例では、ＤＮＡは、精液及び非精液の２つのうちの１つに分類された。非精液とは精液以外のすべての組織を指す。分類は同一の反応において、ＤＮＡ型鑑定と一緒に実施される。

【0194】

組織同定方法は、標準ＳＴＲ鑑定で使用されるものと同一のプラットフォーム（例えば、サーモサイクラー及びキャピラリー電気泳動装置など）を使用するため、単一の反応においてＤＮＡ型鑑定と容易に統合することができる。この可能性は、統合されたＳＴＲ鑑定及び精液検出アッセイを作り出すことによって実証された。ＳＴＲ鑑定キット(Ｐｒｏｆｉｌｅｒ Ｐｌｕｓ)ＰＣＲに、２つの精液同定遺伝子座(図１０中の表４)に特異的なプライマーを補った。これらの遺伝子座は、精液中でのみ効率的に増幅される７０ｂｐｓアンプリコンと、精液以外のすべての組織中で効率的に増幅される９５ｂｐｓアンプリコンからなる。アッセイでは、精液、尿(雄性の)、静脈血、月経血、腟分泌物、及び唾液の純粋な試料を検査した。精液同定増幅の正確なパターンが測定され、組織同定アルゴリズムが、すべての試料における精液の存在／不存在を正確に同定した。図３Ａ及びＢは精液及び尿試料(同一の個体から得られた)の完全な電気泳動図を示し、図３Ｃは、２つの精液同定遺伝子座と３つの鑑定遺伝子座(profiling loci)を含む、すべての試料から得たＦＡＭチャネルデータを示す。測定されたシグナル比は、精液試料中で２５．０４、そしてその他の試料中で０．０４〜０．０８９であった。さらに多様な比率の精液と唾液の混合物においても（図３Ｄ）、複合アッセイを実施した。これらの混合物のそれぞれに対して、試料中の精液のパーセンテージは精液同定遺伝子座のシグナル比から得、鑑定遺伝子座(profiling loci)から得られた対応するパーセンテージと比較した（精液及び唾液試料は、異なる個体から得、従ってＳＴＲ遺伝子座に基づいて識別し得る）。得られたパーセンテージは、最大差１０％（図１１中の表５）に匹敵する。さらに、精液の存在対不存在が、すべての試料で正確に決定された。（１３％の精液のみを含有した試料も含む；図３Ｄ）。統合された精液検出−鑑定アッセイを使用して試料から得られたＳＴＲプロファイルは、Ｐｒｏｆｉｌｅｒ Ｐｌｕｓを使用して同一の試料から得られたプロファイル（精液検出を除く）と同一であった。

【0195】

実施例４
経年及び劣化したＤＮＡ試料の分類
法医学型試料への応用に対する概念実証として、２０ヶ月経過したステイン(コットン上の血液及び精液)から抽出した２つのＤＮＡ試料において、独立型の組織同定アッセイ(実施例１に記載)を実施した。両試料は新鮮な試料と同様に良好に増幅し(図５)、前記アルゴリズムは、両試料の組織起源を正確に同定した。劣化したＤＮＡ試料をシミュレートするため、２つの追加のＤＮＡ試料(血液及び精液)を、部分消化をもたらす条件下において、ＤＮＡｓｅＩによる消化に付した。これらの試料を次いで、複合型の精液検出及び鑑定アッセイで解析した。ＤＮＡｓｅＩ消化により、両試料中のより大きなＳＴＲ中に、それらのプロファイルが部分的であるような、対立遺伝子の脱落が生じた。血液試料中、Ｄ３Ｓ１３５８とアメロゲニン対立遺伝子のみが型付けされ、精液試料においては、対立遺伝子の脱落はＦＧＡ、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ７Ｓ８２０において測定された(図６)。より小さな組織同定遺伝子座は、期待されるパターンで首尾よく増幅し、前記アルゴリズムは、これらの試料中の精液の存在／不存在を正確に同定した。

【0196】

実施例５
複合型鑑定及びＤＮＡ分類
この特定のアッセイは、通常のＤＮＡ試料鑑定（Ｐｒｏｍｅｇａ ＰｏｗｅｒＰｌｅｘ１６キット使用）、及び天然対人工ＤＮＡカテゴリへのＤＮＡ分類の、双方を使用する。

【0197】

従って本アッセイの一面は、ＤＮＡの天然の性質を、いくつか又はすべての人工ＤＮＡ（定義のセクションを参照）と照らし合わせることであり、従っていくつかの異なる比率の解析を含む。そのため、比率を組み合わせることにより、多様な方法で合成された、単一のパラメーターの多様なＤＮＡを比較することが可能になる。単一のパラメーター、例えば表現率は、ゲノム全体を含む試料（天然ＤＮＡであるが、本実施例に示される通り、ＭＤＡ合成されたＤＮＡでもある）と、サブセットのみ（例えば、ＣＯＤＩＳ遺伝子座のみ）を含む試料とを識別することができる。

【0198】

対象Ａの血液から採取された天然ＤＮＡ試料、及び市販のキット（対象Ａの微量の本物のＤＮＡを鋳型として）を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ多置換増幅により合成された人工ＤＮＡ試料、２つのＤＮＡ試料を解析した。

【0199】

２つの試料をまず通常のキット(ＰｏｗｅｒＰｌｅｘ１６)で鑑定し、通常の鑑定ソフトウェア(ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒＩＤ−Ｘ)を使用して解析した。本方法のスキームは簡潔に説明すると、ＰｏｗｅｒＰｌｅｘ１６プライマーミックスを使用してＤＮＡ試料にマルチプレックスＰＣＲを実施し；キャピラリー電気泳動装置上で増幅産物を分離し；次いで出力データを、例えば、ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒＩＤ−Ｘソフトウェアなどで解析する。

【0200】

各試料に対して、本アッセイの最終産物はプロファイルである。図９Ａ，Ｂからわかるように、２つの試料のプロファイルは同一である。さらに、Ｇｅｎｅ ＭａｐｐｅｒＩＤ−Ｘソフトウェアは、両試料のプロファイルを、例外なく、単一寄与体（例えば、単一の個人）のプロファイルであると決定した。これは、人工ＤＮＡから得たプロファイルが、天然ＤＮＡから得たプロファイルと同一であり得るということを示している。参照により本明細書に組み入れられた、Ｄ.Ｆｒｕｍｋｉｎ，ｅｔ ａｌ.，Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｒｅｎｓｉｃ ＤＮＡ ｓａｍｐｌｅｓ，Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ｓｃｉ.Ｉｎｔ.Ｇｅｎｅｔ.(２００９),ｄｏｉ：１０.１０１６／ｊ.ｆｓｉｇｅｎ.２００９．０６．００９を参照のこと。

【0201】

ＤＮＡの両試料を、その後、以下のスキームに基づいて、複合型鑑定及び分類アッセイによっても解析した。ＤＮＡ試料をＨｈａＩで消化し、Ｈｙｐｏ２３などの追加の遺伝子座を増幅するための追加のプライマーとともに、Ｐｏｗｅｒ Ｐｌｅｘ１６プライマーミックスを使用してマルチプレックスＰＣＲを実施し；キャピラリー電気泳動装置上で増幅産物を分離し；出力データを、本明細書で開示されたソフトウェアアルゴリズムなどの、キャピラリー解析ソフトウェアで解析する。

【0202】

各試料に対して、本アッセイの最終産物はプロファイル及びカテゴリの割り当てである。図９Ｃ及びＤからわかるように、天然ＤＮＡは「天然」として、対して、人工の試料を「人工」として割り当てた。

【0203】

本実施例では、カテゴリの割り当ては以下の３つのパラメーターの解析により実施された。
ＳＲ１（ＴＰＯＸ／Ｄ８Ｓ１１７９のシグナル比）、ＳＲ２（Ｄ３Ｓ１３５８／Ｈｙｐｏ２３のシグナル比）、及びＲＲ（ＯＣＡ２／Ｄ３Ｓ１３５８の表現率）。
これらのパラメーターの閾値を表６に示す。

【0204】

【表4】

【0205】

これらのパラメーターの測定値、及び割り当てられたカテゴリを表７に示す。表７（天然ＤＮＡの、閾値を超える値は、グレーで示す）。

【0206】

【表5】

【0207】

カテゴリの割り当ては、以下のルールにもとづいて実施した。

【0208】

もしすべてのパラメーター測定値が、天然ＤＮＡのそれぞれの閾値を超えていれば「天然」カテゴリに割り当て、それ以外であれば「人工」のカテゴリに割り当てる。

【0209】

実施例６
複合鑑定及びＤＮＡ分類（ＭＤＡ対非ＭＤＡ）
この特定のアッセイはＤＮＡ試料の通常の鑑定（Ｐｒｏｍｅｇａ ＰｏｗｅｒＰｌｅｘ１６キットによる）と、ＭＤＡカテゴリ（多置換増幅対他の（非ＭＤＡ）タイプのＤＮＡによって合成された人工ＤＮＡ）へのＤＮＡ分類、双方を使用する。

【0210】

対象Ａの血液から採取された天然ＤＮＡ試料、及び市販のキット（対象Ａの微量の本物のＤＮＡを鋳型として）を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ多置換増幅により合成された人工ＤＮＡ試料、２つのＤＮＡ試料を解析した。

【0211】

２つの試料をまず通常のキット（ＰｏｗｅｒＰｌｅｘ１６）で鑑定し、通常の鑑定ソフトウェア（ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒＩＤ−Ｘ）を使用して解析した。本方法のスキームは以下のとおりである。
ＤＮＡ→ＰｏｗｅｒＰｌｅｘ１６プライマーミックスを使用したマルチプレックスＰＣＲ→増幅産物のキャピラリー電気泳動装置上での分離→ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒＩＤ−Ｘ ソフトウェアでのデータ解析。

【0212】

各試料に対して、本アッセイの最終産物はプロファイルである。図１５Ａ−Ｂからわかるように、２つの試料のプロファイルは同一である。さらに、Ｇｅｎｅ ＭａｐｐｅｒＩＤ−Ｘソフトウェアは、両試料のプロファイルを、例外なく、単一寄与体（例えば、単一の個人）のプロファイルであると決定した。

【0213】

ＤＮＡの両試料を、その後さらに、キャピラリー解析ソフトウェアを使用して解析した。各試料に対して、本アッセイの最終産物はプロファイル及びカテゴリの割り当てである。図１５Ｃ−Ｄからわかるとおり、天然ＤＮＡは「非ＭＤＡ」として、対してＭＤＡ試料は「ＭＤＡ」として割り当てた。

【0214】

本実施例では、カテゴリの割り当ては以下の３つのパラメーターの解析によって実施された。
ＲＲ１（ｖＷＡ／Ｄ１８Ｓ５１の表現率）、ＲＲ２（ＣＳＦ１ＰＯ／Ｐｅｎｔａ＿Ｄの表現率）、及びＲＲ３（Ｄ２１Ｓ１１／Ｄ７Ｓ８２０の表現率）。
複合表現スコアを、以下の通り、これらの３つの比率に基づいて算出した。
ＣＲＳ＝３√Ｒ１＊Ｒ２＊Ｒ３
複数のＭＤＡ試料、及び非ＭＤＡ試料の解析に基づいて決定された閾値は１．５であり、それゆえ１．５以上のＣＲＳ値を有する未知の試料は、「ＭＤＡ」として分類し、一方、１．５未満のＣＲＳ値を有する未知の試料は「非ＭＤＡ」として分類される。

【0215】

ＭＤＡ試料及び非ＭＤＡ試料のＣＲＳ値を、算出し、結果は以下のとおりである
ＭＤＡ試料のＣＲＳ値＝２．０４
非ＭＤＡ試料のＣＲＳ値＝０．９１
閾値に基づき、両試料を正確に分類した。

【0216】

実施例７
独立型精液検知キット
キットで使用されたアッセイは、入力としてＤＮＡ試料を受け入れ、次いで生化学的手順を経て、さらに専用ソフトウェアによってシグナル解析される。アッセイの出力は、ＤＮＡ試料（精液又は非精液）のカテゴリ、及び、出力されたカテゴリがＤＮＡ試料の真のカテゴリである可能性を表す、統計的信頼水準である。

【0217】

本発明の精液検出キットは、１又はつ以上の以下の構成要素を含み得る。

【0218】

１． １又はつ以上の以下の構成要素を含み得る箱
０．６μＭ ＳＤ１ｆ（ＡＡＧＡＧＣＣＣＡＴＣＡＧＧＣＡＧＧＴＣ）；
０．６μＭ ＳＤ１ｒ（ＧＴＴＴＣＴＴＧＴＣＧＡＧＣＡＧＣＡＣＧＴＧＧＡＴＧＡＴＧ）；
１．７５μＭ ＳＤ２ｆ（ＣＴＣＣＡＧＡＡＣＴＧＧＡＡＣＴＴＣＣＴＧ）；
１．７５μＭ ＳＤ２ｒ（ＧＴＴＴＣＴＴＡＡＣＴＴＧＧＡＧＡＣＧＡＣＧＧＣＡＴＣ）；
１．２５μＭ ＳＤ３ｆ（ＴＧＧＡＧＧＡＣＡＡＴＧＣＣＣＴＧＧＴＧ）；
１．２５μＭ ＳＤ３ｒ（ＧＴＴＴＣＴＴＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＧＣＧＡＣＣＧＴＣＴＣ）；
１．７５μＭ ＳＤ４ｆ（ＣＣＣＴＣＣＧＡＧＴＧＧＣＣＡＧＣＡＧ）；
１．７５μＭ ＳＤ４ｒ（ＧＴＴＴＣＴＧＡＣＣＡＣＴＧＣＣＧＴＧＧＧＡＡＴＧ）；
１．７５μＭ ＳＤ５ｆ（ＣＴＴＣＴＣＡＧＣＣＡＡＴＧＧＧＡＡＧＡＧ）；
１．７５μＭ ＳＤ５ｒ（ＡＣＧＴＡＧＡＡＧＧＡＣＣＣＧＡＧＧＡＣ）；
０．９μＭ ＳＤ６ｆ（ＴＡＣＡＧＡＣＡＡＡＴＣＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣ）；及び
０．９μＭ ＳＤ６ｒ （ＧＴＴＴＣＴＴＧＴＣＴＧＡＣＡＣＴＣＧＧＴＴＧＴＡＧＧＴＡＴＴ）の５Ｘプライマーミックスを含むチューブ１；
順方向プライマー（例えば、ＳＤ＿ｆなど）は蛍光で標識した
１０Ｘ反応緩衝液（１５０ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、各０．２ｍＭのｄｎｔｐ、２．５μｇ ＢＳＡ）を含むチューブ２；
ＨｈａＩ制限エンドヌクレアーゼを含むチューブ３；
対照精液ＤＮＡ試料を含むチューブ４；
対照非精液ＤＮＡ試料を含むチューブ５；
ＤＮＡラダーを含むチューブ６；及び
化学物質安全性データシート（ＭＳＤＳ）。

【0219】

２． 以下のプロトコル、又は同様の指示を詳述した文書
（ａ） 各反応に対して、０．２ｍｌチューブ（提供されていない）中で、以下の成分：５μｌ ５Ｘプライマーミックス、２．５μｌ １０Ｘ反応ミックス、０．５μｌ ＨｈａＩエンドヌクレアーゼ、０．５μｌ ＤＮＡポリメラーゼ、０．５ｎｇ ＤＮＡ、及びＤＤＷ（蒸留水）を、総容積２５μｌに混合する
（ｂ） さらに、検査済みのＤＮＡに、供給された精液ＤＮＡを使用した陽性対照精液反応、供給された血液ＤＮＡを使用した陽性対照非精液反応、ＤＮＡの代わりにＤＤＷを使用した陰性対照反応、及び、ＨｈａＩの代わりにＤＤＷを使用した消化制御反応を構成する
（ｃ） サーマルサイクラー中に反応チューブを置き、以下のプログラム：３７℃で１５分間、９５℃で１１分間、続いて９４℃３０サイクルで１分間、５９℃で１分間、７２℃で１分間、続いて、最終伸長工程の、６０℃で４５分間、及び２５℃での保持を実行する
（ｄ） それぞれの増幅後反応に対して、１．５μｌの生成物を、２４．５μｌのホルムアミド、及び０．５μｌのｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｓｉｚｅ ｓｔａｎｄａｒｄと、新しい０．２ｍｌチューブ中で混合する
（ｅ） 試料を９５℃で３分間変性させ、次いで即座に氷上で３分間冷却する
（ｆ） 変性した試料を、以下のパラメーターを使用して、キャピラリー電気泳動装置にかける
モジュール＝ＧＳ ＳＴＲ ＰＯＰ４（１ｍＬ）Ｆ；
Ｉｎｊ．ｓｅｃｓ＝５；
Ｉｎｊ．ｋＶ＝１５；
Ｒｕｎ ｋＶ＝１５；
Ｒｕｎ Ｃ＝６０；
実行時間＝２４分
（ｇ）ＴｉｓｓｕｅＩｄｅｎｔｉｆｉｅｒ解析ソフトウェアで、出力の．ｆｓａファイルを解析する。

【0220】

３． 「アリゴリズム及びソフトウェア」セクションに記載された、組織同定アルゴリズムを実装した「ＴｉｓｓｕｅＩｄｅｎｔｉｆｉｅｒ」解析ソフトウェアに以下の改変を加えたもの。

【0221】

前記アルゴリズムの工程３において、使用された遺伝子座ペアのセットは｛ＳＤ１、ＳＤ６｝、｛ＳＤ２、ＳＤ６｝、｛ＳＤ３、ＳＤ６｝、｛ＳＤ４、ＳＤ６｝、及び｛ＳＤ５、ＳＤ６｝である。

【0222】

不完全消化の補正は｛ＳＤ５、ＳＤ６｝のシグナル比を使用して実施した。ＳＤ５は、消化された制御遺伝子座として作用し、ＳＤ６は、未消化の制御遺伝子座として作用した。

【0223】

２７の異なる個体から得た２７の参照精液試料及び異なる個体から得た８６の参照非精液試料（血液、唾液、尿、膣スワブ、月経血）を使用して、｛ＳＤ１、ＳＤ６｝、｛ＳＤ２、ＳＤ６｝、｛ＳＤ３、ＳＤ６｝、｛ＳＤ４、ＳＤ６｝に対する精液及び非精液の参照確率関数を得た。

【0224】

前記アッセイは６つのゲノム遺伝子座の解析に基づく。これらのうち、４つの遺伝子座が、精液対非精液組織において異なってメチル化されていることが、発明者らにより発見された。これらの４つのうち２つの遺伝子座が、精液を除くすべての組織においてメチル化されており、他の２つの遺伝子座は、精液を除くすべての組織においてメチル化されていなかった。前記アッセイはさらに、ＨｈａＩ認識配列を含まず、従って組織型にかかわらず首尾よく増幅されることが期待される未消化の制御遺伝子座（ＳＤ６）と、すべての可能性のある組織においてメチル化されていないことが本発明者らによって発見された、消化された制御遺伝子座（ＳＤ５）を含む。

【0225】

キットでは、異なる性別、年齢、及び民族の、９５の異なる提供者から採取した、２７の精液及び８６の非精液（血液、唾液、尿、膣スワブ、月経血）ＤＮＡ試料を検査した。前記アルゴリズムは、典型的な信頼水準＞９９．９９９９９９％で、すべての試料の源を正確に同定した。図１２は６試料の標準地を示す。検査した試料は、参照確率関数を得るために使用した試料と同一の試料であった。しかし、偏り（ｂｉａｓ）を避けるため、各特定の解析において、解析された試料は、参照確率関数を得るためには使用しなかった。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【配列表】

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