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特許6082729藍藻類の増殖を抑制する組み換え型ポリペプチド、その遺伝子、およびその製造方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6082729
(24)【登録日】2017年1月27日
(45)【発行日】2017年2月15日
(54)【発明の名称】藍藻類の増殖を抑制する組み換え型ポリペプチド、その遺伝子、およびその製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20170206BHJP
C02F 1/50 20060101ALI20170206BHJP
C07K 16/12 20060101ALI20170206BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20170206BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20170206BHJP
【ＦＩ】
C12N15/00 AZNA
C02F1/50 510D
C02F1/50 520J
C02F1/50 532Z
C07K16/12
C12N1/21
C12P21/08
【請求項の数】10
【全頁数】18
(21)【出願番号】特願2014-505491(P2014-505491)
(86)(22)【出願日】2012年3月27日
(65)【公表番号】特表2014-513939(P2014-513939A)
(43)【公表日】2014年6月19日
(86)【国際出願番号】CN2012073120
(87)【国際公開番号】WO2012142899
(87)【国際公開日】20121026
【審査請求日】2014年1月8日
【審判番号】不服2016-2544(P2016-2544/J1)
【審判請求日】2016年2月19日
(31)【優先権主張番号】201110100775.2
(32)【優先日】2011年4月21日
(33)【優先権主張国】CN
(31)【優先権主張番号】201110155221.2
(32)【優先日】2011年6月10日
(33)【優先権主張国】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】513264935
【氏名又は名称】畿晋▲慶▼三▲聯▼（北京）生物技▲術▼有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＰＲＯＴＥＩＮ ＤＥＳＩＧＮ ＬＡＢ， ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】100093779
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 雅紀
(72)【発明者】
【氏名】丘 小▲慶▼
【合議体】
【審判長】
中島 庸子
【審判官】
大宅 郁治
【審判官】
山本 匡子
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
C12N5/00-10, 15/00-09, C12P21/00-08, C07K16/00-12, C02F1/00-50
ＪＳＴｐｌｕｓ／ＪＭＥＤｐｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡＰＬＵＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）
ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＰＤＢ／ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
藍藻類を識別する能力および藍藻類と結合する能力を有し、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３に示すアミノ酸配列を有することを特徴とするポリペプチド系抗体ミメティック。
【請求項2】
請求項１に記載のポリペプチド系抗体ミメティックをエンコードすることを特徴とする遺伝子。
【請求項3】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示したヌクレオチド配列を有することを特徴とする請求項２に記載の遺伝子。
【請求項4】
請求項１に記載されている、藍藻類を識別する能力および藍藻類と結合する能力を有するポリペプチド系抗体ミメティックが、コリシンポリペプチドのカルボキシ末端に線状に結合することで形成され、前記コリシンがコリシンＥ１、Ｉａ、Ｉｂ、Ａ、ＢまたはＮからなる一群から選ばれることを特徴とする藍藻類の増殖を抑制する組み換え型ポリペプチド。
【請求項5】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７に示すアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項４に記載の藍藻類の増殖を抑制する組み換え型ポリペプチド。
【請求項6】
請求項４または請求項５に記載の藍藻類の増殖を抑制する組み換え型ポリペプチドをエンコードすることを特徴とする遺伝子。
【請求項7】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６に示すヌクレオチド配列を有する請求項６に記載の遺伝子。
【請求項8】
請求項４または請求項５に記載の藍藻類の増殖を抑制する組み換え型ポリペプチドをエンコードする遺伝子を含むことを特徴とする発現ベクタ。
【請求項9】
請求項４または請求項５に記載の藍藻類の増殖を抑制する組み換え型ポリペプチドをエンコードする遺伝子を大腸菌発現系に導入し、転換した大腸菌を培養し、大腸菌から発現されたポリペプチドを分離することを特徴とする藍藻類の増殖を抑制する組み換え型ポリペプチドの製造方法。
【請求項10】
水の富栄養化を制御するのに用いられることを特徴とする請求項４または請求項５に記載の藍藻類の増殖を抑制する組み換え型ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、環境保全に関する生物技術、特に藍藻類の増殖を抑制する組み換え型ポリペプチド、その遺伝子、およびその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【0002】
水中の過剰な栄養素が原因で藍藻類が増殖する。水が汚染されるという現象は、世界中の水生環境に最大の危害を加えるだけでなく、人類に巨大な経済損失を与え、地球生物圏に修復できない危害を加える。国内において、経済発展に伴って工業化および都会化を加速する同時に、生態環境汚染の悪化が日増しに著しくなるため、水生環境を保護および改善することは真剣に解決しなければならない重大問題である。現有の抗菌薬は、藍藻類の増殖を抑制するのに効かない。藍藻類は系統的位置が未確定の藍色細菌と呼ばれる原核細胞である。藍藻類の増殖を抑制できる薬剤は硫酸銅などの重金属化学薬剤しかない。実際の使用状況により、その効果は限られているため、やむを得ず過量の薬剤を繰り返して使用すると、同時に水中の有用な藻類を藍藻類とともに除去され、水生植物および生態を破壊し、逆転できない永久性破壊を環境に与えるだけでなく、環境および農産物に残留した重金属化学薬剤の量が多くなる。従って、効果および安全性の高い藍藻類の増殖抑制剤を開発することが求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【特許文献1】特開２００８−２１４９４２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本発明は、藍藻類の増殖を抑制する新規な組み換え型ポリペプチドの遺伝子、組み換えプラスミドおよびポリペプチドを提供することを主な目的とする。上述したポリペプチドは藍藻類細胞以外の藻類細胞、植物および動物に傷害を与えることなく、藍藻類細胞を死滅させることが特徴である。本発明は上述した藍藻類の増殖を抑制する組み換え型ポリペプチドの製造方法を提供することをもう一つの目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明によるハイブリドーマは、寄託番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ．４７８３である。
【0006】
本発明によるモノクローナル抗体は、上述したハイブリドーマにより分泌される。
【0007】
本発明によるポリペプチド系抗体ミメティックは、藍藻類を識別する能力および藍藻類と結合する能力を有し、上述したモノクローナル抗体の抗原結合性フラグメントである、或いは、上述したモノクローナル抗体の抗原結合性フラグメントの機能区域に基づいて設計された低分子ポリペプチドである。
【0008】
上述したポリペプチド系抗体ミメティックは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３に示したアミノ酸配列を有する。
【0009】
本発明による遺伝子は、上述したポリペプチド系抗体ミメティックをエンコードする
【0010】
上述した遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示したヌクレオチド配列を有する。
【0011】
本発明による藍藻類の増殖を抑制する組み換え型ポリペプチドは、上述した藍藻類を識別する能力および藍藻類と結合する能力を有するポリペプチド系抗体ミメティックが、コリシンポリペプチドのカルボキシ末端に線状に結合することで生成される。上述したコリシンはコリシンＥ１、Ｉａ、Ｉｂ、Ａ、ＢまたはＮから選ぶものである。
【0012】
上述した藍藻類の増殖を抑制する組み換え型ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７に示したアミノ酸配列を有する。
【0013】
本発明による遺伝子は、上述した藍藻類の増殖を抑制する組み換え型ポリペプチドをエンコードする。
【0014】
上述した遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６に示したヌクレオチド配列を有する。
【0015】
本発明によるベクタは、藍藻類の増殖を抑制する組み換え型ポリペプチドをエンコードする遺伝子を含む。
【0016】
藍藻類の増殖を抑制する組み換え型ポリペプチドの製造方法は次の通りである。藍藻類の増殖を抑制する組み換え型ポリペプチドをエンコードする遺伝子を大腸菌発現系に導入し、転換した大腸菌を培養し、大腸菌から発現されたポリペプチドを分離する。
【0017】
上述した藍藻類の増殖を抑制する組み換え型ポリペプチドによって水生態の富栄養化を制御する。
【0018】
本発明による藍藻類の増殖を抑制する組み換え型ポリペプチドは、コリシンポリペプチドと、藍藻類細胞表面抗原のポリペプチド系抗体ミメティックとを結合することによって生成される。このポリペプチド分子において、藍藻類細胞表面抗原の抗体ミメティックは、藍藻を識別する機能および藍藻と結合する機能を有する。分子中のコリシンは、藍藻を攻撃する機能を有する。抗体ミメティックは、藍藻類細胞表面抗原を識別する抗体ミメティックであるため、本発明においてのポリペプチドは、藍藻類細胞以外の水中生物に傷害を与えることなく、藍藻類細胞のみを攻撃するため、水源を汚染することはない。かつ、水を汚染する藍藻類の制御に使用される際、環境を保全し、安全を確保することができる。本発明による藍藻類の増殖を抑制する組み換え型ポリペプチドにおいて、ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．４７８３のハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル抗体の抗原結合性フラグメント（Ｆａｂ）中の軽鎖および重鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列によって設計された抗体ミメティック、例えば一本鎖抗体、低分子量の抗体ミメティックなどは本領域において熟知され、かつ藍藻を識別し、結合させる働きを持つ。本発明により設計された抗体ミメティックに抗原を識別する能力を持たせば本発明の目的を達成することができる。抗体ミメティックは標的生物細胞の表面まで組み換え型ポリペプチドを誘導することが主な役割であり、組み換え型ポリペプチドのうちのコリシンは標的細胞膜にイオンチャンネルを形成し、続いて標的細胞内の可溶物質を漏出させ、死滅させる。従って、上述したモノクローナル抗体に基づいて設計された抗体ミメティックが標的抗原さえ認識できれば、これらの抗体ミメティックとコリシンとを連結することによって生成される組み換え型ポリペプチドは本発明の請求範囲に属すべきである。
【0019】
本発明の好ましい実施形態において、抗体ミメティックは２８個のアミノ酸からなるポリペプチドの抗体ミメティックであり、藍藻類の増殖抑制プロトプラスト表面抗原のモノクローナル抗体（ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．４７８３のハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル抗体）の複数のドメインＶHＣＤＲ１、ＶHＦＲ２およびＶLＣＤＲ３を、ＶHＣＤＲ１−ＶHＦＲ２−ＶLＣＤＲ３の構造に基づいて連結することによって生成される。屋内外での実験結果により、この抗体ミメティックによって生成された藍藻類の増殖抑制ポリペプチドは水性媒体中で作用し、かつ藍藻類細胞表面抗原を見付ける生物学的活性を持つことができる。２８個のアミノ酸からなるポリペプチドの抗体ミメティックはクローニングおよび発現が簡単で元の抗体と同じに識別に働く活性を持つため、組み換え型ポリペプチドのうちのコリシンを藍藻類細胞膜まで誘導し、藍藻類細胞膜にイオンチャンネルを形成し、藍藻類細胞を殺傷することができる。一方、組み換え型ポリペプチドは現有の水汚染処理剤（例えば硫酸銅など）に優れ、生態環境に対する安全性を有する。
【0020】
本発明において、組み換え型ポリペプチドのうちのコリシンはイオンチャンネルを自発的に生じさせるコリシンＥ１、Ｉａ、Ｉｂ、Ａ、ＢまたはＮから選ぶことができる。これらのコリシンは細胞膜にイオンチャンネルを生成し、殺菌作用を果たすことが共通点である。本発明の実施形態はコリシンＩａと、藍藻類に対する抗体ミメティックとによって生成された組み換え型ポリペプチドを対象物として実験するが、これに限らない。つまり、本発明の概念に基づいてこれらのコリシンと、藍藻類に対する抗体ミメティックとを線状に繋げることによって生成された組み換え型ポリペプチドは藍藻類を死滅させる目的を達成することができる。
【0021】
本発明による組み換え型ポリペプチドの遺伝子組み換えプラスミドの製造方法は、エンコードされた抗体ミメティックのヌクレオチド配列を、二本鎖オリゴヌクレオチドに点変異が起こる技術に基づいてコリシンのカルボキシ末端に挿入し、組み換えプラスミドを生成する。まずコリシンがコリシンＩａである場合、エンコードされた抗体ミメティックのヌクレオチド配列をＩａ遺伝子の６２６目のアミノ酸の後（カルボキシ末端）に挿入し、組み換えプラスミドを生成する。組み換えプラスミドの元、即ち、Ｐｒｏｍｅｇａ社製の業務用組み換えプラスミドｐＳＥＬＥＣＴ−１はコリシンＩａとそれに対応する免疫（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）タンパク質の遺伝子を搭載し、抗体ミメティックの遺伝子によって設計された数対のプライマーを有し、配列が第１実施形態に示したとおりである。続いて、二本鎖オリゴヌクレオチドに点変異が起こる技術に基づいてＳｔｒａｔｅｇｅｎｅ社の薬剤箱のマニュアルの通りに組み換えプラスミド、例えばｐＣＨＣｃｙａｎｏＭＡ１を製造する。
【0022】
本発明による藍藻類の増殖抑制ポリペプチドの製造方法は、次の通りである。エンコードされた抗体ミメティックの遺伝子とコリシン遺伝子とを繋げ、エンコードされた藍藻類増殖を抑制する遺伝子組み換え型ポリペプチドの組み換えプラスミドを生成する。続いて、工学的大腸菌細菌にその組み換えプラスミドを染み込ませ、藍藻類の増殖を抑制する組み換え型ポリペプチドのエンジニアリング・バクテリア細胞を生成する。続いてイオン交換カラムによって分離浄化を行えば藍藻類の増殖抑制ポリペプチドが完成する。
【0023】
本発明による藍藻類の増殖抑制ポリペプチドは水汚染処理に適用できる。許容される担体又は賦形剤または別の成分を本発明のポリペプチドに添加し、環境に適用する薬物組成物を製作することができる。そのメカニズムは次の通りである。ポリペプチドのうちの藍藻類細胞表面抗原と識別できる抗体ミメティックによって藍藻類細胞膜の近くまでコリシンを誘導し、コリシンのイオンチャンネル構造の疎水性部位を藍藻類細胞膜に差し込み、続いてコリシンのイオンチャンネル構造によって藍藻類細胞膜にイオンチャンネルを生じさせ、藍藻類細胞の可溶物質を漏出させ、藍藻類細胞を死滅させれば藍藻類細胞を殺す目的を達成することができる。
【0024】
従来の藍藻類の増殖抑制薬物に対し、本発明による藍藻類の増殖抑制ポリペプチドは、ターゲットが特定されるため、処理過程においてターゲット以外の藻類、植物および動物細胞を攻撃することがない。かつ毒性が低く、不良な反応が少ない。一方、本発明は藍藻類細胞膜にイオンチャンネルを形成し、藍藻類細胞を殺傷するため、藍藻類の増殖抑制ポリペプチドのイオンチャンネルによって藍藻類細胞を漏出および死滅させる短い時間内に、藍藻類の増殖抑制ポリペプチドのイオンチャンネルによって欠損が生じた藍藻類細胞膜を、変異遺伝子−タンパク質を発現する方式によって修復することが難しい。つまり、藍藻類細胞は本発明による藍藻類の増殖抑制ポリペプチドに対する耐薬性が低い。従って本発明による藍藻類の増殖抑制ポリペプチドは応用利用分野で期待されると思われる。
【0025】
ハイブリドーマ寄託情報は次の通りである。寄託番号は、ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．４７８３である。
名称は、藍藻類細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマである。
寄託日付は、２０１１年４月２０日である。
寄託機構は、中国微生物菌種寄託管理委員会の普通微生物中心である。
寄託機構の住所は、北京市朝陽区北辰西路１号院３号である。
【図面の簡単な説明】
【0026】
【図1】抗体ミメティックとコリシンＩａ遺伝子を含有した組み換えプラスミドｐＣＨＣｃｙａｎｏＭＡ１の構造を示す模式図である。
【図2】藍藻類の増殖抑制ポリペプチドの構造を示す模式図である。
【図3】一部分の遺伝子Ｎ−Ｃ順序が逆の抗体ミメティックとコリシンＩａ遺伝子を含有した組み換えプラスミドｐＣＨＣｃｙａｎｏＭＡ２の構造を示す模式図である。
【図4A】本発明による藍藻類の増殖抑制ポリペプチドが液体培養基で成長する緑膿藻を抑制する実験結果において対照液を示す図である。
【図4B】本発明による藍藻類の増殖抑制ポリペプチドが液体培養基で成長する緑膿藻を抑制する実験結果において、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンの抑制結果を示す図である。
【図4C】５０μｇ／ｍｌの広域スペクトルフェロモニシン（Ｐｈ−ＮＭ）の抑制結果を示す図である。
【図4D】５０μｇ／ｍｌの藍藻類の増殖抑制ポリペプチド（１）の抑制結果を示す図である。
【図4E】５０μｇ／ｍｌの藍藻類の増殖抑制ポリペプチド（２）の抑制結果を示す図である。
【図5】本発明による藍藻類の増殖抑制ポリペプチド（１）が液体培地で成長する緑膿藻を抑制する実験結果を示す写真である。Ａは４８時間経過後の結果、Ｂは７２時間経過後の結果、Ｃは９６時間経過後の結果である。写真の左から順によって配列されたフラスコの列において、一つ目のフラスコは比較用である。二つ目のフラスコは０．１μｇ／ｍｌの藍藻類の増殖抑制ポリペプチド（１）、三つ目のフラスコは０．５μｇ／ｍｌの藍藻類の増殖抑制ポリペプチド（１）、四つ目のフラスコは１μｇ／ｍｌの藍藻類の増殖抑制ポリペプチド（１）、五つ目のフラスコは５μｇ／ｍｌの藍藻類の増殖抑制ポリペプチド（１）、六つ目のフラスコは１０μｇ／ｍｌの藍藻類の増殖抑制ポリペプチド（１）である。
【図6】本発明による藍藻類の増殖抑制ポリペプチド（１）が液体培地で成長するイカダモを抑制する実験において、１０日を経過した後の結果を示す写真である。写真の左から順によって配列されたフラスコの列において、一つ目のフラスコは比較用である。二つ目のフラスコは１μｇ／ｍｌの藍藻類の増殖抑制ポリペプチド（１）、三つ目のフラスコは５μｇ／ｍｌの藍藻類の増殖抑制ポリペプチド（１）、四つ目のフラスコは１０μｇ／ｍｌの藍藻類の増殖抑制ポリペプチド（１）、五つ目のフラスコは１５μｇ／ｍｌの藍藻類の増殖抑制ポリペプチド（１）、六つ目のフラスコは２０μｇ／ｍｌの藍藻類の増殖抑制ポリペプチド（１）である。
【図7】本発明による藍藻類の増殖抑制ポリペプチド（１）が液体培地で成長する緑膿藻およびイカダモを抑制する実験結果を示すグラフである。上方は緑膿藻抑制実験の結果を示すグラフである。下方はイカダモ抑制実験の結果を示すグラフである。
【図8A】本発明による藍藻類の増殖抑制ポリペプチドが液体培地で成長する緑膿藻を抑制する実験結果を示す写真である。写真の左側のフラスコは比較用である。写真の右側のフラスコは３５μｇ／ｍｌの藍藻類の増殖抑制ポリペプチド（１）を使用した結果である。
【図8B】本発明による藍藻類の増殖抑制ポリペプチドが液体培地で成長するアナベナを抑制する実験結果を示す写真である。写真の左側のフラスコは比較用である。写真の右側のフラスコは３５μｇ／ｍｌの藍藻類の増殖抑制ポリペプチド（１）を使用した結果である。
【図8C】本発明による藍藻類の増殖抑制ポリペプチドが液体培地で成長するクロレラを抑制する実験結果を示す写真である。写真の左側のフラスコは比較用である。写真の右側のフラスコは３５μｇ／ｍｌの藍藻類の増殖抑制ポリペプチド（１）を使用した結果である。
【図8D】本発明による藍藻類の増殖抑制ポリペプチドが液体培地で成長するイカダモを抑制する実験結果を示す写真である。写真の左側のフラスコは比較用である。写真の右側のフラスコは３５μｇ／ｍｌの藍藻類の増殖抑制ポリペプチド（１）を使用した結果である。
【図9】本発明による藍藻類の増殖抑制ポリペプチドが藍藻類により汚染された自然水の汚染を抑制する実験を行った後の結果を示す写真である。図９において、Ａは対照液、Ｂは１μｇ／ｍｌの藍藻類の増殖抑制ポリペプチド（１）、Ｃは５μｇ／ｍｌの藍藻類の増殖抑制ポリペプチド（１）、Ｄは１０μｇ／ｍｌの藍藻類の増殖抑制ポリペプチド（１）、Ｅは０．７μｇ／ｍｌの硫酸銅である。
【図11A】図９に示す藍藻類の増殖抑制ポリペプチドが藍藻類により汚染された自然水の汚染を抑制する実験において、顕微鏡によって４００倍拡大し、一日目の変化を観察した結果を示す写真であり、処理前の状態と、１μｇ／ｍｌの藍藻類の増殖抑制ポリペプチド（１）よって水中のアナベナを処理した後の結果と、０．７μｇ／ｍｌの硫酸銅によって水中のアナベナを処理した後の結果とを比較した写真である。
【図11B】図９に示す藍藻類の増殖抑制ポリペプチドが藍藻類により汚染された自然水の汚染を抑制する実験において、顕微鏡によって４００倍拡大し、二日目の変化を観察した結果を示す写真であり、処理前の状態と、１μｇ／ｍｌの藍藻類の増殖抑制ポリペプチド（１）よって水中のアナベナを処理した後の結果と、０．７μｇ／ｍｌの硫酸銅によって水中のアナベナを処理した後の結果とを比較した写真である。
【図11C】図９に示す藍藻類の増殖抑制ポリペプチドが藍藻類により汚染された自然水の汚染を抑制する実験において、顕微鏡によって４００倍拡大し、三日目の変化を観察した結果を示す写真であり、処理前の状態と、１μｇ／ｍｌの藍藻類の増殖抑制ポリペプチド（１）よって水中のアナベナを処理した後の結果と、０．７μｇ／ｍｌの硫酸銅によって水中のアナベナを処理した後の結果とを比較した写真である。
【発明を実施するための形態】
【0027】
第１実施形態は、藍藻類の増殖抑制ポリペプチドのプラスミドのメカニズムを発現し、組み換え型藍藻類の増殖抑制ポリペプチドを製造する。材料はＣＧＭＣＣ Ｎｏ．４７８３のハイブリドーマである。
ステップは次の通りである。
【0028】
ステップ１は、抗体ミメティックのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を明確にする。まずハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル抗体を収集し、通常の方法に基づいてモノクローナル抗体をテストし、抗原結合性フラグメント（Ｆａｂ）中の重鎖および軽鎖配列を明確にし、そののち抗原相補性決定領域のアミノ酸配列に基づいてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３の如き抗体ミメティックのアミノ酸配列を求める。抗体ミメティックをエンコードするヌクレオチド配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示す。
【0029】
ステップ２は、本実験室でコリシンＩａと免疫（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）タンパク質の遺伝子が搭載されたＰｒｏｍｅｇａ社のｐＳＥＬＥＣＴ−１プラスミドをもとに、二本鎖オリゴヌクレオチドに点変異が起こる技術（（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅTM Ｋｉｔ， Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社）に基づいてエンコードされた藍藻類に対する抗体ミメティックの遺伝子（配列表ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２の如きヌクレオチド配列）を、コリシンＩａ遺伝子のＩ６２６位置に差し込み、組み換えプラスミドｐＣＨＣｃｙａｎｏＭＡ１（図１参照）を生成する。続いて、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ８３４ （ＤＥ３）エンジニア細菌に上述した組み換えプラスミドを染み込ませ、ポリペプチドを発現することによって配列表ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７の如き藍藻類の増殖抑制ポリペプチドを生成する。藍藻類の増殖抑制ポリペプチド、即ち以下の藍藻類の増殖抑制ポリペプチド（１）は、分子量が約７０，０００である。
【0030】
薬剤箱のマニュアルＳｔｒａｔｅｇｅｎｅ ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ （ｃａｔａｌｏｇ＃２００５１８） の通りに変異を導入する。
【0031】
１、以下の点変異に反応する物質を用意する。５μｌの１０ｘｂｕｆｆｅｒ
２μｌ（１０ｎｇ）の野生型コリシンＩａプラスミド
１μｌ（１２５ｎｇ）の設計した５’−３’オリゴヌクレオチドプライマー
１μｌ（１２５ｎｇ）の設計した３’−５’オリゴヌクレオチドプライマー
１μｌのｄＮＴＰ
５０μｌ再蒸留水
１μｌのｐｆｕ
（プラスミド、プライマーおよび再蒸留水以外の物質は箱内の薬剤である。）
【0032】
２、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を進める。増幅条件は変性９５℃３５秒後、アニーリング５３℃７０秒後、伸長６８℃１７分のサイクルを２０回行う。
【0033】
３、１μｌのＤｐｎＩエンドヌクレアーゼを加え、母体ＤＮＡ鎖を（３７℃で１時間）消化させ、１μｌの反応物と５０μｌのＨＭＳ１７４コンピテント細胞とを氷で３０分間冷却させ、４２℃の熱衝撃を４５秒行い、氷の中に２分間入れて置く。
【0034】
４、０．５ｍｌのＮＺＹ培地を加え、そののち攪拌速度２２０ｒｐｍ、温度３７℃で細菌を１時間振り、その中から５０から１００μｌの反応物を取り出し、プレート（ＬＢ培地に１％の寒天と５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを加え、３７℃で一晩寝かす）に敷き並べる。
【0035】
５、１８時間後、菌を選び出し、続いてＱｉａｇｅｎｅ，Ｇｉｂｃｏ社らの業務用薬剤箱によってプラスミドを分離し、変異が成功したか否かを測定する。
【0036】
６、５０ｎｇのプラスミドと、５０μｌのＥ．ｃｏｌｉ Ｂ８３４ （ＤＥ３）エンジニア細菌受容性細胞とを氷で３０分間冷却させ、４２℃の熱衝撃を３０秒行い、その中から５０から１００μｌの反応物を取り出し、それに０．５ｍｌのＳＯＣ培地を加え、続いて攪拌速度２２０ｒｐｍ、温度３７℃で細菌を１時間振り、そののち、プレート（ＬＢ培地に１％の寒天と５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを加える）に敷き並べ、３７℃で培養し、１２から１６時間後にコロニーを取り出す。
【0037】
７、攪拌速度２５０ｒｐｍ、温度３７℃で８から１６リットルのＬＢ培地を６から８時間振り、菌を大量増殖させる。遠心分離法によって菌を沈殿する工程（温度４℃、６０００ｇ、２０分間、ｐＨが９．０で温度が４℃の５０ｍＭ Ｂｏｒａｔｅおよび２ｍＭ ＥＤＴＡ）を進む。まず５０から８０ｍｌの浮遊菌に２５０μｌの０．２ Ｍ ＰＭＳＦを加え、超音波破砕処理（４℃、４００Ｗ、２分間）を行い、そののち高速遠心分離処理（４℃、７５０００ｇ、１．５時間）を行い、菌の組織片を沈殿させる。続いて上澄み液を取り出し、それに硫酸ストレプトマイシンを加えてＤＮＡを沈殿させ、分子量が１５，０００の透析袋に入れ、温度４℃の５０ｍＭ Ｂｏｒａｔｅおよび２ｍＭ ＥＤＴＡを含有した１０リットルのｐＨ９．０緩衝液によって一晩透析する。続いて上澄み液からＣＭカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を取り出し、そののち５０ｍＭ Ｂｏｒａｔｅ、０．３ Ｍ のＮａＣｌおよび２ｍＭ ＥＤＴＡを含有した温度４℃のｐＨ９．０緩衝液で溶出を行えば、組み換えられた藍藻類の増殖抑制ポリペプチド（１）（図２参照）を求めることができる。
【0038】
ｐＣＨＣｃｙａｎｏＭＡ１プラスミドの抗体ミメティックの遺伝子を製造するために具体的に設計した二本鎖オリゴヌクレオチド配列は次の通りである。
【0039】
ｐＣＨＣｃｙａｎｏＭＡ１（１）
５’−３’
ｇｃｇ ａａｔ ａａｇ ｔｔｃ ｔｇｇ ｇｇｔ ａｔｔ ＴＣＴ ＴＡＴ ＴＧＧ ＡＴＧ ＣＡＧ ＴＧＧ ＧＴＴ ＡＡＧ ＣＡＡ ｔａａ ａｔａ ａａａ ｔａｔ ａａｇ ａｃａ ｇｇｃ
３’−５’
ｇｃｃ ｔｇｔ ｃｔｔ ａｔａ ｔｔｔ ｔａｔ ｔｔａ ＴＴＧ ＣＴＴ ＡＡＣ ＣＣＡ ＣＴＧ ＣＡＴ ＣＣＡ ＡＴＡ ＡＧＡ ａａｔ ａｃｃ ｃｃａ ｇａａ ｃｔｔ ａｔｔ ｃｇｃ
（２）
５’−３’
ｔａｔ ｔｇｇ ａｔｇ ｃａｇ ｔｇｇ ｇｔｔ ａａｇ ｃａａ ＡＧＡ ＣＣＧ ＧＧＧ ＣＡＡ ＧＧＧ ＣＴＧ ＧＡＧ ＴＧＧ ＡＴＴ ＧＧＣ ｔａａ ａｔａ ａａａ ｔａｔ ａａｇ ａｃａ ｇｇｃ
３’−５’
ｇｃｃ ｔｇｔ ｃｔｔ ａｔａ ｔｔｔ ｔａｔ ｔｔａ ＧＣＣ ＡＡＴ ＣＣＡ ＣＴＣ ＣＡＧ ＣＣＣ ＴＴＧ ＣＣＣ ＣＧＧ ＴＣＴ ｔｔｇ ｃｔｔ ａａｃ ｃｃａ ｃｔｇ ｃａｔ ｃｃａ ａｔａ
（３）
５’−３’
ｇｇｇ ｃａａ ｇｇｇ ｃｔｇ ｇａｇ ｔｇｇ ａｔｔ ｇｇｃ ＣＡＧ ＣＡＧ ＴＡＴ ＹＧＧ ＴＣＴ ＡＣＧ ＣＣＣ ＣＣＧ ＴＧＧ ＡＣＧ ｔａａ ａｔａ ａａａ ｔａｔ ａａｇ ａｃａ ｇｇｃ
３’−５’
ｇｃｃ ｔｇｔ ｃｔｔ ａｔａ ｔｔｔ ｔａｔ ｔｔａ ＣＧＴ ＣＣＡ ＣＧＧ ＧＧＧ ＣＧＴ ＡＧＡ ＣＣＡ ＡＴＡ ＣＴＧ ＣＴＧ ｇｃｃ ａａｔ ｃｃａ ｃｔｃ ｃａｇ ｃｃｃ ｔｔｇ ｃｃｃ
【0040】
第２実施形態は、藍藻類の増殖抑制ポリペプチドの対照的なプラスミドのメカニズムを発現し、対照的な組み換え型藍藻類の増殖抑制ポリペプチドを製造する。本実験室でコリシンＩａと免疫（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）タンパク質の遺伝子が搭載されたＰｒｏｍｅｇａ社のｐＳＥＬＥＣＴ−１プラスミドをもとに、二本鎖オリゴヌクレオチドに点変異が起こる技術（（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅTM Ｋｉｔ， Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社）に基づいてエンコードされた藍藻類に対する抗体ミメティックの遺伝子（配列表ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４の如きヌクレオチド配列）を、コリシンＩａ遺伝子のＩ６２６位置に差し込み、組み換えプラスミドｐＣＨＣｃｙａｎｏＭＡ２（図３参照）を生成する。続いて、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ８３４ （ＤＥ３）エンジニア細菌に上述した組み換えプラスミドを染み込ませ、ポリペプチドを発現することによって配列表ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９の如き藍藻類の増殖抑制ポリペプチドを生成する。藍藻類の増殖抑制ポリペプチド、即ち以下の藍藻類の増殖抑制ポリペプチド（２）は、分子量が約７０，０００である。
【0041】
ｐＣＨＣｃｙａｎｏＭＡ２プラスミドの抗体ミメティックの遺伝子を製造する際、二本鎖オリゴヌクレオチド配列は第１実施形態の方法によって設計される。その製造方法は第２実施形態と同じである。
【0042】
第３実施形態は、藍藻類の増殖抑制ポリペプチドによって緑膿藻に抑制実験を行う。実験（１）
ステップ１は、供試藍藻を用意する。藍藻は中国科学院水生生物研究所から購入したＦＡＣＨＢ−９７８緑膿藻（Ｍｉｃｒｏｃｕｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）である。
【0043】
供試藻類を培養する方法は、２５０ｍｌのＢＧ１１培地が入れてある５００ｍｌフラスコの中に藻類株を接種する。接種前の藻類株の細胞密度は５ × １０4 個／ｍＬである。汚染を防止するためにフラスコの開口部を通気性のあるラップで封じる。培養温度は２５℃、日照強度は（２５００±１０％）Ｌｕｘ、明暗比は１２ｈ／１２ｈである。日照を均等にするために、２から３時間ごとに実験群のフラスコを振り、位置を変える。接種から五つ目の日になると、２４時間ごとにサンプルを取り、測定する。細胞密度が１０6 個／ｍＬ前後に達すると、次のステップに進む。
【0044】
ステップ２は、試験管Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅに予め製作した藍藻含有液体を１ｍｌずつ加え、そののち抑制剤を加える。試験管Ａは対照液である。試験管Ｂは５０μｇ／ｍｌのアンピシリンである。試験管Ｃは５０μｇ／ｍｌの広域スペクトルフェロモニシン（２００９１００９２１２８．４号 の特許明細書に記載されたＰｈ−ＡＭ１）である。試験管Ｄは５０μｇ／ｍｌの藍藻類の増殖抑制ポリペプチド（１）である。試験管Ｅは５０μｇ／ｍｌの藍藻類の増殖抑制ポリペプチド（２）である。試験管Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅをインキュベーターに入れ、中低速度で振り、１２時間培養し、そののちアクリジンオレンジ（５０ｎＭ）およびヨウ化プロピジウム（６００ｎＭ）を加え、３０分間保温する。続いて数マイクロリットルの量を吸い上げ、ガラスに置き、蛍光顕微鏡（型番がＮｉｋｏｎ ９０ｉ、ＤＭ５０５ および ＤＭ５６５のフィルター）によって染色された藍藻の状態を観察する。
【0045】
結果は図４に示したとおりである。結果により、藍藻類の増殖抑制ポリペプチド（１）は培養した緑膿藻を殺傷でき、藍藻類の増殖抑制ポリペプチド（２）、アンピシリンおよびＰｈ−ＮＭは培養した緑膿藻に全然作用しないことが判明した。【0046】
実験（２）ステップ１は実験（１）のステップ１と同じである。
ステップ２は、供試藻類を接種した六つの５００ｍｌフラスコに藍藻類の増殖抑制ポリペプチドを濃度勾配によって加える。一方、それぞれ緑膿藻に加えた藍藻類の増殖抑制ポリペプチドの量は０、０．１、０．５、１、５、１０ μｇ／ｍｌである。藍藻を抑制する状況は毎日観察する。
【0047】
結果は図５に示したとおりである。実験群に使った藍藻類の増殖抑制ポリペプチド（１）の濃度は異なり、フラスコ内の緑膿藻を含有した液体が緑色から浅黄色に変わる時間の長さはポリペプチドの濃度に正比例する。肉眼で観察した結果により、実験群は７２時間以内に供試緑膿藻を効果的に死滅させることができることが判明した。上述した結果により、藍藻類の増殖抑制ポリペプチド（１）は藍藻類を狙って殺傷する有効性を有することに対し、藍藻類の増殖抑制ポリペプチド（２）は藍藻に殆ど作用しないことが判明した。
【0048】
実験（３）材料は、中科院水生生物研究所から購入したＦＡＣＨＢ−４１７イカダモ（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ ｏｂｌｉｑｎｕｓ）である。実験（１）のステップ１の方法に基づいて供試藻類を培養する。
【0049】
ステップ２は、六つの供試藻類を接種した六つの５００ｍｌフラスコに藍藻類の増殖抑制ポリペプチド（１）を濃度勾配によって加える。加えた量は０、１、５、１０、１５、２０μｇ／ｍｌである。イカダモ増殖を抑制する状況は毎日観察する。
【0050】
結果は図６に示したとおりである。加えた藍藻類の増殖抑制ポリペプチド（１）の量は緑膿藻の処理に使用した量の１０倍であるが、実験時間中（１９０時間）に肉眼で観察した結果により、藍藻類の増殖抑制ポリペプチド（１）はイカダモに殺傷作用が何も起こらないことが判明した。
【0051】
実験（４）実験（１）から実験（３）のフラスコから０．１ｍｌの培養液を取り出し、血球計算盤に置き、続いて顕微鏡下で観察および計算を行う。図７は藻類細胞を計算した結果および比較対照した結果である。図７に示すように、１μｇ／ｍｌの藍藻類の増殖抑制ポリペプチド（１）は７２時間内に供試緑膿藻を死滅させることができるが、供試イカダモには何も作用しない。
【0052】
第４実施形態は、藍藻類の増殖抑制ポリペプチドによって緑膿藻、アナベナ、クロレラおよびイカダモの液体培養地に実験を行う。
【0053】
緑膿藻、アナベナ、クロレラおよびイカダモ、即ち供試藻類は中科院水生生物研究所から購入したものである。藻類を培養する方法および処理剤を添加する方法は第３実施形態の実験（１）のステップ（１）と同じである。
【0054】
藻類の細胞密度が１０6 個／ｍＬに達する４０ｍｌの培養液をそれぞれの３００ｍｌフラスコに分けて入れる。続いて、Ａ即ち同量の対照液およびＢ即ち３５μｇ／ｍｌの藍藻類の増殖抑制ポリペプチド（１）を別々に加え、４日間培養し、増殖状況を観察する。
【0055】
結果は図８に示したとおりである。緑膿藻含有培養液およびアナベナ含有培養液は２４時間後から色が薄く変わり始まり、四日目になると澄明になる。クロレラ含有培養液およびイカダモ含有培養液は色および濁りが全然変化しない。この結果により、藍藻類の増殖抑制ポリペプチド（１）は緑膿藻およびアナベナの増殖を抑制できるが、クロレラおよびイカダモの増殖を抑制できない。以上の実験結果により、藍藻類の増殖抑制ポリペプチド（１）は藍藻類を狙って殺傷する有効性を有することが判明した。
【0056】
第５実施形態は、藍藻類の増殖抑制ポリペプチドによって自然水中の藍藻類を死滅させる実験を行う。
【0057】
自然水は、藍藻類から深刻に汚染されたエビ養殖池（蘇州の陽澄湖）から収集したものである。６０＊４０＊３０ｃｍのプラスチック製容器に２５から３５リットルの自然水を分けて投入し、２０分ごとにポンプで空気を１０分間送り込む。続いて、自動加熱器の温度を２７℃に調整し、日照強度を（２５００±１０％）ｌｕｘに設定し、明暗比を１２ｈ／１２ｈに設定し、毎日サンプルを取り、供試液のｐＨ値、６５０ｎｍの吸光度およびクロロフィルａ吸収値（図９参照）を測定する。
【0059】
分光光度計によって６６５ｎｍの吸光度および７００ｎｍの吸光度を測定し、クロロフィルａの濃度を計算する。数式は下記の通りである。［Ｃｈｌａ］＝［１２．１２ （Ｄ６６４−Ｄ７５０）−１．５８（Ｄ６４７−Ｄ７５０）−０．０８（Ｄ６３０ − Ｄ７５０）］ＶＥ／ＶＳ・ｄ。
【0060】
対照グループは、水中のｐＨ値、６５０ｎｍの吸光度およびクロロフィルａ吸収値が実験期間中に全然下がらない。それに対し、藍藻類の増殖抑制ポリペプチド（１）実験群および硫酸銅実験群は、水中のｐＨ値、６５０ｎｍの吸光度およびクロロフィルａ吸収値が二日目から明らかに下がる。
【0061】
毎日３０ｍｌのサンプルを取り、ホルマリンで固定し、そののち遠心分離法によって１０倍に濃縮し、その中から０．１ｍｌの量を取り出し、血球計算盤に入れて顕微鏡下で観察および計算を行う（図１１参照）。経過観察で一日目に対照グループ、藍藻類の増殖抑制ポリペプチド（１）実験群および硫酸銅実験群にはアナベナが大量増殖し、二日目から藍藻類の増殖抑制ポリペプチド（１）実験群および硫酸銅実験群にはアナベナが大幅に減少し、破片になる。五日目になると、藍藻類の増殖抑制ポリペプチド（１）実験群および硫酸銅実験群にはアナベナが消えてしまう。対照グループには依然としてアナベナが繁茂する。
【0062】
藻類の状況および変化を顕微鏡で観察すると、同時に各種の藻類を計算することによって供試液中の優越性がある浮遊植物の動態および変化（図１０参照）を確認する。対照グループの水中にはアナベナおよび緑膿藻が優越性を有する。藍藻類の増殖抑制ポリペプチド（１）実験群の水中にはアナベナおよび緑膿藻が徐々に減少するのに対し、クロレラが優越性を有する。硫酸銅実験群の水中にはアナベナおよび緑膿藻が徐々に減少するのに対し、別の藍藻およびユレモが優越性を有する。
【0063】
【表1】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D-1】
【図10D-2】
【図10D-3】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図11D】
【図11E】
【配列表】
[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]