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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6087149
(24)【登録日】2017年2月10日
(45)【発行日】2017年3月1日
(54)【発明の名称】タンパク質の生産方法
(51)【国際特許分類】
C12P 21/02 20060101AFI20170220BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20170220BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20170220BHJP
【ＦＩ】
C12P21/02 CZNA
C12N5/10
!C12N15/00 A
【請求項の数】22
【全頁数】28
(21)【出願番号】特願2012-548817(P2012-548817)
(86)(22)【出願日】2011年12月14日
(86)【国際出願番号】JP2011078938
(87)【国際公開番号】WO2012081629
(87)【国際公開日】20120621
【審査請求日】2014年12月9日
(31)【優先権主張番号】特願2010-279850(P2010-279850)
(32)【優先日】2010年12月15日
(33)【優先権主張国】JP
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】000001029
【氏名又は名称】協和発酵キリン株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110002000
【氏名又は名称】特許業務法人栄光特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】黒川 恵
(72)【発明者】
【氏名】林 洋子
(72)【発明者】
【氏名】塚原 正義
【審査官】
川合 理恵
(56)【参考文献】
【文献】
米国特許出願公開第２０１０／０３１１１１６（ＵＳ，Ａ１）
【文献】
国際公開第２００８／０７２５４０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
WESTWOOD, Amy D. et al.，Improved recombinant protein yield using a codon deoptimized DHFR selectable marker in a CHEF1 expre，Biotechnol. Prog.，２０１０年１０月，Vol. 26, No. 6，p. 1558-1566，全文
【文献】
隅山健太、川上浩一，Tol2トランスポゾンを用いた画期的なトランスジェニックマウス作製法，実験医学，２０１０年１０月，Vol. 28, No. 16，p. 2653-2660，第2653頁右欄第8-14行、第2654頁左欄第10-12行
【文献】
YAGITA, Kazuhiro et al.，Real-time monitoring of circadian clock oscillations in primary cultures of mammalian cells using To，BMC Biotechnol.，２０１０年 １月，Vol. 10，p. 1-7
【文献】
WU, Sareina Chiung-Yuan et al.，piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to sleeping beauty, Tol2, and Mos1 i，Proc. Natl. Acad. Sci. USA.，２００６年，Vol. 103, No. 41，p. 15008-15013
【文献】
URASAKI, Akihiro et al.，Functional dissection of the Tol2 transposable element identified the minimal cis-sequence and a hig，Genetics，２００６年，Vol. 174, No. 2，p. 639-649
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０
Ｃ１２Ｐ ２１／０２
Ｃ１２Ｎ ５／１０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
目的タンパク質をコードするＤＮＡおよび減弱化した選択マーカー遺伝子を含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクターを無血清培養で生存および増殖可能な浮遊性のＣＨＯ細胞に導入し、一対のトランスポゾン配列の間に挿入された遺伝子断片を該ＣＨＯ細胞の染色体に組込み、該目的タンパク質を生産する浮遊性のＣＨＯ細胞を得て、且つ該ＣＨＯ細胞を浮遊培養して該目的タンパク質を生産する方法であって、
該減弱化した選択マーカー遺伝子が、改変前の選択マーカー遺伝子と同一のアミノ酸配列をコードし、かつ該ＣＨＯ細胞内で使用頻度の低いコドンを含む、該ＣＨＯ細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子であり、
該一対のトランスポゾン配列が、配列番号２で表わされる塩基配列および配列番号３で表わされる塩基配列である一対のＴｏｌ２由来の塩基配列である方法。
該減弱化した選択マーカー遺伝子が、改変前の選択マーカー遺伝子と同一のアミノ酸配列をコードし、かつ該ＣＨＯ細胞内で使用頻度の低いコドンを含む、該ＣＨＯ細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子であり、
該一対のトランスポゾン配列が、配列番号２で表わされる塩基配列および配列番号３で表わされる塩基配列である一対のＴｏｌ２由来の塩基配列である方法。
【請求項2】
以下の（Ａ）および（Ｂ）の工程を含むことを特徴とする、目的タンパク質の生産方法であって、（Ａ）以下のベクター（ａ）および（ｂ）を同時に無血清培養で生存および増殖可能な浮遊性のＣＨＯ細胞に導入し、一過性に発現させたトランスポゼースにより、一対のトランスポゾン配列の間に挿入された遺伝子断片を該ＣＨＯ細胞の染色体に組込み、目的タンパク質を発現する無血清培養で生存および増殖可能な浮遊性のＣＨＯ細胞を得る工程、
（ａ）目的タンパク質をコードするＤＮＡおよび減弱化した選択マーカー遺伝子を含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター、
（ｂ）前記トランスポゾン配列を認識し、かつ一対のトランスポゾン配列の間に挿入された遺伝子断片を染色体に転移させる活性を有するトランスポゼースをコードするＤＮＡを含むベクター、
（Ｂ）前記目的タンパク質を発現する無血清培養で生存および増殖可能な浮遊性のＣＨＯ細胞を浮遊培養して、目的タンパク質を生産させる工程、
該減弱化した選択マーカー遺伝子が、改変前の選択マーカー遺伝子と同一のアミノ酸配列をコードし、かつ該ＣＨＯ細胞内で使用頻度の低いコドンを含む、該ＣＨＯ細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子であり、
該一対のトランスポゾン配列が、配列番号２で表わされる塩基配列および配列番号３で表わされる塩基配列である一対のＴｏｌ２由来の塩基配列である方法。
（ａ）目的タンパク質をコードするＤＮＡおよび減弱化した選択マーカー遺伝子を含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター、
（ｂ）前記トランスポゾン配列を認識し、かつ一対のトランスポゾン配列の間に挿入された遺伝子断片を染色体に転移させる活性を有するトランスポゼースをコードするＤＮＡを含むベクター、
（Ｂ）前記目的タンパク質を発現する無血清培養で生存および増殖可能な浮遊性のＣＨＯ細胞を浮遊培養して、目的タンパク質を生産させる工程、
該減弱化した選択マーカー遺伝子が、改変前の選択マーカー遺伝子と同一のアミノ酸配列をコードし、かつ該ＣＨＯ細胞内で使用頻度の低いコドンを含む、該ＣＨＯ細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子であり、
該一対のトランスポゾン配列が、配列番号２で表わされる塩基配列および配列番号３で表わされる塩基配列である一対のＴｏｌ２由来の塩基配列である方法。
【請求項3】
ＣＨＯ細胞がＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ、ＤＵＫＸＢ１１、ＣＨＯ／ＤＧ４４、Ｐｒｏ−３およびＣＨＯ−Ｓから選ばれるいずれか１つの細胞である請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
ＣＨＯ細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子が、改変前の選択マーカー遺伝子をコードする塩基配列の１０％以上が改変された遺伝子である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
ＣＨＯ細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子が、当該遺伝子に含まれるロイシン残基に対応するコドンのうち、７０％以上のロイシン残基に対応するコドンがＴＴＡであるように改変された選択マーカー遺伝子である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
ＣＨＯ細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子が、当該遺伝子に含まれるアラニン残基に対応するコドンのうち、７０％以上のアラニン残基に対応するコドンがＧＣＧであるように改変された選択マーカー遺伝子である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
ＣＨＯ細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子が、当該遺伝子に含まれるロイシン残基に対応するコドンが全てＴＴＡであるように、またはアラニン残基に対応するコドンが全てＧＣＧであるように改変された選択マーカー遺伝子である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
選択マーカー遺伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子およびブラストサイジン耐性遺伝子からなる群より選ばれる１の選択マーカー遺伝子である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
目的タンパク質をコードするＤＮＡおよび減弱化した選択マーカー遺伝子を含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端にトランスポゾン配列を含む発現ベクターが導入され、一対のトランスポゾン配列の間に挿入された遺伝子断片が染色体に組込まれ、かつ目的タンパク質を生産する無血清培養で生存および増殖可能な浮遊性のＣＨＯ細胞であって、
該減弱化した選択マーカー遺伝子が、改変前の選択マーカー遺伝子と同一のアミノ酸配列をコードし、かつ該ＣＨＯ細胞内で使用頻度の低いコドンを含む、該ＣＨＯ細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子であり、
該一対のトランスポゾン配列が、配列番号２で表わされる塩基配列および配列番号３で表わされる塩基配列である一対のＴｏｌ２由来の塩基配列であるＣＨＯ細胞。
該減弱化した選択マーカー遺伝子が、改変前の選択マーカー遺伝子と同一のアミノ酸配列をコードし、かつ該ＣＨＯ細胞内で使用頻度の低いコドンを含む、該ＣＨＯ細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子であり、
該一対のトランスポゾン配列が、配列番号２で表わされる塩基配列および配列番号３で表わされる塩基配列である一対のＴｏｌ２由来の塩基配列であるＣＨＯ細胞。
【請求項10】
以下のベクター（ａ）および（ｂ）を同時に導入されることで、一対のトランスポゾン配列の間に挿入された遺伝子断片が染色体に組込まれ、かつ目的タンパク質を生産する無血清培養で生存および増殖可能な浮遊性のＣＨＯ細胞であって、
（ａ）目的タンパク質をコードするＤＮＡと減弱化した選択マーカー遺伝子を含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含むタンパク質発現ベクター、
（ｂ）該トランスポゾン配列を認識し、かつ一対のトランスポゾン配列の間に挿入された遺伝子断片を染色体に転移させる活性を有するトランスポゼース（転移酵素）をコードするＤＮＡを含むベクター、
該減弱化した選択マーカー遺伝子が、改変前の選択マーカー遺伝子と同一のアミノ酸配列をコードし、かつ該ＣＨＯ細胞内で使用頻度の低いコドンを含む、該ＣＨＯ細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子であり、
該一対のトランスポゾン配列が、配列番号２で表わされる塩基配列および配列番号３で表わされる塩基配列である一対のＴｏｌ２由来の塩基配列であるＣＨＯ細胞。
（ａ）目的タンパク質をコードするＤＮＡと減弱化した選択マーカー遺伝子を含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含むタンパク質発現ベクター、
（ｂ）該トランスポゾン配列を認識し、かつ一対のトランスポゾン配列の間に挿入された遺伝子断片を染色体に転移させる活性を有するトランスポゼース（転移酵素）をコードするＤＮＡを含むベクター、
該減弱化した選択マーカー遺伝子が、改変前の選択マーカー遺伝子と同一のアミノ酸配列をコードし、かつ該ＣＨＯ細胞内で使用頻度の低いコドンを含む、該ＣＨＯ細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子であり、
該一対のトランスポゾン配列が、配列番号２で表わされる塩基配列および配列番号３で表わされる塩基配列である一対のＴｏｌ２由来の塩基配列であるＣＨＯ細胞。
【請求項11】
ＣＨＯ細胞が、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ、ＤＵＫＸＢ１１、ＣＨＯ／ＤＧ４４、Ｐｒｏ−３およびＣＨＯ−Ｓから選ばれるいずれか１つの細胞である請求項９または１０に記載のＣＨＯ細胞。
【請求項12】
該ＣＨＯ細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子が、改変前の選択マーカー遺伝子をコードする塩基配列の１０％以上が改変された遺伝子である、請求項９〜１１のいずれか１項に記載のＣＨＯ細胞。
【請求項13】
該ＣＨＯ細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子が、当該遺伝子に含まれるロイシン残基に対応するコドンのうち、７０％以上のロイシン残基に対応するコドンがＴＴＡであるように改変された選択マーカー遺伝子である、請求項９〜１２のいずれか１項に記載のＣＨＯ細胞。
【請求項14】
該ＣＨＯ細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子が、当該遺伝子に含まれるアラニン残基に対応するコドンのうち、７０％以上のアラニン残基に対応するコドンがＧＣＧであるように改変された選択マーカー遺伝子である、請求項９〜１３のいずれか１項に記載のＣＨＯ細胞。
【請求項15】
該ＣＨＯ細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子が、当該遺伝子に含まれるロイシン残基に対応するコドンが全てＴＴＡであるように、もしくはアラニン残基に対応するコドンが全てＧＣＧであるように改変された選択マーカー遺伝子である、請求項９〜１４のいずれか１項に記載のＣＨＯ細胞。
【請求項16】
選択マーカー遺伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子およびブラストサイジン耐性遺伝子からなる群より選ばれる１の選択マーカー遺伝子である、請求項９〜１５のいずれか１項に記載のＣＨＯ細胞。
【請求項17】
目的タンパク質をコードするＤＮＡおよび減弱化した選択マーカー遺伝子を含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む、タンパク質生産に用いる発現ベクターであって、
該減弱化した選択マーカー遺伝子が、改変前の選択マーカー遺伝子と同一のアミノ酸配列をコードし、かつ該ＣＨＯ細胞内で使用頻度の低いコドンを含む、該ＣＨＯ細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子であり、
該一対のトランスポゾン配列が、配列番号２で表わされる塩基配列および配列番号３で表わされる塩基配列である一対のＴｏｌ２由来の塩基配列である発現ベクター。
該減弱化した選択マーカー遺伝子が、改変前の選択マーカー遺伝子と同一のアミノ酸配列をコードし、かつ該ＣＨＯ細胞内で使用頻度の低いコドンを含む、該ＣＨＯ細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子であり、
該一対のトランスポゾン配列が、配列番号２で表わされる塩基配列および配列番号３で表わされる塩基配列である一対のＴｏｌ２由来の塩基配列である発現ベクター。
【請求項18】
ＣＨＯ細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子が、改変前の選択マーカー遺伝子をコードする塩基配列の１０％以上が改変された遺伝子である、請求項１７に記載のベクター。
【請求項19】
ＣＨＯ細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子が、当該遺伝子に含まれるロイシン残基に対応するコドンのうち、７０％以上のロイシン残基に対応するコドンがＴＴＡであるように改変された選択マーカー遺伝子である、請求項１７または１８に記載のベクター。
【請求項20】
ＣＨＯ細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子が、当該遺伝子に含まれるアラニン残基に対応するコドンのうち、７０％以上のアラニン残基に対応するコドンがＧＣＧであるように改変された選択マーカー遺伝子である、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項21】
ＣＨＯ細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子が、当該遺伝子に含まれるロイシン残基に対応するコドンがＴＴＡであるように、またはアラニン残基に対応するコドンが全てＧＣＧであるように改変された選択マーカー遺伝子である、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項22】
選択マーカー遺伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子およびブラストサイジン耐性遺伝子からなる群より選ばれる１の選択マーカー遺伝子である、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、目的タンパク質をコードするＤＮＡおよび選択マーカー遺伝子を含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクターを浮遊性の哺乳動物細胞に導入し、一対のトランスポゾン配列の間に挿入された遺伝子断片を該哺乳動物細胞の染色体に組込み、該目的タンパク質を生産する浮遊性の哺乳動物細胞を得て、該哺乳動物細胞を浮遊培養して該目的タンパク質を生産する方法、および該方法により目的タンパク質を発現する浮遊性の哺乳動物細胞に関する。【背景技術】
【0002】
遺伝子組換え技術による外来タンパク質の生産は、医薬品および食品業界など様々な産業に利用されている。多くの場合、組換えタンパク質の生産は、目的タンパク質をコードする塩基配列を含む発現ベクターを、大腸菌、酵母、昆虫細胞、植物細胞および動物細胞などの宿主に導入し、該発現ベクターが染色体へ組み込まれた形質転換株を選択し、さらに該形質転換株を適切な培養条件で培養して目的タンパク質を発現させることにより行われている。【0003】
しかし、外来タンパク質を効率よく生産できる宿主を開発するためには、目的とするタンパク質ごとに生産性の良い宿主細胞を選定することが必要であり、個々の宿主における外来タンパク質生産技術においてさらなる技術革新が望まれている。【0004】
大腸菌などの細菌または酵母の系では、動物細胞とは異なり糖鎖修飾など翻訳後修飾が困難であることが多く、活性を有するタンパク質を生産する上での問題となる。【0005】
昆虫細胞の系は、生産されたタンパク質が、リン酸化および糖鎖の付加など翻訳後修飾を受け、本来の生理活性を保持したまま発現させることができるというメリットをもつが、分泌タンパク質の糖鎖構造は哺乳類由来の細胞のものとは異なることから、医薬品用途とするには抗原性などが問題となる。【0006】
また、本系は外来遺伝子の導入に組換えウイルスを用いることから、安全性の点から、その不活性化または封じ込めが必要であるという課題がある。【0007】
動物細胞の系では、ヒトをはじめとする高等動物由来のタンパク質に対し、リン酸化、糖鎖付加、フォールディングなどの翻訳後修飾をより生体でつくられるものと同じように施すことが可能である。この正確な翻訳後修飾は、タンパク質の本来有する生理活性を組換えタンパク質で再現するために必要なものであり、そのような生理活性が必要とされる医薬品などには、哺乳動物細胞を宿主としたタンパク質生産系がよく用いられている。【0008】
しかしながら、動物細胞を宿主としたタンパク質発現系の生産性は一般に低く、導入遺伝子の安定性にも問題がある場合が多い。哺乳動物培養細胞を宿主としたタンパク質の生産性向上は、治療用医薬品または診断薬などの製造において非常に重要であるばかりでなく、それらの開発研究にも多いに寄与している。そのため、哺乳動物培養細胞、特にチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）を宿主として、容易に高生産株の獲得を可能にする遺伝子発現系の開発が急務とされている。【0009】
トランスポゾンは、染色体のひとつの遺伝子座から別の遺伝子座へ移動しうる転位性遺伝要素である。トランスポゾンは、分子生物学または遺伝学の研究において強力なツールであり、昆虫または線虫（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒまたはＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）および植物において、変異導入、遺伝子トラッピング、トランスジェニック個体の作製などの目的として利用されているが、このような技術は哺乳動物細胞を含む脊椎動物では開発が遅れていた。【0010】
ところが近年、脊椎動物においても活性のあるトランスポゾンが報告され、そのいくつかがマウスまたはヒトなどの哺乳動物細胞でも活性をもつことが確認された。代表的なものに、メダカからクローニングされたトランスポゾンＴｏｌ１（特許文献１）、Ｔｏｌ２（非特許文献１）、サケ科魚類ゲノムに存在していた非自立性のトランスポゾンから再構築されたＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ（非特許文献２）、カエル由来の人工トランスポゾンＦｒｏｇ ｐｒｉｎｃｅ（非特許文献３）、昆虫由来のトランスポゾンｐｉｇｇｙＢａｃ（非特許文献４）が挙げられる。【0011】
これらのＤＮＡトランスポゾンは、哺乳動物細胞のゲノムに新たな表現系を持ち込むための遺伝子導入ツールとして、変異導入、遺伝子トラッピング、トランスジェニック個体の作製、薬剤耐性タンパク質を発現させることなどに利用されるようになった（非特許文献５〜１２）。【0012】
昆虫においては、鱗翅目昆虫由来のトランスポゾンｐｉｇｇｙＢａｃを用いて、外来遺伝子をカイコ染色体へ導入し、その外来遺伝子がコードするタンパクを発現させる方法が研究され、その技術を用いたタンパク質生産方法が開示されている（特許文献２）。【0013】
しかし、発現させた目的タンパクの発現量が十分ではなく、かつ、カイコ全身に生産されるため、大量の夾雑タンパク質が存在する体液から発現させた外来タンパク質を高純度な形で回収するためには、高度な精製技術を必要とすることから、経済的に問題があった。【0014】
また、メダカ由来Ｔｏｌ２トランスポゾンを用いて、哺乳動物細胞にＧ４１８耐性に関わるタンパク質を発現させた例が知られている（非特許文献１２）。【0015】
高発現細胞を効率よくスクリーニングする方法の１つとして、選択マーカー遺伝子の減弱化が知られている。減弱化の方法としては、ネオマイシン耐性遺伝子におけるアミノ酸改変（非特許文献１３、非特許文献１４）、およびｄｈｆｒ遺伝子における不安定化配列の結合（非特許文献１５）などが知られている。または、減弱化した選択マーカー遺伝子を利用することにより高発現細胞の取得が可能であることも示されている。【0016】
しかし、一方で、減弱化により薬剤耐性細胞数が大幅に減ることも示されており、結果として、薬剤耐性細胞が全く得られない可能性もあり、効率的に高発現細胞をスクリーニングする方法の創出が依然として期待されている。【0017】
タンパク質をコードする遺伝子において、生物種により使用されるコドンに偏りがあることが知られており、このコドンの偏りを最適化することによってＣＨＯ細胞でのヒトエリスロポイエチンの発現が向上することが知られている（非特許文献１６）。【先行技術文献】
【特許文献】
【0018】
【特許文献1】国際公開２００８／０７２５４０号
【特許文献2】日本国特表２００１−５３２１８８号公報
【非特許文献】
【0019】
【非特許文献1】Ｎａｔｕｒｅ ３８３，３０（１９９６）
【非特許文献2】Ｃｅｌｌ ９１，５０１−５１０（１９９７）
【非特許文献3】Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１，６８７３−６８８１（２００３）
【非特許文献4】Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５，１４１−１５１（１９９６）
【非特許文献5】Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６６，８９５−８９９（２００４）
【非特許文献6】ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ．２，ｅ１６９ （２００６）
【非特許文献7】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５，１０７６９−１０７７３ （１９９８）
【非特許文献8】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：６７５９−６７６４ （２００１）
【非特許文献9】Ｎａｔｕｒｅ ４３６，２２１−２２６（２００５）
【非特許文献10】Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１，６８７３−６８８１（２００３）
【非特許文献11】Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３５，ｅ８７（２００７）
【非特許文献12】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０３，１５００８−１５０１３ （２００６）
【非特許文献13】Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８９，５３０−５３８（２００５）
【非特許文献14】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２９５，４９−５６（２００４）
【非特許文献15】Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ９，３０４−３１６（２００７）
【非特許文献16】Ｇｅｎｅ １９９，２９３−３０１（１９９７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0020】
目的タンパク質を生産、解析するためには、哺乳動物由来の培養細胞を用いて目的タンパク質を安定的に高発現する細胞株を選択しなければならないが、目的タンパク質を生産する細胞の作製および培養には、多大な労力と時間を要する。【0021】
また、これまでに、トランスポゾン配列を用いて哺乳動物細胞でタンパク質の発現を行うことは知られていたが、トランスポゾン配列を用いることで、タンパク質の生産系として利用できるようなタンパク質高発現細胞を作製すること、トランスポゾン配列を含んだ高生産細胞および該細胞を用いたタンパク質の生産方法については何ら知られてない。また、コドンを改変して薬剤耐性遺伝子の発現（翻訳）を抑制し、高発現細胞を得た例は知られていない。【0022】
上記のように哺乳動物培養細胞を用いて目的タンパク質を高発現するタンパク質生産系を効率的かつ且つ短期間に作製し、目的のタンパク質を高生産することが従来求められていた。加えて、遺伝子導入から生産株の樹立まで一貫して、動物由来の成分を一切用いることのない生産細胞の樹立が求められていた。【0023】
従って、本発明は、効率的に作製し得る目的タンパク質を高発現する細胞および該細胞を用いて目的タンパク質を生産する方法を提供することを目的とする。【課題を解決するための手段】
【0024】
本発明者らは、上述した課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、目的タンパク質をコードするＤＮＡおよび減弱化した選択マーカー遺伝子を含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクターを浮遊性の哺乳動物細胞に導入し、一対のトランスポゾン配列の間に挿入された遺伝子断片を浮遊性の哺乳動物細胞の染色体に組込むことにより、目的タンパク質を高発現する生産細胞を効率的に作製できること、さらに、これによって、目的タンパク質の高発現細胞株の作製期間を大幅に短縮できることを見出し、本発明を完成させるに至った。従って、本発明の目的は、外来遺伝子を高発現する生産細胞を効率的に作製し得る新規な生産細胞作製法および組換えタンパク質の生産法を提供することである。【0025】
すなわち、本発明は以下のとおりである。１．目的タンパク質をコードするＤＮＡおよび減弱化した選択マーカー遺伝子を含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクターを浮遊性の哺乳動物細胞に導入し、一対のトランスポゾン配列の間に挿入された遺伝子断片を該哺乳動物細胞の染色体に組込み、該目的タンパク質を生産する浮遊性の哺乳動物細胞を得て、且つ該哺乳動物細胞を浮遊培養して該目的タンパク質を生産する方法。
２．以下の（Ａ）および（Ｂ）の工程を含むことを特徴とする、目的タンパク質の生産方法。
（Ａ）以下のベクター（ａ）および（ｂ）を同時に浮遊性の哺乳動物細胞に導入し、一過性に発現させたトランスポゼースにより、一対のトランスポゾン配列の間に挿入された遺伝子断片を該哺乳動物細胞の染色体に組込み、目的タンパク質を発現する浮遊性の哺乳動物細胞を得る工程
（ａ）目的タンパク質をコードするＤＮＡおよび減弱化した選択マーカー遺伝子を含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター
（ｂ）前記トランスポゾン配列を認識し、かつ一対のトランスポゾン配列の間に挿入された遺伝子断片を染色体に転移させる活性を有するトランスポゼースをコードするＤＮＡを含むベクター
（Ｂ）前記目的タンパク質を発現する浮遊性の哺乳動物細胞を浮遊培養して、目的タンパク質を生産させる工程
３．浮遊性の哺乳動物細胞が、無血清培養で生存および増殖可能な浮遊性の哺乳動物細胞である、前項１または２に記載の方法。
４．浮遊性の哺乳動物細胞が、ＣＨＯ細胞を浮遊培養に馴化した浮遊性のＣＨＯ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ラットミエローマ細胞ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０（またはＹＢ２／０ともいう）および浮遊培養に馴化した浮遊性のマウスミエローマ細胞ＮＳ０から選ばれるいずれか１つの細胞である前項１〜３のいずれか１に記載の方法。
５．ＣＨＯ細胞がＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ、ＤＵＫＸＢ１１、ＣＨＯ／ＤＧ４４、Ｐｒｏ−３およびＣＨＯ−Ｓから選ばれるいずれか１つの細胞である前項４に記載の方法。
６．減弱化した選択マーカー遺伝子が、哺乳動物細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子である、前項１〜５のいずれか１に記載の方法。
７．哺乳動物細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子が、改変前の選択マーカー遺伝子と同一のアミノ酸配列をコードし、かつ当該哺乳動物細胞内で使用頻度の低いコドンを含むように改変された遺伝子である、前項６に記載の方法。
８．哺乳動物細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子が、改変前の選択マーカー遺伝子をコードする塩基配列の１０％以上を改変された遺伝子である、前項６または７に記載の方法。
９．哺乳動物細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子が、当該遺伝子遺伝子に含まれるロイシン残基に対応するコドンのうち、７０％以上のロイシン残基に対応するコドンがＴＴＡであるように改変された選択マーカー遺伝子である、前項６〜８のいずれか１に記載の方法。
１０．哺乳動物細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子が、当該遺伝子遺伝子に含まれるアラニン残基に対応するコドンのうち、７０％以上のアラニン残基に対応するコドンがＧＣＧであるように改変された選択マーカー遺伝子である、前項６〜９のいずれか１に記載の方法。
１１．哺乳動物細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子が、当該遺伝子遺伝子に含まれるロイシン残基に対応するコドンが全てＴＴＡであるように、またはアラニン残基に対応するコドンが全てＧＣＧであるように改変された選択マーカー遺伝子である、前項６〜１０のいずれか１に記載の方法。
１２．選択マーカー遺伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子およびブラストサイジン耐性遺伝子からなる群より選ばれる１の選択マーカー遺伝子である、前項１〜１１のいずれか１に記載の方法。
１３．一対のトランスポゾン配列が哺乳動物細胞で機能する一対のトランスポゾン由来の塩基配列である前項１〜１２のいずれか１に記載の方法。
１４．一対のトランスポゾン由来の塩基配列が、一対のＴｏｌ２由来の塩基配列である前項１３に記載の方法。
１５．一対のＴｏｌ２由来の塩基配列が、配列番号２で表される塩基配列および配列番号３で表される塩基配列である前項１４に記載の方法。
１６．一対のトランスポゾン由来の塩基配列が、配列番号３５で表される塩基配列および配列番号３６で表される塩基配列である前項１３に記載の方法。
１７．目的タンパク質をコードするＤＮＡおよび減弱化した選択マーカー遺伝子を含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端にトランスポゾン配列を含む発現ベクターが導入され、一対のトランスポゾン配列の間に挿入された遺伝子断片が染色体に組込まれ、かつ目的タンパク質を生産する浮遊性の哺乳動物細胞。
１８．以下のベクター（ａ）および（ｂ）を同時に導入されることで、一対のトランスポゾン配列の間に挿入された遺伝子断片が染色体に組込まれ、かつ目的タンパク質を生産する浮遊性の哺乳動物細胞。
（ａ）目的タンパク質をコードするＤＮＡと減弱化した選択マーカー遺伝子を含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含むタンパク質発現ベクター
（ｂ）該トランスポゾン配列を認識し、かつ一対のトランスポゾン配列の間に挿入された遺伝子断片を染色体に転移させる活性を有するトランスポゼース（転移酵素）をコードするＤＮＡを含むベクター
１９．無血清培養で生存および増殖可能な浮遊性の哺乳動物細胞である、前項１７または１８に記載の哺乳動物細胞。
２０．ＣＨＯ細胞を浮遊培養に馴化した浮遊性のＣＨＯ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ラットミエローマ細胞ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０（またはＹＢ２／０ともいう）および浮遊培養に馴化した浮遊性のマウスミエローマ細胞ＮＳ０から選ばれるいずれか１つの細胞である前項１７〜１９のいずれか１に記載の哺乳動物細胞。
２１．ＣＨＯ細胞が、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ、ＤＵＫＸＢ１１、ＣＨＯ／ＤＧ４４、Ｐｒｏ−３およびＣＨＯ−Ｓから選ばれるいずれか１つの細胞である前項２０に記載の哺乳動物細胞。
２２．減弱化した選択マーカー遺伝子が、哺乳動物細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子である、前項１７〜２１のいずれか１に記載の哺乳動物細胞。
２３．哺乳動物細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子が、改変前の選択マーカー遺伝子と同一のアミノ酸配列をコードし、かつ当該哺乳動物細胞内で使用頻度の低いコドンを含むように改変された遺伝子である、前項２２記載の哺乳動物細胞。
２４．哺乳動物細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子が、改変前の選択マーカー遺伝子をコードする塩基配列の１０％以上を改変された遺伝子である、前項２２または２３に記載の哺乳動物細胞。
２５．哺乳動物細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子が、当該遺伝子遺伝子に含まれるロイシン残基に対応するコドンのうち、７０％以上のロイシン残基に対応するコドンがＴＴＡであるように改変された選択マーカー遺伝子である、前項２２〜２４のいずれか１に記載の哺乳動物細胞。
２６．哺乳動物細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子が、当該遺伝子遺伝子に含まれるアラニン残基に対応するコドンのうち、７０％以上のアラニン残基に対応するコドンがＧＣＧであるように改変された選択マーカー遺伝子である、前項２２〜２５のいずれか１に記載の哺乳動物細胞。
２７．哺乳動物細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子が、当該遺伝子遺伝子に含まれるロイシン残基に対応するコドンが全てＴＴＡであるように、もしくはアラニン残基に対応するコドンが全てＧＣＧであるように改変された選択マーカー遺伝子である、前項２２〜２６のいずれか１に記載の哺乳動物細胞。
２８．選択マーカー遺伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子およびブラストサイジン耐性遺伝子からなる群より選ばれる１の選択マーカー遺伝子である、前項１７〜２７のいずれか１に記載の哺乳動物細胞。
２９．一対のトランスポゾン配列が哺乳動物細胞で機能する一対のトランスポゾン由来の塩基配列である前項１７〜２８のいずれか１に記載の哺乳動物細胞。
３０．一対のトランスポゾン由来の塩基配列が、一対のＴｏｌ２由来の塩基配列である前項２９に記載の哺乳動物細胞。
３１．一対のＴｏｌ２由来の塩基配列が、配列番号２で表される塩基配列および配列番号３で表される塩基配列である前項３０に記載の哺乳動物細胞。
３２．一対のトランスポゾン由来の塩基配列が、配列番号３５で表される塩基配列および配列番号３６で表される塩基配列である前項２９に記載の哺乳動物細胞。
３３．目的タンパク質をコードするＤＮＡおよび減弱化した選択マーカー遺伝子を含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター。
３４．一対のトランスポゾン配列が一対のＴｏｌ２由来の塩基配列である前項３３に記載の発現ベクター。
３５．一対のＴｏｌ２由来の塩基配列が、配列番号２で表される塩基配列および配列番号３で表される塩基配列である前項３４に記載の発現ベクター。
３６．減弱化した選択マーカー遺伝子が、哺乳動物細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子である、前項３３〜３５のいずれか１に記載のベクター。
３７．哺乳動物細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子が、改変前の選択マーカー遺伝子と同一のアミノ酸配列をコードし、かつ当該哺乳動物細胞内で使用頻度の低いコドンを含むように改変された遺伝子である、前項３６に記載のベクター。
３８．哺乳動物細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子が、改変前の選択マーカー遺伝子をコードする塩基配列の１０％以上を改変された遺伝子である、前項３６または３７に記載のベクター。
３９．哺乳動物細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子が、当該遺伝子遺伝子に含まれるロイシン残基に対応するコドンのうち、７０％以上のロイシン残基に対応するコドンがＴＴＡであるように改変された選択マーカー遺伝子である、前項３６〜３８のいずれか１に記載のベクター。
４０．哺乳動物細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子が、当該遺伝子遺伝子に含まれるアラニン残基に対応するコドンのうち、７０％以上のアラニン残基に対応するコドンがＧＣＧであるように改変された選択マーカー遺伝子である、前項３６〜３９のいずれか１に記載のベクター。
４１．哺乳動物細胞内における発現量が減少するように改変された選択マーカー遺伝子が、当該遺伝子遺伝子に含まれるロイシン残基に対応するコドンがＴＴＡであるように、またはアラニン残基に対応するコドンが全てＧＣＧであるように改変された選択マーカー遺伝子である、前項３６〜４０のいずれか１に記載のベクター。
４２．選択マーカー遺伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子およびブラストサイジン耐性遺伝子からなる群より選ばれる１の選択マーカー遺伝子である、前項３３〜４１のいずれか１に記載のベクター。
【発明の効果】
【0026】
本発明に係るタンパク質の生産方法は目的タンパク質を、哺乳動物細胞を用いて効率よく生産することができる。本発明の細胞は、遺伝子組み換えタンパク質を生産するためのタンパク質生産細胞として使用できる。【図面の簡単な説明】
【0027】
【発明を実施するための形態】
【0028】
本発明は、目的タンパク質をコードするＤＮＡおよび選択マーカー遺伝子を含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクターを浮遊性の哺乳動物細胞に導入し、一対（二つ）のトランスポゾン配列の間に挿入された遺伝子断片を該哺乳動物細胞の染色体に組込み、目的タンパク質を生産する浮遊性の哺乳動物細胞を得て、該哺乳動物細胞を浮遊培養して該目的タンパク質を生産する方法、および目的タンパク質を生産する浮遊性の哺乳動物細胞に関する。【0029】
本発明の目的タンパク質を生産する細胞としては、目的タンパク質をコードするＤＮＡおよび選択マーカー遺伝子を含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクターが導入され、一対のトランスポゾン配列の間に挿入された遺伝子断片が染色体に組込まれ、かつ目的タンパク質を生産する浮遊性の哺乳動物細胞が挙げられる。 【0030】
また、本発明の目的タンパク質を生産する細胞としては、以下の（ａ）および（ｂ）のベクターを同時に導入されることで、一対のトランスポゾン配列の間に挿入された遺伝子断片が染色体に組込まれ、かつ目的タンパク質を生産する浮遊性の哺乳動物細胞が挙げられる。（ａ）目的タンパク質をコードするＤＮＡと選択マーカー遺伝子を含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター
（ｂ）前記トランスポゾン配列を認識し、かつ一対のトランスポゾン配列の間に挿入された遺伝子断片を染色体に転移させる活性を有するトランスポゼースをコードするＤＮＡを含むベクター
【0031】
本発明の目的タンパク質を生産する方法としては、以下の（Ａ）および（Ｂ）の工程を含むことを特徴とする、目的タンパク質の生産方法を挙げることができる。
（Ａ）以下の発現ベクター（ａ）および（ｂ）を同時に浮遊性の哺乳動物細胞に導入し、一過性に発現させたトランスポゼースにより、一対のトランスポゾン配列の間に挿入された遺伝子断片を該哺乳動物細胞の染色体に組込み、該目的タンパク質を発現する浮遊性の哺乳動物細胞を得る工程；
（ａ）目的タンパク質をコードするＤＮＡと選択マーカー遺伝子を含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター
（ｂ）前記トランスポゾン配列を認識し、かつ一対のトランスポゾン配列の間に挿入された遺伝子断片を染色体に転移させる活性を有するトランスポゼースをコードするＤＮＡを含むベクター
（Ｂ）前記目的タンパク質を発現する浮遊性の哺乳動物細胞を浮遊培養して、目的タンパク質を生産させる工程
【0032】
本明細書中で使用される用語は、以下の定義を含むものとする。【0033】
トランスポゾンとは、転位性遺伝要素であり、一定の構造を保ったまま染色体上を、または染色体から別の染色体へ転位（ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）する遺伝子単位を意味する。【0034】
トランスポゾンは、遺伝子単位の両端に逆向きまたは同じ向きの繰り返しのトランスポゾン配列［Ｉｎｖｅｒｔｅｄ Ｒｅｐｅａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＩＲ配列）またはＴｅｒｍｉｎａｌ Ｉｎｖｅｒｔｅｄ Ｒｅｐｅａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＴＩＲ配列）ともいう］および、このトランスポゾン配列を認識して、トランスポゾン配列の間に存在する遺伝子を転移させるトランスポゼースをコードする塩基配列を有している。【0035】
トランスポゾンから翻訳されたトランスポゼースは、トランスポゾンの両端のトランスポゾン配列を認識し、一対のトランスポゾン配列の間に挿入されたＤＮＡ断片を切り出し、転移先へ挿入することで、ＤＮＡの転移を行うことができる。【0036】
トランスポゾン配列とは、トランスポゼースによって認識されるトランスポゾンの塩基配列を意味し、ＩＲ配列またはＴＩＲ配列と同義である。該配列は、トランスポゼースの作用により転移（ゲノム中のほかの位置に挿入）可能であれば、不完全な繰り返し部分を含んでいてもよく、トランスポゼースに特異的なトランスポゾン配列が存在する。【0037】
本発明で用いるトランスポゾン配列は、トランスポゼースにより認識され哺乳動物細胞内で転位可能な天然または人工のトランスポゾン配列であればいずれのものでもよいが、例えば、メダカ由来のＴｏｌ１、Ｔｏｌ２トランスポゾン、サケ科魚類ゲノムに存在していた非自律性のトランスポゾンから再構築されたＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ、カエル由来の人工トランスポゾンＦｒｏｇ Ｐｒｉｎｃｅおよび昆虫由来のトランスポゾンｐｉｇｇｙＢａｃ由来の塩基配列が挙げられる。【0038】
これらの中でも、配列表の配列番号６で表される塩基配列からなるメダカ由来Ｔｏｌ２トランスポゾン由来の塩基配列が好ましい。一対のＴｏｌ２トランスポゾン由来の塩基配列としては、配列表の配列番号６で表されるＴｏｌ２トランスポゾンの塩基配列の１番目から２２２９番目の塩基配列および４１４８番目から４６８２番目の塩基配列が挙げられる。【0039】
一対のＴｏｌ２トランスポゾン由来の塩基配列としては、より好ましくは、配列表の配列番号１で表される塩基配列からなるＴｏｌ２トランスポゾンの塩基配列における、１番目から２００番目の塩基配列（配列番号２）（以下、Ｔｏｌ２−Ｌ配列と記載する）と、２２８５番目から２７８８番目の塩基配列（配列番号３）（以下、Ｔｏｌ２−Ｒ配列と記載する）が挙げられる。 【0040】
本発明のトランスポゾン配列として、配列表の配列番号３７で表される塩基配列からなるメダカ由来Ｔｏｌ１トランスポゾン由来の塩基配列もまた用いることができる。一対のＴｏｌ１トランスポゾン由来の塩基配列としては、配列表の配列番号３７で表される塩基配列からなるＴｏｌ１トランスポゾン由来の塩基配列における、１番目から１５７番目の塩基配列および１７４８番目から１８５５番目の塩基配列が挙げられる。【0041】
一対のＴｏｌ１トランスポゾン由来の塩基配列として、より好ましくは、配列表の配列番号３７で表される塩基配列からなるＴｏｌ１トランスポゾン由来の塩基配列のうち、１番目から２００番目の領域（配列番号３５）（以下、Ｔｏｌ１−Ｌ配列と記載する）と、１３５１番目から１８５５番目の領域（配列番号３６）（以下、Ｔｏｌ１−Ｒ配列と記載する）の配列が挙げられる。【0042】
また、本発明のトランスポゾン配列としては、上記のトランスポゾンに特異的なトランスポゾン配列の部分配列を用いること、塩基配列の長さを調節すること、および塩基配列の付加、欠失または置換による改変を行うことで、転移反応が制御されたトランスポゾン配列も含まれる。転移反応の制御とは、トランスポゼースによる認識を高めることまたは逆に低下させることによって、転移反応を促進すること、および転移反応を抑制することいずれも可能である。【0043】
トランスポゼースとは、トランスポゾン配列を有する塩基配列を認識して、該塩基配列の間に存在する遺伝子断片を染色体上、または染色体から別の染色体へ転位させる酵素を意味する。【0044】
トランスポゼースとしては、例えば、メダカ由来のＴｏｌ１、Ｔｏｌ２、サケ科魚類ゲノムに存在していた非自立性のトランスポゾンから再構築されたＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ、カエル由来の人工トランスポゾンＦｒｏｇ Ｐｒｉｎｃｅ、昆虫由来のトランスポゾンｐｉｇｇｙＢａｃ由来の酵素が挙げられる。【0045】
トランスポゼースは、天然型の酵素を用いてもよいし、トランスポゼースと同様の転位活性を保持していれば、その一部のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または、付加されていてもよい。トランスポゼースの酵素活性を制御することで、トランスポゾン配列の間に存在するＤＮＡの転移反応を制御することができる。【0046】
トランスポゼースと同様の転移活性を保持するかを解析するには、日本国特開２００３−２３５５７５号公報により開示されている２−コンポーネント解析システムにより測定することができる。具体的には、別々の、Ｔｏｌ２トランスポゼースを欠損したＴｏｌ２トランスポゾン（Ｔｏｌ２由来非自律性トランスポゾン）を含むプラスミドとＴｏｌ２トランスポゼースを含むプラスミドを用いて、トランスポゼースの作用により非自律性Ｔｏｌ２エレメントが哺乳動物細胞の染色体内に転移、挿入し得るかを解析することができる。【0047】
本発明において非自律性トランスポゾンとは、トランスポゾン内に存在するトランスポゼースを欠損し、自律的には転移し得ないトランスポゾンをいう。非自律性トランスポゾンは、トランスポゼースのタンパク質、トランスポゼースのタンパク質をコードするｍＲＮＡまたはトランスポゼースのタンパク質をコードするＤＮＡを細胞内に同時に存在させることで、非自律性トランスポゾンのトランスポゾン配列の間に挿入されたＤＮＡを、宿主細胞の染色体内に転移させることができる。【0048】
トランスポゼース遺伝子とは、トランスポゼースをコードした遺伝子を意味する。哺乳動物細胞での発現効率を向上させるために、該遺伝子の翻訳開始コドンＡＴＧの上流に、ｋｏｚａｋのコンセンサス配列（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２，８５７−８７２，１９８４）、またはリボソーム結合配列であるシャイン・ダルガルノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節した配列が連結されてもよい。【0049】
本発明において、発現ベクターを宿主細胞の染色体に組み込むためには、発現ベクターに対してトランスポゼースを作用させる。トランスポゼースを細胞に作用させるためには、トランスポゼース酵素を細胞内に注入してもよいし、トランスポゼース遺伝子をコードするＤＮＡを所望の発現ベクターに組み込み、細胞にトランスフェクションしてもよい。または、トランスポゼース遺伝子をコードするＲＮＡを細胞内にトランスフェクションして、トランスポゼースを細胞内で発現させてもよい。【0050】
ここで用いることができるベクターは特に限定はなく、トランスポゼース遺伝子を組み込んだベクターが導入される宿主細胞、用途などに応じて、当業者において知られている発現ベクターから適宜選択して使用することができる。【0051】
本発明において、２以上のポリペプチドから構成されるタンパク質を生産する場合には、２以上のポリペプチドをコードするＤＮＡを同一のまたは異なる発現ベクターに組み込み、当該発現ベクターを宿主細胞の染色体に組み込んで用いてもよい。具体的には、抗体の重鎖と軽鎖を異なる発現ベクターに組み込み、当該発現ベクターを宿主細胞の染色体に組み込んで用いることが考えられる。【0052】
トランスポゼースは、発現ベクターに組み込まれて目的タンパク質と一緒に発現させてもよいし、発現ベクターとは別のベクターに組み込まれていてもよい。トランスポゼースは一過性に働かせてもいいし、継続的に働かせてもよいが、安定した産生細胞を作製するためにはトランスポゼースを一過性に働かせることが好ましい。【0053】
トランスポゼースを一過性に働かせるためには、例えば、目的タンパク質を有する発現ベクターとは別の発現プラスミドにトランスポゼース遺伝子を組み込んで細胞にトランスフェクションさせることによって行うことができる。【0054】
発現ベクターとは、目的タンパク質を発現させるために、哺乳動物細胞を形質転換させるために用いる発現ベクターを意味する。本発明で用いる発現ベクターは、発現カセットの両側に少なくとも１対のトランスポゾン配列が存在する構造を有する。【0055】
発現カセットとは、目的タンパク質を発現させるために必要な遺伝子発現制御領域および目的タンパク質をコードする配列を有する核酸配列を意味する。遺伝子発現制御領域としては、例えば、エンハンサー、プロモーターおよびターミネーターなどが挙げられる。発現カセットには、選択マーカー遺伝子を含んでいてもよい。【0056】
プロモーターとしては、哺乳動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター、モロニーマウス白血病ウイルス（ｍｏｌｏｎｅｙ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）のプロモーターおよびエンハンサー等が挙げられる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。【0057】
選択マーカー遺伝子とは、プラスミドベクターが導入された細胞と該ベクターを欠く細胞とを区別するために使用することができる任意のマーカー遺伝子を意味する。選択マーカー遺伝子としては、例えば、薬剤耐性遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ＤＨＦＲ遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子およびハイグロマイシン耐性遺伝子）、および、蛍光または生体発光マーカー遺伝子（例えば、緑色蛍光タンパクＧＦＰなど）などが挙げられる。【0058】
減弱化した選択マーカー遺伝子とは、選択マーカー遺伝子にコードされるタンパク質の細胞内における活性が低くなるように改変された選択マーカー遺伝子をいう。【0059】
細胞内における活性が低くなるように改変された選択マーカー遺伝子としては、（Ａ）選択マーカー遺伝子にコードされるタンパク質のアミノ酸配列の改変により当該タンパク質の細胞内における活性が低くなった選択マーカー遺伝子または（Ｂ）選択マーカー遺伝子の発現を制御する塩基配列の改変もしくは選択マーカー遺伝子のＯＲＦ（Ｏｐｅｎ Ｒｅａｄｉｎｇ Ｆｒａｍｅ）内の塩基配列の改変により当該タンパク質の細胞内での発現量が低下した選択マーカー遺伝子を挙げることができる。【0060】
選択マーカー遺伝子にコードされるタンパク質のアミノ酸配列の改変により当該タンパク質の細胞内における活性が低くなった選択マーカー遺伝子の例としては、例えば、Ｓａｕｔｅｒ ｅｔ ａｌ．［Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８９，５３０−５３８（２００５）］またはＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２９５，４９−５６（２００４）］に記載のネオマイシン耐性遺伝子を挙げることができる。【0061】
選択マーカー遺伝子の発現を制御する塩基配列を改変することにより当該タンパク質の細胞内での発現量を低下させる方法としては、例えば、選択マーカー遺伝子の発現を制御するプロモーター配列、ターミネーター配列、エンハンサー配列、ｋｏｚａｋのコンセンサス配列またはシャイン・ダルガルノ配列の配列を改変する方法が挙げられる。【0062】
より具体的には、例えば、選択マーカー遺伝子の発現を制御するプロモーター配列を、より弱いプロモーター配列に置換する方法が挙げられる。【0063】
選択マーカー遺伝子のＯＲＦ内の塩基配列の改変により当該タンパク質の細胞内での発現量を低下させる方法としては、当該ＯＲＦ内のコドンを当該細胞内での使用頻度がより低い同義語コドンに置換する方法を挙げることができる。【0064】
本発明の減弱化した選択マーカー遺伝子としては、上記の当該遺伝子のＯＲＦ内のコドンを当該細胞内での使用頻度がより低い同義語コドンに置換された選択マーカー遺伝子を挙げることができる。【0065】
様々な生物種の細胞内において、各同義語コドンのうち使用頻度のより低い同義語コドンは、公知の文献またはデータベースなどに基づき選択することができる。【0066】
このような使用頻度の低い同義語コドンへの置換として具体的には、例えば、ＣＨＯ細胞の場合、ロイシンのコドンをＴＴＡに、アルギニンのコドンをＣＧＡもしくはＣＧＴに、アラニンのコドンをＧＣＧに、バリンのコドンをＧＴＡに、セリンのコドンをＴＣＧに、イソロイシンのコドンをＡＴＡに、スレオニンのコドンをＡＣＧに、プロリンをＣＣＧに、グルタミン酸のコドンをＧＡＡに、チロシンのコドンをＴＡＴに、リジンのコドンをＡＡＡに、フェニルアラニンのコドンをＴＴＴに、ヒスチジンのコドンをＣＡＴに、グルタミンのコドンをＣＡＡに、アスパラギンのコドンをＡＡＴに、アスパラギン酸のコドンをＧＡＴに、システインのコドンをＴＧＴに、またはグリシンのコドンをＧＧＴに、置換することをいう。【0067】
減弱化した選択マーカー遺伝子において、改変前の選択マーカー遺伝子と比べて置換されるコドンの数は、タンパク質の生産細胞を効率的に取得しうる限り特に制限はないが、２０個以上のアミノ酸残基に対応するコドンを置換することが好ましい。【0068】
減弱化した選択マーカー遺伝子において、改変前の選択マーカー遺伝子と比べて改変される塩基の数は、特に制限はないが、選択マーカー遺伝子をコードする塩基配列の１０％以上を改変することが好ましい。【0069】
また、減弱化した選択マーカー遺伝子において置換するコドンのコードするアミノ酸残基は、特に制限はないが、好ましくはロイシン、アラニン、セリンおよびバリンを挙げることができる。【0070】
減弱化した選択マーカー遺伝子において、ロイシン残基に対応するコドンを置換する場合は、特に制限はないが、選択マーカー遺伝子に含まれる全てのロイシン残基に対応するコドンのうち、７０％以上のロイシン残基に対応するコドンを置換することが好ましい。また減弱化した選択マーカー遺伝子において、アラニン残基に対応するコドンを置換する場合は、特に制限はないが、選択マーカー遺伝子に含まれる全てのアラニン残基に対応するコドンのうち、７０％以上のアラニン残基に対応するコドンを置換することが好ましい【0071】
このような使用頻度の低い同義語コドンに置換することにより改変して得られる、減弱化した選択マーカー遺伝子としては、具体的には、例えば、配列番号９、１１または１３で表される塩基配列からなるネオマイシン耐性遺伝子、配列番号２１、２３または２５で表される塩基配列からなるピューロマイシン耐性遺伝子、配列番号２７または２９で表される塩基配列からなるゼオシン耐性遺伝子、配列番号３１または３３で表される塩基配列からなるハイグロマイシン耐性遺伝子を挙げることができる。【0072】
さらに、抗体生産細胞の作製において薬剤耐性細胞を選択する際の薬剤の濃度を通常用いられる濃度に比べ、著しく高くすること、または薬剤耐性遺伝子が薬剤を代謝・分解する前に追加投与することなどによっても、選択マーカー遺伝子を減弱化することが可能である。【0073】
宿主細胞に、上記のトランスポゾン配列を含む発現ベクター、トランスポゼースを発現するプラスミドベクターまたはＲＮＡを導入する方法としては、特に限定はなく、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、ジーンガン法、リポフェクション法などが挙げられるトランスポゼースを直接タンパク質として導入する場合は、例えば、マイクロインジェクション法またはエンドサイトーシスによる細胞への供給を利用する方法が挙げられる。遺伝子導入は、新遺伝子工学ハンドブック、村松正實・山本雅／編、羊土社、ＩＳＢＮ ９７８４８９７０６３７３７記載の方法で行うことができる。【0074】
宿主細胞としては、継代培養が可能で安定的に目的タンパク質を発現することができる哺乳動物細胞が挙げられる。【0075】
具体的な宿主細胞としては、例えば、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ヒト白血病細胞Ｎａｍａｌｗａ細胞、サル細胞ＣＯＳ細胞、ラットミエローマ細胞ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０（またはＹＢ２／０ともいう）、マウスミエローマ細胞ＮＳ０、マウスミエローマ細胞ＳＰ２／０−Ａｇ１４、シリアンハムスター細胞ＢＨＫ、ＨＢＴ５６３７（日本国特開昭６３−０００２９９号公報）チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ細胞［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１０８，９４５（１９５８）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０，１２７５（１９６８）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５５，５１３（１９６８）；Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ，４１，１２９（１９７３）；Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１８，１１５（１９９６）；ＲａｄｉａｔｉｏｎＲｅｓｅａｒｃｈ，１４８，２６０（１９９７）； Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６（１９８０）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，６０，１２７５（１９６８）；Ｃｅｌｌ，６，１２１（１９７５）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ａｐｐｅｎｄｉｘ Ｉ，ＩＩ（ｐｐ．８８３−９００）］、ＣＨＯ／ＤＧ４４（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−９０９６）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）、ＤＵＫＸＢ１１ （ＡＴＣＣ ＣＣＬ−９０９６）、Ｐｒｏ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１７８１）、ＣＨＯ−Ｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｔ ＃ １１６１９）、Ｐｒｏ−３、およびＣＨＯ細胞の亜株を挙げることができる。【0076】
また、上記の宿主細胞は、染色体ＤＮＡの改変および外来性遺伝子の導入等により、タンパク質の生産に適するように改変して、本発明のタンパク質の生産方法に用いることもできる。【0077】
更に、本発明において、生産する目的タンパク質に結合した糖鎖構造を制御するために、レクチン耐性を獲得したＬｅｃ１３［Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２，５５（１９８６）］またはα１，６−フコース転移酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞（国際公開第０５／３５５８６号、国際公開第０２／３１１４０号）を、本発明の目的タンパク質を生産する宿主細胞として用いることもできる。【0078】
本発明において生産する目的タンパク質は、本発明の非自立性トランスポゾンを用いたタンパク質の生産方法を用いて発現可能であれば、いかなるタンパク質でもよい。具体的には、例えば、ヒト血清タンパク質、ペプチドホルモン、増殖因子、サイトカイン、血液凝固因子、線溶系タンパク質、抗体および各種タンパク質の部分断片などが挙げられる。【0079】
本発明において生産する目的タンパク質として、好ましくはキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体などのモノクローナル抗体、Ｆｃ融合タンパク質、アルブミン結合タンパク質および該部分断片などを挙げることができる。【0080】
本発明において生産されるモノクローナル抗体のエフェクター活性は、種々の方法で制御することができる。例えば、抗体のＦｃ領域の２９７番目のアスパラギン（Ａｓｎ）に結合するＮ結合複合型糖鎖の還元末端に存在するＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）にα−１，６結合するフコース（コアフコースともいう）の量を制御する方法（国際公開第０５／０３５５８６号、国際公開第０２／３１１４０号、国際公開第００／６１７３９号）、または抗体のＦｃ領域のアミノ酸残基を改変することで制御する方法などが知られている。本発明において生産されるモノクローナル抗体にはいずれの方法を用いても、エフェクター活性を制御することができる。【0081】
エフェクター活性とは、抗体のＦｃ領域を介して引き起こされる抗体依存性の活性をいい、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）、補体依存性傷害活性（ＣＤＣ活性）、およびマクロファージまたは樹状細胞などの食細胞による抗体依存性ファゴサイトーシス（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ、ＡＤＰ活性）などが知られている。【0082】
また、本発明において生産されるモノクローナル抗体のＦｃのＮ結合複合型糖鎖のコアフコースの含量を制御することで、抗体のエフェクター活性を増加または低下させることができる。抗体のＦｃに結合しているＮ結合複合型糖鎖に結合するフコースの含量を低下させる方法としては、α１，６−フコース転移酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞を用いて抗体を発現することで、フコースが結合していない抗体を取得することができる。【0083】
フコースが結合していない抗体は高いＡＤＣＣ活性を有する。一方、抗体のＦｃに結合しているＮ結合複合型糖鎖に結合するフコースの含量を増加させる方法としては、α１，６−フコース転移酵素遺伝子を導入した宿主細胞を用いて抗体を発現させることで、フコースが結合している抗体を取得できる。フコースが結合している抗体は、フコースが結合していない抗体よりも低いＡＤＣＣ活性を有する。【0084】
また、抗体のＦｃ領域のアミノ酸残基を改変することでＡＤＣＣ活性またはＣＤＣ活性を増加または低下させることができる。例えば、米国特許出願公開第２００７／０１４８１６５号明細書に記載のＦｃ領域のアミノ酸配列を用いることで、抗体のＣＤＣ活性を増加させることができる。また、米国特許第６，７３７，０５６号明細書、米国特許第７，２９７，７７５号明細書、または米国特許第７，３１７，０９１号明細書に記載のアミノ酸改変を行うことで、ＡＤＣＣ活性またはＣＤＣ活性を、増加させることも低下させることもできる。【0085】
本発明で用いられる浮遊性の哺乳動物細胞とは、マイクロビーズまたは組織培養用培養器（組織培養または接着培養容器などともいう）などの、培養細胞が接着し易くコーティングされた細胞培養支持体に接着せずに、培養液中に浮遊して生存および増殖できる細胞のことをいう。細胞培養支持体に細胞が接着しなければ、培養液中において１つの細胞の状態で生存、増殖してもよく、または細胞同士が複数凝集した細胞塊の状態で生存、増殖していても、いずれの状態でもよい。【0086】
更に本発明で用いられる浮遊性の哺乳動物細胞としては、ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ、以下ＦＣＳと記す）などが含まれていない無血清培地中で、細胞培養支持体に接着せず培養液中に浮遊して生存および増殖できる細胞が好ましく、より好ましくはタンパク質が含まれていない無タンパク質培地中で、浮遊して生存および増殖できる哺乳動物細胞が挙げられる。【0087】
組織培養用培養器としては、接着培養用のコーティングがなされているフラスコ、シャーレ等であればいかなる培養器でもよく、具体的には、市販されている組織培養フラスコ（グライナー社製）、接着培養フラスコ（住友ベークライト社製）などを用いることで、浮遊性の哺乳動物細胞であることが確認できる。【0088】
本発明で用いられる浮遊性の哺乳動物細胞としては、元来浮遊性の性質を有する浮遊培養に馴化された細胞でもよいし、接着性の哺乳動物細胞を浮遊性の培養条件に馴化させた浮遊性の哺乳動物細胞いずれのものでもよい。元来浮遊性の性質を有する哺乳動物細胞としては、例えば、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ラットミエローマ細胞ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０（またはＹＢ２／０ともいう）およびＣＨＯ−Ｓ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）などが挙げられる。【0089】
本発明において、接着性の哺乳動物細胞を浮遊性の培養条件に馴化させた浮遊性の哺乳動物細胞は、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０００，１５（３），２４９−５７記載の方法、または以下に示す方法などで作製することができ、浮遊培養馴化前と同様、またはそれより優れた増殖、生存した細胞を確立することで作製することができる（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７，１３０（３），２８２−９０）。【0090】
浮遊培養馴化前と同等とは、浮遊培養に馴化された細胞の生存率、増殖速度（倍化時間）などが、浮遊培養馴化前の細胞と比べて、実質的に同じであることを意味する。【0091】
本発明において接着性の哺乳動物細胞を浮遊性の培養条件に馴化させる方法としては、例えば、血清含有の培地の血清含量を１／１０に減らし、比較的高い細胞濃度で継代培養を繰り返し、哺乳動物細胞が生存、増殖できるようになった時点で、更に血清含量を斬減して、継代培養を繰り返すことで、非血清下で生存、増殖可能な浮遊性の哺乳動物細胞を作製する方法を挙げることができる。【0092】
また、培養液中に適当な非イオン性界面活性剤Ｐｌｕｒｏｎｉｃ−Ｆ６８などを添加して培養することでも、浮遊性の哺乳動物細胞を作製することができる。接着性の哺乳動物細胞を浮遊性の培養条件に馴化させた浮遊性の哺乳動物細胞としては、例えば、マウスミエローマ細胞ＮＳ０またはＣＨＯ細胞などが挙げられる。【0093】
本発明において、浮遊性のＣＨＯ細胞は、細胞を２×１０５細胞／ｍＬで浮遊培養を行った場合、３〜４日間後の培養終了時の細胞密度が、５×１０５細胞／ｍＬ以上、好ましくは８×１０５細胞／ｍＬ以上、より好ましくは１×１０６細胞／ｍＬ以上、最も好ましくは１．５×１０６細胞／ｍＬ以上になる性質を有することが好ましい。また、本発明の浮遊性のＣＨＯ細胞の倍化時間としては、好ましくは４８時間以下、より好ましくは２４時間以下、更に好ましくは１８時間以下、最も好ましくは１１時間以下である。【0094】
浮遊培地としては、例えば、ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＥＸ−ＣＥＬＬ ３２５−ＰＦ培地（ＳＡＦＣ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＳＦＭ４ＣＨＯ培地（ＨｙＣｌｏｎｅ社）など市販の培地が挙げられる。また、例えば、ＣＨＯ細胞培養に必要な糖類、アミノ酸類、ビタミン類および金属塩類などを配合し、調製することによっても得られる。【0095】
浮遊培養は、浮遊培養が可能な培養容器を用いて、浮遊培養が可能な培養条件によって行うことができる。培養容器としては、例えば、細胞培養用の９６穴プレート（コーニング社）、Ｔ−フラスコ（ベクトン・ディッキンソン社）および三角フラスコ（コーニング社）などが挙げられる。【0096】
培養条件としては、例えば、５％ ＣＯ２雰囲気中、培養温度３７℃で静置培養などによって行うことができる。浮遊培養専用の培養設備であるＷａｖｅバイオリアクター（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）などの振とう培養装置などを用いることもできる。【0097】
Ｗａｖｅバイオリアクター装置を用いたＣＨＯ細胞の浮遊培養条件についてはＧＥヘルスケアバイオサイエンス社ホームページｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏ．ｊｐ／ｔｅｃｈ＿ｓｕｐｐｏｒｔ／ｍａｎｕａｌ／ｐｄｆ／ｃｅｌｌｃｕｌｔ／ｗａｖｅ＿０３＿１６．ｐｄｆに記載の方法で行うことができる。【0098】
振とう培養の他、バイオリアクターなどの旋回撹拌装置による培養も可能である。バイオリアクターでの培養は、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００６）５２：１９９−２０７に記載の方法などで行うことができる。【0099】
本発明において浮遊性のＣＨＯ細胞以外の細胞株を選択した場合、上述のような浮遊培養に馴化させた細胞株であり、かつ本発明のタンパク質生産方法を用いることができ、いずれの細胞株も応用可能である。【0100】
培養細胞で生産したタンパク質の精製はタンパク質を含む培養液または細胞破砕液から目的タンパク質と目的外の不純物を分離することによって行う。分離の方法としては、例えば、遠心、透析、硫安沈殿、カラムクロマトグラフィーまたはフィルターなどが挙げられ、目的タンパク質と不純物の物理化学的性質の違いまたはカラム単体への結合力の違いによって行うことができる。【0101】
タンパク質精製の方法は、タンパク質実験ノート（上）抽出・分離と組換えタンパク質の発現（羊土社、岡田雅人・宮崎香／編、ＩＳＢＮ ９７８４８９７０６９１８０）に記載の方法によって行うことができる。【0102】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。【0103】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。したがって、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、請求の範囲によってのみ限定される。【0104】
以下に実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例の記載に限定されるものではない。【0105】
以降に記述するクローニング等、遺伝子組換えに関する各種実験技術については、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著；モレキュラー クローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）、及びＦｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ発行、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ等に記載の遺伝子工学的方法に準じて行った。【実施例】
【0106】
［実施例１］ネオマイシン耐性遺伝子および抗ヒトＣＤ９８抗体を発現するトランスポゾンベクターの作製（１）野生型ネオマイシン耐性遺伝子および抗ヒトＣＤ９８抗体を発現するトランスポゾンベクターの作製
タンパク質発現用プラスミドベクターには、一対のＴｏｌ２由来の塩基配列の間に挿入された任意のヒト抗体遺伝子および薬剤耐性マーカー遺伝子を含む、哺乳動物細胞用遺伝子発現カセットを含むプラスミドを用いた。
【0107】
用いた遺伝子のＤＮＡは既知の塩基配列をもとに、人工的に化学合成するか、またはその両端配列のプライマーを作製し、適当なＤＮＡソースを鋳型としてＰＣＲを行うことにより取得した。プライマーの端には後の遺伝子操作のために制限酵素切断部位を付加した。トランスポゾン配列は、日本国特開２００３−２３５５７５号公報により開示されている非自律性Ｔｏｌ２トランスポゾンの塩基配列（配列番号１）のうち、１番目から２００番目の塩基配列（Ｔｏｌ２−Ｌ配列）（配列番号２）と、２２８５番目から２７８８番目の塩基配列（Ｔｏｌ２−Ｒ配列）（配列番号３）の塩基配列を用いた。
【0108】
Ｔｏｌ２−Ｒ配列またはＴｏｌ２−Ｌ配列を含むＤＮＡ断片をそれぞれ合成して用いた。【0109】
抗体重鎖遺伝子発現カセットとして、抗ヒトＣＤ９８抗体Ｎ５ＫＧ１−Ｖａｌ Ｃ２ＩｇＧ１ＮＳ／Ｉ１１７Ｌベクター（日本国特許第４３２４６３７号公報）をもとに増幅した、ＣＭＶプロモーター制御下に抗体Ｈ鎖をコードする塩基配列（配列番号１５）を含むＤＮＡ断片を、抗体軽鎖遺伝子発現カセットとして抗ヒトＣＤ９８抗体Ｎ５ＫＧ１−Ｖａｌ Ｃ２ＩｇＧ１ＮＳ／Ｉ１１７Ｌベクターをもとに増幅した、ＳＶ４０プロモーター制御下に抗体軽鎖をコードする塩基配列（配列番号１７）を含むＤＮＡ断片を調製した。【0110】
ネオマイシン耐性遺伝子発現カセットとしては、ＳＶ４０プロモーター制御下にネオマイシン耐性遺伝子をコードする塩基配列からなるＤＮＡ（配列番号７および、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． Ｕ４７１２０．２で表される塩基配列からなるネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ）を有するＤＮＡ断片を調製した。【0111】
上記の抗体重鎖遺伝子発現カセット、抗体軽鎖遺伝子発現カセットおよびネオマイシン耐性遺伝子発現カセットを連結し、さらにその両端にＴｏｌ２−Ｒ配列を含むＤＮＡ断片およびＴｏｌ２−Ｌ配列を含むＤＮＡ断片を連結し、抗ヒトＣＤ９８抗体発現ベクターＡを作製した（図１）。【0112】
（２）改変型ネオマイシン耐性遺伝子１を有する抗ヒトＣＤ９８抗体発現トランスポゾンベクターの作製（１）で得られた野生型ネオマイシン耐性遺伝子を有する抗ヒトＣＤ９８抗体発現トランスポゾンベクターＡのネオマイシン耐性遺伝子を、配列番号９で表される塩基配列からなる改変型ネオマイシン耐性遺伝子１に置換した抗ヒトＣＤ９８抗体発現トランスポゾンベクターＢを作製した。
【0113】
改変型ネオマイシン耐性遺伝子１は、野生型ネオマイシン耐性遺伝子と同一のアミノ酸配列をコードし、かつ全体の２２％にあたる１６７塩基を改変した。具体的には、全３２個のロイシン残基のうち、２５個のロイシン残基に対応するコドンをＴＴＡとなるように改変した。
【0114】
（３）改変型ネオマイシン耐性遺伝子２を有する抗ヒトＣＤ９８抗体発現トランスポゾンベクターの作製（１）で得られた野生型ネオマイシン耐性遺伝子を有する抗ヒトＣＤ９８抗体発現トランスポゾンベクターＡのネオマイシン耐性遺伝子を、配列番号１１で表される塩基配列からなる改変型ネオマイシン耐性遺伝子２に置換した抗ヒトＣＤ９８抗体発現トランスポゾンベクターＣを作製した。
【0115】
改変型ネオマイシン耐性遺伝子２は、野生型ネオマイシン耐性遺伝子と同一のアミノ酸配列をコードし、かつ全体の２３％にあたる１８０塩基を改変した。具体的には、全３２個のロイシン残基のうち、２８個のロイシン残基に対応するコドンをＴＴＡとなるように改変している。
【0116】
（４）改変型ネオマイシン耐性遺伝子３を有する抗ヒトＣＤ９８抗体発現トランスポゾンベクターの作製（１）で得られた野生型ネオマイシン耐性遺伝子を有する抗ヒトＣＤ９８抗体発現トランスポゾンベクターＡのネオマイシン耐性遺伝子を、配列番号１３で表される塩基配列からなる改変型ネオマイシン耐性遺伝子３に置換した抗ヒトＣＤ９８抗体発現トランスポゾンベクターＤを作製した。
【0117】
改変型ネオマイシン耐性遺伝子３は、野生型ネオマイシン耐性遺伝子と同一のアミノ酸配列をコードし、かつ全体の２６％にあたる２０３塩基を改変している。具体的には、全３２個のロイシン残基のうち、３０個のロイシン残基に対応するコドンをＴＴＡとなるように改変している。
【0118】
［実施例２］改変型ネオマイシン耐性遺伝子を発現する抗体生産ＣＨＯ細胞による抗体生産実施例１（１）〜（４）で作製した抗ヒトＣＤ９８抗体発現トランスポゾンベクターＡ〜Ｄを、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるＴｏｌ２トランスポゼースを発現するベクターｐＣＡＧＧＳ−Ｔ２ＴＰ（Ｋａｗａｋａｍｉ Ｋ＆Ｎｏｄａ Ｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１６６， ８９５−８９９（２００４））とともに浮遊化ＣＨＯ−Ｋ１細胞にそれぞれ導入し、抗体生産細胞Ａ〜Ｄを作製した。
【0119】
浮遊ＣＨＯ細胞へのベクターの導入は、ＣＨＯ細胞（４×１０６個）を４００μＬのＰＢＳバッファーに懸濁し、環状ＤＮＡのままの抗ヒトＣＤ９８抗体発現トランスポゾンベクター（１０μｇ）およびＴｏｌ２トランスポゼース発現ベクターｐＣＡＧＧＳ−Ｔ２ＴＰ（２０μｇ）を、エレクトロポレーション法により共導入することにより行った。【0120】
ここで、Ｔｏｌ２トランスポゼース発現ベクターもまた、Ｔｏｌ２トランスポゼースを一過性に発現させるため、環状ＤＮＡのまま導入した。【0121】
また、Ｔｏｌ２トランスポゼースを用いないコントロールとして、実施例１（４）の抗ヒトＣＤ９８抗体発現トランスポゾンベクターＤ（１０μｇ）を、制限酵素ＰｃｉＩ（タカラバイオ社）により直鎖状にした後、エレクトロポレーション法により、浮遊化ＣＨＯ−Ｋ１細胞に導入した。【0122】
エレクトロポレーションは、エレクトロポレーター［Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＸｃｅＩＩ ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）］を用い、電圧３００Ｖ、静電容量５００μＦ、室温の条件で、ｇａｐ幅４ｍｍのキュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を使用して行った。【0123】
エレクトロポレーションによる遺伝子導入後、各々のキュベットの細胞は、１枚の９６穴プレートに播種し、５％大豆加水分解物を加えたＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、ＣＯ２インキュベータ内で３日間培養した。【0124】
次に、遺伝子導入４日後の培地交換から、最終濃度５００μｇ／ｍＬになるようにＧ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｒ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を加え、Ｇ４１８存在下で培養し、１週間毎に培地交換を行いながら、３週間培養した。【0125】
培養後、抗体の発現を、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を利用したサンドイッチ法により、ＬＡＮＣＥ（Ｒ）アッセイ（パーキンエルマー社）で定量した。その結果を表１に示す。【0126】
【表1】
【0127】
表１に示すとおり、改変型ネオマイシン耐性遺伝子を発現する細胞Ｂ〜Ｄでは、野生型ネオマイシン耐性遺伝子を発現する細胞Ａに比べ、抗ヒトＣＤ９８抗体の発現量が高かった。【0128】
特に、改変型ネオマイシン耐性遺伝子３を発現する抗ヒトＣＤ９８抗体生産細胞Ｄでは、野生型ネオマイシン耐性遺伝子を発現する抗ヒトＣＤ９８抗体生産細胞Ａの１０倍の発現を示す細胞株が得られた。【0129】
また、改変型ネオマイシン耐性遺伝子３を用いても、Ｔｏｌ２トランスポゼース発現ベクターを共導入していないコントロール細胞では、ベクターを線状化したにも係わらず、抗ヒトＣＤ９８抗体発現細胞を得ることができなかった。【0130】
［実施例３］ピューロマイシン耐性遺伝子および抗ヒトＣＤ９８抗体を発現するトランスポゾンベクターの作製（１）改変型ピューロマイシン耐性遺伝子１を有する抗ヒトＣＤ９８抗体発現トランスポゾンベクターの作製
実施例１（１）で得られた野生型ネオマイシン耐性遺伝子を有する抗ヒトＣＤ９８抗体発現トランスポゾンベクターＡのネオマイシン耐性遺伝子を配列番号２１で表される塩基配列からなる改変型ピューロマイシン耐性遺伝子１に置換した抗ヒトＣＤ９８抗体発現トランスポゾンベクターＥを作製した。
【0131】
改変型ピューロマイシン耐性遺伝子１は、配列番号１９で表される塩基配列からなる野生型ピューロマイシン耐性遺伝子（ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． Ｕ０７６４８．１に開示される塩基配列からなる）と同一のアミノ酸配列をコードし、かつ全体の３％にあたる１７塩基を改変している。【0132】
具体的には、ピューロマイシン耐性遺伝子に含まれる全２８個のアラニン残基のうち、改変により１７個のアラニン残基に対応するコドンをＧＣＧとし、野生型で既にＧＣＧであったコドンと併せて、全てのアラニン残基に対応するコドンをＧＣＧとした。【0133】
（２）改変型ピューロマイシン耐性遺伝子２を有する抗ヒトＣＤ９８抗体発現トランスポゾンベクターの作製実施例１（１）で得られた野生型ネオマイシン耐性遺伝子を有する抗ヒトＣＤ９８抗体発現トランスポゾンベクターＡのネオマイシン耐性遺伝子を配列番号２３で表される塩基配列からなる改変型ピューロマイシン耐性遺伝子２に置換した抗ヒトＣＤ９８抗体発現トランスポゾンベクターＦを作製した。
【0134】
改変型ピューロマイシン耐性遺伝子２は、野生型ピューロマイシン耐性遺伝子と同一のアミノ酸配列をコードし、かつ全体の１４％にあたる７９塩基を改変した。具体的には、改変型ピューロマイシン耐性遺伝子１のアラニン残基に対応するコドンの改変に加え、ロイシン残基に対応するコドンをＴＴＡ、バリン残基に対応するコドンをＧＴＡ、セリンのコドンをＴＣＧとした。
【0135】
［実施例４］改変型ピューロマイシン耐性遺伝子を発現する抗体生産ＣＨＯ細胞による抗体生産１実施例３（１）の改変型ピューロマイシン耐性遺伝子１を有する抗ヒトＣＤ９８抗体発現トランスポゾンベクターＥ、実施例３（２）の改変型ピューロマイシン耐性遺伝子２を有する抗ヒトＣＤ９８抗体発現トランスポゾンベクターＦ、Ｔｏｌ２トランスポゼース発現ベクターｐＣＡＧＧＳ−Ｔ２ＴＰを浮遊化したＣＨＯ−Ｋ１細胞に導入し、抗体生産細胞ＥおよびＦを作製した。
【0136】
浮遊性ＣＨＯ細胞へのベクターの導入は、浮遊化ＣＨＯ細胞（４×１０６個）を４００μＬのＰＢＳバッファーに懸濁し、環状ＤＮＡのままの改変型ピューロマイシン耐性遺伝子を有する抗ヒトＣＤ９８抗体発現トランスポゾンベクター（１０μｇ）と、ｐＣＡＧＧＳ−Ｔ２ＴＰ（２０μｇ）を、エレクトロポレーション法により共導入することにより行った。【0137】
ここで、Ｔｏｌ２トランスポゼース発現ベクターｐＣＡＧＧＳ−Ｔ２ＴＰもまた、Ｔｏｌ２トランスポゼースを一過性に発現させるため、環状ＤＮＡのまま導入した。【0138】
エレクトロポレーションは、エレクトロポレーター（Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＸｃｅＩＩ ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製））を用い、電圧３００Ｖ、静電容量５００μＦ、室温の条件で、ｇａｐ幅４ｍｍのキュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を使用して行った。【0139】
エレクトロポレーションによる遺伝子導入後、各々のキュベットの細胞は、１枚の９６穴プレートに播種し、５％大豆加水分解物を加えたＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ 培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、ＣＯ２インキュベータ内で３日間培養した。【0140】
次に、遺伝子導入２日後の培地交換から、最終濃度５μｇ／ｍＬになるようにピューロマイシン（Ｐ９６２０、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を加え、１週間毎にピューロマイシンを含む培地に培地交換を行いながら、４週間培養した。【0141】
培養後、抗体の発現量を、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を利用したサンドイッチ法により、ＬＡＮＣＥ（Ｒ）アッセイ（パーキンエルマー社）で定量した。その結果を表２に示す。【0142】
【表2】
【0143】
表２に示すとおり、改変型ピューロマイシン耐性遺伝子２を発現する抗体生産細胞Ｆは、改変型ピューロマイシン耐性遺伝子１を発現する抗体生産細胞Ｅの２倍以上の抗体生産量を示した。【0144】
［実施例５］改変型ピューロマイシン耐性遺伝子を発現する抗体生産ＣＨＯ細胞による抗体生産２実施例４で得られた改変型ピューロマイシン耐性遺伝子２を発現する抗体生産細胞Ｆを三角フラスコで培養し、抗ヒトＣＤ９８抗体を生産した。
【0145】
具体的には、抗体生産細胞Ｆを９６穴プレートから２４穴プレート、次いで６穴プレートと順次拡大培養した。細胞数が十分増えた抗体生産細胞Ｆ２株（細胞株１および細胞株２）を選抜し、それぞれ２×１０５個／ｍｌになるように、５％ 大豆加水分解物を加えたＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ 培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）３５ｍｌに懸濁し、１２５ｍｌ容の三角フラスコ（ベントキャップ付き、コーニング社）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２の雰囲気中で１週間旋回培養し、抗ヒトＣＤ９８抗体を生産した。【0146】
培養後の培地中の抗体量を、ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ社）で定量した。その結果を表３に示す。【0147】
【表3】
【0148】
以上の結果は、浮遊性のＣＨＯ細胞において、一対のトランスポゾン配列の間に挿入された抗体遺伝子、および、改変型薬剤耐性遺伝子が、効率よく宿主の染色体内に導入され、しかも高発現細胞の選抜に有効であることを示している。また、得られた細胞は拡大培養が可能であり、浮遊培養条件にて目的タンパク質の生産が可能であることがわかった。【0149】
［参考例］（１）浮遊化ＣＨＯ細胞の作製１０％血清（ＦＣＳ）を添加したα−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で培養した接着性ＣＨＯ−Ｋ１細胞ＥＣ８５０５１００５（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）を、トリプシン処理により剥離、回収し、新しい１０％ ＦＣＳ添加α−ＭＥＭ培地を用いて、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベータ内で、振とう培養した。数日後、これらの細胞が増殖していることを確認したのち、５％ＦＣＳ添加α−ＭＥＭ培地に２×１０５個／ｍＬの濃度で播種し、振とう培養を行った。
【0150】
さらに数日後、５％ＦＣＳ添加α−ＭＥＭ培地にて同様の播種作業を行った。最終的に、血清を含まないα−ＭＥＭ培地を用いて継代、振とう培養を繰り返し、血清存在下での培養と同様の増殖能を有していることを確認して、浮遊培養馴化株を作製した。【0151】
本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更および変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお、本出願は、２０１０年１２月１５日付けで出願された日本特許出願（特願２０１０−２７９８５０）に基づいており、その全体が引用により援用される。【産業上の利用可能性】
【0152】
本発明のタンパク質の生産方法によれば、目的タンパク質を哺乳動物細胞を用いて効率よく生産することができる。本発明の細胞は、遺伝子組み換えタンパク質を生産するためのタンパク質生産細胞として使用できる。【配列表フリーテキスト】
【0153】
配列番号１−人工配列の説明；非自律性Ｔｏｌ２トランスポゾンの塩基配列配列番号２−人工配列の説明；Ｔｏｌ２−Ｌ配列
配列番号３−人工配列の説明；Ｔｏｌ２−Ｒ配列
配列番号７−人工配列の説明；野生型ネオマイシン耐性遺伝子の塩基配列
配列番号８−人工配列の説明；野生型ネオマイシン耐性遺伝子によりコードされるアミノ酸配列
配列番号９−人工配列の説明；改変型ネオマイシン耐性遺伝子の塩基配列
配列番号１０−人工配列の説明；合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号１１−人工配列の説明；改変型ネオマイシン耐性遺伝子の塩基配列
配列番号１２−人工配列の説明；合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号１３−人工配列の説明；改変型ネオマイシン耐性遺伝子の塩基配列
配列番号１４−人工配列の説明；合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号１５−人工配列の説明；抗ヒトＣＤ９８抗体重鎖可変領域をコードする塩基配列
配列番号１６−人工配列の説明；合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号１７−人工配列の説明；抗ヒトＣＤ９８抗体軽鎖可変領域をコードする塩基配列
配列番号１８−人工配列の説明；合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号１９−人工配列の説明；野生型ピューロマイシン耐性遺伝子の塩基配列
配列番号２０−人工配列の説明；野生型ピューロマイシン耐性遺伝子によりコードされるアミノ酸配列
配列番号２１−人工配列の説明；改変型ピューロマイシン耐性遺伝子の塩基配列
配列番号２２−人工配列の説明；合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号２３−人工配列の説明；改変型ピューロマイシン耐性遺伝子の塩基配列
配列番号２４−人工配列の説明；合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号２５−人工配列の説明；改変型ピューロマイシン耐性遺伝子の塩基配列
配列番号２６−人工配列の説明；合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号２７−人工配列の説明；改変型ゼオシン耐性遺伝子の塩基配列
配列番号２８−人工配列の説明；合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号２９−人工配列の説明；改変型ゼオシン耐性遺伝子の塩基配列
配列番号３０−人工配列の説明；合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号３１−人工配列の説明；改変型ハイグロマイシン耐性遺伝子の塩基配列
配列番号３２−人工配列の説明；合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号３３−人工配列の説明；改変型ハイグロマイシン耐性遺伝子の塩基配列
配列番号３４−人工配列の説明；合成コンストラクトのアミノ酸配列
【図1】
【配列表】
[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]