6089130 抗生剤及びリゾホスファチジルコリンを含む免疫増強または細菌性感染疾患治療用の組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6089130

(24)【登録日】2017年2月10日

(45)【発行日】2017年3月1日

(54)【発明の名称】抗生剤及びリゾホスファチジルコリンを含む免疫増強または細菌性感染疾患治療用の組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/685 20060101AFI20170220BHJP

   A61K 31/435 20060101ALI20170220BHJP

   A61K 31/496 20060101ALI20170220BHJP

   A61K 31/546 20060101ALI20170220BHJP

   A61K 31/407 20060101ALI20170220BHJP

   A61K 31/7036 20060101ALI20170220BHJP

   A61K 38/43 20060101ALI20170220BHJP

   A61K 31/395 20060101ALI20170220BHJP

   A61K 31/575 20060101ALI20170220BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20170220BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20170220BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20170220BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/685

   A61K31/435

   A61K31/496

   A61K31/546

   A61K31/407

   A61K31/7036

   A61K37/465

   A61K31/395

   A61K31/575

   A61P31/04

   A61P37/04

   A61P43/00 121

【請求項の数】2

【全頁数】40

(21)【出願番号】特願2016-57761(P2016-57761)

(22)【出願日】2016年3月23日

(62)【分割の表示】特願2014-516920(P2014-516920)の分割

【原出願日】2012年6月22日

(65)【公開番号】特開2016-147892(P2016-147892A)

(43)【公開日】2016年8月18日

【審査請求日】2016年3月31日

(31)【優先権主張番号】10-2011-0061316

(32)【優先日】2011年6月23日

(33)【優先権主張国】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】511286333

【氏名又は名称】アリビオ， インコーポレーテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100107515

【弁理士】

【氏名又は名称】廣田 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100107733

【弁理士】

【氏名又は名称】流 良広

(74)【代理人】

【識別番号】100115347

【弁理士】

【氏名又は名称】松田 奈緒子

(72)【発明者】

【氏名】チョン・ジェ ジュン

(72)【発明者】

【氏名】ク・セ グワン

(72)【発明者】

【氏名】ソン・ドン クン

【審査官】 鈴木 理文

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００５−５２６７８９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００５−５２３８７９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Int. J. Antimicrob. Agents，２０１０年，Vol.36 No.3，pp.230-233

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３１／６８５

Ａ６１Ｋ ３１／３９５

Ａ６１Ｋ ３１／４０７

Ａ６１Ｋ ３１／４３５

Ａ６１Ｋ ３１／４９６

Ａ６１Ｋ ３１／５４６

Ａ６１Ｋ ３１／５７５

Ａ６１Ｋ ３１／７０３６

Ａ６１Ｋ ３８／４３

Ａ６１Ｐ ３１／０４

Ａ６１Ｐ ３７／０４

Ａ６１Ｐ ４３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

免疫増強用の薬剤学的組成物であって、
（ｉ）_Ｌ−_α−リゾホスファチジルコリン、ステアロイル、及び（ｉｉ）抗生剤を有効成分として含み、
前記抗生剤が、ＤＷ２８６、シプロフロキサシン塩酸塩水和物、セフトリアキソンナトリウム、ドリペネム、塩酸バンコマイシン、ドロトレコジンアルファ、コリスチン、トブラマイシン、及びフシジン酸から構成された群より選択されることを特徴とする免疫増強用の薬剤学的組成物。

【請求項2】

免疫増強用のキットであって、
（ｉ）_Ｌ−_α−リゾホスファチジルコリン、ステアロイル、及び（ｉｉ）抗生剤が、単一または別個の容器に入れられており、
前記抗生剤が、ＤＷ２８６、シプロフロキサシン塩酸塩水和物、セフトリアキソンナトリウム、ドリペネム、塩酸バンコマイシン、ドロトレコジンアルファ、コリスチン、トブラマイシン、及びフシジン酸から構成された群より選択されることを特徴とする免疫増強用のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、リゾホスファチジルコリンまたはこれの類似体、及び抗生剤を有効成分として含む免疫増強または細菌性感染疾患治療用の薬剤学的組成物、上記物質を投与するステップを含む免疫増強または細菌性感染疾患の治療方法、及び上記物質を含む免疫増強または細菌性感染疾患の治療用キットに関するものである。

【背景技術】

【0002】

細菌性感染疾患は、細菌が血液、体液及び組織内に出現して生息し始めながら発病する疾患であって、抗生剤抵抗微生物の増加と共に新しい抗生剤の開発不足によって人間に大きな脅威となっている。細菌性感染疾患としては腹膜炎、肺炎、骨髄炎、蜂巣炎、脳膜炎、腎炎、腸炎、胃炎、食道炎、十二指腸炎、大腸炎及び敗血症などがある。このような細菌性感染疾患は感染に対して免疫系がまともに反応できない好中球の減少を伴う発熱状態、または免疫系の抑制時に（例：ＡＩＤＳのような免疫不全疾患や免疫抑制剤を投与中の患者で）感染に対して好中球の減少なしに発熱が伴うこともある。最近、抗生剤に対する耐性菌の発現増大によって細菌性感染疾患の治療の困難性が増大しつつある。

【0003】

特に、敗血症は微生物に感染されて全身に深刻な炎症反応が起こる状態を言う。米国だけで敗血症で１年に２００，０００名を超える人が死亡しており（非特許文献１）、敗血症は内部免疫の欠陥及び過度なリンパ球アポトーシスによって免疫機能を損傷させると知られている。免疫抑制は結果として敗血症による死亡の重要な因子とされてきており、高用量の化学治療または放射線治療による免疫機能の欠陷からの回復は重要な臨床的問題として残っている。敗血症患者にとってインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）とともに大食細胞の活性化は有用な効果を奏し、敗血症が誘発された実験動物において好中球異常の抑制及びリンパ球アポトーシスの抑制も、有用な効果を奏すると知られてきている（非特許文献２）。

【0004】

一方、リゾホスファチジルコリン（Ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ， ＬＰＣ）は酸化された低密度脂質タンパク質の主な構成要素であって、敗血症治療に有用なものと知られている（非特許文献２）。

【0005】

本明細書の全体にかけて多数の引用文献及び特許文献が参照されてその引用が表示されている。引用された文献及び特許の開示内容はその全体が本明細書に参照により組み込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｈｏｙｅｒｔ ｅｔ ａｌ． Ｄｅａｔｈｓ： ｆｉｎａｌ ｄａｔａ ｆｏｒ １９９７． Ｎａｔｌ． Ｖｉｔａｌ Ｓｔａｔ． Ｒｅｐ． ４７：１−１０４（１９９９）

【非特許文献2】Ｙａｎ ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｉｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｓｅｐｓｉｓ． Ｎａｔ． Ｍｅｄ． １０：１６１−１６７（２００４）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明者らは大量感染でリゾホスファチジルコリンの治療効果を極大化するための方法を開発すべく鋭意努力した。その結果、リゾホスファチジルコリン及び抗生剤を投与する場合、抗生剤またはリゾホスファチジルコリンを単独で投与する場合よりも免疫増強または細菌性感染疾患に対する治療効果が顕著に上昇することを確認し、本発明を完成するに至った。

【0008】

したがって、本発明の目的は、免疫増強用または細菌性感染疾患治療用の組成物を提供することにある。

【0009】

本発明の別の目的は、免疫増強または細菌性感染疾患の治療方法を提供することにある。

【0010】

本の発明のまた別の目的は、免疫増強または細菌性感染疾患の治療用キットを提供することにある。

【0011】

本発明の別の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面によってより明確にされる。

【課題を解決するための手段】

【0012】

本発明の一様態によれば、本発明は、（ｉ）リゾホスファチジルコリンまたはこれの類似体、及び（ｉｉ）抗生剤を有効成分として含む免疫増強用または細菌性感染疾患治療用の薬剤学的組成物を提供する。

【0013】

本発明者らは、大量感染でリゾホスファチジルコリンの治療効果を極大化するための方法を開発すべく鋭意努力した。その結果、リゾホスファチジルコリン及び抗生剤を投与する場合、抗生剤またはリゾホスファチジルコリンを単独で投与する場合よりも免疫増強または細菌性感染疾患に対する治療効果が顕著に上昇することを確認し、本発明を完成するに至った。

【発明の効果】

【0014】

本発明の特徴及び利点を要約すれば、次のとおりである：
（１）本発明によって抗生剤とともにリゾホスファチジルコリンまたはこれの類似体を併用投与すれば、免疫増強または細菌性感染疾患の治療効果の面で相乗効果を発揮する。
（２）本発明は感染を通じて免疫系が抑制された疾患、及び免疫系が抑制された後に感染された疾病の治療などに有用に利用されることができ、既存の抗生剤またはリゾホスファチジルコリンの治療効果を顕著に向上させることができる。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】ＣＰＡ−ＣＬＰで誘導されたモデルでＬＰＣ投与群と投与順序を簡略に示す図である。

【図2】ＣＰＡ−ＣＬＰで誘導されたモデルでＬＰＣ異性体及び抗生剤の投与群と投与順序を簡略に示す図である。

【図3】ＣＰＡ−ＣＬＰで誘導されたモデルでＬＰＣとシプロフロキサシン塩酸塩水和物、ベンジルペニシリンカリウム及びセフトリアキソンナトリウムの投与群と投与順序を簡略に示す図である。

【図4】ＣＰＡ−ＣＬＰで誘導されたモデルでＬＰＣとドリペネム、塩酸バンコマイシン、ＤＷ２８６ａａ、活性型ドロトレコジンアルファの投与群と投与順序を簡略に示す図である。

【図5】ＣＰＡ−ＣＬＰで誘導されたモデルでＬＰＣとコリスチン、トブラマイシン、フシジン酸の投与群と投与順序を簡略に示す図である。

【図6】ＣＰＡ−ＣＬＰで誘導されたモデル及びＣＰＡ誘発免疫抑制モデルでＬＰＣとＤＷ２８６ＡＡの投与群と投与順序を簡略に示す図である。

【図7】ＣＰＡ処理群でＩＮＴＡＣＴ（ａ）、ＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌ（ｂ）、ＬＰＣ（ｃ）、Ｍｉｘ（ｄ）、ＤＷ２８６−ＬＰＣ（ｅ）、ＬＰＣ−ＤＷ２８６（ｆ）、及びＤＷ２８５（ｇ）群の胸腺の組織病理学的プロファイルを示すものである。ＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌでは胸腺皮質内リンパ球細胞の減少を探知した。しかし、このような萎縮性の変化はＬＰＣ、ＬＰＣ−ＤＷ２８６、及びＤＷ２８６−ＬＰＣ群の処理によって効果的に抑制され、他の群に比べてＤＷ２８６−ＬＰＣ群で最も高い抑制傾向を示した。

【図8】ＣＰＡ処理群でＩＮＴＡＣＴ（ａ）、ＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌ（ｂ）、ＬＰＣ（ｃ）、Ｍｉｘ（ｄ）、ＤＷ２８６−ＬＰＣ（ｅ）、ＬＰＣ−ＤＷ２８６（ｆ）、及びＤＷ２８５（ｇ）群の脾臓の組織病理学的プロファイルを示すものである。ＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌでは顕著な脾臓の萎縮及びリンパ球細胞の減少を探知した。しかし、このような萎縮性の変化はＬＰＣ、ＬＰＣ−ＤＷ２８６及びＤＷ２８６−ＬＰＣ群の処理によって効果的に抑制され、他の群に比べてＤＷ２８６−ＬＰＣ群で最も高い抑制傾向を示した。

【図9】ＣＰＡ処理群でＩＮＴＡＣＴ（ａ）、ＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌ（ｂ）、ＬＰＣ（ｃ）、Ｍｉｘ（ｄ）、ＤＷ２８６−ＬＰＣ（ｅ）、ＬＰＣ−ＤＷ２８６（ｆ）、及びＤＷ２８５（ｇ）群の脾臓内ＣＤ３＋細胞の変化を示す図である。ＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌではＩＮＴＡＣＴ ｃｏｎｔｒｏｌに比べて脾臓のＣＤ３＋細胞の顕著な減少を見せた。しかし、このような減少はＣＰＡ ＣＯＮＴＲＯＬに比べてＤＷ２８６群を除く全ての投与群で効果的に減少した。特に、ＬＰＣ群に比べてＤＷ２８６−ＬＰＣ群で類似するかより好ましい効果が探知された。

【図10】ＣＰＡ処理群でＩＮＴＡＣＴ（ａ）、ＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌ（ｂ）、ＬＰＣ（ｃ）、Ｍｉｘ（ｄ）、ＤＷ２８６−ＬＰＣ（ｅ）、ＬＰＣ−ＤＷ２８６（ｆ）、及びＤＷ２８５（ｇ）群の脾臓内ＣＤ４＋細胞の変化を示す図である。ＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌではＩＮＴＡＣＴ ｃｏｎｔｒｏｌに比べて脾臓のＣＤ３＋細胞の顕著な減少を見せた。しかし、このような減少はＣＰＡ ＣＯＮＴＲＯＬに比べてＤＷ２８６群を除く全ての投与群で効果的に減少した。特に、ＬＰＣ群に比べてＤＷ２８６−ＬＰＣ群で類似するかより好ましい効果が探知された。

【図11】ＣＰＡ処理群でＩＮＴＡＣＴ（ａ）、ＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌ（ｂ）、ＬＰＣ（ｃ）、Ｍｉｘ（ｄ）、ＤＷ２８６−ＬＰＣ（ｅ）、ＬＰＣ−ＤＷ２８６（ｆ）、及びＤＷ２８５（ｇ）群の脾臓内ＣＤ８＋細胞の変化を示す図である。ＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌではＩＮＴＡＣＴ ｃｏｎｔｒｏｌに比べて脾臓のＣＤ３＋細胞の顕著な減少を見せた。しかし、このような減少はＣＰＡ ＣＯＮＴＲＯＬに比べてＤＷ２８６群を除く全ての投与群で効果的に減少した。特に、ＬＰＣ群に比べてＤＷ２８６−ＬＰＣ群で類似するかより好ましい効果が探知された。

【図12】ＣＰＡ処理群でＩＮＴＡＣＴ（ａ）、ＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌ（ｂ）、ＬＰＣ（ｃ）、Ｍｉｘ（ｄ）、ＤＷ２８６−ＬＰＣ（ｅ）、ＬＰＣ−ＤＷ２８６（ｆ）、及びＤＷ２８５（ｇ）群の脾臓内ＴＮＦ−α細胞の変化を示す図である。ＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌではＩＮＴＡＣＴ ｃｏｎｔｒｏｌに比べて脾臓のＣＤ３＋細胞の顕著な減少を見せた。しかし、このような減少はＣＰＡ ＣＯＮＴＲＯＬに比べてＤＷ２８６群を除く全ての投与群で効果的に減少した。特に、ＬＰＣ群に比べてＤＷ２８６−ＬＰＣ群で類似するかより好ましい効果が探知された。

【図13】ＣＰＡ処理群でＩＮＴＡＣＴ（ａ）、ＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌ（ｂ）、ＬＰＣ、Ｍｉｘ（ｄ）、ＤＷ２８６−ＬＰＣ（ｅ）、ＬＰＣ−ＤＷ２８６（ｆ）、及びＤＷ２８５（ｇ）群の胸腺内ＣＤ３＋細胞の変化を示す図である。ＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌではＩＮＴＡＣＴ ｃｏｎｔｒｏｌに比べて胸腺のＣＤ３＋細胞の顕著な減少を見せた。しかし、このような減少はＣＰＡ ＣＯＮＴＲＯＬに比べてＤＷ２８６群を除く全ての投与群で効果的に減少した。特に、ＬＰＣ群に比べてＤＷ２８６−ＬＰＣ群で類似するかより好ましい効果が探知された。

【図14】ＣＰＡ処理群でＩＮＴＡＣＴ（ａ）、ＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌ（ｂ）、ＬＰＣ（ｃ）、Ｍｉｘ（ｄ）、ＤＷ２８６−ＬＰＣ（ｅ）、ＬＰＣ−ＤＷ２８６（ｆ）、及びＤＷ２８５（ｇ）群の胸腺内ＣＤ４＋細胞の変化を示す図である。ＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌではＩＮＴＡＣＴ ｃｏｎｔｒｏｌに比べて胸腺のＣＤ４＋細胞の顕著な減少を見せた。しかし、このような減少はＣＰＡ ＣＯＮＴＲＯＬに比べてＤＷ２８６群を除く全ての投与群で効果的に減少した。特に、ＬＰＣ群に比べてＤＷ２８６−ＬＰＣ群で類似するかより好ましい効果が探知された。

【図15】ＣＰＡ処理群でＩＮＴＡＣＴ（ａ）、ＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌ（ｂ）、ＬＰＣ（ｃ）、Ｍｉｘ（ｄ）、ＤＷ２８６−ＬＰＣ（ｅ）、ＬＰＣ−ＤＷ２８６（ｆ）、及びＤＷ２８５（ｇ）群の胸腺内ＣＤ８＋細胞の変化を示す図である。ＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌではＩＮＴＡＣＴ ｃｏｎｔｒｏｌに比べて胸腺のＣＤ８＋細胞の顕著な減少を見せた。しかし、このような減少はＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌに比べてＤＷ２８６群を除く全ての投与群で効果的に減少した。特に、ＬＰＣ群に比べてＤＷ２８６−ＬＰＣ群で類似するかより好ましい効果が探知された。

【図16】ＣＰＡ処理群でＩＮＴＡＣＴ（ａ）、ＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌ（ｂ）、ＬＰＣ（ｃ）、Ｍｉｘ（ｄ）、ＤＷ２８６−ＬＰＣ（ｅ）、ＬＰＣ−ＤＷ２８６（ｆ）、及びＤＷ２８５（ｇ）群の胸腺内ＴＮＦ−α細胞の変化を示す図である。ＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌではＩＮＴＡＣＴ ｃｏｎｔｒｏｌに比べて胸腺のＴＮＦ−α細胞の顕著な減少を見せた。しかし、このような減少はＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌに比べてＤＷ２８６群を除く全ての投与群で効果的に減少した。特に、ＬＰＣ群に比べて ＤＷ２８６−ＬＰＣ群で類似するかより好ましい効果が探知された。

【発明を実施するための形態】

【0016】

本明細書において用語「リゾホスファチジルコリンまたはこれの類似体」は、通常、ホスホリパーゼ酵素活性によるホスファチジルコリンの部分的な加水分解の結果で、１つの脂肪酸グループを除去したホスファチジルコリンの類似体を意味する。本発明は抗生剤と併用した場合に免疫増強または免疫増強を通じて細菌性感染疾患に治療効果を奏する限り、リゾホスファチジルコリン及びその類似体を制限なく含む。

【0017】

本発明の好ましい一実現例によれば、本発明のリゾホスファチジルコリンは、下記化学式１で表される化合物、または下記化学式２で表されるリゾホスファチジルコリンのエーテル類似体である。

【化1】

上記式中、Ｒ_１はＣ_４−３０のアルキルであるか、１つまたはそれ以上の二重結合を持つＣ_４−３０のアルケニルであり、

【化2】

上記式中、Ｒ_２はＣ_４−３０のアルキルであるか、１つまたはそれ以上の二重結合を持つＣ_４−３０のアルケニルである。

【0018】

好ましくは、本発明の化学式１の化合物は、_Ｌ−_α−リゾホスファチジルコリン、ステアロイル（_Ｌ−_α−Ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ， Ｓｔｅａｒｏｙｌ； Ｌｙｓｏｌｅｃｉｔｈｉｎ， ｓｔｅａｒｏｙｌ）；_Ｌ−_α−リゾホスファチジルコリン、ミリストイル（_Ｌ−_α−Ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ， ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ）；_Ｌ−_α−リゾホスファチジルコリン、パルミトイル（_Ｌ−_α−Ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ， Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ； Ｌｙｓｏｌｅｃｉｔｈｉｎ， ｐａｌｍｉｔｏｙｌ）；_ＤＬ−_α−リゾホスファチジルコリン、パルミトイル（_ＤＬ−_α−Ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ， Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ）；及び_Ｌ−_α−リゾホスファチジルコリン、オレオイル（_Ｌ−_α−Ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ， Ｏｌｅｏｙｌ； Ｌｙｓｏｌｅｃｉｔｈｉｎ， ｏｌｅｏｙｌ）から構成された群より選択される。

【0019】

好ましくは、本発明の化学式２の化合物は、_Ｌ−_α−リゾホスファチジルコリン、_γ−Ｏ−アルク−１−エニル（_Ｌ−_α−Ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ， _γ−Ｏ−Ａｌｋ−１−Ｅｎｙｌ； Ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄａｌｃｈｏｌｉｎｅ）；_Ｌ−_α−リゾホスファチジルコリン、_γ−Ｏ−アルキル（_Ｌ−_α−Ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ， _γ−Ｏ−Ａｌｋｙｌ； Ｌｙｓｏ−ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）；_ＤＬ−_α−リゾホスファチジルコリン、_γ−Ｏ−ヘキサデシル（_ＤＬ−_α−Ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ， _γ−Ｏ−Ｈｅｘａｄｅｃｙｌ； ｒａｃ−Ｌｙｓｏ−ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）；及び_Ｌ−_α−リゾホスファチジルコリン、_γ−Ｏ−ヘキサデシル（_Ｌ−_α−Ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ， _γ−Ｏ−Ｈｅｘａｄｅｃｙｌ； Ｌｙｓｏ−ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ； Ｌｙｓｏ−ＰＡＦ−Ｃ １６）から構成された群より選択される。

【0020】

リゾホスファチジルコリン及びこれの類似体は、哺乳動物の体内の内在性物質であるので、安全性は立証されたに違いない。

【0021】

好ましくは， 本発明のリゾホスファチジルコリンはこれの異性体（ｉｓｏｍｅｒ）も含む。本発明の一実施例では、リゾホスファチジルコリンの異性体及び抗生剤の併用投与が、これの単独投与よりも免疫増強及び細菌性感染疾患に優れた治療効果を奏することを確認した（表４及び５）。

【0022】

本明細書において用語「抗生剤」は、微生物が生産する代謝産物で少量で他の微生物の発育を抑制するか死滅させる物質であって、元々自然界にあった抗生物質で作ったものと化学的に合成されたもののいずれも含む。本発明の目的上、本発明の抗生剤は、リゾホスファチジルコリンまたはこれの類似体と併用投与されて、リゾホスファチジルコリンまたはこれの類似体の免疫増強または細菌性感染疾患の治療効果を極大化できる抗生剤であれば、制限なく含む。

【0023】

好ましくは、本発明の抗生剤は、カルバペネム系（ｃａｒｂａｐｅｎｅｍ）抗生剤、セファロスポリン系（ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ）抗生剤、グリコペプチド系（ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅ）抗生剤、ペニシリン系抗生剤、キノロン系（ｑｕｉｎｏｌｏｎｅ）抗生剤、セリンプロテアーゼ系（ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ）抗生剤、ポリミキシン系（ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ）抗生剤、アミノグリコシド系（ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）抗生剤、殺菌系（ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔｉｃ）抗生剤、及び上記抗生剤の組合せで構成された群より選択される。

【0024】

より好ましくは、上記カルバペネム系抗生剤はドリペネム（Ｄｏｒｉｐｅｎｅｍ）を含み、上記セファロスポリン系抗生剤はセフトリアキソンナトリウム（Ｃｅｆｔｒｉａｘｏｎｅ ｓｏｄｉｕｍ）を含み、上記グリコペプチド系抗生剤は塩酸バンコマイシン（Ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）を含み、上記ペニシリン系抗生剤はベンジルペニシリンカリウム（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｂｅｎｚｙｌｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）を含み、上記キノロン系抗生剤はＤＷ２８６（７−［３−（ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ）−４−（ｍｅｔｈｏｘｙｉｍｉｎｏ）−３−ｍｅｔｈｙｌｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−１Ｈ−１−ｐｙｒｒｏｌｙｌ］−１−ｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌ−６−ｆｌｕｏｒｏ−４−ｏｘｏ−１、４−ｄｉｈｙｄｒｏ［１，８］ ｎａｐｈｔｈｙｒｉｄｉｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｃ ａｃｉｄ ｓａｌｔ）及びシプロフロキサシン塩酸塩水和物（Ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ ｈｙｄｒａｔｅ）を含み、上記セリンプロテアーゼ系抗生剤は活性型ドロトレコジンアルファ（Ｄｒｏｔｒｅｃｏｇｉｎ ａｌｆａ（ａｃｔｉｖａｔｅｄ））を含み、上記ポリミキシン系（ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ）抗生剤はコリスチン（ｃｏｌｉｓｔｉｎ）を含み、上記アミノグリコシド系（ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）抗生剤はトブラマイシン（ｔｏｂｒａｍｙｃｉｎ）を含み、上記殺菌系（ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔｉｃ）抗生剤はフシジン酸（ｆｕｓｉｄｉｃ ａｃｉｄ）を含む。

【0025】

本発明において、本発明の組成物に含まれるリゾホスファチジルコリンまたはこれの類似体と抗生剤との割合は、含まれる抗生剤の種類によって決定されることができる。

【0026】

本発明の好ましい一実現例によれば、本発明の組成物に含まれるリゾホスファチジルコリンまたはこれの類似体と抗生剤との重量比は、１：０．１〜４５、好ましくは１：０．２〜４５、より好ましくは１：０．３〜４５、より一層好ましくは１：０．４〜４５、より一層好ましくは１：０．５〜４５であってもよい。

【0027】

本発明のより好ましい一実現例によれば、本発明の組成物に含まれるリゾホスファチジルコリンまたはこれの類似体と抗生剤との重量比は、１：０．１〜４４、好ましくは１：０．２〜４４、より好ましくは１：０．３〜４４、より一層好ましくは１：０．４〜４４、より一層好ましくは１：０．５〜４４であってもよい。

【0028】

本発明のより好ましい一実現例によれば、本発明の組成物に含まれるリゾホスファチジルコリンまたはこれの類似体と抗生剤との重量比は、１：０．１〜４３、好ましくは１：０．２〜４３、より好ましくは１：０．３〜４３、より一層好ましくは１：０．４〜４３、より一層好ましくは１：０．５〜４３であってもよい。

【0029】

本発明のより好ましい一実現例によれば、本発明の組成物に含まれるリゾホスファチジルコリンまたはこれの類似体と抗生剤との重量比は、１：０．１〜４２、好ましくは１：０．２〜４２、より好ましくは１：０．３〜４２、より一層好ましくは１：０．４〜４２、より一層好ましくは１：０．５〜４２であってもよい。

【0030】

本発明のより好ましい一実現例によれば、本発明の組成物に含まれるリゾホスファチジルコリンまたはこれの類似体と抗生剤との重量比は、１：０．１〜４１、好ましくは１：０．２〜４１、より好ましくは１：０．３〜４１、より一層好ましくは１：０．４〜４１、より一層好ましくは１：０．５〜４１であってもよい。

【0031】

本発明のより好ましい一実現例によれば、本発明の組成物に含まれるリゾホスファチジルコリンまたはこれの類似体と抗生剤との重量比は、１：０．１〜４０、好ましくは１：０．２〜４０、より好ましくは１：０．３〜４０、より一層好ましくは１：０．４〜４０、より一層好ましくは１：０．５〜４０であってもよい。

【0032】

本明細書において用語「ＤＷ２８６」は、「ＤＷ２８６ＡＡ」または「ＤＷ２８６ａａ」と混用されて使用されることができる。

【0033】

本発明の好ましい一実現例によれば、本発明の組成物に含まれるＤＷ２８６とリゾホスファチジルコリンまたはこれの類似体との重量比は、１：０．１〜５、好ましくは１：０．２〜５、より好ましくは１：０．３〜５、より一層好ましくは１：０．４〜５、より一層好ましくは１：０．５〜５、より一層好ましくは１：０．６〜５、より一層好ましくは１：０．７〜５、より一層好ましくは１：０．８〜５、より一層好ましくは１：０．９〜５、より一層好ましくは１：１〜５、より一層好ましくは１：１〜４、より一層好ましくは１：１〜３、より一層好ましくは１：２であってもよい。

【0034】

本発明は、抗生剤とリゾホスファチジルコリンまたはこれの類似体との併用投与によって免疫増強または細菌性感染疾患の治療に相乗効果を奏する組成物に関し、相乗効果（ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔ）とは、２つ以上の成分が配合されて使用されるとき、単一成分の投与時に発揮される効果の合計よりも高い効果または予測せぬ異なる効果を発揮することを意味する。上記用語「配合」とは、２つ以上の成分の混合を同時に投与するか、またはこれら成分それぞれを順次に投与することを意味する。

【0035】

本発明の一実施例では、ＬＰＣ及びＤＷ２８６の併用投与による免疫増強及び細菌性感染疾患の治療効果を確認するために、Ｍｉｘ群（ＬＰＣ：ＤＷ２８６ ２：１）と、ＬＰＣ−ＤＷ２８６群（ＬＰＣ事前投与後ＤＷ２８６投与群）、ＤＷ２８６−ＬＰＣ群（ＤＷ２８６事前投与後ＬＰＣ投与群）、ＬＰＣ単独投与群、及びＤＷ２８６単独投与群を、ＣＰＡ−ＣＬＰ誘発された敗血症マウス及びＣＰＡ処理された免疫抑制及び／または変異されたマウスで評価した。その結果、抗生剤及びＬＰＣ併用投与群であるＭｉｘ群、ＬＰＣ−ＤＷ２８６群、及びＤＷ２８６−ＬＰＣ群において単独投与群に比べて上昇された免疫増強効果及び細菌性感染治療効果を観察することができ、ＤＷ２８６−ＬＰＣ群で最も高い免疫増強効果及び細菌性感染治療効果を観察した（表１３）。併せて、ＤＷ２８６以外にシプロフロキサシン塩酸塩水和物、ベンジルペニシリンカリウム、セフトリアキソンナトリウム、ドリペネム、塩酸バンコマイシンまたは活性型ドロトレコジンアルファ、コリスチン、トブラマイシン、及びフシジン酸それぞれをＬＰＣと併用投与した場合、ＬＰＣ単独投与群に比べて上昇された免疫増強効果及び細菌性感染治療効果が現れた（表６ないし表１１）。

【0036】

具体的に、マウスモデルの死亡数測定の結果、ＤＷ２８６−ＬＰＣ群で高い生存率を観察し（表１２及び１３）、臓器重量（胸線及び脾臓）の変化を観察した結果、ＤＷ２８６−ＬＰＣ群はＣＰＡ投与によって誘発されるリンパ臓器重量の減少を効果的に抑制した（表１５）。さらに、血液中白血球数の変化を観察した結果、有意的な白血球数の増加はＤＷ２８６−ＬＰＣ投与群に限ることを発見し（表１６）、白血球の分別 ｃｏｕｎｔｓの変化も、ＬＰＣ単独投与群よりもＤＷ２８６−ＬＰＣ投与群においてより優れた効果が現れた（表１６）。リンパ球細胞の減少及び顕著な脾臓萎縮に係る変化測定の結果、ＤＷ２８６−ＬＰＣ群は他の群（図７及び８）に比べてリンパ球細胞の減少及び脾臓萎縮に対して高い抑制傾向を見せた（表１８）。また、胸腺及び脾臓の免疫組織化学観察の結果、ＣＰＡによって顕著な脾臓及び胸腺内のＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋及びＴＮＦ−α＋細胞の減少がもたらされたが、ＬＰＣ及びＤＷ２８６−ＬＰＣ併用投与はＣＰＡ投与によって誘発されるこれら細胞の減少を比較的効果的に抑制するものと観察され、ＬＰＣ単独投与よりもＤＷ２８６−ＬＰＣ投与群においてより優れた効果が観察された（表１９）。このような結果を通じて、本発明の併用製剤組成物が免疫増強または免疫増強によって細菌性感染疾患の治療に効果があることが分かる。

【0037】

本明細書において用語「細菌性感染疾患」とは、免疫増強によって治療されることができる、生体内に浸透した細菌から直接／間接的な影響を受けて惹起される疾患を意味し、免疫系が抑制された後に感染された疾病である好中球の減少がなくてもＡＩＤＳのような免疫不全疾患や免疫抑制剤を投与中の患者で発熱が伴うか、抗生剤に対する耐性など多様な疾患を含む。

【0038】

好ましくは、本発明の細菌性感染疾患は、腹膜炎、肺炎、骨髄炎、蜂巣炎、脳膜炎、腎炎、心臓炎、腸炎、胃炎、食道炎、十二指腸炎、大腸炎、または敗血症を含む。本発明の一実施例では、ＣＬＰ（Ｃｅｃａｌ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｎｃｔｕｒｅ）を行って腹膜炎を誘発した。本発明の一実施例では、ＣＬＰ及びＣＰＡ（Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ・Ｈ_２Ｏ）を処理したモデルを用いて本発明の併用製剤組成物の免疫増強または細菌性感染疾患の治療効果を確認した。ＣＰＡは免疫系の免疫反応を抑制する物質であるため、本発明の組成物が免疫反応が抑制（免疫機能が低下した）された疾患においても効果があることが分かった。

【0039】

本明細書において用語「免疫」とは、動物体内に存在する自己防御体制であって、外部から侵入してくる各種物質や生命体を自己自身と区別してこの侵入者を除去する生物学的現象を言う。

【0040】

本発明において用語「免疫増強」とは、宿主の特異または非特異、細胞性免疫及び／または体液性免疫反応を上昇させることを言う。本発明の組成物は、免疫が抑制された状態でも抗生剤とＬＰＣまたはこれの類似体との併用投与を通じて免疫増強効果を奏し、このような免疫増強を通じて最終的に細菌性感染疾患の治療に有用である。

【0041】

本発明の組成物は薬学的に許容可能な担体を含み、人体または獣医用に剤形化されることができる。

【0042】

経口投与用の薬剤学的組成物は別個の単位、例えば、カプセル剤または錠剤；散剤または顆粒剤；溶剤、シロップまたは懸濁剤（水性または非水性液状物中；食用発泡剤またはホイップ（ｗｈｉｐ）；またはエマルジョン）で提示されることができる。

【0043】

錠剤または硬質ゼラチンカプセル剤に好適な賦形剤としては、乳糖、とうもろこし澱粉またはこれの誘導体、ステアリン酸またはこれの塩がある。軟質ゼラチンカプセル剤に使用するために好適な賦形剤としては、例えば、植物油、ワックス、脂肪、半固形物または液状ポリオールなどがある。溶剤及びシロップ剤を製造するために使用されることができる賦形剤としては、例えば、水、ポリオール及び糖がある。懸濁剤を製造するために、油（例：植物油）を使用して水中油または油中水懸濁剤を提供することができる。経皮投与用に適応させた薬剤学的組成物は、長期間収容者の表皮と親密に接触され得るようにするための別個のパッチとして提示されることができる。

【0044】

非経口投与用の薬剤学的組成物には酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤（ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔ）及び溶質（収容者の血液と実質的に等張性である）を含有することができる水性及び非水性滅菌注射溶剤；及び懸濁剤及び増粘剤を含むことができる水性及び非水性滅菌懸濁剤が含まれる。注射用溶剤に使用できる賦形剤としては、例えば、水、アルコール、ポリオール、グリセリン及び植物油が含まれる。このような組成物は単位容量（１回分）または多重容量（数回分）容器、例えば、密封されたアンプル及びバイアルに提示されることができ、使用直前に滅菌性液状担体、例えば、注射用水の付加のみを要求する凍結−乾燥条件の下に貯蔵することができる。即席の注射溶剤及び懸濁剤は滅菌性散剤、顆粒剤及び錠剤から製造することができる。

【0045】

本発明の別の様態によれば、本発明は、治療学的有効量の（ｉ）リゾホスファチジルコリンまたはこれの類似体、及び（ｉｉ）抗生剤を個体に投与するステップを含む、免疫増強または細菌性感染疾患の治療方法を提供する。

【0046】

本発明の治療方法において、上記リゾホスファチジルコリンまたはこれの類似体、抗生剤、免疫増強及び細菌性感染疾患は上記の説明とおりであり、本明細書の不要な繰り返し記載による過度な複雑性を避けるために、共通事項はその記載を省略する。

【0047】

本発明の好ましい一実現例によれば、上記物質の併用投与はそれぞれの抗生剤の種類によって、（ｉ）リゾホスファチジルコリンまたはこれの類似体、及び（ｉｉ）抗生剤を、同時にまたは順次に投与することができる。投与間隔は、患者の疾病種類及び重症度、年齢、性別、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出割合、治療期間、同時使用される薬物を含む要素及びその他医学分野によく知られている要素によって決定されることができる。また、上記物質を順次に投与する場合には抗生剤及び／または、リゾホスファチジルコリンまたはこれの類似体を数回にかけて投与することができる。

【0048】

好ましくは、本発明の抗生剤がＤＷ２８６の場合には、ＤＷ２８６を先に投与した後、リゾホスファチジルコリンまたはこれの類似体を投与することができる。

【0049】

本発明の一実施例において、Ｍｉｘ群（ＬＰＣ：ＤＷ２８６＝２：１）と、ＬＰＣ−ＤＷ２８６群（ＬＰＣ事前投与後ＤＷ２８６投与群）、ＤＷ２８６−ＬＰＣ群（ＤＷ２８６事前投与後ＬＰＣ投与群）、ＬＰＣ単独投与群及びＤＷ２８６単独投与群をＣＰＡ−ＣＬＰ誘発された敗血症マウス及びＣＰＡ処理免疫抑制及び／または変異されたマウスで評価した結果、抗生剤及びＬＰＣ併用投与群において単独投与群に比べて上昇された免疫増強効果及び細菌性感染治療効果を観察することができ、ＬＰＣ事前投与後ＤＷ２８６投与群であるＬＰＣ−ＤＷ２８６群よりも、ＤＷ２８６事前投与後ＬＰＣ投与群であるＤＷ２８６−ＬＰＣ群において最も高い免疫増強効果及び細菌性感染治療効果が現れた。

【0050】

本明細書において用語「個体」とは、免疫増強が必要であるか、細菌性感染疾患にかかったか、細菌性感染疾患にかかる危険のある人間と牛、馬、羊、豚、ヤギ、ラクダ、レイヨウ、犬などの哺乳動物を意味するが、これに限定されない。本発明の抗生剤、及びリゾホスファチジルコリンまたはこれの類似体を個体に投与することで免疫を増強させるか、細菌性感染疾患を治療することができる。

【0051】

本明細書において用語「投与」とは、いずれの適切な方法で個体に所定の物質を導入することを意味し、投与経路は目的の組織に到逹することができる限り、いずれの一般的な経路を通じて投与されることができる。腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与、直腸内投与されることができるが、これに限定されることはない。また、製薬組成物は活性物質が標的細胞に移動することができる任意の装置によって投与されることができる。

【0052】

本発明のリゾホスファチジルコリンまたはこれの類似体、及び抗生剤は治療学的有効量で投与されることができる。

【0053】

本明細書において用語「治療学的有効量」とは、医学的治療に適用可能な合理的な受恵／危険の割合で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量の水準は患者の疾病種類及び重症度、年齢、性別、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出割合、治療期間、同時使用される薬物を含む要素及びその他医学分野によく知られている要素によって決定されることができる。上記物質は単一または多重投与されることができる。上記要素を全部考慮して副作用なしに最小限の量で最大の効果を得ることのできる量を投与することが重要であり、当業者によって容易に決定されることができる。

【0054】

本発明のまた別の様態によれば、本発明は（ｉ）リゾホスファチジルコリンまたはこれの類似体、及び（ｉｉ）抗生剤が、単一または別個の容器に入れられている、免疫増強または細菌性感染疾患の治療用キットを提供する。

【0055】

本発明のキットにおいて、上記リゾホスファチジルコリンまたはこれの類似体、抗生剤、免疫増強及び細菌性感染疾患は上記で説明したとおりであり、本明細書の不要な繰り返し記載による過度な複雑性を避けるために、共通事項はその記載を省略する。

【0056】

本発明の好ましい一実現例によれば、本発明のキットには適量のリゾホスファチジルコリンまたはこれの類似体、及び抗生剤が別個の容器に入れられており、薬学的に許容可能な担体、キットの使用のための説明書を含むことができる。上記説明書は、免疫増強または細菌性感染疾患の治療のための抗生剤、及びＬＰＣまたはこれの類似体の混合方法；抗生剤投与後、ＬＰＣまたはこれの類似体の投与順序または投与方法；または、ＬＰＣまたはこれの類似体の投与後、抗生剤の投与順序または投与方法を含むことができる。

【0057】

以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これら実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれら実施例によって制限されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって自明であろう。

【実施例】

【0058】

実施例１：実験材料及び実験動物の準備
ＤＷ２８６（［７−［３−（ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ）−４−（ｍｅｔｈｏｘｙｉｍｉｎｏ）−３−ｍｅｔｈｙｌｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−１Ｈ−１−ｐｙｒｒｏｌｙｌ］−１ ｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌ−６ ｆｌｕｏｒｏ−４−ｏｘｏ−１， ４−ｄｉｈｙｄｒｏ［１，８］ ｎａｐｈｔｈｙｒｉｄｉｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｃ ａｃｉｄ ｓａｌｔ］， Ｌｐｔ， ２００２１）は同和薬品（Ａｎｙａｎｇ， Ｋｏｒｅａ）によって合成された新規のフルオロ−ナフチリジン抗生剤であり、ＬＰＣ（リゾホスファチジルコリン；１８：０ ９４％、ＧｍｂＨ ＰＨＩＳＰＨＯＬＩＰＩＤ、ドイツ）を使用した。ＬＰＣの異性体（ｉｓｏｍｅｒ）である１−オレオイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１−Ｏｌｅｏｙｌ−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ， １−Ｏｌｅｏｙｌ；１８：１ ＬＰＣ）及びシプロフロキサシン塩酸塩水和物（Ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ ｈｙｄｒａｔｅ， Ｃｉｐｒｏ，）、ベンジルペニシリンカリウム（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｂｅｎｚｙｌｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ， Ｐｅｎｉ）、セフトリアキソンナトリウム（Ｃｅｆｔｒｉａｘｏｎｅ ｓｏｄｉｕｍ， Ｃｅｆｔ）、ドリペネム（Ｄｏｒｉｐｅｎｅｍ， Ｄｏｒｉ）、塩酸バンコマイシン（Ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ， Ｖａｎｃｏ）、活性型ドロトレコジンアルファ（Ｄｒｏｔｒｅｃｏｇｉｎ ａｌｆａ（ａｃｔｉｖａｔｅｄ）， Ｘｉｇｒｉｓ）、コリスチン（ｃｏｌｉｓｔｉｎ）、トブラマイシン（ｔｏｂｒａｍｙｃｉｎ）、及びフシジン酸（ｆｕｓｉｄｉｃ ａｃｉｄ， ｆｕｓｉｄｉｎ）はそれぞれシグマなどから購入した。ＬＰＣ、ＤＷ２８６、シプロフロキサシン塩酸塩水和物、ベンジルペニシリンカリウム、セフトリアキソンナトリウム、ドリペネム、塩酸バンコマイシン及び活性型ドロトレコジンアルファはデシケーターに保管されて光と湿気による変性から保護した。

【0059】

ＩＣＲマウス（６週齢、ＳＬＣ， Ｊａｐａｎ）を７日または８日の適応期間を経た後、使用した。動物はポリカーボネートのケージ当たり５または４匹を温度（２０℃−２５℃）、湿度（４０％−４５％）が調節された部屋に割り当てた。明期：暗期サイクルは１２時間：１２時間であり、餌（三養、Ｋｏｒｅａ）及び水は接近しやすく提供した。実験はＣＰＡ−ＣＬＰ及びＣＰＡで誘発された免疫抑制マウスモデル群に分けた。全ての実験動物は‘Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ’ 及び‘Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ ｂｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ， Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ， ＵＳＡ ｏｎ １９９６， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．’によって処理した。

【0060】

実施例２：実験動物モデルの準備
２−１．ＣＰＡ誘導された免疫抑制マウスモデルの準備
手術３日及び１日前にそれぞれ１５０ｍｇ／ｋｇ及び１１０ｍｇ／ｋｇの ＣＰＡ（Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ・Ｈ_２Ｏ、Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を生理食塩水に溶かして１０ｍｌ／ｋｇの濃度で単回腹腔注射して免疫抑制を誘発させた。ＩＮＴＡＣＴ ｃｏｎｔｒｏｌ群ではＣＰＡの代わりに同一量の生理食塩水を同一方法で投与した。

【0061】

ＣＰＡは広く使用される抗がん剤であり、単独で使用するか他の生産物と結合して使用する。ＣＰＡの処理は造血及びリンパ性の組織に深刻な損傷を与えるので、抗がん剤として使用されるか骨髄内移植前処理療法（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ ｒｅｇｉｍｅｓ）として使用して高い白血球減少症をもたらす。核酸のアルキル化を可能にする多くの活性代謝物の生成を導くミクロソーム酵素による生体内の変化後まで、ＣＰＡは自ら生物学的に非活性化されると知られており、フリーラジカルの生成とＤＮＡのアルキル化を通じて染色体を損傷させて突然変異を誘発する。ＣＰＡ誘導免疫抑制及び／または突然変異されたマウスモデルは、抗突然変異効果または好ましい免疫調節効果を探知するための価値ある動物モデルである。さらに、ＣＰＡ処理による免疫抑制及び白血球減少症を誘発することで、胸腺及び脾臓のＴ細胞、特にＣＤ４及びＣＤ８はＴＮＦ−α陽性細胞を含む多様なサイトカインの減少と共に大きく減少する。

【0062】

２−２．ＣＰＡ−ＣＬＰモデルの準備
免疫抑制剤としてよく知られているＣＰＡを、多菌性感染を増幅させるためにＣＬＰ実施の３及び１日前にそれぞれ１５０ｍｇ／ｋｇと１１０ｍｇ／ｋｇのＣＰＡ（Ｓｉｇｍａ， ＵＳＡ）を生理食塩水に溶かして１０ｍｌ／ｋｇの濃度で単回腹腔注射して免疫抑制を誘発させた。このように、ＣＰＡ処理後にＣＬＰを実施すれば、細菌の大量感染モデルとして使用することができる。ＣＬＰのためにマウスをケタミン塩酸塩（Ｋｅｔａｍｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ， ＩＣＮ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．， ＵＳＡ）及びキシラジン塩酸塩（Ｘｙｌａｚｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ， Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｌｔｄ．， Ｊａｐａｎ）の麻酔下に開腹して盲腸を露出し、露出した盲腸は回盲弁（Ｉｌｅｏｃｅｃａｌ ｖａｌｖｅ）のすぐ下を二重結紮した後、２２ゲージの注射針を用い２回貫通させた後、通常の方法に準じて腹腔を閉鎖した。ＩＮＴＡＣＴ及びＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌ群では盲腸露出後、再度腹腔を閉鎖し、ＩＮＴＡＣＴ ｃｏｎｔｒｏｌ群ではＣＰＡの代わりに同一量の生理食塩水を同一方法で投与した。

【0063】

ＣＬＰモデルは人間の急性腹膜炎を最も近く模倣したもので、敗血症と最も臨床的に連関した動物モデルであり、抗敗血症効果を探知するための価値ある動物モデルとされてきた（Ｕｒｂａｓｃｈｅｋ 及び Ｕｒｂａｓｃｈｅｋ， １９８７； Ｙａｎ ｅｔ ａｌ． ２００４； Ｇｈｉｓｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ． ２００６； Ｗｉｒｔｚ ｅｔ ａｌ． ２００６）。ＣＬＰモデルは人間の腹部敗血症の臨床過程をより近く反映したもので、内因性の細菌病巣（ｓｅｐｔｉｃ ｆｏｃｕｓ）は全身性炎症反応症候群とともに多菌性感染をもたらす（Ｗｉｃｈｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ． １９８０； Ｚａｎｔｌ ｅｔ ａｌ． １９９８； Ｍａｉｅｒ ｅｔ ａｌ． ２０００； Ｅｍｍａｎｕｉｌｉｄｉｓ ｅｔ ａｌ． ２００１）。

【0064】

実施例３：実験方法
３−１．ＣＰＡ誘発免疫抑制マウスモデル
免疫抑制を誘発させるために、１５０ｍｇ／ｋｇと１１０ｍｇ／ｋｇのＣＰＡを生理食塩水に溶かしてＣＬＰ手術の３及び１日前または最初投与時に単回腹腔内に投与した。ＩＮＴＡＣＴ ｃｏｎｔｒｏｌ群では、ＣＰＡの代わりに同一量の生理食塩水を同一方法で投与した。

【0065】

３−２．ＣＬＰ手術
マウスはケタミン（Ｋｅｔａｍｉｎｅ）及びキシラジン（Ｘｙｌａｚｉｎｅ）によって麻酔下に開腹して盲腸を露出し、露出した盲腸は回盲弁（Ｉｌｅｏｃｅｃａｌ ｖａｌｖｅ）のすぐ下を二重結紮した後、２２ゲージの注射針を用いて２回貫通させた後、通常の方法に準じて腹腔を閉鎖した。ＩＮＴＡＣＴ及びＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌ群では盲腸露出後、再度腹腔を閉鎖し、ＩＮＴＡＣＴ ｃｏｎｔｒｏｌ群ではＣＰＡの代わりに同一量の生理食塩水を同一方法で投与した。ＣＬＰはＣＰＡの二回目の投与後、一日後に行った。

【0066】

３−３．死亡数、生存数及び体重の測定
ＣＰＡ−ＣＬＰモデルで、体重、生存数及び死亡数は５日間１日に１回ずつ ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ｂａｌａｎｃｅｓ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．， ＵＳＡ）測定し、ＣＰＡ処理モデルでは２日間１日に１回ずつ測定した。増体量は次のように計算した：
＜増体量（ｇ）＞
ＣＰＡ−ＣＬＰ ｍｏｄｅｌ：犠牲当時の体重−ＣＬＰ時の体重（５ｄａｙｓ）、
ＣＰＡ−ｔｒｅａｔ ｍｏｄｅｌ：犠牲当時の体重−最初投与時の体重（２ｄａｙｓ）。

【0067】

３−４．臓器重量の測定
ＣＰＡ処理モデルの犠牲時に脾臓及び胸腺の湿重量（ｗｅｔ−ｗｅｉｇｈｔ）を絶対重量で測定し、その後、相対的な臓器重量（体重の％）を下記式によって計算した：
相対的な臓器重量＝［（絶対的な臓器重量／犠牲当時の個別的な体重）×１００］。

【0068】

３−５．血液収集及びＷＢＣの計算
血液はＣＰＡ処理モデルの大静脈から収集し、血中総白血球数はカウンティングチャンバーを用いて計算し、希釈ピペット（ｄｉｌｕｔｉｎｇ ｐｉｐｅｔｔｅ）と希釈溶液としてＴｕｒｋ溶液を使用して計算した。全ての数字は×１０^３／ｍｍ^３で計算した。さらに、ギムザ液で染色された塗抹血液サンプル内で好酸球、好中球、単球及び好塩基球の細胞数を総１００白血球中で計算した。

【0069】

３−６．骨髄小核多染性赤血球の変化
ＣＰＡ処理モデルの骨髄標本は次のように作製された。つまり、骨髄細胞は非活性化されたウシ胎児血清３ｍｌ内の大腿骨から収集し（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ， ＵＳＡ）、遠心分離して、スライドに塗抹した。標本は乾燥させ、ａｂｓｏｌｕｔｅ ｍｅｔｈａｎｏｌに浸して１０−２０分間固定した。固定されたスライドは下記のような方法で染色した：
メイ・グリュンワルド染色（Ｍａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ ｓｔａｉｎ） ３分、
メイ・グリュンワルド染色（Ｍａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ ｓｔａｉｎ）（１：１ ｄｉｌｕｔｅｄ） ２分、
ギムザ染色（１：６ ｄｉｌｕｔｅｄ） １０分。
スライドは無作為にコードされ、２名の他の専門家によって１０００倍拡大下に観察した。ＰＣＥ（多染性赤血球、Ｐｏｌｙｃｈｒｏｍａｔｉｃ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）の直径の１／５から１／２０の範囲のサイズの小さくて丸いか楕円形の胴体は小核赤血球数として計数した。結果は１０００ＰＣＥ内のＭＮＰＣＥ（小核多染性赤血球、ＰＣＥ ｗｉｔｈ ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ ｎｕｃｌｅｉ）の数として表現した。ＭＮＰＣ±Ｓ．Ｄ．の平均数字を計算した。さらに、ＰＣＥ／（ＰＣＥ＋ＮＣＥ）の割合は細胞毒性の可能性を探知するために５００赤血球を計算した。

【0070】

３−７．組織病理学
器官の重量を測定した後、胸腺と脾臓をサンプル化した。サンプル組織は、１０％中性緩衝ホルマリンに固定した。パラフィンで包埋させた後、３−４μｍ標本を準備した。代表的な部分は光学顕微鏡検査のためにヘマトキシリンとエオシン（Ｈ＆Ｅ， Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ＆ Ｅｏｓｉｎ Ｓｔａｉｎ）で染色した。その後、個別的な器官の組織病理学的プロファイルを観察した。

【0071】

組織形態計測法−自動化されたイメージ分析を使用して（Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ； ＳＩＳ， Ｇｅｒｍａｎｙ）、脾臓での白脾髄の数（Ｎ）／組織病理学標本（×５０）で脾臓内の白脾髄（ｗｈｉｔｅ ｐｕｌｐｓ）の数を計算した。また、胸腺皮質の萎縮性（ａｔｒｏｐｈｉｃ）の変化／総観察された胸腺の数を計算した。

【0072】

３−８．免疫化学組織法（ＩＨＣ）
脱パラフィン化した後に、ＣＤ３抗原決定基の検索は１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−１ｍＭ ＥＤＴＡバッファー（ｐＨ９．０）で行い、１ｍＭ ＥＤＴＡバッファー（ｐＨ８．０）及びＴＮＦ−α ｉｎ １０ｍＭ Ｃｉｔｒａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．０）でＣＤ４及びＣＤ８の検索を上記方法と同一に行った。本実験に使用された１次抗血清は下記表１のとおりである。

【0073】

【表1】

【0074】

バッファーを含む染色皿付きウォーターバスを温度が９５−１００℃に達するまで予熱した後、染色皿を室温に置いてスライドを２０分間冷やした。抗原決定基の検索後に標本は下記のようなステップによって免疫染色した。

【0075】

まず、切片を室温で耐性のペルオキシダーゼ活性を遮断するためにメタノール及び０．３％ Ｈ_２Ｏ_２で３０分間培養した後、０．０１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で３回洗浄した。次に、恒湿器で切片をｎｏｒｍａｌ ｈｏｒｓｅ ｓｅｒｕｍ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎで１時間室温で培養して、兔疫グロブリンの非特異的結合を阻止した（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂ． Ｉｎｃ．， ＣＡ， ＵＳＡ． Ｄｉｌｕｔｉｏｎ １：１００）。その後、０．０１Ｍ ＰＢＳで３回洗浄した後、４℃恒湿器で４つの類型の１次抗血清とともに１２時間切片を培養した。その後、０．０１Ｍ ＰＢＳで３回洗浄した。切片をビオチンが結合された万能二次抗体とともに恒湿器で１時間室温で培養した。その後、０．０１Ｍ ＰＢＳで３回洗浄した。切片をＡＢＣ試薬（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣ Ｋｉｔ， Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂ． Ｉｎｃ．， ＣＡ， ＵＳＡ． Ｄｉｌｕｔｉｏｎ １：５０）と共に恒湿器で１時間室温で培養した後、０．０１Ｍ ＰＢＳで３回洗浄した。標本を Ｐｅｒｏｘｉｄａｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂ． Ｉｎｃ．， ＣＡ）で室温で３０秒間培養した。その後、０．０１Ｍ ＰＢＳで３回洗浄した。Ｍａｙｅｒ’ｓ ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ溶液で対照染色した後、流れる水道水で３０分間洗浄した。９５％エタノールを通じて２分、１００％エタノールで３時間乾燥させた後、キシレンで２時間洗浄した。その後、ｐｅｒｍａｎｅｎｔ ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍがあるＣｏｖｅｒｓｌｉｐ及び光学顕微鏡下で観察した（Ｚｅｉｓｓ， Ｇｅｒｍａｎｙ）。

【0076】

組織形態計測法−１０００個の脾臓または胸腺細胞のうち、各免疫反応細胞（ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋及びＴＮＦ−α＋）の数（Ｎ）／１０００個の脾臓細胞または胸腺細胞を自動化されたイメージ分析を通じて観察した。胸腺で、皮質と髄質とで分離して計算を行った。

【0077】

３−９．統計分析
平均及び標準偏差（平均±Ｓ．Ｄ．）を計算した。統計学的分析はＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ−Ｗｉｌｃｏｘｏｎ Ｒａｎｋ Ｓｕｍ Ｗ ｔｅｓｔ（ＭＷ ｔｅｓｔ） ｗｉｔｈ ＳＰＳＳ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）（Ｒｅｌｅａｓｅ ６．１．３．， ＳＰＳＳ Ｉｎｃ．， ＵＳＡ）を使用して行った。ＣＰＡ処理モデルでＩＮＴＡＣＴ及びＣＰＡ対照群、ＣＰＡ対照群及びテスト群間の差に対するテスト物質の効率の理解を助けるために、次の式を使用した：
ＩＮＴＡＣＴ ｃｏｎｔｒｏｌに対する変化率（％）＝［（（ＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌのデータ−ＩＮＴＡＣＴ ｃｏｎｔｒｏｌのデータ）／ＩＮＴＡＣＴ ｃｏｎｔｒｏｌのデータ） × １００］、
ＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌに対する変化率（％）＝［（（テスト群のデータ−ＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌのデータ）／ＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌのデータ） × １００］。

【0078】

実施例４：ＣＰＡ−ＣＬＰで誘導されたモデルでＬＰＣ濃度が生存に及ぼす影響の分析
ＣＰＡで免疫抑制を誘発させた後、ＣＬＰ（Ｃｅｃａｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ及びｐｕｎｃｔｕｒｅ）で敗血症を誘発させたマウスを用いて、ＬＰＣの投与用量別の薬効を確認した。５用量（１、２．５、５、１０及び２０ｍｇ／ｋｇ）のＬＰＣをＣＰＡ−ＣＬＰ敗血症マウスにＣＬＰ手術の６時間後から１２時間間隔で４回皮下投与した後、死亡率及び体重の変化を観察した。ＬＰＣは５％ ｈｕｍａｎ ａｌｂｕｍｉｎ（緑十字、Ｋｏｒｅａ）に溶解させて１０ｍｌ／ｋｇでそれぞれ投与した。このような投与群と投与順序を図１に簡単に示す。

【0079】

具体的に、ＩＣＲマウス（６週齢、ＳＬＣ， Ｊａｐａｎ）を計７個の群（１群当たり１０匹）であるＣＰＡ対照群（ＣＰＡ投与後 Ｓｈａｍ手術媒体投与群）、ＣＰＡ−ＣＬＰ対照群（ＣＰＡ投与後 ＣＬＰ手術媒体投与群）、ＣＰＡ−ＣＬＰ後 ＬＰＣ １ｍｇ／ｋｇ投与群、ＣＰＡ−ＣＬＰ後 ＬＰＣ ２．５ｍｇ／ｋｇ投与群、ＣＰＡ−ＣＬＰ後 ＬＰＣ ５ｍｇ／ｋｇ投与群、ＣＰＡ−ＣＬＰ後 ＬＰＣ １０ｍｇ／ｋｇ投与群及びＣＰＡ−ＣＬＰ後 ＬＰＣ ２０ｍｇ／ｋｇ投与群に分けた。投与は１２時間４回皮下投与で５％ヒト血清アルブミンを媒体として使用して１０ｍｌ／ｋｇで投与した。すなわち、５用量のＬＰＣをＣＬＰ手術６時間後から１２時間間隔で計４回頸部皮下に投与した。ＬＰＣは５％ヒト血清アルブミン（緑十字、Ｋｏｒｅａ）に溶解させて１０ｍｌ／ｋｇでそれぞれ投与し、Ｓｈａｍ及びＣＬＰ対照群では１０ｍｌ／ｋｇの５％ヒト血清アルブミンのみを同一間隔で皮下投与した。投与後、死亡率及び体重の変化を上記実施例３−３の方法で観察した。

【0080】

【表2】

【0081】

【表3】

【0082】

その結果、上記表２及び３から分かるように、全てのＣＰＡ対照群マウスは観察期間の７日間生存したが、ＣＬＰ対照群ではＣＬＰ２日以内に１０匹のうち１０匹が死亡して１００％の死亡率を示し、ＬＰＣ １及び２．５ｍｇ／ｋｇ投与群ではそれぞれＣＬＰ４及び５日以内に全ての実験動物が死亡し、ＬＰＣ ５、１０及び２０ｍｇ／ｋｇ投与群ではＣＬＰ手術７日後、全ての実験動物が死亡した（表２）。一方、ＬＰＣ １ｍｇ／ｋｇ投与群の全ての実験動物が死亡したＣＬＰ手術４日後、ＬＰＣ ２．５、５、１０及び２０ｍｇ／ｋｇ投与群の生存率はそれぞれ１０、３０、５０及び４０％だった（表３）。

【0083】

全てのＣＰＡ−ＣＬＰ手術群では死亡直前、ＣＰＡ対照群に比べて顕著な体重減少を示したが、全てのＬＰＣ投与群ではＣＰＡ−ＣＬＰ投与群に比べて意味ある体重の変化は起こらなかった。

【0084】

このような敗血症において最も重要視されている指標と知られている生存時間の増加が、ＣＰＡ−ＣＬＰマウスで全５用量のＬＰＣの投与によって顕著に増加されたため、ＬＰＣは敗血症患者の生存時間を高めることができることが分かる。併せて、ＬＰＣ １、２．５、５及び１０ｍｇ／ｋｇ投与群では投与用量依存的な生存時間延長の効果が認められたが、２０ｍｇ／ｋｇ投与群では１０ｍｇ／ｋｇ投与群と類似するか比較的に低い効果が認められ、ＬＰＣのＣＰＡ−ＣＬＰモデルでの最小有効用量は１ｍｇ／ｋｇ前後と判断され、最適有効用量は１０ｍｇ／ｋｇと観察された。

【0085】

実施例５：ＣＰＡ−ＣＬＰで誘導されたモデルでＬＰＣの異性体の投与が生存に及ぼす影響の分析
ＣＰＡで免疫抑制を誘発させた後、ＣＬＰで敗血症を誘発させたマウスを用いて、ＬＰＣとＸｉｇｒｉｓ、ＬＰＡ、１８：１ ＬＰＣ、１８：０ ＬＰＣ及びＤＷ２８６ＡＡの薬効を比較した。５ｍｇ／ｋｇのＬＰＣ、ＬＰＡ、１８：１ ＬＰＣ、１８：０ ＬＰＣ、０．４及び２ｍｇ／ｋｇのＸｉｇｒｉｓ、１０及び２０ｍｇ／ｋｇのＤＷ２８６ＡＡをそれぞれＣＰＡ−ＣＬＰ敗血症マウスにＣＬＰ手術の６時間後に単回静脈投与した後、死亡率及び体重の変化を観察した。全ての実験物質は滅菌生理食塩水に溶解させて１０ｍｌ／ｋｇでそれぞれ投与した。このような投与順序と投与群は図２に簡単に示す。

【0086】

具体的に、ＩＣＲマウス（６週齢雄、ＳＬＣ， Ｊａｐａｎ）を計１０個群（１群当たり１０匹）であるＣＰＡ対照群（ＣＰＡ投与後 Ｓｈａｍ手術媒体投与群）、ＣＰＡ−ＣＬＰ対照群（ＣＰＡ投与後 ＣＬＰ手術媒体投与群）、ＣＰＡ−ＣＬＰ後 ＬＰＣ ５ｍｇ／ｋｇ投与群、ＣＰＡ−ＣＬＰ後 Ｘｉｇｒｉｓ ０．４ｍｇ／ｋｇ投与群、ＣＰＡ−ＣＬＰ後 Ｘｉｇｒｉｓ ２ｍｇ／ｋｇ投与群、ＣＰＡ−ＣＬＰ後 ＬＰＡ ５ｍｇ／ｋｇ投与群、ＣＰＡ−ＣＬＰ後 １８：１ ＬＰＣ ５ｍｇ／ｋｇ投与群、ＣＰＡ−ＣＬＰ後 １８：０ ＬＰＣ ５ｍｇ／ｋｇ投与群、ＣＰＡ−ＣＬＰ後 ＤＷ２８６ＡＡ １０ｍｇ／ｋｇ投与群及びＣＰＡ−ＣＬＰ後 ＤＷ２８６ＡＡ ２０ｍｇ／ｋｇ投与群に分けた。投与は滅菌生理食塩水を媒体として使用してＣＬＰ手術の６時間後に１０ｍｌ／ｋｇで単回静脈投与した。すなわち、５ｍｇ／ｋｇのＬＰＣ、ＬＰＡ、１８：１ ＬＰＣ、１８：０ ＬＰＣ、０．４及び２ｍｇ／ｋｇのＸｉｇｒｉｓ、１０及び２０ｍｇ／ｋｇのＤＷ２８６ＡＡをそれぞれＣＰＡ−ＣＬＰ敗血症マウスにＣＬＰ手術の６時間後に単回静脈投与した。

【0087】

全ての実験物質は滅菌生理食塩水に溶解させて１０ｍｌ／ｋｇでそれぞれ投与し、Ｓｈａｍ及びＣＬＰ対照群では１０ｍｌ／ｋｇの滅菌生理食塩水のみを単回静脈投与した。投与後、死亡率及び体重の変化を上記実施例３−３の方法で観察した。

【0088】

【表4】

【0089】

【表5】

【0090】

その結果、上記表４及び５から分かるように、全てのＣＰＡ対照群マウスは観察期間の１０日間生存したが、ＣＬＰ対照群ではＣＬＰ２日以内に１０匹のうち１０匹が死亡して１００％の死亡率を示し、ＬＰＣ ５ｍｇ／ｋｇ、Ｘｉｇｒｉｓ ０．４及び２ｍｇ／ｋｇ、１８：０ ＬＰＣ ５ｍｇ／ｋｇ投与群ではＣＬＰ８日以内に全ての実験動物が死亡し、ＬＰＡ ５ｍｇ／ｋｇ投与群ではＣＬＰ手術３日後に全ての実験動物が死亡した（表４）。一方、１８：１ ＬＰＣ ５ｍｇ／ｋｇ投与群では全ての実験動物がＣＬＰ手術２日後に死亡し、ＤＷ２８６ＡＡ １０及び２０ｍｇ／ｋｇ投与群ではそれぞれＣＬＰ手術１０日後にもそれぞれ３匹の生存例（３／１０； ３０％）が認められた（表５）。

【0091】

全てのＣＰＡ−ＣＬＰ手術群では死亡直前、ＣＰＡ対照群に比べて顕著な体重減少を示し、ＬＰＣ ５ｍｇ／ｋｇ、ＤＷ２８６ａａ １０及び２０ｍｇ／ｋｇ投与群でそれぞれＣＬＰ手術１日後にＣＰＡ−ＣＬＰ対照群に比べて有意的な（ｐ＜０．０１またはｐ＜０．０５）体重の増加が認められた以外に、全ての投与群ではＣＰＡ−ＣＬＰ投与群に比べて意味ある体重の変化は認められなかった。

【0092】

このような結果は、ＬＰＣ、Ｘｉｇｒｉｓ、１８：０ ＬＰＣ及びＤＷ２８６ＡＡは敗血症患者の生存時間を高めることができるということを裏付け、特にＤＷ２８６ＡＡ １０及び２０ｍｇ／ｋｇ投与群で顕著な生存時間及び生存率の増加を示す。ＬＰＣ ５ｍｇ／ｋｇ投与群はＸｉｇｒｉｓ ２ｍｇ／ｋｇ投与群よりもっと優れた効果が認められ、１８：０ ＬＰＣは１８：１ ＬＰＣより優れた効果を奏し、同一用量のＬＰＣと類似する効果を奏し、このような結果はＬＰＣだけでなく、ＬＰＣの異性体も免疫増強または細菌性感染疾患の治療効果があり得るということを裏付けるものである。

【0093】

実施例６：ＣＰＡ−ＣＬＰで誘導されたモデルでＬＰＣと既存抗生剤との単独及び併用投与が生存に及ぼす影響の分析
ＣＰＡで免疫抑制を誘発させた後、ＣＬＰで敗血症を誘発させたマウスを用いて、ＬＰＣとＣｉｐｒｏ（Ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ ｈｙｄｒａｔｅ）、Ｐｅｎｉ（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｂｅｎｚｙｌｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）及びＣｅｆｔ（Ｃｅｆｔｒｉａｘｏｎｅ ｓｏｄｉｕｍ）の併用効果を比較した。ＬＰＣ（５ｍｇ／ｋｇ）、Ｃｉｐｒｏ（２０ｍｇ／ｋｇ）、Ｐｅｎｉ（６０ｍｇ／ｋｇ）、Ｃｅｆｔ（２５ｍｇ／ｋｇ）、ＬＰＣ＋Ｃｉｐｒｏ（５＋２０ｍｇ／ｋｇ）、ＬＰＣ＋Ｐｅｎｉ（５＋６０ｍｇ／ｋｇ）及びＬＰＣ＋Ｃｅｆｔ（５＋２５ｍｇ／ｋｇ）をそれぞれＣＰＡ−ＣＬＰ敗血症マウスにＣＬＰ手術の６時間後に単回静脈投与した後、死亡率及び体重の変化を観察した。また、ＤＷ２８６ＡＡ（５ｍｇ／ｋｇ）を対照薬物として使用し、全ての単一実験物質は滅菌生理食塩水に溶解させて１０ｍｌ／ｋｇでそれぞれ投与し、全ての複合組成群ではそれぞれの薬物をＬＰＣ（０．５ｍｇ／ｍｌ）が溶解されている溶液に直接適切用量をそれぞれ溶解させて投与した。このような投与順序と投与群は図３に簡単に示す。

【0094】

具体的に、ＩＣＲマウス（６週齢雄、ＳＬＣ， Ｊａｐａｎ）を計１０個の群（１群当たり１０匹）であるＣＰＡ対照群（ＣＰＡ投与後 Ｓｈａｍ手術媒体投与群）、ＣＰＡ−ＣＬＰ対照群（ＣＰＡ投与後 ＣＬＰ手術媒体投与群）、ＣＰＡ−ＣＬＰ後 ＬＰＣ ５ｍｇ／ｋｇ投与群、ＣＰＡ−ＣＬＰ後 ＤＷ２８６ＡＡ ５ｍｇ／ｋｇ投与群、ＣＰＡ−ＣＬＰ後 Ｃｉｐｒｏ ２０ｍｇ／ｋｇ投与群、ＣＰＡ−ＣＬＰ後 Ｐｅｎｉ ６０ｍｇ／ｋｇ投与群、ＣＰＡ−ＣＬＰ後 Ｃｅｆｔ ２５ｍｇ／ｋｇ投与群、ＣＰＡ−ＣＬＰ後 ＬＰＣ＋Ｃｉｐｒｏ ５＋２０ｍｇ／ｋｇ投与群、ＣＰＡ−ＣＬＰ後 ＬＰＣ＋Ｐｅｎｉ ５＋６０ｍｇ／ｋｇ投与群及びＣＰＡ−ＣＬＰ後 ＬＰＣ＋Ｃｅｆｔ ５＋２５ｍｇ／ｋｇ投与群に分けた。投与は滅菌生理食塩水を媒体として使用してＣＬＰ手術の６時間後に１０ｍｌ／ｋｇで単回静脈投与した。すなわち、ＬＰＣ（５ｍｇ／ｋｇ）、ＤＷ２８６ＡＡ（５ｍｇ／ｋｇ）、Ｃｉｐｒｏ（２０ｍｇ／ｋｇ）、Ｐｅｎｉ（６０ｍｇ／ｋｇ）、Ｃｅｆｔ（２５ｍｇ／ｋｇ）、ＬＰＣ＋Ｃｉｐｒｏ（５＋２０ｍｇ／ｋｇ）、ＬＰＣ＋Ｐｅｎｉ（５＋６０ｍｇ／ｋｇ）及びＬＰＣ＋Ｃｅｆｔ（５＋２５ｍｇ／ｋｇ）をそれぞれＣＰＡ−ＣＬＰ敗血症マウスにＣＬＰ手術の６時間後に単回静脈投与した。全ての単一実験物質は滅菌生理食塩水に溶解させて１０ｍｌ／ｋｇでそれぞれ投与し、全ての複合組成群ではそれぞれの薬物をＬＰＣ（０．５ｍｇ／ｍｌ）が溶解されている溶液に直接適切用量をそれぞれ溶解させて投与した。投与後、死亡率及び体重の変化を上記実施例３−３の方法で観察した。

【0095】

【表6】

【0096】

【表7】

【0097】

その結果、上記表６及び７から分かるように、全てのＣＰＡ対照群マウスは観察期間の３日間生存したが、ＣＬＰ対照群及びＰｅｎｉ投与群ではＣＬＰ２日以内に１０匹のうち１０匹が死亡して、１００％の死亡率を示し、ＬＰＣ、Ｃｉｐｒｏ、Ｃｅｆｔ及びＬＰＣ＋Ｐｅｎｉ投与群ではＣＬＰ３日以内に全ての実験動物が死亡した。しかし、ＬＰＣ単独または各抗生剤単独よりも、ＬＰＣとの併用群であるＬＰＣ＋Ｃｉｐｒｏ、ＬＰＣ＋Ｐｅｎｉ、ＬＰＣ＋Ｃｅｆｔ群では死亡率が減るか死亡時間が遅延した（表６）。一方、ＬＰＣ＋Ｃｅｆｔ及びＤＷ２８６ａａ投与群では、ＣＬＰ手術３日後にもそれぞれ３（３／１０； ３０％）及び７（７／１０； ７０％）匹の生存例が認められた（表７）。

【0098】

全てのＣＰＡ−ＣＬＰ手術群ではＣＬＰ手術１日後からＣＰＡ対照群に比べて顕著な体重減少を示し、ＬＰＣ投与群でＣＬＰ手術１日後にＣＰＡ−ＣＬＰ対照群に比べて有意的な（ｐ＜０．０５）体重の減少を示した以外に、全ての投与群ではＣＰＡ−ＣＬＰ投与群に比べて意味ある体重の変化は見られなかった。

【0099】

ＬＰＣ及びそれぞれの抗生剤の単一投与群に比べてＬＰＣ＋Ｃｉｐｒｏ、ＬＰＣ＋Ｐｅｎｉ及びＬＰＣ＋Ｃｅｆｔ投与群で見られた生存率の増加は、ＬＰＣと抗生剤との併用によってこれらの効果が増加されることを裏付けるものであり、本発明の併用製剤が免疫増強及び細菌性感染疾患の治療に優れた効果があることを示唆するものである。

【0100】

実施例７：ＣＰＡ−ＣＬＰで誘導されたモデルでＬＰＣと既存抗生剤との単独及び併用投与が生存に及ぼす影響の分析
ＣＰＡで免疫抑制を誘発させた後、ＣＬＰで敗血症を誘発させたマウスを用いて、ＬＰＣ、Ｄｏｒｉ（Ｄｏｒｉｐｅｎｅｍ）、Ｖａｎｃｏ（Ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）及びＸｉｇｒｉｓ（Ｄｒｏｔｒｅｃｏｇｉｎ ａｌｆａ（ａｃｔｉｖａｔｅｄ））の併用効果を比較した。ＬＰＣ（５ｍｇ／ｋｇ）、ＤＷ２８６ＡＡ（５ｍｇ／ｋｇ）、Ｄｏｒｉ（２００ｍｇ／ｋｇ）、Ｖａｎｃｏ（１０ｍｇ／ｋｇ）、Ｘｉｇｒｉｓ（２ｍｇ／ｋｇ）、ＬＰＣ＋ＤＷ２８６ＡＡ（５＋５ｍｇ／ｋｇ）、ＬＰＣ＋Ｄｏｒｉ（５＋２００ｍｇ／ｋｇ）、ＬＰＣ＋Ｖａｎｃｏ（５＋１０ｍｇ／ｋｇ）及びＬＰＣ＋Ｘｉｇｒｉｓ（５＋２ｍｇ／ｋｇ）をそれぞれＣＰＡ−ＣＬＰ敗血症マウスにＣＬＰ手術の６時間後に単回静脈投与した後、死亡率及び体重の変化を観察した。全ての単一実験物質は滅菌生理食塩水に溶解させて１０ｍｌ／ｋｇでそれぞれ投与し、全ての複合組成群ではそれぞれの薬物をＬＰＣ（０．５ｍｇ／ｍｌ）が溶解されている溶液に直接適切用量をそれぞれ溶解させて投与した。このような投与順序と投与群は図４に簡単に示す。

【0101】

具体的に、ＩＣＲマウス（６週齢雄、ＳＬＣ， Ｊａｐａｎ）を計１１個の群（１群当たり１０匹）であるＣＰＡ対照群（ＣＰＡ投与後 Ｓｈａｍ手術媒体投与群）、ＣＰＡ−ＣＬＰ対照群（ＣＰＡ投与後 ＣＬＰ手術媒体投与群）、ＣＰＡ−ＣＬＰ後 ＬＰＣ ５ｍｇ／ｋｇ投与群、ＣＰＡ−ＣＬＰ後 ＤＷ２８６ＡＡ ５ｍｇ／ｋｇ投与群、ＣＰＡ−ＣＬＰ後 Ｄｏｒｉ ２００ｍｇ／ｋｇ投与群、ＣＰＡ−ＣＬＰ後 Ｖａｎｃｏ １０ｍｇ／ｋｇ投与群、ＣＰＡ−ＣＬＰ後 Ｘｉｇｒｉｓ ２ｍｇ／ｋｇ投与群、ＣＰＡ−ＣＬＰ後 ＬＰＣ＋ＤＷ２８６ＡＡ ５＋５ｍｇ／ｋｇ投与群、ＣＰＡ−ＣＬＰ後 ＬＰＣ＋Ｄｏｒｉ ５＋２００ｍｇ／ｋｇ投与群、ＣＰＡ−ＣＬＰ後 ＬＰＣ＋Ｖａｎｃｏ ５＋１０ｍｇ／ｋｇ投与群及びＣＰＡ−ＣＬＰ後 ＬＰＣ＋Ｘｉｇｒｉｓ ５＋２ｍｇ／ｋｇ投与群に分けた。投与は滅菌生理食塩水を媒体として使用してＣＬＰ手術の６時間後１０ ｍｌ／ｋｇで単回静脈投与した。すなわち、ＬＰＣ（５ｍｇ／ｋｇ）、ＤＷ２８６ＡＡ（５ｍｇ／ｋｇ）、Ｄｏｒｉ（２００ｍｇ／ｋｇ）、Ｖａｎｃｏ（１０ｍｇ／ｋｇ）、Ｘｉｇｒｉｓ（２ｍｇ／ｋｇ）、ＬＰＣ＋ＤＷ２８６ＡＡ（５＋５ｍｇ／ｋｇ）、ＬＰＣ＋Ｄｏｒｉ（５＋２００ｍｇ／ｋｇ）、ＬＰＣ＋Ｖａｎｃｏ（５＋１０ｍｇ／ｋｇ）及びＬＰＣ＋Ｘｉｇｒｉｓ（５＋２ｍｇ／ｋｇ）をそれぞれＣＰＡ−ＣＬＰ敗血症マウスにＣＬＰ手術の６時間後に単回静脈投与した。全ての単一実験物質は滅菌生理食塩水に溶解させて１０ｍｌ／ｋｇでそれぞれ投与し、全ての複合組成群ではそれぞれの薬物をＬＰＣ（０．５ｍｇ／ｍｌ）が溶解されている溶液に直接適切用量をそれぞれ溶解させて投与した。投与後、死亡率及び体重の変化を上記実施例３−３の方法で観察した。

【0102】

【表8】

【0103】

【表9】

【0104】

その結果、上記表８及び９から分かるように、全てのＣＰＡ対照群マウスは観察期間の３日間生存したが、ＣＬＰ対照群ではＣＬＰ２日以内に１０匹のうち１０匹が死亡して、１００％の死亡率を示し、Ｖａｎｃｏ投与群では各ＣＬＰ３日以内に全ての実験動物が死亡し、ＬＰＣ、Ｄｏｒｉ及びＸｉｇｒｉｓ投与群ではＣＬＰ３日以内にそれぞれ９、８、１０匹ずつ実験動物が死亡した。しかし、ＬＰＣ単独またはＤＷ２８６ＡＡ、Ｄｏｒｉ、Ｖａｎｃｏ及びＸｉｇｒｉｓ単独よりもＬＰＣとの併用群であるＬＰＣ＋Ｄｏｒｉ、ＬＰＣ＋Ｖａｎｃｏ、ＬＰＣ＋Ｘｉｇｒｉｓ群で死亡率が減るか死亡時間が遅延した（表８）。一方、ＤＷ２８６ＡＡ、ＬＰＣ＋ＤＷ２８６ＡＡ、ＬＰＣ＋Ｄｏｒｉ、ＬＰＣ＋Ｖａｎｃｏ及びＬＰＣ＋Ｘｉｇｒｉｓ投与群ではＣＬＰ手術３日後にもそれぞれ４（４／１０； ４０％）、９（９／１０； ９０％）、５（５／１０； ５０％）、４（４／１０； ４０％）及び３（３／１０； ３０％）匹の生存例が認められた（表９）。

【0105】

全てのＣＰＡ−ＣＬＰ手術群ではＣＬＰ手術１日後からＣＰＡ対照群に比べて顕著な体重減少を示したが、全ての薬物投与群ではＣＰＡ−ＣＬＰ投与群に比べて意味ある体重の変化は見られなかった。

【0106】

このようなＬＰＣ及びそれぞれの単一投与群に比べてＬＰＣ＋ＤＷ２８６ＡＡ、ＬＰＣ＋Ｄｏｒｉ、ＬＰＣ＋Ｖａｎｃｏ及びＬＰＣ＋Ｘｉｇｒｉｓ投与群で認められた生存率及び生存期間の増加は、ＬＰＣとの併用によってこれらの効果が増加されることを意味し、このような結果は、本発明の併用製剤の免疫増強または細菌性感染疾患に対する優れた治療効果を裏付けるものである。

【0107】

実施例８：ＣＰＡ−ＣＬＰで誘導されたモデルでＬＰＣと抗生剤との単独及び併用投与が生存に及ぼす影響の分析
ＣＰＡで免疫抑制を誘発させた後、ＣＬＰで敗血症を誘発させたマウスを用いて、ＬＰＣとＣｏｌｉｓｔｉｎ、Ｔｏｂｒａ（Ｔｏｂｒａｍｙｃｉｎ）及びＦｕｓｉｄｉｎ（ｆｕｓｉｄｉｃ ａｃｉｄｅ ｓｏｄｉｕｍ）の併用効果を比較した。ＬＰＣ（５ｍｇ／ｋｇ）、ｃｏｌｉｓｔｉｎ（５ｍｇ／ｋｇ）、ｔｏｂｒａｍｙｃｉｎ（４ｍｇ／ｋｇ）、ｆｕｓｉｄｉｎ（８０ｍｇ／ｋｇ）、ＬＰＣ＋ｃｏｌｉｓｔｉｎ（５＋５ｍｇ／ｋｇ）、ＬＰＣ＋ｔｏｂｒａｍｙｃｉｎ（５＋４ｍｇ／ｋｇ）及びＬＰＣ＋ｆｕｓｉｄｉｎ（５＋８０ｍｇ／ｋｇ）をそれぞれＣＰＡ−ＣＬＰ敗血症マウスにＣＬＰ手術の６時間後に単回静脈投与した後、死亡率及び体重の変化を観察した。また、ＤＷ２８６ＡＡ（５ｍｇ／ｋｇ）を対照薬物として使用し、全ての単一実験物質は滅菌生理食塩水に溶解させて１０ｍｌ／ｋｇでそれぞれ投与し、全ての複合組成群ではそれぞれの薬物をＬＰＣ（０．５ｍｇ／ｍｌ）が溶解されている溶液に直接適切用量をそれぞれ溶解させて投与した。このような投与順序と投与群は図５に簡単に示す。

【0108】

具体的に、ＩＣＲマウス（６週齢雄、ＳＬＣ， Ｊａｐａｎ）を計１０個の群であるＣＰＡ対照群（ＣＰＡ投与後 Ｓｈａｍ手術媒体投与群）、ＣＰＡ−ＣＬＰ対照群（ＣＰＡ投与後 ＣＬＰ手術媒体投与群）、ＣＰＡ−ＣＬＰ後 ＤＷ２８６ＡＡ ５ｍｇ／ｋｇ投与群、ＣＰＡ−ＣＬＰ後 ＬＰＣ ５ｍｇ／ｋｇ投与群、ＣＰＡ−ＣＬＰ後 ｃｏｌｉｓｔｉｎ ５ｍｇ／ｋｇ投与群、ＣＰＡ−ＣＬＰ後 ｔｏｂｒａｍｙｃｉｎ ４ｍｇ／ｋｇ投与群、ＣＰＡ−ＣＬＰ後 ｆｕｓｉｄｉｎ ８０ｍｇ／ｋｇ投与群、ＣＰＡ−ＣＬＰ後 ＬＰＣ＋ｃｏｌｉｓｔｉｎ ５＋５ｍｇ／ｋｇ投与群、ＣＰＡ−ＣＬＰ後 ＬＰＣ＋ｔｏｂｒａｍｙｃｉｎ ５＋４ｍｇ／ｋｇ投与群及びＣＰＡ−ＣＬＰ後 ＬＰＣ＋ｆｕｓｉｄｉｎ ５＋８０ｍｇ／ｋｇ投与群に分けた。投与は滅菌生理食塩水を媒体として使用してＣＬＰ手術６時間後に１０ｍｌ／ｋｇで単回静脈投与した。すなわち、ＬＰＣ（５ｍｇ／ｋｇ）、ＤＷ２８６ＡＡ（５ｍｇ／ｋｇ）、ｃｏｌｉｓｔｉｎ（５ｍｇ／ｋｇ）、ｔｏｂｒａｍｙｃｉｎ（４ｍｇ／ｋｇ）、ｆｕｓｄｉｎ（８０ｍｇ／ｋｇ）、ＬＰＣ＋ｃｏｌｉｓｔｉｎ（５＋５ｍｇ／ｋｇ）、ＬＰＣ＋ｔｏｂｒａｍｙｃｉｎ（５＋４ｍｇ／ｋｇ）及びＬＰＣ＋ｆｕｓｉｄｉｎ（５＋８０ｍｇ／ｋｇ）をそれぞれＣＰＡ−ＣＬＰ敗血症マウスにＣＬＰ手術の６時間後に単回静脈投与した。全ての単一実験物質は滅菌生理食塩水に溶解させて１０ｍｌ／ｋｇでそれぞれ投与し、全ての複合組成群ではそれぞれの薬物をＬＰＣ（０．５ｍｇ／ｍｌ）が溶解されている溶液に直接適切用量をそれぞれ溶解させて投与した。投与後、死亡率及び体重の変化を上記実施例３−３の方法で観察した。

【0109】

【表10】

【0110】

【表11】

【0111】

その結果、上記表１０及び１１から分かるように、全てのＣＰＡ対照群マウスは観察期間の３日間生存したが、ＣＬＰ対照群ではＣＬＰ２日以内に１０匹のうち１０匹が死亡して、１００％の死亡率を示し、ＬＰＣ、Ｆｕｓｉｄｉｎ、ｃｏｌｉｓｔｉｎ及びｔｏｂｒａｍｙｃｉｎ単独投与群ではＣＬＰ３日以内にそれぞれ９、８、９及び８匹の動物が死亡した。しかし、ＬＰＣとｃｏｌｉｓｔｉｎ、ｔｏｂｒａｍｙｃｉｎ及びｆｕｓｉｄｉｎ併合投与群では死亡率が減るか死亡時間が遅延した（表１０）。一方、ＤＷ２８６ＡＡ、ＬＰＣ＋ｃｏｌｉｓｔｉｎ、ＬＰＣ＋ｔｏｂｒａｍｙｃｉｎ及びＬＰＣ＋ｆｕｓｉｄｉｎ投与群ではＣＬＰ手術３日後にもそれぞれ、８（８／１０； ８０％）、４（４／１０； ４０％）、５（５／１０； ５０％）及び５（５／１０； ５０％）匹の生存例が認められた（表１１）。全てのＣＰＡ−ＣＬＰ手術群ではＣＬＰ手術１日後からＣＰＡ対照群に比べて顕著な体重減少を示したが、全ての薬物投与群ではＣＰＡ−ＣＬＰ投与群に比べて意味ある体重の変化は見られなかった。

【0112】

このようなＬＰＣ及びそれぞれの単一投与群に比べて、ＬＰＣ＋ｃｏｌｉｓｔｉｎ、ＬＰＣ＋ｔｏｂｒａｍｙｃｉｎ及びＬＰＣ＋ｆｕｓｉｄｉｎ投与群で認められた生存率及び生存期間の増加の結果は、ＬＰＣとの併用によってこれらの効果が増加されることを意味し、このような結果は、本発明の併用製剤の免疫増強または細菌性感染疾患に対する優れた治療効果を裏付けるものである。

【0113】

実施例９：ＬＰＣと新規キノリン系抗生剤であるＤＷ２８６ＡＡとの併用が生存に及ぼす影響の分析
敗血症に対する新しい治療剤の開発過程の中でＬＰＣ及びＤＷ２８６ＡＡの最適な併用投与方法を捜すために、ＣＰＡ−ＣＬＰ及びＣＰＡで誘発された免疫抑制マウスを用いて評価した。ＣＰＡ−ＣＬＰマウス及びＣＰＡ誘発免疫抑制マウスにＬＰＣ及びＤＷ２８６ＡＡを単独、混合（ＬＰＣ：ＤＷ２８６ＡＡ ２：１）、ＬＰＣ先投与後（２回） ＤＷ２８６ＡＡ後投与（２回）、ＤＷ２８６ＡＡ先投与後 ＬＰＣ後投与後の死亡率、胸腺及び脾臓重量、血中白血球数、胸腺及び脾臓内ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋及びＴＮＦ−α＋細胞の数的変化を骨髄内小核多染性赤血球数の変化とともに評価した。

【0114】

計８または９群（媒体対照群を含む）に、１群当たりそれぞれ９匹をＩＮＴＡＣＴ ＣＯＮＴＲＯＬ：正常媒体対照群（媒体：５％ヒト血清アルブミン）、ＣＰＡ ＣＯＮＴＲＯＬ：ＣＰＡ 誘発免疫抑制媒体対照群、ＣＰＡ−ＣＬＰ ＣＯＮＴＲＯＬ：ＣＰＡ及びＣＬＰ実施媒体対照群、ＬＰＣ：ＬＰＣ １ｍｇ／ｋｇ投与群、Ｍｉｘ：ＬＰＣ−ＤＷ２８６ＡＡ（２：１）複合組成 ０．７５ｍｇ／ｋｇ投与群、ＤＷ２８６−ＬＰＣ：ＤＷ２８６ ０．５ｍｇ／ｋｇ ２回先投与後 ＬＰＣ １ｍｇ／ｋｇ ２回投与群、ＬＰＣ−ＤＷ２８６：ＬＰＣ １ｍｇ／ｋｇ ２回先投与後 ＤＷ２８６ＡＡ ０．５ｍｇ／ｋｇ ２回投与群、ＤＷ２８６：ＤＷ２８６ＡＡ ０．５ｍｇ／ｋｇ投与群に分けた。このような投与順序と投与群は図６に簡単に示す。適正量の候補物質を５％ヒト血清アルブミンに溶解させて１０ｍｌ／ｋｇの濃度で、手術６時間後またはＣＰＡ投与終了２４時間後から１２時間間隔で計４回皮下注射で投与した。ＩＮＴＡＣＴ、ＣＰＡまたはＣＰＡ−ＣＬＰ ＣＯＮＴＲＯＬ群では同一量の５％ヒト血清アルブミンを同一方法で投与した。

【0115】

９−１．ＬＰＣ及びＤＷ２８６ａａの投与順序による死亡数及び体重の評価
上記実施例３−３の方法で、死亡数、生存数及び体重を評価した。その結果、ＩＮＴＡＣＴ及びＣＰＡ ＣＯＮＴＲＯＬ群では観察期間中に死亡例が全然認められなかったが、ＣＰＡ−ＣＬＰ ＣＯＮＴＲＯＬ群ではＣＬＰ１日及び２日後にそれぞれ６及び３例の死亡例が認められ、ＣＬＰ２日後に全ての実験動物（９／９， １００％）が死亡した（表１２）。一方、ＬＰＣ、ＬＰＣ−ＤＷ２８６及びＤＷ２８６群ではＣＬＰ４日後に全ての実験動物が死亡し、Ｍｉｘ及びＤＷ２８６−ＬＰＣ群ではＣＬＰ５日後に全ての実験動物が死亡し、Ｍｉｘ群に比べてＤＷ２８６−ＬＰＣ群でより高い初期生存率が認められた（表１２）。

【0116】

【表12】

【0117】

ＣＬＰ手術１日後、ＣＰＡ及びＣＬＰ処理群で有意的な（ｐ＜０．０１ ｏｒ ｐ＜０．０５）体重の減少がＩＮＴＡＣＴ ｃｏｎｔｒｏｌに比べて探知された。しかし、全てのテスト群は本発明のＣＰＡまたはＣＰＡ−ＣＬＰ ｃｏｎｔｒｏｌに比べて体重の意味ある変化が観察されなかった（表１２）。投与期間中の増体量はＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌ群の場合、ＩＮＴＡＣＴ ｃｏｎｔｒｏｌに比べて−３．９５％の変化を示し、ＬＰＣ、Ｍｉｘ、ＤＷ２８６−ＬＰＣ、ＬＰＣ−ＤＷ２８６及びＤＷ２８６投与群ではＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌに比べてそれぞれ−１２．３５、−１７．６５、２．１６、−８．８２、及び−１．３７％の変化を示した。

【0118】

全てのＣＰＡ投与群で認められた体重減少はＣＰＡの直接的な毒性症状によるものと判断され、ＬＰＣ及びＤＷ２８６はＣＰＡ投与によって誘発される体重減少を抑制できないものと観察された。

【0119】

一方、実験物質投与後にもたらされた軽微な増体量の減少は、皮下注射による刺激などによる二次的所見と判断される。

【0120】

また、ＬＰＣ及びＤＷ２８６ＡＡの単独投与時にもＣＰＡ−ＣＬＰによる死亡例を顕著に減少させるものと観察されたが、それぞれの単独投与よりは混合組成及びＤＷ２８６ＡＡ先投与後ＬＰＣを投与したＤＷ２８６−ＬＰＣ群でより優れた生存率を示し、特にＭｉｘよりもＤＷ２８６−ＬＰＣ群でより高い初期生存率を示して（表１３）、敗血症治療時にＤＷ２８６ＡＡ先投与後にＬＰＣを投与した方がより優れた治療効果を奏するものと期待することができる。

【0121】

【表13】

【0122】

９−２．ＣＰＡ処理モデルの体重の変化
全てのＣＰＡ処理群はＩＮＴＡＣＴ ｃｏｎｔｒｏｌに比べて有意的な体重の減少を見せた（ｐ＜０．０１）。本発明のＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌ群に比べて全てのテスト群で体重の意味ない変化が感知された。さらに、ＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌを含む全てのテスト群で犠牲物に最初の投与後、類似する体重の増加を観察した（表１４）。

【0123】

【表14】

【0124】

９−３．ＣＰＡ処理モデルの臓器重量の変化
上記実施例３−４の方法で臓器重量を測定した。その結果、ＩＮＴＡＣＴ ｃｏｎｔｒｏｌに比べてＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌで相対的で絶対的な脾臓及び胸腺の重量の減少を観察した。しかし、有意的ではない胸腺重量の増加をＬＰＣ、Ｍｉｘ及びＤＷ２８６で観察し、有意的な脾臓重量の増加を（ｐ＜０．０１）、ＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌに比べてＬＰＣ、Ｍｉｘ及びＤＷ２８６−ＬＰＣでそれぞれ観察した（表１５）。

【0125】

【表15】

【0126】

絶対及び相対胸腺重量は、ＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌでＩＮＴＡＣＴ ｃｏｎｔｒｏｌに比べてそれぞれ、−５５．７４及び−５２．６２％変化した。ＬＰＣ、Ｍｉｘ、ＤＷ２８６−ＬＰＣ、ＬＰＣ−ＤＷ２８６及びＤＷ２８６群で絶対的な胸腺重量は、１３．３１、１０．２４、７．１７、２．３９及び−２．７３％変化され、相対的な胸腺重量はＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌに比べてそれぞれ、７．５６、１３．７４、９．５１、５．４７及び−３．１２％ 変化した。しかし、有意的な増加は全ての投与群で認められなかった。

【0127】

絶対的で相対的な脾臓の重量は、ＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌでＩＮＴＡＣＴ ｃｏｎｔｒｏｌに比べて−６３．３８及び−６０．６３％変化を示した。絶対的な脾臓の重量はＬＰＣ、Ｍｉｘ、ＤＷ２８６−ＬＰＣ、ＬＰＣ−ＤＷ２８６及びＤＷ２８６で３５．６２、２８．７７、３１．２８、１１．８７及び−７．０８％変化され、相対的な脾臓の重量はＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌに比べてそれぞれ４０．６９、３２．５４、３２．９６、１４．３８及び−７．４６％の変化を示した。

【0128】

全てのＣＰＡ投与群で認められた脾臓及び胸腺の重量減少はリンパ球の減少による変化と考えられ、ＬＰＣ及びＤＷ２８６−ＬＰＣ併用投与はＣＰＡ投与によって誘発されるリンパ臓器重量の減少を効果的に抑制するものと観察され、ＬＰＣ単独投与よりもＭｉｘ及びＬＰＣ−ＤＷ２８６投与群で類似するか比較的低い減少抑制効果が現れた。

【0129】

９−４．ＣＰＡ処理モデルで血中総ＷＢＣ数の変化
上記実施例３−５の方法で血液収集及びＷＢＣを計算した。その結果、ＩＮＴＡＣＴ ｃｏｎｔｒｏｌに比べて全てのＣＰＡ誘発群では有意的な（ｐ＜０．０１）血中総白血球数の減少が生じ、ＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌに比べてＤＷ２８６投与群を除く全ての投与群で顕著な総白血球数の増加が観察されたが、有意的な（ｐ＜０．０１）増加はＤＷ２８６−ＬＰＣ投与群に限って見られた（表１６）。

【0130】

【表16】

【0131】

ＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌで血中総ＷＢＣ数はＩＮＴＡＣＴ ｃｏｎｔｒｏｌに比べて−９１．５８％の変化を見せた。ＬＰＣ、Ｍｉｘ、ＤＷ２８６−ＬＰＣ、ＬＰＣ−ＤＷ２８６及びＤＷ２８６群でＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌに比べてそれぞれ２５．００、３２．７４、６１．３１、１９．６４及び−１１．３１％変化した。すなわち、ＣＰＡ投与時に一般的に顕著な白血球の減少がもたらされるものと知られているが、本実験の結果、ＬＰＣはＣＰＡ投与によって誘発される白血球の減少を比較的効果的に抑制するものと観察され、ＬＰＣ単独投与よりもＤＷ２８６−ＬＰＣ投与群でより優れた効果が奏することを確認した。このような結果は、併用製剤の場合、ＤＷ２８６先投与がより効果が良いということを示す。

【0132】

９−５．ＣＰＡ処理モデルでＷＢＣの分別ｃｏｕｎｔｓの変化
分別ｃｏｕｎｔの結果、ＣＰＡによる白血球の減少は主にリンパ球減少による変化と観察され、相対的に好中球及び単球の割合の増加がもたらされたものと観察された（表１６）。一方、本実験の結果、ＬＰＣ及びＤＷ２８６−ＬＰＣ併用投与はＣＰＡ投与によって誘発される白血球の減少を比較的効果的に抑制するものと観察され、ＬＰＣ単独投与よりもＤＷ２８６−ＬＰＣ投与群でより優れた効果が認められた。

【0133】

ＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌでのリンパ球、好中球及び単球の割合はＩＮＴＡＣＴ ｃｏｎｔｒｏｌに比べてそれぞれ−７２．４７、８８．１１及び４５６．４３％変化した。ＬＰＣ、Ｍｉｘ、ＤＷ２８６−ＬＰＣ、ＬＰＣ−ＤＷ２８６及びＤＷ２８６群でリンパ球の割合は２６８．７８、２４４．８５、２９０．３７、２０４．０１及び−２３．５６％変化し、好中球の割合は−５１．０７、−４６．０５、−５０．０１、−１８．８１及び−１．０９％の変化を示し、単球の割合はＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌに比べて−８５．２７、−８２．３２、−９１．１６、−８６．４５及び１３．４３％の変化を示した。

【0134】

９−６．ＣＰＡ 処理モデルで骨髄ＭＮＰＣＥｓの変化
上記実施例３−６の方法で骨髄小核多染性赤血球の変化を観察した。その結果、ＣＰＡは突然変異発生率を高める物質と知られており、骨髄内の小核多染性赤血球を顕著に増加させるものと知られている。ＩＮＴＡＣＴ ｃｏｎｔｒｏｌに比べてＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌでは小核多染性赤血球（ＭＮＰＣＥｓ）は有意的に増加し（ｐ＜０．０１）、ＰＣＥ／（ＰＣＥ＋ＮＣＥ）は減少した。全ての投与群でＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌに比べて意味ある小核多染性赤血球及びＰＣＥ割合の変化が生じなかった（表１７）。

【0135】

【表17】

【0136】

ＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌで骨髄小核多染性赤血球及び多染性赤血球の割合はＩＮＴＡＣＴ ｃｏｎｔｒｏｌに比べて１５１２．５０及び−６０．３８％変化した。ＬＰＣ、Ｍｉｘ、ＤＷ２８６−ＬＰＣ、ＬＰＣ−ＤＷ２８６及びＤＷ２８６群でＭＮＰＣＥ数は−１４．３４、−０．７８、−１２．０２、−５．４３及び−１０．８５％の変化を示し、多染性赤血球の割合（ＰＣＥ／（ＰＣＥ＋ＮＣＥ））はそれぞれＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌに比べて−１２．９８、６．１４、−１１．８０、−１．４９及び−１４．７９％の変化を示した。

【0137】

このような結果は、ＬＰＣ及びＤＷ２８６単独投与と併用投与はいずれもＣＰＡによって骨髄内小核多染性赤血球細胞の増加に特に影響を及ぼさないことを裏付けるものである。多染性赤血球の割合は実験物質の骨髄内細胞毒性を評価する項目で、本実験の結果、全てのＣＰＡ投与群では顕著なＰＣＥ割合の減少がもたらされ、このようなＰＣＥ割合の減少はＣＰＡの過量投与によるものと判断される。

【0138】

９−７．ＣＰＡ処理モデルで胸腺と脾臓の組織病理的変化
上記実施例３−７の方法で組織病理的変化を観察した。その結果、胸腺皮質でリンパ球細胞の減少及び顕著な脾臓萎縮がＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌで探知された。しかし、このような萎縮性の変化はＬＰＣ、ＬＰＣ−ＤＷ２８６及びＤＷ２８６−ＬＰＣの処理によって効果的に抑制され、ＤＷ２８６−ＬＰＣ群は他の群に比べて最も高い抑制傾向を見せた（図７及び８）。組織形態計測法で、脾臓での白脾髄の数は（ｐ＜０．０１）、ＩＮＴＡＣＴ ｃｏｎｔｒｏｌに比べてＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌで有意的に減少されたが、ＤＷ２８６単独投与群を除く全ての投与群で有意的に増加した。さらに、胸腺皮質でのリンパ性細胞の減少はやはり、ＤＷ２８６群を除くＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌに比べて全ての投与群で顕著に抑制された（表１８）。

【0139】

【表18】

【0140】

脾臓内の白脾髄の数はＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌでＩＮＴＡＣＴ ｃｏｎｔｒｏｌに比べて−６６．６７％の変化を見せた。それらはＬＰＣ、Ｍｉｘ、ＤＷ２８６−ＬＰＣ、ＬＰＣ−ＤＷ２８６及びＤＷ２８６群ではＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌに比べて１０１．７９、７１．４３、１０５．３６、１０１．７９及び−１．７９％の変化を示した。

【0141】

胸腺皮質萎縮頻度（胸腺皮質でのリンパ性細胞の減少現象）はＩＮＴＡＣＴ ｃｏｎｔｒｏｌ、ＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌ、ＬＰＣ、Ｍｉｘ、ＤＷ２８６−ＬＰＣ、ＬＰＣ−ＤＷ２８６及びＤＷ２８６群で０、１００、８８．８９、８８．８９、６６．６７、７７．７８及び１００％とそれぞれ観察された。

【0142】

本実験の結果、ＬＰＣ及びＤＷ２８６−ＬＰＣ併用投与はＣＰＡ投与によって誘発されるリンパ臓器内のリンパ球の減少を比較的効果的に抑制するものと観察され、ＬＰＣ単独投与よりもＤＷ２８６−ＬＰＣ投与群でより優れた効果が認められた。

【0143】

９−８．ＣＰＡ処理モデルで胸腺及び脾臓の免疫組織化学分析
上記実施例３−８の方法で免疫組織化学分析を行った。その結果、脾臓のＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋及びＴＮＦ−α＋細胞の有意的な減少（ｐ＜０．０１）はＩＮＴＡＣＴ ｃｏｎｔｒｏｌに比べてＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌで観察され、ＣＤ３＋及びＴＮＦ−α＋細胞の有意的な減少は胸腺の皮質及び髄質でそれぞれ観察された。しかし、このような細胞はＤＷ２８６群を除く全ての投与群でＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌに比べて有意的に増加した。特に、ＬＰＣ単独投与群よりもＤＷ２８６−ＬＰＣ群で類似するかより優れた減少抑制効果が認められた（表１９及び図９ないし１６）。

【0144】

【表19】

【0145】

脾臓内のＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌ群でＣＤ３＋、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ ｃｅｌｌｓの数はＩＮＴＡＣＴ ｃｏｎｔｒｏｌに比べて−６８．３２、−８３．１５及び−７３．２６％の変化を見せた。ＬＰＣ、Ｍｉｘ、ＤＷ２８６−ＬＰＣ、ＬＰＣ−ＤＷ２８６及びＤＷ２８６群のＣＤ３＋細胞の数は１８．２９、７７．２６、９９．３２、８１．０３及び−１４．０２％変化し、ＣＤ４＋細胞の数は１３６．５４、９９．７６、１３５．５８、７９．８１及び−１０．８２％変化し、ＣＤ８＋細胞はＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌに比べて７２．８９、４８．８１、１０９．３３、３８．８３及び−１０．６３％変化した。

【0146】

胸腺皮質内のＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌ群でＣＤ３＋、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞の数はＩＮＴＡＣＴ ｃｏｎｔｒｏｌに比べて−７５．４１、６４．２９及び２８．５７％変化した。ＬＰＣ、Ｍｉｘ、ＤＷ２８６−ＬＰＣ、ＬＰＣ−ＤＷ２８６及びＤＷ２８６群のＣＤ３＋細胞の数は３２８．６９、２１６．６１、３２３．４４、２７９．９１及び−９．１６％変化し、ＣＤ８＋細胞の数はＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌの数に比べて１１．１１、３３．３３、−７．４１、１１．１１及び３３．３３％変化した。

【0147】

胸腺髄質内のＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌ 群でＣＤ３＋、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞の数はＩＮＴＡＣＴ ｃｏｎｔｒｏｌに比べて−９０．００、−８．３３及び２８．５７％の変化を示した。ＬＰＣ、Ｍｉｘ、ＤＷ２８６−ＬＰＣ、ＬＰＣ−ＤＷ２８６及びＤＷ２８６群でＣＤ３＋細胞の数は２４６６．６７、５００．００、２３６６．６７、２４６６．６７及び−３３．３３％変化し、ＣＤ４＋細胞の数はＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌに比べて−９．０９、−１８．１８、−１３．６４、４．５５及び２７．２７％変化した。ＣＤ８＋細胞の数はＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌに比べて−５．５６、−１１．１１、−５．５６、−１６．６７及び−２２．２２％変化した。

【0148】

脾臓、胸腺皮質及び髄質内のＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌでＴＮＦ−α＋細胞はＩＮＴＡＣＴ ｃｏｎｔｒｏｌに比べて−５１．７３、−５１．０６及び−１５５．５６％の変化を見せた。ＬＰＣ、Ｍｉｘ、ＤＷ２８６−ＬＰＣ、ＬＰＣ−ＤＷ２８６及びＤＷ２８６群で脾臓のＴＮＦ−α＋細胞は３６．７５、１２．８９、３４．８４、２７．６８及び−１３．８４％変化し、胸腺皮質内のＴＮＦ−α＋細胞は６５．２２、３０．４３、６０．８７、３０．４３、及び−１３．０４％変化し、胸腺髄質内のＴＮＦ−α＋細胞はＣＰＡ ｃｏｎｔｒｏｌに比べて１３３．３３、０．００、０．００、１３３．３３及び０．００％変化を示した。すなわち、ＣＰＡによって顕著な脾臓及び胸腺内ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋及びＴＮＦ−α＋細胞の減少がもたらされたが、ＬＰＣ及びＤＷ２８６−ＬＰＣ併用投与はＣＰＡ投与によって誘発されるこれら細胞の減少を比較的効果的に抑制するものと観察され、ＬＰＣ単独投与よりもＤＷ２８６−ＬＰＣ投与群でより優れた効果が認められた。

【0149】

ＬＰＣ単独及びＬＰＣとＤＷ２８６との併用投与は、ＣＰＡ投与によって誘発される免疫抑制及びＣＰＡ−ＣＬＰによってもたらされる敗血症による死亡例を比較的効果的に抑制するものと観察され、特にＤＷ２８６先投与後にＬＰＣを投与する場合（ＤＷ２８６−ＬＰＣ）、最も優れた効果を奏するものと確認された。

【0150】

上記のような結果は、本発明のＬＰＣを多様な抗生剤と同時にまたは順次に併用投与する場合、ＬＰＣ単独の投与よりも顕著な免疫増強効果及び細菌性感染疾患の優れた治療効果を奏することができることを裏付けるものである。

【0151】

以上、本発明の特定の部分を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとってこのような具体的な記述は単に好ましい実現例に過ぎず、これに本発明の範囲が制限されないことは明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とそれの等価物によって定義されると言える。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】