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特許6090836化学療法剤の抗腫瘍活性増強剤

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6090836

(24)【登録日】2017年2月17日

(45)【発行日】2017年3月8日

(54)【発明の名称】化学療法剤の抗腫瘍活性増強剤

(51)【国際特許分類】

A61K 31/198 20060101AFI20170227BHJP

A61P 35/00 20060101ALI20170227BHJP

A61K 45/00 20060101ALI20170227BHJP

A61P 43/00 20060101ALI20170227BHJP

A61K 31/513 20060101ALI20170227BHJP

【ＦＩ】

A61K31/198

A61P35/00

A61K45/00

A61P43/00 121

A61K31/513

A61P43/00 105

【請求項の数】13

【全頁数】29

(21)【出願番号】特願2012-558030(P2012-558030)

(86)(22)【出願日】2012年2月17日

(86)【国際出願番号】JP2012053757

(87)【国際公開番号】WO2012111790

(87)【国際公開日】20120823

【審査請求日】2015年2月17日

(31)【優先権主張番号】特願2011-32511(P2011-32511)

(32)【優先日】2011年2月17日

(33)【優先権主張国】JP

(31)【優先権主張番号】特願2011-215605(P2011-215605)

(32)【優先日】2011年9月29日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】513001606

【氏名又は名称】ＥＡファーマ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100080791

【弁理士】

【氏名又は名称】高島一

(74)【代理人】

【識別番号】100125070

【弁理士】

【氏名又は名称】土井京子

(74)【代理人】

【識別番号】100136629

【弁理士】

【氏名又は名称】鎌田光宜

(74)【代理人】

【識別番号】100121212

【弁理士】

【氏名又は名称】田村弥栄子

(74)【代理人】

【識別番号】100163658

【弁理士】

【氏名又は名称】小池順造

(74)【代理人】

【識別番号】100174296

【弁理士】

【氏名又は名称】當麻博文

(74)【代理人】

【識別番号】100137729

【弁理士】

【氏名又は名称】赤井厚子

(74)【代理人】

【識別番号】100151301

【弁理士】

【氏名又は名称】戸崎富哉

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉良幸

(73)【特許権者】

【識別番号】599045903

【氏名又は名称】学校法人久留米大学

(74)【代理人】

【識別番号】100080791

【弁理士】

【氏名又は名称】高島一

(74)【代理人】

【識別番号】100125070

【弁理士】

【氏名又は名称】土井京子

(74)【代理人】

【識別番号】100136629

【弁理士】

【氏名又は名称】鎌田光宜

(74)【代理人】

【識別番号】100121212

【弁理士】

【氏名又は名称】田村弥栄子

(74)【代理人】

【識別番号】100122688

【弁理士】

【氏名又は名称】山本健二

(74)【代理人】

【識別番号】100117743

【弁理士】

【氏名又は名称】村田美由紀

(74)【代理人】

【識別番号】100163658

【弁理士】

【氏名又は名称】小池順造

(74)【代理人】

【識別番号】100174296

【弁理士】

【氏名又は名称】當麻博文

(72)【発明者】

【氏名】西谷しのぶ

(72)【発明者】

【氏名】矢野博久

【審査官】吉田佳代子

(56)【参考文献】

【文献】特表平１１−５０８２８２（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１０−０８３８５８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開平０３−０６８５１４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００４−３３９１５１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００５−５１８３６１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 HEPATOLOGY RESEARCH，２０１０年，VOL.40，P.574-584

【文献】アミノレバン（登録商標）ＥＮ配合散添付文書，大塚製薬株式会社，２００９年９月

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ３１／００−３３／４４

Ａ６１Ｋ４５／００

Ａ６１Ｐ３５／００

Ａ６１Ｐ４３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

化学療法剤の抗腫瘍活性を増強する量のイソロイシンまたはその塩、ロイシンまたはその塩、およびバリンまたはその塩を含む、癌幹細胞を含む癌に対する、化学療法剤の抗腫瘍活性を増強するための剤であって、イソロイシンまたはその塩、ロイシンまたはその塩、およびバリンまたはその塩の遊離体換算重量比が、１：１．５〜２．５：０．８〜１．５である、剤。

【請求項2】

癌幹細胞を含む癌に罹患している哺乳動物、または癌幹細胞を含む癌の罹患歴を有する哺乳動物に対して、化学療法剤と組み合わせて投与される、請求項１記載の剤。

【請求項3】

化学療法剤の抗腫瘍活性を増強する量のイソロイシンまたはその塩、ロイシンまたはその塩、およびバリンまたはその塩と、有効量の化学療法剤とを組み合わせてなる、癌幹細胞を含む癌を治療するための剤であって、イソロイシンまたはその塩、ロイシンまたはその塩、およびバリンまたはその塩の遊離体換算重量比が、１：１．５〜２．５：０．８〜１．５である、剤。

【請求項4】

化学療法剤の抗腫瘍活性を増強する量のイソロイシンまたはその塩、ロイシンまたはその塩、およびバリンまたはその塩と、有効量の化学療法剤とを組み合わせてなる、癌幹細胞を含む癌の転移または再発を予防するための剤であって、イソロイシンまたはその塩、ロイシンまたはその塩、およびバリンまたはその塩の遊離体換算重量比が、１：１．５〜２．５：０．８〜１．５である、剤。

【請求項5】

化学療法剤が、代謝拮抗剤、アルキル化剤、抗癌性抗生物質、植物アルカロイド、または分子標的治療剤である、請求項１〜４のいずれか１項記載の剤。

【請求項6】

化学療法剤が５ＦＵである、請求項１〜５のいずれか１項記載の剤。

【請求項7】

癌幹細胞を含む癌が化学療法剤抵抗性の癌である、請求項１〜６のいずれか１項記載の剤。

【請求項8】

癌幹細胞を含む癌が胃癌、肝癌、乳癌または大腸癌である、請求項１〜７のいずれか１項記載の剤。

【請求項9】

（１）イソロイシンまたはその塩、ロイシンまたはその塩、およびバリンまたはその塩、
ならびに化学療法剤を同時に単回または複数回投与すること、
（２）第一段階として、イソロイシンまたはその塩、ロイシンまたはその塩、およびバリンまたはその塩を単回または複数回投与し、第二段階として化学療法剤を単回または複数回投与すること、
（３）第一段階として、イソロイシンまたはその塩、ロイシンまたはその塩、およびバリンまたはその塩を単回または複数回投与し、第二段階として、イソロイシンまたはその塩、ロイシンまたはその塩、およびバリンまたはその塩、ならびに化学療法剤を同時期に単回または複数回投与すること、または
（４）（２）または（３）の工程を複数回繰り返すこと
を特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項記載の剤。

【請求項10】

癌幹細胞の分化を誘導する量のイソロイシンまたはその塩、ロイシンまたはその塩、およびバリンまたはその塩を含む、癌幹細胞の分化を誘導するための剤であって、イソロイシンまたはその塩、ロイシンまたはその塩、およびバリンまたはその塩の遊離体換算重量比が、１：１．５〜２．５：０．８〜１．５である、剤。

【請求項11】

癌幹細胞が胃癌幹細胞、肝癌幹細胞または大腸癌幹細胞である、請求項１０記載の剤。

【請求項12】

イソロイシンまたはその塩、ロイシンまたはその塩、およびバリンまたはその塩の遊離体換算重量比が、１：１．９〜２．２：１．１〜１．３である、請求項１〜１１のいずれか１項記載の剤。

【請求項13】

イソロイシンまたはその塩、ロイシンまたはその塩、およびバリンまたはその塩の遊離体換算重量比が、１：２：１．２である、請求項１２項記載の剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、分岐鎖アミノ酸を含む、癌幹細胞を含む癌に対する化学療法剤の抗腫瘍活性を増強するための剤、分岐鎖アミノ酸を含む、癌幹細胞の分化を誘導するための剤、分岐鎖アミノ酸と化学療法剤を組み合わせてなる癌幹細胞を含む癌の転移・再発抑制または治療剤等に関する。

【背景技術】

【0002】

癌幹細胞は、腫瘍に含まれる癌細胞のサブポピュレーションの１つであり、自己複製能および多分化能を有しており、同所性の移入を行ったときに、癌惹起能力を有している（非特許文献１）。

【0003】

種々の癌において、癌幹細胞に特異的に発現するマーカーの存在が知られており、これらのマーカーの発現に基づいて、癌細胞が癌幹細胞であるか否かを評価することができる。肝臓癌幹細胞のマーカーとしてはＥｐＣＡＭ、ＡＦＰ等が知られている（非特許文献２）。大腸癌幹細胞のマーカーとしてはＣＤ４４、ＣＤ２４等が知られている（非特許文献３）。乳癌幹細胞のマーカーとしては、ＣＤ４４、ＣＤ２４、ＥｐＣＡＭ等が知られている（非特許文献１）。

【0004】

癌幹細胞は一般的に増殖のスピードが遅いために、化学療法剤に対して抵抗性を示す。これに対して、分化した癌細胞（癌非幹細胞）は、増殖のスピードが速いために、化学療法剤に対する感受性が高い。化学療法剤の多くは、癌細胞の増殖メカニズムを標的とするので、化学療法剤による治療では、癌非幹細胞だけを標的としており、癌幹細胞を効果的に殺傷できない可能性がある。そのため、化学療法剤による治療によって大部分の癌細胞が退縮しても、ごく少数の癌幹細胞が残っていれば、再発が起こり得ることになり、これが癌においてしばしば転移・再発が生じる原因だと考えられている。従って、癌幹細胞の癌非幹細胞への分化を促進し、化学療法剤への感受性を高めることができれば、癌幹細胞を含む癌全体を効率的に治療または予防することができると期待されている。

【0005】

分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）は、これまでに肝癌の発生や進展を抑制することが報告されている（特許文献１〜４）。更に、分岐鎖アミノ酸の長期投与により、肝細胞癌の再発が抑制されることが報告されている（非特許文献４）。また、分岐鎖アミノ酸がＡｋｔの活性化を抑制することによって、高インスリン血症をしめすかまたは高インスリン血症の危険性のある患者における癌の発生や進展を抑制することが報告されている（特許文献５）。また、分岐鎖アミノ酸がＩＦＮ作用物質の抗Ｃ型肝炎ウイルス活性を増強することが報告されている（特許文献６）。

【0006】

しかしながら、分岐鎖アミノ酸の、癌幹細胞の癌非幹細胞への分化に対する効果については、これまで明らかにされていない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】WO2003/16208

【特許文献2】WO2004/058243

【特許文献3】WO2007/018278

【特許文献4】WO2006/06729

【特許文献5】WO2007/018281

【特許文献6】WO2007/013677

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】PNAS, vol. 100, No. 7, pages 3983-3988, 2003

【非特許文献2】Cancer Research, vol. 65,No. 8, pages 1451-1461, 2008

【非特許文献3】PNAS, vol. 171, No. 8, pages 3722-3727, 2010

【非特許文献4】日消誌, vol. 105、pages 808-816, 2008

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明は、癌幹細胞の癌非幹細胞への分化を促進し、化学療法剤への感受性を高める技術を開発し、これに基づき、効果的に癌幹細胞を含む癌を治療し、癌の再発を予防する手段を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、特定のＢＣＡＡが癌幹細胞の癌非幹細胞への分化を促進し、化学療法剤への感受性を高めることを見出し、本発明を完成した。

【0011】

すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］イソロイシン、ロイシンおよびバリンから選ばれる少なくとも一種の分岐鎖アミノ酸またはその塩を含む、癌幹細胞を含む癌に対する、化学療法剤の抗腫瘍活性を増強するための剤。
［２］癌幹細胞を含む癌に罹患している哺乳動物、または癌幹細胞を含む癌の罹患歴を有する哺乳動物に対して、化学療法剤と組み合わせて投与される、［１］の剤。
［３］イソロイシンまたはその塩、ロイシンまたはその塩、およびバリンまたはその塩を含む、［１］の剤。
［４］化学療法剤が、代謝拮抗剤、アルキル化剤、抗癌性抗生物質、植物アルカロイド、または分子標的治療剤である、［１］の剤。
［５］化学療法剤が５ＦＵである、［１］の剤。
［６］癌幹細胞を含む癌が化学療法剤抵抗性の癌である、［１］の剤。
［７］癌幹細胞を含む癌が胃癌、肝癌、乳癌または大腸癌である、［１］の剤。
［８］イソロイシン、ロイシンおよびバリンから選ばれる少なくとも一種の分岐鎖アミノ酸またはその塩と、化学療法剤とを組み合わせてなる、癌幹細胞を含む癌を治療するための剤。
［９］イソロイシンまたはその塩、ロイシンまたはその塩、およびバリンまたはその塩を含む、［８］の剤。
［１０］化学療法剤が、代謝拮抗剤、アルキル化剤、抗癌性抗生物質、植物アルカロイド、または分子標的治療剤である、［８］の剤。
［１１］化学療法剤が５ＦＵである、［８］の剤。
［１２］癌幹細胞を含む癌が化学療法剤抵抗性の癌である、［８］の剤。
［１３］癌幹細胞を含む癌が胃癌、肝癌、乳癌または大腸癌である、［８］の剤。
［１４］イソロイシン、ロイシンおよびバリンから選ばれる少なくとも一種の分岐鎖アミノ酸またはその塩と、化学療法剤とを組み合わせてなる、癌幹細胞を含む癌の転移または再発を予防するための剤。
［１５］イソロイシンまたはその塩、ロイシンまたはその塩、およびバリンまたはその塩を含む、［１４］の剤。
［１６］化学療法剤が、代謝拮抗剤、アルキル化剤、抗癌性抗生物質、植物アルカロイド、または分子標的治療剤である、［１４］の剤。
［１７］化学療法剤が５ＦＵである、［１４］の剤。
［１８］癌幹細胞を含む癌が化学療法剤抵抗性の癌である、［１４］の剤。
［１９］癌幹細胞を含む癌が胃癌、肝癌、乳癌または大腸癌である、［１４］の剤。
［２０］イソロイシン、ロイシンおよびバリンから選ばれる少なくとも一種の分岐鎖アミノ酸またはその塩を含む、癌幹細胞の分化を誘導するための剤。
［２１］イソロイシンまたはその塩、ロイシンまたはその塩、およびバリンまたはその塩を含む、［２０］の剤。
［２２］癌幹細胞が胃癌幹細胞、肝癌幹細胞または大腸癌幹細胞である、［２０］の剤。
［２３］イソロイシン、ロイシンおよびバリンから選ばれる少なくとも一種の分岐鎖アミノ酸またはその塩を含む、癌幹細胞を含む癌の転移を抑制するための剤。
［２４］イソロイシンまたはその塩、ロイシンまたはその塩、およびバリンまたはその塩を含む、［２３］の剤。
［２５］癌幹細胞を含む癌が胃癌、肝癌、乳癌または大腸癌である、［２３］の剤。
［２６］化学療法剤の抗腫瘍活性の増強において使用するための、イソロイシン、ロイシンおよびバリンから選ばれる少なくとも一種の分岐鎖アミノ酸またはその塩。
［２７］癌幹細胞を含む癌の治療において使用するための、イソロイシン、ロイシンおよびバリンから選ばれる少なくとも一種の分岐鎖アミノ酸またはその塩、及び化学療法剤を含む組み合わせ物。
［２８］癌幹細胞を含む癌の転移または再発の予防において使用するための、イソロイシン、ロイシンおよびバリンから選ばれる少なくとも一種の分岐鎖アミノ酸またはその塩、及び化学療法剤を含む組み合わせ物。
［２９］癌幹細胞の分化誘導において使用するための、イソロイシン、ロイシンおよびバリンから選ばれる少なくとも一種の分岐鎖アミノ酸またはその塩。
［３０］癌幹細胞を含む癌の転移の抑制において使用するための、イソロイシン、ロイシンおよびバリンから選ばれる少なくとも一種の分岐鎖アミノ酸またはその塩。
［３１］イソロイシン、ロイシンおよびバリンから選ばれる少なくとも一種の分岐鎖アミノ酸またはその塩の有効量を哺乳動物に投与することを含む、当該哺乳動物における化学療法剤の抗腫瘍活性増強方法。
［３２］イソロイシン、ロイシンおよびバリンから選ばれる少なくとも一種の分岐鎖アミノ酸またはその塩、及び化学療法剤の有効量を哺乳動物に投与することを含む、該哺乳動物における癌幹細胞を含む癌の治療方法。
［３３］イソロイシン、ロイシンおよびバリンから選ばれる少なくとも一種の分岐鎖アミノ酸またはその塩、及び化学療法剤の有効量を哺乳動物に投与することを含む、該哺乳動物における癌幹細胞を含む癌の転移または再発の予防方法。
［３４］イソロイシン、ロイシンおよびバリンから選ばれる少なくとも一種の分岐鎖アミノ酸またはその塩の有効量を哺乳動物に投与することを含む、該哺乳動物における癌幹細胞の分化誘導方法。
［３５］イソロイシン、ロイシンおよびバリンから選ばれる少なくとも一種の分岐鎖アミノ酸またはその塩の有効量を哺乳動物に投与することを含む、該哺乳動物における癌幹細胞を含む癌の転移の抑制方法。

【発明の効果】

【0012】

分岐鎖アミノ酸は、癌幹細胞の癌非幹細胞への分化を促進し、化学療法剤への感受性を高めるので、これを化学療法剤と組み合わせて、癌幹細胞を含む癌に罹患している患者に投与することにより、効果的に癌を治療することが可能である。
また、分岐鎖アミノ酸を化学療法剤と組み合わせて、癌幹細胞を含む癌の罹患歴がある患者に投与することにより、効果的に癌の転移や再発を予防することが可能である。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】ＨＡＫ４細胞におけるＥｐＣＡＭ１、ＡＦＰおよびＣＹＰ３Ａ４のｍＲＮＡ発現に対するＢＣＡＡの効果を示す。縦軸は、ＬＣ２．５％処理時における発現を１とした場合の各遺伝子の相対的なｍＲＮＡ発現量を示す。T-test, n=6, *p<0.05, 平均値＋ＳＥ。

【図2】５ＦＵとＢＣＡＡの併用によるＨＡＫ４細胞のアポトーシス誘導を示す。縦軸はAnnexin V陽性細胞のパーセンテージを示す。T-test, n=7, *p<0.05, 平均値＋ＳＥ。

【図3】ＨＡＫ１Ｂ細胞におけるＥｐＣＡＭ１、ＡＦＰおよびＣＹＰ３Ａ４のｍＲＮＡ発現に対するＢＣＡＡの効果を示す。縦軸は、ＬＣ２．５％処理時における発現を１とした場合の各遺伝子の相対的なｍＲＮＡ発現量を示す。T-test, n=6, *p<0.05, 平均値＋ＳＥ。

【図4】ＨＡＫ１Ｂ細胞を移植したＢａｌｂ／ｃヌードマウスにおける腫瘍体積の経時的変化を示す。１群：ｖｅｈｉｃｌｅ＋カゼイン混餌食（コントロール群）、２群：５ＦＵ＋カゼイン混餌食、３群：ｖｅｈｉｃｌｅ＋ＢＣＡＡ混餌食、４群：５ＦＵ＋ＢＣＡＡ混餌食。

【図5】１５日目における、腫瘍体積を示す。Dunnet test, n=6, *p<0.05, ***p<0.001, 平均値＋ＳＥ。

【図6】１５日目における、腫瘍重量を示す。Dunnet test, n=6, *p<0.05, ***p<0.001, 平均値＋ＳＥ。

【図7】ＨＣＴ１１６細胞のＣＤ４４発現に対するＢＣＡＡの効果を示す。縦軸は、ＣＤ４４陽性細胞のパーセンテージを示す。T-test, n=7, *p<0.05, 平均値＋ＳＥ。

【図8】５ＦＵとＢＣＡＡの併用によるＨＣＴ１１６細胞のアポトーシス誘導を示す。縦軸はAnnexin V陽性細胞のパーセンテージを示す。T-test, n=14, *p<0.05, 平均値＋ＳＥ。

【図9】ＨＣＴ１１６細胞の肝臓転移に対するＢＣＡＡの効果を示す。縦軸は、マウス１匹あたりの肝転移数を示す。

【図10】５ＦＵとＢＣＡＡの併用によるＭＫＮ４５細胞の細胞死誘導を示す。縦軸はＯＤ４５０ｎｍの相対値を示す。T-test, *p<0.05, n=8。

【図11】５ＦＵとＢＣＡＡの併用によるＭＫＮ４５細胞のアポトーシス誘導を示す。縦軸はアポトーシス細胞のパーセンテージを示す。T-test, *p<0.05, n=8。

【図12】ＭＫＮ４５細胞のＣＤ４４発現に対するＢＣＡＡの効果を示す。縦軸は、ＣＤ４４陽性細胞のパーセンテージを示す。T-test, *p<0.01, n=8。

【図13】６週間後における、腫瘍体積を示す。Dunnet test, n=6, **p<0.01, 平均値＋ＳＥ。

【図14】５ＦＵとＢＣＡＡの併用によるＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞の増殖抑制を示す。Student test vs 5FU, ***p<0.001,平均値＋ＳＥ。

【図15】ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞のＣＤ４４発現に対するＢＣＡＡの効果を示す。縦軸は、ＣＤ４４陽性細胞のパーセンテージを示す。Student test vs RPMI-10%, 平均値＋ＳＥ。

【図16】インビボにおける、ＢＣＡＡのＨＡＫ１Ｂ細胞のＥｐＣＡＭｍＲＮＡ発現に対する効果を示す。T-test, n=6, *p<0.05。

【図17】インビボにおける、ＢＣＡＡのＭＫＮ４５細胞のＣＤ４４、ｎａｎｏｇ、及びＡＢＣＢ５のｍＲＮＡ発現に対する効果を示す。Dunnet test, n=8, *p<0.05, **p<0.01, *** p<0.005 v.s. control。

【発明を実施するための形態】

【0014】

本発明は、イソロイシン、ロイシンおよびバリンから選ばれる少なくとも一種の分岐鎖アミノ酸またはその塩（好ましくは、イソロイシンまたはその塩、ロイシンまたはその塩、およびバリンまたはその塩）を含む、癌幹細胞を含む癌に対する、化学療法剤の抗腫瘍活性を増強するための剤（または組成物）および／または癌幹細胞の分化を誘導するための剤（または組成物）（以下、これらの製剤を本発明の剤または組成物とも称する）を提供するものである。

【0015】

更なる態様において、本発明の剤（または組成物）は、癌幹細胞を含む癌の転移を抑制するための剤（または組成物）であり得る。

【0016】

本発明の剤または組成物は、イソロイシン、ロイシンおよびバリンから選ばれる少なくとも一種の分岐鎖アミノ酸またはその塩（好ましくは、イソロイシンまたはその塩、ロイシンまたはその塩、およびバリンまたはその塩を含む組み合わせ）が、癌幹細胞の癌非幹細胞への分化を促進し、この効果により癌幹細胞を含む癌に対する化学療法剤の抗腫瘍活性を増強することを見出したことに基づき完成したものである。一般に、癌幹細胞は増殖のスピードが遅いために、化学療法剤に対して抵抗性を示す。これに対して、分化した癌細胞（癌非幹細胞）は、一般に増殖のスピードが速いために、化学療法剤に対する感受性が高い。従って、イソロイシン、ロイシンおよびバリンから選ばれる少なくとも一種の分岐鎖アミノ酸またはその塩（好ましくは、イソロイシンまたはその塩、ロイシンまたはその塩、およびバリンまたはその塩を含む組み合わせ）を、癌幹細胞を含む癌に適用し、癌幹細胞の癌非幹細胞への分化を促進することにより、当該癌の化学療法剤に対する感受性が高まり、その結果、当該癌に対する化学療法剤の抗腫瘍活性が増強される。

【0017】

更なる態様において、本発明の剤または組成物は、イソロイシン、ロイシンおよびバリンから選ばれる少なくとも一種の分岐鎖アミノ酸またはその塩（好ましくは、イソロイシンまたはその塩、ロイシンまたはその塩、およびバリンまたはその塩を含む組み合わせ）が、癌幹細胞の癌非幹細胞への分化を促進し、この効果により癌幹細胞を含む癌の転移能を抑制することを見出したことに基づき完成したものである。

【0018】

本発明において、癌幹細胞とは、自己複製能および多分化能を有しており、同所性の移入を行ったときに、腫瘍惹起能力を有している（ここで形成される腫瘍は、癌幹細胞が由来する起源の腫瘍のフェノコピーである）癌細胞をいう（Nat Rev Cancer, vol.5, pages425-436, 2006）。

【0019】

種々の癌において、癌幹細胞に特異的に発現するマーカーの存在が知られているので、これらのマーカーの発現に基づいて、癌細胞が癌幹細胞であるか否か、あるいは癌に癌幹細胞が含まれるかを評価することができる。一態様において、肝臓癌幹細胞はＥｐＣＡＭ^＋ＡＦＰ^＋である（Cancer Research, vol. 65, No. 8, pages 1451-1461, 2008）。一態様において、大腸癌幹細胞はＣＤ４４^＋ＣＤ２４^＋である（PNAS, vol. 171, No. 8, pages 3722-3727, 2010）。一態様において、乳癌幹細胞はＣＤ４４^＋ＣＤ２４^low＋ＥｐＣＡＭ^＋である（PNAS, vol. 100, No. 7, pages 3982-3988, 2003）。一態様において、膵臓癌幹細胞はＣＤ４４^＋である。ここで、これらのマーカーの発現は、これらのマーカータンパク質に対する特異的抗体を用いたフローサイトメトリーまたは免疫組織学的染色によって評価し、少なくともいずれか一方の方法によって特異的染色が認められた場合に当該マーカー発現陽性（＋）と決定する。フローサイトメトリーまたは免疫組織学的染色に有用なこれらのマーカータンパク質に対する特異的抗体は広く市販されているので、当業者であればこれらの抗体を用いて容易に癌細胞が癌幹細胞であるか否か、あるいは癌に癌幹細胞が含まれるかを評価することができる。

【0020】

更なる態様において、胃癌幹細胞はＣＤ４４^＋である。

【0021】

また、これらの癌幹細胞のマーカー発現の減少を指標に、癌幹細胞の癌非幹細胞への分化を評価することができる。特定条件下での処理前と比較して当該処理後に癌における癌幹細胞のマーカーの発現が減少した場合、当該処理により癌幹細胞の癌非幹細胞への分化が誘導されたとすることができる。ここで、癌細胞全体における癌幹細胞のマーカータンパク質を発現している細胞数の比率、または癌全体における癌幹細胞のマーカータンパク質量のいずれか一方が減少した場合に、癌幹細胞のマーカーの発現が減少したと判断される。

【0022】

本発明において、癌にはあらゆる組織由来の癌が包含される。癌としては、例えば、肝癌、大腸癌、腎臓癌、黒色腫、膵癌、甲状腺癌、胃癌、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌）、脳腫瘍、子宮癌、乳癌、多発性骨肉腫、卵巣癌、慢性白血病、前立腺癌、急性リンパ性白血病、胚細胞腫、急性骨髄性白血病、悪性リンパ腫、繊毛癌、小児悪性腫瘍、胆嚢・胆管癌等が挙げられるが、これらに限定されない。

【0023】

一態様において、本発明の剤が適用される、癌幹細胞を含む癌は、化学療法剤抵抗性である。「化学療法剤抵抗性」とは、ヒトへの適用が認められている最大用量の化学療法剤の投与時において、有意に検出可能な応答を示さない性質をいう。上述のように、癌幹細胞は増殖のスピードが遅いために、化学療法剤に対して抵抗性を示すため、化学療法剤抵抗性の癌には、多くの癌幹細胞が含まれている可能性がある。そこで、特定の化学療法剤に抵抗性を有する癌に対して、本発明の剤または組成物を適用することにより、癌幹細胞から癌非幹細胞への分化が促進され、癌の当該化学療法剤に対する感受性が高くなることが期待される。

【0024】

上述の癌のうち、肝癌、大腸癌、腎臓癌、黒色腫、膵癌、甲状腺癌、胃癌、肺癌、乳癌および非小細胞肺癌は、一般的に化学療法剤に対する感受性が低く、化学療法剤が効きにくいことが知られている。従って、本発明の剤または組成物をこれらの癌（好ましくは胃癌、肝癌、乳癌または大腸癌）に適用し、これらの癌に含まれる癌幹細胞の分化を促進することにより、これらの癌の化学療法剤への感受性が高くなることが期待される。

【0025】

本発明において、化学療法剤とは、癌細胞に直接作用し、その分裂を抑制し、殺傷する能力を有する化合物をいう。化学療法剤としては、代謝拮抗剤、白金製剤、アルキル化剤、抗癌性抗生物質、植物アルカロイド、分子標的治療剤等を挙げることができる。

【0026】

代謝拮抗剤とは、癌細胞が分裂・増殖する際に、核酸の材料となる物質と化学的構造が近似している物質でＤＮＡの合成を妨げ、癌細胞の代謝を阻害して、増殖を抑制する化学療法剤をいう。代謝拮抗剤としては、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、テガフール、カルモフール、ドキシフルリジン、ブロクスウリジン、シタラビン、エノシタビン、ヒドロキシフリジン、ヒドロキシカルバミド、メトトレキサート、リン酸フルダラビン等のピリミジン代謝拮抗剤；６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、チオイノシン、塩酸ゲムシタビン等のプリン代謝拮抗剤等が挙げられる。一態様において、代謝拮抗剤は好ましくはピリミジン代謝拮抗剤であり、より好ましくは５−フルオロウラシルまたはテガフールである。

【0027】

白金製剤とは、ＤＮＡの構成塩基であるグアニン、アデニンのＮ−７位に、２つの塩素原子部位で結合し、ＤＮＡ鎖内に架橋を形成し、ＤＮＡ合成を阻害することによって癌細胞の増殖を抑制する効果を発揮する化学療法剤をいう。白金製剤としては、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン等が挙げられる。

【0028】

アルキル化剤とは、ＤＮＡをアルキル化することにより切断して癌細胞の増殖を抑制する効果を発揮する化学療法剤をいう。アルキル化剤としては、ナイトロジェンマスタード、ナイトロジェンマスタードＮ−オキシド、クロラムブシル等のナイトロジェンマスタード系アルキル化剤；カルボコン、チオテパ等のエチレンイミン誘導体；ブスルファン、トシル酸インプロスルファン等のスルホン酸エステル類；塩酸ニムスチン等のニトロソウレア誘導体等が挙げられる。

【0029】

抗癌性抗生物質としては、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ペプロマイシン、ダウノルビシン、アクラルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン、ＴＨＰ−アドリアマイシン、４’−エピドキソルビシン、エピルビシン等のアントラサイクリン系抗生物質抗腫瘍剤；クロモマイシンＡ_３、アクチノマイシンＤ等が挙げられる。

【0030】

植物アルカロイドとしては、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン等のビンカアルカロイド類；エトポシド、テニポシド等のエピポドフィロトキシン類；パクリタキセル、ドタキセル等のタキサン系アルカロイド等が挙げられる。

【0031】

分子標的治療剤とは、癌細胞の増殖に関わる分子を標的にして、その分子を阻害することにより癌細胞を殺傷する活性を有する化合物をいう。分子標的治療剤としては、イマチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、バンデタニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、リツキシマブ、セツキシマブ、インフリキシマブ、トラスツズマブ、ベバシツマブ等を挙げることができる。

【0032】

一態様において、本発明の剤または組成物は、肝臓癌幹細胞を含む肝臓癌に対する、代謝拮抗剤（好ましくはピリミジン代謝拮抗剤、より好ましくは５−フルオロウラシルまたはテガフール）の抗腫瘍活性を増強するためのものである。

【0033】

一態様において、本発明の剤または組成物は、大腸癌幹細胞を含む大腸癌に対する、代謝拮抗剤（好ましくはピリミジン代謝拮抗剤、より好ましくは５−フルオロウラシルまたはテガフール）の抗腫瘍活性を増強するためのものである。

【0034】

一態様において、本発明の剤または組成物は、胃癌幹細胞を含む胃癌、結腸癌幹細胞を含む結腸癌、子宮頸癌幹細胞を含む子宮頸癌、子宮体癌幹細胞を含む子宮体癌、消化器癌幹細胞を含む消化器癌、膵癌幹細胞を含む膵癌、直腸癌幹細胞を含む直腸癌、乳癌幹細胞を含む乳癌、又は卵巣癌幹細胞を含む卵巣癌に対する、代謝拮抗剤（好ましくはピリミジン代謝拮抗剤、より好ましくは５−フルオロウラシルまたはテガフール）の抗腫瘍活性を増強するためのものである。

【0035】

本発明の剤または組成物における有効成分（分岐鎖アミノ酸）である、イソロイシン、ロイシンおよびバリンはそれぞれＬ−体、Ｄ−体、ＤＬ−体いずれも使用可能であるが、好ましくはＬ−体、ＤＬ−体であり、さらに好ましくはＬ−体である。

【0036】

イソロイシン、ロイシンおよびバリンは、それぞれ、遊離体のみならず、塩の形態でも使用することができる。塩の形態としては、酸付加塩や塩基付加塩等を挙げることができるが、化学的に許容されうる塩であればいずれの形態を採ることもできる。本発明の剤または組成物が通常は医療目的で用いられる観点から、塩の形態としては、医薬として許容される塩が好ましい。

【0037】

医薬として許容される塩としては、例えば酸との塩、塩基との塩が挙げられる。イソロイシン、ロイシンまたはバリンにそれぞれ付加して医薬として許容される塩を形成する酸としては、例えば、塩化水素、臭化水素酸、硫酸、リン酸等の無機酸や、酢酸、乳酸、クエン酸、酒石酸、マレイン酸、フマル酸またはモノメチル硫酸等の有機酸が挙げられる。イソロイシン、ロイシン、またはバリンにそれぞれ付加して医薬として許容される塩を形成する塩基としては、例えば、ナトリウム、カリウムなどの金属の水酸化物や、カルシウム等の金属の炭酸化物、アンモニア等の無機塩基、エチレンジアミン、プロピレンジアミン、エタノールアミン、モノアルキルエタノールアミン、ジアルキルエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン等の有機塩基が挙げられる。

【0038】

本発明の剤または組成物は、イソロイシン、ロイシンおよびバリンから選ばれる少なくとも一種の分岐鎖アミノ酸またはそれらの塩が含有されていれば良く、以下の態様が本発明に包含される：
イソロイシンまたはその塩のみを分岐鎖アミノ酸として含有する態様；
ロイシンまたはその塩のみを分岐鎖アミノ酸として含有する態様；
バリンまたはその塩のみを分岐鎖アミノ酸として含有する態様；
イソロイシンまたはその塩およびロイシンまたはその塩を分岐鎖アミノ酸として含有する態様；
イソロイシンまたはその塩およびバリンまたはその塩を分岐鎖アミノ酸として含有する態様；
ロイシンまたはその塩およびバリンまたはその塩を分岐鎖アミノ酸として含有する態様；並びに
イソロイシンまたはその塩、ロイシンまたはその塩、およびバリンまたはその塩を分岐鎖アミノ酸として含有する態様。
本発明の剤または組成物は、好ましくは、イソロイシンまたはその塩、ロイシンまたはその塩、およびバリンまたはその塩を含有する。

【0039】

本発明の剤または組成物に含まれる分岐鎖アミノ酸の配合比（重量比）は、当業者であれば、本発明の剤が所望の活性（例えば、癌幹細胞の分化を誘導する活性、或いは癌幹細胞を含む癌に対する、化学療法剤の抗腫瘍活性を増強する活性）を有する範囲で、適宜調整することが可能であるが、例えばイソロイシンまたはその塩、ロイシンまたはその塩、およびバリンまたはその塩を含有する態様においては、かかる３種のアミノ酸の配合比（イソロイシン：ロイシン：バリン）は、重量比として、通常１：１〜３：０．５〜２．０であり、好ましくは１：１．５〜２．５：０．８〜１．５であり、より好ましくは１：１．９〜２．２：１．１〜１．３であり、最も好ましくは１：２：１．２である。尚、本発明の剤が、イソロイシンの塩、ロイシンの塩、またはバリンの塩を含有する場合、重量比の計算は、各分岐鎖アミノ酸の塩を、全て遊離体に換算した上で行うものとする。

【0040】

本発明の剤および組成物は、動物（好ましくは、ヒト等の哺乳動物）に投与することができる。

【0041】

本発明の剤または組成物を、癌幹細胞を含む癌に対する、化学療法剤の抗腫瘍活性を増強するための剤（または組成物）、或いは癌幹細胞の分化を誘導するための剤（または組成物）として使用する場合、その投与形態・剤型は、経口投与、非経口投与のいずれでもよく、経口投与剤としては、散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤、チュアブル剤などの固形剤、溶液剤、シロップ剤などの液剤が、また、非経口投与剤としては、注射剤、輸液剤、経鼻・経肺用スプレー剤などが挙げられる。本発明の剤または組成物は、通常の方法によって、これらの剤型の医薬に製剤化することができる。

【0042】

患者への負担を軽減する観点からは、分岐鎖アミノ酸は対象者に対して経口投与することが好ましい。一方、経口投与が困難な患者に対しては、分岐鎖アミノ酸をアミノ酸輸液として経静脈・動脈投与することができる。

【0043】

また、本発明の剤は、製剤上の必要に応じて、適宜の薬学的に許容される担体、例えば、賦形剤、結合剤、滑沢剤、溶剤、崩壊剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤、矯味矯臭剤、着色剤などを配合して製剤化される。さらに本発明の組成物は、上記担体と共に調製することができる。

【0044】

賦形剤としては、乳糖、ブドウ糖、Ｄ−マンニトールなどの糖類、でんぷん類、結晶セルロースなどのセルロース類などの有機系賦形剤、炭酸カルシウム、カオリンなどの無機系賦形剤などが、結合剤としては、α化デンプン、ゼラチン、アラビアゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、結晶セルロース、Ｄ−マンニトール、トレハロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールなどが、滑沢剤としては、ステアリン酸、ステアリン酸塩などの脂肪酸塩、タルク、珪酸塩類などが、溶剤としては、精製水、生理的食塩水などが、崩壊剤としては、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、化学修飾されたセルロースやデンプン類などが、溶解補助剤としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、トレハロース、安息香酸ベンジル、エタノール、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなどが、懸濁化剤あるいは乳化剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、アラビアゴム、ゼラチン、レシチン、モノステアリン酸グリセリン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース類、ポリソルベート類、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などが、等張化剤としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリン、尿素などが、安定化剤としては、ポリエチレングリコール、デキストラン硫酸ナトリウム、その他のアミノ酸類などが、無痛化剤としては、ブドウ糖、グルコン酸カルシウム、塩酸プロカインなどが、防腐剤としては、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが、抗酸化剤としては、亜硫酸塩、アスコルビン酸などが、矯味矯臭剤としては、医薬および食品分野において通常に使用される甘味料、香料などが、着色剤としては、医薬および食品分野において通常に使用される着色料が挙げられる。

【0045】

本発明の剤または組成物における有効成分がアミノ酸であり、安全性に優れているため、一態様において、本発明の剤または組成物は飲食品として提供することが可能である。本発明の剤または組成物を飲食品として提供する場合には、特に困難はなく、例えば、有効成分である分岐鎖アミノ酸（好ましくは、イソロイシンまたはその塩、ロイシンまたはその塩、およびバリンまたはその塩）を、ジュース、牛乳、菓子、ゼリー等の飲食品と混合することにより調製することができる。ビタミン類や他のサプリメント類を添加してもよい。得られた飲食品は保健機能食品として提供することも可能である。

【0046】

保健機能食品とは、身体の生理学的機能や生物学的活動に影響を与える保健機能成分を含み、食生活において特定の保健の目的で摂取をするものに対し、その摂取により当該保健の目的が期待できる食品である。

【0047】

保健機能食品は、場合によっては機能性食品、健康食品（栄養サプリメントを含む）などと称されることもある。機能性食品とは食品中に含まれる生体調節成分の機能を生かして作られる食品であり、健康食品とは一般的には健康増進に役立つとされている食品群のことをいう。その中には特定の栄養素を主成分にした栄養サプリメントも含まれる。

【0048】

保健機能食品には、特定保健用食品および栄養機能食品を含み、化学療法剤の投与を受けている、癌幹細胞を含む癌に罹患している患者、または癌幹細胞を含む癌に罹患歴を有する患者における日常の栄養補助食品として摂食させることによって、癌の当該化学療法剤に対する感受性を高めることができる。

【0049】

このような保健機能食品には、癌幹細胞を含む癌に対する化学療法剤の抗腫瘍活性を増強するために用いるものであることの表示を付すことができる。

【0050】

本発明の剤または組成物に含まれる分岐鎖アミノ酸（好ましくは、イソロイシンまたはその塩、ロイシンまたはその塩、およびバリンまたはその塩）の含有量は、製剤の形態等によって相違するが、通常、製剤全体に対して通常１〜１００重量％、好ましくは１０〜１００重量％、より好ましくは３０〜１００重量％、更に好ましくは５０〜１００重量％である。

【0051】

本発明の剤および組成物の好適な例としては、イソロイシン、ロイシンおよびバリンを、１：２：１．２（イソロイシン：０．９５２ｇ、ロイシン：１．９０４ｇ、バリン：１．１４４ｇ）の重量比で含有する分岐鎖アミノ酸製剤リーバクト（登録商標）顆粒（味の素株式会社）（経口投与剤）を挙げることができる。

【0052】

また、好適な非経口投与剤としては、高濃度アミノ酸輸液類のアミニック（（登録商標）点滴静注（味の素製薬株式会社））、モリヘパミン（（登録商標）点滴静注（味の素製薬株式会社））を挙げることができる。

【0053】

本発明の剤または組成物の投与量は、対象患者の年齢・体重・病態、投与方法などによっても異なるが、イソロイシンまたはその塩、ロイシンまたはその塩、およびバリンまたはその塩を含有する態様においては、一般の成人の場合、通常１日量として、イソロイシン０．５〜３０．０ｇ、ロイシン１．０〜６０．０ｇ、バリン０．５〜３０．０ｇを目安とする。好ましくは、一日量として、イソロイシン２．０〜１０．０ｇ、ロイシン３．０〜２０．０ｇ、バリン２．０〜１０．０ｇ、より好ましくは、イソロイシン２．５〜３．５ｇ、ロイシン５．０〜７．０ｇ、バリン３．０〜４．０ｇであり、３種の分岐鎖アミノ酸の全体量としては１日当たり２．０ｇ〜５０．０ｇ程度が好ましく、これを必要に応じて１〜６回、好ましくは１〜３回に分割して投与する。尚、本発明の剤または組成物が、分岐鎖アミノ酸の塩を含有する場合、投与量の計算は、各分岐鎖アミノ酸の塩を、全て遊離体に換算した上で行うものとする。

【0054】

上記本発明で使用する有効成分である分岐鎖アミノ酸の投与量（摂取量）について算出する際、本発明で目的とする疾患の治療、予防等の目的で使用される薬剤の有効成分として前記の算定範囲が決められているので、これとは別目的で、例えば通常の食生活の必要から、あるいは別の疾患の治療目的で、摂取または投与される分岐鎖アミノ酸についてはこれを前記算定に含める必要はない。例えば、通常の食生活から摂取される一日あたりの分岐鎖アミノ酸の量を前記本発明における有効成分の一日あたりの投与量から控除して算定する必要はない。

【0055】

本発明の剤が、イソロイシン、ロイシンおよびバリンから選ばれる二種または三種の分岐鎖アミノ酸またはその塩を含む態様である場合、本発明の有効成分であるイソロイシン、ロイシンおよびバリンまたはそれらの塩は、それぞれが単独で、若しくは任意の組み合わせで製剤に含有されていてもよく、または全てが１種の製剤中に含有されていてもよい。別途製剤化して投与する場合、それらの投与経路、投与剤形は同一であっても、異なっていてもよく、また各々を投与するタイミングも、同時であっても別々であってもよい。併用する薬剤の種類や効果によって適宜決定する。即ち、本発明の剤は、複数の分岐鎖アミノ酸またはそれらの塩を同時に含有する製剤であってもよく、又、それぞれを別途製剤化して併用するような併用剤であってもよい。これらの形態全てを包含するものである。特に、同一製剤中に全ての分岐鎖アミノ酸またはそれらの塩を含有する態様（例えば、同一製剤中に、イソロイシンまたはその塩、ロイシンまたはその塩、およびバリンまたはその塩を含有する態様）が、簡便に投与できて好ましい。

【0056】

本発明において、「重量比」とは、本発明の剤および組成物中のそれぞれのアミノ酸成分の重量の比を示す。例えば、イソロイシン、ロイシンおよびバリンの各有効成分を１つの製剤中に含めた場合には個々の含有量の比であり、各有効成分のそれぞれを単独でまたは任意の組み合わせで複数製剤中に含めた場合には、各製剤に含められる各有効成分の重量の比である。

【0057】

また本発明において、実際の投与量の比は、投与対象（即ち患者）あたりの各有効成分１回投与量あるいは１日投与量の比である。例えば、イソロイシン、ロイシンおよびバリンの各有効成分を１つの製剤中に含め、それを投与対象に投与する場合には、重量比が投与量比に相当する。各有効成分を単独でまたは任意の組み合わせで複数の製剤中に含めて投与する場合には、１回あるいは１日投与した各製剤中の各有効成分の合計量の比が重量比に相当する。

【0058】

イソロイシン、ロイシン、およびバリンは既に、医薬・食品分野において広く用いられていて、安全性は確立しており、例えば、これらの分岐鎖アミノ酸を１：２：１．２の比で含有する本発明の剤および組成物における急性毒性（ＬＤ５０）は、マウスの経口投与において１０ｇ／Ｋｇ以上である。

【0059】

上述の通り、イソロイシン、ロイシンおよびバリンから選ばれる少なくとも一種の分岐鎖アミノ酸またはその塩（好ましくは、イソロイシンまたはその塩、ロイシンまたはその塩、およびバリンまたはその塩を含む組み合わせ）が、癌幹細胞の癌非幹細胞への分化を促進し、この効果により癌幹細胞を含む癌に対する、化学療法剤の抗腫瘍活性を増強する。従って、一態様において、本発明の剤または組成物は、癌幹細胞を含む癌を罹患している哺乳動物（例、ヒト）に対して投与される。該哺乳動物が保持している癌に含まれる癌幹細胞に、イソロイシン、ロイシンおよびバリンから選ばれる少なくとも一種の分岐鎖アミノ酸またはその塩（好ましくは、イソロイシンまたはその塩、ロイシンまたはその塩、およびバリンまたはその塩を含む組み合わせ）が作用することにより、癌幹細胞の癌非幹細胞への分化が促進され、該癌に対する化学療法剤の抗腫瘍活性が増強される。

【0060】

更なる態様において、イソロイシン、ロイシンおよびバリンから選ばれる少なくとも一種の分岐鎖アミノ酸またはその塩（好ましくは、イソロイシンまたはその塩、ロイシンまたはその塩、およびバリンまたはその塩を含む組み合わせ）が、癌幹細胞の癌非幹細胞への分化を促進し、ＣＤ４４等の癌の転移に関与する接着分子の発現を抑制し、この効果により癌幹細胞を含む癌の転移能が抑制される。従って、一態様において、本発明の剤または組成物は、癌幹細胞を含む癌を罹患している哺乳動物（例、ヒト）に対して投与される。該哺乳動物が保持している癌に含まれる癌幹細胞に、イソロイシン、ロイシンおよびバリンから選ばれる少なくとも一種の分岐鎖アミノ酸またはその塩（好ましくは、イソロイシンまたはその塩、ロイシンまたはその塩、およびバリンまたはその塩を含む組み合わせ）が作用することにより、癌幹細胞の癌非幹細胞への分化が促進され、化学療法剤の併用を要することなく、該癌の転移が抑制される。

【0061】

別の態様において、本発明の剤または組成物は、癌幹細胞を含む癌の罹患歴を有する哺乳動物（例、ヒト）に対して投与される。癌幹細胞は、一般に細胞増殖がおそく、化学療法剤に対して抵抗性であるため、いったん癌幹細胞を含む癌を発症した場合、化学療法剤等による治療の結果、見かけ上は癌が寛解し、癌の症状が消失した場合であっても、体内に癌幹細胞が残存していて、これが癌の転移や再発の原因となっていると考えられている。癌の再発とは、治療により癌の症状が完全にまたは一部寛解した後に、再び癌細胞が増殖し、癌の症状が再び現れるかまたは悪化することを意味する。従って、本発明の剤または組成物を、癌幹細胞を含む癌の罹患歴を有する哺乳動物（例、ヒト）に対して投与することにより、その哺乳動物の体内に残存している可能性がある癌幹細胞の癌非幹細胞への分化を促進し、化学療法剤に対する感受性を増強する。

【0062】

従って、好ましい態様において、本発明の剤または組成物は、化学療法剤と組み合わせて、哺乳動物に投与される。本発明の剤または組成物を、化学療法剤と組み合わせて、癌幹細胞を含む癌を罹患している哺乳動物に投与することにより、該癌を効率的に治療することができる。また、本発明の剤または組成物を、化学療法剤と組み合わせて、癌幹細胞を含む癌の罹患歴を有する哺乳動物に投与することにより、該癌の転移や再発を効率的に予防することができる。

【0063】

従って、本発明は、イソロイシン、ロイシンおよびバリンから選ばれる少なくとも一種の分岐鎖アミノ酸またはその塩（好ましくは、イソロイシンまたはその塩、ロイシンまたはその塩、およびバリンまたはその塩）（以下これらを単に分岐鎖アミノ酸と呼ぶことがある）と、化学療法剤とを組み合わせてなる、癌幹細胞を含む癌を治療するための剤（または組成物）および／または癌幹細胞を含む癌の転移または再発を予防するための剤（または組成物）（以下、これらの製剤を本発明の予防または治療剤とも称する）をも提供するものである。

【0064】

本発明の予防または治療剤に係る各用語の定義は、特に断りのない限り、上述の本発明の剤または組成物に係る各用語の定義と同一である。

【0065】

本発明の予防または治療剤を適用することが可能な癌は、上記本発明の剤または組成物が適用可能な癌と同一である。一態様において、本発明の剤が適用される、癌幹細胞を含む癌は、化学療法剤抵抗性である。

【0066】

癌のうち、肝癌、大腸癌、腎臓癌、黒色腫、膵癌、甲状腺癌、胃癌、肺癌、乳癌および非小細胞肺癌は、一般的に化学療法剤に対する感受性が低く、化学療法剤が効きにくいことが知られている。従って、本発明の予防または治療剤をこれらの癌（好ましくは胃癌、肝癌、乳癌または大腸癌）に適用すると、本発明の予防または治療剤に含まれる分岐鎖アミノ酸（好ましくは、イソロイシンまたはその塩、ロイシンまたはその塩、およびバリンまたはその塩）が癌に含まれる癌幹細胞の分化を促進し、これらの癌の化学療法剤への感受性が高くなり、そこへ本発明の予防または治療剤に含まれる化学療法剤が作用することにより、結果的に癌幹細胞の効果的な殺傷が期待される。

【0067】

一態様において、本発明の予防または治療剤は、化学療法剤として代謝拮抗剤（好ましくはピリミジン代謝拮抗剤、より好ましくは５−フルオロウラシルまたはテガフール）を含み、肝臓癌幹細胞を含む肝臓癌を予防または治療するためのものである。

【0068】

一態様において、本発明の予防または治療剤は、化学療法剤として代謝拮抗剤（好ましくはピリミジン代謝拮抗剤、より好ましくは５−フルオロウラシルまたはテガフール）を含み、大腸癌幹細胞を含む大腸癌を予防または治療するためのものである。

【0069】

更なる態様において、本発明の予防または治療剤は、化学療法剤として代謝拮抗剤（好ましくはピリミジン代謝拮抗剤、より好ましくは５−フルオロウラシルまたはテガフール）を含み、胃癌幹細胞を含む胃癌を予防または治療するためのものである。

【0070】

一態様において、本発明の予防または治療剤は、化学療法剤として代謝拮抗剤（好ましくはピリミジン代謝拮抗剤、より好ましくは５−フルオロウラシルまたはテガフール）を含み、胃癌幹細胞を含む胃癌、結腸癌幹細胞を含む結腸癌、子宮頸癌幹細胞を含む子宮頸癌、子宮体癌幹細胞を含む子宮体癌、消化器癌幹細胞を含む消化器癌、膵癌幹細胞を含む膵癌、直腸癌幹細胞を含む直腸癌、乳癌幹細胞を含む乳癌、又は卵巣癌幹細胞を含む卵巣癌を予防または治療するためのものである。

【0071】

分岐鎖アミノ酸と化学療法剤の併用に際しては、分岐鎖アミノ酸と化学療法剤の投与時期は限定されず、分岐鎖アミノ酸と化学療法剤とを、投与対象に対し、同時に投与してもよいし、時間差をおいて投与してもよい。分岐鎖アミノ酸および化学療法剤の投与量は、目的とする効果（癌幹細胞を含む癌を治療する効果、癌幹細胞を含む癌の転移または再発を予防する効果）を達成し得る範囲で特に限定されず、投与対象、投与ルート、症状、組み合わせ等により適宜選択することが出来る。分岐鎖アミノ酸は、好ましくは、癌幹細胞の癌非幹細胞への分化を促進する量が投与され、化学療法剤は、当該癌非幹細胞を殺傷する量が投与される。

【0072】

分岐鎖アミノ酸と化学療法剤の投与形態は、特に限定されず、投与時に、分岐鎖アミノ酸と化学療法剤とが組み合わされていればよい。このような投与形態としては、例えば、（１）分岐鎖アミノ酸と化学療法剤とを同時に製剤化して得られる単一の製剤の投与、（２）分岐鎖アミノ酸と化学療法剤とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の同一投与経路での同時投与、（３）分岐鎖アミノ酸と化学療法剤とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の同一投与経路での時間差をおいての投与、（４）分岐鎖アミノ酸と化学療法剤とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の異なる投与経路での同時投与、（５）分岐鎖アミノ酸と化学療法剤とを別々に製剤化して得られる２種の製剤の異なる投与経路での時間差をおいての投与（例えば、分岐鎖アミノ酸→化学療法剤の順序での投与、あるいは逆の順序での投与）等が挙げられる。

【0073】

本発明の予防または治療剤の投与形態・剤型は、経口投与、非経口投与のいずれでもよく、経口投与剤としては、散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤、チュアブル剤などの固形剤、溶液剤、シロップ剤などの液剤が、また、非経口投与剤としては、注射剤、輸液剤、経鼻・経肺用スプレー剤などが挙げられる。本発明の剤または組成物は、通常の方法によって、これらの剤型の医薬に製剤化することができる。

【0074】

また、本発明の予防または治療剤は、製剤上の必要に応じて、適宜の薬学的に許容される担体、例えば、賦形剤、結合剤、滑沢剤、溶剤、崩壊剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤、矯味矯臭剤、着色剤などを配合して製剤化される。

【0075】

分岐鎖アミノ酸と化学療法剤とを別々に製剤化する場合、分岐鎖アミノ酸を含む製剤中の分岐鎖アミノ酸の含有量は、上述の本発明の剤または組成物と同一である。

【0076】

また、分岐鎖アミノ酸と化学療法剤とを別々に製剤化する場合、化学療法剤を含む製剤中の化学療法剤の含有量は、分岐鎖アミノ酸との併用により、癌幹細胞を含む癌を治療し、または癌幹細胞を含む癌の転移または再発を予防し得る限り特に限定されず、製剤の形態や化学療法剤の種類によって相違するが、通常、製剤全体に対して約０．１〜９９．９重量％、好ましくは約１〜９９重量％、さらに好ましくは約１０〜９０重量％程度である。

【0077】

分岐鎖アミノ酸および化学療法剤を同時に製剤化して単一の製剤として使用する場合も、上記に準じた含有量でよい。この場合、分岐鎖アミノ酸と化学療法剤との配合比は、投与対象、投与ルート、症状、化学療法剤の種類等により適宜選択することができる。

【0078】

分岐鎖アミノ酸の投与量は、上述の本発明の剤または組成物における分岐鎖アミノ酸の投与量と同一であり、イソロイシンまたはその塩、ロイシンまたはその塩、およびバリンまたはその塩を含有する態様においては、一般の成人の場合、通常１日量として、イソロイシン０．５〜３０．０ｇ、ロイシン１．０〜６０．０ｇ、バリン０．５〜３０．０ｇを目安とする。好ましくは、一日量として、イソロイシン２．０〜１０．０ｇ、ロイシン３．０〜２０．０ｇ、バリン２．０〜１０．０ｇ、より好ましくは、イソロイシン２．５〜３．５ｇ、ロイシン５．０〜７．０ｇ、バリン３．０〜４．０ｇであり、３種の分岐鎖アミノ酸の全体量としては１日当たり２．０ｇ〜５０．０ｇ程度が好ましく、これを必要に応じて１〜６回、好ましくは１〜３回に分割して投与する。

【0079】

化学療法剤の投与量は、分岐鎖アミノ酸との併用により、癌幹細胞を含む癌を治療し、または癌幹細胞を含む癌の転移または再発を予防し得る限り特に限定されず、投与対象、症状、投与ルート、抗腫瘍剤の種類等により適宜設定することができる。

【0080】

分岐鎖アミノ酸および／または化学療法剤の投与頻度は、投与対象、症状、投与ルート、抗腫瘍剤の種類などによっても異なるが、例えば１〜７日に１回の頻度、好ましくは１〜３日に１回の頻度である。分岐鎖アミノ酸および／または化学療法剤の投与回数は、投与対象、症状、投与ルート、抗腫瘍剤の種類などによっても異なるが、通常１〜１５回、好ましくは２〜１０回程度である。

【0081】

上述の分岐鎖アミノ酸と化学療法剤をそれぞれ別々に製剤化して併用投与するに際しては、分岐鎖アミノ酸を含有する製剤と化学療法剤を含有する製剤とを同時期に投与してもよいが、化学療法剤を含有する製剤を先に投与した後、分岐鎖アミノ酸を含有する製剤を投与してもよいし、分岐鎖アミノ酸を含有する製剤を先に投与し、その後で化学療法剤を含有する製剤を投与してもよい。時間差をおいて投与する場合、時間差は投与する有効成分、剤形、投与方法により異なるが、例えば、分岐鎖アミノ酸を含有する製剤を先に投与する場合、分岐鎖アミノ酸を含有する製剤を投与した後、１分〜１４日以内に化学療法剤を含有する製剤を投与する方法が挙げられる。化学療法剤を含有する製剤を先に投与する場合、化学療法剤を投与した後１分〜１４日以内に分岐鎖アミノ酸を含有する製剤を投与する方法が挙げられる。

【0082】

上述の通り、癌幹細胞は、増殖のスピードが遅いために、化学療法剤に対して抵抗性を有する。これに対して、分化した癌細胞（癌非幹細胞）は、一般に増殖のスピードが速いために、化学療法剤に対する感受性が高い。そこで、癌幹細胞にイソロイシン、ロイシンおよびバリンから選ばれる少なくとも一種の分岐鎖アミノ酸またはその塩（好ましくは、イソロイシンまたはその塩、ロイシンまたはその塩、およびバリンまたはその塩）を適用し、癌幹細胞の癌非幹細胞への分化を促進することにより、癌幹細胞を含む癌の化学療法剤への感受性が高まり、結果として、高い効率で癌幹細胞を含む癌を殺傷することが可能になる。

【0083】

このような理論に基づけば、化学療法剤の投与は、上述の分岐鎖アミノ酸（好ましくは、イソロイシンまたはその塩、ロイシンまたはその塩、およびバリンまたはその塩）の投与と同時または上述の分岐鎖アミノ酸（好ましくは、イソロイシンまたはその塩、ロイシンまたはその塩、およびバリンまたはその塩）の投与から一定期間後であることが好ましい。即ち、本発明の治療または予防剤の投与態様には、好ましくは上述の分岐鎖アミノ酸（好ましくは、イソロイシンまたはその塩、ロイシンまたはその塩、およびバリンまたはその塩）と化学療法剤とを同時に投与する工程、または上述の分岐鎖アミノ酸（好ましくは、イソロイシンまたはその塩、ロイシンまたはその塩、およびバリンまたはその塩）を投与し、その後化学療法剤を投与する工程が含まれる。

【0084】

従って、本発明の予防または治療剤の投与プロトコールには、好ましくは、
（１）上述の分岐鎖アミノ酸（好ましくは、イソロイシンまたはその塩、ロイシンまたはその塩、およびバリンまたはその塩）および化学療法剤を同時に単回または複数回投与すること、
（２）第一段階として上述の分岐鎖アミノ酸（好ましくは、イソロイシンまたはその塩、ロイシンまたはその塩、およびバリンまたはその塩）を単回または複数回投与し、第二段階として化学療法剤を単回または複数回投与すること、
（３）第一段階として上述の分岐鎖アミノ酸（好ましくは、イソロイシンまたはその塩、ロイシンまたはその塩、およびバリンまたはその塩）を単回または複数回投与し、第二段階として上述の分岐鎖アミノ酸（好ましくは、イソロイシンまたはその塩、ロイシンまたはその塩、およびバリンまたはその塩）および化学療法剤を同時期に単回または複数回投与すること、
（４）（２）または（３）の工程を複数回繰り返すこと
等の工程が含まれる。

【0085】

（１）の具体的な態様としては、例えば、肝臓癌幹細胞を含む肝臓癌を予防または治療する場合に、上述の分岐鎖アミノ酸（好ましくは、イソロイシンまたはその塩、ロイシンまたはその塩、およびバリンまたはその塩）を含有する輸液剤を、肝動脈注入化学療法施行時に化学療法剤とともに動脈内に注入することを挙げることができる。更に、インターフェロンを上記輸液剤及び化学療法剤とともに動脈内に注入してもよい。

【0086】

（２）〜（４）において、第一段階の最後の投与と第二段階の最後の投与との間隔は、投与対象、症状、投与ルート、化学療法剤の種類などによっても異なるが、通常１分〜１４日以内である。

【0087】

（２）〜（４）において、第一段階における上述の分岐鎖アミノ酸（好ましくは、イソロイシンまたはその塩、ロイシンまたはその塩、およびバリンまたはその塩）の投与の後に、癌幹細胞が癌非幹細胞へ分化したか否かを確認してもよい。当該確認は、例えば上述したように、癌幹細胞のマーカーの発現を、当該マーカータンパク質を特異的に認識する抗体を用いた免疫学的手法により、測定することにより実施することができる。上述の分岐鎖アミノ酸の投与前と比較して当該投与後において癌における癌幹細胞のマーカーの発現が減少した場合に、当該投与により癌幹細胞の癌非幹細胞への分化が誘導されたとすることができる。そして、癌幹細胞の癌非幹細胞への分化の誘導を確認した後で、第二段階である化学療法剤の投与を実施することができる。

【0088】

更なる態様において、本発明の剤または組成物を、癌幹細胞を含む癌の罹患歴を有する哺乳動物（例、ヒト）に対して投与することにより、その哺乳動物の体内に残存している可能性がある癌幹細胞の癌非幹細胞への分化を促進し、癌幹細胞の癌非幹細胞への分化が促進され、ＣＤ４４等の癌の転移に関与する接着分子の発現を抑制し、この効果により癌幹細胞を含む癌の転移能が抑制される。従って、本発明の剤または組成物を、癌幹細胞を含む癌の罹患歴を有する哺乳動物に投与することにより、化学療法剤の併用を要することなく、該癌の転移や再発を効率的に予防することができる。

【実施例】

【0089】

次に、実施例により本発明をさらに詳細に述べる。なお、以下の実施例は、本発明の一例について具体的に説明するものであって、本発明をこれに限定するものではない。

【0090】

実施例１：ヒト肝臓癌細胞株ＨＡＫ４における幹細胞マーカーおよび分化マーカーの発現に対するＢＣＡＡの効果
ヒト肝臓癌細胞株ＨＡＫ４を１２０００個／ｗｅｌｌの濃度でプレートに播種し、２ｍＭＢＣＡＡまたはＬＣ２．５％培地中で７２時間培養した。ＢＣＡＡはイソロイシン、ロイシンおよびバリンからなる混合物（重量比：イソロイシン：ロイシン：バリン＝１：２：１．２）である。ＢＣＡＡの濃度「２ｍＭ」は、イソロイシン、ロイシンおよびバリンの全アミノ酸の濃度の合計である。
ＬＣ２．５％培地の組成を以下の表に示す。尚、ＬＣ２．５％の「２．５％」は牛血清の含有量を示している。

【0091】

【表1】

【0092】

なお、Fischer’s ratioは、Valine + Leucine + Isoleucine/ Tyrosine + Phenylalanineを意味する。

【0093】

７２時間培養後に細胞を回収し、細胞のペレットに１ｍｌのＩＳＯＧＥＮ（ニッポン・ジーン）を加えることにより細胞を溶解し、５分間室温に静置した。得られた溶解物に０．２ｍｌのクロロホルムを加え、１５秒間激しく振り、２〜３分間室温に静置し、１２０００×ｇ、４℃にて１５分間遠心分離した。有機相および中間相を除去し、得られた水相に０．５ｍｌのイソプロパノールを加え、５〜１０分間室温に静置し、１２０００×ｇ、４℃にて１０分間遠心分離した。上清を除き、沈殿物に少なくとも１ｍｌの７５（ｖ／ｖ）％エタノールを加え、ボルテックスをし、７５００×ｇ、４℃にて５分間遠心分離した。上清を除き、沈殿物を短時間乾燥し、蒸留水を加え、溶解することにより、全ＲＮＡ溶液を得た。

【0094】

ＲＴ−ＰＣＲ７５００を用いたＲＴ−ＰＣＲにより、ＥｐＣＡＭ（Epithelial cell adhesion molecule；肝臓癌幹細胞のマーカー）、ＡＦＰ（α-feto protein；肝臓癌マーカーおよび肝臓癌幹細胞のマーカー)およびＣＹＰ３Ａ４（cytochrome P450 3A4；分化マーカー)のｍＲＮＡの発現を定量した。ＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマーを以下の表に示す。

【0095】

【表2】

【0096】

結果を図１に示す。ＢＣＡＡにより、ＨＡＫ４細胞において、肝臓癌幹細胞のマーカーであるＥｐＣＡＭおよびＡＦＰの発現が低下し、分化マーカーであるＣＹＰ３Ａ４の発現が上昇した。

【0097】

実施例２：ヒト肝臓癌細胞株ＨＡＫ４に対する５ＦＵ（5-fluorouracil）とＢＣＡＡとの併用の効果（in vitro試験）
ヒト肝臓癌細胞株ＨＡＫ４を３０００個／ｗｅｌｌの濃度でプレートに播種し、以下の条件下で７２時間培養した：
・ＬＣ２．５％培地
・ＢＣＡＡ（２ｍＭ）
・５ＦＵ（２．５μｇ／ｍｌ）
・ＢＣＡＡ（２ｍＭ）＋５ＦＵ（２．５μｇ／ｍｌ）

【0098】

７２時間後に、ApoAlert Annexin V-FITC Apoptosis kit（Clontech）を用いて細胞をannexin Vで染色および固定し、Array Scan（Thermo Fisher）でアポトーシス細胞(%)を検出した。
即ち、９６穴プレート中の細胞を1X Binding Bufferでリンスし、各ウェルにannexin V（１μｌ）を含有する1X Binding Bufferを４０μｌ加え、暗中、室温にて５〜１５分間、インキュベートした。細胞を洗浄し、２％ホルムアルデヒド中で固定した。ヘキスト３３２５８溶液を含むＰＢＳを１００μｌ加え、暗中５分間インキュベートした後、Array Scanでアポトーシス細胞(%)を検出した。

【0099】

結果を図２に示す。ＢＣＡＡ単独処理では、アポトーシス細胞数に有意な変化は認められなかった。５ＦＵ単独処理によりアポトーシス細胞が増加し、ＢＣＡＡを併用すると、５ＦＵによるアポトーシス誘導を増強した。以上の結果から、ＢＣＡＡは、５ＦＵの抗腫瘍効果を増強することが示唆された。

【0100】

実施例３：ヒト肝臓癌細胞株ＨＡＫ１Ｂにおける幹細胞マーカーおよび分化マーカーの発現に対するＢＣＡＡの効果
実施例１と同様に、ヒト肝臓癌細胞株ＨＡＫ１Ｂを４０００個／ｗｅｌｌの濃度でプレートに播種し、２ｍＭＢＣＡＡまたはＬＣ２．５％培地中で７２時間培養した。７２時間培養後に細胞を回収し、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポン・ジーン）により全ＲＮＡを精製した。ＲＴ−ＰＣＲにより、ＥｐＣＡＭ、ＡＦＰおよびＣＹＰ３Ａ４のｍＲＮＡの発現を定量した。

【0101】

結果を図３に示す。ＢＣＡＡにより、ＨＡＫ４細胞と同様に、ＨＡＫ１Ｂ細胞においても、肝臓癌幹細胞のマーカーであるＥｐＣＡＭおよびＡＦＰの発現が低下し、分化マーカーであるＣＹＰ３Ａ４の発現が上昇した。以上の結果から、ＢＣＡＡが肝臓癌の癌幹細胞の癌非幹細胞への分化を誘導し、癌幹細胞を減少させることが示唆された。

【0102】

実施例４：ヒト肝臓癌細胞株ＨＡＫ１Ｂに対する５ＦＵ（5-fluorouracil）とＢＣＡＡとの併用の効果（in vivo試験）
7週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（日本チャールスリバーより購入）にＨＡＫ１Ｂ細胞を７００万個／個体皮下移植した。１週間後に腫瘍面積に基づき群分けを実施した。５ＦＵ２５０μｇ／ｔｕｍｏｒ（ｖｅｈｉｃｌｅ１０％ＤＭＳＯ／ＤＷ）を腫瘍内に投与すると共に（Cancer Research, 70(11), 4687-4697, 2010参照）、３（ｗ／ｗ）％ＢＣＡＡ混餌食または３（ｗ／ｗ）％カゼイン混餌食を２週間供与した。即ち、４つの群における処置は以下の通りである：
１群：ｖｅｈｉｃｌｅ＋カゼイン混餌食（コントロール群）
２群：５ＦＵ＋カゼイン混餌食
３群：ｖｅｈｉｃｌｅ＋ＢＣＡＡ混餌食
４群：５ＦＵ＋ＢＣＡＡ混餌食
ノギスを用いて腫瘍外側から腫瘍体積（長径ｘ短径ｘ高さ（ｍｍ^３））を測定することにより、経時的な腫瘍体積変化をモニターした。43日目に剖検をし、腫瘍の重量および体積を計測した。

【0103】

結果を図４〜６に示す。ＢＣＡＡ単独処理群（３群）では、コントロール群（１群）と比較して、腫瘍重量および腫瘍体積における有意な変化は認められなかった。５ＦＵ単独処理により腫瘍重量および腫瘍体積が有意に減少し（２群）、ＢＣＡＡを併用すると、５ＦＵによる腫瘍重量および腫瘍体積の減少効果が増強された。以上の結果から、ＢＣＡＡは、インビボにおいても５ＦＵの抗腫瘍効果を増強することが示唆された。

【0104】

実施例５：ヒト大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６における幹細胞マーカーの発現に対するＢＣＡＡの効果
ＨＣＴ１１６細胞（ヒト大腸癌細胞株）を４０００個／ｗｅｌｌでプレートに播種し、２ｍＭＢＣＡＡまたはＬＣ２．５％培地中で７２時間培養した。７２時間培養後に細胞を回収し、抗ＣＤ４４抗体（一次抗体）と１時間室温にてインキュベートし、更にＣｙ５をコンジュゲートした二次抗体と１時間室温にてインキュベートした。細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、ヘキスト３３２５８溶液で染色し（５分間室温にてインキュベーション）、染色液をＰＢＳで置換し、Array ScanによりＣＤ４４陽性細胞の割合を解析した。ＣＤ４４は大腸癌幹細胞マーカーである。

【0105】

結果を図７に示す。ＢＣＡＡにより、ＨＣＴ１１６細胞において、大腸癌幹細胞のマーカーであるＣＤ４４の発現が有意に低下した。以上の結果から、ＢＣＡＡが肝臓癌幹細胞のみならず、大腸癌幹細胞の非幹細胞への分化を誘導することが示唆された。

【0106】

実施例６：ヒト大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６に対する５ＦＵとＢＣＡＡとの併用の効果（in vitro試験）
ＨＣＴ１１６細胞（ヒト大腸癌細胞株）を４０００個／ｗｅｌｌの濃度でプレートに播種し、以下の条件下で７２時間培養した：
・ＬＣ２．５％培地
・ＢＣＡＡ（２ｍＭ）
・５ＦＵ（２μｇ／ｍｌ）
・ＢＣＡＡ（２ｍＭ）＋５ＦＵ（２μｇ／ｍｌ）

【0107】

７２時間後に、ApoAlert Annexin V-FITC Apoptosis kit（Clontech）を用いて細胞をannexin Vで染色および固定し、Array Scan（Thermo Fisher）でアポトーシス細胞(%)を検出した。

【0108】

結果を図８に示す。５ＦＵ単独処理によりアポトーシス細胞が増加し、ＢＣＡＡを併用すると、５ＦＵによるアポトーシス誘導が増強された。以上の結果から、ＢＣＡＡは、肝臓癌のみならず大腸癌においても、５ＦＵの抗腫瘍効果を増強することが示唆された。

【0109】

実施例７：ヒト大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６の転移に対するＢＣＡＡの効果（in vivo試験）
ヒト大腸癌細胞ＨＣＴ１１６を、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（雌、６週齢、各群５匹）に１ｘ１０^５個／匹移植した。ＨＣＴ１１６細胞は、予め７日間、４ｍＭＢＣＡＡで処理をした。コントロール群は、ＨＣＴ１１６細胞を４ｍＭＢＣＡＡで処理していない。細胞の移植は、マウスの筋層を切開後、脾臓を露出し、脾臓の両端血管を緩く糸で縛り、脾臓へ注射針でゆっくりＨＣＴ１１６細胞を移入し（１００μｌ）、両端の糸を縛って止血後、脾臓を摘出し、筋層を縫合し、皮膚をホッチキスで止めることにより行った。３週間、マウスを通常飼育した後に、マウスを安楽死させ、肝臓表面の転移癌の個数を測定した。

【0110】

その結果、コントロール群では、５匹全てのマウスにおいて肝臓表面に転移癌の形成が認められたが、ＢＣＡＡ処理群では、１匹のみにおいて、転移癌の形成が認められた。また、１匹あたりの転移癌の個数も、ＢＣＡＡ処理により有意に抑制された（図９）。以上の結果から、ＢＣＡＡは大腸癌の転移能を減少させることが示された。また、実施例５の結果と併せると、このＢＣＡＡによる大腸癌の転移抑制効果は、ＣＤ４４の発現低下による可能性が示唆された。

【0111】

実施例８：ヒト胃癌細胞株ＭＫＮ４５に対する５ＦＵとＢＣＡＡとの併用の効果（in vitro試験）
ＭＫＮ４５細胞（ヒト胃癌細胞株）を４０００個／１００μｌ／ｗｅｌｌで９６穴プレートに播種し、以下の条件で７２時間培養した：
・ＬＣ培地（１０％ＦＢＳ）
・ＬＣ培地＋ＢＣＡＡ（２ｍＭ又は４ｍＭ）
・ＬＣ培地＋５ＦＵ（０．０５μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ又は１μｇ／ｍｌ）
・ＬＣ培地＋ＢＣＡＡ（２ｍＭ又は４ｍＭ）＋５ＦＵ（０．０５μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ又は１μｇ／ｍｌ）

【0112】

７２時間後に、ＷＳＴ−８試薬を添加し（１０μｌ／ｗｅｌｌ）、１時間発色後、ＯＤ４５０ｎｍの吸光度を測定した。無刺激群の吸光度を１００％としたときの相対値で各群の吸光度を表した。尚、ＷＳＴ−８は細胞内脱水素酵素により還元され、水溶性のホルマザンを生成し、このホルマザンの４５０ｎｍの吸光度を直接測定することにより、容易に生細胞数を計測することができる。細胞数と生成するホルマザンの量は直線的な比例関係にある。

【0113】

結果を図１０に示す。５ＦＵ単独処理により生細胞数が減少し、ＢＣＡＡを併用すると、５ＦＵによる生細胞数の減少が増強された。以上の結果から、ＢＣＡＡは、胃癌においても、５ＦＵの抗腫瘍効果を増強することが示唆された。

【0114】

実施例９：ヒト胃癌細胞株ＭＫＮ４５に対する５ＦＵとＢＣＡＡとの併用の効果（in vitro試験）
ＭＫＮ４５細胞（ヒト胃癌細胞株）を４０００個／１００μｌ／ｗｅｌｌで９６穴プレートに播種し、以下の条件下で７２時間培養した：
・ＬＣ培地（１０％ＦＢＳ）
・ＬＣ培地＋ＢＣＡＡ（２ｍＭ又は４ｍＭ）
・ＬＣ培地＋５ＦＵ（０．０５μｇ／ｍｌ又は０．１μｇ／ｍｌ）
・ＬＣ培地＋ＢＣＡＡ（２ｍＭ又は４ｍＭ）＋５ＦＵ（０．０５μｇ／ｍｌ又は０．１μｇ／ｍｌ）

【0115】

７２時間後に、上清を除去し、パラホルムアルデヒドで細胞を固定後、Hoechst試薬で核染色し、アレイスキャンのcell cycleモードでアポトーシス細胞の割合を解析した。

【0116】

結果を図１１に示す。５ＦＵとＢＣＡＡとの併用により、アポトーシス細胞数が有意に増加した。以上の結果から、ＢＣＡＡによる、５ＦＵの胃癌に対する抗腫瘍効果の増強は、アポトーシスの増強による可能性が示唆された。

【0117】

実施例１０：ヒト胃癌細胞株ＭＫＮ４５における幹細胞マーカーの発現に対するＢＣＡＡの効果
ＭＫＮ４５細胞（ヒト胃癌細胞株）を４０００個／１００μｌ／ｗｅｌｌで９６穴プレートに播種し、ＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＢＳ）或いはＢＣＡＡ（２ｍＭ又は４ｍＭ）含有ＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＢＳ）中で７２時間培養した。７２時間後に上清を除去し、パラホルムアルデヒドで固定後、抗ＣＤ４４抗体（一次抗体）と１時間室温にてインキュベートし、更にＴｅｘａｓＲｅｄをコンジュゲートした二次抗体と１時間インキュベートした。上清を除去し、Hoechst試薬で核染色後、Array Scanのtarget activationモードでＣＤ４４陽性細胞の割合を解析した。

【0118】

結果を図１２に示す。ＢＣＡＡにより、ＭＫＮ４５細胞において、胃癌幹細胞のマーカーであるＣＤ４４の発現が有意に低下した。以上の結果から、ＢＣＡＡが胃癌幹細胞の非幹細胞への分化を誘導することが示唆された。

【0119】

実施例１１：ヒト胃癌細胞株ＭＫＮ４５に対するＴＳ−１とＢＣＡＡとの併用の効果（in vivo試験）
6週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにＭＫＮ４５細胞を１×１０^６個／マウス皮下移植した。１週間後に腫瘍体積に基づき群分けを実施した。ＴＳ−１１０ｍｇ／ｋｇ（ｖｅｈｉｃｌｅ０．５％ＣＭＣ）、ＴＳ−１１０ｍｇ／ｋｇ＋ＢＣＡＡ０．７５ｇ／ｋｇ、又はＢＣＡＡ０．７５ｇ／ｋｇを土日を除く毎日、６週間経口投与した。即ち、４つの群における処置は以下の通りである：
１群：ＣＭＣ（ｖｅｈｉｃｌｅ）
２群：ＴＳ−１
３群：ＴＳ−１＋ＢＣＡＡ
４群：ＢＣＡＡ

【0120】

尚、ＴＳ−１は、テガフール、ギメラシル、及びオテラシルカリウムを以下の組成で含有する抗癌剤である。
ＴＳ−１０．２ｇ中
テガフール２０ｍｇ
ギメラシル５．８ｍｇ
オテラシルカリウム１９．６ｍｇ

【0121】

ノギスを用いて腫瘍外側から腫瘍体積（長径ｘ短径ｘ高さ（ｍｍ^３））を測定することにより、経時的な腫瘍体積変化をモニターした。43日目に剖検をし、腫瘍の重量および体積を計測した。

【0122】

結果を図１３に示す。ＴＳ−１又はＢＣＡＡ単独処理群では、ＣＭＣ群と比較して、腫瘍体積の減少傾向は認められるものの、有意な変化は認められなかった。ＴＳ−１とＢＣＡＡの併用により、腫瘍体積が有意に減少した。以上の結果から、ＢＣＡＡは、インビボにおいてＴＳ−１の抗腫瘍効果を増強することが示唆された。

【0123】

実施例１２：ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ２３１の増殖及び幹細胞マーカー発現に対する５ＦＵ及びＢＣＡＡの効果
ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞をＲＰＭＩ−１０％（１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ培地）に懸濁し、２０００個／ｗｅｌｌでプレートに播種した。次の日に、培地を、以下の通りに交換し、更に５日間培養した。
１群：ＲＰＭＩ−１０％
２群：ＢＣＡＡ（４ｍＭ）を含有するＲＰＭＩ−１０％
３群：５−ＦＵ（０．２５μｇ／ｍｌ）を含有するＲＰＭＩ−１０％
４群：５−ＦＵ（０．２５μｇ／ｍｌ）を含有するＲＰＭＩ−１０％

【0124】

５日後に細胞核をヘキスト試薬により染色し、細胞数をカウントした。また、１群及び２群については、抗ＣＤ４４抗体により染色し、蛍光顕微鏡定量装置（Thermo Fisher）を用いたArray ScanによりＣＤ４４陽性細胞の割合を解析した。

【0125】

結果を図１４及び１５に示す。５ＦＵ単独処理により生細胞数が減少し、ＢＣＡＡを併用すると、５ＦＵによる生細胞数の減少が増強された。以上の結果から、ＢＣＡＡは、乳癌において、５ＦＵの抗腫瘍効果を増強することが示唆された。また、ＢＣＡＡにより、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞において、乳癌幹細胞のマーカーであるＣＤ４４の発現が低下する傾向が認められた。以上の結果から、ＢＣＡＡが乳癌幹細胞の非幹細胞への分化を誘導する可能性が示唆された。

【0126】

実施例１３：ヒト肝臓癌細胞株ＨＡＫ１Ｂの幹細胞マーカー発現に対するＢＣＡＡの効果（in vivo試験）
7週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（日本チャールスリバーより購入）にＨＡＫ１Ｂ細胞を７００万個／個体皮下移植した。１週間後に腫瘍面積に基づき群分けを実施した。５ＦＵ２５０μｇ／ｔｕｍｏｒ（ｖｅｈｉｃｌｅ１０％ＤＭＳＯ／ＤＷ）を腫瘍内に投与すると共に（Cancer Research, 70(11), 4687-4697, 2010参照）、３（ｗ／ｗ）％ＢＣＡＡ混餌食または３（ｗ／ｗ）％カゼイン混餌食を２週間供与した。即ち、４つの群における処置は以下の通りである：
１群：ｖｅｈｉｃｌｅ＋カゼイン混餌食（コントロール群）
２群：５ＦＵ＋カゼイン混餌食
３群：ｖｅｈｉｃｌｅ＋ＢＣＡＡ混餌食
４群：５ＦＵ＋ＢＣＡＡ混餌食

【0127】

15日目に、腫瘍組織を摘出し、TriPure Isolation Reagent (Roche)を用いてRNAを抽出した。High Capacity cDNA RT kit (Applied Biosystems)を用いてcDNAを合成した。RT-PCRにより、EpCAM（Epithelial cell adhesion molecule；肝臓癌幹細胞のマーカー）のmRNAの発現を定量した。RT-PCRに用いたプライマーは実施例１と同一である。

【0128】

結果を図１６に示す。ＢＣＡＡにより、ＨＡＫ１Ｂ細胞における肝臓癌幹細胞のマーカーであるＥｐＣＡＭが低下した。以上の結果から、ＢＣＡＡが、インビボにおいても、肝臓癌の癌幹細胞の癌非幹細胞への分化を誘導し、癌幹細胞を減少させることにより、腫瘍の５ＦＵへの感受性を増大させることが示唆された。

【0129】

実施例１４：ヒト胃癌細胞株ＭＫＮ４５の幹細胞マーカー発現に対するＢＣＡＡの併用の効果（in vivo試験）
6週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにＭＫＮ４５細胞を１×１０^６個／マウス皮下移植した。１週間後に腫瘍体積に基づき群分けを実施した。ＴＳ−１１０ｍｇ／ｋｇ（ｖｅｈｉｃｌｅ０．５％ＣＭＣ）、ＴＳ−１１０ｍｇ／ｋｇ＋ＢＣＡＡ０．７５ｇ／ｋｇ、又はＢＣＡＡ０．７５ｇ／ｋｇを土日を除く毎日、６週間経口投与した。即ち、４つの群における処置は以下の通りである：
１群：ＣＭＣ（ｖｅｈｉｃｌｅ）
２群：ＴＳ−１
３群：ＴＳ−１＋ＢＣＡＡ
４群：ＢＣＡＡ

【0130】

43日後に、腫瘍組織を摘出し、TriPure Isolation Reagent (Roche)を用いてRNAを抽出した。High Capacity cDNA RT kit (Applied Biosystems)を用いてcDNAを合成した。RT-PCRにより、CD44（癌幹細胞のマーカー）、nanog（未分化マーカー）及びABCB5（ABCトランスポーター、癌幹細胞に発現していることが報告されている）のmRNAの発現を定量した。RT-PCRに用いたプライマーは以下の通りである。

【0131】

【表3】