特許 6091416 キレート剤およびペプチド抗微生物剤化合物の使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6091416

(24)【登録日】2017年2月17日

(45)【発行日】2017年3月8日

(54)【発明の名称】キレート剤およびペプチド抗微生物剤化合物の使用

(51)【国際特許分類】

   A01N 65/20 20090101AFI20170227BHJP

   A01N 25/00 20060101ALI20170227BHJP

   A01P 1/00 20060101ALI20170227BHJP

   A01P 3/00 20060101ALI20170227BHJP

【ＦＩ】

   A01N65/20

   A01N25/00 101

   A01P1/00

   A01P3/00

【請求項の数】11

【全頁数】15

(21)【出願番号】特願2013-533204(P2013-533204)

(86)(22)【出願日】2011年10月12日

(65)【公表番号】特表2013-539776(P2013-539776A)

(43)【公表日】2013年10月28日

(86)【国際出願番号】EP2011067828

(87)【国際公開番号】WO2012049217

(87)【国際公開日】20120419

【審査請求日】2014年10月14日

(31)【優先権主張番号】1017282.3

(32)【優先日】2010年10月13日

(33)【優先権主張国】GB

(31)【優先権主張番号】105332

(32)【優先日】2010年10月12日

(33)【優先権主張国】PT

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】513086452

【氏名又は名称】コンスモ エム ヴェルデ ビオテクノロジア ダス プランタス ソシエダット アノニマ

【氏名又は名称原語表記】ＣＯＮＳＵＭＯ ＥＭ ＶＥＲＤＥ − ＢＩＯＴＥＣＮＯＬＯＧＩＡ ＤＡＳ ＰＬＡＮＴＡＳ， Ｓ．Ａ．

(74)【代理人】

【識別番号】100147485

【弁理士】

【氏名又は名称】杉村 憲司

(74)【代理人】

【識別番号】100167623

【弁理士】

【氏名又は名称】塚中 哲雄

(72)【発明者】

【氏名】アレクサンドラ マヌエラ ローレンソ カレイラ

(72)【発明者】

【氏名】サラ アレクサンドラ ヴァラダス ダ シルヴァ モンテイロ

(72)【発明者】

【氏名】リカルド マニュエル デ セイシャス ボアヴィダ フェレイラ

【審査官】 山本 昌広

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００９−５０５６３７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表平７−５０１８２０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００５−５００３９３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１３−５４０４４２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特許第５９３４２２５（ＪＰ，Ｂ２）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ０１Ｎ １／００−６５／４８

Ａ０１Ｐ １／００−２３／００

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

キレート剤および、植物上で植物病原性微生物の増殖を阻害する、および／またはそれを殺滅するための、植物病原性微生物に対して効果的である抗微生物剤の使用であって、該抗微生物剤は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるＢｌａｄ配列またはその活性変異体を含むポリペプチドを含み、該活性変異体は抗菌作用を持ち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４または少なくとも１００のアミノ酸長さであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の断片の何れかと少なくとも７０％の同一性を持つ配列を含む、キレート剤および抗微生物剤の使用。

【請求項2】

植物病原性微生物に対して効果的である、抗微生物剤の活性を増加させるためのキレート剤の使用であって、該抗微生物剤は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるＢｌａｄ配列またはその活性変異体を含むポリペプチドを含み、該活性変異体は抗菌作用を持ち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４または少なくとも１００のアミノ酸長さであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の断片の何れかと少なくとも７０％の同一性を持つ配列を含む抗微生物剤である、キレート剤の使用。

【請求項3】

前記キレート剤および前記抗微生物剤がそれを必要とする植物に塗布される、請求項１または請求項２に記載の使用。

【請求項4】

前記抗微生物剤および前記キレート剤が前記植物に：
ａ）同組成物の一部として；または
ｂ）連続してもしくは同時に、別々に
投与される、請求項３に記載の使用。

【請求項5】

前記キレート剤がポリアミノカルボキシレートである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。

【請求項6】

前記キレート剤がＥＤＴＡである、請求項５に記載の使用。

【請求項7】

それを必要とする植物にキレート剤および抗微生物剤を投与するステップを含む、植物病原性微生物の増殖の阻害および／または殺滅方法であって、該抗微生物剤は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるＢｌａｄ配列またはその活性変異体を含むポリペプチドを含み、該活性変異体は抗菌作用を持ち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４または少なくとも１００のアミノ酸長さであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の断片の何れかと少なくとも７０％の同一性を持つ配列を含む抗微生物剤である、植物病原性微生物の増殖の阻害および／または殺滅方法。

【請求項8】

前記抗微生物剤をキレート剤とともに用いるステップを含む、植物病原性微生物に対して効果的である、抗微生物剤の活性の増加方法であって、該抗微生物剤は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるＢｌａｄ配列またはその活性変異体を含むポリペプチドを含み、該活性変異体は抗菌作用を持ち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４または少なくとも１００のアミノ酸長さであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の断片の何れかと少なくとも７０％の同一性を持つ配列を含む抗微生物剤である、抗微生物剤の活性の増加方法。

【請求項9】

前記微生物が植物病原性細菌である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。

【請求項10】

前記細菌が以下の属：シュードモナス、エルウィニアおよびストレプトマイセスの１つからの病原性種である、請求項９に記載の使用。

【請求項11】

前記微生物が植物病原性細菌である、請求項７または８に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は植物病原体を標的とする抗微生物剤の分野に関する。

【背景技術】

【0002】

［序論］
植物病原体の制御および作物の保護は、最近の世界人口の増加および関連する食糧不足とともに大きな懸念となっている深刻な世界的課題である。また、収穫および貯蔵に関する現代の農業慣行は、病原体増殖にとって良好な条件を提供する傾向がある。

【0003】

化学農薬の使用は有害生物制御の標準的な手法だった。しかしながら、多くの現在用いられている農薬はいくつかの重大な不利点を示す。例えば、多くは環境に不利な影響を有し、多くは低いまたは減少性の効力を有する。とくに問題なのは、病原体耐性の発現とともに、いくつかの化合物の活性の低い効力および／または狭いスペクトルである。

【0004】

本発明の目的は、これらの問題の解決を試みることであり、とくに例えば植物病原性微生物に対して効果的である抗微生物剤の活性を向上させる手段を提供することである。

【発明の概要】

【0005】

本発明者らは、驚くべきことに、キレート剤が植物病原性微生物に対して効果的である抗微生物剤の効果を相乗的に増強することができることを見出した。

【0006】

従って、本発明者らは：
（ｉ）植物上で植物病原性微生物の増殖を阻害する、および／またはそれを殺滅するための、キレート剤および植物病原性微生物に対して効果的である抗微生物剤の使用；ならびに
（ｉｉ）植物病原性微生物に対して効果的である抗微生物剤の活性を増加させるための、キレート剤の使用
を提供する。

【0007】

好適な実施形態では、前記キレート剤および前記抗微生物剤はそれを必要とする植物に塗布され、好適にはこの場合前記抗微生物剤および前記キレート剤は前記植物に：
ａ）同組成物の一部として；または
ｂ）連続してもしくは同時に、別々に
投与される。

【0008】

好適な実施形態では、抗微生物剤は植物病原性細菌または真菌に対して効果的である。好適な実施形態では、抗微生物剤はポリペプチドを含み、好適にはこの場合該ポリペプチドはＢｌａｄまたはその活性変異体を含む。好適な実施形態では、キレート剤はポリアミノカルボキシレート、好適にはＥＤＴＡである。

【0009】

本発明者らは：
―それを必要とする植物にキレート剤および植物病原性微生物に対して効果的である抗微生物剤を投与するステップを含む、植物病原性微生物の増殖の阻害および／または殺滅方法；ならびに
―該抗微生物剤をキレート剤とともに用いるステップを含む、植物病原性微生物に対して効果的である微生物の活性の増加方法
も提供する。

【0010】

さらに、本発明者らは、キレート剤および植物病原性微生物に対して効果的である抗微生物剤を含む組成物を提供する。好適には、抗微生物剤は植物病原性細菌または真菌、好適には真菌に対して効果的である。好適な実施形態では、抗微生物剤はポリペプチドを含み、好適にはこの場合該ポリペプチドはＢｌａｄまたはその活性変異体を含む。好適な実施形態では、キレート剤はポリアミノカルボキシレート、好適にはＥＤＴＡである。

【0011】

本発明者らはまた、植物上で植物病原性微生物の増殖を阻害する、および／またはそれを殺滅するための本発明の組成物の使用、ならびにそれを必要とする植物に本発明の組成物を投与するステップを含む、植物病原性微生物の増殖の阻害および／または殺滅方法を提供する。

【0012】

本発明者らは、驚くべきことに、ルピナス（Ｌｕｐｉｎｕｓ、ハウチワマメ）からのＢｌａｄポリペプチドが植物に病原性である多数の多様な細菌有機体に対して強力な抗微生物活性を示すことも見出した。

【0013】

従って、本発明者らは、植物上での植物病原性細菌を殺滅する、またはその増殖を阻害するための、Ｂｌａｄまたはその活性変異体を含む抗微生物ポリペプチドを含む組成物の使用を提供する。好適には、前記組成物はキレート剤をさらに含む。好適な実施形態では、前記細菌は、以下の属：シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）およびストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の１つからの病原性種である。好適な実施形態では、組成物はそれを必要とする植物に塗布される。

【0014】

本発明者らは、植物上での植物病原性細菌の殺滅、またはその増殖の阻害方法であって、該植物に効果的な量のＢｌａｄまたはその活性変異体を含む抗微生物ポリペプチドを含む組成物を投与するステップを含む方法も提供する。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】ルピナス・アルバス（Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ、シロバナハウチワマメ）β−コングルチン前駆体をエンコードする配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を示す。

【図2】Ｂｌａｄに対応するβ−コングルチン前駆体をエンコードする配列の内部断片（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を示す。

【発明を実施するための形態】

【0016】

本発明者らは、キレート剤および植物病原性微生物に対して効果的である抗微生物剤の組み合わせを用いる場合、該組み合わせは植物病原性微生物の増殖の阻害および／または殺滅にとくに効果的であることを見出した。１つの態様では、従って、本発明者らは、キレート剤および植物病原性微生物に対して効果的である抗微生物剤を含む、または本質的にこれらからなる組成物を提供する。キレート剤および植物病原性微生物に対して効果的である抗微生物剤を含む組成物はまた、当業者により組成物に添加された別の化合物を含む製剤であってもよい。

【0017】

抗微生物剤
抗微生物剤は、植物に病原性である微生物の増殖を低減する、またはそれを殺滅するいずれかの作用剤である。前記微生物は好適には細菌（グラム陽性またはグラム陰性）または真菌、好適には真菌である（酵母菌または糸状菌であってもよい）。好適には、抗微生物剤は抗真菌タンパク質のようなポリペプチドを含む（または本質的にこれからなる）。抗真菌タンパク質の適切な例としては、キチナーゼ、チキン結合タンパク質、キトサナーゼ、β−１，３−グルカナーゼ、およびβ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニダーゼが挙げられる。抗微生物剤の標的となり得る微生物の特定の例を以下に示す。

【0018】

Ｂｌａｄポリペプチド
好適な実施形態では、抗微生物剤がポリペプチドを含む（本質的にこれからなる）場合、該ポリペプチドはＢｌａｄまたはその活性変異体を含む（または本質的にこれからなる）。

【0019】

Ｂｌａｄ（「ｂａｎｄａ ｄｅ Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ ｄｏｃｅ」―スイートＬ．アルバスからのバンド）は、β−コングルチン、ルピナス属の種中に存在する主要な貯蔵タンパク質の、安定した中間分解生成物に与えられた名称である。１７３個のアミノ酸残基からなり、ルピナスからのβ−コングルチンの前駆体をエンコードする遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋにおいてアクセッション番号ＡＡＳ９７８６５で公表される、１７９１個のヌクレオチド）の内部断片（ＧｅｎＢａｎｋにおいてアクセッション番号ＡＢＢ１３５２６で登録される、５１９個のヌクレオチド）によりエンコードされる２０ｋＤのポリペプチドとして特徴づけられる。Ｂｌａｄ末端配列をエンコードするプライマーを用いてゲノムルピナスＤＮＡからの配列を増幅する場合、〜６２０ｂｐの生成物が得られ、Ｂｌａｄをエンコードする遺伝子断片中のイントロンの存在を示す。自然発生Ｂｌａｄは、発芽の開始後４〜１２日の間、ルピナス種の子葉のみに（β−コングルチンの集中的かつ限定的なタンパク質分解の後）蓄積する、２１０ｋＤのグリコオリゴマーの主成分である。前記オリゴマーはグリコシル化しているが、自然発生Ｂｌａｄはグルコシル化していない。Ｂｌａｄ含有グリコオリゴマーは、いくつかのポリペプチドを含み、主なものは１４、１７、２０、３２、３６、４８および５０ｋＤの分子量を示す。２０ｋＤのポリペプチド、Ｂｌａｄは、オリゴマー中でもっとも豊富なポリペプチドであり、レクチン活性を有する唯一のものであると考えられる。自然発生Ｂｌａｄは８日齢の植物体中の総子葉タンパク質の約８０％を占める。

【0020】

Ｌ．アルバスβ−コングルチン前駆体をエンコードする配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を図１に示す。β−コングルチン親サブユニットをコードする配列は残基７０〜１６６８に位置する。エンコードされた、５３３個のアミノ酸残基のβ−コングルチン親サブユニット（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）は：

である。

【0021】

Ｂｌａｄに対応するβ−コングルチン前駆体をエンコードする配列の内部断片（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を図２に示す。Ｂｌａｄポリペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）は：

である。

【0022】

従って、抗微生物剤がＢｌａｄまたはその活性変異体を含む（または本質的にこれからなる）ポリペプチドを含む（または本質的にこれからなる）場合、該作用剤はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４を含む（または本質的にこれからなる）ポリペプチド配列またはその活性変異体を含む（または本質的にこれからなる）。

【0023】

Ｂｌａｄの活性変異体は、抗微生物剤として作用する能力を保持する（すなわち、抗微生物活性を有する―こうした活性のレベルおよびどのように測定するかの説明は以下参照）Ｂｌａｄの変異体である。「Ｂｌａｄの活性変異体」は、その範囲内に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の断片を含む。好適な実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の長さの少なくとも１０％、好適には少なくとも２０％、好適には少なくとも３０％、好適には少なくとも４０％、好適には少なくとも５０％、好適には少なくとも６０％、好適には少なくとも７０％、好適には少なくとも８０％、好適には少なくとも９０％、もっとも好適にはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の長さの少なくとも９５％であるものが選択される。Ｂｌａｄまたはその変異体は一般的には、少なくとも１０個のアミノ酸残基、例えば少なくとも２０、２５、３０、４０、５０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０または１７３個のアミノ酸残基の長さを有する。

【0024】

「Ｂｌａｄの活性変異体」は、その範囲内に、例えば全配列について、または少なくとも２０個、好適には少なくとも３０個、好適には少なくとも４０個、好適には少なくとも５０個、好適には少なくとも６０個、好適には少なくとも８０個、好適には少なくとも１００個、好適には少なくとも１２０個、好適には少なくとも１４０個、もっとも好適には少なくとも１６０個以上の隣接するアミノ酸残基の領域について、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４との相同性、例えば少なくとも４０％の同一性、好適には少なくとも６０％、好適には少なくとも７０％、好適には少なくとも８０％、好適には少なくとも８５％、好適には少なくとも９０％、好適には少なくとも９５％、好適には少なくとも９７％、もっとも好適には少なくとも９９％同一性を有するポリペプチド配列も含む。タンパク質相同性の測定方法は当技術分野において周知であり、当業者であれば、本文脈では相同性はアミノ酸同一性（「ハード相同性」と称されることもある）に基づいて計算されることを理解するだろう。

【0025】

相同活性Ｂｌａｄ変異体は一般的には、置換、挿入または削除、例えば１、２、３、４、５〜８個以上の置換、挿入または削除によりＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のポリペプチド配列とは異なる。置換は好適には「保守的」である、すなわちアミノ酸を同様のアミノ酸で置換することができ、それによって同様のアミノ酸は以下の群：芳香族残基（Ｆ／Ｈ／Ｗ／Ｙ）、非極性脂肪族残基（Ｇ／Ａ／Ｐ／Ｉ／Ｌ／Ｖ）、極性非荷電脂肪族（Ｃ／Ｓ／Ｔ／Ｍ／Ｎ／Ｑ）および極性荷電脂肪族（Ｄ／Ｅ／Ｋ／Ｒ）の１つを共有する。好適な亜群は：Ｇ／Ａ／Ｐ；Ｉ／Ｌ／Ｖ；Ｃ／Ｓ／Ｔ／Ｍ；Ｎ／Ｑ；Ｄ／Ｅ；およびＫ／Ｒを含む。

【0026】

（上述のような）Ｂｌａｄまたはその活性変異体を含むポリペプチドは、Ｎ末端および／またはＣ末端にいずれかの数のアミノ酸残基を付加したＢｌａｄまたはその活性変異体からなり得るが、ただしポリペプチドは抗微生物活性を保持する（同様に、こうした活性のレベルおよびこれをどのように測定するかの説明は以下参照）。好適には、３００個以下のアミノ酸残基、より好適には２００個以下のアミノ酸残基、好適には１５０個以下のアミノ酸残基、好適には１００個以下のアミノ酸残基、好適には８０個、６０個または４０個以下のアミノ酸残基、もっとも好適には２０個以下のアミノ酸残基をＢｌａｄまたはその活性変異体の一端または両端に付加する。

【0027】

（上述のような）Ｂｌａｄまたはその活性変異体を含む（または本質的にこれからなる）ポリペプチドは、本発明において精製（例えば植物、動物または微生物供給源から取り出した）もしくは分離形態で用いることができる、および／または組換えであってもよい。組換え形態の製造はＢｌａｄの活性変異体の製造を可能にする。

【0028】

自然発生Ｂｌａｄの精製方法は当技術分野においてすでに説明されている（例えばＲａｍｏｓ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｌａｎｔａ ２０３（１）：２６−３４およびＭｏｎｔｅｉｒｏ ｅｔ ａｌ．（２０１０）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ５（１）：ｅ８５４２）。自然発生Ｂｌａｄの適切な供給源は、好適には発芽の開始後約４〜約１４日の間に採取された、より好適には発芽の開始後約６〜約１２日の間（例えば発芽の開始から８日後）に採取された、ルピナス・アルバスのようなルピナス属の植物、好適には該植物の子葉である。当技術分野では、Ｂｌａｄを含む粗抽出物をもたらす総タンパク質抽出方法、およびこうした抽出物の、例えばＢｌａｄを含むＢｌａｄ含有グリコオリゴマーを含む部分精製抽出物をもたらすタンパク質精製方法が開示されている。

【0029】

Ｂｌａｄそのものを分離するには、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび／または、好適にはＣ−１８カラム上での逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣを用いることができる。

【0030】

Ｂｌａｄを含むグリコオリゴマーを含む部分精製抽出物を得る代替方法は、Ｂｌａｄのキチン結合活性を用いることである。グリコオリゴマーは、キチン親和性クロマトグラフィー精製の一部として、キチンカラムと非常に強く結合し、０．０５ＮのＨＣｌで溶離される。この精製方法の一例の詳細は以下のとおりである：

【0031】

８日齢のルピナス属植物から子葉を採取し、１０ｍＭのＣａＣｌ_２およびＭｇＣｌ_２を含有するＭｉｌｌｉ−Ｑ ｐｌｕｓ水（ｐＨは８．０に調節）中に均質化する。そのホモジェネートをチーズクロスに通してろ過し、４℃で、１時間３０，０００ｇで遠心分離する。ペレットをその後、１０％（ｗ／ｖ）のＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡおよび１０ｍＭのＥＧＴＡを含有するｐＨ７．５の１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝剤中に懸濁させ、４℃で１時間撹拌し、４℃で、１時間３０，０００ｇで遠心分離する。浮遊物に含まれる総グロブリン画分を硫酸アンモニウム（５６１ｇ／ｌ）で沈殿させ、冷却しながら１時間撹拌しつづけ、４℃で、３０分間３０，０００ｇで遠心分離する。得られたペレットを、ｐＨ７．５の５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝剤に溶解し、同じ緩衝剤で平衡化したＰＤ−１０カラム中で脱塩し、同じ緩衝剤で予め平衡化したキチン親和性クロマトグラフィーカラムに通す。カラムをｐＨ７．５の５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝剤で洗浄し、結合タンパク質を０．０５ＮのＨＣｌで溶離する。溶離した画分をすぐに２Ｍのトリスで中和し、ピーク画分を溜め、凍結乾燥させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。

【0032】

キチンカラムの製造について、粗キチンをＳｉｇｍａから入手し、以下のとおり処理する：キチン試料をＭｉｌｌｉ−Ｑ ｐｌｕｓ水のみで、その後０．０５ＮのＨＣｌで洗浄する。次に１％（ｗ／ｖ）の炭酸ナトリウムで、次にエタノールで、洗浄剤の吸収度が０．０５未満になるまで洗浄する。キチンを次にピペット先端に充填し、ｐＨ７．５の５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝剤で平衡化する。

【0033】

組換えタンパク質の製造方法は当技術分野において周知である。ここで適用されるこうした方法は、Ｂｌａｄまたはその活性変異体を含むポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドを適切な発現ベクターに挿入するステップ、該ポリヌクレオチドの１つ以上のプロモーター（例えばＴ７ｌａｃのような誘導性プロモーター）との、および対象の他のポリヌクレオチドまたは遺伝子との並置を可能にするステップ、発現ベクターを適切な細胞または有機体（例えばエシェリキア・コリ）中に導入するステップ、形質転換細胞または有機体においてポリペプチドを発現するステップ、ならびに発現した組換えポリペプチドをその細胞または有機体から取り出すステップを含む。こうした精製を補助するため、発現ベクターは、ポリヌクレオチドが、例えば精製を補助することができる末端タグ：例えば、親和性精製のためのヒスチジン残基のタグをさらにエンコードするように構成することができる。組換えポリペプチドを精製した後、精製タグは、例えばタンパク質分解開裂により、ポリペプチドから取り出すことができる。

【0034】

ポリペプチドを含む（または本質的にこれからなる）抗微生物剤を含む本発明の組成物では、該ポリペプチドは好適には部分精製形態、より好適には精製形態である。前記ポリペプチドは、これに自然と関連する１つ以上の他のポリペプチドを有さない環境中に存在する、および／または存在する総タンパク質の少なくとも約１０％に相当する場合、部分精製である。前記ポリペプチドは、これに自然と関連する他のポリペプチドをすべて、またはほとんどの有さない環境中に存在する場合、精製である。例えば、精製Ｂｌａｄとは、Ｂｌａｄが組成物中の総タンパク質の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％に相当することを意味する。

【0035】

抗微生物剤を含む本発明の組成物では、ルピナスタンパク質分は本質的にＢｌａｄまたはその活性変異体を含む（または本質的にこれからなる）ポリペプチドを含むＢｌａｄ含有グリコオリゴマーからなり得る。

【0036】

植物病原性微生物
抗微生物剤が効果的である植物病原性微生物は、植物上またはその中で疾病を引き起こし得るいずれかの微生物である。とくに好適な細菌標的としては、病原性シュードモナス種、例えばシュードモナス・アエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）、シュードモナス・トラシイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｏｌａａｓｉｉ）およびシュードモナス・アガリシ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｇａｒｉｃｉ）（好適にはＰ．シリンガエ）；病原性エルウィニア種、例えばエルウィニア・ペルシシナ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｐｅｒｓｉｃｉｎａ）、ペクトバクテリウム・カロトボラム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ）、エルウィニア・アミロボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒａ）、エルウィニア・クリサンテミ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）、エルウィニア・プシディ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｐｓｉｄｉｉ）およびエルウィニア・トラケイフィラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｔｒａｃｈｅｉｐｈｉｌａ）；ならびに病原性ストレプトマイセス種、例えばストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）が挙げられる。

【0037】

とくに好適な真菌標的としては、病原性アルテルナリア種、例えばアルテルナリア・アルテルナタ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔａ）、アルテルナリア・アルボレセンス（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｒｂｏｒｅｓｃｅｎｓ）、アルテルナリア・アルブスチ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｒｂｕｓｔｉ）、アルテルナリア・ブラシカエ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、アルテルナリア・ブラシシコラ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ）、アルテルナリア・カロチインクルタエ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｃａｒｏｔｉｉｎｃｕｌｔａｅ）、アルテルナリア・コンジャンクタ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｃｏｎｊｕｎｃｔａ）、アルテルナリア・ダウシ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｄａｕｃｉ）、アルテルナリア・ユーフォルビイコラ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｅｕｐｈｏｒｂｉｉｃｏｌａ）、アルテルナリア・ガイセン（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｇａｉｓｅｎ）、アルテルナリア・インフェクトリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｉｎｆｅｃｔｏｒｉａ）、アルテルナリア・ジャポニカ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、アルテルナリア・ペトロセリニ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｉ）、アルテルナリア・セリニ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｓｅｌｉｎｉ）、アルテルナリア・ソラニ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｓｏｌａｎｉ）およびアルテルナリア・スミルニ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｓｍｙｒｎｉｉ）；病原性フザリウム種、例えばフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）およびフザリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）（好適にはＦ．オキシスポラム）；病原性ボトリチス種、例えばボトリチス・シネレア（Ｂｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）；ならびに病原性コレトトリカム種、例えばコレトトリカム・アキュタタム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ａｃｕｔａｔｕｍ）、コレトトリカム・ココデス（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃｏｃｃｏｄｅｓ）、コレトトリカム・カプシシ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｐｓｉｃｉ）、コレトトリカム・クラシペス（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃｒａｓｓｉｐｅｓ）、コレトトリカム・グロエスポリオイデス（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｏｅｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ）、コレトトリカム・グラミニコラ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）、コレトトリカム・カハワエ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｋａｈａｗａｅ）、コレトトリカム・リンデムチアヌム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｌｉｎｄｅｍｕｔｈｉａｎｕｍ）、コレトトリカム・ムサエ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｍｕｓａｅ）、コレトトリカム・ニグラム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｎｉｇｒｕｍ）、コレトトリカム・オルビクラレ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｏｒｂｉｃｕｌａｒｅ）、コレトトリカム・ピシ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｐｉｓｉ）およびコレトトリカム・サブリネオラム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｕｂｌｉｎｅｏｌｕｍ）が挙げられる。

【0038】

キレート剤
キレート剤（別名、金属イオン封鎖剤）は、金属イオンと結合し、非共有複合体を形成し、イオンの活性を低減するいずれかの化合物である。適切なキレート剤としては、ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）およびＥＧＴＡ（エチレングリコールビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸）のようなポリアミノカルボキシレートが挙げられる。好適には、ＥＤＴＡはキレート剤として、好適には少なくとも１０μｇ／ｍｌ、少なくとも５０μｇ／ｍｌ、または少なくとも１００μｇ／ｍｌ、および５００μｇ／ｍｌまで、１ｍｇ／ｍｌまで、５ｍｇ／ｍｌまで、１０ｍｇ／ｍｌまで、または２０ｍｇ／ｍｌまでの濃度で用いられる。好適には、ＥＤＴＡは０．１ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ、より好適には１ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度で用いられる。

【0039】

成果
抗微生物剤は、キレート剤と組み合わせて、植物病原性微生物の増殖を阻害する（静微生物活性を有することを意味する）、および／または該微生物を殺滅する（殺微生物活性を有することを意味する）のに用いることができる。当業者であれば、日常的な方法によって、選択されるキレート剤の特定の濃度で、微生物のとくに所望の増殖阻害または殺滅を達成するのに適した用量および／または濃度を識別することができる。好適には、抗微生物剤およびキレート剤の組み合わせはヒトまたは動物に非毒性である。

【0040】

好適には、抗微生物剤およびキレート剤の組み合わせ（例えば本発明の組成物）を静微生物剤として用いる場合、この組み合わせは、組み合わせが存在しない同等の条件と比べて、増殖率を１０％、より好適には５０％、より好適には７５％、より好適には９０％、より好適には９５％、より好適には９８％、より好適には９９％、さらにより好適には９９．９％低減する。もっとも好適には、この組み合わせは微生物のいかなる増殖も防止する。

【0041】

好適には、抗微生物剤およびキレート剤の組み合わせ（例えば本発明の組成物）を殺微生物剤として用いる場合、この組み合わせは、組み合わせが存在しない同等の条件と比べて、微生物の集団の１０％、より好適には該集団の５０％、より好適には該集団の７５％、より好適には該集団の９０％、より好適には該集団の９５％、より好適には該集団の９８％、より好適には該集団の９９％、さらにより好適には該集団の９９．９％を殺滅する。もっとも好適には、この組み合わせは微生物の集団のすべてを殺滅する。

【0042】

微生物による植物の感染症を予防または抑制するのに用いる場合、前記組み合わせは好適には効果的な量、すなわち、好適には組み合わせが存在しない同等の条件と比べて、検出可能なレベルの感染症予防または抑制が達成される（例えば検出可能なレベルの植物組織損傷の予防または抑制が達成される）レベルの微生物の増殖阻害および／または殺滅をもたらす量で用いられる。

【0043】

キレート剤（例えば上述の濃度のいずれかのＥＤＴＡ）と組み合わせて、選択される抗微生物剤がＢｌａｄまたはその活性変異体を含むポリペプチドを含む場合、前記ポリペプチドを用いるのに適した濃度としては、少なくとも５μｇ／ｍｌ、少なくとも１０μｇ／ｍｌ、少なくとも２０μｇ／ｍｌ、少なくとも５０μｇ／ｍｌ、少なくとも１００μｇ／ｍｌまたは５００μｇ／ｍｌ、および１ｍｇ／ｍｌまで、２．５ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌまで、または１０ｍｇ／ｍｌまでが挙げられる。好適には、前記ポリペプチドの濃度は５０μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ、より好適には５００μｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌ、さらにより好適には１ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌ（例えば約２．５ｍｇ／ｍｌ）である。
例えば、５０ｍＭ（すなわち約１５．８ｍｇ／ｍｌ）のＥＤＴＡで、例えばそれぞれＢ．シネレアまたはＦ．オキシスポラムの増殖を阻害するには、１ｍｇ／ｍｌまたは２．５ｍｇ／ｍｌのＢｌａｄの濃度を用いることができる。これは、Ｂｌａｄ単独ではこれらの病原体の増殖を阻害するには（それぞれ）約５ｍｇ／ｍｌまたは１０ｍｇ／ｍｌで用いられる必要があることを考えると、驚くべき発見である。本発明者らの発見はａ）キレート剤の使用による、より低い濃度での（植物病原体に対して効果的である）抗微生物剤の効果的な使用またはｂ）キレート剤の使用による、標準的な濃度での（植物病原体に対して効果的である）抗微生物剤の効力の増加を可能にする。これは、微生物による植物（またはその一部）の感染症を予防または治療するための、こうした抗微生物剤のより経済的／効果的な使用を可能にする。

【0044】

使用および方法
本発明者らは、植物上で植物病原性微生物の増殖を阻害する、および／またはそれを殺滅するための、本発明の組成物の使用も提供する。この目的のため、彼らは、それを必要とする植物に本発明の組成物（例えば効果的な量の該組成物）を投与するステップを含む、植物病原性微生物の増殖の阻害および／または殺滅方法も提供する。

【0045】

本発明者らは、植物上で植物病原性微生物の増殖を阻害する、および／またはこれを殺滅するための、キレート剤および植物病原性微生物に対して効果的である抗微生物剤の使用も提供する。彼らは、植物病原性微生物に対して効果的である微生物の活性を増加させるための、キレート剤の使用も提供する。この目的のため、彼らは：
ａ）キレート剤および植物病原性微生物に対して効果的である抗微生物剤（例えば効果的な量の該作用剤の組み合わせ）を投与するステップを含む、植物病原性微生物の増殖の阻害および／または殺滅方法；ならびに
ｂ）抗微生物剤をキレート剤とともに用いるステップを含む、植物病原性微生物に対して効果的である抗微生物剤の活性の増加方法
も提供する。
これらの実施形態では、前記抗微生物剤および前記キレート剤は前記植物に同組成物の一部としてまたは別々に投与することができる。これらの２つの作用剤を別々に投与する場合、投与は連続（どちらかの作用剤を先に投与する）または同時であってもよい。植物への投与は、例えば作用剤（または該作用剤を含む組成物）を植物（またはその一部）上に塗布（例えば噴霧）することにより、または植物もしくはその一部（例えば種子）を適切な溶液中に浸漬させることにより、達成することができる。

【0046】

植物病原性微生物に対して効果的である抗微生物剤の活性を増加させるのにキレート剤を用いる場合、該キレート剤（およびその濃度）は、好適には該抗微生物剤および該キレート剤の組み合わせが、好適にはキレート剤が存在しない同等の条件と比べて、植物病原性微生物の増殖阻害および／または殺滅のレベルの増加をもたらす（例えば植物感染症予防または抑制のレベルの増加が達成される、例えば植物組織損傷の予防または抑制のレベルの増加が達成される）ように選択される。

【0047】

本発明の使用／方法実施形態において、抗微生物剤およびキレート剤は上で詳述したとおりである。

【0048】

植物病原性微生物に対して効果的である抗微生物剤およびキレート剤の組み合わせを必要とする植物は、感染症に罹患するリスクがある、または感染症を有するいずれかの植物とすることができ、この場合該感染症は植物病原性微生物により引き起こされる。好適には、植物は作物植物（例えば収穫され、食料、家畜飼料、燃料、繊維、またはその他の商業的に価値のある生成物をもたらすために栽培されるいずれかの植物）である。好適には、前記作物植物は、食料作物植物、例えば糖をもたらす植物（例えばテンサイ、サトウキビ）、果物（堅果を含む）、野菜または種子である。種子をもたらす特定の植物としては、穀類（例えばトウモロコシ、小麦、大麦、モロコシ、キビ、米、カラス麦およびライ麦）およびマメ科植物（例えばマメ、エンドウマメおよびレンズマメ）が挙げられる。

【0049】

本発明者らは、植物上で植物病原性細菌を殺滅する、および／またはその増殖を阻害するための、Ｂｌａｄまたはその活性変異体を含む（または本質的にこれからなる）抗微生物ポリペプチドを含む（または本質的にこれからなる）組成物の使用も提供する。この目的のため、本発明者らは、植物上での植物病原性細菌の殺滅、またはその増殖の阻害方法であって、該植物に効果的な量のＢｌａｄまたはその活性変異体を含む（または本質的にこれからなる）抗微生物ポリペプチドを含む（または本質的にこれからなる）組成物を投与するステップを含む方法をさらに提供する。任意でＢｌａｄまたはその活性変異体を含む（または本質的にこれからなる）抗微生物ポリペプチドは分離形態で用いてもよい。

【0050】

好適な実施形態では、前記組成物はそれを必要とする植物に塗布される。前記組成物を必要とする植物は、感染症に罹患するリスクがある、または感染症を有するいずれかの植物とすることができ、この場合該感染症は植物病原性細菌により引き起こされる。好適な植物は上述したとおりである。「細菌の殺滅／増殖の阻害」、および「効果的な量」の意味は、抗微生物剤およびキレート剤の組み合わせに関して上述したとおりである。

【実施例】

【0051】

以下の実施例では、ＢＬＡＤは、Ｒａｍｏｓ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｌａｎｔａ ２０３（１）：２６−３４：文献のＭａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓセクションの“Ｐｌａｎｔ ｍａｔｅｒｉａｌ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ”および“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ”部分参照、に従って精製した２０ｋＤのＢｌａｄポリペプチドを含む自然発生Ｂｌａｄ含有グリコオリゴマーを示す。

【0052】

定義：
ＭＩＣ―最小阻害濃度：微生物の目に見える増殖を阻害するもっとも低い抗微生物剤の濃度
ＭＦＣ／ＭＢＣ―最小殺真菌／殺細菌濃度（または最小致死濃度）：標準の条件下、２４時間後に初期接種の９９．９％を殺滅するのに必要なもっとも低い抗微生物剤の濃度。

【実施例1】

【0053】

ＢＬＡＤの殺細菌活性およびそれについてのＥＤＴＡの相乗効果
Ａ． ＢＬＡＤは、Ｐ．アエルギノサに対して、１００μｇ／ｍｌで静細菌性であり、２５０μｇ／ｍｌで殺細菌性であることが見出された。Ｐ．アエルギノサに対して、ＢＬＡＤは５０μｇ／ｍｌで、またはＥＤＴＡは１ｍｇ／ｍｌで増殖を阻害する（すなわち両方とも静細菌性である）が、２つの組み合わせは殺細菌性である。

【0054】

Ｂ． エルウィニア・ピルシシナ（Ｅｒｗｉｎｉａ Ｐｉｒｓｉｃｉｎａ）に対して、ＢＬＡＤは３２μｇ／ｍｌのＭＩＣを有し、ＥＤＴＡは１５ｍＭのＭＩＣを有する。しかしながら、阻害量より低い（０．７５ｍＭ）ＥＤＴＡの存在下で、ＢＬＡＤのＭＩＣは１６μｇ／ｍｌまで低下する。

【0055】

Ｃ． ストレプトマイセス・グリセウスに対して、ＢＬＡＤは１０２４μｇ／ｍｌのＭＩＣを有し、ＥＤＴＡは１６ｍＭのＭＩＣを有する。しかしながら、阻害量より低い（８ｍＭ）ＥＤＴＡの存在下で、ＢＬＡＤのＭＩＣは２５６μｇ／ｍｌまで低下する。

【実施例2】

【0056】

ＢＬＡＤの殺真菌活性についてのＥＤＴＡの相乗効果
［１．２％ｗ／ｖ寒天のポテトデキストロース寒天（ＰＤＡ）（２５℃で３日培養）上でのボトリチス・シネレアに対する、ＥＤＴＡ有りおよび無しでの、ＢＬＡＤの阻害ハロデータ］

【表1】

【0057】

Ｂ．シネレアの増殖は２００μｇおよび１００μｇのＢＬＡＤで阻害された。この阻害は５０ｍＭ（約１５．８ｍｇ／ｍｌ）のＥＤＴＡの添加で増強された。

【0058】

増殖阻害は、ＢＬＡＤ単体を２０μｇもしくは５０μｇで用いる場合、またはＥＤＴＡ単体を５０ｍＭで用いる場合、見られなかった。しかしながら、いずれの濃度のＢＬＡＤも５０ｍＭのＥＤＴＡと組み合わせた場合、阻害が見られた。

【0059】

［１．２％ｗ／ｖ寒天のポテトデキストロース寒天（ＰＤＡ）（２５℃で３日培養）上でのフザリウム・オキシスポラムに対する、ＥＤＴＡ有りおよび無しでの、ＢＬＡＤの阻害ハロデータ］

【表2】

【0060】

Ｆ．オキシスポラムの増殖は２００μｇのＢＬＡＤで阻害された。この阻害は５０ｍＭのＥＤＴＡの添加で増強された。

【0061】

増殖阻害は、ＢＬＡＤ単体を２０μｇ、５０μｇもしくは１００μｇで用いる場合、またはＥＤＴＡ単体を５０ｍＭで用いる場合、見られなかった。しかしながら、５０μｇまたは１００μｇのＢＬＡＤを５０ｍＭのＥＤＴＡと組み合わせた場合、阻害が見られた。

【図1】

【図2】