特許 6093364 生体分子の精製方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6093364

(24)【登録日】2017年2月17日

(45)【発行日】2017年3月8日

(54)【発明の名称】生体分子の精製方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 1/18 20060101AFI20170227BHJP

   C07K 14/62 20060101ALI20170227BHJP

   B01J 20/281 20060101ALN20170227BHJP

【ＦＩ】

   C07K1/18

   C07K14/62

   !B01J20/22 D

【請求項の数】8

【全頁数】12

(21)【出願番号】特願2014-533247(P2014-533247)

(86)(22)【出願日】2012年9月28日

(65)【公表番号】特表2014-530211(P2014-530211A)

(43)【公表日】2014年11月17日

(86)【国際出願番号】SE2012051040

(87)【国際公開番号】WO2013048330

(87)【国際公開日】20130404

【審査請求日】2015年9月25日

(31)【優先権主張番号】1100722-6

(32)【優先日】2011年9月30日

(33)【優先権主張国】SE

(73)【特許権者】

【識別番号】516105833

【氏名又は名称】ジーイー・ヘルスケア・バイオプロセス・アールアンドディ・アクチボラグ

(74)【代理人】

【識別番号】100137545

【弁理士】

【氏名又は名称】荒川 聡志

(72)【発明者】

【氏名】ブレッカン，エッガート

(72)【発明者】

【氏名】エリクソン，チェル

(72)【発明者】

【氏名】ヨハンソン，ボー・レナート

(72)【発明者】

【氏名】シャナガー，ジャミル

【審査官】 坂崎 恵美子

(56)【参考文献】

【文献】 欧州特許出願公開第０００１３８２６（ＥＰ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１１／１０２７９０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１０−５３４３３６（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

Ｂ０１Ｊ ２０／２８１

Ｇ０１Ｎ ３０／０２

Ｇ０１Ｎ ３０／８８

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

プロインスリンからインスリンを精製する方法であって、
開裂プロインスリンの試料を、官能化されていない内側コアとイオン交換リガンドで官能化された外側官能化層とを有する多孔質シェルビーズを含むクロマトグラフィー媒体上にロードする段階と、
インスリンをリガンド上に吸着させる段階と、
１００〜１０００ｃｍ／時の流量でクロマトグラフィー媒体からインスリンを溶出する段階と
を含んでなり、溶出されたインスリンが８５％を超える純度を有する方法。

【請求項2】

シェルビーズが２０〜１００μｍの直径を有する、請求項１記載の方法。

【請求項3】

シェルビーズが２０〜８０μｍの直径を有する、請求項１又は請求項２記載の方法。

【請求項4】

シェルビーズの官能化層が厚さ３〜９μｍの層を含む、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。

【請求項5】

シェルビーズの官能化層が厚さ５〜７μｍの層を含む、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。

【請求項6】

リガンドが、スルホネート（ＳＯ₃^-）、スルフェート（−ＯＳＯ₃^-）、ホスフェート（−ＯＰＯ₃^2-）及びホスホネート（ＰＯ₃^2-）からなる群から選択される強陽イオン交換基である、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法。

【請求項7】

コアが、アガロース、デキストラン、セルロース、デンプン、プルラン、ポリアクリル酸アミド、ポリメタクリル酸アミド及びポリ（ヒドロキシアルキルアクリレート）からなる群から選択される極性ポリマーで満たされている、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法。

【請求項8】

インスリンが細菌内で産生される、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は生体分子精製の分野内にある。さらに詳しくは、本発明は内側コア及び外側官能化層を有する特定の種類のシェルビーズを用いるインスリンのクロマトグラフィー精製に関する。本方法は、９０％を超える非常に高い純度での精製を可能にする。

【背景技術】

【0002】

インスリンは、細菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又は酵母中で産生される。細菌の場合、（プロインスリンとして発現される）インスリンは封入体中に産生され、これが変性、リフォールディング及び再生後にいくつかの段階で精製される。通常、いくつかのクロマトグラフィー段階が濾過段階、プロインスリンからインスリンへの酵素開裂段階、沈殿結晶化段階及び製剤化段階と組み合わされる。酵母発現系の場合には、封入体は形成されない。この点を除けば、プロセスは細菌発現系の場合と全く同様である。

【0003】

インスリンは年間数トンが製造され、インスリンの使用は年々増加している。とりわけ開発途上国においてますます多くの人々が糖尿病を発症している。インスリンの需要の増加は、効率的な製造方法及びプロセスの利用を必要にする。収率は常に重要であり、高い収率を与える方法は通常は良好なプロセス経済性を与え、これはより手頃な価格の生成物に転換される。手頃な価格は、生成物をより広い患者基盤に対して利用可能にするための基本パラメーターである。これはまた、増加するコスト圧力の下で悩んでいるヘルスケアセクターに対して不要の圧迫を加えないようにするためにも重要である。

【0004】

したがって、高い収率で純粋な生成物を与える迅速でより経済的な方法を得ることは望ましいであろう。

【0005】

シェルビーズを用いるインスリンのクロマトグラフィー精製は、以前には提唱されていなかった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】英国特許第１０５４５２３号明細書

【発明の概要】

【0007】

本発明は、クロマトグラフィー媒体のローディング（クロマトグラフィー媒体１ｍｌ当たりにロードされる生成物のグラム数）を通常の技法に比べて３倍に増加させ、クロマトグラフィー媒体の消費量を低減させ得るインスリン精製方法を提供する。これは、一層コスト効率の良いプロセスに直接転換することができる。加えて、本明細書においてクロマトグラフィー段階においてシェルビーズを用いる本方法はより高い速度で運転でき、所定の時間でより多くの生成物の製造を可能にすることで、即ちこの特定のクロマトグラフィー段階のための時間を短縮することで、プロセスを一層経済的なものにする。

【0008】

本発明は、ビーズの最外層のみが官能化されていること（即ち、官能性リガンドがビーズの最外層のみに見出され、コアには見出されないこと）を特徴とするシェルビーズを用いる生体分子精製方法を提供する。官能化層の厚さは調節することができ、官能化されていないビーズのコアは例えばデキストランで満たされるか、或いは空のままであり得る。

【0009】

官能化層を有するクロマトグラフィービーズは、大きい粒子のより良好な圧流特性を維持しながら、ずっと小さい完全官能化ビーズ上での分解能に匹敵する分解能を有する可能性がある。かかるシェルビーズの能力は本質的に官能化されたビーズ体積の分率によって表され、したがって同じサイズの完全官能化ビーズより低い。

【0010】

かくして本発明は、プロインスリンからインスリンを精製する方法であって、開裂プロインスリンの試料を、内側コア及びイオン交換リガンドを備えた外側官能化層を有する多孔質シェルビーズを含むクロマトグラフィー媒体上にロードする段階、インスリンをリガンド上に吸着させる段階、並びに１００〜１０００ｃｍ／時、好ましくは３００〜６００ｃｍ／時の流量でクロマトグラフィー媒体からインスリンを溶出する段階を含んでなり、溶出されたインスリンが８５％を超える、好ましくは９０％を超える純度を有する方法に関する。

【0011】

本方法で使用されるシェルビーズは、２０〜１００μｍ、好ましくは４０〜８０μｍの直径を有している。

【0012】

シェルビーズの官能化層は、厚さ３〜９μｍの層、好ましくは厚さ５〜７μｍの層を含んでいる。

【0013】

イオン交換リガンドは、スルホネート（ＳＯ₃^-）、スルフェート（−ＯＳＯ₃^-）、ホスフェート（−ＯＰＯ₃^2-）及びホスホネート（ＰＯ₃^2-）のような強陽イオン交換基である。

【0014】

一実施形態では、シェルのコアは、コアを一層高密度にしてより良好な分解能（より幅の狭いピーク）を与えるために適当な極性ポリマーで満たされている。かかる極性ポリマーは、アガロース、デキストラン、セルロース、デンプン、プルラン又は完全合成ポリマー（例えば、ポリアクリル酸アミド、ポリメタクリル酸アミド、ポリ（ヒドロキシアルキルアクリレート）であり得る。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】図１は、本発明の精製方法で使用されるシェルビーズの模式的である。

【図2】図２は、シェルビーズクロマトグラフィーを用いたインスリンの精製を示すグラフである。

【図3】図３は、２種の媒体を充填したカラムに加わる背圧に対するベッド高さ及び流量の効果を示している。

【図4】図４は、市販の媒体及び本発明で使用されるシェルビーズ媒体を用いたインスリン精製の比較を示している。

【図5】図５は、市販の媒体及び本発明で使用されるシェルビーズ媒体に対する流量の効果を示している。

【図6】図６は、市販の媒体及びシェルビーズ媒体上でのインスリン精製の結果を示している。

【発明を実施するための形態】

【0016】

以下、若干の非限定的な実施例に関連して本発明を一層詳しく説明しよう。

【0017】

材料及び方法：
本明細書には、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＦＡ ５５に基づく３種のシェルビーズ構築物及び２種の基準プロトタイプ／樹脂が示されている（図１、表１）。

【0018】

図１中で左から右に向かって、プロトタイプＳ６（最外層中にＳリガンドが含まれるが、コアは未官能化のままである）、プロトタイプＳ２０（プロトタイプＳ６と同じだが、コアはデキストランＴ１５０（Ｍｐ １５００００）で満たされている）、プロトタイプＳ２６（プロトタイプＳ２０と同じだが、Ｓリガンドはデキストラン延長剤（Ｍｐ １００００）上にカップリングされている）、プロトタイプＳ１２（ビーズ全体が官能化されている基準プロトタイプ）及びＣａｐｔｏ ＳＰ ＩｍｐＲｅｓである。最初の４つのプロトタイプは７７μｍの粒子サイズを有するのに対し、Ｃａｐｔｏ ＳＰ ＩｍｐＲｅｓは４０μｍの粒子サイズを有する。

【0019】

【表1】

【0020】

Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＦＡ ５５に基づくシェル媒体の製造
プロトタイプＳ６の合成：
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＦＡ ５５のアリル活性化
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＦＡ ５５をガラスフィルター上において蒸留水で洗浄した。ゲル（７００ｍＬの水切りゲル）を三つ口丸底フラスコ内に秤取した。ＮａＯＨ（７００ｍＬ、５０％溶液）を添加し、機械的撹拌を開始した。スラリーを水浴上で５０℃に加熱した。約１時間後、１２６ｍＬのアリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）を添加した。次いで、スラリーを一晩激しく撹拌し続けた。約２０時間後、スラリーをガラスフィルターに移し、蒸留水（×４）、エタノール（×４）及び蒸留水（×４）で洗浄した。

【0021】

次いで、アリル含有量を滴定によって測定したところ、２１５μｍｏｌ／ｍＬであった。

【0022】

シェル活性化（部分臭素化）
アリル化ゲル（１００ｍＬ）をフラスコ内に秤取し、１００ｍＬの蒸留水を添加した。０．５２４ｍＬの臭素を８００ｍＬの蒸留水に溶解し、アリル化ゲルスラリーに添加した。この量の臭素は、約７．５μｍのシェル厚さを与える（それに対応している）と考えられる。臭素溶液は、アリルゲルスラリーを激しく撹拌しながら瞬時に添加した。約１０分後、ゲルをガラスフィルター上において蒸留水で洗浄した。

【0023】

ＳＯ₃^-基のシェルカップリング
１００ｍＬの部分臭素化ゲル（上記参照）をフラスコに移し、１００ｍＬの蒸留水に溶解した１０ｇの亜硫酸ナトリウムと混合した。撹拌しながら、５０％ＮａＯＨを添加してｐＨ１２にし、続いて５０℃で１６時間撹拌し、ガラスフィルター上において蒸留水で洗浄した。次いで、ゲルをガラスフィルター上において蒸留水で洗浄した。

【0024】

結合したＳＯ₃^-基の量は４３μｍｏｌ／ｍＬと推定された。

【0025】

コアのアリル除去
５０ｍＬのＳ−シェルゲル（上記参照）を蒸留水（５０ｍＬ）に溶解した２０％（ｖ／ｖ）チオグリセロールと混合した。ｐＨを１０に調整し、続いて５０℃で２０時間撹拌した。次いで、ゲルをガラスフィルター上において蒸留水で洗浄した。

【0026】

プロトタイプＳ１２の合成：
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＦＡ ５５のアリル活性化
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＦＡ ５５をガラスフィルター上において蒸留水で洗浄した。ゲル（７００ｍＬの水切りゲル）を三つ口丸底フラスコ内に秤取した。ＮａＯＨ（７００ｍＬ、５０％溶液）を添加し、機械的撹拌を開始した。スラリーを水浴上で５０℃に加熱した。約１時間後、２４５ｍＬのアリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）を添加した。次いで、スラリーを一晩激しく撹拌し続けた。約２０時間後、スラリーをガラスフィルターに移し、蒸留水（×４）、エタノール（×４）及び蒸留水（×４）で洗浄した。

【0027】

次いで、アリル含有量を滴定によって測定したところ、２９０μｍｏｌ／ｍＬであった。

【0028】

ビーズの活性化（臭素化）
アリル化ゲル（５０ｍＬ）をフラスコ内に秤取し、５０ｍＬの蒸留水及び２．０ｇの酢酸ナトリウムを添加した。臭素（飽和水溶液）を、持続的な黄色い色が得られるまで添加し、続いて過剰の臭素をギ酸ナトリウムで分解し、ガラスフィルター上において蒸留水で洗浄した。

【0029】

ＳＯ₃^-基のカップリング
５０ｍＬの臭素化ゲル（上記参照）をフラスコに移し、２５ｍＬの蒸留水に溶解した１０ｇの亜硫酸ナトリウムと混合した。撹拌しながら、５０％ＮａＯＨを添加してｐＨ１２にし、続いて５０℃で１８時間撹拌した。次いで、ゲルをガラスフィルター上において蒸留水で洗浄した。

【0030】

結合したＳＯ₃^-基の量は１０３μｍｏｌ／ｍＬと推定された。

【0031】

プロトタイプＳ２０の合成：
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＦＡ ５５のアリル活性化
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＦＡ ５５をガラスフィルター上において蒸留水で洗浄した。ゲル（７００ｍＬの水切りゲル）を三つ口丸底フラスコ内に秤取した。ＮａＯＨ（７００ｍＬ、５０％溶液）を添加し、機械的撹拌を開始した。スラリーを水浴上で５０℃に加熱した。約１時間後、１２６ｍＬのアリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）を添加した。次いで、スラリーを一晩激しく撹拌し続けた。約２０時間後、スラリーをガラスフィルターに移し、蒸留水（×４）、エタノール（×４）及び蒸留水（×４）で洗浄した。

【0032】

次いで、アリル含有量を滴定によって測定したところ、２１５μｍｏｌ／ｍＬであった。

【0033】

シェル活性化（部分臭素化）
アリル化ゲル（１００ｍＬ）をフラスコ内に秤取し、１００ｍＬの蒸留水を添加した。０．５２４ｍＬの臭素を８００ｍＬの蒸留水に溶解し、アリル化ゲルスラリーに添加した。この量の臭素は、約７．５μｍのシェル厚さを与える（それに対応している）と考えられる。臭素溶液は、アリルゲルスラリーを激しく撹拌しながら瞬時に添加した。約１０分後、ゲルをガラスフィルター上において蒸留水で洗浄した。

【0034】

ＳＯ₃^-基のシェルカップリング
１００ｍＬの部分臭素化ゲル（上記参照）をフラスコに移し、１００ｍＬの蒸留水に溶解した１０ｇの亜硫酸ナトリウムと混合した。撹拌しながら、５０％ＮａＯＨを添加してｐＨ１２．５にし、続いて５０℃で１８時間撹拌した。次いで、ゲルをガラスフィルター上において蒸留水で洗浄した。

【0035】

結合したＳＯ₃^-基の量は４３μｍｏｌ／ｍＬと推定された。

【0036】

コアの活性化（臭素化）
５０ｍＬのシェルカップルドビーズ（上記参照）をフラスコ内に秤取し、５０ｍＬの蒸留水及び２．０ｇの酢酸ナトリウムを添加した。臭素（飽和水溶液）を、持続的な黄色い色が得られるまで添加し、続いて過剰の臭素をギ酸ナトリウムで分解し、ガラスフィルター上において蒸留水で洗浄した。

【0037】

ビーズのコア中のデキストランカップリング
５０ｇのデキストラン（ＭＷ：１５００００ｇ／ｍｏｌ）を、周囲温度で２〜４時間ゆっくりと撹拌することで５０ｍＬの蒸留水に溶解した。５０ｍＬの水切りコア活性化ＨＦＡ ５５ビーズ（シェルにＳＯ₃^-基が結合したもの）をデキストラン溶液に添加し、溶液を５０℃で１時間撹拌した。撹拌しながら、６．２５ｍＬの５０％ＮａＯＨを添加した。溶液を５０℃で１６時間撹拌し、次いでガラスフィルター上において蒸留水で洗浄した。

【0038】

プロトタイプＳ２６の合成：
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＦＡ ５５のアリル活性化
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＦＡ ５５をガラスフィルター上において蒸留水で洗浄した。ゲル（４００ｍＬの水切りゲル）を三つ口丸底フラスコ内に秤取した。ＮａＯＨ（４００ｍＬ、５０％溶液）を添加し、機械的撹拌を開始した。スラリーを水浴上で５０℃に加熱した。約１時間後、７２ｍＬのアリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）を添加した。次いで、スラリーを一晩激しく撹拌し続けた。約２０時間後、スラリーをガラスフィルターに移し、蒸留水（×４）、エタノール（×４）及び蒸留水（×４）で洗浄した。

【0039】

次いで、アリル含有量を滴定によって測定したところ、２１５μｍｏｌ／ｍＬであった。

【0040】

ビーズの活性化（臭素化）
４００ｍＬのアリル化ビーズ（上記参照）をフラスコ内に秤取し、５００ｍＬの蒸留水及び２．０ｇの酢酸ナトリウムを添加した。臭素（飽和水溶液）を、持続的な黄色い色が得られるまで添加し、続いて過剰の臭素をギ酸ナトリウムで分解し、ガラスフィルター上において蒸留水で洗浄した。

【0041】

デキストランカップリング
３２０ｇのデキストラン（ＭＷ：１００００ｇ／ｍｏｌ）を、周囲温度で２〜４時間ゆっくりと撹拌することで４００ｍＬの蒸留水に溶解した。４００ｍＬの水切り活性化ＨＦＡ ５５ビーズ（上記参照）をデキストラン溶液に添加し、溶液を５０℃で１時間撹拌した。撹拌しながら、５０ｍＬの５０％ＮａＯＨを添加した。溶液を５０℃で１６時間撹拌し、次いでガラスフィルター上において蒸留水で洗浄した。結合したデキストランの量は１７ｍｇ／ｍＬであった。

【0042】

デキストラン修飾Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＦＡ ５５のアリル活性化
デキストラン修飾Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＦＡ ５５をガラスフィルター上において蒸留水で洗浄した。ゲル（２００ｍＬの水切りゲル）を三つ口丸底フラスコ内に秤取した。ＮａＯＨ（２００ｍＬ、５０％溶液）を添加し、機械的撹拌を開始した。スラリーを水浴上で５０℃に加熱した。約１時間後、３６ｍＬのアリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）を添加した。次いで、スラリーを一晩激しく撹拌し続けた。約１６時間後、スラリーをガラスフィルターに移し、蒸留水（×４）、エタノール（×４）及び蒸留水（×４）で洗浄した。

【0043】

次いで、アリル含有量を滴定によって測定したところ、２２０μｍｏｌ／ｍＬであった
シェル活性化（部分臭素化）
アリル化ゲル（５０ｍＬ）をフラスコ内に秤取し、５００ｍＬの蒸留水を添加した。０．２７ｍＬの臭素を５０ｍＬの蒸留水に溶解し、アリル化ゲルスラリーに添加した。この量の臭素は、約７．５μｍのシェル厚さを与える（それに対応している）と考えられる。臭素溶液は、アリルゲルスラリーを激しく撹拌しながら瞬時に添加した。約１０分後、ゲルをガラスフィルター上において蒸留水で洗浄した。

【0044】

残りのアリル含有量（ビーズのコア中のアリル基）は１３０μｍｏｌ／ｍＬであった。

【0045】

ＳＯ₃^-基のシェルカップリング
５０の部分臭素化ゲル（上記参照）をフラスコに移し、１００ｍＬの蒸留水に溶解した５ｇの亜硫酸ナトリウムと混合した。撹拌しながら、５０％ＮａＯＨを添加してｐＨ１２にし、続いて５０℃で１６時間撹拌した。次いで、ゲルをガラスフィルター上において蒸留水で洗浄した。

【0046】

結合したＳＯ₃^-基の量は５０μｍｏｌ／ｍＬと推定された。

【0047】

コアの活性化（臭素化）
５０ｍＬのシェルカップルドビーズ（上記参照）をフラスコ内に秤取し、５０ｍＬの蒸留水及び２．０ｇの酢酸ナトリウムを添加した。臭素（飽和水溶液）を、持続的な黄色い色が得られるまで添加し、続いて過剰の臭素をギ酸ナトリウムで分解し、ガラスフィルター上において蒸留水で洗浄した。

【0048】

ビーズのコア中のデキストランカップリング
５０ｇのデキストラン（ＭＷ：１５００００ｇ／ｍｏｌ）を、周囲温度で２〜４時間ゆっくりと撹拌することで５０ｍＬの蒸留水に溶解した。５０ｍＬの水切りコア活性化ＨＦＡ ５５ビーズ（シェルにＳＯ₃^-基が結合したもの）をデキストラン溶液に添加し、溶液を５０℃で１時間撹拌した。撹拌しながら、６．２５ｍＬの５０％ＮａＯＨを添加した。溶液を５０℃で１６時間撹拌し、次いでガラスフィルター上において蒸留水で洗浄した。

【実施例】

【0049】

実験１：基準樹脂Ｃａｐｔｏ ＳＰ ＩｍｐＲｅｓ上における開裂プロインスリンからのインスリン精製
開裂プロインスリンからインスリンを精製する。除去すべき３種の夾雑物、即ちプレピーク、トランケート型インスリン及び主夾雑物が存在している。これは、基準樹脂Ｃａｐｔｏ ＳＰ ＩｍｐＲｅｓを使用することで成功裡に達成された（図２）。

【0050】

図２は、１ｍｌのＣａｐｔｏ ＳＰ ＩｍｐＲｅｓ（０．５ｃｍ ｉ.ｄ.）上でのインスリンの精製を示している。インスリン供給濃度は９ｍｇ／ｍｌ樹脂であり、ローディング容量は２ｍｌであった。緩衝液Ａは５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４＋４７．５％エタノールであった。緩衝液Ｂは５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４、２５０ｍＭ ＮａＣｌ＋４７．５％エタノールであった。勾配は１０カラム容積にわたって０〜６０％緩衝液Ｂであった。主夾雑物は１Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液Ａで溶出された。流量は０．４ｍＭ／分（滞留時間５分）であった。ＵＶトレース及び導電率が示されている。

【0051】

実験２：基準樹脂に対する、様々なシェルビーズプロトタイプ上でのインスリン精製の比較
高濃度のエタノールの存在下で精製を行うが、凝集／繊維化の問題が起こり得るためにロードは比較的低い（約１８ｇ／Ｌ）。エタノールの存在は、望ましくない比較的高い背圧を与える。したがって、圧流制限を回避するためにより大きいビーズ上でのシェルビーズ構築物（より低い背圧）を使用することの可能性を検討した。Ｃａｐｔｏ ＳＰ ＩｍｐＲｅｓ及びより大きいシェルビーズに関する背圧の比較を図３に示す。

【0052】

図３は、Ｃａｐｔｏ ＳＰ ＩｍｐＲｅｓ（４０μｍ）並びにシェルビーズＳ６、Ｓ２０及びＳ２６（７７μｍ）を充填したカラムに加わる背圧に対するベッド高さ及び流量の効果を示している。０．４ｍｌ／分及び０．８ｍｌ／分の流量は、それぞれ１２０ｃｍ／時及び２４０ｃｍ／時の線流量に相当している。

【0053】

シェルビーズ構築物をそのインスリン精製能力について試験した。結果は、シェルビーズを使用すれば（プロトタイプＳ２０では）インスリンを＞９０％の純度に精製するのが可能であることを示した（図４）。予想通り、完全に官能化された基準プロトタイプＳ１２に関する分解能はシェルビーズプロトタイプよりずっと悪かった。

【0054】

図４は、１ｍｌのＣａｐｔｏ ＳＰ ＩｍｐＲｅｓ（０．５ｃｍ ｉ.ｄ.）及び２ｍｌのシェルビーズプロトタイプ（０．５ｃｍ ｉ.ｄ.）上でのインスリン精製の比較を示している。インスリン供給濃度は９ｍｇ／ｍｌ樹脂であり、ローディング容量は２ｍｌ（Ｃａｐｔｏ ＳＰ ＩｍｐＲｅｓ）又は４ｍｌ（シェルビーズプロトタイプ）であった。緩衝液Ａは５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４＋４７．５％エタノールであった。緩衝液Ｂは５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４、２５０ｍＭ ＮａＣｌ＋４７．５％エタノールであった。勾配は１０カラム容積にわたって０〜６０％緩衝液Ｂであった。主夾雑物は１Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液Ａで溶出された。シェルビーズプロトタイプに関する滞留時間は２．５分（２４０ｃｍ／時）であったのに対し、Ｃａｐｔｏ ＳＰ ＩｍｐＲｅｓに関しては５分であった。

【0055】

実験３：シェルビーズプロトタイプ及び基準樹脂上における夾雑物からのインスリンの分離に対する流量の効果
基準樹脂Ｃａｐｔｏ ＳＰ ＩｍｐＲｅｓ上においては、１２０及び２４０ｃｍ／時の流量のそれぞれで分離は良好であった。しかし、シェルビーズに関しては、最大４８０ｃｍ／時までの流量で分離が良好であった（図５）。シェルビーズ上においては、最大４８０ｃｍ／時までの流量で純度は＞９０％であった。

【0056】

図５は、Ｃａｐｔｏ ＳＰ ＩｍｐＲｅｓ及びシェルビーズプロトタイプ（Ｓ２０）に対する流量の効果を示している。カラム容積は両樹脂に関して２ｍｌであった。インスリン供給濃度は９ｍｇ／ｍｌ樹脂であった。ローディング容量は４ｍｌであった。緩衝液Ａは５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４＋４７．５％エタノールであった。緩衝液Ｂは５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４、２５０ｍＭ ＮａＣｌ＋４７．５％エタノールであった。勾配は１５カラム容積にわたって０〜９０％緩衝液Ｂであった。

【0057】

実験４：基準樹脂上及び基準樹脂（Ｃａｐｔｏ ＳＰ ＩｍｐＲｅｓ）と同じベースマトリックスを用いて作製されたシェルビーズプロトタイプ上におけるインスリン精製
シェルビーズの概念を使用すれば、大きいビーズ（７７μｍ）上において良好な精製を達成し得ることが上記の実験で示された。

【0058】

本実験では、シェルビーズの概念をＣａｐｔｏ ＳＰ ＩｍｐＲｅｓのより小さいビーズ（４０μｍ）に適用した。２種のシェル厚さ（２及び５μｍ）をそれぞれ官能化した。予想通り、シェルビーズプロトタイプはＣａｐｔｏ ＳＰ ＩｍｐＲｅｓに比べて改善された分解能を有していた（図６）。

【0059】

図６は、Ｃａｐｔｏ ＳＰ ＩｍｐＲｅｓ上及びＣａｐｔｏ ＳＰ ＩｍｐＲｅｓと同じベースマトリックスを用いて作製されたシェルビーズプロトタイプ上におけるインスリン精製を示している。シェルビーズプロトタイプは、それぞれ２μｍ及び５μｍの官能化層を有していた。ロードは、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４及び１０％エタノール中の６．５ｍｇ開裂インスリン／ｍｌ樹脂であった。溶出段階１は、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４、１７０ｍＭ ＮａＣｌ、５０％エタノールを用いて行った。溶出段階２は、ＮａＣｌ濃度が１Ｍであった点を除けば溶出段階１と同じであった。

【0060】

結果及び考察：
ＨＦＡ ＳＰシェルビーズプロトタイプ及びＣａｐｔｏ ＳＰ ＩｍｐＲｅｓ上において得られた推定生産性の比較を、インスリンプロセスからの現実データを用いて実施した。

【0061】

生産性の計算は、ＣＩＥＸ段階のみを見ながら実施した。

【0062】

全てのシミュレーションに関し、Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎ Ｉｎｃ．から入手したＳｕｐｅｒＰｒｏ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ，ｖｅｒｓｉｏｎ ８．５，Ｂｕｉｌｄ ３を使用した。シミュレーションは、インスリンを１５ｇ／Ｌの濃度で処理することに関して行った。１５ｇ／Ｌの濃度は、この段階におけるインスリンの平均濃度として選択した。収率は両樹脂に関して８５％であった。シミュレーションのために使用したベッド高さは２０ｃｍであった。

【0063】

シミュレーションは、ＨＦＡ ＳＰシェルビーズプロトタイプに関しては４８０ｃｍ／時、またＣａｐｔｏ ＳＰ ＩｍｐＲｅｓに関しては１２０ｃｍ／時のローディング段階流量を用いて行った。これは、ＨＦＡ ＳＰシェルビーズプロトタイプに関しては２．５分の滞留時間（ＲＴ）を与え、Ｃａｐｔｏ ＳＰ ＩｍｐＲｅｓに関しては１０分のＲＴを与える。全ての他の流量は、ＨＦＡ ＳＰシェルビーズプロトタイプに関しては６００ｃｍ／時、またＣａｐｔｏ ＳＰ ＩｍｐＲｅｓに関しては２５０ｃｍ／時に設定した。ただし、両樹脂に関して規定の時間（即ち、１５分）に設定した再生／ＣＩＰ段階は除外する。両樹脂に関し、２０ｇインスリン／Ｌ樹脂のワーキング／有効容量を使用した。

【0064】

シミュレートしたポリッシング段階は下記の操作を含んでいた。
●平衡化：Ｃａｐｔｏ ＳＰ ＩｍｐＲｅｓに関しては４ＣＶ、ＨＦＡ ＳＰシェルビーズに関しては２ＣＶ。
●ロード：５０ｇインスリン／Ｌ樹脂。
●洗浄：３ＣＶ。
●溶出：１５ＣＶ勾配０〜７０％、２５ＣＶ及び３ＣＶ １００％。
●ＣＩＰ：１５分。
●再平衡化：Ｃａｐｔｏ ＳＰ ＩｍｐＲｅｓに関しては４ＣＶ、ＨＦＡ ＳＰシェルビーズに関しては２ＣＶ。

【0065】

ＨＦＡ ＳＰシェルビーズプロトタイプを用いるプロセスに関する運転時間は１時間８分であるのに対し、Ｃａｐｔｏ ＳＰ ＩｍｐＲｅｓを含むプロセスは２時間３９分を要する。表１は、これら２種のシミュレーションからの結果を示している。

【0066】

【表2】

【0067】

これら１組のシミュレーションに基づけば、ＨＦＡ ＳＰシェルビーズプロトタイプに関する生産性はＣａｐｔｏ ＳＰ ＩｍｐＲｅｓに比べて約２倍であることがわかる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】