特許 6093757 医薬組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6093757

(24)【登録日】2017年2月17日

(45)【発行日】2017年3月8日

(54)【発明の名称】医薬組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/768 20150101AFI20170227BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20170227BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20170227BHJP

   C12N 7/00 20060101ALI20170227BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20170227BHJP

【ＦＩ】

   A61K35/768ZNA

   A61K45/00

   A61P35/00

   C12N7/00

   C12N15/00 A

【請求項の数】9

【全頁数】27

(21)【出願番号】特願2014-511268(P2014-511268)

(86)(22)【出願日】2013年4月19日

(86)【国際出願番号】JP2013061686

(87)【国際公開番号】WO2013157648

(87)【国際公開日】20131024

【審査請求日】2016年4月12日

(31)【優先権主張番号】特願2012-96088(P2012-96088)

(32)【優先日】2012年4月19日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】504145342

【氏名又は名称】国立大学法人九州大学

(74)【代理人】

【識別番号】100095407

【弁理士】

【氏名又は名称】木村 満

(74)【代理人】

【識別番号】100168114

【弁理士】

【氏名又は名称】山中 生太

(74)【代理人】

【識別番号】100133592

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100162259

【弁理士】

【氏名又は名称】末富 孝典

(74)【代理人】

【識別番号】100139262

【弁理士】

【氏名又は名称】中嶋 和昭

(72)【発明者】

【氏名】谷 憲三朗

(72)【発明者】

【氏名】井上 博之

(72)【発明者】

【氏名】安成 啓祐

(72)【発明者】

【氏名】宮本 将平

【審査官】 佐々木 大輔

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１１／０５４６２０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２０１２−０４６４８９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００９−５０７８２３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００７−５２７７１９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１１−５０７５００（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１１−５１７４０８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００５−５３７８０２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 中川 龍比湖，ヒト由来ウイルスによる担癌マウスの治療の試み，久留米医学会雑誌, 1989, Vol.52, No.1, pp.11-20

【文献】 J. Mol. Med., 2009, Vol.87, pp.385-399

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３５／００−３５／７６８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＤＷＰＩ（Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ）

日経テレコン

ＣｉＮｉｉ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

癌細胞に感染するコクサッキーウイルスＡ１１型を含む、
小細胞肺癌、非小細胞肺癌、悪性中皮腫、大腸癌、食道癌、頭頸部癌、悪性リンパ腫、乳癌及び子宮頸癌からなる群から選択される癌を治療するための医薬組成物。

【請求項2】

前記コクサッキーウイルスＡ１１型は、
カプシドが除去されたことを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項3】

フォスフォイノシトール３キナーゼ阻害剤と併用される、
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の医薬組成物。

【請求項4】

ＭＡＰキナーゼキナーゼ阻害剤と併用される、
ことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項5】

抗癌剤と併用される、
ことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項6】

ＣＤＤＰ抵抗性の癌の治療に使用される、
ことを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項7】

ゲフィチニブ抵抗性又はオキサリプラチン抵抗性の癌の治療に使用される、
ことを特徴とする請求項１乃至６のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項8】

前記癌細胞は、癌幹細胞である、
ことを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項11】

癌細胞に感染するコクサッキーウイルスＡ１１型に由来する核酸を含む、
小細胞肺癌、非小細胞肺癌、悪性中皮腫、大腸癌、食道癌、頭頸部癌、悪性リンパ腫、乳癌及び子宮頸癌からなる群から選択される癌を治療するための医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、腫瘍溶解性エンテロウイルスを含有する医薬組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

悪性腫瘍は、日本人の死因の第１番目であり、統計上は国民の３人に１人が悪性腫瘍を原因として死亡している。長年の努力により、悪性腫瘍に対する手術療法、放射線療法、分子標的薬を含む化学療法の進歩は著しく、治療成績は向上している。しかし、悪性腫瘍による死亡率は依然として高く、悪性腫瘍に有効な新たな治療方法が望まれている。

【0003】

新たな治療方法として、腫瘍溶解性ウイルス療法が直接的な殺細胞効果を有する点で注目されてきている。例えば、ＤＮＡウイルスである腫瘍溶解性アデノウイルスや単純ヘルペスウイルスを用いた臨床研究が脳腫瘍や乳癌を対象として実施されており、安全性と有効性を示唆する結果が報告されている。

【0004】

また、ＲＮＡウイルスであるピコルナウイルス科のエンテロウイルスは、感染後に宿主細胞のゲノムへの組み込みがなく遺伝子変異による癌化リスクが低いことに加え、癌遺伝子を有していないため安全性が高い。また、エンテロウイルスは、細胞内での増殖速度が速いため、迅速かつ高い抗腫瘍効果が期待できる。

【0005】

例えば、特許文献１には、エンテロウイルスであるコクサッキーウイルス（ＣＶ）Ａ２１型、エコーウイルス（ＥＶ）６型、ＥＶ７型、ＥＶ１１型、ＥＶ１２型、ＥＶ１３型、ＥＶ２９型を用いた腫瘍溶解性ウイルス療法が開示されている。また、特許文献２には、ＣＶＡ１３型、ＣＶＡ１５型、ＣＶＡ１８型、ＣＶＡ２１型、ＥＶ１型、ＥＶ７型、ＥＶ８型、ＥＶ２２型を用いた腫瘍溶解性ウイルス療法が開示されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】特表２００７−５２７７１９号公報

【特許文献2】特開２０１２−４６４８９号公報

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Ｋｅｌｌｙ ＥＪ ｅｔ ａｌ． Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ ｔｏ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ， Ｎａｔ Ｍｅｄ， ２００８， １４， １２７８−１２８３

【非特許文献2】Ｔｒａｌｌｅｒｏ Ｇ ｅｔ ａｌ． Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎ Ｓｐａｉ ｏｖｅｒ ｔｈｅ ｄｅｃａｄｅ １９９８−２００７： ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｅｐｉｄｅｍｉｏｇｉｃａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｖｉｒｏｌ， ２０１０， ４７， １７０−１７６

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

しかしながら、ＣＶＡ２１型は、投与したマウスが重篤な筋炎を発症し、高い致死性を示すとの報告がある（非特許文献１参照）。また、ＥＶ６型、ＥＶ１１型等は、無菌性髄膜炎の原因ウイルスとして報告されている（非特許文献２参照）。さらに、上記エンテロウイルスを用いた腫瘍溶解性ウイルス療法には、臨床試験において安全性が確認されたものが未だにない。これらのことから、エンテロウイルスを用いた腫瘍溶解性ウイルス療法は、確実に安全であるとは言い難い。

【0009】

本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、より安全性の高いエンテロウイルスを含む医薬組成物を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明者は、より安全性の高いエントロウイルスを同定すべく、３０種類以上のエンテロウイルス及び多種類のヒト悪性腫瘍細胞株を用いたスクリーニング実験を行った結果、これまでに報告されていないＥＶ４型及びＣＶＡ１１型が高い細胞傷害性を示すことを明らかにした。両ウイルスは、無菌性髄膜炎の患者から検出されることがあるが、その頻度は検出された全ウイルスの１．０％以下であって、ＥＶ６型及びＥＶ１１型等の他のＥＶと比較して非常に低く、安全性が高いウイルスと考えられる。

【0011】

すなわち、本発明の第１の観点に係る医薬組成物は、
癌細胞に感染するコクサッキーウイルスＡ１１型又は癌細胞に感染するエコーウイルス４型を含む。

【0012】

この場合、前記コクサッキーウイルスＡ１１型及びエコーウイルス４型は、
カプシドが除去された、
こととしてもよい。

【0013】

また、上記医薬組成物は、
フォスフォイノシトール３キナーゼ阻害剤と併用される、
こととしてもよい。

【0014】

また、上記医薬組成物は、
ＭＡＰキナーゼキナーゼ阻害剤と併用される、
こととしてもよい。

【0015】

また、上記医薬組成物は、
抗癌剤と併用される、
こととしてもよい。

【0016】

また、上記医薬組成物は、
ＣＤＤＰ抵抗性の癌の治療に使用される、
こととしてもよい。

【0017】

また、上記医薬組成物は、
前記コクサッキーウイルスＡ１１型を含み、
ゲフィチニブ抵抗性又はオキサリプラチン抵抗性の癌の治療に使用される、
こととしてもよい。

【0018】

また、上記医薬組成物は、
前記コクサッキーウイルスＡ１１型を含み、
前記癌細胞は、癌幹細胞である、
こととしてもよい。

【0019】

また、上記医薬組成物は、
前記コクサッキーウイルスＡ１１型を含み、
前記癌細胞は、
小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、悪性中皮腫、大腸癌、結腸直腸癌、食道癌、下咽頭癌、ヒトＢリンパ腫、乳癌及び子宮頸癌からなる群から選択される癌の癌細胞である、
こととしてもよい。

【0020】

また、上記医薬組成物は、
前記エコーウイルス４型を含み、
前記癌細胞は、
小細胞肺癌、非小細胞肺癌、大腸癌、結腸直腸癌、膵癌及び食道癌からなる群から選択される癌の癌細胞である、
こととしてもよい。

【0021】

本発明の第２の観点に係る医薬組成物は、
癌細胞に感染するコクサッキーウイルスＡ１１型に由来する核酸又は癌細胞に感染するエコーウイルス４型に由来する核酸を含む。

【発明の効果】

【0022】

本発明によれば、ヒトに対する病原性が低いＣＶＡ１１型又はＥＶ４型を含むため、エンテロウイルスを用いた医薬組成物の安全性をより高めることができる。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1】食道癌の細胞株に対するＥＶ４型の細胞傷害性を示す図である。

【図2】各種阻害剤存在下での食道癌の細胞株に対するＥＶ４型の細胞傷害性を示す図である。

【図3】ＭＥＫ阻害剤存在下での食道癌の細胞株に対するＥＶ４型の細胞傷害性を示す図である。

【図4】ヒト食道癌担癌マウスの腫瘍体積に対するＥＶ４型の効果を示す図である。

【図5】図４のヒト食道癌担癌マウスの体重を示す図である。

【図6】ＥＶ４型を投与したヒト食道癌担癌マウスの腫瘍体積の経時変化を示す図（その１）である。

【図7】図６のヒト食道癌担癌マウスの体重の経時変化を示す図である。

【図8】ＥＶ４型を投与したヒト食道癌担癌マウスの腫瘍体積の経時変化を示す図（その２）である。

【図9】図８のヒト食道癌担癌マウスの体重の経時変化を示す図である。

【図10】ＣＤＤＰと併用してＥＶ４型を投与したヒト食道癌担癌マウスの腫瘍体積の経時変化を示す図である。

【図11】ヒト食道癌担癌マウスの体重の経時変化を示す図である。

【図12】大腸癌の細胞株に対するＣＡＶ１１型の細胞傷害性を示す図である。

【図13】非小細胞肺癌の細胞株に対するＣＡＶ１１型の細胞傷害性を示す図である。

【図14】悪性中皮腫の細胞株に対するＣＡＶ１１型の細胞傷害性を示す図である。

【図15】抗ＩＣＡＭ−１中和抗体存在下での大腸癌の細胞株に対するＣＶＡ１１型の細胞傷害性を示す図である。

【図16】ＲＤ細胞及びＩＣＡＭ−１を強制発現させたＲＤ細胞に対するＣＶＡ１１型の細胞傷害性を示す図である。

【図17】オキサリプラチンで処理したＷｉＤｒ及びＨＴ２９の細胞生存率、並びにＷｉＤｒ及びＨＴ２９に対するＣＶＡ１１型の細胞傷害性を示す図である。

【図18】大腸癌の細胞株に対するフローサイトメトリー解析の結果を示す図である。

【図19】ＣＶＡ１１型を投与したヒト大腸癌担癌マウスの腫瘍体積の経時変化を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0024】

（実施の形態１）
本発明の実施の形態１について詳細に説明する。本実施の形態に係る医薬組成物は、癌細胞に感染するＣＶＡ１１型又は癌細胞に感染するＥＶ４型を含む。ＣＶＡ１１型及びＥＶ４型は、細胞表面のウイルス受容体に結合することによって、当該細胞に感染することができる。ウイルス受容体として、例えば、崩壊促進因子（ＤＡＦ又はＣＤ５５）、細胞間接着分子‐１（ＩＣＡＭ‐１又はＣＤ５４）、インテグリンα_２β_１（ＣＤ４９ｂ）が知られている。ＣＶＡ１１型及びＥＶ４型がウイルス受容体と相互作用することで、ＣＶＡ１１型及びＥＶ４型のカプシドが脱安定化される。これにより、ＣＶＡ１１型及びＥＶ４型の脱外皮が誘導される。

【0025】

ＣＶＡ１１型及びＥＶ４型は、検体等から既知のウイルス単離方法によって単離できる。ウイルス単離方法は、例えば、遠心分離法や培養細胞によるウイルスの増殖等である。

【0026】

ＣＶＡ１１型及びＥＶ４型は、癌細胞への高い感染性を獲得するよう、天然に存在しているウイルスを、多数回の継代にわたって細胞株において培養することによって生物選抜してもよい。生物選抜に好適な細胞株は、ＤＡＦ、ＩＣＡＭ‐１、インテグリンα_２β_１等を発現する癌細胞株等である。

【0027】

ＣＶＡ１１型及びＥＶ４型は、天然に存在するものであってもよく、改変されたものであってもよい。例えば、ＣＶＡ１１型及びＥＶ４型の改変として、ＣＶＡ１１型及びＥＶ４型は、カプシドが除去されてもよい。カプシドは、例えば、キモトリプシン又はトリプシン等のプロテアーゼによる処理によって除去できる。具体的には、例えば、ＣＶＡ１１型又はＥＶ４型を、アルキル硫酸塩等の界面活性剤の存在下においてキモトリプシンで処理することで、カプシドを除去できる。ＣＶＡ１１型及びＥＶ４型のカプシドを除去することで、ウイルスの癌細胞への感染性を増大させることができる。また、カプシドに存在するタンパク質は宿主の体液性応答及び細胞性応答の主要な因子であるので、ＣＶＡ１１型及びＥＶ４型のカプシドを除去することで、宿主の免疫応答を低下させることができる。

【0028】

ＣＶＡ１１型又はＥＶ４型を含む医薬組成物が対象とする癌種は、特に限定されず、固形癌及び液性癌を含む。ＣＶＡ１１型及びＥＶ４型は、固形癌及び液性癌の癌細胞に対する細胞傷害性を有する。ＣＶＡ１１型及びＥＶ４型による癌細胞に対する細胞傷害性は、ウイルスが癌細胞に感染し、癌細胞の細胞質で複製することによる癌細胞の溶解によるか、ウイルスの感染に起因する癌細胞内のカスパーゼの活性化によるアポトーシスによる。

【0029】

ＣＶＡ１１型及びＥＶ４型の癌細胞に対する細胞傷害性は、ＣＶＡ１１型又はＥＶ４型に暴露された癌細胞の細胞株の生存を試験することで確認することができる。細胞株の生存を試験する方法には、例えば、固定した細胞を染色液で染色して、染色された生細胞の数を定量する方法、クリスタルバイオレット法、アポトーシス特異的なマーカーを定量する方法等がある。これらの方法を用いて、ＣＶＡ１１型又はＥＶ４型とインキュベーションされた癌細胞の細胞株について、所定時間後に生存している癌細胞を定量することで、結果的に、ＣＶＡ１１型又はＥＶ４型の感染による細胞傷害性によって、死滅した癌細胞を定量することができる。

【0030】

ＣＶＡ１１型及びＥＶ４型は、固形癌及び液性癌の癌細胞に対する細胞傷害性を有するが、固形癌において特に強い細胞傷害性が誘導される癌細胞は、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、大腸癌、結腸直腸癌及び食道癌からなる群から選択される癌の細胞である。上記医薬組成物がＣＶＡ１１型を含む場合、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、悪性中皮腫、大腸癌、結腸直腸癌、食道癌、下咽頭癌、ヒトＢリンパ腫、乳癌及び子宮頸癌からなる群から選択される癌の癌細胞を対象に用いられるのが好ましい。一方、上記医薬組成物がＥＶ４型を含む場合、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、大腸癌、結腸直腸癌、膵癌及び食道癌からなる群から選択される癌の癌細胞を対象に用いられるのが好ましい。

【0031】

本実施の形態に係る医薬組成物は、ＣＶＡ１１型又はＥＶ４型に加えて、キャリア、希釈剤又は補助剤等を含むようにしてもよい。キャリアとしては、例えば、リポソーム、ミセル等が好ましい。リポソームは、脂質と膜安定性に寄与するステロイド又はステロイド前駆体との組み合わせを含む。この場合、脂質としては、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、スフィンゴ脂質、ホスファチジルエタノールアミン、セレブロシド、ガングリオシド等のホスファチジル化合物が挙げられる。リポソーム又はミセルで覆われたＣＶＡ１１型及びＥＶ４型は、宿主の免疫応答を低下させることができる。

【0032】

希釈剤としては、例えば、脱塩水、蒸留水及び生理的食塩水等が挙げられる、また、補助剤としては、植物系オイル、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール及び脂肪酸エステル等が挙げられる。

【0033】

本実施の形態に係る医薬組成物は、種々の方法で投与することができる。例えば、癌種に応じて腫瘍内投与、静脈投与、腹腔内投与等で当該医薬組成物を投与することが好ましい。特に、食道癌、大腸癌等の消化器癌の多くは、内視鏡等で腫瘍組織を視認しながら、医薬組成物を腫瘍組織に直接注射できる。この場合、内視鏡等で注射した部位を確認できるため、出血しても対処しやすいという利点もある。なお、当該医薬組成物は、経口投与でもよいし、筋肉、皮下、直腸、膣 、鼻腔等を介して投与してもよい。経口投与の場合、当該医薬組成物は、甘味剤、崩壊剤、希釈剤、コーティング剤、保存剤等を含有してもよい。

【0034】

本実施の形態に係る医薬組成物は、ＣＶＡ１１型又はＥＶ４型が、癌を治療するのに十分な量となるように投与される。投与量は、患者の体重、年齢、性別、腫瘍組織の大きさ等に基づいて決定される。例えば、当該医薬組成物を液剤とする場合、ＣＶＡ１１型又はＥＶ４型が液剤１ｍｌに１×１０^２〜１×１０^１０プラーク形成ユニット含まれていればよい。好ましくは、ＣＶＡ１１型又はＥＶ４型が液剤１ｍｌに１×１０^５プラーク形成ユニット以上含まれていればよい。当該医薬組成物は、単回で投与してもよいし、複数回で投与してもよい。また、当該医薬組成物は、徐放製剤として持続的に投与してもよい。

【0035】

本実施の形態に係る医薬組成物は、フォスフォイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤と併用されてもよい。ＰＩ３Ｋ阻害剤は、イノシトールリン脂質のイノシトール環３位のヒドロキシル基をリン酸化する酵素の活性を阻害する。下記実施例に示すように、ＣＶＡ１１型及びＥＶ４型は、ＰＩ３Ｋ阻害剤と併用されることで、癌細胞に対する細胞傷害性が増強される。ＰＩ３Ｋ阻害剤として、複数の化合物が開発されており、市販されているものを用いてもよいし、合成したものを用いてもよい。

【0036】

また、本実施の形態に係る医薬組成物は、ＭＡＰキナーゼキナーゼ阻害剤と併用されてもよい。ＭＡＰキナーゼキナーゼ阻害剤は、細胞内シグナル伝達系でＧタンパク質の下流にあるＭＡＰキナーゼをリン酸化する酵素の活性を阻害する。下記実施例に示すように、ＣＶＡ１１型及びＥＶ４型は、ＭＥＫ阻害剤（ＭＡＰキナーゼキナーゼ阻害剤）と併用されることで、癌細胞に対する細胞傷害性が増強される。ＭＡＰキナーゼキナーゼ阻害剤として、複数の化合物が開発されており、市販されているものを用いてもよいし、合成したものを用いてもよい。

【0037】

併用されるＰＩ３Ｋ阻害剤及びＭＡＰキナーゼキナーゼ阻害剤は、種々の方法で投与することができる。例えば、癌種に応じて腫瘍内投与、静脈投与、腹腔内投与等で当該医薬組成物を投与することが好ましい。併用されるＰＩ３Ｋ阻害剤及びＭＡＰキナーゼキナーゼ阻害剤の投与量は、患者の体重、年齢、性別、腫瘍組織の大きさ等に基づいて決定される。例えば、ＰＩ３Ｋ阻害剤及びＭＡＰキナーゼキナーゼ阻害剤のそれぞれ投与量は、患者の性別、年齢、体重、症状等によって適宜決定される。静脈注射の場合、投与量は、成人一日あたり０．０００１ｍｇ／ｋｇ乃至１００ｍｇ／ｋｇである。この場合、ＰＩ３Ｋ阻害剤及びＭＡＰキナーゼキナーゼ阻害剤は、それぞれ１回、あるいは複数回に分けて投与されてもよく、複数回の投与においては、連続して投与されてもよい。また、経口投与の場合、ＰＩ３Ｋ阻害剤及びＭＡＰキナーゼキナーゼ阻害剤それぞれの投与量は、成人一日あたり０．００１ｍｇ／ｋｇ乃至１０００ｍｇ／ｋｇである。なお、必要に応じて、上記の範囲外の量を用いることもできる。

【0038】

本実施の形態に係る上記医薬組成物は、抗癌剤と併用されてもよい。抗癌剤は、特に限定されないが、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、悪性中皮腫、大腸癌、結腸直腸癌、食道癌、下咽頭癌、ヒトＢリンパ腫、子宮頸癌及び膵癌等の治療に用いられるものが望ましい。具体的には、抗癌剤は、ＣＤＤＰ（シスプラチン）、ゲフィチニブ、オキサリプラチンなどである。

【0039】

また、本実施の形態に係る上記医薬組成物は、ＣＤＤＰ抵抗性の癌の治療に使用されてもよい。ＣＤＤＰ抵抗性の癌は、例えば、臨床上効果が得られる用量のＣＤＤＰを投与しても、腫瘍体積の減少、増大の抑制又は当該癌に関連する状態の改善等が見られない癌である。ＣＤＤＰ抵抗性の癌の種類は特に限定されないが、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、悪性中皮腫、大腸癌、結腸直腸癌、下咽頭癌、ヒトＢリンパ腫、子宮頸癌及び膵癌等である。特に、ＣＤＤＰ抵抗性の癌の種類として食道癌が好ましい。

【0040】

本実施の形態に係る上記医薬組成物は、ＣＶＡ１１型を含む場合、ゲフィチニブ抵抗性又はオキサリプラチン抵抗性の癌の治療に使用されてもよい。ゲフィチニブ抵抗性又はオキサリプラチン抵抗性の癌の種類は、特に限定されないが、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、悪性中皮腫、大腸癌、結腸直腸癌、食道癌、下咽頭癌、ヒトＢリンパ腫、乳癌及び子宮頸癌等である。

【0041】

また、下記実施例に示すように、ＣＶＡ１１型は、癌幹細胞に対して強い細胞傷害性を示す。このため、本実施の形態に係る上記医薬組成物は、ＣＶＡ１１型を含む場合、特に癌幹細胞を対象にして用いられてもよい。癌幹細胞は、癌幹細胞マーカー、例えばＣＤ１３３の発現を調べることで識別できる。

【0042】

以上詳細に説明したように、本実施の形態に係る医薬組成物によれば、ヒトに対する病原性が低いＣＶＡ１１型又はＥＶ４型を用いるため、エンテロウイルスを用いた医薬組成物の安全性をより高めることができる。

【0043】

また、本実施の形態におけるＣＶＡ１１型及びＥＶ４型は、カプシドが除去されてもよいこととした。こうすることで、ウイルスの癌細胞への感染性を増大させることができ、宿主の免疫応答を低下させることができる。この結果、ＣＶＡ１１型及びＥＶ４型の癌細胞に対する感染性、ひいては医薬組成物の癌細胞に対する細胞傷害性を向上させることができる。

【0044】

また、本実施の形態に係る医薬組成物は、臓器や組織に形成される固形癌に対して医薬組成物を腫瘍組織に直接投与できる。このため、ＣＶＡ１１型又はＥＶ４型の癌細胞への感染性が高まり、より強力な治療効果が期待できる。

【0045】

また、本実施の形態に係る医薬生成物によって強い細胞傷害性が誘導される癌細胞は、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、大腸癌、結腸直腸癌及び食道癌からなる群から選択される癌の細胞である。肺癌は、罹患者数が上位の癌種であるため、本実施の形態に係る医薬組成物によってより多くの肺癌患者の治療に貢献できる。大腸癌、結腸直腸癌は、欧米型食生活の定着した日本において罹患率が増加しており、死亡率も増加している。このため、本実施の形態に係る医薬組成物により、大腸癌、結腸直腸癌に対する治療薬の選択肢が増えることは患者にとって有益である。食道癌は、手術切除後の再発率が３０〜５０％と高く、既存の薬剤に対する感受性が低いため、本実施の形態に係る医薬組成物によって食道癌の治療成績を向上させることができる。

【0046】

また、本実施の形態に係る医薬組成物は、ＰＩ３Ｋ阻害剤及びＭＡＰキナーゼキナーゼ阻害剤の少なくとも一方と併用してもよいこととした。当該医薬組成物は、ＰＩ３Ｋ阻害剤及びＭＡＰキナーゼキナーゼ阻害剤の少なくとも一方と併用することにより、癌細胞に対する殺細胞活性が増強される。このため、癌治療において、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＭＡＰキナーゼキナーゼ阻害剤等の分子標的薬の導入が進められている状況において、当該医薬組成物は、分子標的薬の治療成績を高めることができる。

【0047】

本実施の形態に係る医薬組成物は、抗癌剤と併用されてもよいこととした。当該医薬組成物と異なる作用機序を有する抗癌剤を併用することで、抗腫瘍効果の向上が期待できる。

【0048】

また、本実施の形態に係る医薬組成物は、ＣＤＤＰ抵抗性、ゲフィチニブ抵抗性又はオキサリプラチン抵抗性の癌の細胞に対して強い細胞傷害性を有する。このため、これらの抗癌剤に抵抗性を示す、いわゆる難治性癌に対する有効な治療を提供することができる。

【0049】

また、本実施の形態に係る医薬組成物は、ＣＶＡ１１型を含む場合、癌幹細胞に対しても強い細胞傷害性を示す。癌幹細胞は、癌再発の原因の１つと考えられており、癌の転移及び再発の防止に有用である。

【0050】

（実施の形態２）
本発明の実施の形態２について詳細に説明する。本実施の形態に係る医薬組成物は、癌細胞に感染するＣＶＡ１１型に由来する核酸又は癌細胞に感染するＥＶ４型に由来する核酸を含む。

【0051】

ＣＶＡ１１型に由来する核酸及びＥＶ４型に由来する核酸は、それぞれＣＶＡ１１型及びＥＶ４型から直接単離されたウイルスＲＮＡ、合成ＲＮＡ、単離されたウイルスＲＮＡの塩基配列に対応するｃＤＮＡであってもよい。ウイルスＲＮＡを単離するには、任意の方法を使用することができる。ウイルスＲＮＡを単離する方法は、例えば、フェノール／クロロホルム抽出の使用に基づく方法、磁気ビーズに基づく単離を利用する方法等である。また、当該核酸は、ウイルスを生じさせるための核酸を組み込んだウイルスプラスミドや発現ベクターであってもよい。発現ベクターには、例えば、ウイルスを生じさせるために必要なウイルスタンパク質をコードするＤＮＡを発現することができるプラスミドが含まれる。発現ベクターには、挿入された核酸が機能的に連結された転写調節制御配列が含まれてもよい。ここでの転写調節制御配列は、例えば、転写を開始させるためのプロモーター、転写されたｍＲＮＡに対するリボソームの結合を可能にするための発現制御エレメント等である。

【0052】

発現ベクターとしては、例えば、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＥＦ−ＰＧｋ．ｐｕｒｏ 、ｐＴｋ２、非複製アデノウイルスシャトルベクター、サイトメガロウイルスプロモータ等を用いることができる。ウイルスを生じさせるために必要なウイルスタンパク質をコードするｃＤＮＡは、ウイルスＲＮＡ又はそのフラグメントを逆転写することによって調製することができる。

【0053】

本実施の形態に係る医薬組成物は、癌細胞に感染するＣＶＡ１１型に由来する核酸又は癌細胞に感染するＥＶ４型に由来する核酸に加えて、例えば、リポソーム等のキャリアを含むようにしてもよい。ＣＶＡ１１型に由来する核酸は、例えば配列番号１に示す配列を有する核酸である。ＥＶ４型に由来する核酸は、例えば配列番号２に示す配列を有する核酸である。

【0054】

本実施の形態に係る医薬組成物は、種々の方法で投与することができる。例えば、癌種に応じて腫瘍内投与、静脈投与、腹腔内投与等で当該医薬組成物を投与することが好ましい。なお、当該医薬組成物は、経口投与でもよいし、筋肉、皮下、直腸、膣 、鼻腔等を介して投与してもよい。経口投与の場合、当該医薬組成物は、甘味剤、崩壊剤、希釈剤、コーティング剤、保存剤等を含有してもよい。

【0055】

本実施の形態にかかる医薬組成物は、癌細胞に感染するＣＶＡ１１型に由来する核酸又は癌細胞に感染するＥＶ４型に由来する核酸が、癌を治療するのに十分な量となるように投与される。投与量は、患者の体重、年齢、性別、腫瘍組織の大きさ等に基づいて決定される。例えば、当該医薬組成物を液剤とする場合、ＣＶＡ１１型又はＥＶ４型の１×１０^２〜１×１０^１０プラーク形成ユニットに相当する核酸が液剤１ｍｌに含まれていればよい。好ましくは、ＣＶＡ１１型又はＥＶ４型の１×１０^５プラーク形成ユニット相当以上の核酸が液剤１ｍｌに含まれていればよい。当該医薬組成物は、単回で投与してもよいし、複数回で投与してもよい。また、徐放製剤として持続的に投与してもよい。

【0056】

なお、本実施の形態に係る医薬組成物は、上記実施の形態１と同様に、ＰＩ３Ｋ阻害剤及びＭＡＰキナーゼキナーゼ阻害剤の少なくとも一方と併用されてもよい。

【0057】

以上詳細に説明したように、本実施の形態に係る医薬組成物は、癌細胞に感染するＣＶＡ１１型に由来する核酸又は癌細胞に感染するＥＶ４型に由来する核酸を含むようにした。

【実施例】

【0058】

以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

【0059】

（実施例１）
ＥＶ４型（Ｄｕ ｔｏｉｔ）の調製
ＥＶ４型は、ＲＤ細胞を用いて増殖させた。Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）を用いて継代培養したＲＤ細胞にＥＶ４型を１時間孵置した後、培地をＤＭＥＭに置換し、細胞変性効果が始まるまで静置した。培地を除去後、培養用シャーレにＯＰＴＩ-ＭＥＭ Iを添加し、セルスクレーパーを用いて細胞を剥離回収した。なお、ＥＶ４型及びＲＤ細胞は、インキュベーター内で３７℃、５％ＣＯ₂下で培養した。液体窒素を用いて、回収したＲＤ細胞の凍結、融解を３回繰り返した後、４℃、３０００ｒｐｍで１５分間遠心を行い、上清を回収した。回収した上清（ウイルス溶液）は、−８０℃で保存した。

【0060】

ウイルスの感染力価（ＭＯＩ）の算出
以下で用いるＭＯＩは、以下の方法で算出した。
細胞を９６穴のプレートに５×１０^３cells/１００μl/ウェルで播種し、３７℃、５％Ｃｏ_２下で５時間維持した。ウイルスは、ＯＰＴＩ-ＭＥＭ Iで１００倍又は１０００倍希釈して、これをＭＯＩ測定用のウイルス原液とした（ここでの希釈倍率の常用対数をＬとする）。ウイルス原液を１０倍ずつ段階希釈し（ここでの希釈倍率の常用対数をｄとする）、希釈系列液を調製した。次に、各ウェルに希釈系列液を０．０５ｍlずつ添加した（添加した希釈系列液の体積をｖとする）。１２０時間後に５０％以上の細胞変性効果が認められたウェル数の合計を８で除算した値Ｓを算出し、ＭＯＩを以下の式で算出した。
ｌｏｇ_１０（ＭＯＩ）＝Ｌ＋ｄ（Ｓ−０．５）＋ｌｏｇ_１０（１／ｖ）

【0061】

ＥＶ４型のクリスタルバイオレット法を用いたスクリーニング
クリスタルバイオレット法により、ＥＶ４型による殺癌細胞効果としての細胞傷害性を評価した。試験対象の各細胞を７２時間後にコンフルエントになる密度（３×１０^４ｃｅｌｌｓ/ウェル）で２４穴のプレートに播種した。適切な感染力価（ＭＯＩ＝０．００１、０．０１、０．１）になるように、ＯＰＴＩ-ＭＥＭ IでＥＶ４型を希釈し、ＥＶ４型の希釈液を調製した。約６時間後、プレートから培地を除去し、ＥＶ４型の希釈液を各ウェルに２００μl添加し、３７℃、５％ＣＯ₂下にプレートを１時間維持した。次に、ＥＶ４型の希釈液を除去し、各細胞用培地を各ウェルに１ｍｌ加え、７２時間培養した。７２時間後、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で緩やかに洗浄し、０．５％グルタルアルデヒド含有ＰＢＳを各ウェルに３００μl添加した後、１５分間室温に静置することで生存接着細胞を固定した。その後、グルタルアルデヒド含有ＰＢＳを除去し、ＰＢＳで洗浄後、２％エタノール及び０．１％クリスタルバイオレットを含有する滅菌水を、各ウェルに３００μl添加し、室温で１０分間静置することで生細胞を染色した。

【0062】

染色後のプレートの各ウェルを滅菌水５００μlで２回洗浄し、スキャナを用いて染色の程度を数値化した。数値化においては、青紫色に染色された細胞を生細胞として処理した。細胞の生存率（％）は、Ｉｍａｇｅ Ｇａｕｇｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒ. ４．１を用いて定量した生細胞の面積から算出した。細胞傷害性は、死滅した細胞、すなわち１００％から生存率を減じた値で評価した。

【0063】

ここでの試験対象の細胞は、小細胞肺癌（ＳＢＣ−５、ＳＢＣ−３）、非小細胞肺癌（Ｈ１２９９、Ｈ４６０、ＬＫ８７、Ａ５４９）、肺扁平上皮癌（ＱＧ９５）、大腸癌（ＤＬＤ−１、ＳＷ６２０、ＨＴ２９、Ｌｏｖｏ、Ｃａｃｏ−２）、膵癌（ＢｘＰＣ３、Ｐａｎｃ−１、ＭｉａＰａＣａ−２、Ａｓｐｃ−１）、悪性中皮腫（ＭＳＴＯ、Ｈ２０５２、Ｈ２４５２）、食道癌扁平上皮癌（Ｔ．Ｔｎ、ＴＥ６、ＴＥ８）、舌扁平上皮癌（ＨＳＣ３、ＨＳＣ４）、下咽頭癌（ＦａＤｕ）及びヒト正常皮膚角質細胞（ＨａＣａＴ）である。

【0064】

フローサイトメトリー法によるウイルス受容体の発現量の定量
上記試験対象の細胞表面におけるＣＤ４９ｂ、ＣＤ５５の発現量を定量するため、蛍光標識した抗体と反応させた各細胞を、フローサイトメトリー法で解析した。培養された細胞を回収し、２×１０⁶ｃｅｌｌｓ/ｍｌになるようにＰＢＳに懸濁した。９６穴のプレートの各ウェルに、得られた細胞懸濁液を１００μlずつ分注した（２×１０⁵ｃｅｌｌｓ/ウェル）。４℃、２０００ｒｐｍで５分間遠心後、ペレットにフルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗ヒトＣＤ４９ｂ抗体、又はフィコエリシン（ＰＥ）標識抗ＤＡＦ（ＣＤ５５）抗体を含む１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳを１００μlずつ添加した。暗所条件下、プレートを氷中に１時間静置し、抗体を反応させた。コントロールの細胞は、アイソタイプＩｇＧ抗体で標識した。

【0065】

抗体標識後、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで２回洗浄し、洗浄した細胞をＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（登録商標）を使用して、ＣＤ４９ｂとＣＤ５５の発現量を、コントロールの細胞における発現量に対する割合（％）として数値化した。データ解析には、ＦｌｏｗＪｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒ ７．６を用いた。

【0066】

（結果）
表１は、ＥＶ４型の癌細胞に対する細胞傷害性、ＣＤ４９ｂ及びＣＤ５５の発現量を示す。癌細胞に対する細胞傷害性は、クリスタルバイオレット法で評価した細胞傷害性が６６％以上の場合を「３＋」、３３％以上６６％未満の場合を「２＋」、０％より高く３３％未満の場合を「＋」、０％の場合を「−」で示した。この結果、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、大腸癌、膵癌のいくつかの細胞株で高い細胞傷害性を認めた。また、食道癌扁平上皮癌における全ての細胞株で、極めて低いＭＯＩ＝０．００１でも高い細胞傷害性を認めた。食道癌扁平上皮癌における全ての細胞株は、いずれもＣＤ４９ｂ及びＣＤ５５の９０％以上の高い発現を認めた。このことから、ＥＶ４型は、ＣＤ４９ｂ及びＣＤ５５をウイルス受容体として癌細胞に感染することが示唆された。
ヒト正常皮膚角質細胞（ＨａＣａＴ）に対しては、いずれのＭＯＩにおいても細胞傷害性が０％であった。

【0067】

【表1】

【0068】

図１は、食道癌扁平上皮癌の細胞株（Ｔ．Ｔｎ、ＴＥ８、ＴＥ６）のクリスタルバイオレット染色後の顕微鏡像を示す。未分化型の細胞株であるＴ．Ｔｎ、中分化型扁平上皮癌の細胞株であるＴＥ８、高分化扁平上皮癌の細胞株であるＴＥ６それぞれに対して、ＥＶ４型は、ＭＯＩ依存的に細胞傷害性を示した。ＥＶ４型の細胞傷害性が予後不良（難治性）とされるＴ．Ｔｎに対しても示されたことから、ＥＶ４型を含む医薬組成物は、難治性の食道癌の治療に有効であることが示唆された。また、ＥＶ４型は、ヒトの正常細胞に対しては細胞傷害性を示さず、癌細胞特異的に細胞傷害性を示した。

【0069】

（実施例２）
ＥＶ４型の細胞傷害性に対する各種阻害剤の影響（１）
ＥＶ４型の細胞傷害性に対する影響を検討した阻害剤は、汎カスパーゼ阻害剤としてのＺ−ＶＡＤｆｍｋ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、ＰＩ３Ｋ阻害剤としてのＬＹ２９４００２（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、ＭＥＫ阻害剤としてのＰＤ０３２５９０１（Ｗａｋｏ社）、ＰＴＥＮ阻害剤としてのｂｐＶ（Ｍｅｒｃｋ社）である。

【0070】

Ｔ.Ｔｎを1×１０^４ｃｅｌｌｓ/ウェルで９６穴のプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ₂下にプレートを約７時間静置した。ウェル内の培地を、１００μｌ/ウェルとなるように各阻害剤を添加した培地に置換した。各阻害剤の濃度は、Ｚ−ＶＡＤｆｍｋが１００μＭ、ＬＹ２９４００２が２５μＭ、ＰＤ０３２５９０１が０．１μＭ、ｂｐＶが１.０μＭとした。培地を置換後、１時間３７℃、５％ＣＯ_２下に静置した。培地を除去後、ＥＶ４型をＭＯＩ＝０．１になるようＯＰＴＩ-ＭＥＭ Iで希釈したＥＶ４型の希釈液１００μlを各ウェルに添加し、１時間３７℃、５％ＣＯ_２下に静置した。次に、ＥＶ４型の希釈液を除去し、各阻害剤入りのＲＰＭＩ培地をそれぞれ各ウェルに添加し、共培養した。共培養開始から４日後、光学顕微鏡にて各ウェルを撮影した。なお、各阻害剤の濃度は、Ｔ.Ｔｎに対する細胞傷害性を示さないと考えられる濃度とした。

【0071】

（結果）
図２は、Ｔ．Ｔｎに対するＥＶ４型（ＤＭＳＯ、ＭＯＩ＝０．１）のみ、ＥＶ４型とアポトーシス阻害剤としての汎カスパーゼ阻害剤（Ｚ−ＶＡＤｆｍｋ）の併用、ＥＶ４型とＰＩ３Ｋ阻害剤（ＬＹ２９４００２）の併用、ＥＶ４型とＭＥＫ阻害剤（ＰＤ０３２５９０１）の併用、ＥＶ４型とＰＩ３Ｋを阻害することが知られるＰＴＥＮ阻害剤（ｂｐＶ）の併用において、感染４日後の細胞傷害性に対する影響を顕微鏡像により示した図である。ＥＶ４型による細胞傷害性は、アポトーシス阻害剤及びＰＩ３Ｋを阻害することが知られるＰＴＥＮ阻害剤により減弱された。また、ＥＶ４型による細胞傷害性は、ＰＩ３Ｋ阻害剤及びＭＥＫ阻害剤により増強された。
したがって、カスパーゼ依存性アポトーシス及びＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ、ＭＥＫ／ＥＲＫ細胞増殖シグナル伝達系はＥＶ４型による細胞傷害性（ＥＶ４の食道癌細胞内増殖機構）に関与することが示唆された。これにより、ＥＶ４型を含む医薬組成物は、近年固形癌治療の臨床試験で使用されている新規分子標的薬ＰＩ３Ｋ（Ａｋｔ）あるいはＭＥＫ阻害剤（ＭＡＰキナーゼキナーゼ阻害剤）との併用によって、その抗腫瘍効果が増強されることが強く示唆された。

【0072】

（実施例３）
ＥＶ４型の細胞傷害性に対する各種阻害剤の影響（２）
ＥＶ４型の細胞傷害性に対するＭＥＫ阻害剤ＰＤ０３２５９０１の影響をより定量的に検討した。

【0073】

ＴＥ８を1×１０^４ｃｅｌｌｓ/ウェルで９６穴のプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ₂下にプレートを６時間静置した。ウェル内の培地を、５０ｎＭのＰＤ０３２５９０１のＤＭＳＯ溶液を含む培地に置換した。培地を置換後、１時間３７℃、５％ＣＯ_２下に静置した。培地を除去後、ＥＶ４型をＭＯＩ＝１．０になるようＯＰＴＩ-ＭＥＭ Iで希釈したＥＶ４型の希釈液１００μlを各ウェルに添加し、１時間３７℃、５％ＣＯ_２下に静置した。なお、対照には、ＥＶ４型を含まない希釈液１００μlを加えた。次に、希釈液を除去し、ＰＤ０３２５９０１を含む培地をそれぞれ各ウェルに添加し、共培養した。共培養開始から４８時間後、プロメガ社のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）キットを用いて生細胞を定量した。

【0074】

（結果）
図３は、対照及びＥＶ４型を感染させたＴＥ８の細胞生存率を示す。ＰＤ０３２５９０１を作用させることで、ＥＶ４型によるＴＥ８の殺細胞効果が有意に増強された。
このことからも、ＥＶ４型を含む医薬組成物は、ＭＥＫ阻害剤との併用によって、その抗腫瘍効果が増強されることが強く示唆された。

【0075】

（実施例４）
ＥＶ４型のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効果の評価（１）
実施例１で確認したＥＶ４型の癌細胞に対する細胞傷害性による腫瘍退縮能を、ヒト食道癌扁平上皮癌の細胞株ＴＥ８による担癌ヌードマウスを用いて検討した。ＴＥ８をＰＢＳで洗浄し、１.０×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるようにＯＰＴＩ−ＭＥＭ Iに懸濁した。 ６−８週齢のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの右側腹部にＴＥ８を含む懸濁液を、１００μlずつ２７Ｇ針を用いて皮下注射した。マウスは非投与群と３つのＥＶ４型投与群に無作為に分配した。腫瘍の長径及び短径は、ノギスを用いて測定した。腫瘍長径が４ｍｍ前後になって腫瘍がマウスに定着したのを確認して、５０μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ Iに懸濁したＥＶ４型溶液を腫瘍内に１回投与した。各ＥＶ４型投与群に対して投与したＥＶ４型の感染価は、１.０×１０^５、１.０×１０^６、１.０×１０^７ＴＣＩＤ_５０とした。ＴＣＩＤ_５０は、ヒト横紋筋肉腫の細胞であるＲＤ細胞を用いて、ウイルス感染の５日後に評価した。非投与群に対しては、右側腹部にＥＶ４型を含まないＯＰＴＩ−ＭＥＭ Iを、ＥＶ４型投与群と同量投与した。ＥＶ４型投与４日後、各ＥＶ４型投与群の腫瘍体積及び体重を測定した。なお、腫瘍体積は、長径×短径×短径×０．５で算出した。

【0076】

（結果）
図４は、非投与群の腫瘍体積に対する各ＥＶ４型投与群の腫瘍体積の相対値を示す。ＥＶ４型を投与したマウスでは、非投与群と比較して、ＥＶ４型の用量依存的に腫瘍体積の増加が有意に抑制された。また、図５は、非投与群及び各ＥＶ４型投与群の体重を示す。この結果、ＥＶ４型投与群において有意な体重減少を認めなかった。この時点での体重減少は、有害事象を示唆するため、体重減少を認めないことは、ＥＶ４型投与による明らかな有害事象を認めなかったといえる。この点は、致死性の重篤な有害事象が認められたエンテロウイルスＣＶＡ２１型と異なっており、ＥＶ４型の安全性を裏付けるものである。

【0077】

（実施例５）
ＥＶ４型のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効果の評価（２）
ＥＶ４型の癌細胞に対する細胞傷害性による腫瘍退縮能を、ＴＥ８による担癌ヌードマウスを用いてさらに検討した。ＴＥ８をＰＢＳで洗浄し、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ Iに懸濁した。ヌードマウスの右側腹部に、２.０×１０^６ｃｅｌｌｓ／投与になるようにＴＥ８を、２７Ｇ針を用いて皮下接種した。ノギスで測定した腫瘍長径が４ｍｍ以上になったのを確認して（０日目）、５０μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ Iに懸濁したＥＶ４型溶液を、１×１０^７ＴＣＩＤ_５０／投与となるように１日１回、計１０回腫瘍内に投与した。なお、対照には、同量のＯＰＴＩ−ＭＥＭ Iを投与した。腫瘍退縮能の感染価に対する依存性を検討するため、同様の実験に５×１０^７ＴＣＩＤ_５０／投与群を加えて行った。評価項目は、上記実施例４と同様に腫瘍体積と体重とした。また、有害事象の有無を確認した。

【0078】

（結果）
図６は、腫瘍体積の経時変化を示す。対照と比較して、ＥＶ４型を投与したマウスでは、腫瘍体積の増大の抑制が見られた。ＥＶ４型を投与したマウスの腫瘍体積は、最初のＥＶ４型投与後１８日目において対照の５０％程度にしかならず、有意な腫瘍退縮能を示した。この実験におけるマウスの体重の経時変化を図７に示す。対照と同じように体重が維持され、重篤な有害事象は見られなかった。
２種類の感染価のＥＶ４型を投与したときの腫瘍体積の経時変化を図８に示す。ＥＶ４型投与群は、ＥＶ４型による腫瘍体積の増大の抑制には、感染価依存性が見られた。この実験におけるマウスの体重の経時変化を図９に示す。感染価を高めてＥＶ４型を投与しても、対照と同じように体重が維持され、重篤な有害事象は見られなかった。
以上のことから、ＥＶ４型は、複数回投与しても比較的長期間に渡って安全性が高く、抗腫瘍効果を発揮することが示された。

【0079】

（実施例６）
ＣＤＤＰ抵抗性腫瘍に対するＥＶ４型のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効果の評価
食道癌の化学療法で用いられるＣＤＤＰ（シスプラチンともいう）に抵抗性を示すＴＥ８担癌ヌードマウスに対するＥＶ４型の腫瘍退縮能を検討した。ＴＥ８を実施例５と同様にヌードマウスに接種し（０日目）、腫瘍長径が４ｍｍ以上になったのを確認して、生理食塩水に溶解したＣＤＤＰを１２５μｇ／投与で腹腔内に投与した（２日目）。なお、未治療群には、同量の生理食塩水を投与した。ＴＥ８の接種後８日目から、さらに５０μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ Iに懸濁したＥＶ４型溶液を１×１０^７ＴＣＩＤ_５０／投与又は５×１０^７ＴＣＩＤ_５０／投与で１日１回、計５回腫瘍内に投与した。なお、未治療群及びＣＤＤＰ投与群には、同量のＯＰＴＩ−ＭＥＭ Iを投与した。評価項目は、上記実施例４と同様に腫瘍体積と体重とした。

【0080】

（結果）
図１０は、腫瘍体積の経時変化を示す。ＣＤＤＰ投与群は、８日間、腫瘍体積の増大を抑制したものの、その後腫瘍体積の増大が見られた。このようにＣＤＤＰに抵抗性を示すＴＥ８担癌ヌードマウスに対して、１×１０^７ＴＣＩＤ_５０及び５×１０^７ＴＣＩＤ_５０のＥＶ４型を投与したマウスは、対照及びＣＤＤＰ投与群それぞれと比較して、どちらも有意に腫瘍体積の増加を抑制し、ＣＤＤＰ抵抗性腫瘍に対して抗腫瘍効果を示した。
図１１は、ＴＥ８担癌ヌードマウスの体重の経時変化を示す。ＥＶ４を投与しても体重は維持され、重篤な有害事象は見られなかった。
以上のことから、ＥＶ４型は、抗癌剤抵抗性の腫瘍に対して、高い安全性のもとで、抗腫瘍効果を発揮することが示された。また、ＥＶ４型は、ＣＤＤＰなどの抗癌剤と併用することで抗癌剤抵抗性の腫瘍に対して強力な抗腫瘍効果を発揮することが示された。

【0081】

（実施例７）
ＣＶＡ１１型のクリスタルバイオレット法を用いたスクリーニング（１）
実施例１と同様にＣＶＡ１１型による殺癌細胞効果としての細胞傷害性を評価した。試験対象の細胞は、小細胞肺癌（ＳＢＣ−５、ＳＢＣ−３）、非小細胞肺癌（Ｈ１２９９、Ｈ４６０、ＬＫ８７、Ａ５４９）、肺扁平上皮癌（ＱＧ９５）、大腸癌（ＤＬＤ−１、ＳＷ６２０、Ｌｏｖｏ、Ｃａｃｏ−２）、悪性中皮腫（ＭＳＴＯ、Ｈ２０５２、Ｈ２４５２、Ｈ２８）、食道癌扁平上皮癌（Ｔ．Ｔｎ、ＴＥ６、ＴＥ８）、舌扁平上皮癌（ＨＳＣ３、ＨＳＣ４）、下咽頭癌（ＦａＤｕ）、喉頭癌（Ｈｅｐ２）、ヒトＢリンパ腫（Ｄａｕｄｉ）である。

【0082】

フローサイトメトリー法によるウイルス受容体の定量
上記試験対象とした細胞表面におけるＣＤ５４、ＣＤ５５の発現量を定量するため、蛍光標識した抗体と反応させた各細胞を、上記実施例１と同様にフローサイトメトリー法で解析した。ＣＤ５４の検出には、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）標識抗ヒトＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）抗体を用いた。なお、Ｄａｕｄｉに関しては、ウイルス受容体の定量の対象外とした。

【0083】

（結果）
表２は、ＣＶＡ１１型の細胞傷害性、ＣＤ５４及びＣＤ５５の発現量を示す。非小細胞肺癌の細胞株Ｈ１２９９、Ｈ４６０に対してＭＯＩ＝０．００１以上で強い細胞傷害性を認めた。Ａ５４９に対しては、ＭＯＩ＝０．１で強い細胞傷害性を認めた。一方、大腸癌の全ての細胞株に対してＭＯＩ＝０．１において強い細胞傷害性を認め、ＳＷ６２０に対しては、ＭＯＩ＝０．００１でも強い細胞傷害性を認めた。また、ＬｏＶｏに対しては、ＭＯＩ＝０．０１でも強い細胞傷害性を認めた。食道癌扁平上皮癌の細胞株ＴＥ６、ＴＥ８に対しては、ＭＯＩ＝０．０１で強い細胞傷害性を認めた。その他、小細胞肺癌の細胞株ＳＢＣ−３、悪性中皮腫の細胞株ＭＳＴＯ及びＨ２０５２、下咽頭癌の細胞株ＦａＤｕ、ヒトＢリンパ腫の細胞株Ｄａｕｄｉに対しても細胞傷害性を認めた。
また、ＣＤ５４の発現の低い細胞（ＳＢＣ−５、ＬＫ８７、ＱＧ９５、Ｈ２８、Ｈｅｐ２）では細胞傷害性を認めず、ＩＣＡＭ−１がＣＶＡ１１型のウイルス受容体のひとつであることが示唆された。

【0084】

【表2】

【0085】

図１２は、大腸癌の細胞株（Ｃａｃｏ−２、ＤＬＤ−１及びＳＷ６２０）の染色後の顕微鏡像を示す。これらの細胞株全てにおいて、ＭＯＩ依存的に細胞傷害性を認めた。注目すべきは、ｐ５３やｋ−ＲＡＳの変異があり、標準治療抵抗性株として知られるＳＷ６２０に対して、最も高い細胞傷害性を示したことである。このことから、ＣＶＡ１１型を含む医薬組成物は、治療抵抗性の大腸癌に有効であることが示唆された。

【0086】

図１３は、非小細胞肺癌（Ｈ１２９９、Ｈ４６０、ＬＫ８７、Ａ５４９）及び肺扁平上皮癌（ＱＧ９５）の染色後の顕微鏡像を示す。ＣＶＡ１１型による細胞傷害性を認めたＨ１２９９、Ｈ４６０及びＡ５４９において、ＭＯＩ依存的に細胞傷害性を認めた。

【0087】

図１４は、悪性中皮腫（ＭＳＴＯ、Ｈ２０５２、Ｈ２４５２、Ｈ２８）の染色後の顕微鏡像を示す。ＣＶＡ１１型による細胞傷害性を認めたＭＳＴＯ及びＨ２０５２において、ＭＯＩ依存的に細胞傷害性を認めた。

【0088】

（実施例８）
ＣＶＡ１１型の感染機序の検討
（大腸癌の細胞株に対するＣＶＡ１１型による細胞傷害性への抗ＩＣＡＭ−１中和抗体の影響）
大腸癌細胞株（ＤＬＤ−１及びＳＷ６２０）を３×１０^４ｃｅｌｌｓ/ウェルで４８穴のプレートに播種した。プレートから培地を除去後、各細胞用の培地で希釈した抗ヒトＩＣＡＭ−１抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）溶液１０μｇ/ｍｌを添加した。１時間後、培地を除去後、ＭＯＩ＝０．００１となるようにＯＰＴＩ-ＭＥＭ Iで希釈したＣＶＡ１１型希釈液を、各ウェルに１００μｌ添加し、３７℃、５％Ｃｏ_２下で１時間維持した。感染後、ＣＶＡ１１型希釈液を除去し、各細胞用の培地を対応するウェルに１ｍl添加し、３７℃、５％ＣＯ₂下で１２時間培養した。培養後、光学顕微鏡にて各ウェルを撮影した。なお、ＤＬＤ−１及びＳＷ６２０に対する培地は、それぞれＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳとした。

【0089】

（ＩＣＡＭ−１強制発現実験）
ＩＣＭＡ−１を発現していないＲＤ細胞又はプラスミドを用いた遺伝子導入法によりＩＣＡＭ−１遺伝子を導入した細胞ＲＤ−ＩＣＡＭ−１を、２４穴プレートに３×１０^４ｃｅｌｌｓ/ウェルで播種した。１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で６時間培養後、ＯＰＴＩ-ＭＥＭ Iに希釈したＣＶＡ１１型を各ＭＯＩで１時間、感染培養した。３日後にクリスタルバイオレット法により細胞傷害性を評価した。なお、フローサイトメトリー法を用いて、ＲＤ−ＩＣＡＭ−１におけるＩＣＡＭ−１の発現を確認した。

【0090】

（結果）
図１５は、培養後に撮影した大腸癌の細胞株（ＳＷ６２０及びＤＬＤ-1）の光学顕微鏡画像を示す。ＣＶＡ１１型のみでは、両細胞株ともにＭｏｃｋと比較して、細胞数が減少しており、明らかなＣＰＥ（Ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ Ｅｆｆｅｃｔ）を伴う細胞傷害性を認めた。一方、抗ＩＣＡＭ−１中和抗体の存在下では、ＣＶＡ１１型による細胞傷害性が消失した。
図１６は、ＩＣＡＭ−１強制発現実験におけるＲＤ細胞及びＲＤ−ＩＣＡＭ−１のクリスタルバイオレット染色後の顕微鏡像を示す。ＩＣＡＭ−１を発現していないＲＤ細胞では、細胞傷害性を示さなかったのに対して、ＩＣＡＭ−１を発現させたＲＤ−ＩＣＡＭ−１では、強い細胞傷害性が見られた。
以上により、ＩＣＡＭ−１は、ＣＶＡ１１型の感染に関与するウイルス受容体の１つであることが示された。
従って、ＩＣＡＭ−１が、ＣＶＡ１１型のウイルス受容体であることが証明され、ＩＣＡＭ−１はＣＶＡ１１型による細胞傷害性に重要である。このため、ＣＶＡ１１型は、癌細胞の中でも特にＩＣＡＭ−１を発現する細胞に対して強い細胞傷害性を発揮することが示唆された。

【0091】

（実施例９）
ＣＶＡ１１型のクリスタルバイオレット法を用いたスクリーニング（２）
実施例７と同様にクリスタルバイオレット法を用いて、ＣＶＡ１１型による殺癌細胞効果としての細胞傷害性を評価した。ただし、本実施例では、試験対象の各細胞を、当該細胞の大きさ及び増殖速度を勘案して、２×１０^４〜２×１０^５ｃｅｌｌｓ/ウェルで播種した。約６時間後、プレートから培地を除去し、ＥＶ４型の希釈液を各ウェルに２００μl添加し、３７℃、５％ＣＯ₂下にプレートを１時間維持した。次に、ＥＶ４型の希釈液を除去し、各細胞用培地を各ウェルに１ｍｌ加え、７２時間培養した。ＥＶ４型の希釈液は、ＭＯＩ＝０．００１、０．０１、０．１又は１．０に調製した。
試験対象の細胞は、ＨＳＣ３、ＨＳＣ４及びＤａｕｄｉを除く実施例７で用いた細胞に加えて、非小細胞肺癌（Ｈ１９７５、Ｈ２００９）、悪性中皮腫（ＭＥＳＯ１、ＭＥＳＯ４）、食道癌扁平上皮癌（ＴＥ１、ＴＥ４、ＴＥ５、ＴＥ９、ＫＹＳＥ１７０）、大腸癌（ＷｉＤｒ、ＨＴ２９）、トリプルネガティブ乳癌（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）、乳癌（ＭＣＦ７）、子宮頸癌（ＨｅＬａ）である。なお、Ａ５４９、Ｈ１９７５及びＴＥ４は、それぞれゲフィチニブ一次抵抗性、ゲフィチニブ二次抵抗性及びＣＤＤＰ抵抗性である。

【0092】

また、上記試験対象の細胞の内、ＷｉＤｒ及びＨＴ２９のオキサリプラチン抵抗性を調べるために、所定濃度のオキサリプラチンを含有する培地で、４８時間培養した後のＷｉＤｒ及びＨＴ２９それぞれの細胞生存率をＭＴＳ法で評価した。

【0093】

実施例７及び実施例８に示すように、ＩＣＡＭ−１がＣＶＡ１１型の受容体であるため、各細胞におけるＩＣＭＡ−１（ＣＤ５４）の発現量を実施例７と同様にして定量した。

【0094】

（結果）
表３は、呼吸器癌の細胞に対するＣＶＡ１１型の細胞傷害性及びＣＤ５４の発現量を示す。ＳＢＣ−５、Ｈ２８及びＭＥＳＯ４を除くすべての細胞で、少なくともＭＯＩ＝０．１で細胞傷害性を認めた。ＣＶＡ１１型は、ゲフィチニブ一次抵抗性であるＡ５４９及びゲフィチニブ二次抵抗性であるＨ１９７５に対してもＭＯＩ＝０．１で強い細胞傷害性を示した。また、細胞傷害性とＣＤ５４の発現量には相関性が見られ、ＭＯＩ＝０．１で細胞傷害性を認めなかった細胞のうち、ＳＢＣ−５及びＨ２８におけるＣＤ５４の発現量が低かった。

【表3】

【0095】

図１７にオキサリプラチンで処理したＷｉＤｒ（上段）及びＨＴ２９（下段）の細胞生存率を示す。ＷｉＤｒ及びＨＴ２９は、それぞれ２００μＭ及び１００μＭという高濃度のオキサリプラチンであっても、オキサリプラチンで処理していない対照群と同程度の細胞生存率を維持した。よって、ＷｉＤｒ及びＨＴ２９は、オキサリプラチン抵抗性であることが示された。ＷｉＤｒ及びＨＴ２９にＣＶＡ１１型を感染させると、図１７のクリスタルバイオレット染色後の顕微鏡像に示すように、ＷｉＤｒ及びＨＴ２９のいずれもＭＯＩ＝０．０１以上で細胞傷害性が得られた。

【0096】

表４は、頭頚部癌、消化器癌、乳癌の細胞に対するＣＶＡ１１型の細胞傷害性及びＣＤ５４の発現量を示す。Ｈｅｐ２を除くすべての細胞で、少なくともＭＯＩ＝０．１で強い細胞傷害性が示された。ＣＶＡ１１型は、ＣＤＤＰ抵抗性の細胞であるＴＥ４及びオキサリプラチン抵抗性であるＷｉＤｒ及びＨＴ２９に対して、少なくともＭＯＩ＝０．００１〜０．０１で強い細胞傷害性を示した。また、ＣＶＡ１１型は、乳癌の細胞、特に難治性乳癌であるトリプルネガティブ乳癌の細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１に対して強い細胞傷害性を示した。ここでも細胞傷害性とＣＤ５４の発現量には相関性が見られ、ＭＯＩ＝０．１で細胞傷害性を認めなかったＨｅｐ２におけるＣＤ５４の発現量が低かった。

【表4】

【0097】

表５は、呼吸器癌の細胞に対するＭＯＩ＝１．０までのＣＶＡ１１型の細胞傷害性及びＣＤ５４の発現量を示す。ＭＯＩ＝１．０で評価すると、Ｈ２８を除くすべての細胞で細胞傷害性が示された。
以上の結果より、ＣＶＡ１１型を含む医薬組成物は、非小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、小細胞肺癌、悪性中皮腫、食道癌扁平上皮癌、下咽頭癌、大腸癌、乳癌、子宮頸癌、Ｂリンパ腫等の治療に有効であることが示唆された。しかも、当該医薬組成物は、ゲフィチニブ一次抵抗性又はゲフィチニブ二次抵抗性の非小細胞肺癌、ＣＤＤＰ抵抗性の食道癌扁平上皮癌、オキサリプラチン抵抗性の大腸癌及びトリプルネガティブ乳癌にも抗腫瘍効果を有することが示唆された。

【表5】

【0098】

（実施例１０）
癌幹細胞マーカーの検出
上記試験対象に含まれる大腸癌の細胞（ＤＬＤ−１、ＨＴ２９及びＷｉＤｒ）の表面における癌幹細胞マーカーＣＤ１３３の発現量を定量するため、ＰＥ標識抗ヒトＣＤ４６抗体で標識した各細胞を、上記実施例１と同様にフローサイトメトリー法で解析した。ＣＤ１３３の検出には、ＡＰＣ標識抗ヒトＣＤ１３３抗体を用いた。

【0099】

（結果）
フローサイトメトリー法で解析結果を図１８に示す。ＣＤ１３３を発現する細胞の割合は、ＤＬＤ−１（１．８％）に対して、オキサリプラチン抵抗性のＨＴ２９及びＷｉＤｒでより大きかった（それぞれ３０．９％及び６３．６％）。
このように、大腸癌由来のオキサリプラチン抵抗性細胞株において、ＣＤ１３３の発現量が高いことが示された。また、実施例９に示したように、ＣＶＡ１１型は、オキサリプラチン抵抗性のＨＴ２９及びＷｉＤｒに強い細胞傷害性を示すため、ＣＶＡ１１型は、癌幹細胞に対しても細胞傷害性を有することが示唆された。

【0100】

（実施例１１）
オキサリプラチン抵抗性腫瘍に対するＣＶＡ１１型のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効果の評価
１００μｌのＰＢＳに懸濁したオキサリプラチン抵抗性癌細胞ＷｉＤｒを５×１０^６をヌードマウスの右側腹部に接種した。播種から１日目より腫瘍長径が４ｍｍ以上になったのを確認して、５０μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ Iに懸濁したＣＶＡ１１型溶液を、２日おきに合計４回腫瘍内に投与した。１回の投与におけるＣＶＡ１１型の感染価は、３×１０^６ＴＣＩＤ_５０とした。ＴＣＩＤ_５０は、ヒト子宮頚癌の細胞であるＨｅＬａを用いて、ウイルス感染の５日後に評価した。腫瘍体積を上記実施例４と同様にして評価した。対照には、５０μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ Iを腫瘍内に投与した。

【0101】

（結果）
図１９は、腫瘍体積の経時変化を示す。ＣＶＡ１１型を投与したマウスは、対照と比較して腫瘍体積の増加を抑制し、有害事象も見られなかった。
このように、ＣＶＡ１１型は、生体におけるＷｉＤｒに対して抗腫瘍効果を示したため、ＣＶＡ１１型を含む医薬組成物は、オキサリプラチン抵抗性腫瘍に対する抗腫瘍効果を有することが示唆された。

【0102】

以上の各実施例により、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、大腸癌、膵癌及び食道癌扁平上皮癌の細胞株に対するＥＶ４型による殺癌細胞効果を確認した。ＣＡＶ１１型については、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、大腸癌、悪性中皮腫、食道癌扁平上皮癌、下咽頭癌、ヒトＢリンパ腫、乳癌及び子宮頸癌の細胞株に対する殺癌細胞効果を確認した。ＥＶ４型は、ＣＤＤＰ抵抗性のヒト食道癌モデルマウスにおいて明らかな腫瘍退縮能を示した。一方、ＣＶＡ１１型は、オキサリプラチン抵抗性のヒト大腸癌モデルマウスにおいて明らかな腫瘍退縮能を示した。

【0103】

また、担癌マウスによる実験において重篤な有害事象が観察されず、体重減少の所見がなかったことから、ＥＶ４型及びＣＶＡ１１型の高い安全性が示唆された。上述のように、ＥＶ４型及びＣＶＡ１１型は、エンテロウイルスが検出される傾向にある無菌性髄膜炎でほとんど検出されない。これらのことから、ＥＶ４型及びＣＶＡ１１型は、安全性に問題があるとされるＣＶＡ２１型、ＥＶ６型、ＥＶ１１型等と同じエンテロウイルスでありながら、その強い抗腫瘍効果と高い安全性によって、腫瘍溶解性ウイルス療法のための医薬組成物への利用に好適であると考えられる。

【0104】

本発明は、本発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施の形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。

【0105】

本出願は、２０１２年４月１９日に出願された日本国特許出願２０１２−０９６０８８号に基づく。本明細書中に日本国特許出願２０１２−０９６０８８号の明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものとする。

【産業上の利用可能性】

【0106】

本発明は、医薬組成物に好適である。本発明を適用することにより、臨床現場における癌患者の予後が大きく改善することが期待される。

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図18】

【図19】

【図1】

【図2】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]