特許 6093764 ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ酵素およびその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6093764

(24)【登録日】2017年2月17日

(45)【発行日】2017年3月8日

(54)【発明の名称】ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ酵素およびその使用方法

(51)【国際特許分類】

   C12P 7/24 20060101AFI20170227BHJP

   C12P 7/16 20060101ALI20170227BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20170227BHJP

   C12N 1/19 20060101ALN20170227BHJP

   C12N 9/88 20060101ALN20170227BHJP

【ＦＩ】

   C12P7/24ZNA

   C12P7/16

   !C12N15/00 A

   !C12N1/19

   !C12N9/88

【請求項の数】15

【全頁数】92

(21)【出願番号】特願2014-523101(P2014-523101)

(86)(22)【出願日】2012年7月27日

(65)【公表番号】特表2014-521339(P2014-521339A)

(43)【公表日】2014年8月28日

(86)【国際出願番号】US2012048737

(87)【国際公開番号】WO2013016717

(87)【国際公開日】20130131

【審査請求日】2015年7月15日

(31)【優先権主張番号】61/512,866

(32)【優先日】2011年7月28日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】310011310

【氏名又は名称】ビュータマックス・アドバンスド・バイオフューエルズ・エルエルシー

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100140132

【弁理士】

【氏名又は名称】竹林 則幸

(72)【発明者】

【氏名】ジェシカ・マクエルヴァイン

(72)【発明者】

【氏名】ダニエル・ピー・オキーフ

(72)【発明者】

【氏名】ブライアン・ジェイムズ・ポール

(72)【発明者】

【氏名】マーク・エス・ペイン

(72)【発明者】

【氏名】スティーヴン・キャリー・ロスマン

(72)【発明者】

【氏名】ホンシーアン・ヘ

【審査官】 西 賢二

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２０１０／０１２９８８６（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１０／０３７１１１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２０１１／００７６７３３（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２００９／０３０５３７０（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｐ １／００−４１／００

Ｃ１２Ｎ １／００−７／０８

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

α−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの変換方法であって、
ａ．（ｉ）配列番号５２または６１のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対する少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、および
（ｉｉ）α−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ活性、１よりも大きいα−ケトイソバレレートのピルベートに対する特異性比、および２０μＭ以下のチアミン二リン酸補因子活性化定数（Ｋ_c）、
を含むポリペプチドを提供するステップと、
ｂ．該ポリペプチドをイソブチルアルデヒドが生成される条件下でα−ケトイソバレレートと接触させるステップと
を含む方法。

【請求項2】

接触させるステップが組換え宿主細胞内で行なわれ、ポリペプチドが組換え宿主細胞にとって異種である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

組換え宿主細胞が、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、イサチェンキア（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）属、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、またはサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の一員である、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

組換え宿主細胞がサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、請求項２に記載の方法。

【請求項5】

組換え宿主細胞がさらに、基質から生成物への変換：（ａ）ピルベートからアセトラクテートへの変換、（ｂ）アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの変換、および（ｃ）２，３−ジヒドロキシイソバレレートから２−ケトイソバレレートへの変換を触媒するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

宿主細胞がさらに、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

組換え宿主細胞は、さらに、低下したピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を備えるか、または該活性が排除される、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

組換え宿主細胞がさらに、Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする内在性遺伝子において少なくとも１つの欠失、突然変異、および／または置換を含む、請求項２〜７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

組換え宿主細胞がｆｒａ２の欠失を含む、請求項２〜８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

組換え宿主細胞は、低下したグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を備えるか、または該活性が排除される、請求項２〜９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

ａ．イソブタノール産生経路を備える組換え宿主細胞を提供するステップであって、該産生経路がポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが、
（ｉ）配列番号５２または６１のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対する少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、および
（ｉｉ）α−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ活性、１よりも大きいα−ケトイソバレレートのピルベートに対する特異性比、および２０μＭ以下のチアミン二リン酸補因子活性化定数（Ｋ_c）、
を含むステップと、
ｂ．該組換え宿主細胞をイソブタノールが生成される条件下で炭素基質と接触させるステップと、
を含む、イソブタノールの製造方法。

【請求項12】

さらに、液液抽出を用いてイソブタノールを単離するステップを含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

抽出剤が、Ｃ₁₂〜Ｃ₂₂脂肪アルコール、Ｃ₁₂〜Ｃ₂₂脂肪酸、Ｃ₁₂〜Ｃ₂₂脂肪酸のエステル、Ｃ₁₂〜Ｃ₂₂脂肪アルデヒド、およびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

組換え宿主細胞がサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

接触させるステップが、３０ｇ／Ｌ未満のチアミンの存在下で行なわれる、請求項１１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

政府のライセンス権利
本発明は、米国エネルギー省により裁定された契約ＤＥ−ＡＲ００００００６の下で政府支援により行われた。政府は、本発明において特定の権利を有する。

【0002】

関連出願への相互参照
本出願は、参照によって本明細書中に援用される２０１１年７月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／５１２，８６６号明細書に関連し、それに対する優先権の権利を主張する。

【0003】

本発明は、イソブタノール産生経路における実施に適したα−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドに関する。

【背景技術】

【0004】

ブタノールは、燃料添加剤として、プラスチック工業における原料化学物質として、そして食品および香料産業における食品グレードの抽出剤として有用である、重要な工業用化学物質である。毎年、１００〜１２０億ポンドのブタノールが石油化学的手段によって製造されており、この汎用化学物質の必要性は将来的に高まる可能性が高いであろう。

【0005】

ブタノール異性体のイソブタノールの化学合成のための方法は、例えば、オキソ合成、一酸化炭素の接触水素化（非特許文献１）、およびメタノールとｎ−プロパノールのＧｕｅｒｂｅｔ縮合（非特許文献２）などが知られている。これらの方法は、石油化学物質に由来する出発材料を使用する。植物由来の原材料からのイソブタノールの製造は化石燃料の使用を最小限にし、当該技術分野における進歩を表すであろう。

【0006】

特許文献１には、組換え微生物におけるイソブタノールの産生のための酵素経路が記載されている。そこに記載されるイソブタノールの産生のための１つの代謝経路の最後から２番目のステップは、α−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの変換である。当該技術分野では、イソブタノール生合成経路において使用するのに適した付加的な酵素を同定することが依然として必要とされている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】米国特許第７，８５１，１８８号明細書

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００３，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｖｏｌ．５，ｐｐ．７１６−７１９

【非特許文献2】Ｃａｒｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｃａｔａｌ．Ａ．Ｃｈｅｍ．２２０：２１５−２２０，２００４

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0009】

本明細書には、開示されるポリペプチドを用いてα−ケトイソバレレートをイソブチルアルデヒドへ変換する組換え宿主細胞および方法が提供されている。実施形態において、本方法は、（ａ）（ｉ）配列番号５１、５２、５３、５５、５６、５８、５９、６１もしくは６３またはこれらの活性断片に対する少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の同一性、あるいは（ｉｉ）α−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ活性、約１よりも大きいα−ケトイソバレレートのピルベートに対する特異性比、および約２０μＭ以下のチアミン二リン酸補因子活性化定数（Ｋ_ｃ）のうちの少なくとも１つを含むポリペプチドを提供するステップと、（ｂ）イソブチルアルデヒドが産生される条件下で、前記ポリペプチドをα−ケトイソバレレートと接触させるステップとを含む。実施形態において、ポリペプチドは、配列番号５１、５２、５３、５５、５６、５８、５９、６１または６３のアミノ酸配列を含む。実施形態において、ポリペプチドは、リステリア・グレイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｇｒａｙｉ）またはマクロコッカス・カセオリチクス（Ｍａｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｓｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）からの配列を含む。実施形態において、ポリペプチドは、配列番号５８または６１のアミノ酸配列を含む。実施形態において、接触は、約３０ｍｇ／Ｌ未満、約２０ｍｇ／Ｌ未満、または約１０ｍｇ／Ｌ未満のチアミンの存在下で生じる。実施形態において、接触は組換え宿主細胞内で生じ、ポリペプチドは組換え宿主細胞にとって異種である。実施形態において、組換え宿主細胞は、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、イサタケンキア（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）属、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、またはサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の一員である。実施形態において、組換え宿主細胞はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。実施形態において、組換え宿主細胞はさらに、基質から産物への変換：（ａ）ピルベートからアセトラクテートへの変換、（ｂ）アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの変換、および（ｃ）２，３−ジヒドロキシイソバレレートから２−ケトイソバレレートへの変換を触媒するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。実施形態において、宿主細胞はさらに、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの基質から産物への変換を触媒するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。実施形態において、組換え宿主細胞はさらに、低下または除去されたピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を含む。実施形態において、組換え宿主細胞はさらに、Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする内因性遺伝子において少なくとも１つの欠失、突然変異、および／または置換を含む。実施形態において、組換え宿主細胞はｆｒａ２の欠失を含む。実施形態において、組換え宿主細胞は、低下または除去されたグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を含む。

【0010】

また本明細書には、（ａ）イソブタノール産生経路を含む組換え宿主細胞を提供するステップであって、この産生経路がポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが、（ｉ）配列番号５１、５２、５３、５５、５６、５８、５９、６１もしくは６３またはこれらの活性断片に対する少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の同一性、あるいは（ｉｉ）α−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ活性、１よりも大きいα−ケトイソバレレートのピルベートに対する特異性比、および約２０μＭ以下のチアミン二リン酸補因子活性化定数（Ｋ_ｃ）のうちの少なくとも１つを含むステップと、（ｂ）イソブタノールが産生される条件下で、組換え宿主細胞を炭素基質と接触させるステップとを含む、イソブタノールの製造方法も提供されている。実施形態において、ポリペプチドは、配列番号５１、５２、５３、５５、５６、５８、５９、６１または６３のアミノ酸配列を含む。実施形態において、ポリペプチドは、リステリア・グレイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｇｒａｙｉ）またはマクロコッカス・カセオリチクス（Ｍａｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｓｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）からの配列を含む。実施形態において、ポリペプチドは、ｈｍｍｓｅａｒｃｈプログラムを用いるＫＩＶＤクラスタープロファイルＨＭＭのＥ値が１Ｅ−２２３未満である。実施形態において、本方法はさらにイソブタノールを単離するステップを含み、実施形態では、単離は液液抽出を含む。実施形態において、液液抽出のための抽出剤は、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪アルコール、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪酸、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪酸のエステル、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪アルデヒド、およびこれらの混合物を含む。実施形態において、組換え宿主細胞はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。実施形態において、本明細書において提供されるイソブタノールの製造方法は、（ａ）配列番号５２または６１に対する少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の同一性を有するポリペプチドを含むイソブタノール生合成を含む組換え宿主細胞を提供するステップと、（ｂ）イソブタノールが産生される条件下で、組換え宿主細胞を炭素基質と接触させるステップとを含む。実施形態において、接触は、約３０ｇ／Ｌ未満のチアミンの存在下で生じる。

【0011】

実施形態において、本明細書で提供される方法および組換え宿主細胞は、配列番号配列番号５１、５２、５３、５５、５６、５８、５９、６１、６３、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、もしくは４１６、またはこれらの活性断片に対する少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％の同一性を有するポリペプチドを含む。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】ＫＩＶＤポリペプチド例（左から右に向かって、Ｍｃａ、Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）、ＫｄｃＡ、ｋｉｖＤ８１）の基質α−ケトイソバレレートおよびピルベートの特異性比データを示す。

【図2】実施例において説明されるように、０ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌおよび３０ｍｇ／Ｌのチアミンの存在下、組換え宿主細胞のα−ケトイソバレレートおよびピルベートの収率を実証する。

【図3】実施例において説明されるように、０、１ｍｇ／Ｌ、および３０ｍｇ／Ｌのチアミンの存在下、組換え宿主細胞のα−ケトイソバレレートの濃度を発酵時間に関して示す。

【発明を実施するための形態】

【0013】

本明細書と共に電子出願された配列リストおよび表の組込み
本明細書と共に電子出願され、参照によってその全体が本明細書中に援用される表Ｚは、本明細書において記載されるＫＩＶＤクラスタープロファイルＨＭＭである。表Ｚは本明細書の一部を形成する。

【0014】

参照によって本明細書中に援用される、本明細書と共に出願された配列リスト（２０１２０７２７＿ＣＬ５２５３ＵＳＮＰ＿ＳＥＱ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、サイズ：１，３０４，７７１ バイトバイト、作成日：２０１２年７月２６日）において提供される配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１−１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の開示を含む特許出願の要件−配列規則（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ／ｏｒ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ − ｔｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｕｌｅｓ）」）に従い、世界知的所有権機関（Ｗｏｒｌｄ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（２００９年）ならびにＥＰＯおよびＰＣＴの配列リスト要件（規則５．２および４９．５（α−βｉｓ）ならびに実施細則の第２０８条および付属書Ｃ）と一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用される記号および型式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に明記される規則に従う。

【0015】

定義
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合には、定義を含む本出願が支配するであろう。また、文脈によって他に要求されない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。本明細書において言及される全ての刊行物、特許および他の参考文献は、全ての目的のためにその全体が参照によって援用される。

【0016】

本発明をさらに定義するために、本明細書において以下の用語および定義が提供される。

【0017】

本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」もしくは「含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語、またはこれらの他のあらゆる変化形は、記載される完全体（ｉｎｔｅｇｅｒ）または完全体のグループの包含を意味するが、任意の他の完全体または完全体のグループの排除は意味しないと理解されるであろう。例えば、要素のリストを含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置は、必ずしもこれらの要素だけに限定されるのではなく、明白に記載されていないか、あるいはこのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置に固有の他の要素も含み得る。さらに、反対する明確な記載がない限り、「または（ｏｒ）」は包括的な「または」を指し、排他的な「または」を指さない。例えば、条件ＡまたはＢは以下のいずれか１つによって満たされる：Ａが真であり（または存在し）かつＢが偽である（または存在しない）、Ａが偽であり（または存在せず）かつＢが真である（または存在する）、ならびにＡおよびＢの両方が真である（または存在する）。

【0018】

本明細書で使用される場合、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）」という用語、または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）」もしくは「からなっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」などの変化形は、本明細書および特許請求の範囲を通じて使用される場合、列挙される任意の完全体または完全体のグループの包含を示すが、指定の方法、構造、または組成物に付加的な完全体または完全体のグループを追加することはできない。

【0019】

本明細書で使用される場合、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語、または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」もしくは「から本質的になっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」などの変化形は、本明細書および特許請求の範囲を通じて使用される場合、列挙される任意の完全体または完全体のグループの包含を示し、場合により、指定の方法、構造または組成物の基本的または新規の特性を実質的に変化させることのない、列挙される任意の完全体または完全体のグループの包含も示す。Ｍ．Ｐ．Ｅ．Ｐ．§２１１１．０３を参照されたい。

【0020】

また、本発明の要素または成分に先行する不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、その要素または成分の例の数、すなわち発生の数に関して非限定的であることが意図される。そのため、「ａ」または「ａｎ」は１つまたは少なくとも１つを含むように読み取られるべきであり、要素または成分の単数の語形は、その数が明らかに単数形であることを意味しない限りは複数形も含む。

【0021】

「発明」または「本発明」という用語は、本明細書で使用される場合、非限定的な用語であり、どれか１つの特定の本発明の実施形態を指すことは意図されず、本出願で開示される全ての可能性のある実施形態を包含する。

【0022】

本明細書で使用される場合、使用される本発明の原料または反応物の量を修飾する「約」という用語は、例えば、実際に濃縮物または溶液の製造のために使用される典型的な測定および液体処理手順によって、これらの手順における不注意な誤差によって、組成物の製造または方法の実行のために使用される原料の製造、供給源、または純度の差異によって、そして同様のことによって生じ得る数量の変動を指す。また「約」という用語は、特定の初期混合物から得られる組成物に対する平衡条件が異なるために異なる量も包含する。「約」という用語によって修飾されているかどうかにかかわらず、特許請求の範囲はその量と同等の量を含む。一実施形態では、「約」という用語は、報告される数値の１０％以内、好ましくは、報告される数値の５％以内を意味する。

【0023】

「イソブタノール生合成経路」という用語は、イソブタノールを産生するための酵素経路を指す。時折、「イソブタノール生合成経路」は「イソブタノール産生経路」と同義に使用される。

【0024】

「炭素基質」または「発酵性炭素基質」という用語は、本明細書中で開示される組換え宿主細胞によって代謝されることが可能な炭素源を指す。炭素基質の非限定的な例は本明細書で提供されており、単糖、オリゴ糖、多糖類、エタノール、ラクテート、スクシネート、グリセロール、二酸化炭素、メタノール、グルコース、フルクトース、スクロース、キシロース、アラビノース、デキストロース、一炭素基質またはこれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。

【0025】

本明細書で使用される場合、「有効力価」という用語は、発酵培地１リットルあたり、発酵によって産生されるイソブタノールの総量を指す。イソブタノールの総量には、ｉ）発酵培地中のイソブタノールの量、（ｉｉ）例えば有機抽出剤との接触によって発酵培地から回収されるイソブタノールの量、および（ｉｉｉ）ガスストリッピングが使用される場合には、気相から回収されるイソブタノールの量が含まれる。

【0026】

本明細書で使用される場合、「有効速度」という用語は、１時間の発酵で発酵培地１リットルあたり、発酵によって産生されるイソブタノールの総量を指す。

【0027】

本明細書で使用される場合、「有効収量」という用語は、生体触媒により消費される発酵性炭素基質１単位あたり、産生されるイソブタノールの量を指す。

【0028】

「アセト乳酸シンターゼ」という用語は、ピルベートからアセトラクテートおよびＣＯ_２への変換を触媒する酵素を指す。アセトラクテートは、２つの立体異性体（（Ｒ）および（Ｓ））を有し、酵素は、生物系によって作られる（Ｓ）−異性体を好む。アセト乳酸シンターゼは、ＥＣ番号２．２．１．６に分類され得る（Ｅｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ １９９２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）。

【0029】

「ケトール酸レダクトイソメラーゼ」（略語「ＫＡＲＩ」）、および「アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ」という用語は交換可能に使用され、（Ｓ）−アセトラクテートの２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの反応を触媒することができる酵素を指すであろう。ＫＡＲＩ酵素は、ＥＣ番号ＥＣ１．１．１．８６に分類され得る（Ｅｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ １９９２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）。

【0030】

「アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼ」および「ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ」（ＤＨＡＤ）という用語は、２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換を触媒する酵素を指す。アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼはＥＣ番号４．２．１．９に分類することができ、無数の微生物から入手可能である。

【0031】

「分枝鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼ」または「α−ケト酸デカルボキシラーゼ」または「α−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ」または「２−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ」（本明細書では、ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ、あるいは時折、ＫＩＶＤとも呼ばれる）という用語は、α−ケトイソバレレート（「α−Ｋｉｖ」）からイソブチルアルデヒドおよびＣＯ_２への変換を触媒する酵素を指す。ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ配列は、本明細書中で開示されるものを含むいくつかの微生物源から入手可能である。

【0032】

「分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼ」という用語は、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換を触媒する酵素を指す。分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼはＥＣ番号１．１．１．２６５に分類され得るが、他のアルコールデヒドロゲナーゼにも分類され得る（具体的には、ＥＣ１．１．１．１または１．１．１．２）。

【0033】

「ＫＩＶＤクラスタープロファイルＨＭＭ」という用語は、本明細書中で開示されるように作成されたプロファイル隠れマルコフモデル（Ｐｒｏｆｉｌｅ Ｈｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ Ｍｏｄｅｌ）を指す。ＫＩＶＤクラスタープロファイルＨＭＭは表Ｚとして提供される。

【0034】

「単離核酸分子」、「単離核酸断片」および「遺伝子構築物」という用語は交換可能に使用され、場合により合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基を含有する、一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーを意味するであろう。ＤＮＡポリマーの形態の単離核酸断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つまたは複数のセグメントから構成され得る。

【0035】

「アミノ酸」という用語は、タンパク質またはポリペプチドの基本的な化学構造単位を指す。本明細書では、特定のアミノ酸を同定するために以下の略語が使用される。

【0036】

【表1】

【0037】

「遺伝子」という用語は、特異的タンパク質として発現されることが可能なポリヌクレオチドを指し、場合により、コード配列の前の制御配列（５’非コード配列）およびコード配列の後の制御配列（３’非コード配列）が含まれる。「天然遺伝子」は、その独自の制御配列を有する天然に見出される遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、天然に一緒に見出されない制御およびコード配列を含む、天然遺伝子でない任意の遺伝子を指す。従って、キメラ遺伝子は、異なる源に由来する制御配列およびコード配列、あるいは同じ源に由来するが、天然に見出されるものとは異なった形で配列された制御配列およびコード配列を含むことができる。「内因性遺伝子」は、微生物のゲノム中のその天然の位置にある天然遺伝子を指す。「外来性」遺伝子は、通常は宿主微生物中に見出されないが、遺伝子導入によって宿主微生物中に導入された遺伝子を指す。例えば、外来性遺伝子は、非天然微生物中に挿入された天然遺伝子、またはキメラ遺伝子を含むことができる。外来性遺伝子は、例えば、コード化ポリペプチドのアミノ酸残基を変化させる突然変異を有する天然遺伝子を含むこともできる。「導入遺伝子」は、形質転換手順によってゲノム内に導入された遺伝子である。

【0038】

本明細書で使用される場合、「コード配列」という用語は、特異的なアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「適切な制御配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、内部、または下流（３’非コード配列）に位置し、関連コード配列の転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性、または翻訳に影響を与えるヌクレオチド配列を指す。制御配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステムループ構造を含むことができる。

【0039】

「内因性」という用語は、ポリヌクレオチド、遺伝子、またはポリペプチドに関連して使用される場合、生物のゲノム中のその天然位置にある天然ポリヌクレオチドまたは遺伝子を指すか、あるいは天然ポリペプチドの場合は、ゲノム中のこの位置から転写および翻訳される。

【0040】

「異種」という用語は、ポリヌクレオチド、遺伝子、またはポリペプチドに関連して使用される場合、通常は宿主生物中に見出されないポリヌクレオチド、遺伝子、またはポリペプチドを指す。また「異種」は、対応する天然遺伝子とは異なる形態でソース生物中に再導入された（例えば、生物のゲノム中のその天然位置にない）天然コード領域またはその一部も含む。異種ポリヌクレオチドまたは遺伝子は、例えば、遺伝子導入によって、宿主生物中に導入され得る。異種遺伝子は、天然宿主中に再導入された非天然制御領域を有する天然コード領域を含むことができる。「導入遺伝子」は、形質転換手順によってゲノム中に導入された遺伝子である。

【0041】

「組換え遺伝子発現要素」という用語は、タンパク質のコード配列の前の制御配列（５’非コード配列）およびコード配列の後の（３’終結配列）を含む、１つまたは複数の特異的タンパク質を発現する核酸断片を指す。キメラ遺伝子は、組換え遺伝子発現要素である。オペロンのコード領域は、作動可能に連結されたプロモーターおよび終結領域と共に、組換え遺伝子発現要素を形成することができる。

【0042】

「制御配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、内部、または下流（３’非コード配列）に位置し、関連コード配列の転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性、または翻訳に影響を与えるヌクレオチド配列を指す。制御配列は、プロモーター、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、転写終結シグナル、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステムループ構造を含むことができる。

【0043】

「プロモーター」という用語は、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を調節することができる核酸配列を指す。一般に、コード配列は、プロモーター配列の３’に位置する。プロモーターはその全体が天然遺伝子に由来してもよいし、天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なる要素で構成されてもよいし、さらに、合成核酸セグメントを含んでいてもよい。異なるプロモーターが、異なる組織または細胞型において、あるいは異なる発達段階で、あるいは異なる環境または生理学的条件に応答して、遺伝子の発現を指示し得ることは当業者によって理解される。ほとんどの時点でほとんどの細胞型において遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と称される。一方、「誘導性プロモーター」は、プロモーター特異的シグナルまたは分子によってプロモーターが誘導またはオンにされる場合に遺伝子の発現を引き起こす。さらに、ほとんどの場合、制御配列の正確な境界は完全には画定されていないので、異なる長さのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有し得ることが認識される。例えば、「ＦＢＡ１プロモーター」は、ＦＢＡ１遺伝子のプロモーター領域に由来する断片を指すために使用可能であることが理解されるであろう。

【0044】

本明細書で使用される場合、「ターミネーター」という用語は、コード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を指す。これには、ポリアデニル化認識配列、およびｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現に影響を与えることができる制御シグナルをコードする他の配列が含まれる。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’端部へのポリアデニル酸経路の付加に影響を与えることを特徴とする。３’領域は、関連コード配列の転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性、または翻訳に影響を与えることができる。ほとんどの場合、制御配列の正確な境界は完全には画定されていないので、異なる長さのＤＮＡ断片が同一のターミネーター活性を有し得ることが認識される。例えば、「ＣＹＣ１ターミネーター」は、ＣＹＣ１遺伝子のターミネーター領域に由来する断片を指すために使用可能であることが理解されるであろう。

【0045】

「作動可能に連結された」という用語は、一方の機能が他方によって影響されるような単一の核酸断片における核酸配列の関連を指す。例えば、プロモーターは、コード配列の発現をもたらすことができる（すなわち、コード配列がプロモーターの転写調節下にある）場合、そのコード配列と作動可能に連結される。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向で制御配列に作動可能に連結され得る。

【0046】

「発現」という用語は、本明細書で使用される場合、本発明の核酸断片に由来するセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定的な蓄積を指す。また発現は、ｍＲＮＡからポリペプチドへの翻訳を指すこともある。

【0047】

本明細書で使用される場合、「形質転換」という用語は、遺伝的に安定な遺伝形質をもたらす、宿主微生物のゲノムへの核酸断片の転移を指す。形質転換された核酸断片を含有する宿主微生物は、「遺伝子導入」または「組換え」または「形質転換」微生物と称される。

【0048】

「プラスミド」、「ベクター」および「カセット」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞の中心的な代謝の一部ではない遺伝子を保有することが多く、通常は環状二本鎖ＤＮＡ断片の形態である染色体外要素を指す。このような要素は、任意のソースに由来する一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの自己複製配列、ゲノム組込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列（線状または環状）であってもよく、ここで、多数のヌクレオチド配列は、選択された遺伝子産物のためのプロモーター断片およびＤＮＡ配列を適切な３’非翻訳配列と共に細胞内に導入することができる独特の構成に結合または組換えられている。「形質転換カセット」は、外来性遺伝子を含有し、外来性遺伝子に加えて特定の宿主細胞の形質転換を容易にする要素を有する特異的なベクターを指す。「発現カセット」は、外来性遺伝子を含有し、外来性遺伝子に加えて外来性宿主におけるその遺伝子の発現の強化を可能にする要素を有する特異的なベクターを指す。

【0049】

「相補的」は、互いにハイブリッド形成することができるヌクレオチド塩基間の関係を表すために使用される。例えば、ＤＮＡに関して、アデニンはチミンに対して相補的であり、シトシンはグアニンに対して相補的である。そしてＲＮＡに関して、アデニンはウラシルに対して相補的であり、シトシンはグアニンに対して相補的である。

【0050】

任意のポリペプチド鎖のアミノ酸をコードするコドンを含むヌクレオチド配列における偏差は、遺伝子をコードする配列における変動を可能にする。各コドンは３つのヌクレオチドからなり、ＤＮＡを含むヌクレオチドは４つの特定の塩基に限定されるので、６４個の可能なヌクレオチドの組み合わせが存在し、そのうちの６１個がアミノ酸をコードする（残りの３個のコドンは翻訳を終了させるシグナルをコードする）。どのコドンがどのアミノ酸をコードするかを示す「遺伝コード」は本明細書において表２のように再現される。結果として、多数のアミノ酸が２つ以上のコドンによって指定される。例えば、アミノ酸アラニンおよびプロリンは４つのトリプレットによってコードされ、セリンおよびアルギニンは６つによってコードされるが、トリプトファンおよびメチオニンはただ１つのトリプレットによってコードされる。この縮重によって、ＤＮＡ塩基組成は、ＤＮＡによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を改変することなく広範囲にわたって変化することができる。

【0051】

【表2】

【0052】

多数の生物は、成長しているペプチド鎖における特定のアミノ酸の挿入をコードするために特定のコドンの使用に対するバイアスを示す。生物間のコドン使用における差異であるコドン選択またはコドンバイアスは遺伝コードの縮重によって提供され、多数の生物の間で十分に実証されている。コドンバイアスはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関することが多く、これは次に、特に、翻訳中のコドンの特性および特定の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用能に依存していると考えられる。細胞中で選択されるｔＲＮＡが優勢であることは、一般に、ペプチド合成において最も頻繁に使用されるコドンの反映である。従って、遺伝子は、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適な遺伝子発現のために調整され得る。

【0053】

種々の宿主の形質転換のための核酸分子の遺伝子またはコード領域を指す場合の「コドン最適化」という用語は、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドを変更することなく宿主生物の典型的なコドン使用を反映するための、核酸分子の遺伝子またはコード領域におけるコドンの改変を指す。このような最適化は、その生物の遺伝子中でより頻繁に使用される１つまたは複数のコドンによる、少なくとも１つ、または２つ以上、またはかなりの数のコドンの置換を含む。

【0054】

様々な種類の動物、植物および微生物種に対して多数の遺伝子配列が利用可能であれば、相対的なコドン使用頻度を計算することが可能である。コドン使用表は、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／（２００８年３月２０日訪問）で入手可能な「Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ」において当該技術分野で容易に入手可能であり、これらの表は、多数の方法で適合させることができる。Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００）を参照されたい。ＧｅｎＢａｎｋ Ｒｅｌｅａｓｅ １２８．０［２００２年２月１５日］から計算される酵母のためのコドン使用表は、以下の表３のように再現される。この表はｍＲＮＡ命名法を使用するので、ＤＮＡ中に見出されるチミン（Ｔ）の代わりに、この表では、ＲＮＡ中に見出されるウラシル（Ｕ）が使用される。表１Ｂは、頻度が６４個の全てのコドンに対してではなく各アミノ酸に対して計算されるように適合されている。

【0055】

【表3】

【0056】

【表4】

【0057】

この表または類似の表を用いることによって、当業者は任意の所与のポリペプチド配列に頻度を適用して、ポリペプチドをコードするが所与の種にとって最適なコドンを使用するコドン最適化コード領域の核酸断片を生じることができる。

【0058】

コドンを最適化頻度でランダムに割り当てて所与のポリペプチド配列をコード化することは、各アミノ酸のコドン頻度を計算し、次にコドンをポリペプチド配列にランダムに割り当てることによって手作業で行うことができる。さらに、種々のアルゴリズムおよびコンピュータソフトウェアプログラムは、当業者にとって容易に利用可能である。例えば、ＤＮＡｓｔａｒ，Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から入手可能なＬａｓｅｒｇｅｎｅ Ｐａｃｋａｇｅにおける「ＥｄｉｔＳｅｑ」機能、ＩｎｆｏｒＭａｘ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）から入手可能なＶｅｃｔｏｒＮＴＩ Ｓｕｉｔｅにおける折り返し翻訳（ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）機能、およびＡｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手可能なＧＣＧ−Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅにおける「ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｅ」機能である。所与の頻度に基づいてコドンを割り当てるために基本的なアルゴリズムを構築することも、基本的な数学関数を用いて当業者により容易に達成され得る。コドン最適化コード領域は、「ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｇｅｎｅ ｄｅｓｉｇｎｅｒ」（ｕｓｅｒｐａｇｅｓ．ｕｍｂｃ．ｅｄｕ／〜ｗｕｇ１／ｃｏｄｏｎ／ｓｇｄ／、２０１２年３月１９日訪問）などのソフトウェアパッケージを含む、当業者に知られている種々の方法によって設計することができる。

【0059】

本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は単一の「ポリペプチド」および複数の「ポリペプチド」を包含することが意図され、アミド結合（ペプチド結合としても知られている）によって直線的に連結されたモノマー（アミノ酸）から構成される分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、任意のアミノ酸鎖または２つ以上のアミノ酸の鎖を指し、産物の特定の長さを指さない。従って、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、またはアミノ酸鎖もしくは２つ以上のアミノ酸の鎖を指すために使用される他の任意の用語は、「ポリペプチド」の定義の中に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語のいずれかの代わりに、または交換可能に使用することができる。ポリペプチドは天然の生物学的ソースに由来してもよいし、あるいは組換え技術によって作製されてもよいが、必ずしも指定される核酸配列から翻訳されるわけではない。化学合成を含む任意の方法で生成することができる。

【0060】

「単離」ポリペプチドまたはその断片、変異体、もしくは誘導体とは、その自然環境にないポリペプチドを意図する。特定のレベルの精製は必要とされない。例えば、単離ポリペプチドは、その天然または自然環境から取り出すことができる。宿主細胞中で発現される組換えで産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって分離、分画、または部分的もしくは実質的に精製された天然または組換えポリペプチドなので、本発明の目的では単離されていると考えられる。

【0061】

アミノ酸またはヌクレオチド配列の「実質的な部分」は、当業者による配列の手動評価によって、あるいはＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９３））などのアルゴリズムを用いるコンピュータ自動化配列比較および同定によって、そのポリペプチドまたは遺伝子を推定的に同定するのに十分なポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列を含む部分である。一般に、ポリペプチドまたは核酸配列が既知のタンパク質または遺伝子に相同であると推定的に同定するためには、１０以上の近接アミノ酸または３０以上のヌクレオチドの配列が必要である。さらに、ヌクレオチド配列に関して、配列依存性の遺伝子同定法（例えば、サザンハイブリダイゼーション）および単離法（例えば、細菌コロニーまたはバクテリオファージプラークのインサイツハイブリダイゼーション）において、２０〜３０の近接ヌクレオチドを含む遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブが使用されてもよい。加えて、プライマーを含む特定の核酸断片を得るために、ＰＣＲにおける増幅プライマーとして１２〜１５塩基の短いオリゴヌクレオチドが使用されてもよい。従って、ヌクレオチド配列の「実質的な部分」は、配列を含む核酸断片を特異的に同定および／または単離するために十分な配列を含む。本明細書は、特定のタンパク質をコードする完全なアミノ酸およびヌクレオチド配列を教示する。当業者は、本明細書で報告されるような配列の利益を得て、開示される配列の全てまたは実質的な部分を当業者に既知の目的のためにこれから使用することができる。従って、本発明は、添付の配列表において提供されるような完全な配列と、上記で定義したこれらの配列の実質的な部分とを含む。

【0062】

「同一性パーセント」という用語は、当該技術分野において知られているように、配列を比較することによって決定される、２つ以上のポリペプチド配列の間または２つ以上のポリヌクレオチド配列の間の関係である。当該技術分野において、「同一性」は、場合によっては、このような配列のストリング間の一致によって決定されるポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度も意味する。「同一性」および「類似性」は、１．）Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：ＮＹ（１９８８）、２．）Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ：ＮＹ（１９９３）、３．）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，Ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎｉａ：ＮＪ（１９９４）、４．）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ（１９８７）、および５．）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，Ｅｄｓ．）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ：ＮＹ（１９９１）に記載される方法を含むが、これらに限定されない既知の方法によって容易に計算することができる。

【0063】

同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間に最良の一致を与えるように設計される。同一性および類似性を決定するための方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラムにおいて体系化されている。配列アライメントおよび同一性パーセントの計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラムを用いて実施され得る。配列の多重アライメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖと標識されるアライメント法に相当する「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖアライメント法」（Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３（１９８９）、Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，８：１８９−１９１（１９９２）によって記載される）を含む数種類のアルゴリズムを包含し、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラムにおいて見出される「Ｃｌｕｓｔａｌアライメント法」を用いて実施される。多重アライメントの場合、デフォルト値は、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０およびＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に相当する。Ｃｌｕｓｔａｌ法を用いるタンパク質配列のペアワイズアライメントおよび同一性パーセントの計算のためのデフォルトパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝５である。核酸については、これらのパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝４である。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖプログラムを用いた配列のアライメントの後、同じプログラム内の「配列距離」表を見ることによって「同一性パーセント」を得ることが可能である。さらに、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗアライメント法」も利用可能であり、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗと標識されるアライメント法（Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３（１９８９）、Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．８：１８９−１９１（１９９２）によって記載される）に相当し、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）ｖ６．１プログラムにおいて見出される。多重アライメントのためのデフォルトパラメータ（ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．２、Ｄｅｌａｙ Ｄｉｖｅｒｇｅｎ Ｓｅｑｓ（％）＝３０、ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ Ｗｅｉｇｈｔ＝０．５、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ Ｓｅｒｉｅｓ、ＤＮＡ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｔｒｉｘ＝ＩＵＢ）。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを用いた配列のアライメントの後、同じプログラム内の「配列距離」表を見ることによって「同一性パーセント」を得ることが可能である。

【0064】

他の種からのものなどのポリペプチド（ここで、このようなポリペプチドは、同一または類似の機能または活性を有する）の同定において、あるいは対応するポリヌクレオチドの記述において、多数の配列同一性レベルが有用であることは当業者によって十分に理解されている。同一性パーセントの有用な例としては、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％などの５５％〜１００％の任意の整数の百分率が本発明の記述において有用であり得る。適切なポリヌクレオチド断片は上記の相同性を有するだけでなく、通常、少なくとも５０個のヌクレオチド、少なくとも１００個のヌクレオチド、少なくとも１５０個のヌクレオチド、少なくとも２００個のヌクレオチド、または少なくとも２５０個のヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを含む。さらに、上記の相同性を有する適切なポリヌクレオチド断片は、少なくとも５０個のアミノ酸、少なくとも１００個のアミノ酸、少なくとも１５０個のアミノ酸、少なくとも２００個のアミノ酸、または少なくとも２５０個のアミノ酸を有するポリペプチドをコードする。

【0065】

「配列分析ソフトウェア」という用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析に有用な任意のコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は市販のものでもよいし、あるいは独立して開発されてもよい。典型的な配列分析ソフトウェアには、１．）ＧＣＧプログラム一式（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、２．）ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０））、３．）ＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、４．）ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）、および５．）Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを組み込んだＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４），Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｄａｔｅ １９９２，１１１−２０．Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ．Ｐｌｅｎｕｍ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）が含まれ得るが、これらに限定されない。本出願との関連において、分析のために配列分析ソフトウェアが使用される場合、他に指定されない限り、分析結果が、参照されるプログラムの「デフォルト値」に基づくことは理解されるであろう。本明細書で使用される場合、「デフォルト値」は、最初の初期化の際にソフトウェアと共に最初にロードされた値またはパラメータの任意のセットを意味するであろう。

【0066】

本明細書で使用される標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該技術分野においてよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）（以下、「Ｍａｎｉａｔｉｓ」と称する）によって、そしてＳｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄ Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）によって、そしてＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎ
ｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅによる出版）（１９８７）によって記載されている。本明細書で使用される付加的な方法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ １９４，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｐａｒｔ Ａ，２００４，Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ Ｇｕｔｈｒｉｅ
ａｎｄ Ｇｅｒａｌｄ Ｒ．Ｆｉｎｋ（Ｅｄｓ．），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）中にある。その他の分子手段および技術は当該技術分野において既知であり、重複伸長ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるスプライシング（Ｙｕ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔ．Ｂｉｏｌ．４１：９７３−９８１）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＵＲＡ３座位における突然変異の正の選択（Ｂｏｅｋｅ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９７，３４５−３４６、Ｍ Ａ Ｒｏｍａｎｏｓ，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９１ Ｊａｎｕａｒｙ １１；１９（１）：１８７）、ｃｒｅ−ｌｏｘ部位特異的組換え系ならびに突然変異体ｌｏｘ部位およびＦＬＰ基質突然変異（Ｓａｕｅｒ，Ｂ．（１９８７）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ７：２０８７−２０９６、Ｓｅｎｅｃｏｆｆ，ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ２０１，Ｉｓｓｕｅ ２，Ｐａｇｅｓ ４０５−４２１、Ａｌｂｅｒｔ，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ．Ｖｏｌｕｍｅ ７，Ｉｓｓｕｅ ４，ｐａｇｅｓ ６４９−６５９）、「シームレス」遺伝子欠失（Ａｋａｄａ，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｙｅａｓｔ；２３（５）：３９９−４０５）、およびギャップ修復法（Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ５８：２０１−２１６；１９８１）が含まれる。

【0067】

本明細書中で開示されるように、本出願人らは、α−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの基質から産物への変換を触媒することができるα−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼポリペプチドとしてこれまで注釈がつけられていないポリペプチドを発見した。推定デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドを合成し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現させ、α−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ活性について試験した。実施例において示されるように、イソブタノール生合成経路を含む組換え宿主細胞において特定のポリペプチドを使用した。

【0068】

ＫＩＶＤポリペプチド
ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ（ＫＩＶＤ）のタンパク質ファミリーのメンバーは、Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）ＫｉｖＤ（アルファ−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ）（配列番号６８）、Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）ＫＤＣＡ（分枝鎖ケト酸デカルボキシラーゼ）（配列番号６６）、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）ＩＰＤＣ（インドールピルビン酸デカルボキシラーゼ）（配列番号２５７）のアミノ酸配列を用いて、ＮＣＢＩ非冗長性（ｎｒ）タンパク質データベースのＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／、２０１２年７月２７日訪問）ＢＬＡＳＴ検索により、以下の検索パラメータ：Ｅ値＝１０、ワードサイズ＝３、マトリックス＝Ｂｌｏｓｕｍ６２、ならびにギャップオープニング＝１１およびギャップエクステンション＝１、１０^−３のＥ値カットオフで同定した。３回のｂｌａｓｔの結果セットを結合し、同一であるか、またはその長さが７１２を超えるかもしくは５８３未満である配列を除去した。次に、プログラムＣＤ−Ｈｉｔ（ダウンロード２００７年１月、ｗｅｉｚｈｏｎｇ−ｌａｂ．ｕｃｓｄ．ｅｄｕ／ｃｄ−ｈｉｔ／で入手可能、２０１２年７月２５日訪問）を用いて、この結合した配列セットを配列間の最大同一性が６５％であるセット（「ｎｒ６５セット」）に縮小した。１１８４のＫＩＶＤ配列のセットが得られた。

【0069】

全てのデフォルトパラメータを用いるＣｌｕｓｔａｌＷを用いて１１８４の配列をアラインさせた。次に、ＣｌｕｓｔａｌＷを用いる近隣結合プログラムにより多重配列アライメントから系統樹を構築した。プログラムｉＴＯＬ（ｉｔｏｌ．ｅｍｂｌ．ｄｅ／、２０１２年７月２７日訪問）を用いて、系統樹を可視化した。Ｌ．ラクティス（Ｌ．Ｌａｃｔｉｓ）ＫｉｖＤ、Ｅ．クロアカ（Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ）ＩＰＤＣ、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＰＤＣ（ピルビン酸デカルボキシラーゼ）およびザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）ＰＤＣならびにこれらの相同体に及ぶ１８０配列のサブツリーを選択した。次にこのサブツリーを、これらの１８０配列のｎｒ６５セット内の全てのクラスターメンバーを含むように拡張した。最終セットは６０１配列からなり、これを使用して、以下に記載されるような配列類似性ネットワークを構築した。

【0070】

配列類似性ネットワークは、定義されたしきい値よりも良いペアワイズ関係に相当するエッジの集まりで構成された（Ａｔｋｉｎｓｏｎ ＨＪ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２００９，４：ｅ４３４５）。ここでの分析について、ペアワイズ関係は、Ｅ値に関連するＢＬＡＳＴアライメントに相当する。６０１配列のセットを使用し、「ｆｏｒｍａｔｄｂ」（ＮＣＢＩ、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｄｏｃｓ／ｆｏｒｍａｔｄｂ．ｈｔｍｌ、２０１２年７月２６日訪問）を用いて、カスタムＢＬＡＳＴデータベースを作成した。次に、ＢＬＡＳＴを用いてこのデータベースに対してセット内の各配列を検索した。ＢＬＡＳＴのＥ値は対称ではないので、最良のＥ値を維持し、各ペアワイズ比較に関連させた。

【0071】

Ｅ−１３０のＥ値しきい値よりも良い全てのペアワイズアライメントをプログラムＣｙｔｏｓｃａｐｅ（ｗｗｗ．ｃｙｔｏｓｃａｐｅ．ｏｒｇ、２０１２年７月２７日訪問）にロードし、Ｏｒｇａｎｉｃレイアウトアルゴリズムを用いてグラフを作成した。可視化すると、これらの６０１配列は識別可能なクラスターに分かれた。１７０配列を含有する１つのクラスターは、Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）ＫｉｖＤ、Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）ＫＤＣＡ、およびＥ．クロアカ（Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ）ＩＰＤＣを含有することが確認された。Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）ＫｉｖＤおよびＬ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）ＫＤＣＡは既知のα−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼなので、多様性選択のためにこのクラスターからいくつかの候補を選択した。本明細書で示されるように、このクラスターからの特定の配列がα−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ活性を有することを実験的に検証した（実施例３および５を参照）。

【0072】

クラスターは、□−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドを含有することが検証されたので、上記で説明され、表４で提供される１７０配列のセットからＫＩＶＤクラスターのプロファイルＨＭＭを作成した。ＣｌｕｓｔａｌＷにより多重配列アライメントから決定される、□−エトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ活性を有することが実験的に検証された配列に対するクラスター配列の同一性％は、表４に提供される。当業者は、表４に提供されるポリペプチドが本明細書において提供される実施形態の候補ポリペプチドであり、□−ケト酸デカルボキシラーゼ活性のためのポリペプチドを容易に製造および試験できることを認識するであろう。従って、表４に提供されるソース生物は、本明細書において提供される実施形態に適したポリペプチドのためのソース生物であり得る。従って、本明細書には、α−ケトイソバレレートをイソブチルアルデヒドへ変換するための方法が提供されており、本方法は、配列番号５１、５２、５３、５５、５６、５８、５９、６１、６３、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、または４１６を含むポリペプチド（またはこれらもしくはその活性断片に対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％の同一性を有するポリペプチド）を提供するステップと、イソブチルアルデヒドが産生される条件下で、前記ポリペプチドをα−ケトイソバレレートと接触させるステップとを含む。いくつかの実施形態では、前記接触は組換え宿主細胞内で生じる。いくつかの実施形態では、前記宿主細胞は、イソブタノール生合成経路を含む。いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞は、表４のポリペプチド、またはこれらもしくはその活性断片に対する少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。本明細書にはイソブタノールを製造するための方法が提供されており、本方法は、配列番号５１、５２、５３、５５、５６、５８、５９、６１、６３、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、または４１６を含むポリペプチド（またはこれらもしくはその活性断片に対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％の同一性を有するポリペプチド）を含む組換え宿主細胞を提供するステップと、イソブチルアルデヒドが産生される条件下で、前記ポリペプチドをα−ケトイソバレレートと接触させるステップとを含む。

【0073】

【表5】

【0074】

【表6】

【0075】

【表7】

【0076】

【表8】

【0077】

【表9】

【0078】

【表10】

【0079】

【表11】

【0080】

【表12】

【0081】

【表13】

【0082】

【表14】

【0083】

【表15】

【0084】

【表16】

【0085】

【表17】

【0086】

【表18】

【0087】

【表19】

【0088】

【表20】

【0089】

【表21】

【0090】

【表22】

【0091】

【表23】

【0092】

【表24】

【表25】

【0093】

プロファイルＨＭＭの作成
ＨＭＭＥＲ（Ｊａｎｅｌｉａ Ｆａｒｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃａｍｐｕｓ，Ａｓｈｂ
ｕｒｎ，ＶＡ）から利用可能であるユーザーガイドに従い、ＨＭＭＥＲソフトウェアパッケージ（プロファイルＨＭＭの背後にある理論は、Ｒ．Ｄｕｒｂｉｎ，Ｓ．Ｅｄｄｙ，Ａ．Ｋｒｏｇｈ，ａｎｄ Ｇ．Ｍｉｔｃｈｉｓｏｎ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ：ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９８、Ｋｒｏｇｈ ｅｔ ａｌ．，１９９４、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３５：１５０１−１５３１に記載されている）を用いて、上記のそして表Ｚで提供される１７０配列のアミノ酸配列を分析した。ＨＭＭＥＲソフトウェアプログラムの出力は、入力配列を特徴付けるプロファイル隠れマルコフモデル（プロファイルＨＭＭ）である。ユーザーガイドに記載されるように、プロファイルＨＭＭは多重配列アライメントのコンセンサスの統計的記述である。これらは、アミノ酸（またはヌクレオチド）のための位置特異的なスコアと、挿入または欠失をオープンおよび伸長するための位置特異的なスコアとを使用する。他のプロファイルベースの方法と比較して、ＨＭＭは形式的な確率論的基準（ｆｏｒｍａｌ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ ｂａｓｉｓ）を有する。多数のタンパク質ファミリーのためのプロファイルＨＭＭは、ＰＦＡＭデータベース（Ｊａｎｅｌｉａ Ｆａｒｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃａｍｐｕｓ，Ａｓｈｂｕｒｎ，ＶＡ）において公的に入手可能である。

【0094】

プロファイルＨＭＭは、以下のように構築した。

【0095】

ステップ１．配列アライメントの構築
デフォルトパラメータでＣｌｕｓｔａｌ Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．，ａｎｄ Ｇｉｂｓｏｎ Ｔ．Ｊ．（１９９４）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２２：４６７３ ４６８０）を用いて、上記のようなクラスター内の１７０の配列を整列させた。

【0096】

ステップ２．プロファイルＨＭＭの構築
デフォルトパラメータを用いて、整列された配列のセットにおいてｈｍｍｂｕｉｌｄプログラムを実行した。ｈｍｍｂｕｉｌｄは多重配列アライメントファイルを読み込み、新しいプロファイルＨＭＭを構築し、プロファイルＨＭＭをファイルにセーブする。このプログラムを用いて、ステップ１に記載される１７０配列の多重配列アライメントから非較正プロファイルを発生させた。

【0097】

ＨＭＭＥＲソフトウェアユーザーガイドに基づいた以下の情報は、ｈｍｍｂｕｉｌｄプログラムによりプロファイルＨＭＭを作成する方法のいくらかの説明を提供する。プロファイルＨＭＭは一連のノードからなる線形状態機械であり、ノードのそれぞれは、それを構築する多重配列アライメント内の位置（列）にほぼ対応する。ギャップが無視されれば対応は正確であり、すなわちプロファイルＨＭＭは、アライメント内の各列に対するノードを有し、各ノードは１つの状態、一致状態に存在することができる。「一致」という語は、ここではモデルに整列される配列内の全ての位置に対してモデル内の位置が存在することを意味する。ギャップは、挿入（Ｉ）状態および欠失（Ｄ）状態を用いてモデル化される。特定の割合ｘよりも多いギャップ文字を含有する全ての列は、挿入列として割り当てられるであろう。デフォルトにより、ｘは０．５に設定される。各一致状態は、それに関連するＩおよびＤ状態を有する。ＨＭＭＥＲは、アライメント内の同じコンセンサス位置「ノード」において３つの状態（Ｍ／Ｄ／Ｉ）のグループを呼び出すことができる。

【0098】

プロファイルＨＭＭは、それに関連するいくつかのタイプの確率を有する。１つのタイプは、遷移確率（１つの状態から別の状態へ遷移する確率）である。また、アライメント内のその位置に存在する所与の残基の確率に基づいて、各一致状態に関連する出力確率も存在する。例えば、アライメント内の非常によく保存された列の場合、最も一般的なアミノ酸の出力確率は０．８１であり得るが、他の１９のアミノ酸のそれぞれに対しては０．０１であり得る。

【0099】

プロファイルＨＭＭは、ＨＭＭをパラメータ化するために使用される全ての確率を含有するＨＭＭＥＲ２プロファイルセーブファイルに完全に記載される。一致状態または挿入状態の出力確率は、ｎｕｌｌモデルに対する対数オッズ比：Ｌｏｇ_２（ｐ＿ｘ）／（ｎｕｌｌ＿ｘ）として保存される。ここで、ｐ＿ｘは、プロファイルＨＭＭに従う、アライメント内の特定の位置におけるアミノ酸残基の確率であり、ｎｕｌｌ＿ｘはＮｕｌｌモデルに従う確率である。Ｎｕｌｌモデルは、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴリリース２４におけるアミノ酸の分布から誘導される２０のアミノ酸のそれぞれに対する出力確率の予め計算されたセットを有する単純な１つの状態確率モデルである。状態遷移スコアは対数オッズパラメータとしても保存され、Ｌｏｇ_２（ｔ＿ｘ）に比例する。ここで、ｔ＿ｘは１つの状態から別の状態へ遷移する遷移確率である。

【0100】

ステップ３．プロファイルＨＭＭの較正
ｈｍｍｃａｌｉｂｒａｔｅを用いてプロファイルＨＭＭを読み込み、プロファイル（使用される合成配列のデフォルト数は５，０００である）により多数の合成ランダム配列をスコア化し、これらのスコアのヒストグラムに極値分布（ＥＶＤ）を適合させ、この時点でＥＶＤパラメータを含んでいるＨＭＭファイルを再度セーブする。これらのＥＶＤパラメータ（μおよびλ）を使用して、プロファイルがタンパク質配列データベースに対して検索される場合に、ビットスコアのＥ値を計算する。ｈｍｍｃａｌｉｂｒａｔｅは、「ＥＶＤ」とラベル化されたラインにおいてＨＭＭファイルに２つのパラメータを書き込み、これらのパラメータは、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴとほぼ同じ長さおよび残基組成のランダムに発生された配列において計算されたスコアのヒストグラムに最良適合する極値分布（ＥＶＤ）のμ（位置）およびλ□（スケール）パラメータである。この較正は、プロファイルＨＭＭに対して１回行った。

【0101】

ＫＩＶＤ配列のセットのための較正されたプロファイルＨＭＭは表Ｚにおいて提供され、ここでは、ＫＩＶＤクラスタープロファイルＨＭＭと称される。ＨＭＭフラグラインから出発するメインモデルセクションにおいて、モデルは、Ｍのノード（ここで、ＬＥＮＧラインによって与えられるように、Ｍは一致状態の数である）に対して、ノードにつき３本のラインを有する。１番めのラインは、一致出力対数オッズスコア：その状態およびＮｕｌｌモデルから各アミノ酸を出力する対数オッズ比を報告する。最初の数はノード数（１．．Ｍ）である。次のＫ個の数は、アミノ酸につき１つの一致放出スコアである。最高スコアのアミノ酸はノード数の後の括弧内に示される。これらの対数オッズスコアは、ｎｕｌｌモデル確率を用いて元のＨＭＭ確率へ変換することができる。ライン上の最後の数は、この一致状態のアライメント列インデックスを表す。２番目のラインは挿入放出スコアを報告し、３番目のラインは、状態遷移スコアについて報告する：Ｍ→Ｍ、Ｍ→Ｉ、Ｍ→Ｄ；Ｉ→Ｍ、Ｉ→Ｉ；Ｄ→Ｍ、Ｄ→Ｄ；Ｂ→Ｍ；Ｍ→Ｅ。

【0102】

ステップ４．構築されたプロファイルＨＭＭの特異性および感受性の試験
ｈｍｍｆｉｌｅからプロファイルＨＭＭを読み込み、有意に類似の配列一致について配列ファイルを検索するｈｍｍｓｅａｒｃｈを用いてプロファイルＨＭＭを評価した。検索された配列ファイルは６０１の配列を含有していた（上記を参照）。検索の間、データベース（Ｚパラメータ）のサイズを１０億に設定した。このサイズ設定は、現在のデータベースに対して有意なＥ値が、予測可能な将来において有意なままであり得ることを保証する。Ｅ値カットオフを１０に設定した。

【0103】

１７０のＫＩＶＤ相同体のアライメントから発生されたＫＩＶＤクラスタープロファイルＨＭＭ（参照によって本明細書中に援用される表Ｚ）によるｈｍｍｅｒ検索は、６０１の配列全てを１Ｅ−２２３未満のＥ値と一致させた。この結果は、ＫＩＶＤクラスターのメンバーが有意な配列類似性を共有することを示す。Ｅ値のカットオフＥ−２２３によるｈｍｍｅｒ検索を用いて、ＫＩＶＤを他のタンパク質から分離した。従って、ｈｍｍｅｒ検索を用いてＫＩＶＤクラスタープロファイルＨＭＭのＥ値＜１Ｅ−２２３を有するポリペプチドは、α−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの基質から産物への変換を含む方法および組換え宿主細胞などの、本明細書において提供される実施形態のための適切な候補であると考えられる。

【0104】

本開示を備えて、そして当該技術分野において利用可能であると共に本明細書において提供される構造および配列情報の組み合わせを用いて、本明細書で提供される宿主細胞および方法において使用するために、ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ活性と、表４、５および６に例示される配列に対して１００％未満の同一性とを含むポリペプチドが構築され得ることは認識されるであろう。例えば、本出願人らは本明細書において提供されるポリペプチドがケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ活性を有することを実証したので、当業者は、配列情報およびプロファイルＨＭＭによって本明細書において提供される生化学情報、分子情報、および構造情報も、ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼに関して当該技術分野で利用可能な情報も利用することができる。例えば、Ｂｅｒｔｈｏｌｄらは、Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）からのｈｏｌｏ−ＫｄｃＡの構造を提供し（Ａｃｔａ Ｃｒｙｓ．（２００７）Ｄ６３：１２１７−１２２４）、Ｙｅｐら（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３４（２００６）３２５−３３６）は、基質結合ポケットを形成すると思われる残基として残基Ｓｅｒ２８６、Ｐｈｅ３８１、Ｖａｌ４６１、およびＭｅｔ３５８を同定する、Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）からのＫｄｃＡの構造の相同性モデルを開発し、Ｓｍｉｔら（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００５）７１：３０３−３１１）は、ＫｄｃＡのアミノ酸配列を、２つの脱炭酸酵素、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）のインドールピルビン酸デカルボキシラーゼおよび酵母ピルビン酸デカルボキシラーゼ（Ｘ線結晶構造解析によって研究されている）と整列させた。

【0105】

本開示を備えた当業者は、例えば、Ｎ末端またはＣ末端における配列アライメントに基づいて本明細書において提供されるポリペプチドを切断し、α−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ活性を確認することによって、本明細書において提供されるポリペプチドの活性断片も作成することができる。

【0106】

従って、本明細書中で開示されるα−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの基質から産物への変換を触媒することができるポリペプチドには、配列番号５１、５２、５３、５５、５６、５８、５９、６１、もしくは６３またはこれらの活性断片のいずれか１つに対する少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の同一性を含むポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。実施形態において、ポリペプチドは、ｈｍｍｓｅａｒｃｈプログラムを用いるＫＩＶＤクラスタープロファイルＨＭＭのＥ値が１Ｅ−２２３未満である。同様に、本出願人らはここで、配列番号３０、３１、３２、３４、３５、３７、３８、４０、または４２、あるいは例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの特定の宿主細胞における発現のためにコドン最適化されたこれらの配列のいずれか１つに対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の同一性を含むポリヌクレオチドを含むがこれらに限定されない、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。

【0107】

チアミン二リン酸（チアミンピロリン酸または「ＴＰＰ」または「ＴＤＰ」としても知られている）は、ＫＩＶＤによって補因子として使用される補酵素である。チアミンは、発酵培地などの反応媒体中に補充され得るビタミン形態である。細胞内に輸送されると、チアミンはチアミン二リン酸へ変換されるであろう。さらに、本明細書中で開示されるケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ活性を有する特定のポリペプチドは、配列番号６８を有するラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ポリペプチドと比べて増大したＴＰＰに対する親和性を有し、従って、利点を提供し得る。例えば、本明細書において提供されるポリペプチドは、コストおよびプロトコルの複雑さを低下させる可能性のある、少量または低下したチアミンの条件下で、α−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの基質から産物への変換を触媒するために有用であり得る。実施形態において、このようなポリペプチドは、配列番号５１、５２、５３、５５、５６、５８、５９、６１、もしくは６３またはこれらの活性断片のいずれか１つに対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の同一性を含む。いくつかの実施形態では、このようなポリペプチドは、それぞれリステリア・グレイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｇｒａｙｉ）、マクロコッカス・カセオリチクス（Ｍａｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｓｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）、またはラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）からのｋｉｖＤ８１、Ｍｃａ、もしくはｋｄｃＡの配列またはこれらの活性断片を含む。いくつかの実施形態では、このようなポリペプチドは、配列番号５２、６１、もしくは６６またはこれらの活性断片に対して少なくとも約８０％の同一性を含む。いくつかの実施形態では、このようなポリペプチドは、配列番号５２もしくは６１またはこれらの活性断片に対して少なくとも約８０％の同一性を含む。

【0108】

本明細書において提供されるポリペプチドおよびこれらをコードするポリヌクレオチドは、α−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの基質から産物への変換を含むイソブタノール生合成経路を含む組換え宿主細胞などの組換え宿主細胞における発現のためにも有用である。さらに、本出願人らは、本明細書において提供されるポリペプチドが、発酵の間のα−ケトイソバレレートの蓄積によって測定される場合に、少なくとも配列番号６８を有するラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ポリペプチド配列と同程度に、組換え宿主細胞においてα−ケトイソバレレートをイソブチルアルデヒドへ変換できることを示した（実施例１２を参照）。同様に、本明細書において提供されるポリペプチドは、配列番号６８を有するラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ポリペプチド配列を用いる細胞において観察されるイソブタノール収量と比較して、組換え宿主細胞におけるイソブタノール収量の増大を提供することができる（実施例１２を参照）。従って、本明細書には、配列番号５１、５２、５３、５５、５６、５８、５９、６１、もしくは６３またはこれらの活性断片のいずれか１つに対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の同一性を含むポリペプチド、あるいはこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞が提供されている。

【0109】

組換え宿主細胞の構築
本明細書に記載される宿主細胞の遺伝子操作は、標準的な遺伝子技術およびスクリーニングを用いて実施することができ、遺伝子操作に適した任意の宿主細胞において行うことができる（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ．２０１−２０２）。実施形態において、本明細書中で開示される組換え宿主細胞は、遺伝子修飾および組換え遺伝子発現に有用な任意の細菌、酵母または真菌宿主であり得る。他の実施形態では、組換え宿主細胞は、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、イサタケンキア（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）属、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、またはサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の一員であり得る。他の実施形態では、宿主細胞は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロミセス・サーモトレランス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、クルイベロミセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、ピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、またはＬ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）であり得る。さらに他の実施形態では、宿主細胞は酵母宿主細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞はサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の一員である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）またはシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）である。いくつかの実施形態では、宿主細胞はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母は当該技術分野において知られており、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）Ｆｕｎｇａｌ Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｅｎｔｒｅ、ＬｅＳａｆｆｒｅ、Ｇｅｒｔ Ｓｔｒａｎｄ ＡＢ、Ｆｅｒｍ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｍａｒｔｒｅｘ、およびＬａｌｌｅｍを含むがこれらに限定されない様々な供給元から入手可能である。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）としては、ＢＹ４７４１、ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ、Ｅｔｈａｎｏｌ Ｒｅｄ（登録商標）酵母、Ｆｅｒｍ Ｐｒｏ^ＴＭ酵母、Ｂｉｏ−Ｆｅｒｍ（登録商標）ＸＲ酵母、Ｇｅｒｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｐｒｅｓｔｉｇｅ Ｂａｔｃｈ Ｔｕｒｂｏアルコール酵母、Ｇｅｒｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｐｏｔ Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ酵母、Ｇｅｒｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ Ｔｕｒｂｏ酵母、ＦｅｒＭａｘ^ＴＭｇｒｅｅｎ酵母、ＦｅｒＭａｘ^ＴＭＧｏｌｄ酵母、Ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃ（登録商標）酵母、ＢＧ−１、ＰＥ−２、ＣＡＴ−１、ＣＢＳ７９５９、ＣＢＳ７９６０、およびＣＢＳ７９６１が挙げられるが、これらに限定されない。

【0110】

組換え宿主細胞（酵母細胞を含むが、これに限定されない）における遺伝子発現のための方法は当該技術分野において既知である（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ １９４，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｐａｒｔ Ａ，２００４，Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ Ｇｕｔｈｒｉｅ ａｎｄ Ｇｅｒａｌｄ Ｒ．Ｆｉｎｋ（Ｅｄｓ．），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡを参照）。実施形態において、発現されるα−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ酵素のコード領域は、当業者によく知られているように、標的宿主細胞のためにコドン最適化され得る。組換え宿主細胞（酵母細胞を含むが、これに限定されない）における遺伝子の発現は、対象のコード領域に作動可能に連結されたプロモーター、および転写ターミネーターを必要とし得る。酵母における使用に適した以下の構成的プロモーター：ＦＢＡ１、ＴＤＨ３（ＧＰＤ）、ＡＤＨ１、およびＧＰＭ１、ならびに酵母における使用に適した以下の誘導性プロモーター：ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０およびＣＵＰ１を含むがこれらに限定されないいくつかのプロモーターを、遺伝子の発現カセットの構築において使用することができる。その他の酵母プロモーターとしては、ハイブリッドプロモーターＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＦＢＡ１ｐ（配列番号２２８）、ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＥＮＯ２ｐ（配列番号２２９）、ＵＡＳ（ＦＢＡ１）−ＰＤＣ１ｐ（配列番号２３０）、ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＰＤＣ１ｐ（配列番号２３１）、およびＵＡＳ（ＰＧＫ）−ＯＬＥ１ｐ（配列番号２３２）が挙げられる。発現のためのキメラ遺伝子構築物において使用可能な適切な転写ターミネーターには、ＦＢＡ１ｔ、ＴＤＨ３ｔ、ＧＰＭ１ｔ、ＥＲＧ１０ｔ、ＧＡＬ１ｔ、ＣＹＣ１ｔ、およびＡＤＨ１ｔが含まれるがこれらに限定されない。

【0111】

様々な宿主細胞の形質転換に有用なベクターは一般的であり、文献に記載されている。通常、ベクターは、選択可能なマーカー、ならびに所望の宿主における自己複製または染色体組込みを可能にする配列を含有する。さらに、適切なベクターは、コード領域ＤＮＡ断片が間に挿入され得る転写開始調節および転写終結調節領域を有するプロモーター領域を含み、挿入されたコード領域の発現を提供することができる。調節領域は両方とも形質転換宿主細胞に相同の遺伝子に由来することができるが、このような調節領域が、産生宿主として選択される特定の種にとって天然でない遺伝子に由来することもできることは理解されるべきである。

【0112】

実施形態において、適切なプロモーター、転写ターミネーター、およびα−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼコード領域は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−酵母シャトルベクター内にクローン化され、酵母細胞に形質転換され得る。このようなベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および酵母株の両方における菌株の増殖を可能にし、選択可能なマーカー、ならびに所望の宿主における自己複製または染色体組込みを可能にする配列を含有することができる。酵母において通常使用されるプラスミドには、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）複製開始点（例えば、ｐＭＢ１）、酵母２−ミクロン複製開始点、および栄養選択のためのマーカーを含有する、シャトルベクターｐＲＳ４２３、ｐＲＳ４２４、ｐＲＳ４２５、およびｐＲＳ４２６（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）が含まれるが、これらに限定されない。これらの４つのベクターのための選択マーカーは、ＨＩＳ３（ベクターｐＲＳ４２３）、ＴＲＰ１（ベクターｐＲＳ４２４）、ＬＥＵ２（ベクターｐＲＳ４２５）およびＵＲＡ３（ベクターｐＲＳ４２６）である。

【0113】

実施形態において、記載される酵素をコードするキメラ遺伝子を有する発現ベクターの構築は、酵母におけるギャップ修復組換え法によって実施することができる。実施形態において、酵母ベクターＤＮＡは消化され（例えば、その多重クローニング部位において）、その配列内に「ギャップ」を形成する。互いに、そしてベクターＤＮＡの５’および３’終端と順次重なる約２１ｂｐの配列を５’および３’端部の両方に含有する、対象のいくつかの挿入ＤＮＡが生成される。例えば、「遺伝子Ｘ」のための酵母発現ベクターを構築するために、酵母プロモーターおよび酵母ターミネーターが発現カセットのために選択される。プロモーターおよびターミネーターは酵母ゲノムＤＮＡから増幅され、遺伝子Ｘはそのソース生物からＰＣＲ増幅されるか、あるいは遺伝子Ｘ配列を含むクローニングベクターから得られる。直線化ベクターの５’端部とプロモーター配列との間、プロモーターと遺伝子Ｘとの間、遺伝子Ｘとターミネーター配列との間、そしてターミネーターと直線化ベクターの３’端部との間には、少なくとも２１ｂｐのオーバーラップ配列が存在する。次に、「ギャップ」ベクターおよび挿入ＤＮＡは酵母株に同時形質転換され、プラスミド上の栄養選択マーカーの相補性を可能にする適切な化合物の混合物を含有する培地にプレーティングされる。正しい挿入断片の組み合わせの存在は、選択された細胞から調製されるプラスミドＤＮＡを用いて、ＰＣＲマッピングにより確認することができる。次に、酵母（通常、低濃度）から単離されたプラスミドＤＮＡを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株、例えばＴＯＰ１０に形質転換した後、ミニプレップおよび制限酵素マッピングを行い、プラスミド構築物をさらに検証することができる。最後に、構築物を配列分析によって検証することができる。

【0114】

ギャップ修復技術と同様に、酵母ゲノムへの組込みも、酵母における相同組換えシステムを利用する。実施形態において、コード領域と、調節要素（プロモーターおよびターミネーター）および栄養要求性マーカーとを含有するカセットは、このカセットとハイブリッド形成し、挿入が所望されるゲノム領域の領域５’および３’に対して配列相同性を有する４０〜７０の塩基対を含有するプライマーを用いて、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼによりＰＣＲ増幅される。次に、ＰＣＲ産物は酵母に形質転換され、組み込まれた栄養要求性マーカーの選択を可能にする適切な化合物混合物を含有する培地にプレーティングされる。例えば、「遺伝子Ｘ」を染色体位置「Ｙ」に組み込むために、プロモーター−コード領域Ｘ−ターミネーター構築物がプラスミドＤＮＡ構築物からＰＣＲ増幅され、ＳＯＥ ＰＣＲまたは一般的な制限消化およびクローニングのいずれかによって、独立栄養性マーカー（ＵＲＡ３など）に結合される。プロモーター−コード領域Ｘ−ターミネーター−ＵＲＡ３領域を含有する全カセットは、酵母染色体における位置「Ｙ」の領域５’および３’に対する相同性を有する４０〜７０ｂｐを含有するプライマー配列によりＰＣＲ増幅される。ＰＣＲ産物は酵母に形質転換され、ウラシルが欠けた増殖培地上で選択される。形質転換体は、コロニーＰＣＲまたは染色体ＤＮＡの直接配列決定のいずれかによって検証することができる。

【0115】

ＫＩＶＤ活性
本明細書中で開示される組換え宿主細胞におけるα−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ活性の存在は、当該技術分野において既知のルーチン方法を用いて確認することができる。非限定的な実施例において、そして本明細書中の実施例において記載されるように、形質転換体は、α−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ遺伝子に対するプライマーを用いるＰＣＲによってスクリーニングすることができる。別の非限定的な例では、そして本明細書中の実施例において記載されるように、α−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ活性は、本明細書中で開示される内因性α−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ活性が欠けている組換え宿主細胞において、本明細書中で開示されるα−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ酵素を発現させることによってアッセイされ得る。別の非限定的な例では、α−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ活性は、生合成経路内のイソブチルアルデヒドの下流の産物を測定するなどのより間接的な方法によって確認することができる。別の非限定的な例では、α−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ活性は、補因子の消失を測定することによって、あるいは生合成経路内のイソブチルアルデヒドの下流のステップのための補因子の消失を測定することによって、例えば、本明細書および／または当該技術分野において記載される結合アッセイ（例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（２００８）１０５（５２）：２０６５３−２０６５８を参照）によって確認することができる。別の非限定的な例では、α−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ活性は、本明細書に記載されるアルデヒド特異的Ｐｕｒｐａｌｄ（登録商標）比色酵素アッセイにより、α−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの変換率を決定することによって確認することができる。別の非限定的な例では、α−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ活性は、当該技術分野において既知の方法を用いてα−ケトイソバレレートの消失を測定することによって確認することができる（例えば、ｄｅ ｌａ Ｐｌａｚａ，ｅｔ ａｌ．ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔｅｒｓ（２００４）２３８：３６７−３７４を参照）。

【0116】

ＴＰＰに対する酵素親和性の尺度を提供するＴＰＰ補因子活性化定数は、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（１９９９）３３９：２５５−２６０）において記載される。本明細書において提供されるポリペプチドＴＰＰ補因子活性化定数は、観察される比活性をＴＰＰ濃度の関数としてプロットすることによって決定することができる。α−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの変換率は、Ｇｏｃｋｅ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（Ａｄｖ．Ｓｙｎｔｈ．Ｃａｔａｌ．２００７，３４９，１４２５−１４３５）において記載されている種々のＴＰＰ濃度で実行されるウマ肝臓ＡＤＨ（ｈＡＤＨ）結合酵素アッセイにおいて測定され得る。比活性は次にＴＰＰ濃度に対してプロットされる。得られた曲線は次に、Ｋａｌｅｉｄａｇｒａｐｈ（Ｓｙｎｅｒｇｙ）などのソフトウェアを用いて、飽和式ＳＡ＝（ＳＡ_ｍａｘ^＊［ＴＰＰ］）／（Ｋ_ｃ＋［ＴＰＰ］）＋Ｃ（式中、ＳＡは比活性であり、ＳＡ_ｍａｘは最大比活性であり、Ｋ_ｃは補因子活性化定数であり、［ＴＰＰ］はＴＰＰの濃度であり、そしてＣはＴＰＰが添加されない場合の活性である）に当てはめられ、補因子活性化定数（Ｋｃ）を決定することができる。ポリペプチドのＴＰＰ親和性は、Ｃｈａｎｇら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（１９９９）３３９：２５５−２６０）で記載されるように、蛍光消光法によって測定することもできる。

【0117】

実施形態において、本明細書において提供されるポリペプチドは、約５μＭ未満、約１０μＭ未満、約２０μＭ未満、約３０μＭ未満、約４０μＭ未満、約５０μＭ未満、約７０μＭ未満、または約９０μＭ未満のＴＰＰ補因子活性化定数（Ｋ_ｃ）を有する。

【0118】

基質特異性比は、競合する基質の反応を酵素が区別する能力の尺度を提供し、Ｆｅｒｓｈｔ，Ａ．（Ｅｎｚｙｍｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，１９７７，１９８５ Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）によって記載されている。所与のポリペプチドについてのα−ケトイソバレレートのピルベートに対する特異性比は、ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの変換のＶ_ｍａｘおよびＫ_Ｍ値と、ピルベートからアセトアルデヒドへの変換のＶ_ｍａｘおよびＫ_Ｍ値とを測定することによって決定することができる。α−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの変換率、ならびにピルベートからアセトアルデヒドへの変換率は、Ｇｏｃｋｅ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（Ａｄｖ．Ｓｙｎｔｈ．Ｃａｔａｌ．２００７，３４９，１４２５−１４３５）において記載されている種々の基質濃度で実行されるウマ肝臓ＡＤＨ（ｈＡＤＨ）結合酵素アッセイにおいて測定され得る。次に比活性は基質濃度に対してプロットされる。得られた曲線は次に、Ｋａｌｅｉｄａｇｒａｐｈ（Ｓｙｎｅｒｇｙ）などのソフトウェア用いて、Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｏｎに当てはめられ、各基質に対するＶ_ｍａｘおよびＫ_Ｍ値を決定することができる。「特異性比」は、本明細書で使用される場合、α−ケトイソバレレートに対して決定されたＶ_ｍａｘ／Ｋ_Ｍを、ピルベートに対して決定されたＶ_ｍａｘ／Ｋ_Ｍで除した商である。

【0119】

実施形態において、本明細書中で開示されるポリペプチドの特異性比は、約１よりも大きい、約１０よりも大きい、約２０よりも大きい、約５０よりも大きい、約１００よりも大きい、約１５０よりも大きい、約２００よりも大きい、約２５０よりも大きい、あるいは約３００よりも大きい。

【0120】

本明細書には、開示されるポリペプチドを用いる、α−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの変換方法が提供されている。実施形態において、本方法は、（ａ）（ｉ）配列番号５１、５２、５３、５５、５６、５８、５９、６１もしくは６３またはこれらの活性断片に対する少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性、およびα−ケト酸デカルボキシラーゼ活性、あるいは（ｉｉ）α−ケト酸デカルボキシラーゼ活性、約１よりも大きい、約１０よりも大きい、約１００よりも大きい、約１５０よりも大きい、または約２００よりも大きいα−ケトイソバレレートのピルベートに対する特異性比、および約１００μＭ、約５０μＭ、または約２０μＭ以下のチアミン二リン酸補因子活性化定数（Ｋ_ｃ）のうちの少なくとも１つを含むポリペプチドを提供するステップと、（ｂ）イソブチルアルデヒドが産生される条件下で、前記ポリペプチドをα−ケトイソバレレートと接触させるステップとを含む。実施形態において、本方法は、（ａ）配列番号５１、５２、５３、５５、５６、５８、５９、６１もしくは６３またはこれらの活性断片に対する少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性、およびα−ケト酸デカルボキシラーゼ活性を含むポリペプチドを提供するステップと、（ｂ）イソブチルアルデヒドが産生される条件下で、前記ポリペプチドをα−ケトイソバレレートと接触させるステップとを含む。実施形態において、前記ポリペプチドは、配列番号５２もしくは６１またはこれらの活性断片に対する少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を含む。実施形態において、本方法は、（ａ）α−ケト酸デカルボキシラーゼ活性、約１よりも大きい、約１０よりも大きい、約１００よりも大きい、約１５０よりも大きい、約２００よりも大きいα−ケトイソバレレートのピルベートに対する特異性比、および約１００μＭ、約５０μＭ、または約２０μＭ以下のチアミン二リン酸補因子活性化定数（Ｋ_ｃ）を含むポリペプチドを提供するステップと、（ｂ）イソブチルアルデヒドが産生される条件下で、前記ポリペプチドをα−ケトイソバレレートと接触させるステップとを含む。実施形態において、接触は、約１０ｍｇ／Ｌ未満のチアミンの存在下で生じる。実施形態において、接触は、約３０ｍｇ／Ｌ未満のチアミン、約２０ｍｇ／Ｌ未満のチアミン、または約５ｍｇ／Ｌ未満のチアミンの存在下で生じる。実施形態において、接触は、約１〜約１０ｍｇ／Ｌのチアミン、約５〜約２０ｍｇ／Ｌのチアミン、約１０〜約１５ｍｇ／Ｌのチアミン、約５〜約１５ｍｇ／Ｌのチアミン、約５〜約１０ｍｇ／Ｌのチアミン、または約１〜約５ｍｇ／Ｌのチアミンの存在下で生じる。実施形態において、接触は組換え宿主細胞内で生じ、ポリペプチドは、組換え宿主細胞にとって異種である。実施形態において、組換え宿主細胞は、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、イサタケンキア（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）属、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、またはサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の一員である。実施形態において、組換え宿主細胞はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。実施形態において、組換え宿主細胞はさらに、基質から産物への変換：（ａ）ピルベートからアセトラクテートへの変換、（ｂ）アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの変換、および（ｃ）２，３−ジヒドロキシイソバレレートから２−ケトイソバレレートへの変換を触媒するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。実施形態において、宿主細胞はさらに、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの基質から産物への変換を触媒するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。実施形態において、組換え宿主細胞はさらに、低下または除去されたピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を含む。実施形態において、組換え宿主細胞はさらに、Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする内因性遺伝子において少なくとも１つの欠失、突然変異、および／または置換を含む。実施形態において、組換え宿主細胞はｆｒａ２の欠失を含む。実施形態において、組換え宿主細胞は、低下または除去されたグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を含む。

【0121】

イソブタノールの製造
本明細書には、イソブタノールの製造方法が提供されている。実施形態において、本方法は、（ａ）イソブタノール生合成経路およびポリペプチドを含む宿主細胞を提供するステップであって、前記ポリペプチドが、ｉ）配列番号５１、５２、５３、５５、５６、５８、５９、６１、もしくは６３またはこれらの活性断片に対する少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性同一性、およびα−ケト酸デカルボキシラーゼ活性、あるいは（ｉｉ）α−ケト酸デカルボキシラーゼ活性、約１よりも大きい、約１０よりも大きい、約１００よりも大きい、約１５０よりも大きい、または約２００よりも大きいα−ケトイソバレレートのピルベートに対する特異性比、および約１００μＭ、約５０μＭ、または約２０μＭ以下のチアミン二リン酸補因子活性化定数（Ｋ_ｃ）のうちの少なくとも１つを含むステップと、（ｂ）イソブタノールが産生される条件下で、宿主細胞を発酵性炭素基質と接触させるステップとを含む。実施形態において、接触は、約１０ｍｇ／Ｌ未満のチアミンまたは約１ｍｇ／Ｌ未満のチアミンの存在下で生じる。実施形態において、組換え宿主細胞は、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、イサタケンキア（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）属、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、またはサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の一員である。実施形態において、組換え宿主細胞はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。実施形態において、組換え宿主細胞はさらに、基質から産物への変換：（ａ）ピルベートからアセトラクテートへの変換、（ｂ）アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの変換、および（ｃ）２，３−ジヒドロキシイソバレレートから２−ケトイソバレレートへの変換を触媒するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。実施形態において、宿主細胞はさらに、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの基質から産物への変換を触媒するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。実施形態において、組換え宿主細胞はさらに、低下または除去されたピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を含む。実施形態において、組換え宿主細胞はさらに、Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする内因性遺伝子において少なくとも１つの欠失、突然変異、および／または置換を含む。実施形態において、組換え宿主細胞はさらにｆｒａ２の欠失を含む。実施形態において、組換え宿主細胞は、低下または除去されたグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を含む。実施形態において、イソブタノールは、配列番号６８を含むが（ｉ）も（ｉｉ）も含まないポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む類似の宿主細胞によって産生されるよりも高い有効収率で産生される。

【0122】

従って、本明細書では、（ｉ）配列番号５１、５２、５３、５５、５６、５８、５９、６１もしくは６３またはこれらの活性断片に対する少なくとも約８０％の同一性を含む、α−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの基質から産物への変換を触媒する異種ポリペプチド、あるいは（ｉ）の異種ポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞も提供される。実施形態において、前記ポリペプチドは、配列番号５１、５２、５３、５５、５６、５８、５９、６１もしくは６３またはこれらの活性断片に対する少なくとも約９５％の同一性を含む。実施形態において、宿主細胞はさらに、基質から産物への変換：（ａ）ピルベートからアセトラクテートへの変換、（ｂ）アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの変換、（ｃ）２，３−ジヒドロキシイソバレレートから２−ケトイソバレレートへの変換を触媒するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。実施形態において、宿主細胞はさらに、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの基質から産物への変換を触媒するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。実施形態において、基質から産物への変換を触媒するポリペプチドはそれぞれ、宿主細胞にとって天然ではない。実施形態において、組換え宿主細胞は、低下または除去されたピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を含む。実施形態において、組換え宿主細胞は、Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする内因性遺伝子において少なくとも１つの欠失、突然変異、および／または置換を含む。実施形態において、組換え宿主細胞は、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、イサタケンキア（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）属、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、またはサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の一員である。実施形態において、組換え宿主細胞はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。

【0123】

イソブタノール生合成経路
使用され得るイソブタノールの産生のための生合成経路は、米国特許第７，８５１，１８８号明細書、米国特許第７，８８９，９９３号明細書、および米国特許第８，１７８，３２８号明細書（全て、参照によって本明細書中に援用される）に記載されるものを含む。１つのイソブタノール生合成経路は、以下の基質から産物への変換を含む：
− 例えばアセト乳酸シンターゼによって触媒され得るピルベートからアセトラクテートへの変換、
− 例えばアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼによって触媒され得るアセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの変換、
− 例えばアセトヒドロキシ酸デヒドラターゼによって触媒され得る２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換、
− 例えば分枝鎖ケト酸デカルボキシラーゼによって触媒され得るα−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの変換、および
− 例えば分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼによって触媒され得るイソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換。

【0124】

いくつかの実施形態では、イソブタノール生合成経路は、宿主細胞にとって異種である少なくとも１つのポリヌクレオチド、少なくとも２つのポリヌクレオチド、少なくとも３つのポリヌクレオチド、または少なくとも４つのポリヌクレオチドを含む。実施形態において、組換え宿主細胞におけるイソブタノール生合成経路の基質から産物への変換はそれぞれ、異種ポリペプチドによって触媒される。実施形態において、アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの基質から産物への変換を触媒するのポリペプチド、および／またはイソブチルアルデヒドからイソブタノールへの基質から産物への変換を触媒するポリペプチドは、補因子としてＮＡＤＨを用いることができる。

【0125】

本明細書に記載される基質から産物への変換のために使用可能な遺伝子およびポリペプチド、ならびにこのような遺伝子およびポリペプチドの同定方法は、本明細書および／または当該技術分野において記載されており、例えばイソブタノールについては、実施例において、そして米国特許第７，８５１，１８８号明細書、米国特許第７，８８９，９９３号明細書、および米国特許第８，１７８，３２８号明細書において記載されている。ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ）酵素の例は、米国特許第８，１２９，１６２号明細書および米国特許第８，２２２，０１７号明細書、ならびに米国特許出願公開第２００８０２６１２３０Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１００１９７５１９Ａ１号明細書、ならびにＰＣＴ出願公開第ＷＯ／２０１１／０４１４１５号パンフレット（これらは全て、参照によって援用される）に記載されている。これらにおいて開示されるＫＡＲＩの例は、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ビブリオ・コレラエ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰＡＯ１、およびシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＰＦ５変異体からのものである。ＫＡＲＩには、アナエロスティペス・カッカエ（Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ ｃａｃｃａｅ）ＫＡＲＩ変異体「Ｋ９Ｇ９」および「Ｋ９Ｄ３」（それぞれ、配列番号２３５および２３４）が含まれる。米国特許出願公開第２０１０００８１１５４Ａ１号明細書、および米国特許第７，８５１，１８８号明細書には、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）（タンパク質配列番号４１７）からのＤＨＡＤを含むジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＤＨＡＤ）が記載されている。参照によって本明細書中に援用される米国特許第８，１８８，２５０号明細書には、ＳａｄＢ、アクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）からのアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）が記載されている。アルコールデヒドロゲナーゼには、参照によって本明細書中に援用される米国特許出願公開第２０１１０２６９１９９号明細書に記載されるウマ肝臓ＡＤＨ（「ＨＡＤＨ」）およびベイジェリンキア・インディカ（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｋｉａ ｉｎｄｉｃａ）ＡＤＨ（タンパク質配列番号２４７）も含まれる。

【0126】

本明細書において提供されるイソブタノール生合成経路を含む宿主細胞がさらに、１つまたは複数の付加的な修飾を含み得ることは認識されるであろう。米国特許出願公開第２００９０３０５３６３号明細書（参照によって援用される）には、サイトゾル局在化アセト乳酸シンターゼの発現およびピルビン酸デカルボキシラーゼ活性の実質的な除去のために酵母を操作することによる、ピルベートからアセトラクテートへの変換の増大が開示される。米国特許出願公開第２００９０３０５３６３号明細書（参照によって本明細書中に援用される）に記載されるような、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を低減するための修飾、および／またはピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子における破壊、またはピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子発現を調節する制御要素をコードする少なくとも１つの遺伝子における破壊、米国特許出願公開第２０１００１２０１０５号明細書（参照によって本明細書中に援用される）に記載されるような、Ｅｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｏｒｏｆｆ経路による炭素フラックスの増大または当量バランスの低下を提供する宿主細胞への修飾。その他の修飾には、ピルベート利用生合成経路におけるステップを触媒するポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドの組込みが含まれる。その他の修飾には、アセト乳酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおける少なくとも１つの欠失、突然変異、および／または置換が含まれる。実施形態において、アセト乳酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）のＹＭＲ２２６Ｃ（配列番号２３６）またはその相同体である。付加的な修飾には、アルデヒドデヒドロゲナーゼおよび／またはアルデヒドオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおける欠失、突然変異、および／または置換が含まれる。実施形態において、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのＡＬＤ６（配列番号２３３）またはその相同体である。酵母産生宿主細胞がｐｄｃ−である場合にグルコース抑制を低減する効果を有する遺伝子修飾は、参照によって本明細書中に援用される米国特許出願公開第２０１１０１２４０６０号明細書に記載されている。

【0127】

組換え宿主細胞はさらに、（ａ）ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドと、（ｂ）（ｉ）Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする内因性遺伝子における少なくとも１つの欠失、突然変異、および／もしくは置換、ならびに／または（ｉｉ）Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドとを含んでいてもよい。実施形態において、Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドは、ＡＦＴ１（核酸配列番号２３７、アミノ酸配列番号２３８）、ＡＦＴ２（配列番号２３９および２４０）、ＦＲＡ２（配列番号２４１および２４２）、ＧＲＸ３（配列番号２４３および２４４）、またはＣＣＣ１（配列番号２４５および２４６）によってコードされる。実施形態において、Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドは、構成的突然変異体ＡＦＴ１Ｌ９９Ａ、ＡＦＴ１Ｌ１０２Ａ、ＡＦＴ１Ｃ２９１Ｆ、またはＡＦＴ１Ｃ２９３Ｆである。

【0128】

産生のための増殖
本明細書に開示される組換え宿主細胞は、適切な炭素基質を含有する発酵培地中で増殖される。追加的な炭素基質は、グルコースやフルクトースなどの単糖、ラクトース、マルトース、ガラクトース、もしくはスクロースなどのオリゴ糖、デンプンもしくはセルロースなどの多糖類、またはこれらの混合物と、チーズ乳清透過物、コーンスティープリカー、サトウダイコン糖蜜、および大麦モルトなどの再生可能な原料からの未精製混合物とを含むことができるが、これらに限定されない。その他の炭素基質としては、エタノール、ラクテート、スクシネート、またはグリセロールが挙げられる。

【0129】

さらに、炭素基質は、重要な生化学的中間体への代謝的変換が実証されている二酸化炭素、またはメタノールなどの一炭素基質であってもよい。一および二炭素基質に加えて、メチロトローフ生物は、代謝活性のためにメチルアミン、グルコサミンおよび様々なアミノ酸などの多数の他の炭素含有化合物も利用することが知られている。例えば、メチロトローフ酵母はメチルアミンからの炭素を利用して、トレハロースまたはグリセロールを形成することが知られている（Ｂｅｌｌｉｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｇｒｏｗｔｈ Ｃ１ Ｃｏｍｐｄ．，［Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］，７ｔｈ（１９９３），４１５−３２，Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：Ｍｕｒｒｅｌｌ，Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎ；Ｋｅｌｌｙ，Ｄｏｎ Ｐ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ，Ａｎｄｏｖｅｒ，ＵＫ）。同様に、様々なカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）種は、アラニンまたはオレイン酸を代謝するであろう（Ｓｕｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５３：４８５−４８９（１９９０））。従って、本発明において利用される炭素源は様々な種類の炭素含有基質を包含することができ、生物の選択によってのみ制限され得ることが意図される。

【0130】

上記の炭素基質およびその混合物は全て本発明において適切であることが意図されるが、いくつかの実施形態では、炭素基質は、グルコース、フルクトース、およびスクロースであるか、あるいはＣ５糖を使用するように修飾された酵母細胞についてはこれらとキシロースおよび／またはアラビノースなどのＣ５糖との混合物である。スクロースは、サトウキビ、サトウダイコン、キャッサバ、スイートソルガム、およびこれらの混合物などの再生可能な糖源に由来し得る。グルコースおよびデキストロースは、トウモロコシ、小麦、ライ麦、大麦、オート麦、およびこれらの混合物などの穀類を含むデンプンベースの原料の糖化による再生可能な穀類源に由来し得る。さらに、発酵性の糖は、例えば、米国特許出願公開第２００７００３１９１８Ａ１号明細書に記載されるような前処理および糖化プロセスにより再生可能なセルロースまたはリグノセルロース系バイオマスに由来し得る。バイオマスは任意のセルロースまたはリグノセルロース系材料を指し、セルロースと、場合によりさらに、ヘミセルロース、リグニン、デンプン、オリゴ糖および／または単糖とを含む材料が含まれる。またバイオマスは、タンパク質および／または脂質などの付加的な成分も含み得る。バイオマスは単一のソースに由来してもよいし、あるいはバイオマスは２つ以上のソースに由来する混合物を含むこともでき、例えば、バイオマスは、トウモロコシ穂軸およびトウモロコシ茎葉の混合物、または草および葉の混合物を含むことができる。バイオマスには、バイオエネルギー作物、農業残渣、都市固形廃棄物、産業固形廃棄物、製紙業からのスラッジ、庭の廃棄物、木材および林業廃棄物が含まれるが、これらに限定されない。バイオマスの例としては、トウモロコシ穀粒、トウモロコシ穂軸、作物残渣、例えばトウモロコシ皮、トウモロコシ茎葉、草、小麦、小麦わら、菜種、大麦、大麦わら、干し草、稲わら、スイッチグラス、古紙、サトウキビバガス、ソルガム、大豆、穀粒の製粉から得られる成分、木、枝、根、葉、木材チップ、おがくず、灌木および低木、野菜、果実、花（例えばヒマワリおよびベニバナ）、動物性肥料、並びにこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。

【0131】

適切な炭素源に加えて、発酵培地には、適切なミネラル、塩、補因子、緩衝液、および培養物の増殖と、本明細書に記載される酵素経路の促進とに適した当業者に既知の他の成分が含有されなければならない。

【0132】

培養条件
通常、細胞は、適切な培地中、約２０℃〜約４０℃の範囲の温度で増殖される。本発明における適切な増殖培地は、Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス、Ｓａｂｏｕｒａｕｄ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ（ＳＤ）ブロス、Ｙｅａｓｔ Ｍｅｄｉｕｍ（ＹＭ）ブロス、または酵母窒素ベース、硫酸アンモニウム、およびデキストロース（炭素／エネルギー源として）を含むブロス、またはＹＰＤ培地（ほとんどのサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株を増殖させるために最適な割合のペプトン、酵母抽出物、およびデキストロースのブレンド）などの一般的な市販の培地を含む。その他の定義された増殖培地または合成増殖培地も使用することができ、特定の微生物の増殖のための適切な培地は、微生物学または発酵科学の当業者には分かるであろう。異化産物抑制を直接または間接的に調節することが知られている薬剤、例えば環状アデノシン２’：３’−一リン酸塩の使用も発酵培地中に組み込むことができる。

【0133】

発酵のために適切なｐＨ範囲は、約ｐＨ５．０〜約ｐＨ９．０の間である。一実施形態では、約ｐＨ６．０〜約ｐＨ８．０が初期条件として使用される。酵母の発酵のために適切なｐＨ範囲は、通常、約ｐＨ３．０〜約９．０の間である。一実施形態では、約ｐＨ５．０〜約ｐＨ８．０が初期条件として使用される。他の微生物の発酵のために適切なｐＨ範囲は、約ｐＨ３．０〜約ｐＨ７．５の間である。一実施形態では、約ｐＨ４．５〜約ｐＨ６．５が初期条件として使用される。

【0134】

発酵は、好気条件または嫌気条件下で実施することができる。一実施形態では、発酵のために嫌気条件または微好気条件が使用される。

【0135】

工業的バッチおよび連続発酵
イソブタノールまたは他の産物は、バッチ発酵方法を用いて産生することができる。古典的なバッチ発酵は閉鎖系であり、培地の組成は発酵の最初に設定され、発酵は人為的な変更を受けない。標準的なバッチ系の変化形は、流加系である。流加発酵プロセスも本発明において適切であり、発酵が進行するにつれて基質が徐々に添加される点以外は典型的なバッチ系を含む。流加系は、異化産物抑制が細胞の代謝を阻害する傾向にある場合、および培地中の基質の量が制限されることが望ましい場合に有用である。バッチ発酵および流加発酵は一般的であり、当該技術分野においてよく知られており、その例は、Ｔｈｏｍａｓ Ｄ．Ｂｒｏｃｋ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ．，ｏｒ Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ Ｖ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３６：２２７，（１９９２）において見出すことができる。

【0136】

イソブタノールまたは他の産物は、連続発酵法を用いて産生することもできる。連続発酵は開放系であり、定義された発酵培地がバイオリアクターに連続的に添加され、処理のために同時に等量の条件培地が除去される。連続発酵は、一般に、細胞が主に対数増殖期にあるときに、培養物を一定の高い密度に維持する。連続発酵は、細胞増殖または最終産物濃度に影響を与える１つの因子または任意の数の因子の調節を可能にする。連続発酵プロセスのための栄養物および成長因子の調節方法、ならびに産物形成速度を最大にするための技術は工業微生物学の分野でよく知られており、様々な方法が上記のＢｒｏｃｋによって詳述されている。

【0137】

イソブタノールまたは他の産物の産生はバッチ、流加または連続プロセスを用いて実施可能であり、任意の既知の発酵モードが適切であり得ることが意図される。さらに、細胞は全細胞触媒として基質上に固定化可能であり、イソブタノール産生のための発酵条件にさらされることが意図される。

【0138】

発酵培地からのイソブタノールの単離方法
バイオ産生されたイソブタノールは、ＡＢＥ発酵のための当該技術分野において既知の方法を用いて、発酵培地から単離することができる（例えば、Ｄｕｒｒｅ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４９：６３９−６４８（１９９８），Ｇｒｏｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｓｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７：６１−７５（１９９２）、およびその中の参考文献を参照）。例えば、固体は、遠心分離、ろ過、デカンテーションなどによって発酵培地から除去され得る。次に、イソブタノールは、蒸留、共沸蒸留、液液抽出、吸着、ガスストリッピング、膜蒸発、またはパーベーパレイションなどの方法を用いて発酵培地から単離され得る。

【0139】

イソブタノールは水と低沸点の共沸混合物を形成するので、蒸留を用いて、混合物をその共沸組成まで分離することができる。蒸留は、共沸混合物付近の分離を得るために、別の分離方法と組み合わせて使用することができる。ブタノールを単離および精製するために蒸留と組み合わせて使用することができる方法には、デカンテーション、液液抽出、吸着、および膜ベースの技術が含まれるがこれらに限定されない。さらに、ブタノールは、共沸剤を用いた共沸蒸留を用いて単離され得る（例えば、Ｄｏｈｅｒｔｙ ａｎｄ Ｍａｌｏｎｅ，Ｃｏｎｃｅｐｔｕａｌ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｄｉｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００１を参照）。

【0140】

ブタノール−水混合物は不均一な共沸混合物を形成するので、イソブタノールを単離および精製するために、蒸留は、デカンテーションと組み合わせて使用され得る。この方法では、イソブタノール含有発酵ブロスは、共沸組成近くまで蒸留される。次に、共沸混合物は濃縮され、デカンテーションによって発酵培地からイソブタノールが分離される。デカントされた水相は、還流として第１の蒸留塔に戻すことができる。デカントされたイソブタノールが豊富な有機相は、第２の蒸留塔において、蒸留によりさらに精製され得る。

【0141】

またイソブタノールは、蒸留と組み合わせて液液抽出を用いて発酵培地から単離することもできる。この方法では、イソブタノールは、適切な溶媒による液液抽出を用いて発酵ブロスから抽出される。次に、イソブタノール含有有機相は、ブタノールを溶媒から分離するために蒸留される。

【0142】

蒸留を吸着と組み合わせて使用して、発酵培地からイソブタノールを単離することもできる。この方法では、イソブタノールを含有する発酵ブロスは共沸組成近くまで蒸留され、次に、モレキュラーシーブなどの吸着剤の使用により残存する水が除去される（Ａｄｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ Ｂｉｏｍａｓｓ ｔｏ Ｅｔｈａｎｏｌ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ Ｃｏ−Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｄｉｌｕｔｅ Ａｃｉｄ Ｐｒｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｆｏｒ Ｃｏｒｎ Ｓｔｏｖｅｒ，Ｒｅｐｏｒｔ ＮＲＥＬ／ＴＰ−５１０−３２４３８，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｊｕｎｅ ２００２）。

【0143】

さらに、蒸留をパーベーパレイションと組み合わせて使用して、発酵培地からイソブタノールを単離および精製することもできる。この方法では、イソブタノールを含有する発酵ブロスは共沸組成近くまで蒸留され、次に、親水性膜を通るパーベーパレイションによって残存する水が除去される（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｓｃｉ．２４５，１９９−２１０（２００４））。

【0144】

その場生成物除去（ｉｎ ｓｉｔｕ ｐｒｏｄｕｃｔ ｒｅｍｏｖａｌ）（ＩＳＰＲ）（抽出発酵とも呼ばれる）は、ブタノール（または他の発酵アルコール）を、産生されたときに発酵容器から除去するために使用することができ、それにより、微生物はブタノールを高収率で産生することが可能になる。当該技術分野で記載されている発酵アルコールを除去するためのＩＳＰＲの１つの方法は液液抽出である。通常、例えばブタノール発酵に関して、微生物を含む発酵培地は、ブタノール濃度が毒性レベルに達するよりも前の時点で有機抽出剤と接触される。有機抽出剤および発酵培地は二相混合物を形成する。ブタノールは有機抽出剤相に分配され、微生物を含有する水相中の濃度を低下させ、それにより抑制性ブタノールに対する微生物の暴露が制限される。

【0145】

液液抽出は、例えば、米国特許出願公開第２００９／０３０５３７０号明細書（その開示は本明細書にその全体が援用される）に記載される方法に従って実施することができる。米国特許出願公開第２００９／０３０５３７０号明細書には、液液抽出を用いて発酵ブロスからブタノールを製造および回収するための方法が記載されており、この方法は、発酵ブロスを水と非混和性の抽出剤と接触させて、水相および有機相を含む２相混合物を形成するステップを含む。通常、抽出剤は、飽和、一価不飽和、多価不飽和（およびこれらの混合物）Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪アルコール、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪酸、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪酸のエステル、Ｃ_１２〜Ｃ_２２脂肪アルデヒド、およびこれらの混合物からなる群から選択される有機抽出剤であり得る。ＩＳＰＲのための抽出剤は、非アルコール抽出剤であり得る。ＩＳＰＲ抽出剤は、オレイルアルコール、ベヘニルアルコール、セチルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、ステアリルアルコール、１−ウンデカノール、オレイン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、ミリスチン酸メチル、オ
レイン酸メチル、ウンデカナール、ラウリン酸アルデヒド、２０−メチルウンデカナール、およびこれらの混合物などの外因性有機抽出剤であり得る。

【0146】

いくつかの実施形態では、有機酸（例えば、脂肪酸）および有機酸によりアルコールをエステル化することができる触媒と、発酵培地中のアルコールを接触させることによって、エステルを形成することができる。このような実施形態では、有機酸は、アルコールエステルが分配されるＩＳＰＲ抽出剤としての役割を果たすことができる。有機酸は発酵容器に供給されることができ、そして／あるいは発酵容器に送給される発酵性炭素を供給するバイオマスから得ることもできる。原料中に存在する脂質は触媒作用により有機酸に加水分解することができ、同じ触媒（例えば、酵素）がアルコールにより有機酸をエステル化することができる。触媒は発酵よりも前に原料に供給されてもよいし、あるいは原料の供給よりも前または供給と同時に発酵容器に供給されてもよい。触媒が発酵容器に供給される場合、アルコールエステルは、脂質の有機酸への加水分解と、発酵容器内に存在するブタノールによる実質的に同時的な有機酸のエステル化とによって得ることができる。原料に由来しない有機酸および／または天然油を発酵容器に送給することもでき、天然油は有機酸に加水分解される。アルコールによりエステル化されない有機酸はどれもＩＳＰＲ抽出剤の一部としての役割を果たすことができる。アルコールエステルを含有する抽出剤は発酵培地から分離することができ、アルコールは抽出剤から回収することができる。抽出剤は、発酵容器へリサイクルすることができる。従って、ブタノールの製造の場合、例えば、ブタノールからエステルへの変換は発酵培地中の遊離ブタノール濃度を低下させ、ブタノール濃度を増大させる毒性効果から微生物を保護する。加えて、脂質は触媒作用により有機酸に加水分解され、それによりＩＳＰＲ抽出剤中の脂質の蓄積速度を低下させることができるので、分画されていない粒子を、その中の脂質を分離することなく原料として使用することができる。

【0147】

その場生成物除去はバッチモードまたは連続モードで実行することができる。その場生成物除去の連続モードでは、生成物は反応器から連続的に除去される。その場生成物除去のバッチモードでは、大量の有機抽出剤が発酵容器に添加され、プロセスの間、抽出剤は除去されない。その場生成物除去の場合、有機抽出剤は発酵の開始時に発酵培地と接触して、二相発酵培地を形成することができる。あるいは、有機抽出剤は、微生物が所望の量の増殖（培養物の光学濃度の測定により決定することができる）を達成した後に発酵培地と接触することができる。さらに、有機抽出剤は、発酵培地中の生成物アルコールレベルが予め選択されたレベルに達した時点で発酵培地と接触することができる。本発明のいくつかの実施形態に従うブタノールの製造の場合、有機酸抽出剤は、有機酸によりブタノールをエステル化してブタノールエステルを生成し、その結果発酵容器中のブタノールの濃度を低減するように、ブタノール濃度が毒性レベルに達するよりも前の時点で発酵培地と接触することができる。次に、エステル含有有機相は、ブタノールエステルの所望の有効力価が達成された後で、発酵容器から除去する（そして、水相を構成する発酵ブロスから分離する）ことができる。いくつかの実施形態では、エステル含有有機相は、発酵容器内の利用可能な発酵性糖の発酵が実質的に完了した後で水相から分離される。

【0148】

任意の相内のイソブタノール力価は、例えば、参照によって本明細書中に援用される米国特許出願公開第２００９０３０５３７０号明細書に記載されるように、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）またはガスクロマトグラフィなどの当該技術分野で既知の方法によって決定することができる。

【実施例】

【0149】

プラスミド：
ｐＹＺ０９０（配列番号６９）は、ＡＬＳの発現のために、酵母ＣＵＰ１プロモーター（ｎｔ２−４４９）、続いてＣＹＣ１ターミネーター（ｎｔ２１８１−２４３０）から発現されるバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からのａｌｓＳ遺伝子のコード領域（ｎｔ位置４５７−２１７２）を有するキメラ遺伝子と、ＫＡＲＩの発現のために、酵母ＩＬＶ５プロモーター（２４３３−３６２６）、続いてＩＬＶ５ターミネーター（ｎｔ４６８２−５３０４）から発現されるラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）（ｎｔ３６３４−４６５６）からのｉｌｖＣ遺伝子のコード領域を有するキメラ遺伝子とを含有するように構築した。

【0150】

ｐＹＺ０９０をＳｐｅＩおよびＮｏｔＩによって消化し、ＣＵＰ１プロモーターのほとんど、ならびにａｌｓＳコード配列およびＣＹＣターミネーターの全てを除去した。次に、Ｋｌｅｎｏｗ断片による処理の後にベクターを自己連結させ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓｔｂｌ３細胞に形質転換し、アンピシリン耐性を選択した。ＤＮＡ領域の除去は、ＰＣＲによる連結結合部にわたるＤＮＡ配列決定によって、２つの独立したクローンについて確認した。得られたプラスミドをｐＹＺ０９０ΔａｌｓＳ（配列番号１８２）と命名した。

【0151】

プラスミドｐＬＨ７０２（配列番号２１８）は、以下の段落において記載されるように、ｐＹＺ０９０から一連のステップで構築した。このプラスミドは、酵母ＩＬＶ５プロモーターからＫＡＲＩ変異体Ｋ９Ｄ３（配列番号２３４）を発現する。

【0152】

ｐＹＺ０５８（ｐＨＲ８１−ＰＣＵＰ１−ＡｌｓＳ−ＰＩＬＶ５−酵母ＫＡＲＩ）はｐＹＺ０９０（ｐＨＲ８１−ＰＣＵＰ１−ＡｌｓＳ−ＰＩＬＶ５−ｌａｃｔｉｓ ＫＡＲＩ）に由来した。ｐＹＺ０９０をＰｍｅＩおよびＳｆｉＩ酵素により切断し、酵母ＫＡＲＩのＰＣＲ産物と連結させた。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＹ４７４１（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ．）株のゲノムＤＮＡから、上部プライマー５’−ｃａｔｃａｔｃａｃａｇｔｔｔａａａｃａｇｔａｔｇｔｔｇａａｇｃａａａｔｃａａｃｔｔｃｇｇｔｇｇ−３’（配列番号２４８）および下部プライマー５’−ｇｇａｃｇｇｇｃｃｃｔｇｃａｇｇｃｃｔｔａｔｔｇｇｔｔｔｔｃｔｇｇｔｃｔｃａａｃｔｔｔｃｔｇａｃ−３’（配列番号２４９）を用いてＰＣＲ産物を増幅し、ＰｍｅＩおよびＳｆｉＩ酵素により消化した。ｐＹＺ０５８を配列決定により確認した。ｐＬＨ５５０（ｐＨＲ８１−ＰＣＵＰ１−ＡｌｓＳ−ＰＩＬＶ５−Ｐｆ５．ＫＡＲＩ）はｐＹＺ０５８に由来した。野生型Ｐｆ５．ＫＡＲＩ遺伝子をＯＴ１３４９（５’−ｃａｔｃａｔｃａｃａｇｔｔｔａａａｃａｇｔａｔｇａａａｇｔｔｔｔｃｔａｃｇａｔａａａｇａｃｔｇｃｇａｃｃ−３’（配列番号２５０））およびＯＴ１３１８（５’−ｇｃａｃｔｔｇａｔａｇｇｃｃｔｇｃａｇｇｇｃｃｔｔａｇｔｔｃｔｔｇｇｃｔｔｔｇｔｃｇａｃｇａｔｔｔｔｇ−３’（配列番号２５１））によりＰＣＲ増幅し、ＰｍｅＩおよびＳｆｉＩ酵素により消化し、ＰｍｅＩおよびＳｆｉＩにより切断されたｐＹＺ０５８ベクターと連結させた。生成されたベクターｐＬＨ５５０を配列決定により確認した。ｐＬＨ５５６は、ＳｐｅＩおよびＮｏｔＩ酵素によりベクターを消化し、ＳｐｅＩおよびＮｏｔＩ部位のためのオーバーラップ配列を含有するＯＴ１３８３（５’−ｃｔａｇｔｃａｃｃｇｇｔｇｇｃ−３（配列番号２５２））およびＯＴ１３８４（５’−ｇｇｃｃｇｃｃａｃｃｇｇｔｇａ−３’（配列番号２５３））からアニーリングされたリンカーと連結させることによって、ｐＬＨ５５０から得た。このクローニングステップは、機能性でない配列の上流１６０ｂｐ残基と共に、ａｌｓＳ遺伝子およびＰＣＵＰ１プロモーターの大型断片をプラスミドから除去する。ｐＬＨ５５６を配列決定により確認した。ｐＬＨ７０２はｐＬＨ５５６に由来した。ＰｍｅＩおよびＳｆｉＩ酵素を用いて、Ｋ９Ｄ３突然変異体ＫＡＲＩ遺伝子を別のベクターから切除し、ＰｍｅＩおよびＳｆｉＩ部位でｐＬＨ５５６と連結させ、Ｐｆ５．ＫＡＲＩ遺伝子をＫ９Ｄ３遺伝子で置換した。構築されたベクターｐＬＨ７０２を配列決定により確認した。

【0153】

ｐＬＨ４６８プラスミドを、酵母中のＤＨＡＤ、ＫｉｖＤおよびＨＡＤＨの発現のために構築した。ｐＢＰ９１５は、ｋｉｖＤ遺伝子およびｋｉｖＤの上流のＴＤＨ３プロモーターの９５７塩基対を欠失させることによって、ｐＬＨ４６８から構築した。ｐＬＨ４６８をＳｗａＩにより消化し、大型断片（１２８９６ｂｐ）をアガロースゲルにおいて精製した後、Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）により精製した。ＤＮＡの単離断片をＴ４ＤＮＡリガーゼにより自己連結させ、エレクトロコンピテントなＴＯＰ１０エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を形質転換するために使用した。形質転換体からのプラスミドを単離し、ＳｗａＩ制限酵素による制限分析によって適切な欠失について検査した。また単離物は欠失部位にわたって配列決定した。適切な欠失を有するクローンをｐＢＰ９１５（ｐＬＨ４６８ΔｋｉｖＤ、配列番号１６６）と命名した。

【0154】

以下のキメラ遺伝子：１）ジヒドロキシ酸デヒドラターゼの発現のために、酵母ＦＢＡ１プロモーター、続いてＦＢＡ１ターミネーターから発現される、Ｃ末端Ｌｕｍｉｏタグを有するＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＵＡ１５９からのｉｌｖＤ遺伝子のコード領域、２）アルコールデヒドロゲナーゼの発現のために、酵母ＧＰＭ１プロモーター、続いてＡＤＨ１ターミネーターから発現されるウマ肝臓ＡＤＨのコード領域、３）ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼの発現のために、酵母ＴＤＨ３プロモーター、続いてＴＤＨ３ターミネーターから発現される、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）からのＫｉｖＤ遺伝子のコード領域を含有するように、ｐＹＺ０６７（配列番号２５４）を構築した。

【0155】

ｋｉｖＤおよびａｄｈの両方のためのプロモーター−遺伝子−ターミネーターカセットを欠失させることによって、ｐＹＺ０６７からプラスミドｐＹＺ０６７ΔｋｉｖＤΔｈＡＤＨを構築した。ＢａｍＨＩおよびＳａｃＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）によりｐＹＺ０６７を消化し、７９３４ｂｐ断片をアガロースゲルにおいて精製した後、Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）により精製した。ＤＮＡポリメラーゼＩ、大型（Ｋｌｅｎｏｗ）断片（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）によりＤＮＡの単離断片を処理し、次にＴ４ＤＮＡリガーゼと自己連結させ、コンピテントなＴＯＰ１０エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を形質転換するために使用した。形質転換体からのプラスミドを単離し、配列分析によって適切な欠失を検査した。正しいプラスミド単離物をｐＹＺ０６７ΔｋｉｖＤΔｈＡＤＨ（配列番号２５５）と命名した。

【0156】

実施例１：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における候補酵素の発現
生物多様性検索（本明細書において上記で記載される）に基づいて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＤＮＡ２．０，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆ）における発現のために最適化されたコドンを用いて９個の酵素をコードする遺伝子を合成した。ベクターｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０４（ＤＮＡ２．０，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆ）においてＴ５プロモーターの制御下で各遺伝子をクローン化し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ）中で発現させた。１００ｕｇのアンピシリン／ｍＬが補充され、３０ｍｇ／Ｌのチアミンが補充されるか補充されないＬＢ培地において３７ＣでＯＤ６００ｎｍ＝０．５まで振とうフラスコで増殖させた後、１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、培養物をさらに１４〜１６時間増殖させた。遠心分離によって細胞を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって異種タンパク質発現を確認した。

【0157】

【表26】

【0158】

実施例２：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における候補酵素の発現
１回目の生物多様性検索からの酵素アッセイ結果に基づいて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＤＮＡ２．０，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆ）における発現のために最適化されたコドンを用いて１３個の付加的な酵素をコードする遺伝子（表６）を合成した。さらに、Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）ｋｉｖＤ（対照、配列番号１）をコードするコドン最適化遺伝子を調製した。ベクターｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０４（ＤＮＡ２．０，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆ）においてＴ５プロモーターの制御下で各遺伝子をクローン化し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ）中で発現させた。１００ｕｇのアンピシリン／ｍＬが補充され、３０ｍｇ／Ｌのチアミンが補充されるか補充されないＬＢ培地において３７ＣでＯＤ６００ｎｍ＝０．５まで振とうフラスコで増殖させた後、１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、培養物をさらに１４〜１６時間増殖させた。遠心分離によって細胞を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって異種タンパク質発現を確認した。

【0159】

【表27】

【0160】

【表28】

【0161】

実施例３．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現されたときにＫＩＶＤ活性を示す酵素の同定
以下に記載される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）無細胞抽出物の酵素アッセイによって、所望のα−ケトイソバレレート（αＫＩＶ）デカルボキシラーゼ活性を有する推定ＫＩＶＤ酵素を同定した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における推定酵素の発現は、実施例１および２において詳述される。

【0162】

無細胞抽出物の調製
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を、３ｍＬの１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ６．８、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２中に懸濁させ、０℃において超音波処理により破壊した。マイクロチッププローブを用いて細胞を１０秒間超音波処理し、２５秒間静止させた。全部で２分間の超音波処理のためにこのサイクルを１２回繰り返した。破壊細胞からの粗抽出物を遠心分離して、細胞片をペレット状にした。上清を除去し、アッセイされるまで氷上で貯蔵した。

【0163】

タンパク質の定量化
無細胞抽出物中の全タンパク質濃度を、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＃２３２３８、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．）を用いてＢｒａｄｆｏｒｄ Ａｓｓａｙにより測定した。標準としてＢＳＡを用いた。Ｃａｒｙ ３００分光光度計（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ Ｄｅｌ．）を用いて５９５ｎｍにおける吸光度を追跡することによってタンパク質の濃度を測定した。

【0164】

ＫＩＶＤ酵素アッセイプロトコル−共役
Ｇｏｃｋｅ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（Ａｄｖ．Ｓｙｎｔｈ．Ｃａｔａｌ．２００７，３４９，１４２５−１４３５）において記載されているウマ肝臓ＡＤＨ（ｈＡＤＨ）共役酵素アッセイにおいてα−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの変換率を測定した。無細胞抽出物のアッセイは、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ６．８、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、２００μＭのＮＡＤＨ、５００μＭのＴＰＰ、３０ｍＭのα−ＫＩＶ（Ｓｉｇｍａ）、および０．４５ＵのｈＡＤＨ（１ｍｇ＝１．５Ｕ）（Ｓｉｇｍａ）を含有する緩衝液において３０℃で実施した。Ｃａｒｙ ３００分光光度計（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ Ｄｅｌ．）において１ｃｍ経路長キュベット中３４０ｎｍで、ＮＡＤＨの酸化をモニターした。ＮＡＤＨに対して６２２０Ｍ^−１ｃｍ^−１のモル吸光係数を用いて酵素速度を計算した。種々の濃度のｈＡＤＨおよび無細胞抽出物における対照によって、測定される速度がＫＩＶＤ酵素活性によって決定されることを保証した。

【0165】

測定された酵素活性および全タンパク質濃度から、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現される推定ＫＩＶＤ酵素の比活性を計算した。１回目および２回目からの結果はそれぞれ表７および８に示される。

【0166】

【表29】

【0167】

【表30】

【0168】

ＫＩＶＤ酵素アッセイプロトコル−比色
高ＫＩＶＤ活性を有する３つの酵素のα−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒド（ｉｓｏｂｕｔｒｙａｌｄｅｈｙｄｅ）への変換率は、ＤｕＰｏｎｔ−ＤｕｒｓｔおよびＧｏｋｅｌ（Ｊ．Ｃｈｅｍ Ｅｄｕ．１９７８，５５，２０６）によって記載されているアルデヒド特異的Ｐｕｒｐａｌｄ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ）比色酵素アッセイによっても測定した。無細胞抽出物のアッセイは、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ６．８、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、５００μＭのＴＰＰおよび３０ｍＭのα−ＫＩＶを含有する緩衝液において３０℃で実施した。全反応容積は１ｍＬであった。固定された時点（０、１０、２０および３０分）で２００μＬのアリコートを除去し、１ｍＬのＰｕｒｐａｌｄ（登録商標）ストック溶液（２ＭのＮａＯＨ中５ｍｇ／ｍＬのＰｕｒｐａｌｄ）中で反応を停止させることによって、イソブチルアルデヒドの形成をモニターした。次に、混合物を室温で２０分間インキュベートして、発色を可能にした。インキュベーション工程中、混合物を５分ごとに混合した。０〜１０ｍＭのイソブチルアルデヒドの標準曲線を用いて、酵素により発生されるイソブチルアルデヒドの濃度を決定した。２００μＬの各標準物を作り、ゼロ時点で１ｍＬのＰｕｒｐａｌｄ（登録商標）ストック溶液に添加した。標準物を室温で２０分間インキュベートし、５分毎に混合した。Ｃａｒｙ ３００分光光度計（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ Ｄｅｌ．）を用いて５３５ｎｍにおける吸光度を測定した。測定された酵素活性および全タンパク質濃度から、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現される推定ＫＩＶＤ酵素の比活性を計算した。

【0169】

表９に示されるように比色および連続共役アッセイについて同等の比活性が見出された。

【0170】

【表31】

【0171】

実施例４．ＫＩＶＤ酵素のＴＰＰ補因子活性化定数の測定
１回目および２回目からの最高活性を有する３つの推定ＫＩＶＤ酵素（ＫｉｖＤ８０、ＫｉｖＤ８１、およびＭｃａ）、Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）ＫｉｖＤおよびＫｄｃＡを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞の粗溶解物におけるＴＰＰ補因子活性化定数について評価した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるこれらの酵素の発現は、実施例１および２で記載される。粗溶解物の生成およびタンパク質の定量化は、実施例３に記載されるように実施した。

【0172】

無細胞抽出物の脱塩
Ｚｅｂａ Ｄｅｓａｌｔ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＶＷＲ ＰＩ８９８８９）を用いてタンパク質を脱塩し、緩く結合したＴＰＰを除去した。カラム調製は、製造業者の使用説明書に従って実施した。全ての遠心分離ステップは、１０００ｘｇで２分間実行した。最初の遠心分離ステップにより製造業者の貯蔵緩衝液を除去した。２ｍＬの１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ６．８のカラムへの添加と、その後の遠心分離とからなる４回の洗浄ステップにより、細胞溶解物を脱塩するためにカラムを調製した。洗浄ステップが終了したら、カラムを新しい１５ｍＬのＣｏｒｎｉｎｇ管（ＶＷＲ、２１００８−６７０）に入れ、６００μＬの細胞溶解物を脱塩カラムに添加し、遠心分離した。流出液を捕集し、ＴＰＰ依存性のＫｉｖＤ活性について分析した。

【0173】

ＫＩＶＤ酵素アッセイプロトコル−共役
Ｇｏｃｋｅ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（Ａｄｖ．Ｓｙｎｔｈ．Ｃａｔａｌ．２００７，３４９，１４２５−１４３５）において記載されているウマ肝臓ＡＤＨ（ｈＡＤＨ）共役酵素アッセイにおいてα−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒド（ｉｓｏｂｕｔｒｙａｌｄｅｈｙｄｅ）への変換率を測定した。無細胞抽出物のアッセイは、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ６．８、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、２００μＭのＮＡＤＨ、３０ｍＭのα−ＫＩＶ（Ｓｉｇｍａ）、および０．４５ＵのｈＡＤＨ（１ｍｇ＝１．５Ｕ）（Ｓｉｇｍａ）を含有する緩衝液において３０℃で実施した。ＴＰＰ濃度を変化させた。Ｃａｒｙ ３００分光光度計（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ Ｄｅｌ．）において１ｃｍ経路長キュベット中３４０ｎｍで、ＮＡＤＨの酸化をモニターした。ＮＡＤＨに対して６２２０Ｍ^−１ｃｍ^−１のモル吸光係数を用いて酵素速度を計算した。種々の濃度のｈＡＤＨおよび無細胞抽出物における対照によって、測定される速度がＫＩＶＤ酵素活性によって決定されることを保証した。

【0174】

測定された酵素活性および全タンパク質濃度から、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現される推定ＫＩＶＤ酵素の比活性を計算した。これらの比活性をＴＰＰ濃度に対してプロットした。Ｋａｌｅｉｄａｇｒａｐｈ（相乗効果）を用いて、得られた曲線を飽和式（ＳＡ＝（ＳＡ_ｍａｘ^＊［ＴＰＰ］）／（Ｋ_ｃ＋［ＴＰＰ］））＋Ｃ）に当てはめた。ＴＰＰ補因子活性化定数（Ｋ_ｃ）を決定し、値を表１０に記載する。

【0175】

【表32】

【0176】

実施例５．チアミン補充培地による大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での発現の後の選択された２回目の酵素のＫＩＶＤ活性
ＫＩＶＤ活性を有する酵素に対する配列相同性に基づいて、２回目の候補のうちの５つをさらに分析した。挿入のないベクターおよびＭｃａをそれぞれ負および正の対照として使用した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現は、増殖培地に３０ｍｇ／Ｌのチアミン塩酸塩（Ｓｉｇｍａ）を補充することを変更して実施例２に記載されるように実施した。粗抽出物を調製し、実施例３に記載されるようにアッセイした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において不溶性タンパク質としてＮｐｕが発現されることが示された。

【0177】

【表33】

【0178】

実施例６．基質特異性比の測定
２つの推定ＫＩＶＤ酵素（ＫｉｖＤ８１、Ｍｃａ）、ＫｄｃＡおよびＬａｃｔｉｓ ＫｉｖＤを基質選択性について評価した。酵素のそれぞれをコードするプラスミド（例えば、プラスミドの説明については実施例１および２を参照）を単離し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のエレクトロコンピテントなＫＥＩＯΔｌｄｈ株（Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）に形質転換した。１００ｕｇのアンピシリン／ｍＬが補充されたＬＢ培地において３０℃でＯＤ６００ｎｍ＝０．５まで振とうフラスコで増殖させた後、１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、培養物をさらに１４〜１６時間増殖させた。粗細胞溶解物を以下のように生成させ、ａＫｉｖおよびピルベートとの活性に関して推定ＫｉｖＤ酵素を分析した。

【0179】

無細胞抽出物の調製
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を、３ｍＬの１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ６．８、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２中に懸濁させ、０℃において超音波処理により破壊した。プローブを用いて細胞を１０秒間超音波処理し、２５秒間静止させた。全部で２分間の超音波処理のためにこのサイクルを１２回繰り返した。破壊細胞からの粗抽出物を遠心分離して、細胞片をペレット状にした。上清を除去し、アッセイされるまで氷上で貯蔵した。

【0180】

タンパク質の定量化
無細胞抽出物中の全タンパク質濃度を、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＃２３２３８、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．）を用いてＢｒａｄｆｏｒｄ Ａｓｓａｙにより測定した。標準としてＢＳＡを用いた。Ｃａｒｙ ５０分光光度計（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ Ｄｅｌ．）を用いて５９５ｎｍにおける吸光度を追跡することによってタンパク質の濃度を測定した。

【0181】

ＫＩＶＤ酵素アッセイプロトコル−共役
Ｇｏｃｋｅ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（Ａｄｖ．Ｓｙｎｔｈ．Ｃａｔａｌ．２００７，３４９，１４２５−１４３５）において記載されているウマ肝臓ＡＤＨ（ｈＡＤＨ）共役酵素アッセイにおいてケトイソバレレートからイソブチルアルデヒド（ｉｓｏｂｕｔｒｙａｌｄｅｈｙｄｅ）への変換率を測定した。無細胞抽出物のアッセイは、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ６．８、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、２００μＭのＮＡＤＨ、５００μＭのＴＰＰ、および０．４５ＵのｈＡＤＨ（１ｍｇ＝１．５Ｕ）（Ｓｉｇｍａ）を含有する緩衝液において３０℃で実施した。基質、ピルベート（Ｓｉｇｍａ）またはαＫＩＶ（Ｓｉｇｍａ）を種々の濃度で添加した。Ｃａｒｙ ３００分光光度計（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ Ｄｅｌ．）において１ｃｍ経路長キュベット中３４０ｎｍで、ＮＡＤＨの酸化をモニターした。ＮＡＤＨに対して６２２０Ｍ^−１ｃｍ^−１のモル吸光係数を用いて酵素速度を計算した。種々の濃度のｈＡＤＨおよび無細胞抽出物における対照によって、測定される速度がＫＩＶＤ酵素活性によって決定されることを保証した。

【0182】

測定された酵素活性および全タンパク質濃度から、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現される推定ＫＩＶＤ酵素の比活性を計算した。これらの比活性を適切な基質に対してプロットした。Ｋａｌｅｉｄａｇｒａｐｈ（相乗効果）を用いて、得られた曲線をＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｏｎ式に当てはめ、Ｋ_ｍおよびＶ_ｍａｘを決定した。動力学的な値および特異性比（［（Ｖ_ｍａｘ／Ｋ_ｍ）αＫｉｖ］／［（Ｖ_ｍａｘ／Ｋ_ｍ）ピルベート］）は表１２に記載される。

【0183】

【表34】

【0184】

実施例７：ＰＮＹ１５０３（ＢＰ１０６４）の構築
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＢＰ１０６４（ＰＮＹ１５０３）の構築
株ＢＰ１０６４は、ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ（ＣＢＳ８３４０、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）Ｆｕｎｇａｌ Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｒｙ Ｃｅｎｔｒｅ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に由来し、以下の遺伝子：ＵＲＡ３、ＨＩＳ３、ＰＤＣ１、ＰＤＣ５、ＰＤＣ６、およびＧＰＤ２の欠失を含有する。

【0185】

標的遺伝子の上流および下流の相同性領域と、形質転換体の選択のためのＧ４１８耐性マーカーまたはＵＲＡ３遺伝子のいずれかとを含有するＰＣＲ断片による相同組換えによって、コード配列全体を完全に除去した欠失を作成した。Ｃｒｅリコンビナーゼ（ｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅ、配列番号７１）を用いて、ｌｏｘＰ部位により隣接されるＧ４１８耐性マーカーを除去した。ＵＲＡ３遺伝子を相同組換えにより除去して痕跡のない（ｓｃａｒｌｅｓｓ）欠失を作成する、あるいはｌｏｘＰ部位に隣接される場合には、Ｃｒｅリコンビナーゼを用いて除去した。

【0186】

痕跡のない欠失の手順は、Ａｋａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｓｔ，２３：３９９，２００６から適合させた。一般に、４つの断片Ａ−Ｂ−Ｕ−ＣをオーバーラップＰＣＲにより結合させることによって、痕跡のない欠失のそれぞれに対するＰＣＲカセットを作った。ＰＣＲカセットは、選択可能／対抗選択可能なマーカー、天然ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ ＵＲＡ３遺伝子からなるＵＲＡ３（断片Ｕ）を、プロモーター（ＵＲＡ３遺伝子の上流２５０ｂｐ）およびターミネーター（ＵＲＡ３遺伝子の下流１５０ｂｐ）と共に含有した。断片ＡおよびＣは、標的遺伝子のすぐ上流５００ｂｐ（断片Ａ）および標的遺伝子の３’端部の５００ｂｐ（断片Ｃ）に相当した。断片ＡおよびＣは、相同組換えによるカセットの染色体への組込みのために使用した。断片Ｂ（長さ５００ｂｐ）は標的遺伝子のすぐ下流の５００ｂｐに相当し、カセットの染色体への組込みの際に断片Ｂに相当する配列の直接反復が作成されるように、相同組換えによる染色体からのＵＲＡ３マーカーおよび断片Ｃの切除のために使用した。ＰＣＲ産物ＡＢＵＣカセットを用いて、まずＵＲＡ３マーカーを組込み、次に相同組換えにより染色体から切除した。最初の組込みにより、３’の５００ｂｐを除く遺伝子が欠失された。切除の際、遺伝子の３’の５００ｂｐ領域も欠失された。この方法を用いる遺伝子の組込みのために、組み込むべき遺伝子は、断片ＡとＢの間でＰＣＲカセットに包含させた。

【0187】

ＵＲＡ３の欠失
内因性ＵＲＡ３コード領域を欠失させるために、ｕｒａ３：：ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ−ｌｏｘＰカセットを、ｐＬＡ５４テンプレートＤＮＡ（配列番号７２）からＰＣＲ増幅した。ｐＬＡ５４は、Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＴＥＦ１プロモーターおよびｋａｎＭＸマーカーを含有し、ｌｏｘＰ部位によって隣接されて、Ｃｒｅリコンビナーゼによる組換えおよびマーカーの除去を可能にする。ＰＣＲは、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼならびにプライマーＢＫ５０５およびＢＫ５０６（配列番号７３および７４）を用いて行った。各プライマーのＵＲＡ３部分は、ｌｏｘＰ−ｋａｎＭＸ−ｌｏｘＰマーカーの組込みがＵＲＡ３コード領域の置換をもたらすように、ＵＲＡ３プロモーターの上流の５’領域およびコード領域の下流の３’領域に由来した。標準遺伝子技術（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ．２０１−２０２）を用いてＰＣＲ産物をＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄに形質転換し、Ｇ４１８（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＹＰＤにおいて３０℃で形質転換体を選択した。形質転換体をスクリーニングして、プライマーＬＡ４６８およびＬＡ４９２（配列番号７５および７６）を用いるＰＣＲによって正しい組込みを検証し、ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤΔｕｒａ３：：ｋａｎＭＸと命名した。

【0188】

ＨＩＳ３の欠失
Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）と、Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）により調製したテンプレートとしてのＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤゲノムＤＮＡとを用いて、痕跡のないＨＩＳ３欠失のためのＰＣＲカセットの４つの断片を増幅した。プライマーｏＢＰ４５２（配列番号７７）と、ＨＩＳ３断片Ｂの５’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ４５３（配列番号７８）とを用いて、ＨＩＳ３断片Ａを増幅した。ＨＩＳ３断片Ａの３’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ４５４（配列番号７９）と、ＨＩＳ３断片Ｕの５’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ４５５（配列番号８０）とを用いて、ＨＩＳ３断片Ｂを増幅した。ＨＩＳ３断片Ｂの３’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ４５６（配列番号８１）と、ＨＩＳ３断片Ｃの５’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ４５７（配列番号８２）とを用いて、ＨＩＳ３断片Ｕを増幅した。ＨＩＳ３断片Ｕの３’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ４５８（配列番号８３）と、プライマーｏＢＰ４５９（配列番号８４）とを用いて、ＨＩＳ３断片Ｃを増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。ＨＩＳ３断片ＡおよびＨＩＳ３断片Ｂを混合し、プライマーｏＢＰ４５２（配列番号７７）およびｏＢＰ４５５（配列番号８０）により増幅することによって、オーバーラップＰＣＲによりＨＩＳ３断片ＡＢを作成した。ＨＩＳ３断片ＵおよびＨＩＳ３断片Ｃを混合し、プライマーｏＢＰ４５６（配列番号８１）およびｏＢＰ４５９（配列番号８４）により増幅することによって、オーバーラップＰＣＲによりＨＩＳ３断片ＵＣを作成した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルにおいて精製した後、Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。ＨＩＳ３断片ＡＢおよびＨＩＳ３断片ＵＣを混合し、プライマーｏＢＰ４５２（配列番号７７）およびｏＢＰ４５９（配列番号８４）により増幅することによって、オーバーラップＰＣＲによりＨＩＳ３ＡＢＵＣカセットを作成した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。

【0189】

ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤΔｕｒａ３：：ｋａｎＭＸのコンピテント細胞を作り、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＩＩキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）を用いて、ＨＩＳ３ＡＢＵＣＰＣＲカセットで形質転換した。形質転換混合物を、２％のグルコースが補充されたウラシルを欠いた合成完全培地において３０℃でプレーティングした。Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）により調製されたゲノムＤＮＡを用いて、ｈｉｓ３ノックアウトを有する形質転換体を、プライマーｏＢＰ４６０（配列番号８５）およびｏＢＰ４６１（配列番号８６）によるＰＣＲによってスクリーニングした。正しい形質転換体を株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤΔｕｒａ３：：ｋａｎＭＸΔｈｉｓ３：：ＵＲＡ３として選択した。

【0190】

Δｕｒａ３部位からのＫａｎＭＸマーカーの除去およびΔｈｉｓ３部位からのＵＲＡ３マーカーの除去
Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＩＩキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて、ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤΔｕｒａ３：：ｋａｎＭＸΔｈｉｓ３：：ＵＲＡ３を、ｐＲＳ４２３：：ＰＧＡＬ１−ｃｒｅ（配列番号７１）で形質転換し、２％のグルコースが補充されたヒスチジンおよびウラシルを欠いた合成完全培地において３０℃でプレーティングすることによって、ＫａｎＭＸマーカーを除去した。１％のガラクトースが補充されたＹＰ中、３０℃で約６時間、形質転換体を増殖させて、ＣｒｅリコンビナーゼおよびＫａｎＭＸマーカーの切除を誘発させ、回収のために３０℃でＹＰＤ（２％のグルコース）プレートにプレーティングした。分離株をＹＰＤ中で一晩増殖させ、５−フルオロ−オロト酸（０．１％）を含有する合成完全培地に３０℃でプレーティングして、ＵＲＡ３マーカーを失った分離株を選択した。ｐＲＳ４２３：：Ｐ_ＧＡＬ１−ｃｒｅプラスミドの除去のために、５−ＦＯＡ耐性分離株をＹＰＤにおいて増殖およびプレーティングした。ＹＰＤ＋Ｇ４１８プレート、ウラシルを欠いた合成完全培地プレート、およびヒスチジンを欠いた合成完全培地プレートにおける増殖をアッセイすることによって、ＫａｎＭＸマーカー、ＵＲＡ３マーカー、およびｐＲＳ４２３：：Ｐ_ＧＡＬ１−ｃｒｅプラスミドの損失について分離株を検査した。Ｇ４１８に対して感受性があり、ウラシルおよびヒスチジンに対して栄養要求性である正しい分離株を、株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤΔｕｒａ３：：ｌｏｘＰΔｈｉｓ３として選択し、ＢＰ８５７と命名した。欠失およびマーカー除去は、Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）により調製されたゲノムＤＮＡを用いて、Δｕｒａ３のためのプライマーｏＢＰ４５０（配列番号８７）およびｏＢＰ４５１（配列番号８８）、ならびにΔｈｉｓ３のためのプライマーｏＢＰ４６０（配列番号８５）およびｏＢＰ４６１（配列番号８６）によるＰＣＲおよび配列決定によって確認した。

【0191】

ＰＤＣ６の欠失
Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）と、Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）により調製したテンプレートとしてのＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤゲノムＤＮＡとを用いて、痕跡のないＰＤＣ６欠失のためのＰＣＲカセットの４つの断片を増幅した。プライマーｏＢＰ４４０（配列番号８９）と、ＰＤＣ６断片Ｂの５’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ４４１（配列番号９０）とを用いて、ＰＤＣ６断片Ａを増幅した。ＰＤＣ６断片Ａの３’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ４４２（配列番号９１）と、ＰＤＣ６断片Ｕの５’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ４４３（配列番号９２）とを用いて、ＰＤＣ６断片Ｂを増幅した。ＰＤＣ６断片Ｂの３’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ４４４（配列番号９３）と、ＰＤＣ６断片Ｃの５’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ４４５（配列番号９４）とを用いて、ＰＤＣ６断片Ｕを増幅した。ＰＤＣ６断片Ｕの３’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ４４６（配列番号９５）と、プライマーｏＢＰ４４７（配列番号９６）とを用いて、ＰＤＣ６断片Ｃを増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。ＰＤＣ６断片ＡおよびＰＤＣ６断片Ｂを混合し、プライマーｏＢＰ４４０（配列番号８９）およびｏＢＰ４４３（配列番号９２）により増幅することによって、オーバーラップＰＣＲによりＰＤＣ６断片ＡＢを作成した。ＰＤＣ６断片ＵおよびＰＤＣ６断片Ｃを混合し、プライマーｏＢＰ４４４（配列番号９３）およびｏＢＰ４４７（配列番号９６）により増幅することによって、オーバーラップＰＣＲによりＰＤＣ６断片ＵＣを作成した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルにおいて精製した後、Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。ＰＤＣ６断片ＡＢおよびＰＤＣ６断片ＵＣを混合し、プライマーｏＢＰ４４０（配列番号８９）およびｏＢＰ４４７（配列番号９６）により増幅することによって、オーバーラップＰＣＲによりＰＤＣ６ＡＢＵＣカセットを作成した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。

【0192】

ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤΔｕｒａ３：：ｌｏｘＰΔｈｉｓ３のコンピテント細胞を作り、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＩＩキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて、ＰＤＣ６ＡＢＵＣＰＣＲカセットで形質転換した。形質転換混合物を、２％のグルコースが補充されたウラシルを欠いた合成完全培地において３０℃でプレーティングした。Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）により調製されたゲノムＤＮＡを用いて、ｐｄｃ６ノックアウトを有する形質転換体を、プライマーｏＢＰ４４８（配列番号９７）およびｏＢＰ４４９（配列番号９８）によるＰＣＲによってスクリーニングした。正しい形質転換体を株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤΔｕｒａ３：：ｌｏｘＰΔｈｉｓ３Δｐｄｃ６：：ＵＲＡ３として選択した。

【0193】

ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤΔｕｒａ３：：ｌｏｘＰΔｈｉｓ３Δｐｄｃ６：：ＵＲＡ３をＹＰＤ中で一晩増殖させ、５−フルオロ−オロト酸（０．１％）を含有する合成完全培地において３０℃でプレーティングして、ＵＲＡ３マーカーを失った分離を選択した。欠失およびマーカー除去は、Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）により調製されたゲノムＤＮＡを用いて、プライマーｏＢＰ４４８（配列番号９７）およびｏＢＰ４４９（配列番号９８）によるＰＣＲおよび配列決定によって確認した。分離株からのＰＤＣ６遺伝子の不在は、ＰＤＣ６のコード配列、ｏＢＰ５５４（配列番号９９）およびｏＢＰ５５５（配列番号１００）に特異的なプライマーを用いて、ネガティブＰＣＲ結果によって実証した。正しい分離株を株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤΔｕｒａ３：：ｌｏｘＰΔｈｉｓ３Δｐｄｃ６として選択し、ＢＰ８９１と命名した。

【0194】

ＰＤＣ１欠失ｉｌｖＤＳｍ組込み
ＰＤＣ１遺伝子を欠失させ、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）ＡＴＣＣ＃７００６１０からのｉｌｖＤコード領域で置換した。Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）と、Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）により調製したテンプレートとしてのＮＹＬＡ８３（参照によってその全体が本明細書中に援用される米国特許出願公開第２０１１０１２４０６０号明細書に記載される）ゲノムＤＮＡとを用いて、ＰＤＣ１欠失−ｉｌｖＤＳｍ組込みのためのＰＣＲカセットのＡ断片とその後のストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）からのｉｌｖＤコード領域を増幅した。（ＮＹＬＡ８３は、参照によってその全体が本明細書中に援用される米国特許出願公開第２００９／０３０５３６３号明細書に記載されるＰＤＣ１欠失ｉｌｖＤＳｍ組込みを有する菌株である。）プライマーｏＢＰ５１３（配列番号１０２）と、ＰＤＣ１断片Ｂの５’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ５１５（配列番号１０３）とを用いて、ＰＤＣ１断片Ａ−ｉｌｖＤＳｍ（配列番号１０１）を増幅した。Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）と、Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）により調製したテンプレートとしてのＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤゲノムＤＮＡとを用いて、ＰＤＣ１欠失−ｉｌｖＤＳｍ組込みのためのＰＣＲカセットのＢ、Ｕ、およびＣ断片を増幅した。ＰＤＣ１断片Ａ−ｉｌｖＤＳｍの３’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ５１６（配列番号１０４）と、ＰＤＣ１断片Ｕの５’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ５１７（配列番号１０５）とを用いて、ＰＤＣ１断片を増幅した。ＰＤＣ１断片Ｂの３’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ５１８（配列番号１０６）と、ＰＤＣ１断片Ｃの５’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ５１９（配列番号１０７）とを用いて、ＰＤＣ１断片Ｕを増幅した。ＰＤＣ１断片Ｕの３’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ５２０（配列番号１０８）と、プライマーｏＢＰ５２１（配列番号１０９）とを用いて、ＰＤＣ１断片Ｃを増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。ＰＤＣ１断片Ａ−ｉｌｖＤＳｍおよびＰＤＣ１断片Ｂを混合し、プライマーｏＢＰ５１３（配列番号１０２）およびｏＢＰ５１７（配列番号１０５）により増幅することによって、オーバーラップＰＣＲによりＰＤＣ１断片Ａ−ｉｌｖＤＳｍ−Ｂを作成した。ＰＤＣ１断片ＵおよびＰＤＣ１断片Ｃを混合し、プライマーｏＢＰ５１８（配列番号１０６）およびｏＢＰ５２１（配列番号１０９）により増幅することによって、オーバーラップＰＣＲによりＰＤＣ１断片ＵＣを作成した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルにおいて精製した後、Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。ＰＤＣ１断片Ａ−ｉｌｖＤＳｍ−ＢおよびＰＤＣ１断片ＵＣを混合し、プライマーｏＢＰ５１３（配列番号１０２）およびｏＢＰ５２１（配列番号１０９）により増幅することによって、オーバーラップＰＣＲによりＰＤＣ１Ａ−ｉｌｖＤＳｍ−ＢＵＣカセットを作成した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。

【0195】

ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤΔｕｒａ３：：ｌｏｘＰΔｈｉｓ３Δｐｄｃ６のコンピテント細胞を作り、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＩＩキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて、ＰＤＣ１Ａ−ｉｌｖＤＳｍ−ＢＵＣＰＣＲカセットで形質転換した。形質転換混合物を２％のグルコースが補充されたウラシルを欠いた合成完全培地において３０℃でプレーティングした。Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）により調製されたゲノムＤＮＡを用いて、ｐｄｃ１ノックアウトｉｌｖＤＳｍ組込みを有する形質転換体を、プライマーｏＢＰ５１１（配列番号１１０）およびｏＢＰ５１２（配列番号１１１）によるＰＣＲによってスクリーニングした。分離株からのＰＤＣ１遺伝子の不在は、ＰＤＣ１のコード配列、ｏＢＰ５５０（配列番号１１２）およびｏＢＰ５５１（配列番号１１３）に特異的なプライマーを用いて、ネガティブＰＣＲ結果によって実証した。正しい形質転換体を株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤΔｕｒａ３：：ｌｏｘＰΔｈｉｓ３Δｐｄｃ６Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍ−ＵＲＡ３として選択した。

【0196】

ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤΔｕｒａ３：：ｌｏｘＰΔｈｉｓ３Δｐｄｃ６Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍ−ＵＲＡ３をＹＰＤ中で一晩増殖させ、５−フルオロ−オロト酸（０．１％）を含有する合成完全培地において３０℃でプレーティングして、ＵＲＡ３マーカーを失った分離株を選択した。ＰＤＣ１の欠失、ｉｌｖＤＳｍの組込み、およびマーカーの除去は、Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）により調製されたゲノムＤＮＡを用いて、プライマーｏＢＰ５１１（配列番号１１０）およびｏＢＰ５１２（配列番号１１１）によるＰＣＲおよび配列決定によって確認した。正しい分離株を株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤΔｕｒａ３：：ｌｏｘＰΔｈｉｓ３Δｐｄｃ６Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍとして選択し、ＢＰ９０７と命名した。

【0197】

ＰＤＣ５欠失ｓａｄＢ組込み
ＰＤＣ５遺伝子を欠失させ、アクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）からのｓａｄＢコード領域で置換した（ｓａｄＢ遺伝子は、参照によってその全体が本明細書中に援用される米国特許出願公開第２００９／０２６９８２３号明細書に記載されている）。ＰＤＣ５欠失−ｓａｄＢ組込みのためのＰＣＲカセットのセグメントをまずプラスミドｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳにクローン化した。

【0198】

ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳはｐＵＣ１９に基づき、マルチクローニング部位（ＭＣＳ）内に位置するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのＵＲＡ３遺伝子の配列を含有する。ｐＵＣ１９は、ｐＭＢ１レプリコン、およびエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）における複製および選択のためにベータ−ラクタマーゼをコードする遺伝子を含有する。ＵＲＡ３のコード配列に加えて、この遺伝子の上流および下流からの配列は、酵母におけるＵＲＡ３遺伝子の発現のために含まれる。ベクターはクローニングの目的で使用することができ、酵母組込みベクターとして使用することができる。

【0199】

サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤゲノムＤＮＡからのＵＲＡ３コード領域の上流２５０ｂｐおよび下流１５０ｂｐと共に、ＵＲＡ３コード領域を包含するＤＮＡを、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を用いて、ＢａｍＨＩ、ＡｓｃＩ、ＰｍｅＩ、およびＦｓｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ４３８（配列番号１１４）と、ＸｂａＩ、ＰａｃＩ、およびＮｏｔＩ制限部位を含有するｏＢＰ４３９（配列番号１１５）により増幅した。Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲノムＤＮＡを調製した。ＰＣＲ産物およびｐＵＣ１９（配列番号１１６）を、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩによる消化の後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼと連結させ、ベクターｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳを作成した。ベクターは、プライマーｏＢＰ２６４（配列番号１１７）およびｏＢＰ２６５（配列番号１１８）によるＰＣＲおよび配列決定によって確認した。

【0200】

ｓａｄＢのコード配列およびＰＤＣ５断片ＢをｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳにクローン化して、ＰＤＣ５Ａ−ｓａｄＢ−ＢＵＣＰＣＲカセットのｓａｄＢ−ＢＵ部分を作成した。ｐＬＨ４６８−ｓａｄＢ（配列番号１１９）をテンプレートとして用いて、ＡｓｃＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ５３０（配列番号１２０）と、ＰＤＣ５断片Ｂの５’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ５３１（配列番号１２１）とによりｓａｄＢのコード配列を増幅した。ｓａｄＢの３’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ５３２（配列番号１２２）と、ＰｍｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ５３３（配列番号１２３）とを用いて、ＰＤＣ５断片Ｂを増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。ｓａｄＢおよびＰＤＣ５断片ＢのＰＣＲ産物を混合し、プライマーｏＢＰ５３０（配列番号１２０）およびｏＢＰ５３３（配列番号１２３）により増幅することによって、オーバーラップＰＣＲによりｓａｄＢ−ＰＤＣ５断片Ｂを作成した。得られたＰＣＲ産物をＡｓｃＩおよびＰｍｅＩにより消化し、適切な酵素による消化の後、ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳの対応する部位にＴ４ＤＮＡリガーゼと共に連結させた。プライマーｏＢＰ５３６（配列番号１２４）と、ＰＤＣ５断片Ｃの５’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するｏＢＰ５４６（配列番号１２５）とを用いて、ｓａｄＢ−断片Ｂ−断片Ｕの増幅のために、得られたプラスミドをテンプレートとして使用した。ＰＤＣ５ｓａｄＢ−断片Ｂ−断片Ｕの３’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ５４７（配列番号１２６）と、プライマーｏＢＰ５３９（配列番号１２７）とを用いて、ＰＤＣ５断片Ｃを増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。ＰＤＣ５ｓａｄＢ−断片Ｂ−断片ＵおよびＰＤＣ５断片Ｃを混合し、プライマーｏＢＰ５３６（配列番号１２４）およびｏＢＰ５３９（配列番号１２７）により増幅することによって、オーバーラップＰＣＲによりＰＤＣ５ｓａｄＢ−断片Ｂ−断片Ｕ−断片Ｃを作成した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルにおいて精製した後、Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。天然ＰＤＣ５コード配列のすぐ上流の５０個のヌクレオチドに対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ５４２（配列番号１２９）と、ｏＢＰ５３９（配列番号１２７）とを用いてＰＤＣ５ｓａｄＢ−断片Ｂ−断片Ｕ−断片Ｃを増幅することによって、ＰＤＣ５Ａ−ｓａｄＢ−ＢＵＣカセット（配列番号１２８）を作成した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。

【0201】

ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤΔｕｒａ３：：ｌｏｘＰΔｈｉｓ３Δｐｄｃ６Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍのコンピテント細胞を作り、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＩＩキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて、ＰＤＣ５Ａ−ｓａｄＢ−ＢＵＣＰＣＲカセットで形質転換した。形質転換混合物を１％のエタノールが補充されたウラシルを欠いた合成完全培地（グルコースなし）において３０℃でプレーティングした。Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）により調製されたゲノムＤＮＡを用いて、ｐｄｃ５ノックアウトｓａｄＢ組込みを有する形質転換体を、プライマーｏＢＰ５４０（配列番号１３０）およびｏＢＰ５４１（配列番号１３１）によるＰＣＲによってスクリーニングした。分離株からのＰＤＣ５遺伝子の不在は、ＰＤＣ５のコード配列、ｏＢＰ５５２（配列番号１３２）およびｏＢＰ５５３（配列番号１３３）に特異的なプライマーを用いて、ネガティブＰＣＲ結果によって実証した。正しい形質転換体を株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤΔｕｒａ３：：ｌｏｘＰΔｈｉｓ３Δｐｄｃ６Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍΔｐｄｃ５：：ｓａｄＢ−ＵＲＡ３として選択した。

【0202】

ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤΔｕｒａ３：：ｌｏｘＰΔｈｉｓ３Δｐｄｃ６Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍΔｐｄｃ５：：ｓａｄＢ−ＵＲＡ３をＹＰＥ（１％のエタノール）中で一晩増殖させ、エタノールが補充され、５−フルオロ−オロト酸（０．１％）を含有する合成完全培地（グルコースなし）において３０℃でプレーティングして、ＵＲＡ３マーカーを失った分離を選択した。ＰＤＣ５の欠失、ｓａｄＢの組込み、およびマーカーの除去は、Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）により調製されたゲノムＤＮＡを用いて、プライマーｏＢＰ５４０（配列番号１３０）およびｏＢＰ５４１（配列番号１３１）によるＰＣＲによって確認した。正しい分離株を株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤΔｕｒａ３：：ｌｏｘＰΔｈｉｓ３Δｐｄｃ６Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍΔｐｄｃ５：：ｓａｄＢとして選択し、ＢＰ９１３と命名した。

【0203】

ＧＰＤ２の欠失
内因性ＧＰＤ２コード領域を欠失させるために、ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰＰＣＲ（配列番号１３５）をテンプレートＤＮＡとして用いて、ｇｐｄ２：：ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰカセット（配列番号１３４）をＰＣＲ増幅した。ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰは、ｌｏｘＰリコンビナーゼ部位に隣接される（ＡＴＣＣ♯７７１０７）からのＵＲＡ３マーカーを含有する。Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼならびにプライマーＬＡ５１２およびＬＡ５１３（配列番号１３６および１３７）を用いてＰＣＲを行った。ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰマーカーの組込みがＧＰＤ２コード領域の置換をもたらすように、各プライマーのＧＰＤ２部分は、ＧＰＤ２コード領域の上流の５’領域およびコード領域の下流の３’領域に由来した。ＰＣＲ産物をＢＰ９１３に形質転換し、形質転換体を１％のエタノールが補充されたウラシルを欠いた合成完全培地（グルコースなし）において選択した。形質転換体をスクリーニングして、プライマーｏＢＰ５８２およびＡＡ２７０（配列番号１３８および１３９）を用いるＰＣＲによって正しい組込みを検証した。

【0204】

ｐＲＳ４２３：：Ｐ_ＧＡＬ１−ｃｒｅ（配列番号７１）による形質転換と、１％のエタノールが補充され、ヒスチジンを欠いた合成完全培地における３０℃でのプレーティングとによって、ＵＲＡ３マーカーを再利用した。形質転換体を１％のエタノールが補充され、５−フルオロ−オロト酸（０．１％）を含有する合成完全培地上に画線し、３０℃でインキュベートして、ＵＲＡ３マーカーを失った分離株を選択した。ｐＲＳ４２３：：Ｐ_ＧＡＬ１−ｃｒｅプラスミドを除去するために５−ＦＯＡ耐性分離株をＹＰＥ（１％のエタノール）中で増殖させた。欠失およびマーカー除去は、プライマーｏＢＰ５８２（配列番号１３８）およびｏＢＰ５９１（配列番号１４０）によるＰＣＲによって確認した。正しい分離株を株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤΔｕｒａ３：：ｌｏｘＰΔｈｉｓ３Δｐｄｃ６Δｐｄｃ１：：ｉｌｖＤＳｍΔｐｄｃ５：：ｓａｄＢΔｇｐｄ２：：ｌｏｘＰとして選択し、ＢＰ１０６４（ＰＮＹ１５０３）と命名した。

【0205】

実施例８：ＰＮＹ１５０７の構築
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＢＰ１１３５（ＰＮＹ１５０５）およびＰＮＹ１５０７ならびにイソブタノール産生誘導体の構築
この実施例の目的は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＢＰ１１３５およびＰＮＹ１５０７を構築することであった。これらの株はＰＮＹ１５０３（ＢＰ１０６４）に由来した。ＰＮＹ１５０３（ＢＰ１０６４）の構築は上記に記載される。ＢＰ１１３５は、ＦＲＡ２遺伝子の付加的な欠失を含有する。ＰＮＹ１５０７はＢＰ１１３５に由来し、ＡＤＨ１遺伝子の付加的な欠失を有し、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現のためにコドン最適化されたラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）からのｋｉｖＤ遺伝子のＡＤＨ１座位への組込みを有した。

【0206】

ＦＲＡ２の欠失
ＦＲＡ２の欠失は、ＦＲＡ２コード配列の最初の１１３個のヌクレオチドはインタクトのままにして、コード配列の３’端部から２５０個のヌクレオチドを欠失するように設計した。インフレームの終止コドンは欠失の７ヌクレオチド下流に存在した。Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）と、Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）により調製したテンプレートとしてのＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤゲノムＤＮＡとを用いて、痕跡のないＦＲＡ２の欠失のためのＰＣＲカセットの４つの断片を増幅した。プライマーｏＢＰ５９４（配列番号１４１）と、ＦＲＡ２断片Ｂの５’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ５９５（配列番号１４２）とを用いて、ＦＲＡ２断片Ａを増幅した。ＦＲＡ２断片Ａの３’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ５９６（配列番号１４３）と、ＦＲＡ２断片Ｕの５’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ５９７（配列番号１４４）とを用いて、ＦＲＡ２断片Ｂを増幅した。ＦＲＡ２断片Ｂの３’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ５９８（配列番号１４５）と、ＦＲＡ２断片Ｃの５’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ５９９（配列番号１４６）とを用いて、ＦＲＡ２断片Ｕを増幅した。ＦＲＡ２断片Ｕの３’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ６００（配列番号１４７）と、プライマーｏＢＰ６０１（配列番号１４８）とを用いて、ＦＲＡ２断片Ｃを増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。ＦＲＡ２断片ＡおよびＦＲＡ２断片Ｂを混合し、プライマーｏＢＰ５９４（配列番号１４１）およびｏＢＰ５９７（配列番号１４４）により増幅することによって、オーバーラップＰＣＲによりＦＲＡ２断片ＡＢを作成した。ＦＲＡ２断片ＵおよびＦＲＡ２断片Ｃを混合し、プライマーｏＢＰ５９８（配列番号１４５）およびｏＢＰ６０１（配列番号１４８）により増幅することによって、オーバーラップＰＣＲによりＦＲＡ２断片ＵＣを作成した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルにおいて精製した後、Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。ＦＲＡ２断片ＡＢおよびＦＲＡ２断片ＵＣを混合し、プライマーｏＢＰ５９４（配列番号１４１）およびｏＢＰ６０１（配列番号１４８）により増幅することによって、オーバーラップＰＣＲによりＦＲＡ２ＡＢＵＣカセットを作成した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。

【0207】

ＰＮＹ１５０３のコンピテント細胞を作り、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＩＩキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）を用いて、ＦＲＡ２ＡＢＵＣＰＣＲカセットで形質転換した。形質転換混合物を、１％のエタノールが補充されたウラシルを欠いた合成完全培地において３０℃でプレーティングした。Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）により調製されたゲノムＤＮＡを用いて、ｆｒａ２ノックアウトを有する形質転換体を、プライマーｏＢＰ６０２（配列番号１４９）およびｏＢＰ６０３（配列番号１５０）によるＰＣＲによってスクリーニングした。正しい形質転換体をＹＰＥ（酵母抽出物、ペプトン、１％のエタノール）中で増殖させ、５−フルオロ−オロト酸（０．１％）を含有する合成完全培地において３０℃でプレーティングして、ＵＲＡ３マーカーを失った分離株を選択した。欠失およびマーカー除去は、Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）により調製されたゲノムＤＮＡを用いて、プライマーｏＢＰ６０２（配列番号１４９）およびｏＢＰ６０３（配列番号１５０）によるＰＣＲによって確認した。分離株からのＦＲＡ２遺伝子の欠損は、ＦＲＡ２のコード配列、ｏＢＰ６０５（配列番号１５１）およびｏＢＰ６０６（配列番号１５２）に特異的なプライマーを用いて、陰性ＰＣＲ結果によって実証した。正しい分離株を株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤＭＡＴａ ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ ｈｉｓ３Δｐｄｃ６Δｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＤＨＡＤ｜ｉｌｖＤ＿Ｓｍ−ＰＤＣ１ｔ ｐｄｃ５Δ：：Ｐ［ＰＤＣ５］−ＡＤＨ｜ｓａｄＢ＿Ａｘ−ＰＤＣ５ｔ ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ ｆｒａ２Δとして選択し、ＰＮＹ１５０５（ＢＰ１１３５）と命名した。この菌株をイソブタノール経路プラスミド（ｐＹＺ０９０、配列番号６９）およびｐＬＨ４６８（配列番号７０）で形質転換させ、１つのクローンをＢＰ１１６８（ＰＮＹ１５０６）と命名した。

【0208】

ＡＤＨ１欠失およびｋｉｖＤ Ｌｌ（ｙ）組込み
ＡＤＨ１遺伝子を欠失させ、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現のためにコドン最適化されたラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）からのｋｉｖＤコード領域で置換した。ＡＤＨ１欠失−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）の組込みのための痕跡のないカセットを、まずプラスミドｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳにクローン化した。

【0209】

ｐＬＨ４６８（配列番号７０）をテンプレートとして用いて、ＰｍｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ５６２（配列番号１５３）と、ＡＤＨ１断片Ｂの５’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ５６３（配列番号１５４）とにより、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現のためにコドン最適化されたラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）からのｋｉｖＤコード領域を増幅した。ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）の３’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ５６４（配列番号１５５）と、ＦｓｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ５６５（配列番号１５６）とにより上記のように調製したゲノムＤＮＡからＡＤＨ１断片Ｂを増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）およびＡＤＨ１断片ＢのＰＣＲ産物を混合し、プライマーｏＢＰ５６２（配列番号１５３）およびｏＢＰ５６５（配列番号１５６）により増幅することによって、オーバーラップＰＣＲによりｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１断片Ｂを作成した。得られたＰＣＲ産物をＰｍｅＩおよびＦｓｅＩにより消化し、適切な酵素による消化の後、ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳの対応する部位にＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結させた。ＳａｃＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ５０５（配列番号１５７）と、ＡｓｃＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ５０６（配列番号１５８）とにより、ゲノムＤＮＡからＡＤＨ１断片Ａを増幅した。ＡＤＨ１断片ＡのＰＣＲ産物をＳａｃＩおよびＡｓｃＩにより消化し、ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１断片Ｂを含有するプラスミドの対応する部位にＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結させた。ＰａｃＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ５０７（配列番号１５９）と、ＳａｌＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ５０８（配列番号１６０とにより、ゲノムＤＮＡからＡＤＨ１断片Ｃを増幅した。ＡＤＨ１断片ＣのＰＣＲ産物をＰａｃＩおよびＳａｌＩにより消化し、ＡＤＨ１断片Ａ−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１断片Ｂを含有するプラスミドの対応する部位にＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結させた。ＡｓｃＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ６７４（配列番号１６２）と、ＰｍｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ６７５（配列番号１６３）とにより、ベクターｐＲＳ３１６−ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−Ｐ_ＦＢＡ１−ＧＵＳ（配列番号１６１）から、ハイブリッドプロモーターＵＡＳ（ＰＧＫ１）−Ｐ_ＦＢＡ１を増幅した。ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−Ｐ_ＦＢＡ１のＰＣＲ産物をＡｓｃＩおよびＰｍｅＩにより消化し、ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１断片ＡＢＣを含有するプラスミドの対応する部位にＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結させた。プライマーｏＢＰ５０５（配列番号１５７）およびｏＢＰ５０８（配列番号１６０）を用いて、得られたプラスミドから組込みカセット全体を増幅し、ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。

【0210】

ＰＮＹ１５０５のコンピテント細胞を作り、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＩＩキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて、上記で構築したＡＤＨ１−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）ＰＣＲカセットで形質転換した。形質転換混合物を、１％のエタノールが補充されたウラシルを欠いた合成完全培地において３０℃でプレーティングした。形質転換体をＹＰＥ（１％のエタノール）中で増殖させ、５−フルオロ−オロト酸（０．１％）を含有する合成完全培地において３０℃でプレーティングし、ＵＲＡ３マーカーを失った分離株を選択した。Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）により調製されたゲノムＤＮＡを用いて、外部プライマーｏＢＰ４９５（配列番号１６４）およびｏＢＰ４９６（配列番号１６５）ならびにｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）特異的プライマーｏＢＰ５６２（配列番号１５３）および外部プライマーｏＢＰ４９６（配列番号１６５）によるＰＣＲによってＡＤＨ１の欠失およびｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）の組込みを確認した。正しい分離株を株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ ＭＡＴａ ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ ｈｉｓ３Δｐｄｃ６Δｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＤＨＡＤ｜ｉｌｖＤ＿Ｓｍ−ＰＤＣ１ｔｐｄｃ５Δ：：Ｐ［ＰＤＣ５］−ＡＤＨ｜ｓａｄＢ＿Ａｘ−ＰＤＣ５ｔ ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ ｆｒａ２Δａｄｈ１Δ：：ＵＡＳ（ＰＧＫ１）Ｐ［ＦＢＡ１］−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔとして選択し、ＰＮＹ１５０７（ＢＰ１２０１）と命名した。

【0211】

実施例９：ＰＮＹ２２１１の構築
Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＰＮＹ２２１１およびＰＮＹ２２０９の構築
ＰＮＹ２２１１は、以下の段落に記載されるように、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＰＮＹ１５０７から、いくつかのステップで構築した。まず、ホスホケトラーゼ（ｐｈｏｓｏｐｈｏｋｅｔｏｌａｓｅ）遺伝子を含有するように菌株を修飾した。次に、ホスホケトラーゼ遺伝子に隣接する配列に標的化された組込みベクターを用いて、アセト乳酸シンターゼ遺伝子（ａｌｓＳ）を菌株に付加した。最後に、相同組換えを用いてホスホケトラーゼ遺伝子および組込みベクター配列を除去し、ｐｄｃ１Δ：：ｉｌｖＤと、染色体ＸＩＩの天然ＴＲＸ１遺伝子との間の遺伝子間領域におけるａｌｓＳの痕跡のない挿入を得た。ＰＮＹ２２１１の得られた遺伝子型は、ＭＡＴａ ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ ｈｉｓ３Δｐｄｃ６Δｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＤＨＡＤ｜ｉｌｖＤ＿Ｓｍ−ＰＤＣ１ｔ−Ｐ［ＦＢＡ１］−ＡＬＳ｜ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ ｐｄｃ５Δ：：Ｐ［ＰＤＣ５］−ＡＤＨ｜ｓａｄＢ＿Ａｘ−ＰＤＣ５ｔ ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ ｆｒａ２Δａｄｈ１Δ：：ＵＡＳ（ＰＧＫ１）Ｐ［ＦＢＡ１］−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔである。

【0212】

ホスホケトラーゼ遺伝子カセットを相同組換えによりＰＮＹ１５０７に導入した。組込み構築物は以下のように作成した。プラスミドｐＲＳ４２３：：ＣＵＰ１−ａｌｓＳ＋ＦＢＡ−ｂｕｄＡ（参照によってその全体が本明細書中に援用される米国特許出願公開２００９／０３０５３６３号明細書に既に記載されている）をＮｏｔＩおよびＸｍａＩにより消化して１．８ｋｂのＦＢＡ−ｂｕｄＡ配列を除去し、Ｋｌｅｎｏｗ断片で処理した後、ベクターを連結させた。次に、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）からのＤＮＡ合成およびベクター構築サービスにより、ＣＵＰ１プロモーターをＴＥＦ１プロモーター変異体（参照によってその全体が本明細書中に援用されるＮｅｖｏｉｇｔ ｅｔ ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７２：５２６６−５２７３（２００６）によって既に記載されているＭ４変異体）で置換した。得られたプラスミド、ｐＲＳ４２３：：ＴＥＦ（Ｍ４）−ａｌｓＳをＳｔｕＩおよびＭｌｕＩ（ａｌｓＳ遺伝子の一部およびＣＹＣ１ターミネーターを含有する１．６ｋｂ部分を除去する）で切断し、プライマーＮ１１７６（配列番号１６８）およびＮ１１７７（配列番号１６９）によりｐＲＳ４２６：：ＧＰＤ−ｘｐｋ１＋ＡＤＨ−ｅｕｔＤ（配列番号１６７）から生成された４ｋｂのＰＣＲ産物、ならびにプライマーＮ８２２（配列番号１７０）およびＮ１１７８（配列番号１７１）により酵母ゲノムＤＮＡ（ＥＮＯ１プロモーター領域）から生成された０．８ｋｂのＰＣＲ産物ＤＮＡと結合させ、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＢＹ４７４１（ＡＴＣＣ＃２０１３８８）に形質転換した（ギャップ修復クローニング法、Ｍａ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ ５８：２０１−２１６（１９８７）を参照）。ヒスチジンを含まない合成完全培地に細胞をプレーティングすることによって形質転換体を得た。ＰＣＲ（プライマーＮ８２１（配列番号１７３）およびＮ１１１５（配列番号１７４））および制限消化（ＢｇｌＩ）によって、予想されるプラスミド（ｐＲＳ４２３：：ＴＥＦ（Ｍ４）−ｘｐｋ１＋ＥＮＯ１−ｅｕｔＤ、配列番号１７２）の適切な構築物を確認した。続いて、２つのクローンを配列決定した。３．１ｋｂのＴＥＦ（Ｍ４）−ｘｐｋ１遺伝子を、ＳａｃＩおよびＮｏｔＩによる消化によって単離し、ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３：：ｉｌｖＤ−ＴＲＸ１ベクターにクローン化した（クローンＡ、ＡｆｌＩＩで切断）。クローニング断片をＫｌｅｎｏｗ断片で処理して、連結のための平滑断端を生成した。連結反応物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓｔｂｌ３細胞に形質転換し、アンピシリン耐性について選択した。ＰＣＲ（プライマーＮ１１１０（配列番号１７５）およびＮ１１１４（配列番号１７６））によってＴＥＦ（Ｍ４）−ｘｐｋ１の挿入を確認した。ベクターをＡｆｌＩＩにより直線化し、Ｋｌｅｎｏｗ断片で処理した。１．８ｋｂのＫｐｎＩ−ＨｉｎｃＩＩジェネテシン耐性カセットを、Ｋｌｅｎｏｗ断片処理の後、連結によりクローン化した。連結反応物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓｔｂｌ３細胞に形質転換して、アンピシリン耐性について選択した。ＰＣＲ（プライマーＮ１６０ＳｅｑＦ５（配列番号１８３）およびＢＫ４６８（配列番号１７８））によってジェネテシンカセットの挿入を確認した。プラスミド配列は、配列番号１７９（ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３：：ｐｄｃ１：：ＴＥＦ（Ｍ４）−ｘｐｋ１：：ｋａｎ）として提供される。

【0213】

得られた組込みカセット（ｐｄｃ１：：ＴＥＦ（Ｍ４）−ｘｐｋ１：：ＫａｎＭＸ：：ＴＲＸ１）を単離し（ＡｓｃＩおよびＮａｅＩ消化により５．３ｋｂバンドが生じ、これをゲル精製した）、Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（カタログ番号Ｔ２００１）を用いてＰＮＹ１５０７に形質転換した。ＹＰＥ＋５０μｇ／ｍｌのＧ４１８にプレーティングすることによって形質転換体を選択した。ＰＣＲ（プライマーＮ８８６（配列番号１８０）およびＮ１２１４（配列番号１８１））によって、予想される座位における組込みを確認した。次に、ＣｒｅリコンビナーゼをコードするプラスミドｐＲＳ４２３：：ＧＡＬ１ｐ−Ｃｒｅ（配列番号７１）を使用して、ｌｏｘＰ隣接ＫａｎＭＸカセットを除去した。ＰＣＲ（プライマーｏＢＰ５１２（配列番号１１１）およびＮ１６０ＳｅｑＦ５（配列番号１７７））によって、カセットの適切な除去を確認した。最後に、ａｌｓＳ組込みプラスミド（配列番号２２５、ｐＵＣ１９−ｋａｎ：：ｐｄｃ１：：ＦＢＡ−ａｌｓＳ：：ＴＲＸ１、クローンＡ）を、包含されたジェネテシン選択マーカーを用いてこの菌株に形質転換した。プラスミドｐＹＺ０９０ΔａｌｓＳ（配列番号１８２）およびｐＢＰ９１５（配列番号１６６）による形質転換（Ａｍｂｅｒｇ，Ｂｕｒｋｅ ａｎｄ Ｓｔｒａｔｈｅｒｎ”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ”（２００５）のプロトコル＃２を用いて形質転換）、ならびにグルコース含有培地における増殖およびイソブタノール産生の評価によって、２つの組込み体をアセト乳酸シンターゼ活性について試験した（増殖およびイソブタノール測定方法は以下の通りである：炭素源として０．３％のグルコースおよび０．３％のエタノールを含有するヒスチジンおよびウラシルのない合成完全培地（１２５ｍＬの通気口のあるＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ（ＶＷＲカタログ番号８９０９５−２６０）内に１０ｍＬの培地）において全ての菌株を増殖させた。一晩のインキュベーション（Ｉｎｎｏｖａ（登録商標）４０ Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｈａｋｅｒ中、３０℃、２５０ｒｐｍ）の後、２％のグルコースおよび０．０５％のエタノールを含有する合成完全培地（１２５ｍＬの堅くフタをしたＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ（ＶＷＲカタログ番号８９０９５−２６０）内に２０ｍｌの培地）において、培養物を０．２ＯＤ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＢｉｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒ測定）に希釈して戻した。４８時間のインキュベーション（Ｉｎｎｏｖａ（登録商標）４０ Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｈａｋｅｒ中、３０℃、２５０ｒｐｍ）の後、米国特許出願公開第２００７００９２９５７号明細書に記載される方法によるＨＰＬＣによって培養の上清（Ｓｐｉｎ−Ｘ遠心管フィルタユニット、Ｃｏｓｔａｒカタログ番号８１６９を用いて捕集）を分析した。）。２つのクローンのうちの１つは陽性であり、ＰＮＹ２２１８と命名した。

【0214】

ＰＮＹ２２１８をＣｒｅリコンビナーゼで処理し、得られたクローンを、ＰＣＲ（プライマーＮ８８６（配列番号１８０）およびＮ１６０ＳｅｑＲ５（配列番号１８３））によりｘｐｋ１遺伝子およびｐＵＣ１９組込みベクター配列の損失についてスクリーニングした。これにより、ｘｐｋ１の上流のＤＮＡ、および組込みベクターの挿入中に導入された相同ＤＮＡの組換えの後、ｐｄｃ１−ＴＲＸ１遺伝子間領域に組み込まれたａｌｓＳ遺伝子だけが残された（ベクター、マーカー遺伝子およびｌｏｘＰ配列は失われるので、「痕跡のない」挿入）。この組換えはどの時点でも生じたはずであるが、ジェネテシン選択がなくてもベクターの組込みは安定していたようであり、組換え事象はＣｒｅリコンビナーゼの導入後にのみ観察された。１つのクローンをＰＮＹ２２１１と命名した。

【0215】

実施例１０：ＰＮＹ１５２８の構築
ＰＮＹ１５２８（ＰＮＹ２２１１におけるｈＡＤＨの組込み）
標的領域の上流および下流の相同性領域ならびに形質転換体の選択のためのＵＲＡ３遺伝子を含有するＰＣＲ産物による相同組換えによって、欠失／組込みを作成した。ＵＲＡ３遺伝子を相同組換えにより除去して、痕跡のない欠失／組込みを作成した。

【0216】

痕跡のない欠失／組込み手順は、Ａｋａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｓｔ，２３：３９９（２００６）から適合させた。欠失／組込み手順のためのＰＣＲによりカセット全体を増幅する前に、個々の断片をプラスミドにクローン化することにより４つの断片Ａ−Ｂ−Ｕ−Ｃおよび組み込むべき遺伝子を結合させることによって、各欠失／組込みのためのＰＣＲカセットを作った。組み込むべき遺伝子は、断片ＡとＢの間でカセットに包含させた。ＰＣＲカセットは、選択可能／対抗選択可能なマーカー、天然ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ ＵＲＡ３遺伝子からなるＵＲＡ３（断片Ｕ）を、プロモーター（ＵＲＡ３遺伝子の上流２５０ｂｐ）およびターミネーター（ＵＲＡ３遺伝子の下流１５０ｂｐ）領域と共に含有した。断片ＡおよびＣ（それぞれ、長さ約１００〜５００ｂｐ）は、標的領域のすぐ上流の配列（断片Ａ）および標的領域の３’配列（断片Ｃ）に相当した。断片ＡおよびＣは、相同組換えによるカセットの染色体への組込みのために使用した。断片Ｂ（長さ５００ｂｐ）は標的領域のすぐ下流の５００ｂｐに相当し、カセットの染色体への組込みの際に断片Ｂに相当する配列の直接反復が作成されるように、相同組換えによる染色体からのＵＲＡ３マーカーおよび断片Ｃの切除のために使用した。

【0217】

ＹＰＲＣΔ１５の欠失およびウマ肝臓ａｄｈの組込み
ＹＰＲＣΔ１５座位を欠失させ、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのＰＤＣ５プロモーター領域（５３８ｂｐ）およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのＡＤＨ１ターミネーター領域（３１６ｂｐ）と共に、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現のためにコドン最適化されたウマ肝臓ａｄｈ遺伝子で置換した。ＹＰＲＣΔ１５欠失−Ｐ［ＰＤＣ５］−ａｄｈ＿ＨＬ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔの組込みのための痕跡のないカセットを、まずプラスミドｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳにクローン化した。

【0218】

Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）と、Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）により調製したテンプレートとしてのＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤゲノムＤＮＡとを用いて、断片Ａ−Ｂ−Ｕ−Ｃを増幅した。ＫｐｎＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ６２２（配列番号１８４）と、ＹＰＲＣΔ１５断片Ｂの５’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ６２３（配列番号１８５）とにより、ゲノムＤＮＡからＹＰＲＣΔ１５断片Ａを増幅した。ＹＰＲＣΔ１５断片Ａの３’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ６２４（配列番号１８６）と、ＦｓｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ６２５（配列番号１８７）とにより、ゲノムＤＮＡからＹＰＲＣΔ１５断片Ｂを増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。ＹＰＲＣΔ１５断片ＡおよびＹＰＲＣΔ１５断片ＢのＰＣＲ産物を混合し、プライマーｏＢＰ６２２（配列番号１８４）およびｏＢＰ６２５（配列番号１８７）により増幅することによって、オーバーラップＰＣＲによりＹＰＲＣΔ１５断片Ａ−ＹＰＲＣΔ１５断片Ｂを作成した。得られたＰＣＲ産物をＫｐｎＩおよびＦｓｅＩにより消化し、適切な酵素による消化の後、ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳの対応する部位にＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結させた。ＮｏｔＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ６２６（配列番号１８８）と、ＰａｃＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ６２７（配列番号１８９）とにより、ゲノムＤＮＡからＹＰＲＣΔ１５断片Ｃを増幅した。ＹＰＲＣΔ１５断片ＣのＰＣＲ産物をＮｏｔＩおよびＰａｃＩにより消化し、ＹＰＲＣΔ１５断片ＡＢを含有するプラスミドの対応する部位にＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結させた。ＡｓｃＩ制限部位を含有するプライマーＨＹ２１（配列番号１９０）と、ｄｈ＿Ｈｌ（ｙ）の５’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーＨＹ２４（配列番号１９１）とにより、ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤゲノムＤＮＡからＰＤＣ５プロモーター領域を増幅した。Ｐ［ＰＤＣ５］の３’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーＨＹ２５（配列番号１９２）と、ＰｍｅＩ制限部位を含有するＨＹ４（配列番号１９３）とにより、ｐＢＰ９１５（配列番号１６６）からａｄｈ＿Ｈｌ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔを増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。Ｐ［ＰＤＣ５］およびａｄｈ＿ＨＬ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔのＰＣＲ産物を混合し、プライマーＨＹ２１（配列番号１９０）およびＨＹ４（配列番号１９３）により増幅することによって、オーバーラップＰＣＲによりＰ［ＰＤＣ５］−ａｄｈ＿ＨＬ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔを作成した。得られたＰＣＲ産物をＡｓｃＩおよびＰｍｅＩにより消化し、ＹＰＲＣΔ１５断片ＡＢＣを含有するプラスミドの対応する部位にＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結させた。プライマーｏＢＰ６２２（配列番号１８４）およびｏＢＰ６２７（配列番号１８９）を用いて、得られたプラスミドから組込みカセット全体を増幅した。

【0219】

ＰＮＹ２２１１のコンピテント細胞を作り、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＩＩキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）を用いて、ＹＰＲＣΔ１５欠失−Ｐ［ＰＤＣ５］−ａｄｈ＿ＨＬ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔ組込みカセットＰＣＲ産物で形質転換した。形質転換混合物を、１％のエタノールが補充されたウラシルを欠いた合成完全培地において３０Ｃでプレーティングした。形質転換体を、プライマーＵＲＡ３−ｅｎｄ Ｆ（配列番号１９４）およびｏＢＰ６３７（配列番号１９５）によるＰＣＲによってスクリーニングした。正しい形質転換体をＹＰＥ（１％のエタノール）中で増殖させ、１％のＥｔＯＨが補充され、５−フルオロ−オロト酸（０．１％）を含有する合成完全培地において３０Ｃでプレーティングして、ＵＲＡ３マーカーを失った分離株を選択した。ＹｅａＳｔａｒ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）により調製されたゲノムＤＮＡを用いて、外部プライマーｏＢＰ６３６（配列番号１２４）およびｏＢＰ６３７（配列番号１９５）によるＰＣＲによってＹＰＲＣΔ１５の欠失およびＰ［ＰＤＣ５］−ａｄｈ＿ＨＬ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔの組込みを確認した。さらなる修飾のために以下の遺伝子型の正しい分離株を選択した：ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ ＭＡＴａ ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ ｈｉｓ３Δｐｄｃ６Δｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＤＨＡＤ｜ｉｌｖＤ＿Ｓｍ−ＰＤＣ１ｔ−Ｐ［ＦＢＡ１］−ＡＬＳ｜ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ ｐｄｃ５Δ：：Ｐ［ＰＤＣ５］−ＡＤＨ｜ｓａｄＢ＿Ａｘ−ＰＤＣ５ｔ ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ ｆｒａ２Δａｄｈ１Δ：：ＵＡＳ（ＰＧＫ１）Ｐ［ＦＢＡ１］−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔｙｐｒｃΔ１５Δ：：Ｐ［ＰＤＣ５］−ＡＤＨ｜ａｄｈ＿Ｈｌ−ＡＤＨ１ｔ。

【0220】

ｆｒａ２Δにおけるウマ肝臓ａｄｈの組込み
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのＰＤＣ１プロモーター領域（８７０ｂｐ）およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのＡＤＨ１ターミネーター領域（３１６ｂｐ）と共に、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現のためにコドン最適化されたウマ肝臓ａｄｈ遺伝子をｆｒａ２の欠失部位に組み込んだ。ｆｒａ２Δ−Ｐ［ＰＤＣ１］−ａｄｈ＿ＨＬ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔの組込みのための痕跡のないカセットを、まずプラスミドｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳにクローン化した。

【0221】

Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）と、Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）により調製したテンプレートとしてのＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤゲノムＤＮＡとを用いて、断片Ａ−Ｂ−Ｕ−Ｃを増幅した。ＮｏｔＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ６９５（配列番号１９７）と、ＰａｃＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ６９６（配列番号１９８）とにより、ゲノムＤＮＡからｆｒａ２Δ断片Ｃを増幅した。ｆｒａ２Δ断片ＣのＰＣＲ産物をＮｏｔＩおよびＰａｃＩにより消化し、ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳの対応する部位にＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結させた。ＰｍｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ６９３（配列番号１９９）と、ＦｓｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ６９４（配列番号２００）とにより、ゲノムＤＮＡからｆｒａ２Δ断片Ｂを増幅した。得られたＰＣＲ産物をＰｍｅＩおよびＦｓｅＩにより消化し、適切な酵素による消化の後、ｆｒａ２Δ断片Ｃを含有するプラスミドの対応する部位にＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結させた。ＢａｍＨＩおよびＡｓｉＳＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ６９１（配列番号２０１）と、ＡｓｃＩおよびＳｗａＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ６９２（配列番号２０２）とにより、ゲノムＤＮＡからｆｒａ２Δ断片Ａを増幅した。ｆｒａ２Δ断片ＡのＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＡｓｃＩにより消化し、適切な酵素による消化の後、ｆｒａ２Δ断片ＢＣを含有するプラスミドの対応する部位にＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結させた。ＡｓｃＩ制限部位を含有するプライマーＨＹ１６（配列番号２０３）と、ａｄｈ＿Ｈｌ（ｙ）の５’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーＨＹ１９（配列番号２０４）とにより、ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤゲノムＤＮＡからＰＤＣ１プロモーター領域を増幅した。Ｐ［ＰＤＣ１］の３’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーＨＹ２０（配列番号２０５）と、ＰｍｅＩ制限部位を含有するＨＹ４（配列番号１９３）とにより、ｐＢＰ９１５からａｄｈ＿Ｈｌ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔを増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。Ｐ［ＰＤＣ１］およびａｄｈ＿ＨＬ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔのＰＣＲ産物を混合し、プライマーＨＹ１６（配列番号２０３）およびＨＹ４（配列番号１９３）により増幅することによって、オーバーラップＰＣＲによりＰ［ＰＤＣ１］−ａｄｈ＿ＨＬ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔを作成した。得られたＰＣＲ産物をＡｓｃＩおよびＰｍｅＩにより消化し、ｆｒａ２Δ断片ＡＢＣを含有するプラスミドの対応する部位にＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結させた。プライマーｏＢＰ６９１（配列番号２０１）およびｏＢＰ６９６（配列番号１９８）を用いて、得られたプラスミドから組込みカセット全体を増幅した。

【0222】

ＹＰＲＣΔ１５においてａｄｈ＿Ｈｌ（ｙ）が組み込まれたＰＮＹ２２１１変異体のコンピテント細胞を作り、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＩＩキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて、ｆｒａ２Δ−Ｐ［ＰＤＣ１］−ａｄｈ＿ＨＬ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔ組込みカセットＰＣＲ産物で形質転換した。形質転換混合物を、１％のエタノールが補充されたウラシルを欠いた合成完全培地において３０Ｃでプレーティングした。形質転換体を、プライマーＵＲＡ３−ｅｎｄ Ｆ（配列番号１９４）およびｏＢＰ７３１（配列番号２０６）によるＰＣＲによってスクリーニングした。正しい形質転換体をＹＰＥ（１％のエタノール）中で増殖させ、１％のＥｔＯＨが補充され、５−フルオロ−オロト酸（０．１％）を含有する合成完全培地において３０Ｃでプレーティングして、ＵＲＡ３マーカーを失った分離株を選択した。ＹｅａＳｔａｒ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）により調製されたゲノムＤＮＡを用いて、内部プライマーＨＹ３１（配列番号２０７）および外部プライマーｏＢＰ７３１（配列番号１５５）によるコロニーＰＣＲと、外部プライマーｏＢＰ７３０（配列番号２０８）およびｏＢＰ７３１（配列番号２０６）によるＰＣＲとによって、Ｐ［ＰＤＣ１］−ａｄｈ＿ＨＬ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔの組込みを確認した。以下の遺伝子型の正しい分離株をＰＮＹ１５２８と命名した：ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ ＭＡＴａ ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ ｈｉｓ３Δｐｄｃ６Δｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＤＨＡＤ｜ｉｌｖＤ＿Ｓｍ−ＰＤＣ１ｔ−Ｐ［ＦＢＡ１］−ＡＬＳ｜ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ ｐｄｃ５Δ：：Ｐ［ＰＤＣ５］−ＡＤＨ｜ｓａｄＢ＿Ａｘ−ＰＤＣ５ｔ ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ ｆｒａ２Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＡＤＨ｜ａｄｈ＿Ｈｌ−ＡＤＨ１ｔａｄｈ１Δ：：ＵＡＳ（ＰＧＫ１）Ｐ［ＦＢＡ１］−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔｙｐｒｃΔ１５Δ：：Ｐ［ＰＤＣ５］−ＡＤＨ｜ａｄｈ＿Ｈｌ−ＡＤＨ１ｔ。

【0223】

実施例１１：菌株ＰＮＹ１５４９、ＰＮＹ１５５０、およびＰＮＹ１５５１の構築
この実施例の目的は、ａｄｈ１Δ座位におけるＰＮＹ１５２８中のｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）の染色体コピーをｋｉｖＤ＿Ｌｇ（ｙ）またはｋｉｖＤ＿Ｍｃ（ｙ）で置換するために使用される構築物の組み立て、ならびにｋｉｖＤ遺伝子を発現するイソブタノロゲン株ＰＮＹ１５４９、ＰＮＹ１５５０、およびＰＮＹ１５５１の構築を説明することである。

【0224】

標的領域の上流および下流の相同性領域ならびに形質転換体の選択のためのＵＲＡ３遺伝子を含有するＰＣＲ産物による相同組換えによって、欠失／組込みを作成した。ＵＲＡ３遺伝子を相同組換えにより除去して、痕跡のない欠失／組込みを作成した。痕跡のない欠失／組込み手順は、Ａｋａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｓｔ，２３：３９９、２００６から適合させた。欠失／組込み手順のためのＰＣＲによりカセット全体を増幅する前に、個々の断片をプラスミドにクローン化することにより４つの断片Ａ−Ｂ−Ｕ−Ｃおよび組み込むべき遺伝子を結合させることによって、各欠失／組込みのためのＰＣＲカセットを作った。組み込むべき遺伝子は、断片ＡとＢの間でカセットに包含させた。ＰＣＲカセットは、選択可能／対抗選択可能なマーカー、天然ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ ＵＲＡ３遺伝子からなるＵＲＡ３（断片Ｕ）を、プロモーター（ＵＲＡ３遺伝子の上流２５０ｂｐ）およびターミネーター（ＵＲＡ３遺伝子の下流１５０ｂｐ）領域と共に含有した。断片ＡおよびＣ（長さ５００ｂｐ）は、標的領域のすぐ上流の配列（断片Ａ）および標的領域の３’配列（断片Ｃ）に相当した。断片ＡおよびＣは、相同組換えによるカセットの染色体への組込みのために使用した。断片Ｂ（長さ５００ｂｐ）は標的領域のすぐ下流の５００ｂｐに相当し、カセットの染色体への組込みの際に断片Ｂに相当する配列の直接反復が作成されるように、相同組換えによる染色体からのＵＲＡ３マーカーおよび断片Ｃの切除のために使用した。

【0225】

ｋｉｖＤ＿Ｌｇ（ｙ）およびｋｉｖＤ＿Ｍｃ（ｙ）を組み込むためのプラスミドは、ＵＡＳ（ＰＧＫ１）Ｐ［ＦＢＡ１］−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）をサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＡＤＨ１座位に組み込むために構築されたプラスミドに由来した。ＵＡＳ（ＰＧＫ１）Ｐ［ＦＢＡ１］−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）をＡＤＨ１座位に組み込むために使用されるプラスミドの構築は以下で説明される。プラスミドは、ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳにおいて構築した。

【0226】

ＡＤＨ１欠失／ＵＡＳ（ＰＧＫ１）Ｐ［ＦＢＡ１］−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）組込みプラスミドの構築
ｐＬＨ４６８（配列番号７０）をテンプレートとして用いて、ＰｍｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ５６２（配列番号１５３）と、ＡＤＨ１断片Ｂの５’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ５６３（配列番号１５４）とにより、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現のためにコドン最適化されたラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）からのｋｉｖＤコード領域、ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）を増幅した。ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）の３’端部に対する相同性を有する５’尾部を含有するプライマーｏＢＰ５６４（配列番号１５５）と、ＦｓｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ５６５（配列番号１５６）とにより、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤゲノムＤＮＡからＡＤＨ１断片Ｂを増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）により精製した。ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）およびＡＤＨ１断片ＢのＰＣＲ産物を混合し、プライマーｏＢＰ５６２（配列番号１５３）およびｏＢＰ５６５（配列番号１５６）により増幅することによって、オーバーラップＰＣＲによりｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１断片Ｂを作成した。得られたＰＣＲ産物をＰｍｅＩおよびＦｓｅＩにより消化し、適切な酵素による消化の後、ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳの対応する部位にＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結させた。ＳａｃＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ５０５（配列番号１５７）と、ＡｓｃＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ５０６（配列番号１５８）とにより、ゲノムＤＮＡからＡＤＨ１断片Ａを増幅した。ＡＤＨ１断片ＡのＰＣＲ産物をＳａｃＩおよびＡｓｃＩにより消化し、ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１断片Ｂを含有するプラスミドの対応する部位にＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結させた。ＰａｃＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ５０７（配列番号１５９）と、ＳａｌＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ５０８（配列番号１６０）とにより、ゲノムＤＮＡからＡＤＨ１断片Ｃを増幅した。ＡＤＨ１断片ＣのＰＣＲ産物をＰａｃＩおよびＳａｌＩにより消化し、ＡＤＨ１断片Ａ−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１断片Ｂを含有するプラスミドの対応する部位にＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結させた。ＡｓｃＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ６７４（配列番号１６２）と、ＰｍｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ６７５（配列番号１６３）とにより、ベクターｐＲＳ３１６−ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−Ｐ_ＦＢＡ１−ＧＵＳから、ハイブリッドプロモーターＵＡＳ（ＰＧＫ１）−Ｐ_ＦＢＡ１（配列番号１６１）を増幅した。ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−Ｐ_ＦＢＡ１のＰＣＲ産物をＡｓｃＩおよびＰｍｅＩにより消化し、ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１断片ＡＢＣを含有するプラスミドの対応する部位にＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結させて、ｐＢＰ１１８１を生成した。

【0227】

ｐＢＰ１７１６、ｐＢＰ１７１９、およびｐＢＰ２０１９の構築
ＡＤＨ１欠失／ＵＡＳ（ＰＧＫ１）Ｐ［ＦＢＡ１］−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）組込みプラスミドｐＢＰ１１８１からｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）を除去した。プラスミドをＰｍｅＩおよびＦｓｅＩにより消化し、大型ＤＮＡ断片をアガロースゲルにおいて精製した後、Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。ＰｍｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ８２１（配列番号２１０）と、ＦｓｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ４８４（配列番号２１１）とにより、ｐＢＰ１１８１からＡＤＨ１断片Ｂを増幅した。ＡＤＨ１断片ＢのＰＣＲ産物をＰｍｅＩおよびＦｓｅＩにより消化し、ゲル精製した大型ＤＮＡ断片の対応する部位にＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結させた。ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）の３’の５００ｂｐに相当するＰＣＲ断片を、ＰＮＹ１５２８におけるｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）の標的化欠失のために、得られたベクターにクローン化した。ＮｏｔＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ８２２（配列番号２１２）と、ＰａｃＩ制限部位を含有するｏＢＰ８２３（配列番号２１３）により、ｐＢＰ１１８１から断片を増幅した。ＮｏｔＩおよびＰａｃＩにより断片を消化し、適切な制限酵素による消化の後、ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）欠失を有する上記プラスミドにおいてＵＲＡ３の下流の対応する部位へＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結させた。得られたプラスミドをｐＢＰ１７１６と命名した。

【0228】

サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現のためにコドン最適化されたリステリア・グレイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｇｒａｙｉ）からのｋｉｖＤコード領域（配列番号２１４）、ｋｉｖＤ＿Ｌｇ（ｙ）を、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）により合成した。ＰｍｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ８２８（配列番号２１５）と、ＰｍｅＩ制限部位を含有するｏＢＰ８２９（配列番号２１６）とにより、ｋｉｖＤ＿Ｌｇ（ｙ）を増幅した。得られたＰＣＲ産物をＰｍｅＩにより消化し、適切な酵素による消化の後、ｐＢＰ１７１６における対応する部位にＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結させた。プライマーＦＢＡｐ−Ｆ（配列番号２１７）およびｏＢＰ８２９（配列番号２１６）によるＰＣＲによって、クローン化遺伝子の方向性を検査した。正しい方向性でｋｉｖＤ＿Ｌｇ（ｙ）を有する分離株をｐＢＰ１７１９と命名した。

【0229】

サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現のためにコドン最適化されたマクロコッカス・カセオリチクス（Ｍａｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｓｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）からのｋｉｖＤコード領域（配列番号２２４）、ｋｉｖＤ＿Ｍｃ（ｙ）を、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）により合成した。ＰｍｅＩ制限部位を含有するプライマーｏＢＰ９００（配列番号２２６）と、ＰｍｅＩ制限部位を含有するｏＢＰ９０１（配列番号２２７）とにより、ｋｉｖＤ＿Ｍｃ（ｙ）を増幅した。得られたＰＣＲ産物をＰｍｅＩにより消化し、適切な酵素による消化の後、ｐＢＰ１７１６における対応する部位にＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結させた。プライマーＦＢＡｐ−Ｆ（配列番号２１７）およびｏＢＰ９０１（配列番号２２７）によるＰＣＲによって、クローン化遺伝子の方向性を検査した。正しい方向性でｋｉｖＤ＿Ｍｃ（ｙ）を有する分離株をｐＢＰ２０１９と命名した。

【0230】

菌株ＰＮＹ１５４９、ＰＮＹ１５５０、およびＰＮＹ１５５１の構築
菌株ＰＮＹ１５２８をプラスミドｐＬＨ７０２およびｐＹＺ０６７ΔｋｉｖＤΔｈＡＤＨで形質転換した。形質転換体をＰＮＹ１５４９と命名した。

【0231】

ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）欠失／ｋｉｖＤ＿Ｌｇ（ｙ）組込みカセットを、プライマーｏＢＰ５０５（配列番号７３）およびｏＢＰ８２３（配列番号２１３）によりｐＢＰ１７１９から増幅した。ＰＮＹ１５２８のコンピテント細胞を作り、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＩＩキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）を用いてＰＣＲ産物で形質転換した。形質転換混合物を、１％のエタノールが補充されたウラシルを欠いた合成完全培地において３０Ｃでプレーティングした。形質転換体をＹＰＥ（１％のエタノール）中で増殖させ、１％のＥｔＯＨが補充され、５−フルオロ−オロト酸（０．１％）を含有する合成完全培地において３０Ｃでプレーティングして、ＵＲＡ３マーカーを失った分離株を選択した。ＹｅａＳｔａｒ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）により調製したゲノムＤＮＡを用いて、プライマーｏＢＰ６７４（配列番号１６２）およびｏＢＰ８３０（配列番号２２０）によるＰＣＲによって、ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）の欠失およびｋｉｖＤ＿Ｌｇ（ｙ）の組込みを確認した。正しい分離株は、ＰＮＹ１５２８中のｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）と同じ座位に、同じプロモーターから発現されたｋｉｖＤ＿Ｌｇ（ｙ）を含有した。分離株をプラスミドｐＬＨ７０２およびｐＹＺ０６７ΔｋｉｖＤΔｈＡＤＨで形質転換した。形質転換体をＰＮＹ１５５０と命名した。

【0232】

ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）欠失／ｋｉｖＤ＿Ｍｃ（ｙ）組込みカセットを、プライマーｏＢＰ５０５（配列番号１５７）およびｏＢＰ８２３（配列番号２１３）によりｐＢＰ２０１９から増幅した。ＰＮＹ１５２８のコンピテント細胞を作り、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＩＩキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いてＰＣＲ産物で形質転換した。形質転換混合物を、１％のエタノールが補充されたウラシルを欠いた合成完全培地において３０Ｃでプレーティングした。形質転換体を、プライマーＨＹ５１（配列番号２２１）およびｏＢＰ９０６（配列番号２２２）によるＰＣＲによってスクリーニングした。正しい形質転換体をＹＰＥ（１％のエタノール）中で増殖させ、１％のＥｔＯＨが補充され、５−フルオロ−オロト酸（０．１％）を含有する合成完全培地において３０Ｃでプレーティングして、ＵＲＡ３マーカーを失った分離株を選択した。ＹｅａＳｔａｒ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で調製したゲノムＤＮＡを用いて、プライマーＨＹ５０（配列番号２２３）およびＨＹ５１（配列番号２２１）によるＰＣＲによって、ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）の欠失およびｋｉｖＤ＿Ｍｃ（ｙ）の組込みを確認した。正しい分離株は、ＰＮＹ１５２８中のｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）と同じ座位に、同じプロモーターから発現されたｋｉｖＤ＿Ｍｃ（ｙ）を含有した。分離株をプラスミドｐＬＨ７０２およびｐＹＺ０６７ΔｋｉｖＤΔｈＡＤＨで形質転換した。形質転換体をＰＮＹ１５５１と命名した。

【0233】

実施例１２：ＫＩＶＤ発酵
方法：
播種材料の調製
各菌株に対して、単一の凍結バイアルを解凍し、１２５ｍＬの通気口のある振とうフラスコ内の１０ｍＬの種培地へ移し、一晩の増殖させるために３０℃および３００ｒｐｍで振とうさせてインキュベートした。次に、５ｍＬの一晩培養物を、７５ｍＬの種培地を入れた２５０ｍＬの通気口のある振とうフラスコに移し、３０℃および３００ｒｐｍで振とうさせながら一晩増殖させた。培養物がＯＤ６００ １−２に達したら、フラスコ培養物を用いて１Ｌの発酵槽を播種した。種培地の組成は次の通りである：アミノ酸を含まない酵母窒素塩基（Ｄｉｆｃｏ）、６．７ｇ／Ｌ；ヒスチジン、ロイシン、トリプトファンおよびウラシルを含まないＹｅａｓｔ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｄｒｏｐ−ｏｕｔ Ｍｅｄｉｕｍ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ（Ｓｉｇｍａ）、２．８ｇ／Ｌ；Ｌ−ロイシン、２０ｍｇ／Ｌ；Ｌ−トリプトファン、４ｍｇ／Ｌ；チアミンＨＣｌ、２０ｍｇ／Ｌ；ナイアシン、２０ｍｇ／Ｌ；エタノール、３ｇ／Ｌ；グルコース１０ｇ／Ｌ。２０％の水酸化カリウムによりｐＨを５．２に調整し、培地を０．２２μフィルタによりろ過滅菌した。

【0234】

発酵槽の調製および操作：
発酵は１ＬのＢｉｏｓｔａｔ Ｂ ＤＣＵ３発酵槽（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，ＵＳＡ）内で行った。Ｐｒｉｍａ ＤＢ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐ．，ＵＳＡ）によりオフガスの組成をモニターした。オフガス中のイソブタノールおよびエタノールを測定するために、氷水浴に入れた、０．５Ｌの水を含む１リットルのＳｈｏｔｔボトルにまずガスを通した後、質量分析計に送った。発酵全体を通して、発酵槽の温度を３０℃に保持し、ｐＨを２０％のＫＯＨにより５．２に調節した。エアレーションを０．２標準リットル／分に調節し、攪拌を１００ｒｐｍに調節した。溶解酸素は調節せず、発酵の大部分の間検出されなかった。サンプルを抜き取り、ＹＳＩ Ｓｅｌｅｃｔ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＹＳＩ，Ｉｎｃ．，Ｙｅｌｌｏｗ Ｓｐｒｉｎｇｓ，Ｏｈｉｏ）によって、６００ｎｍにおける光学濃度およびグルコース濃度について分析した。この分析を用いる際、５０％（ｗ／ｗ）溶液を手で添加することによりグルコースを過剰（５〜２０ｇ／Ｌ）に保持した。

【0235】

発酵のために使用される培地を以下のように調製した：滅菌の前、４．０ｇの硫酸アンモニウムを含む５２０ｍＬの水、２．２ｇの一塩基性リン酸カリウム、１．５ｇの硫酸マグネシウム七水和物、および０．２ｍＬのＳｉｇｍａ Ａｎｔｉｆｏａｍ ２０４を発酵槽に移した。発酵槽を１２１℃で３０分間滅菌した。３０℃の設定点まで冷却した後、後滅菌成分をポンプにより無菌で添加した。後滅菌成分を２００ｍＬの全容積で作った：４．８ｍＬの微量ミネラル溶液（１Ｌの水中で調製：１５ｇのＥＤＴＡ、４．５ｇの硫酸亜鉛七水和物、０．８ｇの塩化マンガン無水物、０．３ｇの塩化コバルト六水和物、０．３ｇの硫酸銅五水和物、０．４ｇのモリブデン二ナトリム（ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｍｏｌｙｂｄｅｎｕｍ）無水物、４．５ｇの塩化カルシウム二水和物、３ｇの硫酸鉄七水和物、１ｇのホウ酸、０．１ｇのヨウ化カリウム）、０．８ｍＬのビタミン混合物（１Ｌの水中、５０ｍｇのビオチン、１ｇのパントテン酸Ｃａ、１ｇのニコチン酸、２５ｇのミオイノシトール、１ｇのピリドキソール（ｐｙｒｉｄｏｘｏｌ）塩酸塩、０．２ｇのｐ−アミノ安息香酸）、１６ｇのグルコース、３ｍＬのエタノール、１２．８ｍｇのＬ−ロイシン、３．２ｍｇのＬ−トリプトファン、２．２ｇのヒスチジン、ロイシン、トリプトファンおよびウラシルを含まないＹｅａｓｔ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｄｒｏｐ−ｏｕｔ Ｍｅｄｉｕｍ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ（Ｓｉｇｍａ）、チアミンＨＣｌを、特定の発酵に対して表１に示される量で添加し、容積が２００ｍＬになるように脱イオン水を添加し、発酵槽へ添加する前に溶液をろ過滅菌した。播種後の発酵槽の最終容積は８００ｍＬであった。

【0236】

培養上清中のグルコース、イソブタノール、および他の発酵副産物の測定は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｈカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＵＳＡ）を用いて、屈折率（ＲＩ）およびダイオードアレイ（２１０ｎｍ）検出器と、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ，ＵＳＡ）とによるＨＰＬＣによって行った。クロマトグラフ分離は、０．６ｍＬ／分の流速および４０℃のカラム温度で、移動相として０．０１ＮのＨ_２ＳＯ_４を用いて達成した。水トラップを発酵の最後にサンプリングし、同じＨＰＬＣ法により分析した。イソブタノールおよびエタノールの総量を決定するために、発酵槽から除去したトラップ中の水の重量も測定した。供給ボトル中のグルコース濃度は、Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ ＲＥ４０ Ｒｅｆｒａｃｔｏｍｅｔｅｒ（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ，ＵＳＡ）を用いて２０℃で決定した。報告される収率は消費されたグルコースに基づく。イソブタノールの収率には最後のサンプルの発酵ブロスおよび水トラップ中のイソブタノールが含まれる。図２は、各チアミン濃度において、各菌株のイソブタノールおよびα−ケトイソバレレートのモル収率を示す。図３は、各チアミン濃度において、α−ケトイソバレレートの濃度を各菌株の発酵時間に関して示す。

【0237】

【表35】

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]