特許 6093775 自動認識治療用Ｒ／ＤＮＡキメラナノ粒子（ＮＰ）

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6093775

(24)【登録日】2017年2月17日

(45)【発行日】2017年3月8日

(54)【発明の名称】自動認識治療用Ｒ／ＤＮＡキメラナノ粒子（ＮＰ）

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20170227BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20170227BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20170227BHJP

   A61P 31/10 20060101ALI20170227BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20170227BHJP

   A61P 33/00 20060101ALI20170227BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20170227BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 GZNA

   A61K31/713

   A61P31/04

   A61P31/10

   A61P31/14

   A61P33/00

   A61P35/00

【請求項の数】54

【全頁数】70

(21)【出願番号】特願2014-542565(P2014-542565)

(86)(22)【出願日】2012年11月19日

(65)【公表番号】特表2015-500005(P2015-500005A)

(43)【公表日】2015年1月5日

(86)【国際出願番号】US2012065945

(87)【国際公開番号】WO2013075140

(87)【国際公開日】20130523

【審査請求日】2015年11月19日

(31)【優先権主張番号】61/561,257

(32)【優先日】2011年11月17日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/698,113

(32)【優先日】2012年9月7日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】514124403

【氏名又は名称】ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ， アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー， デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ

(74)【代理人】

【識別番号】100102668

【弁理士】

【氏名又は名称】佐伯 憲生

(74)【代理人】

【識別番号】100182486

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 正展

(74)【代理人】

【識別番号】100189131

【弁理士】

【氏名又は名称】佐伯 拓郎

(74)【代理人】

【識別番号】100147289

【弁理士】

【氏名又は名称】佐伯 裕子

(74)【代理人】

【識別番号】100158872

【弁理士】

【氏名又は名称】牛山 直子

(72)【発明者】

【氏名】シャピロ， ブルース アレン

(72)【発明者】

【氏名】アフォーニン， キリル アンドレーヴィチ

(72)【発明者】

【氏名】ヴィヤール， マティアス デニス

(72)【発明者】

【氏名】ビンデヴァルト， エッカート エイチ． ユー．

【審査官】 宮岡 真衣

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２００９／０２３４１０９（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２０１０／００３５２３３（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特表２０１４−５３３９５３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 HOGREFE R.I. et al，Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids，25(2006)，p.889-907

【文献】 HOERTER J.A. et al，PLoS ONE，6(5)(2011 May)，e20359

【文献】 Zhang D.Y. et al，SCIENCE，318(2007)，p.1121-1125

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／１１３

Ａ６１Ｋ ３１／７１３

Ａ６１Ｐ ３１／０４

Ａ６１Ｐ ３１／１０

Ａ６１Ｐ ３１／１４

Ａ６１Ｐ ３３／００

Ａ６１Ｐ ３５／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

少なくとも２つのキメラナノ粒子を含むＲ／ＤＮＡキメラ多機能ナノ粒子（Ｒ／ＤＮＡ ＮＰ）であって、
第１キメラナノ粒子が、第１ＤＮＡオリゴヌクレオチド及びその長さに沿ってハイブリダイズする１又はそれ以上の相補的第１ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含み、
第２キメラナノ粒子が、第２ＤＮＡオリゴヌクレオチド及びその長さに沿ってハイブリダイズする１又はそれ以上の相補的第２ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含み、
第１ＤＮＡオリゴヌクレオチドが、第２ＤＮＡオリゴヌクレオチドに相補的であり、
１又はそれ以上の第１ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、１又はそれ以上の第２ＲＮＡオリゴヌクレオチドに相補的であり、
第１ＤＮＡオリゴヌクレオチドが、少なくとも５ヌクレオチドからなる５’トーホールド配列を含み、
第２ＤＮＡオリゴヌクレオチドが、少なくとも５ヌクレオチドからなり５’トーホールド配列に相補的な３’トーホールド配列を含み、
５’トーホールド及び３’トーホールドのハイブリダイゼーションとそれに続く相補的な第１ＲＮＡオリゴヌクレオチド及び第２ＲＮＡオリゴヌクレオチドの再会合によってＤＮＡ二重鎖と１又はそれ以上の機能的なＲＮＡ二重鎖が形成される、
Ｒ／ＤＮＡキメラ多機能ナノ粒子。

【請求項2】

前記１又はそれ以上の機能的なＲＮＡ二重鎖が、ダイサー基質を形成し、ダイサーによる切断後にｓｉＲＮＡに変換される、請求項１に記載のＲ／ＤＮＡキメラ多機能ナノ粒子。

【請求項3】

前記ｓｉＲＮＡが、標的ＲＮＡを阻害する、請求項２に記載のＲ／ＤＮＡキメラ多機能ナノ粒子。

【請求項4】

前記標的ＲＮＡが、阻害された場合に治療的に有利な結果を生じるものである、請求項３に記載のＲ／ＤＮＡキメラ多機能ナノ粒子。

【請求項5】

前記標的ＲＮＡが、疾患の経過及びその一部に関与するタンパク質をコードするＲＮＡを含む、請求項３又は４に記載のＲ／ＤＮＡキメラ多機能ナノ粒子。

【請求項6】

前記標的ＲＮＡが、アポトーシス阻害タンパク質をコードする、請求項３〜５のいずれか一項に記載のＲ／ＤＮＡキメラ多機能ナノ粒子。

【請求項7】

前記アポトーシス阻害タンパク質が、ＢＣＬ−２、ＦＬＩＰ、ＳＴＡＴ３及びＸＩＡＰからなる群から選択される、請求項６に記載のＲ／ＤＮＡキメラ多機能ナノ粒子。

【請求項8】

前記標的ＲＮＡが、病原性ＲＮＡゲノム、病原性物質のゲノム由来のＲＮＡ転写産物、又はそれらの一部である、請求項３〜５のいずれか一項に記載のＲ／ＤＮＡキメラ多機能ナノ粒子。

【請求項9】

前記第１キメラナノ粒子が、蛍光タグ、細胞取り込みを促進するＲＮＡ−フルオロフォア複合体ドメイン、スプリット機能性ドメイン、スプリットリパーゼ及びスプリットＧＦＰからなる群から選択される第１機能性部分を含む、請求項１に記載のＲ／ＤＮＡキメラ多機能ナノ粒子。

【請求項10】

前記第２キメラナノ粒子が、蛍光タグ、細胞取り込みを促進するＲＮＡ−フルオロフォア複合体ドメイン、スプリット機能性ドメイン、スプリットリパーゼ及びスプリットＧＦＰからなる群から選択される第２機能性部分を含む、請求項９に記載のＲ／ＤＮＡキメラ多機能ナノ粒子。

【請求項11】

前記第１又は第２機能性部分が、認識ドメインである、請求項９又は１０に記載のＲ／ＤＮＡキメラ多機能ナノ粒子。

【請求項12】

前記認識ドメインが、認識標的に結合する、請求項１１に記載のＲ／ＤＮＡキメラ多機能ナノ粒子。

【請求項13】

前記認識標的が、標的細胞上に位置するか、又はその中に位置する、請求項１２に記載のＲ／ＤＮＡキメラ多機能ナノ粒子。

【請求項14】

前記標的細胞が、疾患細胞である、請求項１３に記載のＲ／ＤＮＡキメラ多機能ナノ粒子。

【請求項15】

前記疾患細胞が、腫瘍形成細胞、病原性物質に感染した細胞及び遺伝的障害を有する細胞からなる群から選択される、請求項１４に記載のＲ／ＤＮＡキメラ多機能ナノ粒子。

【請求項16】

前記認識ドメインが、核酸分子、ポリペプチド、又はそれらのフラグメントに特異的に結合する、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載のＲ／ＤＮＡキメラ多機能ナノ粒子。

【請求項17】

前記認識ドメインが、細胞膜ポリペプチド又は細胞膜構造に特異的に結合する、請求項１６に記載のＲ／ＤＮＡキメラ多機能ナノ粒子。

【請求項18】

前記細胞膜ポリペプチド又は細胞膜構造が、癌特異的膜タンパク質又は構造である、請求項１７に記載のＲ／ＤＮＡキメラ多機能ナノ粒子。

【請求項19】

前記認識ドメインが、アプタマーである、請求項１１〜１８のいずれか一項に記載のＲ／ＤＮＡキメラ多機能ナノ粒子。

【請求項20】

前記５’トーホールドが５〜５０ヌクレオチドを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のＲ／ＤＮＡキメラ多機能ナノ粒子。

【請求項21】

前記５’トーホールドが５〜３０ヌクレオチドを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のＲ／ＤＮＡキメラ多機能ナノ粒子。

【請求項22】

前記３’トーホールドが５〜５０ヌクレオチドを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のＲ／ＤＮＡキメラ多機能ナノ粒子。

【請求項23】

前記３’トーホールドが５〜３０ヌクレオチドを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のＲ／ＤＮＡキメラ多機能ナノ粒子。

【請求項24】

少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のＲ／ＤＮＡキメラ多機能ナノ粒子。

【請求項25】

前記修飾ヌクレオチドが、ロックド核酸（ＬＮＡ）、２’フルオロアミダイト及び２’ＯＭｅ ＲＮＡアミダイトからなる群から選択される、請求項２４に記載のＲ／ＤＮＡキメラ多機能ナノ粒子。

【請求項26】

前記Ｒ／ＤＮＡキメラ多機能ナノ粒子が、少なくとも１組の追加のキメラナノ粒子を更に含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載のＲ／ＤＮＡキメラ多機能ナノ粒子。

【請求項27】

一方の追加のキメラナノ粒子が３’トーホールド配列を含み、他方の追加のキメラナノ粒子が相補的５’トーホールド配列を含む、請求項２６に記載のＲ／ＤＮＡキメラ多機能ナノ粒子。

【請求項28】

請求項１〜２７のいずれか一項に記載のＲ／ＤＮＡキメラ多機能ナノ粒子を含む組成物。

【請求項29】

請求項１〜２７のいずれか一項に記載のＲ／ＤＮＡキメラ多機能ナノ粒子を含む医薬組成物。

【請求項30】

薬学的に許容可能な賦形剤、担体又は希釈剤を更に含む、請求項２９に記載の医薬組成物。

【請求項31】

前記医薬組成物が疾患の治療用に製剤化される、請求項２９又は３０に記載の医薬組成物。

【請求項32】

前記医薬組成物が病原性物質による感染症の治療用に製剤化される、請求項３１に記載の医薬組成物。

【請求項33】

前記病原性物質がウイルス、細菌、真菌又は寄生体である、請求項３２に記載の医薬組成物。

【請求項34】

前記病原性物質がウイルスである、請求項３３に記載の医薬組成物。

【請求項35】

前記病原性物質がＲＮＡウイルスである、請求項３４に記載の医薬組成物。

【請求項36】

前記医薬組成物が、病原性物質による感染と関連する症状を治療又は低減する第２剤を更に含む、請求項３２〜３５のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項37】

前記第２剤が抗ウイルス剤である、請求項３６に記載の医薬組成物。

【請求項38】

前記医薬組成物が腫瘍形成の治療用に製剤化される、請求項３１に記載の医薬組成物。

【請求項39】

前記医薬組成物が、腫瘍形成と関連する症状を治療又は低減する第２剤を更に含む、請求項３８に記載の医薬組成物。

【請求項40】

前記第２剤が抗癌剤である、請求項３９に記載の医薬組成物。

【請求項41】

請求項１〜２７のいずれか一項に記載のＲ／ＤＮＡキメラ多機能ナノ粒子、又は請求項２８〜４０のいずれか一項に記載の組成物を含む、キット。

【請求項42】

前記キットが第２治療剤を更に含む、請求項４１に記載のキット。

【請求項43】

前記第２治療剤が抗癌剤又は病原性物質による感染症と関連する症状を治療若しくは低減する剤である、請求項４２に記載のキット。

【請求項44】

前記キットが標的遺伝子の選択的阻害に使用される、請求項４１〜４３のいずれか一項に記載のキット。

【請求項45】

前記キットがＲＮＡの選択的阻害に対するキットの使用のための説明書を含む、請求項４４に記載のキット。

【請求項46】

前記キットがＲＮＡの阻害のために使用される、請求項４１〜４３のいずれか一項に記載のキット。

【請求項47】

前記キットがＲＮＡの選択的阻害のための説明書を含む、請求項４６に記載のキット。

【請求項48】

前記キットが腫瘍形成の治療のために使用される、請求項４１〜４３のいずれか一項に記載のキット。

【請求項49】

前記キットが新生物の治療のための説明書を含む、請求項４８に記載のキット。

【請求項50】

前記キットが病原性感染症の治療に使用される、請求項４１〜４３のいずれか一項に記載のキット。

【請求項51】

前記キットが病原性感染症の治療のための説明書を含む、請求項５０に記載のキット。

【請求項52】

前記病原性物質がウイルス、細菌、真菌又は寄生体である、請求項５０又は５１に記載のキット。

【請求項53】

前記病原性物質がウイルスである、請求項５２に記載のキット。

【請求項54】

前記ウイルスがＲＮＡウイルスである、請求項５３に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年１１月１７日付で出願された米国仮出願番号第６１／５６１，２５７号及び２０１２年９月７日付で出願された米国仮出願番号第６１／６９８，１１３号の利益を主張し、これらの内容はその全体において参照により援用される。

【0002】

連邦政府による委託研究のもと行われた発明に対する権利に関する記載
本研究は、米国保健研究所の支援を受けた。政府は、本発明について一定の権利を有する。

【背景技術】

【0003】

過去数年において、生物医学適用のためのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の使用に対する関心が非常に高まっている。ＲＮＡｉは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、並びに一組の具体的なタンパク質及び酵素を利用する遺伝子サイレンシングの転写後配列特異的プロセスである。簡単に作用機構を説明すると、ＲＮａｓｅＩＩＩ様酵素であるダイサーが、ｄｓＲＮＡを短い二重鎖（２１〜２３ｂｐ）へとプロセッシングする。これらの短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる二重鎖は、その後ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）へとロードされ、パッセンジャー又はセンスと呼ばれる一方のｓｉＲＮＡ鎖が廃棄される。ガイド又はアンチセンスと呼ばれる他方の鎖は、切断及び翻訳の阻止の対象となる標的ｍＲＮＡを認識するためにＲＩＳＣにより使用される。ＲＮＡｉは、癌及びＨＩＶの治療法としての使用可能性を示す、様々な種において特定の目的遺伝子の選択的な抑制のための強力な技術となった。特定の目的遺伝子に対する合成ｓｉＲＮＡは、細胞内へと外因的に導入されてＲＮＡｉを活性化する。更に、ｓｉＲＮＡよりわずかに長い合成非対照ダイサー基質（２５ｂｐ）の導入は、サイレンシングの有効性を非常に高める。これは、ＲＩＳＣ複合体をｓｉＲＮＡでロードするプロセスにおけるＤｉｃｅｒの関与により説明される。ｓｉＲＮＡの可能性にもかかわらず、ＲＮＡｉの臨床での輸送に関連する幾つかの課題を克服する新規なアプローチが必要とされている。

【0004】

本明細書に記載されるように、本発明は、Ｄｉｃｅｒ基質ｓｉＲＮＡ二重鎖の機能性を２つのＲ／ＤＮＡハイブリッドへと分割し、これら２つのハイブリッドは同じ罹患細胞内に同時に存在する場合にトーホールド相互作用を介して互いに認識し、活性なｓｉＲＮＡを放出しながら再会合する。この新規なアプローチは、静脈内分解（Ｒ／ＤＮＡハイブリッドに関して減少する）、組織特異性（ＤＮＡ化学はＲＮＡよりも簡素であり、ターゲッティング又は輸送に関する様々な特徴による化学的修飾を受容する）、薬力学（蛍光タグはＲ／ＤＮＡハイブリッドの再会合に際して活性化され得、輸送及び反応を画像化するフェルスター共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を補佐する）等のＲＮＡｉの臨床での輸送に関連する幾つかの課題を克服する。更に、これら全ての追加の機能性を、Ｒ／ＤＮＡハイブリッド中のＤＮＡ鎖の化学修飾を介して導入することができ、従って、放出されたｓｉＲＮＡの処理能力を干渉しない。また、これらの機能性の数は、二重鎖ハイブリッド又はより複雑なハイブリッドナノ構造の組成物中に入るＤＮＡ鎖の数の少なくとも２倍の多さであってもよい。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明は、再構成して機能性ｄｓＲＮＡを産生することが可能な、Ｒ／ＤＮＡキメラ多機能ナノ粒子を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0006】

一態様では、本発明は、概して第１ＤＮＡオリゴヌクレオチド及び相補的第１ＲＮＡオリゴヌクレオチドを有する第１キメラナノ粒子、並びに第２ＤＮＡオリゴヌクレオチド及び相補的第２ＲＮＡオリゴヌクレオチドを有する第２キメラナノ粒子の少なくとも２つのキメラナノ粒子を有し、第１ＤＮＡオリゴヌクレオチドが５’トーホールド配列を有し、かつ第２ＤＮＡオリゴヌクレオチドが３’トーホールド配列を有する、Ｒ／ＤＮＡキメラ多機能ナノ粒子（Ｒ／ＤＮＡ ＮＰ）を特徴とする。実施形態では、第１ＲＮＡは第２ＲＮＡに相補的であり、二重鎖の場合ｓｉＲＮＡを形成する。

【0007】

実施形態では、Ｒ／ＤＮＡ ＮＰは相補的な５’及び３’トーホールド配列を有する別のキメラナノ粒子対を含有する。

【0008】

実施形態では、第１ＲＮＡオリゴヌクレオチドは少なくとも２つのＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。関連する実施形態では、第２ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、第１ＲＮＡオリゴヌクレオチドを構成する少なくとも２つのＲＮＡオリゴヌクレオチドに対応する少なくとも２つのＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。実施形態では、相補的ＲＮＡオリゴヌクレオチドの二重鎖形態は、ｓｉＲＮＡである。

【0009】

実施形態では、第１キメラナノ粒子及び第２キメラナノ粒子は各々、互いに及びＤＮＡオリゴヌクレオチドに相補的な少なくとも１つの追加のＲＮＡを含む。関連する実施形態では、少なくとも１つの追加のＲＮＡの二重鎖形態はｓｉＲＮＡである。

【0010】

実施形態では、５’トーホールドは、５〜５０ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、５’トーホールドは１２〜３０ヌクレオチドを含む。

【0011】

実施形態では、３’トーホールドは、５〜５０ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、３’トーホールドは１２〜３０ヌクレオチドを含む。

【0012】

実施形態では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドはロックド核酸（ＬＡＮ）、２’フルオロアミダイト及び２’ＯＭｅ ＲＮＡアミダイトからなる群から選択される。

【0013】

実施形態では、ｓｉＲＮＡは標的ＲＮＡを阻害する。一般的に、標的ＲＮＡは阻害された場合に治療的に有利な結果を生むものである。実施形態では、標的ＲＮＡは、疾患の進行又はその一部に関与するタンパク質をコードするＲＮＡを含む。

【0014】

関連する実施形態では、標的ＲＮＡは、アポトーシス阻害タンパク質又はその一部（例えば、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ＢＣＬ−２、ＦＬＩＰ、ＳＴＡＴ３及びＸＩＡＰ）をコードするＲＮＡを含む。

【0015】

関連する実施形態では、標的ＲＮＡは病原性ＲＮＡゲノム、すなわち病原性物質のゲノムに由来するＲＮＡ転写産物又はその一部である。一部の実施形態では、標的ＲＮＡはウイルスＲＮＡゲノム又はその一部（例えば、ＨＩＶゲノム）である。

【0016】

上記態様及び実施形態のいずれにおいても、第１キメラナノ粒子は、第１機能性部分を含み得る。

【0017】

上記態様及び実施形態のいずれにおいても、第２キメラナノ粒子は、第２機能性部分を含み得る。

【0018】

関連する実施形態では、第１及び／又は第２機能性部分は、認識ドメインである。実施形態では、認識ドメインは、認識標的に結合する。認識標的は標的細胞上又はその中に位置し得る。

【0019】

実施形態では、標的細胞は疾患細胞（例えば、新生物細胞、病原体に感染した細胞、又は遺伝障害を有する細胞）である。

【0020】

実施形態では、認識ドメインは、核酸分子、ポリペプチド又はそれらの断片に特異的に結合する。

【0021】

実施形態では、蛍光タグ、細胞内取り込みを促進するドメイン、スプリット機能性ドメイン、スプリットリパーゼ及びスプリットＧＦＰ。また、一部の実施形態では、機能性部分は、会合に際してシグナルを発するＲＮＡ−フルオロフォア複合体であってもよい。Ｐａｉｇｅ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３３：６４２−６４６（２０１１）を参照されたい。

【0022】

実施形態では、認識ドメインはアプタマーである。実施形態では、アプタマーは、細胞膜ポリペプチド又は細胞膜構造を結合する。細胞膜ポリペプチド又は細胞膜構造は、疾患特異的膜タンパク質又は構造（例えば、癌特異的膜タンパク質又は構造、病原性物質による感染と関連する特異的膜タンパク質又は構造等）であり得る。実施形態では、アプタマーは、細胞中の分子を結合する。例えば、アプタマーは、標的細胞中の核酸分子又はその一部（例えば、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子又はそれらのフラグメント）を結合し得る。

【0023】

一部の実施形態では、Ｒ／ＤＮＡ ＮＰは、少なくとも１つの本明細書（明細書及び図面）に記載される配列を含有する。

【0024】

別の態様では、本発明は、本明細書に記載されるＲ／ＤＮＡ ＮＰを使用する方法を特徴とする。

【0025】

態様では、本発明は、細胞における標的遺伝子の発現を阻害又は低減する方法を特徴とする。実施形態では、前記方法は、細胞と、治療的有効量の本明細書に記載される少なくとも１つのＲ／ＤＮＡ ＮＰとを接触させることを含む。実施形態では、細胞は被験体内にある。

【0026】

態様では、本発明は病原体に感染した細胞を死滅させる方法を特徴とする。実施形態では、前記方法は、細胞と、治療的有効量の本明細書に記載される少なくとも１つのＲ／ＤＮＡ ＮＰを接触させることを含む。実施形態では、細胞は被験体内にある。

【0027】

態様では、本発明は、細胞における病原体の複製を阻害する方法を特徴とする。態様では、前記方法は、細胞と、治療的有効量の本明細書に記載される少なくとも１つのＲ／ＤＮＡ ＮＰを接触させることを含む。実施形態では、細胞は被験体内にある。

【0028】

態様では、本発明は、被験体における病原性負荷を低減する方法を特徴とする。実施形態では、前記方法は、治療的有効量の治療的有効量の本明細書に記載される少なくとも１つのＲ／ＤＮＡ ＮＰを投与することを含む。実施形態では、被験体は病原性感染症を発症するリスクがある。実施形態では、前記被験体は病原性感染症に罹患していると診断されている。

【0029】

態様では、本発明は、被験体における病原性感染症を治療又は予防する方法を特徴とする。実施形態では、前記方法は、治療的有効量の治療的有効量の本明細書に記載される少なくとも１つのＲ／ＤＮＡ ＮＰを投与することを含む。実施形態では、前記方法は、病原性負荷を低減することにより、病原性感染症を治療又は予防する。実施形態では、前記方法は、感染した細胞の死を誘導することにより、病原性感染症を予防又は治療する。

【0030】

上記態様及び実施形態のいずれにおいても、前記被験体は哺乳類（例えば、ヒト）であり得る。

【0031】

上記態様及び実施形態のいずれにおいても、前記病原体はウイルス、細菌、真菌又は寄生体であり得る。一部の実施形態では、病原体はウイルス（例えば、ＨＩＶ）である。

【0032】

上記態様及び実施形態のいずれにおいても、前記方法は、前記細胞と治療的有効量の第２治療剤を更に接触させることを含むか、又は治療的有効量の第２治療剤を被験体に更に投与することを含み得る。第２治療剤は、病原性感染症又は病原性感染症に関連する症状を治療し得る。例えば、第２治療剤は、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗真菌剤又は駆虫剤であり得る。かかる薬剤は当該技術分野においてよく知られており、第２治療剤の適切な用量を選択及び決定することは内科医の権限の範囲内である。例えば、それらの内容が全体において参照により援用される、Ｄｒｕｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ：Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｏｒ Ａｌｌ Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ ａｎｄ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌｓ，２０^ｔｈ Ｅｄ．，Ｃ．Ｆ．Ｌａｃｙ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）（Ｌｅｘｉ−Ｃｏｍｐ ２０１１）；Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ ＡＢＸ Ｇｕｉｄｅ：Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ＆Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，２^ｎｄ Ｅｄ．，Ｊ．Ｇ．Ｂａｒｔｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）（Ｊｏｎｅｓ＆Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ ２０１０）；及びＭａｎｄｅｌｌ，Ｄｏｕｇｌａｓ，ａｎｄ Ｂｅｎｎｅｔｔ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ｅｘｐｅｒｔ Ｃｏｎｓｕｌｔ Ｐｒｅｍｉｕｍ Ｅｄｉｔｉｏｎ，７^ｔｈ Ｅｄ．，Ｇ．Ｌ．Ｍａｎｄｅｌｌ（ｅｄ．）（Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ ２００９）；Ｔｈｅ Ｓａｎｆｏｒｄ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０１２，４２^ｎｄ Ｅｄ．，Ｄ．Ｎ．Ｇｉｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０１２）；Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ２０１３，１１^ｔｈ Ｅｄ．，Ｃ．Ｇ．Ｗｅｂｅｒ（ｅｄ．）（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃａｒｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ２０１２）を参照されたい。

【0033】

態様では、本発明は、新生物細胞を死滅させる方法を特徴とする。実施形態では、前記方法は、細胞と、治療的有効量の本明細書に記載される少なくとも１つのＲ／ＤＮＡ ＮＰを接触させることを含む。実施形態では、細胞は被験体内にある。

【0034】

態様では、本発明は、腫瘍形成を有する被験体を治療する方法を特徴とする。実施形態では、前記方法は、治療的有効量の治療的有効量の本明細書に記載される少なくとも１つのＲ／ＤＮＡ ＮＰを投与することを含む。

【0035】

実施形態では、腫瘍形成細胞は、固形腫瘍に存在する癌細胞である。実施形態では、癌は、乳癌、前立腺癌、黒色腫、神経膠芽腫、結腸癌、卵巣癌及び非小細胞性肺癌からなる群から選択される。

【0036】

関連する実施形態では、前記方法は、前記細胞と治療的有効量の第２治療剤を接触させることを含むか、又は治療的有効量の第２治療剤を被験体に投与することを含み得る。一部の実施形態では、第２治療剤は抗癌剤である。抗癌剤は、当該技術分野においてよく知られており、任意のかかる薬剤は本発明における使用に好適である。例えば、それらの内容が全体において参照により援用される、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ：Ｄｅｓｉｇｎ，Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（Ｃａｎｃｅｒ Ｅｔｉｏｌｏｇｙ，Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ）（ｅｄｓ．Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｐ．＆ Ｈｏｌｔ，Ｗ．）（Ｎｏｖａ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，２０１１）；Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（ｅｄ．Ｇｕｌｌａｔｔｅ）（Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｎｕｒｓｉｎｇ Ｓｏｃｉｅｔｙ，２００７）；Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ａｎｄ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（ｅｄｓ．Ｐｏｌｏｖｉｃｈ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．）（Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｎｕｒｓｉｎｇ Ｓｏｃｉｅｔｙ，２００９）；Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ Ｄｒｕｇ Ｍａｎｕａｌ ２０１２（ｅｄｓ．Ｃｈｕ，Ｅ．＆ＤｅＶｉｔａ，Ｊｒ．，Ｖ．Ｔ．）（Ｊｏｎｅｓ＆Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｌｅａｒｎｉｎｇ，２０１１）；ＤｅＶｉｔａ，Ｈｅｌｌｍａｎ，ａｎｄ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ’ｓ Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（ｅｄｓ．ＤｅＶｉｔａ，Ｊｒ．，Ｖ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．）（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２０１１）；及びＣｌｉｎｉｃａｌ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（ｅｄｓ．Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎ，Ｌ．Ｌ．＆Ｔｅｐｐｅｒ，Ｊ．Ｅ．）（Ｓａｕｎｄｅｒｓ）（２０１１）を参照されたい。例えば、抗癌剤の非限定的な例として、アビラテロンアセテート、アファチニブ、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アリトレチノイン、アルトレタミン、アミホスチン、アミノグルテチミド、アナグレリド、アナストロゾール、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、アザシチジン、アザチオプリン、ベンダムスチン、ベバシズマブ、ベキサロチン（Ｂｅｘａｒｏｔｉｎｅ）、ビカルタミド、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、セツキシマブ、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クリゾチニブ、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダサチニブ、ダウノルビシン、デニロイキンジフチトクス、デシタビン、ドセタキセル、デキサメタゾン、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エポエチンアルファ、エポチロン、エルロチニブ、エストラムスチン、エチノスタット（Ｅｔｉｎｏｓｔａｔ）、エトポシド、エベロリムス、エキセメスタン、フィルグラスチム、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、葉酸結合アルカロイド、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゲムツズマブオゾガマイシン、ＧＭ−ＣＴ−０１、ゴセレリン、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシウレア、イブリツモマブ、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、イリノテカン、イクサベピロン、ラパチニブ、ロイコボリン、ロイプロリド、レナリドマイド、レトロゾール、ロムスチン、メクロレタミン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、ネララビン、ニロチニブ、ニルタミド、オクトレオチド、オファツムマブ、オプレルベキン、オキサリプラチン、パクリタキセル、パニツムマブ、ペメトレキセド、ペントスタチン、多糖類ガレクチン阻害剤、プロカルバジン、ラロキシフェン、レチノイン酸、リツキシマブ、ロミプロスチム、サルグラモスチム、ソラフェニブ、ストレプトゾシン、スニチニブ、タモキシフェン、テムシロリムス、テモゾラミド、テニポシド、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、チオグアニン、トポテカン、トレミフェン、トシツモマブ、トラメチニブ、トラスツズマブ、トレチノイン、バルルビシン、ＶＥＧＦ阻害剤及びトラップ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ビンタフォリド（ＥＣ１４５）、ボリノスタット又はこれらの塩が挙げられる。

【0037】

上記態様及び実施形態のいずれにおいても、病原体は、当該技術分野において公知の任意のウイルス、細菌、真菌又は寄生体であり得る。例えば、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ２０１３，１１^ｔｈ Ｅｄ．，Ｃ．Ｇ．Ｗｅｂｅｒ（ｅｄ．）（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃａｒｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ２０１２）を参照されたい。

【0038】

細菌性病原体の例として、アエロバクター、アエロモナス、アシネトバクター、アクチノミセス・イスラエリイ、アグロバクテリウム、バチルス、炭疽菌、バクテロイデス、バルトネラ、ボルデテラ、ボルテラ、ボレリア、ブルセラ、バークホルデリア、カリマトバクテリウム、カンピロバクター、シトロバクター、クロストリジウム、ウェルシュ菌、破傷風菌、コリネバクテリウム、コリネバクテリウム・ジフテリエ、コリネバクテリウム属、エンテロバクター、エンテロバクター・アエロゲネス、エンテロコッカス、豚丹毒菌、大腸菌、フランシセラ、フゾバクテリウム・ヌクレアタム、ガードネレラ、ヘモフィルス、ハフニア、ヘリコバクター、クレブシエラ、肺炎桿菌、乳酸桿菌、レジオネラ、レプトスピラ、リステリア、モルガネラ、モラクセラ、マイコバクテリウム、ナイセリア、パスツレラ、パスツレラ・ムルトシダ、プロテウス、プロビデンシア、シュードモナス、リケッチア、サルモネラ、セラチア、赤痢菌、ブドウ球菌、ステントロホモナス（Ｓｔｅｎｔｏｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）、連鎖球菌、ストレプトバシラス・モニリフォルミス、トレポネーマ、梅毒トレポネーマ、フランベジアトレポネーマ、キサントモナス、ビブリオ及びエルシニアが挙げられるが、これらに限定されない。

【0039】

ウイルスの例として、レトロウイルス科（例えば、ＨＩＶ−１（ＨＤＴＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶＥ若しくはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶとも呼ばれる、又はＨＩＶ−ＩＩＩ等のヒト免疫不全ウイルス；及びＨＩＶ−ＬＰ等の他の分離株；ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；カルシウイルス科（Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、胃腸炎を引き起こす株）；トガウイルス科（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；フラウイルス科（Ｆｌａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、デング熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、黄熱ウイルス）；コロノウイルス科（Ｃｏｒｏｎｏｖｉｒｕｓ）（例えば、コロナウイルス）；ラブドウイルス科（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（例えば、エボラウイルス）；パラミクソウイルス科（例えば、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）；オルソミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルス）；ブンガウイルス科（Ｂｕｎｇａｖｉｒｉｄｅａ）（例えば、ハンターンウイルス、ブンガウイルス（ｂｕｎｇａ ｖｉｒｕｓ）、フレボウイルス及びナイロウイルス）；アレナウイルス科（出血熱ウイルス）；レオウイルス科（例えば、レオウイルス、オルビウイルス及びロタウイルス）；ビルナウイルス科；ヘパドナウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（パルボウイルス）；パポーバウイルス科（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；アデノウイルス科（殆どのアデノウイルス）；ヘルペスウイルス科（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１及び２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス；ポックスウイルス科（痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）、及びイリドウイルス科（例えば、アフリカ豚コレラウイルス）；並びに未分類ウイルス（例えば、Ｄ型肝炎の作用因子（Ｂ型肝炎ウイルスの欠陥サテライトウイルスと考えられている）、非Ａ非Ｂ型肝炎の作用因子（クラス１＝内部感染；クラス２＝非経口感染（すなわち、Ｃ型肝炎）；ノーウォーク及び関連ウイルス、並びにアストロウイルス）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0040】

病原性真菌の例として、限定されることなく、アルテルナリア、アスペルギルス、バシディオボールス、ビポラリス、ブラストシゾミセス、カンジダ、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・クルセイ、カンジダ・グラブラタ（旧名トルロプシス・グラブラタ）、カンジダ・パラプシロシス、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・プソイドトロピカリス、カンジダ・グイリエルモンディ、カンジダ・ドゥブリニエンシス及びカンジダ・ルシタニエ、コクシジオイデス、クラドフィアロフォラ、クリプトコッカス、カニングハメラ、カーブラリア、エクソフィアラ、フォンセケア、ヒストプラズマ、マズレラ、マラセチア、プラストミセス（Ｐｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ）、ロドトルラ、スケドスポリウム、スコプラリオプシス、スポロボロマイセス、白癬及びトリコスポロンが挙げられる。

【0041】

寄生体は、細胞内であるか細胞外であるかに基づいて分類される。本明細書で使用される「細胞内寄生体」は、その生活環全体が細胞内にある寄生体である。ヒト細胞内寄生体として、リーシュマニア、マラリア原虫、クルーズトリパノソーマ、トキソプラズマ原虫、バベシア、及び旋毛虫が挙げられる。本明細書で使用される「細胞外寄生体」は、その生活環全体が細胞外にある寄生体である。ヒトに感染し得る細胞外寄生体として、赤痢アメーバ、ランブル鞭毛虫、エンテロシトゾーン・ビエヌーシ、ネグレリア及びアカントアメーバ、並びに殆どの蠕虫が挙げられる。更に別の種類の寄生体は、主に細胞外であるが、生活環の中で危機的な段階には偏性に細胞内に存在すると定義される。かかる寄生体は本明細書において「偏性細胞内寄生体」と呼ぶ。これらの寄生体は、それらの生涯の大半又は生涯の一部のみが細胞外環境に存在し得るが、それら全てが生活環の中で少なくとも（ａｔ ｌｅｓｔ）１度の偏性細胞内段階を有する。この後者の分類の寄生体として、ローデシアトリパノソーマ及びガンビアトリパノソーマ、イソスポラ、クリプトスポリジウム、アイメリア、ネオスポラ、サルコシスチス、並びに住血吸虫が挙げられる。一態様では、本発明は、細胞内寄生体及び生活環において少なくとも１度の細胞内段階を有する偏性細胞内寄生体により生じる感染症の予防及び治療に関する。一部の実施形態では、本発明は、細胞内に優勢である偏性細胞内寄生体による感染症の予防を対象とする。本発明の一部の態様に関する寄生体の非限定的な一覧の例として、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、並びに三日熱マラリア原虫等のマラリア原虫属及びトキソプラズマ原虫が挙げられる。血液媒介寄生体及び／又は組織寄生体として、プラスモジウム属、バベシアミクロティ、多型バベシア、熱帯リーシュマニア、リーシュマニア属、ブラジルリーシュマニア、ドノバンリーシュマニア、ガンビアトリパノソーマ及びローデシアトリパノソーマ（アフリカ睡眠病）、クルーズトリパノソーマ（シャーガス病）、並びにトキソプラズマ原虫が挙げられる。血液媒介寄生体及び／又は組織寄生体として、プラスモジウム、バベシアミクロティ、多型バベシア、熱帯リーシュマニア、リーシュマニア、ブラジルリーシュマニア、ドノバンリーシュマニア、ガンビアトリパノソーマ及びローデシアトリパノソーマ（アフリカ睡眠病）、クルーズトリパノソーマ（シャーガス病）、並びにトキソプラズマ原虫が挙げられる。

【0042】

また、本発明は、本明細書に記載される少なくとも１つのＲ／ＤＮＡ ＮＰを含有する組成物（医薬組成物を含む）を特徴とする。また、実施形態では、前記組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤、担体又は希釈剤をも含有する。

【0043】

実施形態では、前記組成物は、本明細書に記載される少なくとも１つの方法に使用される。

【0044】

実施形態では、前記組成物は、少なくとも１つの追加の治療剤を更に含有する。一部の実施形態では、第２治療剤は、病原性物質による感染症と関連する症状を治療又は低減する。一部の実施形態では、第２治療剤は抗癌剤である。

【0045】

本発明は、本明細書に記載されるＲ／ＤＮＡ ＮＰ及び／又は組成物を含むキットを更に特徴とする。実施形態では、前記キットは、本明細書に記載される少なくとも１つの方法に使用される。関連する実施形態では、前記キットは、本明細書に記載される少なくとも１つの方法におけるキットの使用に関する指示書を更に含む。

【0046】

一部の実施形態では、前記キットは、少なくとも１つの追加の治療剤を含む。実施形態では、第２治療剤は、病原性物質による感染症と関連する症状を治療又は低減する。実施形態では、第２治療剤は抗癌剤である。

【0047】

ＲＮＡｉ経路並びに標的とされる細胞又は疾患細胞内の他の機能性を誘発する手段である、コンピューターにより設計された治療用Ｒ／ＤＮＡキメラ多機能ナノ粒子（Ｒ／ＤＮＡ ＮＰ）が記載される。治療用Ｒ／ＤＮＡ ＮＰは、２つのＤＮＡ及び２つのＲＮＡが互いに相補的である、少なくとも一対のＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖である。ＤＮＡ分子は、相補的なトーホールド配列を有する。各Ｒ／ＤＮＡ ＮＰにおけるトーホールド配列は、分子を再会合させ、ＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖及びＲＮＡ／ＲＮＡ二重鎖を生じる。ＲＮＡ／ＲＮＡ二重鎖は、標的ＲＮＡを阻害するｓｉＲＮＡとなるように設計される。標的ＲＮＡは、それをサイレンシングすることにより治療的効果を有する任意の転写産物であり得る。従って、Ｒ／ＤＮＡ ＮＰは、ｓｉＲＮＡが使用されるか、又は使用が考慮される任意の状況において使用され得る。また、Ｒ／ＤＮＡ ＮＰ分子は、様々な分子に結合する部分も有し得る。例えば、前記部分は、目的細胞（例えば、疾患細胞、新生物細胞又はウイルスに感染した細胞、例えばＨＩＶ感染細胞）上のみに存在する細胞表面タンパク質に結合し得る。従って、前記粒子は、そこで標的遺伝子を阻害することが意図される特定の細胞（例えば、新生物細胞、感染細胞を含む疾患細胞）を標的とし、それに進入する。再会合に続き、ｓｉＲＮＡは活性化され、標的遺伝子の阻害をもたらし、治療的に望ましい効果（例えば、新生物細胞又は感染細胞の死）を生じる。

【0048】

本発明の更なる目的及び利点は、一部は以下の記載において明らかにされ、また一部は本明細書から自明であるか、又は本発明の実施により理解されるであろう。本発明の目的及び利点は、添付の特許請求の範囲において指摘されるものを含み、本明細書に開示される要素及び組み合わせの手段により具現化され、達成されるであろう。上記の総合的な記載及び以下の詳細な記載は、両者とも例示及び説明であるにすぎず、請求項に記載される本発明を制限するものではないことが理解されるべきである。本出願に組み込まれ、本出願の一部を構成する添付の図面は、明細書と共に、本発明の幾つかの実施形態を図解し、本発明の原理を説明する役割を果たす。

【0049】

定義
「治療用Ｒ／ＤＮＡキメラ多機能ナノ粒子」又は「Ｒ／ＤＮＡ ＮＰ」は、ＤＮＡ分子とＲＮＡ分子が相補的である一対のＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド分子を意味する。第１Ｒ／ＤＮＡ ＮＰのＤＮＡ分子は、３’トーホールド配列を有し、第２Ｒ／ＤＮＡ ＮＰのＤＮＡ分子は５’トーホールド配列を有する。３’及び５’トーホールド配列は、互いに相補的である。２つのＲ／ＤＮＡ ＮＰを混合すると、トーホールド配列は、２つのＲ／ＤＮＡ ＮＰの再会合を生じる二重鎖を形成する。再会合の最終結果は、ＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖及びＲＮＡ／ＲＮＡ二重鎖であり、ここで、ＲＮＡ／ＲＮＡ二重鎖は標的ＲＮＡを阻害するｓｉＲＮＡとして作用するように設計されている。

【0050】

「トーホールド」は、核酸の１本鎖伸長を意味する。Ｒ／ＤＮＡ ＮＰは、相補的なトーホールドの結合が２つのＲ／ＤＮＡ ＮＰ間の再会合を生じる、相補的なトーホールドを含有する。本明細書で記載されるトーホールドは、５〜５０ヌクレオチド長であり、好ましくは１２〜３０ヌクレオチド長である。

【0051】

「標的ＲＮＡ」又は「標的ヒトＲＮＡ」は、その阻害が治療的に有益である機能性を有するポリペプチドをコードするＲＮＡを意味する。

【0052】

「物質（ａｇｅｎｔ）」は、任意の小分子化合物、抗体、核酸分子若しくはポリペプチド又はそれらのフラグメントを意味する。

【0053】

「改善する」は、疾患の発症又は進行を軽減、抑制、和らげる、縮小、阻止、又は安定化することを意味する。

【0054】

「変更」は、本明細書で記載されるような標準的な当分野で公知の方法により検出される遺伝子又はポリペプチドの発現レベル又は活性の変化（増加又は減少）を意味する。本明細書で使用されるように、変更は、発現レベルにおける１０％の変化、発現レベルにおける好ましくは２５％の変化、より好ましくは４０％の変化、更に最も好ましくは５０％以上の変化を含む。

【0055】

「アナログ」は、同一ではないが、類似する機能的特徴又は構造的特徴を有する分子を意味する。例えば、ポリペプチドアナログは、天然由来のポリペプチドと比較してアナログの機能を増強する特定の生化学的修飾を有しつつ、対応する天然由来のポリペプチドの生物学的活性を維持する。かかる生物学的修飾は、例えばリガンド結合を変更することなく、アナログのプロテアーゼ耐性、膜透過性又は半減期を高め得る。アナログは、非天然アミノ酸を含み得る。

【0056】

本開示では、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」及び「有する（ｈａｖｉｎｇ）」等は、米国特許法においては、それらに属する意味を有し、「包含する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「包含している（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」等を意味し得る；「から本質的になる」又は「本質的にからなる」等は、米国特許法においては属する意味を有し、前記用語は開放型であり、列挙されるものの基本的又は新規な特徴が列挙されるものより多くの存在によって変更されない限り、列挙されるものより多くの存在を認めるが、先行技術の実施形態を除外する。

【0057】

「検出する」は、検出される検体の存在、不在又は量を特定することを指す。

【0058】

「検出可能な標識」は、目的の分子に結合した場合に、分光光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段又は化学的手段を介して後者を検出可能とする組成物を意味する。例えば、有用な標識として、放射性同位体、磁性ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡに通常使用される）、ビオチン、ジゴキシゲニン又はハプテンが挙げられる。

【0059】

「疾患」は、細胞、組織又は器官の正常な機能を損傷する又はそれと干渉する任意の状態又は障害を意味する。

【0060】

「有効量」は、治療していない患者と比較して、疾患の症状を緩和するために必要な量を意味する。疾患の治療的処置のための本発明の実施に使用される活性化合物の有効量は、投与方式、被験体の年齢、体重及び全身の健康状態に応じて変動する。最終的には、担当する内科医又は獣医が適切な量及び投与計画を決定する。かかる量は、「有効」量と呼ばれる。

【0061】

本発明は、治療用の高特異性薬物の開発又は本明細書に記述される方法により特徴づけられる障害に有用な多数の標的を提供する。更に、本発明の方法は、被験体における使用に安全な治療法を特定するための手軽な手段を提供する。更に、本発明の方法は、本明細書に記載される疾患に対する効果に関し、高容量スループット、高感度及び低複雑性で実質的に任意の数の化合物を分析する道を提供する。

【0062】

「フラグメント」は、ポリペプチド又は核酸分子の一部を意味する。この部分は、好ましくは参照核酸分子又はポリペプチドの全長の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％を含有する。フラグメントは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００又は１０００のヌクレオチド又はアミノ酸を含有し得る。

【0063】

「ハイブリダイゼーション」は、相補的ヌクレオベース間のワトソン−クリック、フーグスティーン又は逆フーグスティーン水素結合であり得る、水素結合を意味する。例えば、アデニン及びチミンは、水素結合の形成によって一対となる相補的ヌクレオベースである。

【0064】

「腫瘍形成を阻害する」は、腫瘍形成へと発達する細胞の性質を低減すること、又は腫瘍形成の成長又は増殖を遅延、低減若しくは安定化することを意味する。

【0065】

「阻害性核酸」は、二本鎖ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ若しくはアンチセンスＲＮＡ、又はそれらの一部、又はそれらの模倣物を意味し、哺乳類細胞に投与された場合に標的遺伝子の発現減少（例えば、１０％、２５％、５０％、７５％、更には９０％〜１００％）を生じる。典型的には、核酸阻害剤は、標的核酸分子の一部、若しくはそのオーソログを含むか、又は標的核酸分子の相補鎖の少なくとも一部を含む。例えば、阻害性核酸分子は、本明細書に記述される少なくともいずれかの又は全ての核酸の一部を含む。

【0066】

「単離されたポリヌクレオチド」は、本発明の核酸分子が由来する生物の天然のゲノムにおいて前記遺伝子に隣接する遺伝子を含まない核酸（例えばＤＮＡ）を意味する。従って、前記用語は、例えば、ベクター中；自律複製可能なプラスミド若しくはベクター中；又は原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡ中に組み込まれた組換えＤＮＡ、又は他の配列から独立した別々の分子であるＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ、又はＰＣＲ若しくは制限酵素消化により産生されたゲノム若しくはｃＤＮＡフラグメント）を含む。更に、前記用語は、ＤＮＡから転写されたＲＮＡ分子、並びに追加のポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡを含む。

【0067】

「単離されたポリペプチド」は、天然に付随する成分から分離された本発明のポリペプチドを意味する。典型的には、ポリペプチドは、少なくとも６０重量％が、天然に付随しているタンパク質及び天然の有機分子を含まない場合に、単離されている。好ましくは、前記製剤は、本発明のポリペプチドの少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも９０重量％、最も好ましくは少なくとも９９重量％である。単離された本発明のポリペプチドは、例えば、天然起源からの抽出により、かかるポリペプチドをコードする組換え核酸の発現により、又は前記タンパク質を化学合成することにより得られ得る。純度は、任意の適切な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、又はＨＰＬＣ分析による方法によって測定され得る。

【0068】

「マーカー」は、疾患又は障害と関連する発現レベル又は活性の変化を有する任意のタンパク質又はポリヌクレオチドを意味する。

【0069】

「腫瘍形成」は、不適切に高レベルの細胞分裂、不適切に低レベルのアポトーシス、又はこれらの両方により引き起こされるか、又はこれらを生じる任意の疾患を意味する。例えば、癌は腫瘍形成である。癌の例として、限定されることなく、白血病（例えば、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病）、真性多血症、リンパ腫（ホジキン病、非ホジキン病）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、Ｈ鎖病、並びに肉腫及び癌腫等の固形腫瘍（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮細胞肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、ナイル管癌（ｎｉｌｅ ｄｕｃｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、絨毛癌、精上皮種、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、希突起膠腫、神経鞘腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、及び網膜芽細胞腫）が挙げられる。リンパ増殖性障害もまた、増殖性疾患とされている。

【0070】

「腫瘍形成細胞」は、腫瘍形成の成分である細胞を意味する。

【0071】

本明細書で使用されるように「作用物質を得ること」における「得ること」は、その作用物質を合成すること、購入すること、或いは別の方法で取得することを含む。

【0072】

「プライマーセット」は、例えばＰＣＲに使用され得る一組のオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーセットは、少なくとも２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、２００、２５０、３００、４００、５００、６００又はそれより多いプライマーからなるであろう。

【0073】

「認識ドメイン」は、認識標的に結合する化学的構造を意味する。

【0074】

「認識標的」は、認識ドメインによって結合される標的細胞表面に存在する構造を意味する。

【0075】

「低減」は、少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％又は１００％の負の変更を意味する。

【0076】

「参照」は、標準又は対照条件を意味する。

【0077】

「参照配列」は、配列比較の基礎として使用される規定された配列である。参照配列は、指定された配列のサブセット又は全体；例えば、全長ｃＤＮＡ又は遺伝子配列のセグメント、又は完全なｃＮＤＡ若しくは遺伝子配列であってもよい。ポリペプチドについては、参照ポリペプチド配列の長さは、通常、少なくとも約１６アミノ酸、好ましくは少なくとも約２０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約２５アミノ酸、また更に好ましくは約３５アミノ酸、約５０アミノ酸、又は約１００アミノ酸であろう。核酸については、参照核酸配列の長さは、通常、少なくとも約５０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約６０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約７５ヌクレオチド、また更に好ましくは約１００ヌクレオチド若しくは約３００ヌクレオチド、又はその近辺若しくはその間の整数であろう。

【0078】

「ｓｉＲＮＡ」は、二本鎖ＲＮＡを意味する。最適には、ｓｉＲＮＡは、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４ヌクレオチドの長さであり、その３’末端に２塩基のオーバーハングを有する。これらのｄｓＲＮＡを個々の細胞又は動物全体に導入することができ、例えば、血流を介して全身に導入され得る。かかるｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡレベル又はプロモーター活性の下方制御に使用される。

【0079】

「特異的に結合する」は、本発明のポリペプチドを認識して結合するが、試料、例えば本来的に本発明のポリペプチドを含む生物学的試料中の他の分子を実質的に認識せず、及び結合しない化合物又は抗体を意味する。

【0080】

本発明の方法に有用な核酸分子は、ポリペプチド、非コーディングＲＮＡ、又はそれらのフラグメントをコードする任意の核酸分子を含む。かかる核酸分子は、内因性の核酸配列と１００％同一である必要はないが、典型的には実質的な同一性を呈するであろう。内因性配列に対して「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的には、二本鎖核酸分子の少なくとも１本の鎖とハイブリダイズすることが可能である。本発明の方法に有用な核酸分子は、本発明のポリペプチド又はそのフラグメントをコードする任意の核酸分子を含む。かかる核酸分子は、内因性核酸配列に対して１００％同一である必要はないが、典型的には実質的な同一性を呈するであろう。内因性配列に対して「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的には、二本鎖核酸分子の少なくとも１本の鎖とハイブリダイズすることが可能である。「ハイブリダイズする」は、様々なストリンジェンシー条件下で、対が、相補的なポリヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載される遺伝子）又はその一部の間で二本鎖分子を形成することを意味する（例えば、Ｗａｈｌ，Ｇ．Ｍ．ａｎｄ Ｓ．Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３９９；Ｋｉｍｍｅｌ，Ａ．Ｒ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：５０７を参照されたい）。

【0081】

例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常は、約７５０ｍＭ未満のＮａＣｌ及び７５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウム、好ましくは約５００ｍＭ未満のＮａＣｌ及び５０ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウム、より好ましくは約２５０ｍＭ未満のＮａＣｌ及び２５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムであろう。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションを、有機溶媒、例えばホルムアミドの不在下で得ることができ、一方、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションを少なくとも約３５％のホルアミド、より好ましくは少なくとも約５０％のホルムアミドの存在下で得ることができる。ストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約３０℃、より好ましくは少なくとも約３７℃、最も好ましくは少なくとも約４２℃の温度を含む。ハイブリダイゼーション時間、洗浄剤、例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の濃度、及び担体ＤＮＡを含むこと若しくは排除すること等の変動する追加のパラメーターは、当業者によく知られている。これらの様々な条件を必要に応じて組み合わせることにより、様々なレベルのストリンジェンシーが達成される。好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは、７５０ｍＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、及び１％ＳＤＳ中３０℃にて生じるであろう。より好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは、５００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％ＳＤＳ、３５％ホルムアミド及び１００．ｍｕ．ｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中３７℃にて生じるであろう。最も好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは、２５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、及び２００μｇ／ｍｌのｓｓＤＮＡ中４２℃で生じるであろう。これらの条件に対する有用な変数は、当業者に直ちに明白であろう。

【0082】

殆どの適用に関して、ハイブリダイゼーション後の洗浄工程もまた、ストリンジェンシーが異なる。洗浄ストリンジェンシー条件は、塩濃度及び温度により規定され得る。上述のように、洗浄ストリンジェンシーは、塩濃度の減少又は温度の上昇により増加し得る。例えば、洗浄工程に関してストリンジェントな塩濃度は、好ましくは、約３０ｍＭ未満のＮａＣｌ及び３ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウム、また最も好ましくは１５ｍＭ未満のＮａＣｌ及び１．５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムであろう。洗浄工程に関してストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約２５℃、より好ましくは少なくとも約４２℃、また更に好ましくは少なくとも約６８℃の温度を含む。好ましい実施形態では、洗浄工程は３０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのクエン酸三ナトリウム及び０．１％ＳＤＳ中２５℃で生じる。より好ましい実施形態では、洗浄工程は、１５ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム及び０．１％ＳＤＳ中４２℃で生じる。より好ましい実施形態では、洗浄工程は１５ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム及び０．１％ＳＤＳ中６８℃で生じる。これらの条件に対する更なる変化は、当業者に直ちに明白であろう。ハイブリダイゼーション技術は、当業者によく知られており、例えば、Ｂｅｎｔｏｎ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ（Ｓｃｉｅｎｃｅ １９６：１８０，１９７７）；Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｈｏｇｎｅｓｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ７２：３９６１，１９７５）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００１）；Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ（Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；及びＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されている。

【0083】

「実質的に同一」は、参照アミノ酸配列（例えば、本明細書に記載される任意の１つのアミノ酸配列）又は核酸配列（本明細書に記載される任意の１つの核酸配列）に対して少なくとも５０％の同一性を呈するポリペプチド又は核酸分子を意味する。好ましくは、かかる配列は、比較に使用される配列に対して、アミノ酸レベル又は核酸レベルで少なくとも６０％、より好ましくは８０％若しくは８５％、またより好ましくは９０％、９５％、更には９９％同一である。

【0084】

配列同一性は、典型的には配列分析ソフトウェア（例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ，１７１０ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７０５，ＢＬＡＳＴプログラム、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム、ＧＡＰプログラム又はＰＩＬＥＵＰ／ＰＲＥＴＴＹＢＯＸプログラム）を使用して測定される。かかるソフトウェアは、様々な置換、欠失及び／又は他の修飾に対する相同性の程度を指定することにより、同一又は類似の配列をマッチングする。保存的置換は、典型的には、以下の群内の置換を含む：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リシン、アルギニン；及びフェニルアラニン、チロシン。同一性の程度を決定するための例示的アプローチでは、関連性の高い配列を示すｅ^−３〜ｅ^−１００の確率スコアによりＢＬＡＳＴプログラムを使用することができる。

【0085】

「被験体」は、ヒト、又はウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ若しくはネコ等の非ヒト哺乳動物を含むが、これらに限定されない哺乳類を意味する。

【0086】

本明細書において提供される範囲は、その範囲内の全ての値の簡略表記であると理解される。例えば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０からなる群から選択される任意の数字、数字の組み合わせ、又は部分範囲を含むと理解される。

【0087】

本明細書で使用されるように、用語「治療する」、「治療すること」、「治療」等は、それと関連する障害及び／又は症状を低減又は緩和することを指す。障害又は状態を治療することは、それと関連する障害、状態又は症状を完全に除去することを必要としないことが理解されるが、これを排除するものではない。

【0088】

別段の定めがない限り又は文脈から自明でない限り、本明細書で使用されるように、用語「又は」は包括的であると理解される。別段の定めがない限り又は文脈から自明でない限り、本明細書で使用されるように、用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、単一又は複数であると理解される。

【0089】

別段の定めがない限り又は文脈から自明でない限り、本明細書で使用されるように、用語「約」は、当該技術分野における一般交差の範囲内、例えば、平均の２つの標準偏差内であると理解される。約は、表示される値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、又は０．０１％内であると理解される。文脈から明白でない限り、本明細書において提供される全ての数値は、用語「約」により修飾される。

【0090】

本明細書中の変数の任意の定義における化学基の一覧の列挙は、任意の単一の基又は列挙される基の組み合わせとしてのその変数の定義を含む。本明細書中の変数又は態様に関する実施形態の列挙は、任意の単一の実施形態、又は任意の他の実施形態若しくはその一部との組み合わせとしてのその実施形態を含む。

【0091】

本明細書において提供される任意の組成物又は方法を、本明細書において提供される１又は複数の他の組成物及び方法のいずれかと組み合わせることができる。

【図面の簡単な説明】

【0092】

【図1】図１は、ＲＮＡｉ経路を示す概略図である。

【図2】図２は、Ｄｉｃｅｒ酵素の構造的特徴を示す。

【図3】図３は、Ｄｉｃｅｒは二本鎖ＲＮＡを切断し得るが、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを切断し得ないことを示す概略図である。

【図4】図４は、自己認識ハイブリッド二重鎖の設計における第１工程を解説する概略図である。

【図5】図５は、自己認識ハイブリッド二重鎖の設計における第２工程、すなわちトーホールド配列の付加を解説する概略図である。

【図6】図６は、設計した自己認識ハイブリッド二重鎖の作用を解説する概略図である。

【図7】図７は、自己活性化治療剤の作用を解説する概略図である。

【図8】図８は、各自己認識ハイブリッドにおける相補的トーホールド配列の存在が、ＲＮＡ二重鎖の形成をもたらすトーホールド二重鎖を形成する方法を解説する概略図である。

【図9】図９は、自己認識粒子を産生するための合理的設計の使用を解説する。

【図10】図１０は、ＦＲＥＴにより測定されるハイブリッド再会合のｉｎ ｖｉｔｒｏでの形成を示す。

【図11】図１１は、トーホールドを有さない陰性対照二重鎖を使用するハイブリッド再会合の親和性を示す。

【図12】図１２は、トーホールドを有する二重鎖を使用するハイブリッド再会合の親和性を示す。

【図13】図１３は、ハイブリッド再結合のキネティクスを示す一組のグラフである。

【図14】図１４は、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるハイブリッドの再会合の追跡を示す。

【図15】図１５は、生細胞におけるハイブリッドの再会合の追跡を示す。

【図16】図１６は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて脱消光（ｄｅ−ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）（ＦＲＥＴ）により再会合がどのようにモニタリングされ得るかを解説する。

【図17】図１７は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて再会合を追跡する解説例である。

【図18】図１８は、ハイブリッド脱消光のキネティクスの解説例である。

【図19】図１９は、脱消光による生細胞内でのハイブリッドの再会合の追跡を示す。

【図20】図２０は、脱消光による生細胞内でのハイブリッドの再会合の追跡を示す。

【図21】図２１は、自己認識粒子が、予備形成されたｓｉＲＮＡ二重鎖に匹敵するレベルの標的遺伝子の発現をサイレンシングすることができることを示す。

【図22】図２２は、同日のハイブリッドの同時形質移入が、予備形成したｓｉＲＮＡ二重鎖で見られるものに匹敵する標的遺伝子サイレンシングレベルをもたらすことを示す。

【図23】図２３は、同日のハイブリッドの同時形質移入の例である。

【図24】図２４は、異なる２日間のハイブリッド同時形質移入が標的遺伝子のサイレンシングをもたらすことを示す。

【図25】図２５は、リポフェクタミン２０００が部分的に蛍光を消光することを示す。

【図26】図２６は、リポフェクタミン２０００がハイブリッド再結合を阻止することを示す。

【図27】図２７は、予備形成したリポフェクタミン２０００／ハイブリッドは再結合を示さないことを示す。

【図28】図２８は、可変的なトーホールド長を有するハイブリッドの設計を示す概略図である。

【図29】図２９は、同日の形質移入におけるサイレンシングに対する可変的なトーホールド長の影響を示す。

【図30】図３０は、異日の形質移入におけるサイレンシングに対する可変的なトーホールド長の影響を示す。

【図31】図３１は、多段階の輸送を高める改善されたハイブリッドの設計を示す。

【図32】図３２は、２つの自動認識Ｒ／ＤＮＡハイブリッドによる機能性の活性化を示す。（ａ）２つの非機能性単位の再会合による機能性の活性化の一般的な原理を示す挿絵。（ｂ）非対照性Ｄｉｃｅｒ基質ｓｉＲＮＡ放出を生じる、自動認識Ｒ／ＤＮＡハイブリッド再会合の概略的な図示。色分けは図を通して同じとする。

【図33】図３３は、再会合により機能性（非対称２５／２７ｍｅｒ Ｄｉｃｅｒ基質）を放出することが可能なＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの合理的設計を示す挿絵である。

【図34】図３４は、Ｒ／ＤＮＡハイブリッド及びＲＮＡ二重鎖の比較分析を示す。（ａ）組換えヒトｔｕｒｂｏ ｄｉｃｅｒ酵素キット（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ）によりＲ／ＤＮＡハイブリッド及び非対称２５／２７ｍｅｒ Ｄｉｃｅｒ基質ｓｉＲＮＡ二重鎖に対してそれぞれ行われた、ダイシング実験に関する全ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ染色未変性ＰＡＧＥ結果。（ｂ）８０％のヒト血清におけるＲ／ＤＮＡハイブリッド及び非対称２５／２７ｍｅｒ Ｄｉｃｅｒ基質ｓｉＲＮＡ二重鎖の相対的安定性をそれぞれ表す、全臭化エチジウム染色アガロースゲル及び定量結果。

【図35】図３５は、３７℃における溶液中での自動認識Ｒ／ＤＮＡハイブリッド再会合の蛍光研究を示す。（ａ）再結合ができないＡｌｅｘａ４８８及びＡｌｅｘａ５４６で蛍光標識化された対照ＤＮＡ二重鎖（上部）及び再会合用にプログラムされた蛍光標識化された自動認識Ｒ／ＤＮＡハイブリッド（下部）の概略的表示。（ｂ）ＦＲＥＴを示さない対照ＤＮＡ二重鎖、及びＡｌｅｘａ５４６発光シグナルが増加した再結合した自動認識Ｒ／ＤＮＡハイブリッドの発光スペクトル。（ｃ）Ａｌｅｘａ４８８及びＡｌｅｘａ５４６で標識化した自動認識Ｒ／ＤＮＡハイブリッドの再会合におけるＦＲＥＴ時間トレース。（ｄ）混合前に個別にＬ２Ｋと結合させた蛍光標識化したＲ／ＤＮＡハイブリッドに、その後、蛍光時間トレーシングを行った。Ｌ２Ｋはハイブリッドと複合体を形成して、それらの再会合を阻止し、（ｃ）に比べてＡｌｅｘａ４８８の発光シグナル（緑色）はＡｌｅｘａ５４６（赤色）の上に留まることに留意されたい。（ｅ〜ｆ）再結合用にプログラムされた対応するハイブリッドの概略的表示を含む、Ａｌｅｘａ４８８及びクエンチャーＩｏｗａＢｌａｃｋ ＦＱ（緑色）で標識化した自動認識Ｒ／ＤＮＡハイブリッドの再会合における概略的表示及びＦＲＥＴ時間トレース。（ｄ）と同様に、Ｌ２Ｋは消光したハイブリッド（青色）と複合体を形成して、それらの再結合を阻止することに留意されたい。

【図36】図３６は、３７℃での３時間のインキュベーション後の溶液中での自動認識Ｒ／ＤＮＡハイブリッドの再会合の蛍光研究を示す。再結合できないＡｌｅｘａ４８８及びＡｌｅｘａ５４６で蛍光標識化した対照ＤＮＡ二重鎖（上欄）、並びに再会合用にプログラムされた蛍光標識化した自動認識Ｒ／ＤＮＡハイブリッドの発光（下欄）の発光スペクトル及び概略的表示。Ａｌｅｘａ５４６発光シグナルが増加していることに留意されたい。種々の濃度（ｎＭで示される）の全ての試料について、励起は４６０ｎｍであった。

【図37】図３７Ａ〜３７Ｅは、３７℃における自動認識Ｒ／ＤＮＡハイブリッドの再会合のキネティクスを示す概略図及びグラフである。（ａ）再会合の概略的表示及び（ｂ〜ｆ）ＦＲＥＴ時間トレース、並びに各々の場合について上記で指定される種々の等モル濃度で混合したＡｌｅｘａ４８８及びＡｌｅｘａ５４６で標識化し、３７℃でインキュベートした自動認識Ｒ／ＤＮＡハイブリッドの再会合におけるそれらのフィッティング。全ての試料について、励起を４６０ｎｍに設定し、ｂ〜ｄについては１秒毎に、またｅ及びｆについては３０秒毎に５２０ｎｍで発光を測定した。（ｇ）自動認識Ｒ／ＤＮＡハイブリッドの再会合の定数（ｂ〜ｆのフィッティングに由来する）は、より低い濃度（３０ｎｍ未満）でのハイブリッド濃度に依存する。（ｈ）トーホールドを有さないトランケートハイブリッド及び対応するＦＲＥＴ時間トレースの概略的表示。蛍光シグナルに有意な変化はなく、トーホールドが再会合に必須であることが示唆されていることに留意されたい。

【図38】図３８は、リポフェクタミン２０００（Ｌ２Ｋ）の添加は、溶液中で再結合したＲ／ＤＮＡハイブリッドの蛍光を消光し、酵素分解から二重鎖を保護することを示す。（ａ）Ａｌｅｘａ４８８及びＡｌｅｘａ５４６で標識化したＲ／ＤＮＡハイブリッドを、１００ｎＭの濃度で混合し、３７℃にて２時間のインキュベーション後にＬ２Ｋを添加した。励起を４６０ｎｍに設定し、発光を５２０ｎｍ及び５７０ｎｍで測定した。Ａｌｅｘａ５４６の発光シグナルはＡｌｅｘａ４８８の上に留まることに留意されたい。（ｂ）Ａｌｅｘａ４８８及びＩｏｗａＢｌａｃｋ ＦＱで標識した消光したＤＮＡ二重鎖を、３００ｎＭの濃度でＬ２Ｋと混合し、３７℃で２分間インキュベートした（青色線）後ＤＮａｓｅ添加した。３時間のインキュベーションの後、分解は観察されなかった。対照として、Ｌ２Ｋを含まない同じ二重鎖をＤＮａｓｅにより完全に消化した（赤色線）。その後、消化の際にＬ２Ｋを添加して、消化した二重鎖に対するそれ自身の消光可能性を評価することにより、Ｌ２Ｋ複合化二重鎖により消化が起きた場合に予想されるシグナルに対する参照を提供した。励起を４６０ｎｍで設定し、発光を５２０ｎｍで測定した。

【図39】図３９は、３７℃で３時間のインキュベーション後の溶液中の自動認識Ｒ／ＤＮＡハイブリッドの再会合の蛍光研究を示す。全ての試料について、励起を４６０ｎｍに設定し、１００ｎＭ濃度を使用した。Ａｌｅｘａ４８８（緑色曲線）又はＡｌｅｘａ５４６（赤色曲線）で標識化したＲ／ＤＮＡハイブリッド、Ａｌｅｘａ４８８及びクエンチャーＩｏｗａＢｌａｃｋ ＦＱを含有する二重鎖（黄色曲線）、並びに二重鎖Ａｌｅｘａ４８８／ＩｏｗａＢｌａｃｋ ＦＱとその同族のＲ／ＤＮＡ Ａｌｅｘａ５４６ハイブリッド（黒色）の混合物について発光スペクトルを収集した。

【図40】図４０Ａ〜図４０Ｄは、共焦点蛍光顕微鏡により可視化したヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）における自動認識Ｒ／ＤＮＡハイブリッドの再会合及び局在を示す。（図４０Ａ）ＦＲＥＴ実験：Ａｌｅｘａ４８８及びＡｌｅｘａ５４６で標識化した同族のハイブリッドで細胞を同時形質移入し、次の日に画像を撮った。（図４０Ｂ）脱消光実験：Ａｌｅｘａ４８８及びＩｏｗａＢｌａｃｋ ＦＱで標識化した１つの二重鎖を有する同族の二重鎖で細胞を同時形質移入した。画像を次の日に撮った。（図４０Ｃ〜Ｄ）エンドソーム区画に通常使用されるマーカーＥＥＡ１（図４０Ｃ）及びＲａｂ７（図４０Ｄ）を有する自動認識Ｒ／ＤＮＡハイブリッドの局在。 ａ〜ｄの画像番号は以下に対応する：微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）画像（１）、Ａｌｅｘａ４８８発光（２）、Ａｌｅｘａ５４６発光（３）、ブリードスルー補正ＦＲＥＴ画像（４）、黄色の星印で対応を示しているブリードスルー補正ＦＥＲＴ画像の白色の四角により示される拡大されたフラグメントの３Ｄチャート表示（５）、ＥＡＡ１抗体染色（６）及びＲａｂ７抗体染色（７）。画像（１＋２＋３）、（１＋４）、（１＋２）、（１＋３＋６）、（１＋３＋７）は、２つ又は３つの異なる画像の重複像である。

【図41】図４１は、共焦点蛍光顕微鏡により可視化したヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）における自動認識Ｒ／ＤＮＡハイブリッドの再会合（Ｎ＝５）を示す。Ａｌｅｘａ４８８及びＡｌｅｘａ５４６で標識化した同族のハイブリッドで細胞を同時形質移入し、画像を次の日に撮った。画像番号は以下に対応する：Ａｌｅｘａ５４６発光（１）、Ａｌｅｘａ４８８発光（２）、ＤＩＣ（３）。

【図42】図４２は、共焦点蛍光顕微鏡により可視化したヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）における自動認識Ｒ／ＤＮＡハイブリッドの脱消光再会合実験（Ｎ＝６）を示す一組の写真である：Ａｌｅｘａ４８８及びＩｏｗａＢｌａｃｋ ＦＱで標識化した１つのハイブリッドを有する同族のハイブリッドで細胞を同時形質移入した。対照として（上欄）、Ｎ＝６、細胞を消光した二重鎖のみで形質移入した。画像を次の日に撮った。画像番号は以下に対応する：ＤＩＣ（１）、Ａｌｅｘａ４８８発光（２）。

【図43】図４３Ａ〜図４３Ｃ 安定的に増強されたＧＦＰ（ｅＧＦＰ）を発現するヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＧＦＰ）に対するＧＦＰノックダウンアッセイ。ｅＧＦＰに対してｓｉＲＮＡを放出するようにプログラムした自動認識Ｒ／ＤＮＡハイブリッド（Ｈ＿ｓ及びＨ＿ａｎｔ）で細胞を形質移入してから３日後、（図４３Ａ）蛍光顕微鏡によりｅＧＦＰ発現を観察し、（図４３Ｂ）フローサイトメトリー実験によりｅＧＦＰ発現を統計学的に分析した。対照として、ｅＧＦＰに対するｓｉＲＮＡ二重鎖を使用した。個々のＲ／ＤＮＡハイブリッドはｅＧＦＰ産生の減少を引き起こさないことに留意されたい（補足図Ｓ８）。（図４３Ｃ）異なる２日間に同時形質移入した自動認識Ｒ／ＤＮＡハイブリッドにおけるトーホールド長の依存性は、ｅＧＦＰ発現をノックダウンするそれらの能力を示す。アンチセンス（Ｈ＿ａｎｔ）を含有するＲ／ＤＮＡハイブリッドを、センス（Ｈ＿ｓ）を含むハイブリッドの一日前に形質移入した。３日後、ｅＧＦＰ発現を分析した。

【図44】図４４は、安定的に増強されたＧＦＰ（ｅＧＦＰ）を発現するヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＧＦＰ）に対するＧＦＰノックダウンアッセイを示す一組の写真である。ｅＧＦＰに対してｓｉＲＮＡを放出するようにプログラムした様々な等モル濃度の自動認識Ｒ／ＤＮＡハイブリッド（Ｈ＿ｓ及びＨ＿ａｎｔ）で細胞を形質移入してから３日後、蛍光顕微鏡によりｅＧＦＰ発現を観察した。対照として、ｅＧＦＰに対するｓｉＲＮＡ二重鎖を使用した。

【図45】図４５Ａ及び図４５Ｂは、安定的に増強されたＧＦＰ（ｅＧＦＰ）を発現するヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＧＦＰ）に対するＧＦＰノックダウンアッセイの結果を示す写真及びグラフである。（ａ）単一のＲ／ＤＮＡハイブリッドによる細胞の形質移入から３日後、ｅＧＦＰ発現を蛍光顕微鏡により観察し、フローサイトメトリー実験により統計学的に分析した。個々のＲ／ＤＮＡハイブリッドはｅＧＦＰ産生の減少を引き起こさないことに留意されたい。（ｂ）陰性対象として、ＨＩＶ−１に対して設計したｅＧＦＰサイレンシングに無関係の自動認識Ｒ／ＤＮＡハイブリッドを使用した。ＨＩＶに対してｓｉＲＮＡを放出するように設計したＲ／ＤＮＡハイブリッドで細胞を形質移入してから３日後、蛍光顕微鏡実験及びフローサイトメトリー実験によってｅＧＦＰ発現は観察されなかった。自動認識Ｒ／ＤＮＡハイブリッド及びｅＧＦＰに対するｓｉＲＮＡを、陽性対照として使用した。

【図46】図４６は、Ｒ／ＤＮＡハイブリッドを有する古典的なサイズのｓｉＲＮＡ（２１ｎｔｓ）の使用が、伸長された（２５／２７ｍｅｒ）ハイブリッドと比較して、同等のＧＦＰノックダウンのサイレンシング効率を実証することを示す。ｅＧＦＰ発現の統計学的分析をフローサイトメトリーにより行った。Ｒ／ＤＮＡハイブリッドを同日に同時形質移入し、３日後に、ｅＧＦＰ発現を分析した。

【図47】図４７Ａ及び図４７Ｂは、Ｒ／ＤＮＡハイブリッドを有する内部セグメント化干渉ＲＮＡの使用は、通常のハイブリッドと比べてより高効率のＧＦＰノックダウンをもたらすことを示す。（ａ）内部セグメント化された干渉ＲＮＡ（Ｈ＿セグメント化＿ｓ）を有する自動認識Ｒ／ＤＮＡハイブリッドの概略的表示。（ｂ）フローサイトメトリーによるｅＧＦＰ発現の統計学的分析。Ｒ／ＤＮＡハイブリッドを同日に同時形質移入し、３日後に、ｅＧＦＰ発現を分析した。

【図48】図４８は、同日に同時形質移入された自動認識Ｒ／ＤＮＡハイブリッドにおける、それらのｅＧＦＰ発現をノックダウンする能力に対するトーホールド長の依存性を示す。（ａ）異なる長さの非ジップドトーホールドを有する自動認識Ｒ／ＤＮＡハイブリッドの概略的表示。（ｂ）フローサイトメトリーによるｅＧＦＰ発現の統計学的分析。Ｒ／ＤＮＡハイブリッド（Ｈ＿ｓ及びＨ＿ａｎｔ）を同日に同時形質移入した。３日後、ｅＧＦＰ発現を分析した。

【図49】図４９は、腫瘍異種移植片マウスモデルにおける自動認識Ｒ／ＤＮＡハイブリッドのｉｎ ｖｉｖｏ研究の結果を示す。（ａ）尾静脈注射の３時間後における腫瘍を有するマウスにおける、蛍光標識化したＲ／ＤＮＡハイブリッドの薬物動態プロファイル。比較的高レベルのハイブリッド蓄積が腫瘍組織において生じる。３時間画像において、蛍光最大（赤色）は注射（１）、腫瘍（２）及び採血（３）の場所に対応する。（ｂ）マウス血流中の蛍光プローブの量（Ｒ／ＤＮＡハイブリッド及びＩＲＤｙｅ７００で標識化されたＤｉｃｅｒ基質ｓｉＲＮＡ）を、注射の３時間後に測定した。（ｃ）マウス腎臓及び腫瘍のｅｘ ｖｉｖｏ蛍光画像及び分析は、Ｄｉｃｅｒ基質ｓｉＲＮＡに比べて、Ｒ／ＤＮＡハイブリッドについて比較的高い腫瘍取り込みを示す。（ｄ）ｉｎ ｖｉｖｏにおける注射から５日後の腫瘍のｅｘ ｖｉｖｏ蛍光画像は、ｓｉＲＮＡ及び自動認識Ｒ／ＤＮＡハイブリッドにより引き起こされるのと同等レベルのｅＧＦＰサイレンシングを示す。

【図50】図５０は、ｉｎ ｖｉｖｏでの注射から５日後の腫瘍のｅｘ ｖｉｖｏ蛍光画像を示す一組の写真であり、ｓｉＲＮＡ及び自動認識Ｒ／ＤＮＡハイブリッドにより引き起こされるのと同等のｅＧＦＰサイレンシングレベルを示す。腫瘍をマウスから除去し、４℃にて４％ＰＦＡで終夜固定し、パラフィン加工した。５μｍの切片をスライドの上に置いた後、段階的なエタノールからｄＨ_２Ｏ、その後ＰＢＳにより、脱パラフィン及び再水和した。プロテイナーゼＫ（ＤＡＫＯ）による予備処理を室温にて５分間行った。切片をＮＧＳ中でブロックし、抗ＧＦＰ抗体（ａｂｃａｍ ＃ａｂ６５５６、１：１０００に希釈）と共に４℃にてインキュベート（ｉｎｃｕｂａｔｅｄ ＯＮ）した。蛍光標識化のため、切片をヤギａ／ウサギＩｇＧ Ａｌｅｘａ ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）とインキュベートし、ＤＡＰＩで対比染色した後、Ｐｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ ａ／Ｆａｄｅ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でカバースリップした。ＱＩｍａｇｉｎｇ Ｒｅｔｉｇａ−２０００Ｒカメラ及びＮｉｋｏｎのＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ＡＲ Ｉｍａｇｉｎｇソフトウェアを備えたＮｉｋｏｎのＥｃｌｉｐｓｅ ８０ｉ顕微鏡を使用して画像を取得した。ＤＡＢ標識のため、切片をビオチン化ヤギａ／ウサギＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）中でインキュベートし、その後ＡＢＣ Ｅｌｉｔｅ試薬（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）、それに続いてＤＡＢでインキュベートした。ヘマトキシリン対比染色を行い、スライドをＰｅｒｍｏｕｎｔでカバースリップした。ＡｐｅｒｉｏのＳｃａｎＳｃｏｐｅデジタルスライドスキャナを使用してスライド全体のデジタル画像を取得した。

【図51】図５１は、ＨＩＶ−１発現及び産生がｓｉＲＮＡ及び再結合したＲ／ＤＮＡハイブリッドにより阻害されたことを示す。（ａ）ＨｅＬａ細胞を、ｓｉＲＮＡと共に又はこれを伴わずに、ｐＮＬ４−３で形質移入した。ウイルス上清を回収し、ＲＴ活性を測定した；ｓｉＲＮＡを含まないウイルス対照（ＶＣ．１及びＶＣ．２）に対して正規化したデータを示す。エラーバーはＳＤを示す；Ｎ＝４。（ｂ）形質移入から４８時間後において、４時間に亘って［^３５Ｓ］ＭｅｔＣｙｓでＨｅＬａ細胞を代謝性に標識化した。細胞溶解物に放射性免疫沈降法を行った。外皮糖タンパク質前駆体であるｇｐｌ６０、及び表面糖タンパク質ｇｐｌ２０の位置；Ｐｒ５５Ｇａｇ（Ｐｒ５５）、ＣＡ−ＳＰｌ（ｐ２５）及びＣＡ（ｐ２４）が示される。全細胞関連Ｇａｇの定量：Ｐｒ５５＋ｐ２５＋２４。１００に設定したｓｉＲＮＡを含まないウイルス対照（ＶＣ）における全Ｇａｇ。エラーバーはＳＤを示す；Ｎ＝３。

【図52】図５２Ａ〜５２Ｄは、フローサイトメトリー（図５１Ａ）及び自己認識Ｒ／ＤＮＡハイブリッドを含むＨｅＬａ細胞中のＲａｂ５／７（エンドソーム）共局在（図５１Ｂ）により測定された形質移入効率を示す。フローサイトメトリーによる形質移入効率を統計学的に分析し（図５２Ａ）、共局在を共焦点蛍光顕微鏡により可視化した（図５２Ｂ）。ＨＩＶ−１発現ＨｅＬａ細胞におけるｓｉＲＮＡの細胞毒性（ＬＣＰＳ＝ルシフェラーゼカウント／秒）（図５２Ｃ）は、最小５ｎＭ〜２０ｎＭである。細胞を、ｓｉＲＮＡを含む又はｓｉＲＮＡを含まない、ｐＮＬ４−３及びｐｓｉＣＨＥＣＫ^ＴＭ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ）で同時形質移入した。形質移入から４８時間後、細胞を溶解し、ウミシイタケルシフェラーゼを測定した。ｅＧＦＰ ｓｉＲＮＡを対照として使用した。Ｖ．Ｃ．ウイルス対照。ＬｕｃＣ．ルシフェラーゼ対照。エラーバーは、ＳＤ；Ｎ＝４を示す。（図５２Ｄ）ＲＴ産生に対する影響。ｅＧＦＰ ｓｉＲＮＡを陰性対照として使用した。ｅＧＦＰ ｓｉＲＮＡをｐＮＬ４−３プラスミドと共に同時形質移入し、４８時間後の上清中のＲＴレベルを測定した。Ｖ．Ｃ．ウイルス対照。

【図53】図５３は、ウェスタンブロットにより示されるＲ／ＤＮＡ処理の後のＡ５４９肺腺癌細胞におけるＧＳＴＰ１タンパク質発現における相対的減少（３回の反復より算出された対応する標準偏差（ＳＤ）及び標準誤差（ＳＥ）と共に）を示す。Ｈ＿ｓ＋Ｈ＿ａｎｔ（ＧＳＴＰ１）の場合、ＲＮＡセンス鎖を含む自動認識Ｒ／ＤＮＡハイブリッドを最初に形質移入し、３７℃で２４時間のインキュベーション後にＧＳＴＰ１ ｓｉＲＮＡのＲＮＡアンチセンス鎖を含有する相補的（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）Ｒ／ＤＮＡハイブリッドを形質移入した。細胞を採取し、２４時間後に標準的なプロトコルを使用する免疫ブロッティングのため処理した。抗ＧＳＴＰ１抗体はＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによるものであり、β−アクチン抗体はＡｂｃａｍによるものであった。

【図54】図５４は、細胞内での再結合の前（上欄）及び後（下欄）における２つの同族の自動認識治療用Ｒ／ＤＮＡ ＮＰの概略的表示である。

【図55】図５５は、ＧＦＰ遺伝子（上欄）に対して設計されたｓｉＲＮＡを放出する自動認識Ｒ／ＤＮＡ二重鎖の再結合、及び自動認識Ｒ／ＤＮＡ二重鎖の再会合により誘発されたヒト細胞内でのＧＦＰ発現のサイレンシングを示すＦＡＣＳデータを示す概略図である。

【図56】図５６は、再会合において複数の機能性（ＦＲＥＴ反応、ｓｉＲＮＡ及びＲＮＡアプタマー）を放出する例示的な自動認識ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを示す概略図である。

【図57】図５７Ａ〜図５７Ｃは、自動認識ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの再会合による複数の機能性（ＦＲＥＴ、ｓｉＲＮＡ、ＭＧアプタマー）の放出を示す。図５７Ａは、再会合によるｓｉＲＮＡ及びＭＧアプタマーの放出を示すハイブリッド再会合及び未変性ＰＡＧＥの概略図である。図５７Ｂは、放出中のＭＧアプタマーの活性化を示す静的及び動的蛍光実験である。ＭＧそれ自身は非蛍光（青色曲線）であり、いずれか１つのハイブリッドの存在はその蛍光発光を活性化しない（緑色曲線）。しかしながら、２つの同族のハイブリッドの再会合は、個々のＭＧアプタマー鎖の放出、それらの集合、更にはその蛍光発光の顕著な増加をもたらすＭＧ取り込みをもたらす（赤紫色の曲線）。図５７Ｃ 上欄：再会合におけるＦＲＥＴの活性化。ＦＲＥＴを示さない対照ＤＮＡ二重鎖（青色曲線）、及び増加したＡｌｅｘａ５４６発光シグナルを伴う再会合した自動認識Ｒ／ＤＮＡハイブリッド（赤色曲線）の発光スペクトル。図５７Ｃ 下欄：Ａｌｅｘａ４８８及びＡｌｅｘａ５４６で標識化した自動認識Ｒ／ＤＮＡハイブリッドの再会合におけるＦＲＥＴ時間トレース。

【図58】図５８は、自動認識ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの再会合による複数の機能性（２つのｓｉＲＮＡ、ＭＧアプタマー）の放出を示す。ＭＧアプタマーは、３つの異なる位置に配置され（３組のハイブリッドを試験した）、従って、（ｓｓＤＮＡトーホールドに関する位置にかかわらず）３つ全ての場合においてＭＧ蛍光の活性化は全ての機能性の放出を証明する。左欄：ハイブリッド再会合の概略図、並びに再会合によるｓｉＲＮＡ及びＭＧアプタマーの放出を示す全ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ染色未変性ＰＡＧＥ。右欄：放出の間のＭＧアプタマーの活性化を示す静的及び動的蛍光実験。

【図59】図５９Ａ〜図５９Ｄは、共焦点蛍光顕微鏡により可視化したヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）における自動認識Ｒ／ＤＮＡハイブリッドの再会合、局在、更には安定的に増強したＧＦＰ（ｅＧＦＰ）を発現するヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ２３１／ＧＦＰ）に対するＧＦＰノックダウンアッセイにより追跡したｓｉＲＮＡの放出を示す。図５９Ａは、これらの実験において比較した種々のサイズのハイブリッド再会合の概略図である。ＦＲＥＴ実験（図５９Ｂ）：Ａｌｅｘａ４８８及びＡｌｅｘａ５４６で標識化した同族ハイブリッドで同時形質移入し、次の日に画像を取得した細胞。図５９Ｃは、ｓｉＲＮＡの放出を示す全ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ染色未変性ＰＡＧＥを示すゲルである。ＧＦＰノックダウンアッセイ（図５９Ｄ）：ｅＧＦＰに対する１個（ハイブリッド（ｉ））、２個（ハイブリッド（ｉｉ））、及び３個（ハイブリッド（ｉｉｉ））のｓｉＲＮＡを放出するようにプログラムした、自動認識Ｒ／ＤＮＡハイブリッドによる細胞の形質移入から３日後。ｅＧＦＰ発現を蛍光顕微鏡で観察し、フローサイトメトリー実験により統計学的に分析した。対照として、ｅＧＦＰに対するｓｉＲＮＡ二重鎖を使用した。図５９Ｂにおける画像番号は以下に対応する：Ａｌｅｘａ４８８発光（１）、Ａｌｅｘａ５４６発光（２）、ブリードスルー補正ＦＲＥＴ画像（３）、ＦＲＥＴ重複で補正した微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）画像（４）。黄色の星印で対応を示しているブリードスルー補正ＦＥＲＴ画像の白色の四角により示される拡大されたフラグメントの３Ｄチャート表示（５）。

【発明を実施するための形態】

【0093】

治療剤としてＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を使用することにより、疾患細胞において標的遺伝子の発現をノックダウンすることが日常的に可能である。ＲＮＡｉの仕組みを開始する一つの方法は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）二重鎖の細胞への直接的な外因性の導入による。本明細書に記載される発明は、ＲＮＡｉ経路並びに疾患細胞内の他の機能性を誘発するために一般的に使用され得る、治療用ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドに基づく戦略を提供する。個々には、各ハイブリッドは機能的に不活性であり、治療用ｓｉＲＮＡの提示は、同じ細胞内に同時に存在する少なくとも２つの同族のハイブリッドが再会合することによってのみ活性化され得る。本発明は、同日に又は異なる２日間に同族のハイブリッドを細胞に同時に輸送するｉＲＮＡ放出の方法を特徴とする。本発明は、生化学的適用のための「賢明な」ナノ粒子に基づく核酸を提供する。

【0094】

本発明は、細胞内での再会合による組み込まれた機能性の放出の誘発を経ることが可能なプログラム可能な自動認識Ｒ／ＤＮＡハイブリッドを設計及び操作する新規戦略に基づく。Ｒ／ＤＮＡハイブリッドは、ｓｉＲＮＡと比べて血液血清中で顕著に高い安定性を有し、しかもＲ／ＤＮＡハイブリッドアプローチの使用は、（ｉ）ｓｉＲＮＡの処理能力の直接的な干渉を伴うことなく更なる機能性を導入すること、（ｉｉ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び細胞内部におけるスプリット機能性（例えば、ＦＲＥＴ）の活性化、（ｉｉ）細胞内におけるリアルタイムでのこれらのハイブリッドの輸送又は再会合の追跡、（ｉｉｉ）細胞培養物及びｉｎ ｖｉｖｏにおけるｓｉＲＮＡの誘発された放出、（ｉｖ）ｓｉＲＮＡと比べて遺伝子サイレンシングの効果の延長を可能とする。更に、このアプローチは、（ｉ）標的特異性に対するより高い制御（例えば、２つのハイブリッドが２つの異なる組織特異的認識部分により装飾される場合）、（ｉｉ）分岐ハイブリッド構造を導入することによる機能性の数の増加、（ｉｉｉ）化学的アナログ（例えば、ロックド核酸（ＬＡＮ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）等）によるＤＮＡ鎖の置換を介する化学的安定性の微調整による生体液中の保持時間の増加、（ｉｖ）条件付きのｓｉＲＮＡ又は他の機能性の放出を可能とし得る。更に、トーホールド相互作用の熱安定性は、それらの長さ及び組成を変更することにより微調整され得る。本発明は、ナノテクノロジー適用及び生物医学的適用の幅広いアレイに対する核酸系ナノ粒子の更なる開発のための新たな道を開くものである。

【0095】

本発明の特定の態様は、被験体において遺伝子発現を阻害するのに有用な組成物及び方法を特徴とする。本発明は、第１ＤＮＡ分子が５’トーホールド配列を有し、かつ第２ＤＮＡ分子が３’トーホールド配列を有し、５’及び３’トーホールド配列が相補的である、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖対である治療用Ｒ／ＤＮＡキメラ多機能ナノ粒子（Ｒ／ＤＮＡ ＮＰ）を特徴とする。２つのＲ／ＤＮＡ ＮＰを混合すると、トーホールド配列は、２つのＲ／ＤＮＡ ＮＰの再会合を生じる二重鎖を形成する。再会合産物は、ＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖及びＲＮＡ／ＲＮＡ二重鎖であり、ＲＮＡ二重鎖は特異的な標的ＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡとして機能するように設計されている。また、Ｒ／ＤＮＡ ＮＰは、標的分子に特異的に結合する付着した部分を有する。一実施形態では、標的分子は、標的遺伝子を発現する細胞上に存在する細胞表面タンパク質である。従って、Ｒ／ＤＮＡ ＮＰは、特定の細胞における特定の標的遺伝子のターゲッティングを可能とする。

【0096】

本発明は、医学的に重要な遺伝子又は医学的に重要な細胞における遺伝子を標的とするために使用され得る。例えば、一実施形態では、ウイルスに感染した細胞をターゲッティングすることにより被験体のウイルス負荷を低減するため、Ｒ／ＤＮＡ ＮＰを使用することができるであろう。具体的な実施形態では、Ｒ／ＤＮＡ ＮＰは、ウイルスに感染した細胞におけるアポトーシス阻害剤を阻害することにより、ウイルスに感染した細胞を特異的に死滅させる。特定の実施形態では、ウイルスはＨＩＶである。他の実施形態では、Ｒ／ＤＮＡ ＮＰは、新生物細胞を標的とするために使用されるであろう。更なる実施形態では、Ｒ／ＤＮＡ ＮＰは、腫瘍形成における標的遺伝子を阻害して、腫瘍形成の死滅又はアポトーシスを生じるであろう。従って、Ｒ／ＤＮＡ ＮＰは、遺伝子サイレンシングアプローチを受け入れることが可能な任意の疾患を治療するために使用されるであろう。

【0097】

また、本発明は、ＨＩＶ感染細胞を標的とする有効量のＲ／ＤＮＡ ＮＰを投与して、標的化されたアポトーシス阻害剤の破壊を生じ、ＨＩＶ感染細胞の死をもたらすことにより被験体からＨＩＶを根絶することによってＨＩＶ感染被験の服従を治療する方法を提供する。

【0098】

更に、本発明は、腫瘍形成細胞を標的とする有効量のＲ／ＤＮＡ ＮＰを投与して腫瘍形成細胞の死又はアポトーシスをもたらす標的遺伝子のノックダウンを生じることによって、腫瘍形成を有する被験体を治療する方法を特徴とする。

【0099】

本明細書において前記方法は、かかる効果を生じるために本明細書に記載される化合物、又は本明細書に記載される組成物の有効量を被験体（かかる治療が必要と特定された被験体を含む）に投与することを含む。かかる治療が必要な被験体の特定は、被験体又は医療の専門家によって判断され、主観的（例えば、意見）又は客観的（例えば試験若しくは診断方法により測定可能）であってもよい。

【0100】

本明細書で使用されるように、用語「治療する」、「治療すること」、「治療」等は、それと関連する障害及び／又は症状を低減又は緩和することを指す。障害又は状態を治療することは、それと関連する障害、状態又は症状が完全に除去されることを必要としないが、それを排除するものではないと理解されるであろう。

【0101】

本明細書で使用されるように、用語「予防する」、「予防すること」、「予防」、「予防的治療」等は、障害又は症状を有していないが発症しやすいリスクにある被験体における障害又は症状の発症可能性を低減することを指す。

【0102】

通常、本発明の治療法（予防的治療を含む）は、本明細書の式の化合物等の本明細書の化合物の治療的有効量を、哺乳類、具体的にはヒトを含むそれを必要とする被験体（例えば、動物、ヒト）に投与することを含む。かかる治療は、疾患、障害又はそれらの症状に罹患した、有する、傾向がある、又はリスクがある被験体、具体的にはヒトに好適に投与されるであろう。「そのリスクにある」被験体の判定は、診断検査又は被験体若しくは医療提供者の意見（例えば、遺伝子検査、酵素若しくはタンパク質マーカー、マーカー（本明細書に規定される）、家族歴等）による任意の客観的若しくは主観的判断により行われ得る。また、本明細書の化合物は、ウイルス、具体的にはＨＩＶが関係する可能性のある任意の他の障害の治療にも使用され得る。

【0103】

１つの実施形態では、本発明は、治療経過をモニタリングする方法を提供する。前記方法は、ウイルスに感染した細胞、具体的にはＨＩＶに感染した細胞（例えば、本明細書の化合物、タンパク質又はその前駆体等により調節される、本明細書に記述される任意の標的）に対する診断マーカーのレベルを判定する工程、又はウイルス、具体的にはＨＩＶと関連する障害若しくはその症状に罹患した、若しくはそれに感受性の被験体における診断的測定（例えば、スクリーニング、アッセイ）の工程を含み、ここで、被験体は、その疾患若しくは症状を治療するのに十分な本明細書の化合物の治療的量を投与されている。前記被験体の疾患状態を確立するため、前記方法で判定されたマーカーのレベルを、健康な正常対照又は他の罹患患者のいずれかにおける既知のマーカーのレベルと比較することができる。好ましい実施形態では、第１レベルの判定より後の時間点において被験体におけるマーカーの第２レベルを判定し、２つのレベルを比較して一連の疾患又は治療法の有効性をモニタリングする。特定の好ましい実施形態では、被験体における治療前のマーカーのレベルを、本発明による治療の開始前に判定し、その後、この治療前のマーカーのレベルを治療開始後の被験体におけるマーカーのレベルと比較して治療の有効性を判定する。

【0104】

薬学的治療剤
本発明の開示は、疾患細胞における標的タンパク質の発現又は活性を減少するＲ／ＤＮＡ ＮＰを提供する。例えば、非限定的な一実施形態では、本開示は、疾患細胞においてアポトーシス阻害剤の発現又は活性を阻害するＲ／ＤＮＡ ＮＰを含む医薬組成物を提供する。更なる実施形態では、前記疾患細胞は、新生物細胞又はウイルスに感染した細胞である。しかしながら、本明細書に記載される薬学的適用は、遺伝子サイレンシングを受け入れることが可能な、又は受け入れることが可能とされる任意の疾患状態の治療に適用可能である。治療用途に関し、本明細書に開示される方法を使用して特定された前記組成物又は薬剤は、全身投与されてもよく、例えば、薬学的に許容可能な担体中に製剤化され得る。好ましい投与経路として、例えば、患者における薬物の継続的、持続的レベルを提供する、皮下注射、静脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、又は髄腔内注射が挙げられる。ヒト患者又は他の動物の治療は、生理学的に許容可能な担体中の治療的有効量のＲ／ＤＮＡ ＮＰを使用して行われる。好適な担体及びそれらの製剤は、例えば、Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。投与される治療剤の量は、投与方式、患者の年齢及び体重、並びに疾患進行の臨床症状に応じて変化する。一般的に、量は、その疾患の治療に使用される他の薬剤について使用される量の範囲内であるが、特定の場合、前記化合物の特異性が高められているため、より低量となる。化合物は、当業者に既知の診断方法によるか、又は疾患と関連する遺伝子の転写活性化を測定する任意のそのアッセイを使用して、判定される癌の進行又は転移の臨床的又は生理学的症状を制御する用量で投与される。

【0105】

医薬組成物の調製
疾患の治療のための本開示のＲ／ＤＮＡ ＮＰ又はそのアナログの投与は、他の成分と組み合わせて、疾患の緩和、低減、根絶又は安定化において効果的なＲ／ＤＮＡ ＮＰの濃度を生じる任意の好適な手段によるものであってもよい。一実施形態では、Ｒ／ＤＮＡ ＮＰの投与は、標的遺伝子の発現又は活性を低減する。別の実施形態では、Ｒ／ＤＮＡ ＮＰは、疾患と関連する疾患の予防又は治療のため被験体に投与される。

【0106】

かかるＲ／ＤＮＡ ＮＰの投与方法は、当該技術分野において既知である。本開示は、当該技術分野において既知の任意の手段による薬剤の治療的投与を提供する。前記化合物を、任意の好適な担体物質中に任意の適切な量で含有させてもよく、通常、前記化合物は、組成物全重量の１〜９５重量％の量で存在する。前記組成物は、非経口（例えば、皮下、静脈内、筋肉内又は腹腔内）投与経路に好適な剤型で提供され得る。医薬組成物は、従来の薬学的慣習に従って製剤化され得る（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０ｔｈ ｅｄ．），ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２０００ ａｎｄ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ｊ．Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ ａｎｄ Ｊ．Ｃ．Ｂｏｙｌａｎ，１９８８−１９９９，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい）。好適な製剤として、経口投与、デポ製剤、パッチによる輸送用製剤、及び局所又は経皮的に輸送させるための半固形投与形態が挙げられる。

【0107】

本開示による医薬組成物は、投与に際して実質的に即時に、又は任意の予定された時若しく投与後の期間に活性化合物を放出するように製剤化され得る。後者のタイプの組成物は、一般的に、放出制御製剤として知られ、（ｉ）延長された期間に亘って体内で実質的に一定の薬物濃度を生じる製剤；（ｉｉ）予定された遅延時間の後に延長された期間に亘って体内で実質的に一定の薬物濃度を生じる製剤；（ｉｉｉ）活性物質の血漿レベルの変動（のこぎり刃キネティックパターン）と関連する望ましくない副作用を同時に最小化しながら、体内で相対的に一定の有効レベルを維持することによって、予定された期間に亘り作用を持続させる製剤；（ｉｖ）例えば、中枢神経系又は脳脊髄液に隣接するか又はその中での放出制御組成物の空間的な配置により作用を局在化する製剤；（ｖ）例えば、毎週１回又は２週間に１回、服用量が投与されるように、簡易な投薬を可能とする製剤；並びに（ｖｉ）担体又は化学的誘導体を使用することによって腫瘍細胞を標的とし、癌においてその機能が攪乱されている特定の細胞種へと治療剤を輸送する製剤、を含む。一部の適用については、放出制御製剤は、日中の頻繁な投薬を不要にし、血漿レベルを治療レベルに持続させる。

【0108】

放出速度が問題の化合物の代謝速度を上回る、制御された放出を得るために、任意の多数の戦略を遂行することができる。一例では、例えば、様々な種類の放出制御組成物及びコーティングを含む、製剤化パラメーター及び成分の適切な選択により、制御された放出が得られる。従って、治療剤は、適切な賦形剤と共に、投与に際して制御された方式で治療剤を放出する医薬組成物へと製剤化される。例として、シングルユニット又はマルチユニットのタブレット組成物又はカプセル組成物、油溶液、懸濁剤、乳剤、マイクロカプセル、ミクロスフィア、分子複合体、ナノ粒子、パッチ及びリポソームが挙げられる。

【0109】

非経口組成物
医薬組成物は、剤型、製剤、又は好適な輸送デバイス若しくは従来の非毒性の薬学的に許容可能な担体及びアジュバントを含有するインプラントで、注射、点滴又は移植（皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内等）により非経口的に投与され得る。かかる組成物の製剤化及び調製は、医薬製剤の技術分野における当業者によく知られている。製剤は、上記Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙに見出され得る。非経口用途の組成物は、単位投与形態（例えば、単回投与アンプルで）、又は好適な防腐剤が添加され得る（以下を参照）複数投与を含有するバイアルで提供され得る。前記組成物は、溶液、懸濁液、乳剤、点滴デバイス若しくは移植用輸送デバイスの形態であってもよく、又は使用前に水又は別の好適なビヒクルにより再構成される乾燥粉末として提示され得る。活性な治療剤とは別に、前記組成物は、好適な非経口的に許容可能な担体及び／又は賦形剤を含み得る。活性な治療剤は、制御された放出のためミクロスフィア、マイクロカプセル、ナノ粒子、リポソーム等に組み込まれ得る。更に、前記組成物は、懸濁剤、可溶化剤、安定化剤、ｐＨ調整剤、等張化剤及び／又は分散剤を含み得る。

【0110】

上述のように、本開示による医薬組成物は、滅菌注射に好適な形態であってもよい。かかる組成物を調製するため、好適な活性な治療剤を非経口的に許容可能な液体ビヒクルに溶解又は懸濁する。

【0111】

放出制御非経口組成物
放出制御非経口組成物は、懸濁液、ミクロスフィア、マイクロカプセル、磁性ミクロスフィア、油溶液、油懸濁液又は乳剤の形態であり得る。或いは、活性な薬物は、生体適合性の担体、リポソーム、ナノ粒子、インプラント又は点滴デバイスに組み込まれ得る。ミクロスフィア及び／又はマイクロカプセルの調製に使用される材料は、例えば、ポリガラクチン（ｐｏｌｙｇａｌａｃｔｉｎ）、ポリ−（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−Ｌ−グルタミン）及びポリ（乳酸）である。放出制御非経口製剤を製剤化する場合に使用され得る生体適合性担体は、炭水化物（例えばデキストラン）、タンパク質（例えばアルブミン）、リポタンパク質又は抗体である。インプラントに使用する材料は、非生分解性（例えばポリジメチルシロキサン）又は生分解性（例えばポリ（カプロラクトン）、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）若しくはポリ（オルトエステル）又はそれらの組み合わせ）であってもよい。

【0112】

阻害性核酸
本明細書に記載されるＲ／ＤＮＡ分子は、標的細胞において阻害性核酸分子を一度形成することによりはたらく。かかる阻害性核酸は、標的ＲＮＡ（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド分子、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）をコードする核酸分子を結合する１本鎖及び２本鎖核酸分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びこれらのアナログ）、並びに標的ポリペプチドに直接結合してその生物学的活性を調節する核酸分子（例えば、アプタマー）を含む。

【0113】

リボザイム
本開示のアンチセンス標的ＲＮＡ配列を含む触媒ＲＮＡ分子又はリボザイムは、ｉｎ ｖｉｖｏにおける標的ＲＮＡの発現を阻害するために使用され得る。アンチセンスＲＮＡ中にリボザイム配列を含むことは、それらに対してＲＮＡ切断活性を与え、それによりコンストラクトの活性を高める。標的ＲＮＡ特異的リボザイムの設計及び使用は、各々参照により援用される、Ｈａｓｅｌｏｆｆ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５８５−５９１．１９８８及び米国特許出願第２００３／０００３４６９ Ａ１号明細書に記載されている。

【0114】

従って、本開示は、結合アームに８〜１９の連続したヌクレオベースを有するアンチセンスＲＮＡを含む触媒ＲＮＡ分子も特徴とする。本開示の好ましい実施形態では、触媒核酸分子は、ハンマーヘッドモチーフ又はヘアピンモチーフに形成される。かかるハンマーヘッドモチーフの例は、Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，８：１８３，１９９２に記載されている。ヘアピンモチーフの例は、Ｈａｍｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８８年９月２０日付出願の米国特許出願番号第０７／２４７，１００号の部分継続出願である、１９８９年９月２０日付出願の「ＲＮＡ Ｃａｔａｌｙｓｔ ｆｏｒ Ｃｌｅａｖｉｎｇ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＲＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」、Ｈａｍｐｅｌ ａｎｄ Ｔｒｉｔｚ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８：４９２９，１９８９、及びＨａｍｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８：２９９，１９９０に記載されている。これらの具体的なモチーフは、本開示において限定的なものではなく、当業者であれば、本開示の酵素核酸分子において重要であることの全ては、それが１又は複数の標的遺伝子ＲＮＡ領域に相補的な特異的基質結合部位を有し、及びそれが分子にＲＮＡ切断活性を与える基質結合部位内又はその周囲のヌクレオチド配列を有することであることを認識するであろう。

【0115】

低分子ヘアピン型ＲＮＡは、任意選択による３’ＵＵオーバーハングを有するステムループ構造からなる。変化し得るが、ステムは２１〜３１ｂｐ（望ましくは２５〜２９ｂｐ）の範囲であってもよく、ループは４〜３０ｂｐ（望ましくは４〜２３ｂｐ）の範囲であってもよい。細胞内でのｓｈＲＮＡの発現のため、ポリメラーゼＩＩＩ Ｈ１−ＲＮＡ又はＵ６プロモーターのいずれか、ステムループＲＮＡインサートのためのクローニング部位、及び４−５チミジン転写終結シグナルを含有するプラスミドベクターを利用することができる。ポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、通常、明確な開始部位又は停止部位を有し、それらの転写産物はポリ（Ａ）テールを欠く。これらのプロモーターの終結シグナルは、ポリチミジントラクトにより規定され、転写産物は典型的には２番目のウリジンの後に切断される。この位置における切断により、発現されたｓｈＲＮＡにおける３’ＵＵオーバーハングを生じ、これは合成ｓｉＲＮＡの３’オーバーハングに類似する。哺乳類細胞においてｓｈＲＮＡを発現する更なる方法は、上記に引用された参考文献において記載されている。

【0116】

ｓｉＲＮＡ
短い２１〜２５ヌクレオチドの二本鎖ＲＮＡは、遺伝子発現の下方制御に有効である（参照により本明細書に援用される、Ｚａｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １０１：２５−３３；Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４９４−４９８，２００１）。哺乳類におけるｓｉＲＮＡアプローチの治療有効性は、ＭｃＣａｆｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ４１８：３８−３９，２００２）によりｉｎ ｖｉｖｏで実証された。

【0117】

標的遺伝子の配列を考慮すると、ｓｉＲＮＡは、遺伝子を不活性化するように設計され得る。かかるｓｉＲＮＡは、例えば罹患組織に直接投与されるか、又は全身投与されるであろう。Ｐａｒｌ遺伝子の核酸配列を低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の設計に使用することができる。２１〜２５ヌクレオチドのｓｉＲＮＡは、例えば、疾患関連遺伝子を阻害する治療剤として使用され得る。

【0118】

本開示の阻害性核酸分子は、標的ＲＮＡ発現のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）媒介ノックダウンのための二本鎖ＲＮＡとして利用され得る。治療的実施形態では、標的ＲＮＡは、疾患関連遺伝子である。例えば、非限定的な実施形態では、標的ＲＮＡは、癌の発症又は進行に関与する遺伝子である。別の実施形態では、標的ＲＮＡ発現は、ウイルスに感染した細胞において減少する。別の実施形態では、標的ＲＮＡはアポトーシス阻害タンパク質をコードし、前記細胞はＨＩＶに感染している。ＲＮＡｉは、目的の具体的タンパク質の細胞発現を減少する方法である（Ｔｕｓｃｈｌ，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ ２：２３９−２４５，２００１；Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ Ｄｅｖ １５：４８５−４９０，２０００；Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ ａｎｄ Ｚａｍｏｒｅ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅｔ Ｄｅｖｅｌ １２：２２５−２３２，２００２；及びＨａｎｎｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ４１８：２４４−２５１，２００２において概説される）。ｄｓＲＮＡの形質移入によるか、又はプラスミドに基づく発現系を使用するｓｉＲＮＡの発現を介するかのいずれかによるｓｉＲＮＡの細胞への導入は、哺乳類細胞において機能喪失型の表現型を生じるためにますます使用されている。

【0119】

本開示の一実施形態では、本開示のヌクレオベースオリゴマーの８〜１９の連続したヌクレオベースを含む二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子が作製される。ｄｓＲＮＡは、二重鎖化された、又は自己二重鎖化（ｓｅｌｆ−ｄｕｐｌｅｘｅｄ）（低分子ヘアピン型（ｓｈ）ＲＮＡ）した単独のＲＮＡ鎖を有する２本の異なるＲＮＡ鎖であり得る。典型的には、ｄｓＲＮＡは、約２１〜２２塩基対であるが、望ましい場合は、それよりも短く、又は長く（約２９ヌクレオベース以下）てもよい。ｄｓＲＮＡは、標準的な技術を使用して作製され得る（例えば、化学合成又はｉｎ ｖｉｖｏ転写）。キットは、例えばＡｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）及びＥｐｉｃｅｎｔｒｅ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ）から入手可能である。哺乳類細胞においてｄｓＲＮＡを発現する方法は、各々参照により本明細書において援用される、Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：５５０−５５３，２００２；Ｐａｄｄｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｄｅｖ １６：９４８−９５８，２００２．Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０：５０５−５０８，２００２；Ｓｕｉ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９：５５１５−５５２０，２００２；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９：６０４７−６０５２，２００２；Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０：４９７−５００，２００２；及びＬｅｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０：５００−５０５，２００２に記載されている。特定の実施形態では、二本鎖ｓｉＲＮＡのセンス鎖は２つのより小さいオリゴヌクレオチドへと分割され、３本鎖ｓｉＲＮＡとも呼ばれる。

【0120】

低分子ヘアピン型ＲＮＡは、任意選択による３’ＵＵオーバーハングを有するステムループ構造からなる。変化し得るが、ステムは２１〜３１ｂｐ（望ましくは２５〜２９ｂｐ）の範囲であってもよく、ループは４〜３０ｂｐ（望ましくは４〜２３ｂｐ）の範囲であってもよい。細胞内でのｓｈＲＮＡの発現のため、ポリメラーゼＩＩＩ Ｈ１−ＲＮＡ又はＵ６プロモーターのいずれか、ステムループＲＮＡインサートのためのクローニング部位、及び４−５チミジン転写終結シグナルを含有するプラスミドベクターを利用することができる。ポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、通常、明確な開始部位又は停止部位を有し、それらの転写産物はポリ（Ａ）テールを欠く。これらのプロモーターの終結シグナルは、ポリチミジントラクトにより規定され、転写産物は典型的には２番目のウリジンの後に切断される。この位置における切断により、発現されたｓｈＲＮＡにおける３’ＵＵオーバーハングを生じ、これは合成ｓｉＲＮＡの３’オーバーハングに類似する。哺乳類細胞においてｓｈＲＮＡを発現する更なる方法は、上記に引用された参考文献において記載されている。

【0121】

本発明は、３’及び５’エキソヌクレアーゼ並びにエンドヌクレアーゼから保護する修飾を有する安定化されたＲ／ＤＮＡ ＮＰを包含する。かかる修飾は、望ましくはｉｎ ｖｉｖｏでの安定性を高めつつ、標的親和性を維持する。様々な実施形態では、本発明のＲ／ＤＮＡ ＮＰは、所与のヌクレオベース配列のリボース及び／又はリン酸及び／又は塩基位置における化学的置換を含む。例えば、本発明のＲ／ＤＮＡ ＮＰは、リボース部分の２’位置における化学修飾、アプタマーの環状化、３’キャッピング及び「シュピーゲルマー」技術を含む。その２’−ＯＣＨ３修飾対応物により順次置き換えられたＡ及びＧヌクレオチドを有するＲ／ＤＮＡ ＮＰは、本発明の方法に特に有用である。かかる修飾は、典型的には親和性及び特異性を維持するという点で良好な耐容性を示す。様々な実施形態では、Ｒ／ＤＮＡ ＮＰは、少なくとも１０％、２５％、５０％又は７５％の修飾されたヌクレオチドを含む。他の実施形態では、８０％〜９０％ものＲ／ＤＮＡ ＮＰのヌクレオチドが安定化置換を含む。他の実施形態では、２’−ＯＭｅ含有Ｒ／ＤＮＡ ＮＰが合成される。かかるＲ／ＤＮＡ ＮＰは、合成するのに安価であり、天然のポリメラーゼが２’−ＯＭｅヌクレオチド三リン酸を基質として受け入れず、従って２’−ＯＭｅヌクレオチドが宿主ＤＮＡへと再利用され得ないことから望ましい。本明細書に記載される方法を使用することにより、Ｒ／ＤＮＡ ＮＰは、ｉｎ ｖｉｖｏ安定性の向上のために選択されるであろう。一実施形態では、２’−Ｆ及び２’−ＯＣＨ_３修飾を有するＲ／ＤＮＡ ＮＰを使用して、ヌクレアーゼ耐性アプタマーを作出する。他の実施形態では、本発明の核酸は、１又は複数のロックド核酸（ＬＮＡ）を有する。ＬＮＡは、修飾ＲＮＡヌクレオチドを指す。ＬＮＡのリボースは、Ｎｏｒｔｈ又は３’−ｅｎｄｏコンホメーションへとリボースをロックする、２’酸素及び４’炭素を接続する余分のブリッジにより修飾される。例えば、Ｋａｕｒ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．４５，ｐａｇｅｓ ７３４７−５５；及びＫｏｓｈｋｉｎ，Ａ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，ｖｏｌ．５４，ｐａｇｅｓ３６０７−３６３０を参照されたい。他の実施形態では、本発明の１又は複数の核酸は、核酸塩基がデオキシリボース環に代えてモルホリン環に結合され、リン酸に代えてホスホロジアミデート基を介して連結される、モルホリノ構造を組み込む。例えば、Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ，Ｊ．ａｎｄ Ｗｅｌｌｅｒ，Ｄ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ＆Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｖｏｌ．７，ｐａｇｅｓ １８７−１９５を参照されたい。更なる他の修飾として、核酸のリン酸骨格が、リン酸骨格中の酸素基を１又は複数の硫黄基で置換することによって修飾される、（ＰＳ）−リン酸硫黄修飾が挙げられる。核酸を安定化する他の修飾は当該技術分野において既知であり、例えば、米国特許第５，５８０，７３７号；及び米国特許出願第２００５００３７３９４号明細書、同第２００４０２５３６７９号明細書、同第２００４０１９７８０４号明細書及び同第２００４０１８０３６０号明細書に記載される。

【0122】

ヌクレオチド系オリゴマーの輸送
ネイキッドの阻害性核酸分子、又はそのアナログは、哺乳類細胞に進入し、目的遺伝子の発現を阻害することが可能である。それにもかかわらず、特許請求されているＲ／ＤＮＡ ＮＰを細胞へと輸送するためにオリゴヌクレオチド又は他のヌクレオベースのオリゴマーの輸送を補助する製剤を利用することが望ましい場合がある（例えば、各々参照により本明細書に援用される、米国特許第５，６５６，６１１号、同第５，７５３，６１３号、同第５，７８５，９９２号、同第６，１２０，７９８号、同第６，２２１，９５９号、同第６，３４６，６１３号及び同第６，３５３，０５５号を参照されたい）。

【0123】

投与量
動物モデルと比較したヒトに対する投与量を修正するために当該技術分野において当業者が通例と認識するように、ヒトの投与量は、最初に、マウスで使用された化合物の量から外挿することによって決定され得る。特定の実施形態では、投与量は、化合物約１ｍｇ／体重ｋｇ〜化合物約５０００ｍｇ／体重ｋｇの間；又は約５ｍｇ／体重ｋｇ〜約４０００ｍｇ／体重ｋｇ、又は約１０ｍｇ／体重ｋｇ〜約３０００ｍｇ／体重ｋｇ；又は約５０ｍｇ／体重ｋｇ〜約２０００ｍｇ／体重ｋｇ；又は約１００ｍｇ／体重ｋｇ〜１０００ｍｇ／体重ｋｇ；又は約１５０ｍｇ／体重ｋｇ〜約５００ｍｇ／体重ｋｇの間で変化し得ると予想される。他の実施形態では、この容量は、約１、５、１０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００ｍｇ／体重Ｋｇであってもよい。他の実施形態では、より高い投与量が使用され得ることが予想され、かかる投与量は、化合物約５ｍｇ／体重ｋｇ〜化合物約２０ｍｇ／体重ｋｇであってもよい。他の実施形態では、前記投与量は、約８、１０、１２、１４、１６又は１８ｍｇ／体重ｋｇであってもよい。勿論、この投与量は、初期の臨床試験の結果及び特定の患者の要求に応じて、かかる治療プロトコルにおいて日常的に行われるように、上方へ又は下方へと調整され得る。

【0124】

治療方法
本開示は、特異的な標的細胞における１又は複数の標的遺伝子を特異的に阻害又は低減することにより疾患、具体的には腫瘍形成及びウイルス感染症を治療する方法を提供する。前記方法は、被験体に治療的有効量のＲ／ＤＮＡ ＮＰを投与することを含み、Ｒ／ＤＮＡ ＮＰは標的細胞に結合して進入する。一旦標的細胞内に入ると、Ｒ／ＤＮＡ ＮＰは、ＤＮＡオリゴヌクレオチド中に存在するトーホールド配列を介して再結合する。再会合により、機能性ＲＮＡ分子が放出される。一実施形態では、ＲＮＡ分子は相補的であり、ｓｉＲＮＡである二重鎖を形成する。放出ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子を阻害し、疾患細胞の治療をもたらす。前記方法は、疾患が治療されるような条件下において、治療的量又は疾患若しくはその症状を治療するのに十分な量の本明細書の化合物を被験体に投与する工程を含む。

【0125】

本明細書の方法は、かかる効果を生じるために本明細書に記載される化合物、又は本明細書に記載される組成物の有効量を被験体（かかる治療が必要と特定された被験体を含む）に投与することを含む。かかる治療が必要な被験体の特定は、被験体又は医療の専門家によって判断され得、及び主観的（例えば、意見）又は客観的（例えば試験若しくは診断方法により測定可能）であり得る。

【0126】

予防的治療を含む、本開示の治療方法は、通常、哺乳類、具体的にはヒトを含むそれを必要とする被験体（例えば、動物、ヒト）への本明細書の製剤の化合物等の治療的有効量の本明細書の薬剤の投与を含む。かかる治療は、癌の進行若しくは転移又はそれらの症状に罹患した、有する、感受性の又はそのリスクにある被験体、具体的にはヒトに好適に投与される。「リスクにある」被験体の判定は、診断検査又は被験体若しくは医療提供者の意見（例えば、遺伝子検査、酵素若しくはタンパク質マーカー、マーカー（本明細書に規定される）、家族歴等）による任意の客観的若しくは主観的判断により行われ得る。本明細書の薬剤は、転写活性が関与し得る任意の他の疾患の治療にも使用され得る。

【0127】

一実施形態では、本開示は、治療経過をモニタリングする方法を提供する。前記方法は、疾患に罹患している又はそれに感受性の被験体における診断マーカー（マーカー）（例えば、腫瘍形成又はウイルス感染症を示すマーカー）のレベルを特定する工程、又は診断測定（例えば、スクリーニング、アッセイ）の工程を含み、ここで、被験体は、疾患若しくはその症状を治療するのに十分な治療的量の本明細書の化合物を投与されている。前記被験体の疾患状態を確立するため、前記方法で判定されたマーカーのレベルを、健康な正常対照又は他の罹患患者のいずれかにおける既知のマーカーのレベルと比較することができる。一実施形態では、マーカーは、腫瘍形成又はウイルス感染症の指標である。好ましい実施形態では、第１レベルの判定より後の時間点において被験体におけるマーカーの第２レベルを判定し、２つのレベルを比較して疾患又は治療効果の経過をモニタリングする。特定の好ましい実施形態では、被験体における治療前のマーカーのレベルを本開示による治療の開始前に判定し、その後、この治療前のマーカーのレベルを治療開始後の被験体におけるマーカーのレベルと比較して治療の有効性を判定する。

【0128】

キット
本開示は、疾患の治療又は予防のためのキットを提供する。一実施形態では、キットは、単位投与形態の有効量の本発明の薬剤（例えば、Ｒ／ＤＮＡ ＮＰ）を含有する治療用又は予防用組成物を含む。一部の実施形態では、キットは、治療用又は予防用化合物を含有する滅菌容器を含み、かかる容器は、ボックス、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、バッグ、パウチ、ブリスターパック又は当該技術分野で既知の他の好適な容器形態であり得る。かかる容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属箔又は医薬品の保持に好適な他の材料で作製され得る。

【0129】

望ましい場合、本開示の薬剤は、疾患を有する又は発症するリスクにある被験体に投与するための指示書と共に提供される。前記指示書は、通常、疾患（例えば、腫瘍形成又はウイルス感染症）の治療用又は予防用組成物の使用に関する情報を含む。他の実施形態では、前記指示書は、以下の少なくとも１つを含む：化合物の説明；投与計画及び疾患又はその症状の治療若しくは予防のための投与；用法注意；警告；指示；禁忌；過剰投与の情報；有害反応；動物薬理学；臨床研究；及び／又は参考文献。前記指示書は、（容器がある場合）容器に直接印刷されてもよく、容器にラベルとして貼り付けられてもよく、又は容器内に又は容器と共に供給される別のシート、パンフレット、カード若しくはホルダーであってもよい。

【0130】

併用療法
本開示の組成物及び方法は、当該技術分野において既知の任意の従来の治療法と組み合わせて使用され得る。一実施形態では、抗ＨＩＶ活性を有する本開示の組成物（例えば、Ｒ／ＤＮＡ ＮＰを含む組成物）は、当該技術分野において既知の抗ウイルスと組み合わせて使用され得る。他の実施形態では、抗腫瘍形成活性を有するＲ／ＤＮＡ ＮＰを含む組成物は、外科手術に対するアジュバントとして、又は１若しくは複数の抗腫瘍形成化学療法と組み合わせて使用され得る。或る特定の実施形態では、１又は複数の化学療法薬は、酢酸アビラテロン、アルトレタミン、無水ビンブラスチン、オーリスタチン、ベキサロテン、ビカルタミド、ＢＭＳ１８４４７６、２，３，４，５，６−ペンタフルオロ−Ｎ−（３−フルオロ−４−メトキシフェニル）ベンゼンスルホンアミド、ブレオマイシン、Ｎ，Ｎ−ジメチルＬ−バリル−Ｌ−バリル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｌ−プロリル−１-Ｌプロリン−ｔ−ブチルアミド、カケクチン、セマドチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、３’，４’−ジデヒドロ−４’−デオキシ−８’−ノルビン−カロイコブラスチン、ドセタキソール、ドキセタキセル、シクロホスファミド、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、シスプラチン、クリプトフィシン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デシタビン ドラスタチン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エトポシド、５−フルオロウラシル、フィナステリド、フルタミド、ヒドロキシウレア及びヒドロキシウレアタキサン、イホスファミド、リアロゾール、ロニダミン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ＭＤＶ３１００、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、メルファラン、イセチオン酸ミボブリン、リゾキシン、セルテネフ、ストレプトゾシン、マイトマイシン、メトトレキサート、タキサン、ニルタミド、オナプリストン、パクリタキセル、プレドニムスチン、プロカルバジン、ＲＰＲ１０９８８１、リン酸ストラムスチン（ｓｔｒａｍｕｓｔｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、タモキシフェン、タソネルミン、タキソール、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン硫酸、及びビンフルニンから選択される。

【0131】

組換えポリペプチド発現
本発明の実施は、特段の定めがない限り、十分に当業者の認識範囲内である分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来の技術を利用する。かかる技術は、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｇａｉｔ，１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，１９８７）；「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｗｅｉｒ，１９９６）；「Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ」（Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｃａｌｏｓ，１９８７）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ａｕｓｕｂｅｌ，１９８７）；「ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ」，（Ｍｕｌｌｉｓ，１９９４）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｃｏｌｉｇａｎ，１９９１）等の文献において十分説明されている。これらの技術は、本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドの産生に適用可能であり、それ自身、本発明の作製及び実施において考慮され得る。特定の実施形態に有用な具体的な技術を以下の欄で説明する。

【0132】

以下の実施例は、当業者に対して本発明のアッセイ法、スクリーニング法及び治療法をどのようにして作製し使用するかに関する完全な開示及び説明を提供するように提示され、これらは本発明者らが彼らの発明とする範囲を限定することを意図するものではない。

【実施例】

【0133】

実施例１．自己認識ハイブリッド二重鎖の設計
ＲＮＡｉ経路及びＤｉｃｅｒ酵素の関与が図１〜３に示される。自己認識Ｒ／ＤＮＡハイブリッドの設計に含まれる工程が図４〜６に示される。自己認識Ｒ／ＤＮＡハイブリッドの操作を図７〜９に示す。ハイブリッド再会合のｉｎ ｖｉｔｒｏでの形成、並びに親和性及び形成のキネティクスを図１０〜１３に示す。ｉｎ ｖｉｖｏにおけるハイブリッドの形成を図１４及び１５に示す。図１６〜２０に示されるように、Ｒ／ＤＮＡハイブリッドの再会合を、脱消光（ＦＲＥＴ）によりｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方で追跡することができる。図２１〜２４に示されるように、Ｒ／ＤＮＡハイブリッドは、予備形成されたｓｉＲＮＡ二重鎖に匹敵するレベルで標的遺伝子発現をサイレンシングすることができる。リポフェクタミン２０００は、部分的に蛍光を消光し（図２５）、ハイブリッド再会合を阻止する（図２６及び２７）。図２８〜３０に示されるように、トーホールド長は、遺伝子サイレンシングに対する様々な影響により変更され得る。図３１に示されるように、Ｒ／ＤＮＡハイブリッドは、化学修飾されたＲＮＡ、異なる細胞表面認識を有するドメイン、及びエンドソームエスケープを向上する部分を用いて設計され得る。

【0134】

実施例２．Ｒ／ＤＮＡハイブリッドの合理的設計及び名称
原理証明として、再会合に際して、増強された緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）、ＨＩＶ−１又はグルタチオンＳ−トランスフェラーゼＰ１（ＧＳＴＰ１）に対する非対称Ｄｉｃｅｒ基質を放出する、幾つかのＲ／ＤＮＡハイブリッド対を設計した。Ｒ／ＤＮＡハイブリッドの設計原理は以下の通りである（図３２及び３３）：機能的Ｄｉｃｅｒ基質ｓｉＲＮＡをダイスされないように２つのＲ／ＤＮＡハイブリッドの間で分割することにより、それらを非機能的とする（図３３、工程１）。更に、一方又は両方のｓｉＲＮＡ鎖をＤＮＡで置換することにより、ＲＮＡｉを完全になくすことが示されている。次に、ハイブリッドＤＮＡ鎖の各々を、ハイブリッド再会合に必要とされる相補的なトーホールドで装飾し（図３３、工程２）、Ｄｉｃｅｒ基質ｓｉＲＮＡ放出を生じる。センス鎖を含有する全てのハイブリッドは、Ｈ＿ｓと呼ばれ、アンチセンス鎖を含有するハイブリッドはＨ＿ａｎｔと呼ばれる。使用した部分的な配列セットを以下に列挙する。

【0135】

ＲＮＡ配列
ｓｉＲＮＡ二重鎖：
ｅＧＦＰに対して設計した非対称２５／２７ｍｅｒ Ｄｉｃｅｒ基質ｓｉＲＮＡ二重鎖
センス
５’−ｐＡＣＣＣＵＧＡＡＧＵＵＣＡＵＣＵＧＣＡＣＣＡＣＣＧ
アンチセンス
５’−ＣＧＧＵＧＧＵＧＣＡＧＡＵＧＡＡＣＵＵＣＡＧＧＧＵＣＡ

【0136】

ｓｉＲＮＡ用のニックドセンス鎖：
ｅＧＦＰに対して設計した非対称２５／２７ｍｅｒ Ｄｉｃｅｒ基質ｓｉＲＮＡ二重鎖用ニックドセンス鎖
１／２センス１
５’−ｐＡＣＣＣＵＧＡＡＧＵＵＣ
１／２センス２
５’−ＡＵＣＵＧＣＡＣＣＡＣＣＧ
センス及び１／２センス＿１２ｎｔ鎖の５’側はリン酸化されている。

【0137】

ｅＧＦＰに対して設計したｓｉＲＮＡ二重鎖
センス
５’−ｐＡＣＣＣＵＧＡＡＧＵＵＣＡＵＣＵＧＣＡＣＣ
アンチセンス
５’−ＵＧＣＡＧＡＵＧＡＡＣＵＵＣＡＧＧＧＵＣＡ

【0138】

ＨＩＶ−１に対して設計した非対称Ｄｉｃｅｒ基質ｓｉＲＮＡ二重鎖
プロテアーゼ（Ｐｒｏ）．位置２３３２〜２３５６、ｐＮＬ４−３による。
センス
５’−ｐＧＡＧＣＡＧＡＵＧＡＵＡＣＡＧＵＡＵＵＡＧＡＡＧＡ
アンチセンス
５’−ＵＣＵＵＣＵＡＡＵＡＣＵＧＵＡＵＣＡＵＣＵＧＣＵＣＣＵ

【0139】

エンベロープ（Ｅｎｖ）．ｇｐ１２０、位置７６４２〜７６６５、ｐＮＬ４−３による。
センス
５’−ＧＧＡＣＡＡＵＵＧＧＡＧＡＡＧＵＧＡＡＵＵＡＵＡＵＵ
アンチセンス
５’−ｐＵＡＵＡＡＵＵＣＡＣＵＵＣＵＣＣＡＡＵＵＧＵＣＣ

【0140】

ＧＳＴＰ−１に対して設計した非対称Ｄｉｃｅｒ基質ｓｉＲＮＡ二重鎖
センス
５’−ｐＡＡＧＧＡＵＧＡＣＵＡＵＧＵＧＡＡＧＧＣＡＣＵＧＣ
アンチセンス
５’−ＧＣＡＧＵＧＣＣＵＵＣＡＣＡＵＡＧＵＣＡＵＣＣＵＵＧＣ

【0141】

ＤＮＡ配列
非ジップドトーホールドを下線で示し、それらの長さ（ｎｔ）を名称の横に現す。

【0142】

ｅＧＦＰに対して設計したハイブリッド
センス＿１２のＤＮＡ
５’−ＧＧＡＧＡＣＣＧＴＧＡＣＣＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＣＡ
アンチセンス＿１２のＤＮＡ
５’−ＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＧＧＴＣＡＣＧＧＴＣＴＣＣ
センス＿２０のＤＮＡ
５’−ＧＧＡＧＡＣＣＧＴＧＡＣＡＧＴＧＡＴＴＡＣＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＣＡ
アンチセンス＿２０のＤＮＡ
５’−ＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＧＴＡＡＴＣＡＣＴＧＴＣＡＣＧＧＴＣＴＣＣ
センス＿３０のＤＮＡ
５’−ＧＧＡＧＡＣＣＧＴＧＡＣＡＧＴＧＡＴＴＡＧＡＴＴＡＣＡＣＴＣＣＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＣＡ
アンチセンス＿３０のＤＮＡ
５’−ＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＧＧＡＧＴＧＴＡＡＴＣＴＡＡＴＣＡＣＴＧＴＣＡＣＧＧＴＣＴＣＣ

【0143】

ＨＩＶ−１に対して設計したハイブリッド
プロテアーゼ（Ｐｒｏ）
センス＿１２のＤＮＡ
５’−ＡＧＵＣＵＵＣＵＡＡＵＡＣＵＧＵＡＵＣＡＵＣＵＧＣＵＣＣＵＧＴＣＡＣＧＧＴＣＴＣＣ
アンチセンス＿１２のＤＮＡ
５’−ＧＧＡＧＡＣＣＧＴＧＡＣＧＡＧＣＡＧＡＵＧＡＵＡＣＡＧＵＡＵＵＡＧＡＡＧＡ

【0144】

エンベロープ（Ｅｎｖ）
センス＿１２のＤＮＡ
５’−ＡＡＴＡＴＡＡＴＴＣＡＣＴＴＣＴＣＣＡＡＴＴＧＴＣＣＧＴＣＡＣＧＧＴＣＴＣＣ
アンチセンス＿１２のＤＮＡ
５’−ＧＧＡＧＡＣＣＧＴＧＡＣＧＧＡＣＡＡＴＴＧＧＡＧＡＡＧＴＧＡＡＴＴＡＴＡＴＴ
５’−ＧＧＡＧＡＣＣＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＧＡＡＡＴＧＡＡＣＡＡＧＴＡＧＡＴＡＡＡＴ

【0145】

ＧＳＴＰ１に対して設計したハイブリッド
センスのＤＮＡ
５’−ＧＣＡＧＴＧＣＣＴＴＣＡＣＡＴＡＧＴＣＡＴＣＣＴＴＧＣＧＴＣＡＣＧＧＴＣＴＣＣ
アンチセンスのＤＮＡ
５’−ＧＧＡＧＡＣＣＧＴＧＡＣＧＣＡＡＧＧＡＴＧＡＣＴＡＴＧＴＧＡＡＧＧＣＡＣＴＧＣ

【0146】

蛍光標識化したＲＮＡ配列
ｅＧＦＰ^１に対して設計したｓｉＲＮＡ二重鎖のセンス鎖
ＲＮＡ＿センスＩＲＤｙｅ７００
５’−／５ＩＲＤ７００／ＡＣＣＣＵＧＡＡＧＵＵＣＡＵＣＵＧＣＡＣＣＡＣＣＧ

【0147】

蛍光標識化したＤＮＡ配列
センス＿１２＿Ａｌｅｘａ４８８のＤＮＡ
５’−ＧＧＡＧＡＣＣＧＴＧＡＣＣＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＣＡｔｔ／３ＡＩｅｘＦ４８８Ｎ／
アンチセンス＿１２＿Ａｌｅｘａ５４６のＤＮＡ
５’−／５ＡＩ ｅｘＦ５４６Ｎ／ａａＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＧＧＴＣＡＣＧＧＴＣＴＣＣ
アンチセンス＿１２＿Ａｌｅｘａ５４６のトランケートＤＮＡ
５’−／５ＡＩ ｅｘＦ５４６Ｎ／ａａＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＧ
ＤＮＡセンス＿ＩｏｗａＢｌａｃｋ ＦＱ
５’／５ＩＡｂＦＱ／ＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＧ

【0148】

ハイブリッドの再会合のスキームを図３４に示す。Ｒ／ＤＮＡハイブリッド中の相補的な１本鎖非ジップドトーホールドを、任意の安定的な二次構造を回避するためＭｆｏｌｄ（Ｚｕｋｅｒ，Ｍ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３１，３４０６−３４１５（２００３））を使用して設計する。３７℃の融点（Ｔ_ｍ）を超えるためには、ＧＣ含有量が６０％以上の非ジップドトーホールドの最小長さは、少なくとも１２ヌクレオチド（ｎｔｓ）とすべきである。設計した１本鎖トーホールドに対するＴ_ｍは、ウォレスルール（Ｗａｌｌａｃｅ，Ｒ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ６，３５４３−３５５７（１９７９））を使用して約４０℃と予測される。２０ｎｔｓ及び３０ｎｔｓのトーホールドも試験した。ｓｉＲＮＡ二重鎖の非対照性により、全てのＨ＿ｓハイブリッドは、２塩基の３’オーバーハングを有する（図３４）。ＤＮＡ、Ｒ／ＤＮＡ及びＲＮＡ二重鎖の相対的な熱力学的安定性を、それぞれ、ＲＮＡについて最も高く、ＤＮＡ二重鎖について最も低く整えることができる（Ｓｕｇｉｍｏｔｏ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４，１１２１１−１１２１６（１９９５））。核酸パッケージＮＵＰＡＣＫ（Ｚａｄｅｈ，Ｊ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｏｍｐｕｔ Ｃｈｅｍ ３２，１７０−１７３（２０１１））を使用して、３７℃、等モル濃度（１μＭ）の個別の鎖でのＲＮＡ及びＤＮＡ二重鎖の二量体化の自由エネルギーを計算した。現在、公的にＲ／ＤＮＡハイブリッド自由エネルギー計算のための利用可能な計算方法が存在しない。従って、設計したＲ／ＤＮＡハイブリッドのΔＧを推定するため、本発明者らは以下の近似等式を使用した：
ΔＧ（Ｒ／ＤＮＡハイブリッド）〜（ΔＧ ＤＮＡ「ハイブリッド」二重鎖）＋（ΔＧ ＲＮＡ「ハイブリッド」二重鎖）／２（等式１）
式中、（ΔＧ ＤＮＡ「ハイブリッド」二重鎖）は、対応するＲ／ＤＮＡハイブリッドと同一の配列を有するＤＮＡ二重鎖について計算した自由エネルギーであり、ΔＧ（ＲＮＡ「ハイブリッド」二重鎖）は、同じハイブリッドと同一の配列を有するＲＮＡ二重鎖の自由エネルギーである。
初期状態の自由エネルギーを計算した：
ΔＧ_{ｉｎｉｔｉａｌ}〜ΔＧ（Ｒ／ＤＮＡハイブリッド１）＋ΔＧ（Ｒ／ＤＮＡハイブリッド２）（等式２）
最終状態の自由エネルギーを計算した：
ΔＧ_{ｆｉｎａｌ}〜ΔＧ（最終ＲＮＡ二重鎖）＋ΔＧ（最終ＤＮＡ二重鎖）（等式３）
最終状態と初期状態の間の自由エネルギーの差を計算した。
ΔΔＧ〜ΔＧ_{ｆｉｎａｌ}−ΔＧ_{ｉｎｉｔｉａｌ} （等式４）

【0149】

従って、トーホールドジッピング後の再会合のための駆動力は、初期状態（約−８５．４ｋｃａｌ／ｍｏｌのΔＧを有するＲ／ＤＮＡハイブリッド（２５及び２７ｂｐ）、上記等式２）及び最終状態（約１０４．９ｋｃａｌ／ｍｏｌのΔＧを有するｓｉＲＮＡ（２５ｂｐ）及びＤＮＡ二重鎖（３９ｂｐ）、上記等式３）の自由エネルギーの差（約−１９．５ｋｃａｌ／ｍｏｌのΔΔＧ、上記等式４）である。ＲＮＡ二重鎖及びＤＮＡ二重鎖の二量体化の自由エネルギーは、ＮＵＰＡＣＫ（Ｚａｄｅｈ，Ｊ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｏｍｐｕｔ Ｃｈｅｍ ３２，１７０−１７３（２０１１））を使用して計算した。

【0150】

実施例３．ダイシングアッセイ及びヒト血清中でのリボヌクレアーゼ分解に対する耐性
操作したＲ／ＤＮＡハイブリッド及びｓｉＲＮＡ二重鎖を調製し、以前に記載されたヒト組換えＤｉｃｅｒ（Ａｆｏｎｉｎ，Ｋ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ６，２０２２−２０３４（２０１１）及びＧｒａｂｏｗ，Ｗ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ １１，８７８−８８７（２０１１））により処理される能力について試験した。
図３４に提示される未変性ゲルシフトアッセイにより、ヒト酵素Ｄｉｃｅｒは個別のＲ／ＤＮＡハイブリッドに対して不活性であるが、ＲＮＡ二重鎖を切断するであろうという、以前に公開された知見（Ｚｈａｎｇ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ＥＭＢＯ ｊｏｕｒｎａｌ ２１，５８７５−５８８５（２００２））を確認した。従って、予備的なダイシングの結果は、細胞に別々に進入する再結合したＲ／ＤＮＡハイブリッドのみがＤｉｃｅｒにより処理され、更に順にＲＮＡｉを活性化するＲＩＳＣに積載されるという見解を支持する。

【0151】

生物学的状況において、ネイキッドｓｉＲＮＡはヌクレアーゼにより急速に分解され得るため、血流中における機能的ｓｉＲＮＡの保持時間を増加するため、化学修飾したｄＮＭＰが導入されることが多い（Ｇｕｏ，Ｐ．，Ｎａｔ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ ５，８３３−８４２（２０１０））。しかしながら、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドは、血流中で良好に保護されていることが報告されている（Ｈｏｅｒｔｅｒ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，ＰｌｏＳ ｏｎｅ ６，ｅ２０３５９（２０１１））。自動認識Ｒ／ＤＮＡハイブリッド及びそれらの対応するｓｉＲＮＡ二重鎖について測定された相対的安定性は、以前の知見を強く確認し 図３４。

【0152】

実施例４．ＦＲＥＴを使用するｉｎ ｖｉｔｒｏでのＲ／ＤＮＡハイブリッド再会合の研究
輸送に対して誘発された反応及び細胞内でのＲ／ＤＮＡハイブリッドの再会合を画像化する更なる機能性を導入するため、及びｉｎ ｖｉｔｒｏでのそれらの相互作用を研究するため、アンチセンス結合ＤＮＡの３’側及びセンス結合ＤＮＡの５’側をＡｌｅｘａ４８８及びＡｌｅｘａ５４６でそれぞれ蛍光的にタグ付けした（図３５Ａ）。これらの色素は、フェルスター共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）研究で一般的に使用される（Ｂｅｒｎｅｙ，Ｃ．＆ Ｄａｎｕｓｅｒ，Ｇ．，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ８４，３９９２−４０１０（２００３））。２つの蛍光標識化したＲ／ＤＮＡハイブリッドを混合し、３７℃でインキュベートした場合、それらの再会合は、Ａｌｅｘａ５４６のフェルスター距離（Ｒ_ｏ＝６．３１ｎｍ）以内にＡｌｅｘａ４８８を配置する。結果として、４６０ｎｍで励起された場合、Ａｌｅｘａ５４６の発光は非常に増加し、Ａｌｅｘａ４８８のシグナルは、予め作製した再結合が不可能な蛍光標識化ＤＮＡ二重鎖の対照系に比べて低下する（図３５Ｂ及び３６）。種々の濃度に関する滴定実験を行って、ＦＲＥＴが記録され得る、同族のＲ／ＤＮＡハイブリッドの最も低い感受性濃度（約５ｎＭ）を判定した（図３６）。

【0153】

また、再会合のキネティクスも同じＦＲＥＴに基づくシステムを使用して研究した。これらの実験では、Ａｌｅｘａ４８８で標識化したＲ／ＤＮＡハイブリッドを３７℃にて２分間インキュベートし、続いてＡｌｅｘａ５４６でタグ付けしたハイブリッドを添加した。ＦＲＥＴ測定による再会合のプロセスを３０秒毎に追跡した（図３５Ｃ）。幾つかの異なる濃度の同族のＲ／ＤＮＡハイブリッドでこの実験を繰り返した（図３７Ａ〜３７Ｆ）。自動認識Ｒ／ＤＮＡハイブリッドの再会合反応は、２つの工程からなり、以下の等式により表される：

【0154】

【数1】

【0155】

式中、Ｒ及びＤは１本鎖ＲＮＡ及びＤＮＡを現す。第１工程（ｋ_１）は、トーホールドのジッピングによるＲ／ＤＮＡハイブリッドの自動認識であり、テトラマーの形成をもたらす。第２工程（ｋ_２）は、ＲＮＡ二重鎖及びＤＮＡ二重鎖を生じるリハイブリダイゼーションである。

【0156】

再結合のキネティクス
再会合プロセスの間に起こる反応は、以下の通り説明される：

【0157】

【数2】

【0158】

或いはより簡潔には、

【0159】

【数3】

【0160】

次に、種々の生成物の崩壊は以下の通り説明され得る：

【0161】

【数4】

【0162】

２つのキネティクス定数が異なる場合、微分方程式の統合により以下の速度方程式が得られる：

【0163】

【数5】

【0164】

最初に、再会合が起こらないことから、［Ｂ］_０＝０及び［Ｃ］_０＝０であり、前記方程式は以下の通り簡略化される：

【0165】

【数6】

【0166】

２つのハイブリッド間の第１反応が二次的な反応であるため、ｋ_１は初期濃度［Ａ］_０に比例する。
初期濃度が非常に高い場合、［Ａ］_０、ｋ_２＜＜ｋ_１であり、及びＦＲＥＴを産生する生成物の出現Ｃは以下の指数関数型崩壊によりモデル化され得る：
［Ｃ］＝［Ａ］_０（１−ｅ^−ｋ２ｔ）
これについて、速度定数ｋ_２は濃度に非依存的である。
初期濃度が非常に低い場合、［Ａ］_０、ｋ_２＞＞ｋ_１であり、及びＦＲＥＴを産生する生成物の出現Ｃは以下の指数関数型崩壊によりモデル化され得る：
［Ｃ］＝［Ａ］_０（１−ｅ^−ｋ１ｔ）
これについて、速度定数ｋ_１は初期ハイブリッド濃度［Ａ］_０に依存する。
数式モデルにより、高初期濃度のハイブリッドについて、第２工程は速度制限的（ｒａｔｅ ｌｉｍｉｔｉｎｇ）であり、この速度は濃度依存的である一方、低初期濃度のハイブリッドについては、第１工程は速度決定的（ｒａｔｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ）となり、速度は濃度依存的であるということを予想される。このモデルに従い、本発明者らは、単一の指数関数型崩壊で種々の濃度におけるデータをフィッティングすることができ（図３７）、約３０ｎＭより低い濃度において再会合の制限工程は、トーホールドのジッピングである一方で、より高い濃度では、リハイブリダイゼーションが速度決定工程となることを示す。

【0167】

再会合及びｓｉＲＮＡ放出のプロセスにおけるトーホールド相互作用の重要性を強調するため、その再結合する能力についてトーホールドを有さないハイブリッドを試験した（図３７Ｈ）。この実験において、Ａｌｅｘａ４８８で標識化したＨ＿ｓハイブリッドをＡｌｅｘａ５４６で標識化したトランケートハイブリッドＨ＿ａｎｔ＿トランケートと混合し、それらの相互作用を上記のＦＲＥＴ測定により追跡した。結果は、３７℃における３時間のインキュベートの内で顕著な相互作用を示さず、従って、再会合プロセスにおけるトーホールドジッピングの重要な役割に関する証明を与えた。

【0168】

ｉｎ ｖｉｔｒｏでの形質移入条件を模倣するため、この研究において全ての形質移入実験で使用するポリカチオン性担体であるリポフェクタミン２０００（Ｌ２Ｋ）で蛍光標識化ハイブリッドを別々に予めインキュベートし、その後、再会合のキネティクスを追跡した（図３５Ｄ）。結果は、溶液中でＬ２Ｋと一体化した自動認識Ｒ／ＤＮＡハイブリッド間に再会合は示されなかった。興味深いことに、Ｌ２Ｋの添加は、Ａｌｅｘａ４８８及び５４６に対する蛍光シグナルの約１０倍の低下を引き起こす（図３８Ａ）。更に、Ｌ２Ｋは、酵素活性に対して二重鎖に良好な（約４％未満の分解）保護を与える（図３８Ｂ）。

【0169】

再結合を追跡する代替法として、ＩｏｗａＢｌａｃｋ蛍光クエンチャーにより消光したＡｌｅｘａ４８８を有する自動認識二重鎖に基づく別のＦＲＥＴシステムを使用した（図３９）。この場合、再会合は、Ａｌｅｘａ４８８からクエンチャーを分離し、その発光を回復した。以前の知見と一致して、Ｌ２Ｋによる実験は、再結合を示さなかった。

【0170】

実施例５．ＦＲＥＴを使用して細胞内におけるＲ／ＤＮＡハイブリッド再会合をモニタリングした
自動認識Ｒ／ＤＮＡハイブリッドの細胞内への進入及び再結合の能力を、共焦点顕微鏡により評価した。Ａｌｅｘａ４８８及びＡｌｅｘａ５４６で標識化したＲ／ＤＮＡハイブリッドを、ＭＤＡ ＭＢ２３１細胞に同時形質移入し、次の日に共焦点顕微鏡により画像化した（図４０及び４１）。図４０Ａに見られる中断された不均質なパターンは、図４０の蛍光ハイブリッドのエンドソーム位置と一致する。Ａｌｅｘａ４８８及びＡｌｅｘａ５４６蛍光の重複は、それらの一部が異なるエンドソームに分布するものの、黄色シグナルを特徴とする相当量の共局在が起きていることを示している。ＦＲＥＴがそれらのエンドソーム区画内で起こるかどうかを更に確認するため、Ａｌｅｘａ５４６増感発光を画像化した。試料を４８８ｎｍで励起し、Ａｌｅｘａ５４６の発光を収集した。ブリードスルー補正に際して残るＦＲＥＴシグナルを図４０Ａ（１＋４及び５）に提示する。Ｒ／ＤＮＡハイブリッドはエンドソーム区画に共局在するのみならず、かなりのＦＲＥＴを呈する。高濃度のハイブリッドはエンドソーム内に蓄積するため、観察されたＦＲＥＴは更に近辺から発散され、これは再結合をもたらさない。より決定的な方法でこの事項に取り組むため、異なるシステムを使用した。再会合によりＦＲＥＴを呈することが可能なフルオロフォアを導入することに代えて、Ａｌｅｘａ４８８及びＩｏｗａＢｌａｃｋ蛍光発光クエンチャーを含有する消光した自動認識二重鎖を形質移入した。この二重鎖それ自体は何らの蛍光発光も呈さない（図４０Ｂ一番上の行及び図４２）。しかしながら、この消光した二重鎖が自動認識Ｒ／ＤＮＡハイブリッドと共に同時形質移入された場合には、エンドソーム区分内でのＡｌｅｘａ４８８の非消光が観察され、細胞内での２つのコンストラクト間の再会合が起きていることを更に証明している。

【0171】

実施例６．細胞内での再会合Ｒ／ＤＮＡハイブリッドによるｓｉＲＮＡの放出
細胞内における自動認識Ｒ／ＤＮＡハイブリッドの再結合及び治療用部分（ｓｉＲＮＡ）を放出する能力を評価するため、ｅＧＦＰを安定的に発現するヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ２３１／ｅＧＦＰ）による実験を実施した（図４４及び４５）。まず、細胞を一度に１つのみのハイブリッド（Ｈ＿ｓ又はＨ＿ａｎｔ）で同時形質移入し、３日後、ｅＧＦＰ発現レベルを蛍光顕微鏡及びフローサイトメトリーにより分析した。全ての実験を少なくとも３回繰り返した。結果は、個々のハイブリッドにより引き起こされるｅＧＦＰ産生におけるサイレンシングを示さなかった（図４３及び４５Ａ）。しかしながら、別々に調製した、個々の同族のＲ／ＤＮＡハイブリッドを含むＬ２Ｋの複合体（Ｈ＿ｓ／Ｌ２Ｋ及びＨ＿ａｎｔ／Ｌ２Ｋ）で細胞を同時形質移入した場合、３日後に測定されたサイレンシングレベルは、対照の予め形成された非対称Ｄｉｃｅｒ基質ｓｉＲＮＡによる形質移入でもたらされたサイレンシングに匹敵するものであった（図４３及び４３Ｂ）。Ｌ２Ｋ結合Ｒ／ＤＮＡハイブリッドに関する再会合のキネティクス研究に基づき（図３５Ｄ及び図３５Ｅ）、同時形質移入したハイブリッドの再会合及びｓｉＲＮＡ放出は、細胞内ではなく培地中で起こると結論付けることができる。

【0172】

陰性対照として、ＨＩＶ−１に対して設計したｅＧＦＰサイレンシングに無関係の自動認識Ｒ／ＤＮＡハイブリッドを使用した（図４３Ｂ）。また、Ｒ／ＤＮＡハイブリッド再会合による古典的サイズのｓｉＲＮＡ（２１ｎｔｓ）の放出は、非対称Ｄｉｃｅｒ基質ｓｉＲＮＡと比べてより低いサイレンシング効率を示し（図４６）、これは公開されたデータ（Ｒｏｓｅ，Ｓ．Ｄ．ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３，４１４０−４１５６（２００５））と一致する。

【0173】

更に、より高いサイレンシング可能性を有すると報告されている小さい内部セグメント化された干渉ＲＮＡ（Ｂｒａｍｓｅｎ，Ｊ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３５，５８８６−５８９７（２００７））をＲ／ＤＮＡハイブリッドレベルで試験した（図４７）。これらの実験では、センス鎖を２つのより短いＲＮＡ（１／２センス１及び１／２センス２）にセグメント化し、これらをＤＮＡセンス鎖と共に使用してセグメント化Ｒ／ＤＮＡハイブリッド（Ｈ＿セグメント化＿ｓ）を作製した。同時形質移入の結果は、セグメント化ｓｉＲＮＡとのハイブリッドについてより高いサイレンシング効率を示し、これは公開されたデータと一致した（Ｂｒａｍｓｅｎ，Ｊ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３５，５８８６−５８９７（２００７））。

【0174】

実施例７．細胞内でのｓｉＲＮＡ放出に対するトーホールド長の影響
Ｒ／ＤＮＡハイブリッドを異なる２日間に同時形質移入する実験は、同様にいくらかのサイレンシングを示した（図４３Ｂ、赤色線）。これは、細胞内再会合及びｓｉＲＮＡの治療的放出に関する更なる証拠としてはたらく。その後、ｓｉＲＮＡ放出の相対的効率に対するＲ／ＤＮＡハイブリッドにおけるジッピングトーホールドの長さの影響を調査した。同日又は異なる２日間に同時形質移入した１２ｎｔｓ、２０ｎｔｓ及び３０ｎｔｓのトーホールドを有するコンストラクトについて、ｅＧＦＰの相対的サイレンシングを統計学的に分析した。図４８に提示される結果は、同日に同時形質移入したハイブリッドについてサイレンシング効率における差がないことを示す。しかしながら、個々のハイブリッドを１日間隔で形質移入した場合、３０ｎｔｓのトーホールドを有するコンストラクトは、最も高い効率を示し（図４３）、一方で１２及び２０ｎｔｓトーホールドを有するコンストラクトについては、より弱い同等のサイレンシングが観察された。

【0175】

実施例８．ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＲ／ＤＮＡハイブリッドの輸送及び再会合
ｉｎ ｖｉｖｏにおける自動認識Ｒ／ＤＮＡハイブリッドの輸送を評価するため、異種移植片腫瘍を有する無胸腺ヌードマウスにおいて生体分布実験を行った。Ｒ／ＤＮＡハイブリッド及びＩＲＤｙｅ７００で蛍光標識化したＤｉｃｅｒ基質ｓｉＲＮＡを尾静脈注射によりマウスに全身的に輸送した。結果として、ｉｎ ｖｉｖｏ生体分布及び腫瘍取り込みを、１０分後、２０分後、３０分後、４５分後、１時間後、２時間後及び３時間後に蛍光画像化によって推定した（図４９）。生体分布プロファイルは、３時間の時間経過内において他の主要な器官（脾臓、肝臓、腎臓、腸、及び胆嚢）と比較して、腫瘍内で比較的高い自動認識Ｒ／ＤＮＡハイブリッドの取り込みを示す。脾臓、肺、心臓及び脳において、蛍光シグナルは検出されなかった。３時間点において、一部の器官、腫瘍及び血液試料を、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて定量的に分析した。図４９Ｂに示されるように、３時間後のマウス血液中のＲ／ＤＮＡハイブリッドの相対濃度は、ｓｉＲＮＡの濃度よりもほぼ６倍高い。図４９Ｃに示される腫瘍／腎臓比は、主に腎臓に蓄積したｓｉＲＮＡと比較して顕著に高い（約２．５倍）Ｒ／ＤＮＡハイブリッドの取り込みを示す。これは、その分解及び腎排泄をもたらすｉｎ ｖｉｖｏでのｓｉＲＮＡの相対的化学不安定性に起因し得る。更に、本発明者らは、ｅＧＦＰ発現ＭＤＡ−ＭＢ２３１異種移植片のｉｎ ｖｉｖｏにおける遺伝子サイレンシングを行った。自動認識Ｒ／ＤＮＡハイブリッド及びｅＧＦＰに対するｓｉＲＮＡを、２匹のマウスにおいて腫瘍内注射によって投与した。注射から５日後の（対照動物と比較した）腫瘍におけるｅＧＦＰの蛍光強度の測定により、ｅｘ ｖｉｖｏにおいてサイレンシングの程度を分析した（図４９Ｄ及び図５０）。Ｒ／ＤＮＡハイブリッド及びｓｉＲＮＡによる注射の両方が、ｅＧＦＰ蛍光強度の約７０％に匹敵する減少をもたらした。これらの結果は、本発明者らの複数のｉｎ ｖｉｔｒｏサイレンシング実験と良好に一致し、自動認識Ｒ／ＤＮＡハイブリッドによる標的遺伝子のサイレンシングの成功が確認された。

【0176】

実施例９．ＨＩＶ標的及び癌標的に対する自動認識Ｒ／ＤＮＡハイブリッド
前記アプローチの普遍性及び自動認識Ｒ／ＤＮＡハイブリッドを治療用部分として使用することの実行可能性を示すため、幾つかのＨＩＶ−１及び癌遺伝子も標的とした。

【0177】

ＨＩＶ−１標的遺伝子の場合、以前に記載されるｓｉＲＮＡ（Ｌｏｗｅ，Ｊ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２０，８２０−８２８（２０１２）））を使用して自動認識Ｒ／ＤＮＡハイブリッド及び対応するｓｉＲＮＡ二重鎖を設計した。２つの主な標的、すなわちＧａｇ及びＧａｇ−Ｐｏｌポリタンパク質前駆体（ｐｒｏ−ｓｉＲＮＡ）をコードする全長ゲノムＲＮＡに見出されるプロテアーゼコーディング領域、及びＨＩＶ−１糖タンパク質ｅｎｖ ｍＲＮＡ（Ｅｎｖ＿ｓｉＲＮＡ、ｇｐ１２０に位置する）を選択した。図５１に示される結果は、ｓｉＲＮＡ及びＲ／ＤＮＡハイブリッドによる用量依存的ウイルス阻害を示した。たった２０ｎＭのＰｒｏ＿ハイブリッドによりＨＩＶ−１産生を８５％まで阻害した。Ｇａｇ及びＧａｇ−Ｐｏｌをコードする全長ｍＲＮＡにも結合する、Ｅｎｖ＿ｓｉＲＮＡは、６５％〜８５％までウイルス産生を低減した（図５１Ａ）。細胞内のｇｐ１６０及びｇｐ１２０のレベルも低減された（図５１Ｂ）。ＨＩＶ−１ ｇｐ１６０及びｇｐ１２０の阻害は、それぞれ、７６％及び８２％にまで達した（データは示されていない）。細胞内での再結合の後、２０ｎＭのＰｒｏハイブリッドｓｉＲＮＡによりＧａｇ（Ｐｒ５５＋ｐ２４／ｐ２５）の総量を平均で７２％まで低減した。Ｅｎｖ＿ハイブリッドｓｉＲＮＡは、細胞内Ｇａｇを７５％までノックダウンした（図５１Ｂ）。また、本発明者らは、本発明者らのシステムにおけるこれらのｓｉＲＮＡの毒性作用を研究するために異なるアプローチを試験した。同時形質移入したウミシイタケルシフェラーゼをコードするベクターの発現により示されるように、毒性レベルは低かった（補足図５２）。また、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の細胞発現レベルは、有意には影響を受けなかった（データは示されていない）。これらの結果は、自動認識Ｒ／ＤＮＡハイブリッドが細胞内で再結合することができ、種々の標的を介してＨＩＶ−１を阻害することを明確に示している。

【0178】

癌標的遺伝子として、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼＰ１（ＧＳＴＰ１）を選択した。ＧＳＴＰ１は、抗癌剤を含む様々な求電子化合物に対するグルタチオンの共役を触媒する第ＩＩ相解毒酵素である。ＧＳＴＰ１は、腫瘍細胞の発生及び生存において重要な保護的役割を果たす、及び癌において頻繁に観察されるＧＳＴＰ１の過剰発現は化学療法抵抗性と結び付けられていると考えられている（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，Ｄ．Ｍ．＆ Ｔｅｗ，Ｋ．Ｄ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２２，７３６９−７３７５（２００３））。更に、ＧＳＴＰ１は、ｃ−ｊｕｎ−ＮＨ２−キナーゼ１（ＪＮＫ１）と直接相互作用してマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）経路を阻害し、薬物誘導性アポトーシスに対する細胞の感受性を低減することが提案されている（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，Ｄ．Ｍ．＆Ｔｅｗ，Ｋ．Ｄ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２２，７３６９−７３７５（２００３））。ＲＮＡ干渉によるＧＳＴＰ１の発現減少は、化学療法に対して癌細胞を感作するために治療的に使用され得る。

【0179】

内因性ＧＳＴＰ１タンパク質発現は、個別に２４時間間隔の異なる２日間に同時形質移入したＲ／ＤＮＡハイブリッドにより効果的に減少され得ることが示された。Ａ５４９肺腺癌細胞のＲ／ＤＮＡハイブリッドとのインキュベーションは、ＧＳＴＰ１タンパク質産生に顕著な（約５５％）の減少をもたらした（補足図５３）。

【0180】

実施例１０．Ｒ／ＤＮＡキメラ多機能ナノ粒子（ＮＰ）はＨＩＶに感染した細胞に結合して進入し、ＨＩＶに感染した細胞においてアポトーシスを増加する。
治療用Ｒ／ＤＮＡキメラ多機能ナノ粒子（ＮＰ）を、ＨＩＶ感染の認識、可視化及び機能的治癒に向けてコンピューターで設計した。特定の理論に拘束されるものではないが、複数の治療用ｓｉＲＮＡの放出は、ＨＩＶにより感染した細胞に別々に進入する少なくとも２つのＲ／ＤＮＡ ＮＰの存在によって誘発され得る。２以上の同族のＲ／ＤＮＡ ＮＰを、ＨＩＶに感染した細胞の細胞表面タンパク質の特徴（例えば、ｇｐ４１及び／又はｇｐ１２０に対するアプタマー）の発現をターゲッティングする異なる認識ドメインにより装飾する。

【0181】

治療用Ｒ／ＤＮＡ ＮＰを図５４に示す。各々の同族のＲ／ＤＮＡ ＮＰは、独立して治療的に不活性であり、ＤＮＡ鎖に共有結合している幾つかのスプリット機能性（スプリットリパーゼ、スプリット緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等）と同様に、幾つかの機能性（細胞表面認識ドメイン、蛍光タグ、細胞取り込みを容易にするドメイン等）を有する。

【0182】

一実施形態では、２以上の同族のＲ／ＤＮＡ ＮＰは、ＨＩＶに感染した細胞の細胞表面タンパク質の特徴をターゲッティングする異なる認識ドメイン（例えば、ｇｐ４１及び／又はｇｐ１２０に対するアプタマー）で装飾される。コンピューターによる予測は、近接する（例えば、エンドソーム又は細胞質）両方の同族のＲ／ＤＮＡ ＮＰの存在が、操作したトーホールド認識を介して構造的再会合を促進することを示す。これは、機能性（エンドソームエスケープのためのリパーゼ、可視化用のＧＦＰ等）を活性化し、治療用ｓｉＲＮＡを放出する。低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を使用することにより、標的ｍＲＮＡの発現をノックダウンすることがごく普通に可能である。更に、様々なｓｉＲＮＡにより幾つかのヒトアポトーシス阻害遺伝子を同時にターゲッティングすることによって、コンビナトリアルＲＮＡ干渉（ｃｏ−ＲＮＡｉ）を介して細胞死（アポトーシス）を誘導することが可能である。

【0183】

重要なことは、本発明のＲ／ＤＮＡ ＮＰにおいて、治療用ｓｉＲＮＡの数は、具体的な課題に応じて分岐の数を調節することによって完全にプログラム化することができる。ヒト酵素Ｄｉｃｅｒは個別のＲ／ＤＮＡ ＮＰに対して不活性であるが、再結合したｓｉＲＮＡを切断し、一方のｓｉＲＮＡ鎖（ガイド鎖）をＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）へと輸送し、これは次にｃｏ−ＲＮＡｉを活性化する。ガイド鎖は、ヒトアポトーシス阻害遺伝子（ＢＣＬ−２、ＦＬＩＰ、ＳＴＡＴ３、ＸＩＡＰ等）に対するアンチセンス配列を有するように設計される。従って、ｃｏ−ＲＮＡｉの活性化は、ＨＩＶ感染細胞のアポトーシスを生じる。

【0184】

その化学的不安定性及び小さいサイズ（１０ｎｍ未満）のため、一般的なｓｉＲＮＡの薬物動態（ｐｈａｒｍｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）は非常に乏しく、腎臓クリアランスを促進することが知られている。Ｒ／ＤＮＡ ＮＰは１０ｎｍを超える平均サイズで化学的に安定であり、これにより治療用途に魅力的な候補とされている。かかる合成の「賢明な」Ｒ／ＤＮＡ ＮＰは、ＨＩＶに感染した患者の根絶療法に対する主要な構成要素である。

【0185】

実施例１１．ＧＦＰをターゲッティングする自動認識Ｒ／ＤＮＡ二重鎖は細胞内のＧＦＰ発現を減少させた
ヒト細胞におけるＧＦＰの産生をターゲッティングする、最初からの及び研究された自己認識Ｒ／ＤＮＡ二重鎖システムを操作した（図５５）。自動認識Ｒ／ＤＮＡ二重鎖は、細胞内において効果的に互いを発見し、ＧＦＰの合成をノックダウンするｓｉＲＮＡを放出した。従って、自動認識Ｒ／ＤＮＡ二重鎖は、再結合されるまでＤｉｃｅｒには処理されなかった。更に、自動認識Ｒ／ＤＮＡ二重鎖が個別に異なる２日間に形質移入された場合であっても、ｓｉＲＮＡ放出が観察された。

【0186】

実施例１２．ＨＩＶ細胞表面認識ドメイン及びＨＩＶに感染した細胞においてアポトーシスを増加するアポトーシス阻害遺伝子をターゲッティングするｓｉＲＮＡ配列を有する治療用Ｒ／ＤＮＡ ＮＰ
設計した粒子のコンピューターによる特徴づけのため、ＲＮＡの二次構造予想のための新規かつ先行するバイオインフォマティクスアプローチ、ＲＮＡ ３Ｄ構造モデリング及びＲＮＡ配列設計が開発されている。分子運動シミュレーションに供された治療用Ｒ／ＤＮＡ ＮＰの三次元モデルの作製は、合成Ｒ／ＤＮＡ ＮＰのキネティクス動態に関する重要な情報を与える。

【0187】

ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで設計した治療用Ｒ／ＤＮＡ ＮＰのライブラリをｉｎ ｖｉｔｒｏ及びＨＩＶ感染細胞において試験した。所望の組成物のＲ／ＤＮＡ ＮＰ中へと集合するそれらの能力について、新たに設計した配列をｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した。一旦集合すると、２つ一組で同族のＲ／ＤＮＡ ＮＰを自動認識（結合親和性、再結合のキネティクス等）について試験した。同族のＲ／ＤＮＡ ＮＰ対からのｓｉＲＮＡ二重鎖の放出は、ヒトＤｉｃｅｒの処理能力に影響されやすく、治療に有用である。Ｄｉｃｅｒ活性は自動認識再結合の場合に予想される。必要であれば、ＲＮＡ構造に対して適切な化学修飾を行って、再結合したｓｉＲＮＡのＤｉｃｅｒ処理能力、更にはＲＩＳＣ複合体のロードを促進する。

【0188】

Ｒ／ＤＮＡ ＮＰ対の活性を試験するため、異なる時間点、濃度、及び組成物において、ＨＩＶに感染したヒト細胞（Ｈ９及び／又はＪｕｒｋａｔ細胞）を同族のＲ／ＤＮＡ ＮＰで形質移入した。細胞表面ＨＩＶマーカーをターゲッティングする細胞認識ドメインを有するＲ／ＤＮＡ ＮＰは、ＨＩＶに感染した細胞に結合して進入する。Ｒ／ＤＮＡ ＮＰは、ＨＩＶに感染した細胞においてアポトーシスを増加する、アポトーシス阻害遺伝子をターゲッティングするｓｉＲＮＡ配列を含有する。特定の理論に拘束されるものではないが、近接する（例えば、エンドソーム又は細胞質）両方の同族のＲ／ＤＮＡ ＮＰの存在は、操作したトーホールド認識部分を介する構造的な再会合を促進する。アポトーシスは、商業用キットにより、例えば、ＢＤ（商標）ＭｉｔｏＳｃｒｅｅｎ（ＪＣ−１）フローサイトメトリーキットを使用するフローサイトメトリーにより、測定され得る。非感染細胞株を対照として使用する。

【0189】

実施例１３．再会合により複数の機能性を放出する自動認識ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド
これは、複数の機能性（ＦＲＥＴ、アプタマー、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、タンパク質等）を分割し、それらを同時に自動認識ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドへと導入することができる。これらのハイブリッドは、それら自体は不活性であるが、それらの少なくとも２の存在下により再会合及び機能性放出を生じる（図５６）。アプタマー、様々なｓｉＲＮＡ（ｅＧＦＰ及びＨＩＶ−１に対する）、及びフェルスター色素の蛍光対を含有する幾つかのハイブリッドを設計し、実験的に試験した。配列を以下に示す：

【0190】

センス
５’−ｐＡＣＣＣＵＧＡＡＧＵＵＣＡＵＣＵＧＣＡＣＣ
アンチセンス
５’−ｐＵＧＣＡＧＡＵＧＡＡＣＵＵＣＡＧＧＧＵＣＡ
ＭＧアプタマー１
５’−ＵＡＵＧＡＣＡＵＧＧＵＡＡＣＧＡＡＵＧＡＣＡＧＵＡＵ
ＭＧアプタマー２
５’−ＡＵＡＣＵＧＵＣＣＧＡＣＡＵＧＵＣＡＵＡ

【0191】

ｓｉＲＮＡ及びＭＧアプタマー用のハイブリッド
小文字の配列をＤＮＡ鎖に付加してＭＧアプタマー及びｓｉＲＮＡの２ｎｔｓ ３’オーバーハングの非対称性を補償した。

【0192】

【化1】

【0193】

ＭＧアプタマー及びｓｉＲＮＡ

【0194】

【化2】

【0195】

２つのｓｉＲＮＡ

【0196】

【化3】

【0197】

ＭＧアプタマー及び２つのｓｉＲＮＡ

【0198】

【化4】

【0199】

３つのｓｉＲＮＡ

【0200】

【化5】

【0201】

ＨＩＶ−１に対する３つのｓｉＲＮＡ（１８７７、ｌｄｒ、Ｇａｇ）
プロテアーゼ（Ｐｒｏ）．位置２３３２〜２３５６、ｐＮＬ４−３による、−１８７７
センス
５’−ｐＧＡＧＣＡＧＡＵＧＡＵＡＣＡＧＵＡＵＵＡＧＡＡＧＡ
アンチセンス
５’−ＵＣＵＵＣＵＡＡＵＡＣＵＧＵＡＵＣＡＵＣＵＧＣＵＣＣＵ
エンベロープ（Ｅｎｖ）．ｇｐｌ２０、位置７６４２〜７６６５、ｐＮＬ４−３による、−７１９３
センス
５’−ＧＧＡＣＡＡＵＵＧＧＡＧＡＡＧＵＧＡＡＵＵＡＵＡＵＵ
アンチセンス
５’−ｐＵＡＵＡＡＵＵＣＡＣＵＵＣＵＣＣＡＡＵＵＧＵＣＣ
Ｒ／Ｔ−３７２２
センス
５’−ｐＧＡＧＧＡＡＡＵＧＡＡＣＡＡＧＵＡＧＡＵＡＡＡＵ
アンチセンス
５’−ＡＵＵＵＡＵＣＵＡＣＵＵＧＵＵＣＡＵＵＵＣＣＵＣＣＡ

【0202】

【化6】

【0203】

結果は、全ての機能性の放出の成功を示す。ハイブリッドの異なる位置に組み込まれた蛍光レポーターとしてのスプリットマラカイトグリーンアプタマーを使用した（図５７及び５８）。本発明者らは、水溶液中で結合していない状態において、効率的な内部転換によりＳＩ励起状態から非常に低い蛍光量子収率を呈することから、トリフェニルメタン色素であるマラカイトグリーン（ＭＧ）を蛍光レポーターとして選択した。この色素の発光は、ＳＩからの無放射緩和チャネルが閉じた場合に、実質的に増加する。この現象の根本的な機構の詳細は今も議論されており、関連する研究により、高粘性環境又は結合ケージにおくことによりこの色素を「硬化すること（ｒｉｇｉｄｉｆｙｉｎｇ）」は、劇的にその発光を増加することが示されている。例えば、最近では、ＭＧの発光は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ選択（ＳＥＬＥＸ）により得られるＲＮＡアプタマーへの結合により桁違いに増加することが報告されている。

【0204】

自動認識Ｒ／ＤＮＡハイブリッドの細胞内に進入して再結合する能力を、共焦点顕微鏡により評価した（図５９）。Ａｌｅｘａ４８８及びＡｌｅｘａ５４６で標識化したＲ／ＤＮＡハイブリッドをＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に同時形質移入し、翌日に共焦点顕微鏡により画像化した。図５９Ｂに見られる中断された不均質なパターンは、蛍光ハイブリッドのエンドソーム位置と一致する（図５９Ｃ及び５９Ｄ）。Ａｌｅｘａ４８８及びＡｌｅｘａ５４６蛍光発光の重複は、それらの一部が異なるエンドソームに分布しているものの、黄色シグナルを特徴とする相当量の共局在が起きていることを示している。ＦＲＥＴがそれらのエンドソーム区画内で起きているかどうかを更に確認するため、Ａｌｅｘａ５４６増感発光を画像化した。試料を４８８ｎｍで励起し、Ａｌｅｘａ５４６の発光を収集した。ブリードスルー補正により残るＦＲＥＴシグナルが図５９Ｂ（４及び５）に提示される。

【0205】

自動認識Ｒ／ＤＮＡハイブリッドの細胞内で再会合し機能性部分（非対称Ｄｉｃｅｒ基質ｓｉＲＮＡ）を放出する能力を評価するため、安定的にｅＧＦＰを発現するヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ｅＧＦＰ）を用いて実験を行った（図５９Ｄ）。まず、細胞を一度に１つのみのハイブリッド（Ｈ１又はＨ２）で同時形質移入し、３日後ｅＧＦＰの発現レベルを蛍光顕微鏡及びフローサイトメトリーにより分析した。全ての実験を少なくとも３回繰り返した。結果は、個々のハイブリッドにより引き起こされるｅＧＦＰ産生に何らのサイレンシングも示さなかった。しかしながら、別々の調製したＬ２Ｋの複合体及び個々の同族のＲ／ＤＮＡハイブリッド（Ｈ１／Ｌ２Ｋ及びＨ２／Ｌ２Ｋ）で細胞を同時形質移入した場合、３日後に測定したサイレンシングレベルは、３つのｓｉＲＮＡ（ハイブリッド（ｉｉｉ））を放出するハイブリッドに対するより高いサイレンシング効率を有する対照の予備形成された非対称Ｄｉｃｅｒ基質ｓｉＲＮＡによる形質移入によりもたらされるサイレンシングに匹敵した。

【0206】

上記実施例を、以下の材料及び方法を使用して行った。

【0207】

ＲＮＡ及びＤＮＡ配列設計。１本鎖ＤＮＡトーホールド配列をｍＦｏｌｄプログラム（Ｚｕｋｅｒ，Ｍ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３１，３４０６−３４１５ （２００３））で最適化し、代替的な二次構造フォールドの発生を最小化した。以前の研究から二重鎖用のｓｉＲＮＡ配列を使用した（Ａｆｏｎｉｎ，Ｋ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ６，２０２２−２０３４（２０１１）及びＲｏｓｅ，Ｓ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３，４１４０−４１５６（２００５））。使用したＲＮＡ及びＤＮＡ配列の全ての一覧を入手することができる（補足情報）。ハイブリッド二重鎖用のＲＮＡ、ＤＮＡ及び蛍光標識化ＤＮＡをＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．から購入した。蛍光標識化ＤＮＡの場合、２つのヌクレオチドの追加のリンカー（ＴＴ又はＡＡのいずれか）を蛍光タグ用に付加した。

【0208】

ハイブリッドＲ／ＤＮＡ二重鎖の集合及び未変性ＰＡＧＥ。様々な二重鎖形成アプローチが他（Ａｆｏｎｉｎ，Ｋ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ６，２０２２−２０３４（２０１１））及び本研究においてに詳述され、本発明者らは、最も早いプロトコルを使用した。本文に規定される濃度のオリゴ（ＲＮＡ及び／ＤＮＡ）単位を２回に亘り脱イオンした（ｄｏｕｂｌｅｄｅｉｏｎｉｚｅｄ）水に混合し、９５℃にて２分間のヒートブロックでインキュベートした。試料を含有するブロックを熱から除き、１０分間に亘って直接氷上に置いた。９５℃の加熱前又はその工程後にハイブリダイゼーションバッファー（８９ｍＭのＴｒｉｓ、８０ｍＭのホウ酸（ｐＨ８．３）、１０ｍＭの酢酸マグネシウム）を混合物に添加した。未変性ＰＡＧＥ実験を記載される通り行った（Ａｆｏｎｉｎ，Ｋ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ６，２０２２−２０３４（２０１１）；Ａｆｏｎｉｎ，Ｋ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ ９，１９０２−１９０５（２００８）；Ａｆｏｎｉｎ，Ｋ．Ａ．＆ Ｌｅｏｎｔｉｓ，Ｎ．Ｂ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １２８，１６１３１−１６１３７（２００６））。典型的には、報告されている集合実験は、８９ｍＭのＴｒｉｓホウ酸塩、ｐＨ８．３、２ｍＭのＭｇ（ＯＡｃ）_２の存在下で、１０℃にて７％（２９：１）の未変性ポリアクリルアミドゲル上で分析されていた。Ｈｉｔａｃｈｉ ＦＭＢＩＯ ＩＩ Ｍｕｌｔｉ−Ｖｉｅｗ Ｉｍａｇｅｒを使用してＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ染色したＲ／ＤＮＡハイブリッドを可視化した。

【0209】

組換えヒトＤｉｃｅｒアッセイ。最終濃度３μＭまでハイブリッドＲ／ＤＮＡ二重鎖を上述の通り調製した。ダイシング実験のため、製造業者が提案するプロトコルに従って、３７℃にて４時間に亘り、ウルトラアクティブ形態のヒト組換えｄｉｃｅｒ酵素を含有する組換えヒトｔｕｒｂｏ ｄｉｃｅｒ酵素キット（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ）と共に試料をインキュベートした。ダイシング反応を、２ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ）_２未変性７％ＰＡＧＥ（上記される）上での分析の前に、ｄｉｃｅｒ停止溶液（製造業者により提供された）によりクエンチした。

【0210】

ヒト血清分解研究。新たに得たヒト全血血清のアリコート（血液を凝集させ、遠心沈殿させて上清を採取した）をすぐに各々の新たな研究に使用した。様々な期間に亘る３７℃での８０％（ｖ／ｖ）のヒト血清とのインキュベーションの前に、本発明者らによるｉｎ ｖｉｔｒｏでの有効性の研究で使用されたものより１００倍高い濃度のＲＮＡ二重鎖及びＲ／ＤＮＡハイブリッドを氷上に維持した。最終ＲＮＡ濃度は２μＭであった。２％アガロースゲルにロードする直前、ドライアイス上で分解時間経過をクエンチした。Ｈｉｔａｃｈｉ ＦＭＢＩＯ ＩＩ Ｍｕｌｔｉ−Ｖｉｅｗ Ｉｍａｇｅｒを使用して、臭化エチジウムで染色したＲＮＡ二重鎖及びＲ／ＤＮＡハイブリッドを可視化した。

【0211】

蛍光発光研究。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＲ／ＤＮＡハイブリッドの再会合を評価するため、ＦｌｕｏｒｏＭａｘ３（Ｊｏｂｉｎ−Ｙｖｏｎ，Ｈｏｒｉｂａ）を使用するＦＲＥＴ測定を行った。全ての実験について、励起波長を４６０ｎｍに設定し、励起及び発光スリット幅を２ｎｍに設定した。最初の実験セットでは、相補的ＤＮＡをＡｌｅｘａ４８８及びＡｌｅｘａ５４６で修飾した。再結合のキネティクスに従うため、まずセンスＲＮＡを含有するＡｌｅｘａ４８８Ｒ／ＤＮＡハイブリッドを３７℃にて２分間インキュベートし、その後、アンチセンスＲＮＡを含有するＡｌｅｘａ５４３Ｒ／ＤＮＡハイブリッドを本文で規定される等モル量で添加した。ＦＲＥＴ測定による再会合のプロセスを追うため、４６０ｎｍでの励起により、５２０ｎｍ及び５７０ｎｍでの発光を３０秒毎に同時に記録した。これは、形質移入条件に関連する量のネイキッドハイブリッド及び予めリポフェクタミン２０００と複合体化させたハイブリッドにより行われた（以下を参照）。また、等モル量の２つの蛍光標識化ハイブリッドの３時間の同時インキュベーションによる静的測定も行った。２つ目の実験セットでは、Ａｌｅｘａ４８８で修飾された一方の鎖及びＩｏｗａＢｌａｃｋ ＦＱで修飾されたもう一方の鎖を含有するＤＮＡ二重鎖を使用した。Ａｌｅｘａ５４３ Ｒ／ＤＮＡハイブリッド又は非標識化Ｒ／ＤＮＡハイブリッドの添加によるＡｌｅｘａ４８８の脱消光を、ＦＲＥＴ実験について上述の通り行った。Ａｌｅｘａ４８８蛍光発光の減少をＳｉｇｍａｐｌｏｔにおいてフィッティングした。以下の３つのパラメーターを含む単一の指数関数型崩壊方程式：
ｙ＝ｙｏ＋ａｅ^−ｋｔ
にデータをフィットするため、線形回帰を適用した。

【0212】

ＲＱ１ ＤＮａｓｅによる安定性アッセイ。ヌクレアーゼ存在下での予備形成した二重鎖／Ｌ２Ｋ複合体の安定性を調べるため、Ａｌｅｘａ４８８で修飾された一方の鎖及びＩｏｗａＢｌａｃｋ ＦＱで修飾されたもう一方の鎖を含有するＤＮＡ二重鎖を、Ｌ２Ｋと予めインキュベートし、ＦＲＥＴ実験について上述される通り、ＲＱ１ ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた消化によるＡｌｅｘａ４８８の脱消光を行った。対照として、消光したＤＮＡ二重鎖を単独で使用した。ＲＱ１ ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅを製造業者のプロトコルに従って使用した。

【0213】

ｓｉＲＮＡ含有ＲＮＡ ＮＰによるヒト乳癌細胞の形質移入。機能性Ｒ／ＤＮＡハイブリッドの輸送をアッセイするため、ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ｅＧＦＰを含む、又は含まない）を、５％ＣＯ_２インキュベーターにおいて１０％ＦＢＳ及びペニシリン−ストレプトマイシンで補填したＤ−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）中で成長させた。このプロジェクトにおける全ての形質移入を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入したリポフェクタミン２０００（Ｌ２Ｋ）を使用して行った。Ｒ／ＤＮＡハイブリッドの１０倍又は５０倍溶液を、Ｌ２Ｋと共に３０℃にて予めインキュベートした。各形質移入の前に細胞培地をＯＰＴＩ−ＭＥＭで交換し、調製した１０倍又は５０倍ＲＮＡ＿ＮＰ／Ｌ２Ｋ複合体を１倍の最終濃度まで添加した。細胞を４時間インキュベートした後、培地を交換した（Ｄ−ＭＥＭ、１０％ＦＣＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン）。

【0214】

顕微鏡検査。細胞内でのＲ／ＤＮＡハイブリッドの再会合を評価するため、６３×、１．４ ＮＡ拡大レンズを備えたＬＳＭ ７１０共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）を使用して測定を行った。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をガラス底ペトリ皿（Ｉｂｉｄｉ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に播種し、上述のＲ／ＤＮＡハイブリッドによる形質移入に供した。最初の実験セットでは、個々にＡｌｅｘａ４８８及びＡｌｅｘａ５４６で修飾したＲ／ＤＮＡハイブリッドを上述の通り細胞へと同時形質移入した。翌日、室温にて２０分間４％パラホルムアルデヒド中でインキュベートすることにより試料を固定した。その後、細胞の画像を撮り、試料内のＦＲＥＴの出現を評価した。Ａｌｅｘａ４８８画像化のため、アルゴンレーザの４８８ｎｍラインを励起として使用し、発光を４９３〜５５７ｎｍで収集した。Ａｌｅｘａ５４６画像化のため、ＤＰＳＳ ５６１レーザを励起に使用し、発光を５６６〜６８０ｎｍで収集した。ＦＲＥＴによる増感発光を評価するため、４８８ｎｍラインで試料を励起し、５６６〜６８０ｎｍの発光を収集することにより画像を取得した。スペクトル重複のため、ＦＲＥＴシグナルは、アクセプターチャネルへのドナー発光及び、ドナー励起波長によるアクセプター分子の励起によって汚染される。このブリードスルーを個々の色素により形質移入した試料を用いて行った測定により評価し、ＦＲＥＴの画像から数学的に除去した。別の実験セットでは、Ａｌｅｘａ４８８で修飾した一方の鎖及び、ＩｏｗａＢｌａｃｋ ＦＱで修飾した別の鎖を含有するＤＮＡ二重鎖を使用した。この二重鎖を、単独で形質移入するか、又は二重鎖と再結合が可能なＲ／ＤＮＡハイブリッドと同時形質移入するかのいずれかを行った。Ａｌｅｘａ４８８蛍光発光を上述の通りモニタリングした。全ての画像を１エアリーユニットに調整したピンホールを用いて撮った。

【0215】

エンドソーム共局在研究。細胞中の形質膜陥入した蛍光標識化Ｒ／ＤＮＡハイブリッドのエンドソーム位置を確認するため、幾つかのエンドソームマーカーによる共染色実験を行った。１つの実験セットでは、細胞をＡｌｅｘａ５４６ Ｒ／ＤＮＡハイブリッドで形質移入した。次の日、室温にて２０分間、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、その後この温度で扱った。試料をＰＢＳで３回洗浄した後、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で２０分間透過処理した。ＰＢＳによる３回の洗浄に際し、試料を１％ＢＳＡで１時間に亘ってブロックし、その後、初期エンドソーム関連タンパク質ＥＥＡ１（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）又は後期エンドソームマーカーＲａｂ７（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）に対する一次抗体に暴露した。ＰＢＳによる３回の洗浄に際し、試料を二次Ａｌｅｘａ４８８抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で染色した。２つ目の実験セットでは、細胞をＧＦＰ−Ｒａｂ５又はＧＦＰ−Ｒａｂ７を発現するプラスミドで形質移入した。形質移入から２日以内に、細胞をＡｌｅｘａ５４６ Ｒ／ＤＮＡハイブリッドで再度形質移入し、翌日画像化した。両方の実験セットにおいて、Ａｌｅｘａ４８８及び５４６蛍光発光を、上述の共焦点顕微鏡で分析した。

【0216】

フローサイトメトリー実験。フローサイトメトリー実験による統計学的解析のため、１２ウェルプレート（１ウェル当たり１０×１０^４細胞）で成長させたＭＤＡ−ＭＢ−２３１ ２３１（ｅＧＦＰを含む又は含まない）細胞を細胞解離バッファーで解離させ、ＰＢＳで２度洗浄してＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメトリー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）上でｅＧＦＰの発現レベルを蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）分析により判定した。少なくとも２０，０００の事象を収集し、Ｃｅｌｌ ｑｕｅｓｔソフトウェアを使用して分析した。

【0217】

ｉｎ ｖｉｖｏ実験。Ｆｅｄｅｒｉｃｋ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅのガイドラインに従って、動物実験を行った。全ての実験について、１０^６のＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞を各無胸腺ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）の脇腹に注射した。腫瘍の最も長い直径が５ｍｍに達したとき（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ｅＧＦＰなし）注射から約２週間後）に生体分布実験を行った。マウスの尾静脈に、１０μｇ／ｍｌのボラ型両親媒性カチオン性担体（Ｇｒｉｎｂｅｒｇ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ ２１，７６３８−７６４５（２００５）に記載される）と関連付けられた、１００μｌ（５００ｎＭ）のｓｉＲＮＡ＿ＩＲＤｙｅ７００又はＲ／ＤＮＡ＿ＩＲＤｙｅ７００を一度注射した。対照マウスを１００μｌのＰＢＳバッファーで注射した。蛍光画像化（Ｍａｅｓｔｒｏ ＧＮＩＲ−ＦＬＥＸ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）を、動物が麻酔（１Ｌ／分フローでＯ_２中１〜２％のイソフルラン）されている間に、ベースライン（自動蛍光発光を測定するための注射前）、並びに注射から１０分、２０分、３０分、４５分、１時間及び２時間及び３時間後に実施した。スキャン（加熱した画像化テーブル）の前、間、及び麻酔から回復する間の画像化の後、動物の内部温度を維持した。画像分析（自動蛍光発光及び造影剤に関する画像ライブラリ）を製造業者のプロトコルに従って行った（Ｍａｅｓｔｒｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ ２．１０．０，ＣＲｉ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）。造影剤のＩＲ波長パラメーターにより、画像取得は、励起フィルター（５９０±１５ｎｍ）、発光フィルター（６４５ｎｍロングパス）及び１０ｎｍ段階毎の６５０〜８５０ｎｍのマルチスペクトル取得を利用した。目的の領域を異なる器官周辺で摘出し、全シグナル（カウント／秒）を種々の時間点について回収した。その後、シグナルを種々の器官の重量で正規化した。注射から３時間後の時間点において、マウスを安楽死させ（ＡＣＵＣガイドラインによりＣＯ_２窒息）、関連する器官（脾臓、肺、脳、肝臓、腎臓、腸、心臓、腫瘍及び膀胱）の重量を測定し、ｉｎ ｖｉｖｏ画像取得パラメーターの実行を取り込んだ。サイレンシング実験のため、ｅＧＦＰを発現しているＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞を使用した。腫瘍細胞注射の５日後、マウスに、１０μｇ／ｍｌのボラ両親媒性カチオン性担体（他で記載されている）と関連付けられた、１００μｌ（５００ｎＭ）のｓｉＲＮＡを腫瘍内注射するか、自己認識Ｒ／ＤＮＡハイブリッド各々５０μｌ（５００ｎＭ）を同時注射するかのいずれかを行った。対照マウスを１００μｌのＰＢＳバッファーで注射した。５日（１２０時間）後及び１０日（２４０時間）後にマウスを犠牲にした。マウスから腫瘍を取り出し、４℃にて４％ＰＦＡ中で終夜固定した後、４℃にて終夜２０％スクロースに移した。過剰量のスクロースを腫瘍から瓶に入れ、腫瘍をＯＣＴ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ）に包埋した。１０μｍの凍結切片をスライドに置き、ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した後、Ｐｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ ａ／Ｆａｄｅ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でカバースリップした。Ｑｌｍａｇｉｎｇ Ｒｅｔｉｇａ−２０００Ｒカメラ及びＮｉｋｏｎのＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ＡＲ Ｉｍａｇｉｎｇソフトウェアを備えたＮｉｋｏｎのＥｃｌｉｐｓｅ ８０ｉ顕微鏡を使用して画像を取得した。

【0218】

自動認識Ｒ／ＤＮＡハイブリッドによるＨＩＶ−１阻害。細胞内再会合後のハイブリッドによるＨＩＶ−１阻害の潜在的可能性を試験するため、ＨｅＬａ細胞をＷＴ ＨＩＶ−１分子クローンであるｐＮＬ４−３、及びＲ／ＤＮＡハイブリッドで同時形質移入した。２つの異なる標的を選択した：プロテアーゼ、全長ゲノムｍＲＮＡをターゲッティングする；及びｇｐ１２０、ｅｎｖ及び全長の両方のゲノムｍＲＮＡをターゲッティングする。ノックダウン対照として、ヘテロ二重鎖ｓｉＲＮＡを使用した。このアッセイで使用したｓｉＲＮＡ濃度は、５ｎＭ、１０ｎＭ及び２０ｎＭであった。ｐＮＬ４−３及びリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に、ハイブリッドプロテアーゼ＿アンチセンス及びプロテアーゼ＿センスのインキュベーションを別々に行い、その後細胞に添加した（１ウェル当たり２μｇのＤＮＡ及び２μｌのリポフェクタミン２０００）。形質移入の４８時間後、上清を回収し、逆転写酵素（ＲＴ）活性をｉｎ ｖｉｔｒｏ反応で測定した（Ｆｒｅｅｄ １９９４）。ＲＴ活性のレベルは、放出されたウイルスのレベルに正比例する。細胞溶解物を以前に記載されたプロトコル（Ｗａｈｅｅｄ ＡＡ ｅｔ ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８５，１６３−８４（２００９））に従って放射性免疫沈降分析により分析した。簡潔には、形質移入の４８時間後、細胞をＭｅｔ／Ｃｙｓ不含ＲＰＭＩ培地で３０分間飢餓状態に置き、４時間に亘り［^３５Ｓ］Ｍｅｔ／Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−ミックス（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で代謝的に標識化した。細胞溶解物を調製し、ＨＩＶ−１感染患者（ＨＩＶ−Ｉｇ：ＮＩＨ ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ）から集めた免疫グロブリンで免疫沈降した。免疫沈降したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより１２％アクリルアミドゲル上で分離し、ゲルをｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒプレート（Ｋｏｄａｋ又はＦｕｊｉ）に暴露し、Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によりバンドを定量した。全ＨＩＶ−１ Ｇａｇタンパク質を測定し（５５ｋＤａ Ｇａｇ前駆体＋キャプシド ｐ２４／ｐ２５）、値をウイルス対照（ｐＮＬ４−３と共にｓｉＲＮＡを同時形質移入していない）で正規化した。

【0219】

抗ＧＳＴＰ１自動認識Ｒ／ＤＮＡハイブリッドによる形質移入実験及び免疫ブロッティング。製造業者のプロトコルを使用して、ＨｉＰｅｒｆｅｃｔ形質移入試薬（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用い、２５ｎｍｏｌのＲ／ＤＮＡハイブリッド１又は２で６０％コンフルエントのＡ５４９肺腺癌を、形質移入した。最初のハイブリッド添加から２４時間後に、同じプロトコルを使用して補充のハイブリッドを同時形質移入した。細胞を採取し、２４時間後に標準プロトコルを使用して免疫ブロッティング用に処理した。抗ＧＳＴＰ１抗体はＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによるものであり、β−アクチン抗体はＡｂｃａｍによるものであった。

【0220】

増感発光法。
１）Ａｌｅｘａ４８８（Ｇは緑色）及びＡｌｅｘａ５４６（Ｒは赤色）の２つの蛍光プローブを使用した。以下に記載されるように、大文字のＧ及びＲをプローブ自体を略記するために使用し、小文字は対応する励起（Ａｌｅｘａ４８８に対して４８８ｎｍ及びＡｌｅｘａ５４６に対して５６１ｎｍ）及び発光波長（Ａｌｅｘａ４８８について４９３〜５５７ｎｍ及びＡｌｅｘａ５４６について５６６〜６８０ｎｍ）を表すために使用する。
２）各試料について、３つの画像を撮った。最初の２つの画像は４８８励起（ｇ）を使用して同時に撮り、２つの採取収集チャネル、一方はｇで表す４９３〜５５７ｎｍ（ｇｇ、第１画像）及び他方はｒで表す５６６〜６８０ｎｍ（ｇｒ、増感発光及びブリードスルーに相当する第２画像）を用いた。第３画像は５６１励起（ｒ）を使用した直後に、ｒで表す５６６〜６８０ｎｍの発光の収集（ｒｒ、第３画像）を用いて撮った。
２つのプローブを含む試料に対し、増感発光画像（ｇｒ）中の所与のピクセルにおけるＳは、以下の等式により記載される。
Ｓ_ｇｒ^{ｓａｍｐｌｅ}＝Ｆ＋Ｂ_ｇｒ^Ｇ×Ｇ_ｇｇ^{ｓａｍｐｌｅ}＋Ｂ_ｇｒ^Ｒ×Ｒ_ｒｒ^{ｓａｍｐｌｅ} （等式１）
式中、下付き文字の最初の文字は使用した励起波長を指し、２つ目の文字は収集した発光波長を指す（例えば：ｇｒは４８８ｎｍでの緑色励起及び５６６〜６８０ｍｎの赤色発光を現す）。上付き文字のｓａｍｐｌｅは、この値は試料に依存的であることを意味する。Ｆは、所与のピクセルでのＦＲＥＴシグナルである。下付きのＧ及びＲは、各々Ａｌｅｘａ４８８及びＡｌｅｘａ５４６を指す。Ｂ_ｇｒ^Ｇは、４８８ｎｍで励起された場合のＡｌｅｘａ５４６発光チャネルへのＡｌｅｘａ４８８のブリードスルーである。同様に、Ｂ_ｇｒ^Ｒは、４８８ｎｍで励起された場合のＡｌｅｘａ４８８発光チャネルへのＡｌｅｘａ５４６のブリードスルーである。それらのブリードスルー補正因子は、以下に記載される別々に測定された定数である。Ｇ_ｇｇ^{ｓａｍｐｌｅ}は、４８８ｎｍにより励起された場合のＡｌｅｘａ４８８からの強度であり、４９３ｎｍ〜５５７ｎｍの発光を収集する。同様に、Ｒ_ｒｒ^{ｓａｍｐｌｅ}は、５６１ｎｍにより励起された場合のａｌｅｘａ５４６からの強度であり、５６６〜６８０ｎｍの発光を収集する。Ｇ_ｇｇ^{ｓａｍｐｌｅ}及びＲ_ｒｒ^{ｓａｍｐｌｅ}は、試料に依存的であり、それぞれ第１画像及び第３画像からのシグナルに対応する。
第１画像について、等式１は以下の通り簡略化する。Ｓ_ＧＧ^{ｓａｍｐｌｅ}＝Ｇ_ＧＧ^{ｓａｍｐｌｅ}
第３画像について、等式１は以下の通り簡略化する。Ｓ_ＲＲ^{ｓａｍｐｌｅ}＝Ｒ_ＲＲ^{ｓａｍｐｌｅ}
２つのブリードスルー補正因子は、Ａｌｅｘａ４８８のみ又はＡｌｅｘａ５４６のみを含有する異なる試料から算出される。
Ａｌｅｘａ４８８のみを含有する試料に対して、等式１は以下の通り簡略化する。
第１画像について、Ｓ_ｇｇ^{ｓａｍｐｌｅ}＝Ｇ_ｇｇ^{ｓａｍｐｌｅ}
第２画像について、Ｓ_ｇｒ^{ｓａｍｐｌｅ}＝Ｂ_ｇｒ^Ｇ×Ｇ_ｇｇ^{ｓａｍｐｌｅ}
２つの比を取ることにより、本発明者らは、Ｂ_ｇｒ^Ｇ＝Ｓ_ｇｒ^{ｓａｍｐｌｅ}／Ｓ_ｇｇ^{ｓａｍｐｌｅ}を得る。
Ａｌｅｘａ５４６のみを含有する試料に対して、等式１は以下の通り簡略化する。
第３画像について、Ｓ_ｒｒ^{ｓａｍｐｌｅ}＝Ｒ_ｒｒ^{ｓａｍｐｌｅ}
第２画像について、Ｓ_ｇｒ^{ｓａｍｐｌｅ}＝Ｂ_ｇｒ^Ｒ×Ｒ_ｒｒ^{ｓａｍｐｌｅ}
２つの比を取ることにより、本発明者らは、Ｂ_ｇｒ^Ｒ＝Ｓ_ｇｒ^{ｓａｍｐｌｅ}／Ｓ_ｒｒ^{ｓａｍｐｌｅ}を得る。
４）全ての画像を、同一の共焦点顕微鏡設定の下で収集し、上記計算を行う前にバックグラウンドシグナルを減算した。

【0221】

他の実施形態
上記より、本明細書に記載される発明に対して、様々な用途及び条件に適合させるため、変化及び改良がなされ得ることが明らかである。また、かかる実施形態は、下記特許請求の範囲の範囲内である。

【0222】

本明細書において任意の変数の定義において列挙される要素は、列挙される要素のうち任意の単独の要素又は組み合わせ（又は部分的組み合わせ）としての変数の定義を包含する。本明細書の実施形態の列挙は、任意の単独の実施形態、又は任意の他の実施形態又はその一部との組み合わせとしての実施形態を包含する。

【0223】

本明細書において言及される特許及び出版物は全て、各々の独立した特許及び出版物が具体的かつ個別に参照により援用されることが示されるのと同じ程度に、本明細書において参照により援用される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】

【図45】

【図46】

【図47】

【図48】

【図49】

【図50】

【図51】

【図52】

【図53】

【図54】

【図55】

【図56】

【図57】

【図58】

【図59】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]