特許 6094022 遺伝子導入ベクターおよびその調製法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6094022

(24)【登録日】2017年2月24日

(45)【発行日】2017年3月22日

(54)【発明の名称】遺伝子導入ベクターおよびその調製法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20170313BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 A

【請求項の数】4

【全頁数】10

(21)【出願番号】特願2009-72745(P2009-72745)

(22)【出願日】2009年2月26日

(65)【公開番号】特開2010-193875(P2010-193875A)

(43)【公開日】2010年9月9日

【審査請求日】2012年2月22日

【審判番号】不服2015-7477(P2015-7477/J1)

【審判請求日】2015年4月3日

(73)【特許権者】

【識別番号】503356668

【氏名又は名称】加藤 敬一

(72)【発明者】

【氏名】加藤 敬一

(72)【発明者】

【氏名】宮▲崎▼ 龍彦

(72)【発明者】

【氏名】坂山 憲史

【合議体】

【審判長】 中島 庸子

【審判官】 長井 啓子

【審判官】 三原 健治

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００３−０１２５０３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００２／２８３６７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００１−２５６５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，ｖｏｌ．２００，ｐｐ．７３−８６（２０００）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

C12N 5/00

ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＣＡ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ベシクル表面上に遺伝子を固定化し、そのベシクルをさらに粒径の大きいベシクルの内水相中に包括して、その包括されたベシクルが粒径の大きいベシクルの内水相中で運動の自由度を有する、二重構造ベシクルである遺伝子導入ベクターであって、両ベシクルは、Ｓｐａｎ（登録商標）８０を主成分とし、カチオニック界面活性剤を含むカチオニックＳｐａｎ（登録商標）８０ベシクルであることを特徴とする、ベクター。

【請求項2】

粒径の大きいベシクルの表面に抗体が固定化されていることを特徴とする、請求項１記載のベクター。

【請求項3】

Ｓｐａｎ（登録商標）８０とカチオニック界面活性剤を混合して調製した、カチオニックＳｐａｎ（登録商標）８０ベシクルの表面上に遺伝子を固定化した小粒径ベシクルを、さらに大粒径のベシクルの中に内包する二重ベシクルの調製法。

【請求項4】

Ｓｐａｎ（登録商標）８０とカチオニック界面活性剤を混合して調製した、カチオニックＳｐａｎ（登録商標）８０ベシクルの表面上に遺伝子を固定化した小粒径ベシクルを、さらに表面に抗体を固定化した大粒径のベシクルの中に内包する二重イムノベシクルの調製法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、生体内遺伝子導入効率に優れた遺伝子ベクターとしてのカチオニックＳｐａｎ（登録商標）８０ベシクルからなる二重ベシクルを用いる遺伝子導入技術に関する。

【背景技術】

【0002】

遺伝子治療などの生体内遺伝子導入を試みるとき、血中に遺伝子ベクターを投与することになる。この場合ベクターに固定化された遺伝子は血中のＤＮａｓｅなどの攻撃を受け分解され易い。そのため従来のような、遺伝子をベクター表面に固定化したものは生体内ではその有効性が低下する。さらに、細胞形質内に導入された遺伝子ベクターは、血中での攻撃を受けるため、細胞形質内での遺伝子ベクターとしての機能が低下する。また、エンドサイトーシスで導入された遺伝子ベクターでは、その遺伝子活性が低下する。そのため血中、および細胞形質内で有効に機能するベクターの開発が望まれている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】特許公開２００３−００１０９７号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

遺伝子導入に際して、導入効率の良い遺伝子ベクターを開発することを目的とする。従来のリポソームを用いた遺伝子導入では、リポソームの外表面に遺伝子を固定化しているため、血中ではその遺伝子がＤＮａｓｅなどの攻撃を受け、活性劣化する。また目的細胞に取り込まれる場合のメカニズムはエンドサイトーシス（細胞貪食）であるため、細胞形質内で遺伝子が核まで送達される効率が悪い。このような状況下、効率の良い遺伝子ベクターを用いた遺伝子導入技術の開発が望まれている。

【課題を解決するための手段】

【0005】

遺伝子ベクターとして、表面に遺伝子を固定化したベシクル（小粒径ベシクル）を、そのベシクルよりもさらに大きいベシクル（大粒径ベシクル）に内包した、いわゆる二重ベシクルを調製する。これらのベシクルにはカチオン界面活性を混合させ、カチオニックなベシクルとして用い、目的細胞への親和性を増強させた。この二重ベシクルは、膜融合能に優れたＳｐａｎ（登録商標）８０ベシクルが基本となっており、高効率の生体内遺伝子導入が期待できる。この導入機能は以下の４段階からなる。▲１▼まず、上記の二重構造を有する大粒径のベシクルを血中に投与して、そのベシクルに内包した小粒径ベシクル表面の遺伝子を、血中のＤＮａｓｅなどの攻撃から保護した状態で、目的細胞まで送達する。▲２▼大粒径ベシクルが目的細胞に到達後は、その大粒径ベシクルが目的細胞と融合して、内包した遺伝子固定化小粒径ベシクルを細胞形質内に放出する。▲３▼その放出された小粒径ベシクルが、細胞形質内で遺伝子ベクターの役割を果して、遺伝子を核まで効率良く送達して、▲４▼核内への遺伝子導入を図る。

【発明の効果】

【0006】

生体内遺伝子導入において、細胞との融合能、生体安全性に優れたＳｐａｎ（登録商標）８０のベシクルを用いて、血中と細胞形質内での二段構えの遺伝子送達機能を付与した。そのため、高効率で安全な遺伝子導入が実現できる。

【図面の簡単な説明】

【0007】

【図1】使用した遺伝子

【図2】種々のベシクル模型図

【図3】プラスミド外付けベシクルを内包した二重ベシクル（ＶＰＶ）の位相差顕微鏡写真

【図4】種々のベシクルによる相対遺伝子発現量のグラフ（ヒト骨肉腫細胞株（ＯＳＴ）の場合）

【図5】種々のベシクルによる相対遺伝子発現量のグラフ（ヒトＥＧＦＲ抗原組み込みマウス細胞 （ＥＲＭ５−１細胞）の場合）

【符号の説明】

【0008】

１．使用した癌細胞
ＯＳＴ：ヒト骨肉腫細胞
ＥＲＭ５−１：ヒトＥＧＦＲ抗原組み込みマウス細胞
２．使用したベシクル
ＶＰＶ： プラスミド外付けベシクルを内包したベシクル
ＩＶＰＶ：プラスミド外付けベシクルを内包したイムノベシクル
ＶＰ： プラスミド内包ベシクル
ＰＶ： プラスミド外付けベシクル
ＶＶ： ベシクル内包ベシクル
３．使用した遺伝子：ｐＥＧＦＰＬｕｃ
４．ＩＡＯＥ：Ｉｓｏｃｙａｎｉｃ Ａｃｉｄ Ｏｃｔａｄｅｃｙｌ Ｅｓｔｅｒ
５．ＤＯＴＡＰ：カチオニック界面活性剤（化学式：Ｃ_４３Ｈ_８３ＮＯ_８Ｓ）
６．ＢｕｆｆｅｒＰ１：プラスミドＤＮＡ調製用の再懸濁バッファー、Ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＲＮａｓｅ Ａ ｎｏｔ ｉｎｃｌｕｄｅｄ）
７．ＢｕｆｆｅｒＰ２：プラスミドＤＮＡ調製用の溶解バッファー、Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ
８．ＢｕｆｆｅｒＰ３：プラスミドＤＮＡ調製用の中和バッファー、Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ
９．ＢｕｆｆｅｒＱＣ：プラスミドＤＮＡ調製用の洗浄バッファー、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ
１０．ＢｕｆｆｅｒＱＦ：プラスミドＤＮＡ調製用の溶出バッファー、Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ
１１．ＢｕｆｆｅｒＱＢＴ：プラスミドＤＮＡ調製用の平衡バッファー、Ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ

【発明を実施するための形態】

【0009】

レポーター遺伝子として、遺伝子導入されるとルシフェラーゼを産性するｐＥＧＦＰＬｕｃを用いて、そのプラスミドを大腸菌で培養して増殖させた。一方、二段階乳化法により調製する界面活性剤Ｓｐａｎ（登録商標）８０ベシクルを基本として、種々のベシクルを調製し、上記の遺伝子のベクターとして用いた。
このＳｐａｎ（登録商標）８０ベシクルには、膜強化剤として微量の大豆レシチンおよびコレステロールを混合し、さらにはカチオン界面活性剤であるＤＯＴＡＰを上記のＳｐａｎ（登録商標）８０中に２０ｗｔ％の割合で混合させ、カチオニックＳｐａｎ（登録商標）８０ベシクルとして用いた。このベシクル粒径はエクストルダーによる粒径制御や二次乳化後の長時間撹拌により、約１５０ｎｍ以下に調製した。
▲１▼この小粒径のカチオニックＳｐａｎ（登録商標）８０ベシクルの表面にｐ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎを媒体としてプラスミドを結合させて、いわゆるプラスミド外付けベシクル（ＰＶ）を調製した。▲２▼一方、カチオニックＳｐａｎ（登録商標）８０ベシクル内にプラスミドを内包したベシクル（ＶＰ）も二段階乳化法により調製した。▲３▼さらに上記のＰＶを内包した二重ベシクル（ＶＰＶ）も調製した。▲４▼またこのＶＰＶベシクルの表面に抗体を固定化したＩＶＰＶも調製した。このような４種類のベシクルを用いて、以下の癌細胞に対する遺伝子導入実験を行った。使用した癌細胞はヒト骨肉腫細胞（ＯＳＴ）およびヒトＥＧＦＲ抗原組み込みマウス細胞（ＥＲＭ５−１）である。ＯＳＴ細胞の遺伝子導入実験に対しては、ＰＶ、ＶＰ、ＶＰＶの三種類のベクターを、また、ＥＲＭ５−１に対する遺伝子導入実験では、ＰＶ、ＶＰ、ＶＰＶ、ＩＶＰＶの４種類を用いた。ＩＶＰＶの抗体には、ＥＲＭ５−１細胞表面の抗原ＥＧＦＲを標的させるために、抗ＥＧＦＲ抗体を用いた。
これらの実験から、二重ベシクルＶＰＶの内部に存在するＰＶが、ベシクルと細胞が融合した後、細胞形質内で核まで遺伝子を送達させるベクターとして機能し、遺伝子導入効率を上昇させることを実証した。

【実施例】

【実施例1】

【0010】

【実施例１】ＥＲＭ５−１細胞、ＯＳＴ細胞のメンテナンスは以下のように行った。
▲１▼細胞が入った１０ｍｌシャーレの上澄み液を除去し、５ｍｌの滅菌ＰＢＳで洗浄し、▲２▼０．０２５％トリプシンを１ｍｌ添加後、細胞をインキュベーターに移し、約３０秒インキュベートする。▲３▼その後、血清をトリプシンと同量添加して、６ｍｌのＤＭＥＭ培地で細胞をはがし、▲４▼遠心管にその細胞溶液を移して遠心処理する（１０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）。▲５▼その上澄み液を除去する。▲６▼一方、新しいシャーレに血清１ｍｌ、ＤＭＥＭ培地８ｍｌを添加する。▲７▼（▲５▼）で沈殿した細胞を、希釈したい量の培地で懸濁する。▲８▼この細胞懸濁液１ｍｌを上記（▲６▼）のシャーレに添加し、▲９▼そのシャーレを速やかにインキュベーターに移す。

【実施例2】

【0011】

【実施例２】使用したプラスミドを図１に示す。プラスミド調製法は以下のように行った。▲１▼（ＬＢ培地の調製法）ＮａＣｌ １ｇ、ＢａｃｔｏＹｅａｓｔＥｘｔｒａｃｔ １ｇ、ポリペプトン２ｇ、蒸留水２００ｍｌを加え攪拌する。オートクレーブ滅菌（１２１℃、２０ｍｉｎ）し、ある程度冷えたら冷蔵保存する。▲２▼（５０ｍｇ／ｍｌカナマイシンの調製）カナマイシン５００ｍｇ、蒸留水１０ｍｇをビーカーに測り取り、攪拌する。ドラフト内でシリンジに移し、フィルターを通して、１５ｍｌ遠心管（３本）に分けて凍結保存する。▲３▼（ＬＢプレートの作成）ＬＢ培地３００ｍｌ、寒天４．５ｇを三角フラスコに入れ、オートクレーブ滅菌（１２１℃、２０ｍｉｎ）後、６５℃近傍で５０ｍｇ／ｍｌカナマイシン６００μｌを加える。その溶液を１０ｍｌシャーレに約１０ｍｌずつ分注し、固まったら冷蔵保存する。▲４▼（大腸菌の形質転換）試験管にＬＢ培地２ｍｌ、大腸菌培養液０．１ｍｌを入れる。３７℃で二時間振盪する（１６６ｍｉｎ^−１）。この大腸菌１．５ｍｌをエッペンチューブに移し、遠心処理後（１２０００ｒｐｍ，３０秒）、上澄み液を吸引除去して、５０ｍＭＣａＣｌ_２ ０．５ｍｌを加え、ボルテックスする。１００μｌをエッペンチューブに移し、目的のプラスミド１０μｌを加え、氷上に２０分間以上放置する。その後、試験管にＬＢ培地１ｍｌと上記放置の大腸菌を入れ、３７℃で１時間振盪する（１６６ｍｉｎ^−１）

ート一面にぬる。▲５▼（大腸菌培養）▲１▼１５ｍｌ遠心管にＬＢ培地２ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌカナマイシン４μｌを入れる。▲２▼前日培養したシャーレ（上記ＬＢプレートにぬったもの）から大腸菌のコロニーをセルスクレーパを用いて採取し、（▲１▼）の培地に加える。▲３▼３７℃で１０〜２０時間振盪する（１６６ｍｉｎ^−１）。▲４▼ＬＢ培地２０ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌカナマイシン４０μｌを入れた１００ｍｌ三角フラスコに、（▲３▼）の溶液を加える。▲５▼これを３７℃で７〜８時間振盪する（１００〜１１０ｍｉｎ^−１）。▲６▼ＬＢ培地１０００ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌカナマイシン２ｍｌを入れた２Ｌ三角フラスコに、（▲５▼）の溶液を加える。▲７▼３７℃で１０〜２０時間振盪する。（１００〜１１０ｍｉｎ^−１）▲６▼（Ｐｌａｓｍｉｄの調製）Ｍａｘｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ Ｐｒｏｔｃｏｌ（ＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ，ｌｏｔ Ｎｏ．４２１４７５３３）により、以下のようにした。▲１▼大腸菌の培養液を遠心管に移し、４℃で５０００×ｇ，１０分間遠心操作しバクテリア細胞を収集する。▲２▼遠心後、上澄み液を棄て、バクテリアペレットを１０ｍｌのＢｕｆｆｅｒ Ｐ１でペレットが無くなるまで懸濁する。▲３▼これに１０ｍｌのＢｕｆｆｅｒ Ｐ２を添加後、４〜６回静かに転倒混和して充分に混合し、５分間室温に放置する。▲４▼これに１０ｍｌのＢｕｆｆｅｒ Ｐ３（４℃に冷却しておく）を添加後、直ちに４〜６回静かに転倒混和して充分に混合した後、２０分間氷上でインキュベートする。▲５▼これを、４℃，７０００×ｇ以上で３０分間遠心操作する。遠心後、プラスミドＤＮＡ（上澄み液）を素早く回収する。▲６▼回収した上澄み液を４℃，７０００×ｇ以上で１５分間再度遠心操作して、プラスミドＤＮＡを含む上澄み液を素早く回収する。▲７▼１０ｍｌのＢｕｆｆｅｒ ＱＢＴにより平衡化しておいたＱＩＡＧＥＮ−ｔｉｐ５００（プラスミド精製用オープンカラム）に（▲６▼）で回収した上澄み液を添加し、自然落下により樹脂に浸透させる。▲８▼このＱＩＡＧＥＮ−ｔｉｐ５００を２×３０ｍｌのＢｕｆｆｅｒ ＱＣで洗浄する。▲９▼その後、１５ｍｌのＢｕｆｆｅｒ ＱＦを用いてプラスミドＤＮＡを溶出する。▲１０▼この溶出液に、１０．５ｍｌの室温のイソプロパノールを添加し、よく混合した後、直ちに４℃、５０００×ｇ以上で６０分間遠心操作する。遠心後、上澄み液を捨てる。▲１１▼ＤＮＡペレットを５ｍｌの室温７０％エタノールで洗浄し５０００×ｇ以上で６０分間遠心操作する。▲１２▼上澄み液を捨て、５０００×ｇ以上で１分間遠心操作する。▲１３▼上澄み液をピペット

に溶解する。▲１５▼分光光度計によりこの溶液のプラスミドＤＮＡ濃度を測定し、濃度を１ｍｇ／ｍｌになるように調整する。

【実施例4】

【0012】

【実施例４】種々のベシクルの調製法を以下に示す。なおここで調製した遺伝子ベクターとしてのベシクルの模型図を図２に示す。

相を構成する溶液）の調整＞００１１段落で記載したプラスミド２０μｌ（濃度５００μｇ／ｍｌ）、Ｐｏｌｙ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ７０μｌ、ＴＥ ｂｕｆｆｅｒ ６０μｌを加えて、１５分間放置した。＜ベシクルの調製＞▲１▼５ｍｌの茶瓶（１）にＳｐａｎ（登録商標）８０を５２．８ｍｇ，５ｍｌの茶瓶（２）にＴｗｅｅｎ８０を２４ｍｇ計り取る。▲２▼（▲１▼）の茶瓶（２）にＴＥ ｂｕｆｆｅｒ ３．０ｍｌを加え撹拌子を入れて撹拌させる。▲３▼（▲１▼）の茶瓶（１）にＤＯＴＡＰ１３．２ｍｇ、コレステロール３ｍｇ，レシチン６ｍｇ，ヘキサン２．０ｍｌを加える。（（コレステロール＋レシチン）の量は全量の１２％になるようにする。コレステロール：レシチン＝１：２になるようにする）。▲４▼（▲３▼）の茶瓶（１）の溶液中に内水（Ｐｌａｓｍｉｄ溶液）１５０μｌを滴下しながらホモジナイザーにより撹拌する。（回転数１００００ｒｐｍ、（１５秒攪拌＋１５秒休み）を８セット。）▲５▼茶瓶（１）をヘキサンで洗いながらすり付きナスフラスコに入れ替え、エバポレーターでヘキサンを除去する。▲６▼そのナスフラスコの中に、（▲２▼）で撹拌しておいたＴｗｅｅｎ８０溶液を加える。（ナスフラスコの壁面についたクリームを割り箸でこすり落とし分散させる。）▲７▼ホモジナイザーで分散させる。（回転数３５００ｒｐｍ、１ｍｉｎ）▲８▼先程の茶瓶（２）に移し変え、撹拌子を入れて一昼夜冷蔵庫で撹拌する。＜ベシクルの精製＞▲１▼瓶のふたを緩めて１５分程度撹拌する。▲２▼遠心管に３ｍｌのベシクル溶液を移し変える。▲３▼そのベシクル溶液を遠心にかける。（５００００ｒｐｍ，２ｈｏｕｒ，４℃）▲４▼遠心後、上層の油玉を取り除く。

【0013】

瓶（１）にＳｐａｎ（登録商標）８０を５２．８ｍｇ、５ｍｌの茶瓶（２）にＴｗｅｅｎ８０を２４ｍｇ計り取る。▲２▼茶瓶（２）にＴＥ ｂｕｆｆｅｒ３．０ｍｌを加え撹拌子を入れて撹拌させる。▲３▼（▲１▼）の茶瓶（１）にＤＯＴＡＰ１３．２ｍｇ、コレステロール３ｍｇ，レシチン６ｍｇ，ヘキサン２．０ｍｌを加える。（（コレステロール＋レシチン）の量は全量の１２％になるようにする。コレステロール：レシチン＝１：２になるようにする。）▲４▼この茶瓶（１）に内水（ＴＥ ｂｕｆｆｅｒ）１５０μｌを滴下しながらホモジナイザーにより撹拌する。（回転数１００００ｒｐｍ、（１５秒攪拌＋１５秒休み）を８セット。）▲５▼茶瓶（１）の溶液をヘキサンで洗いながらすり付きナスフラスコに入れ替え、エバポレーターでヘキサンを除去する。▲６▼そのナスフラスコの中に（▲２▼）で撹拌しておいたＴｗｅｅｎ８０溶液を加え、ナスフラスコの壁面についたクリームを割り箸でこすり落とし分散させる。▲７▼そのナスフラスコをホモジナイザー処理する（回転数３５００ｒｐｍ、１ｍｉｎ）。▲８▼この処理した溶液を、上記の空の茶瓶（２）に戻し、撹拌子を入れて一昼夜冷蔵庫で撹拌する（こうして長時間撹拌することにより、ベシクル粒径が約３０〜１５０ｎｍの小粒径のベシクルが調製される）。▲９▼均一なベシクルを調製するときは、１００ｎｍのメンブランを用いたエクストルダーを用いて粒径制御をして、約１００ｎｍのほぼ均一な小粒径ベシクルにした。＜ベシクルの精製＞▲１▼上記（▲８▼）の一昼夜撹拌保存した茶瓶（２）のふたを緩めて１５分程度撹拌する。▲２▼このベシクル溶液３ｍｌを遠心管に移し変える。▲３▼ベシクル溶液を遠心にかける（５００００ｒｐｍ，４ｈｏｕｒ，４℃）。▲４▼遠心後、上層の油玉を取り除き、精製ベシクル（Ｖ）を調製する。▲５▼Ｐｌａｓｍｉｄ４．２μｌ，Ｐｏｌｙ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ １５μｌ、（▲４▼）で精製したベシクル１０μｌをそれぞれエッペンチューブに加え、１５分間放置する。こうしてＰｏｌｙ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅを結合媒体として、ベシクル表面に、Ｐｌａｓｍｉｄを結合させたＰｌａｓｍｉｄ外付けベシクル（ＰＶ）を調製する。

【0014】

の調製＞▲１▼５ｍｌの茶瓶（１）にＳｐａｎ（登録商標）８０を５２．８ｍｇ，５ｍｌの茶瓶（２）にＴｗｅｅｎ８０を２４ｍｇ計り取る。▲２▼茶瓶（２）にＴＥ ｂｕｆｆｅｒ３．０ｍｌを加え撹拌子を入れて撹拌させる。▲３▼（▲１▼）の茶瓶（１）にＤＯＴＡＰ１３．２ｍｇ、コレステロール３ｍｇ，レシチン６ｍｇ，ヘキサン２．０ｍｌを加える（（コレステロール＋レシチン）の量は全量の１２％になるようにする。コレステロール：レシチン＝１：２になるようにする）。▲４▼内水（００１３段落で調製したｐｌａｓｍｉｄ外付けベシクル懸濁液）を１５０μｌ入れながらホモジナイザーにより撹拌する。（回転数１００００ｒｐｍ、（１５秒攪拌＋１５秒休み）を８セット。）▲５▼（▲３▼）の茶瓶（１）の溶液をヘキサンで洗い落としながら、すり付きナスフラスコに移し、エバポレーターでヘキサンを除去する。▲６▼（▲２▼）で撹拌しておいたＴｗｅｅｎ８０溶液をそのナスフラスコに加える。（ナスフラスコの壁面についたクリームを割り箸でこすり落とし溶解させる。）▲７▼そのナスフラスコの溶液をホモジナイザーで分散させる（回転数３５００ｒｐｍ、１ｍｉｎ）。▲８▼これを茶瓶（２）に移し変え、３時間撹拌して、ヘキサンを完全除去し、一昼夜冷蔵庫で保存する。こうして比較的大粒径のＶＰＶベシクル（平均粒径で３００ｎｍであるが、マイクロサイズのベシクルも生成する）が調製される。＜ベシクルの精製＞▲１▼（▲８▼）の一昼夜撹拌保存した茶瓶（２）のふたを緩めて１５分程度撹拌する。▲２▼このベシクル溶液３ｍｌを遠心管に移し、▲３▼そのベシクル溶液を遠心にかける。（５００００ｒｐｍ，２ｈｏｕｒ，４℃）▲４▼遠心後、上層の油玉を取り除き、Ｐｌａｓｍｉｄ外付けベシクルを内包するベシクル（ＶＰＶ）を調製する。＜二重ベシクルの確認＞▲１▼このようにして調製したＶＰＶのベシクルの顕微鏡写真を図３に示すが、大粒径ベシクル内に小粒径ベシクルが存在している様子が確認できる。実際には、蛍光物質ＦＩＴＣを内包させた小粒径ベシクルを調製して、それを大粒径ベシクルに内包させた。蛍光測定により、その小粒径ベシクルが大粒径ベシクル内に内包されている事を確認した。

【0015】

ＩＡＯＥ−ｐｒｏｔｅｉｎＡ調製＞▲１▼エッペンチューブにｐｒｏｔｅｉｎＡ １００μｌ，Ｃａｒｂｏｎａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ １００μｌを採取して攪拌する。▲２▼別のエッペンチューブにＩＡＯＥ１０ｍｇ，Ｎ−Ｎジメチルホルムアミド１〜２滴を入れ、（▲１▼）の溶液を５０μｌ加える。▲３▼湯槽上で２時間放置する（３０分毎に攪拌）。＜ベシクル調製＞▲１▼５ｍｌの茶瓶（１）にＳｐａｎ（登録商標）８０を１３２ｍｇ，５ｍｌの茶瓶（２）にＴｗｅｅｎ８０を４８ｍｇ計り取る。▲２▼（▲１▼）の茶瓶（２）にｐＨ９．０ Ｃａｒｂｏｎａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ３．０ｍｌ，ＩＡＯＥ−ｐｒｏｔｅｉｎＡ ５０μｌを加え撹拌子を入れて撹拌する。▲３▼（▲１▼）の茶瓶（１）にＤＯＴＡＰ ２６．４ｍｇ、コレステロール６ｍｇ，レシチン１２ｍｇ，ヘキサン３．０ｍｌを加える。（（コレステロール＋レシチン）の量は全量の１２％になるようにする。コレステロール：レシチン＝１：２になるようにする）。▲４▼その茶瓶（１）にベシクルの内水となる水溶液を３００μｌ滴下しながらマイクロホモジナイザーで攪拌する（回転数２００００ｒｐｍ、３ｍｉｎ）。▲５▼（▲４▼）の茶瓶（１）の溶液をヘキサンで洗い落としながらすり付きナスフラスコに入れ替え、エバポレーターでヘキサンを除去する。▲６▼そのナスフラスコに、（▲２▼）で撹拌しておいた、茶瓶（２）のＴｗｅｅｎ８０溶液、およびＩＡＯＥ−ｐｒｏｔｅｉｎの混合溶液を加え、ナスフラスコの壁面についたクリームを割り箸でこすり落とし溶解させる。▲７▼そのナスフラスコ中の溶液をホモジナイザー処理した後（回転数３５００ｒｐｍ、１ｍｉｎ）、▲８▼（▲６▼）の空になった茶瓶（２）に移し変え、３時間撹拌してヘキサンを除去する。▲９▼その後、蔵庫内で保存し、残ったヘキサンを除去する。＜ベシクルの精製＞▲１▼その一昼夜保存の瓶のふたを緩めて１５分程度撹拌する。▲２▼そのベシクル溶液３ｍｌを遠心管に移し変える。▲３▼それを遠心にかける（５００００ｒｐｍ，２ｈｏｕｒ，４℃）。▲４▼遠心後、上層の油玉を取り除いた後、▲５▼ＥＧＦＲ抗体を７５μｌ加え、冷蔵庫内で４８時間放置する。こうして、ベシクル表面にその抗体を固定化して、ＩＶＰＶを調製する。

【実施例3】

【0016】

【実施例３】ＥＲＭ５−１細胞およびＯＳＴ細胞への遺伝子導入をする方法を以下に示す。▲１▼（遺伝子外付けベシクル（ＰＶ）の場合） ▲１▼遺伝子導入実験を行う前日に、６穴プレートに約２×１０^５個／ｍｌに調整したＥＲＭ５−１細胞をプレーティングしておく。▲２▼また遠心管にＰｌａｓｍｉｄ ４．２μｌ，Ｐｏｌｙ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ １５μｌ，ＤＭＥＭ培地１．５ｍｌをそれぞれ混合し、１５分間室温に放置する。▲３▼その後、あらかじめ調製しておいたＤＯＴＡＰ含有ベシクル液（００１３段落の＜ベシクル精製＞の▲４▼に記載）６μｌを（▲２▼）のプラスミド溶液にそれぞれ添加して、１５分間室温に放置し、ＰＶ溶液を調製する。▲４▼上記の（▲１▼）で予めプレーティングしておいたＥＲＭ５−１細胞をＰＢＳで一回洗浄した後、そのＥＲＭ５−１細胞に上記（▲３▼）のＰＶ液を１穴あたり０．５ｍｌ添加する。▲５▼３７℃、５％ＣＯ_２下で３時間保温後、水溶液を全て吸い取った後、ＤＭＥＭ培地を１ｍｌ加えて培地交換する。さらに２４時間培養して、遺伝子導入実験を行った。▲２▼ＰＶ以外のベシクル（ＶＰ，ＶＰＶ，ＩＶＰＶ）は下記の方法によった。▲１▼遺伝子導入実験を行う前日に、１２穴プレートに約２×１０^５個／ｍｌに調整したＥＲＭ５−１細胞を１ｍｌずつプレーティングする。▲２▼プレートの上澄みを除去し、ＰＢＳで細胞を洗浄後、１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地を０．５０ｍｌ入れた後、予め濁度調整しておいた各ベシクルサンプルを、上記の細胞に２５μｌ添加する。▲３▼３時間後、水溶液を全て吸い取った後、ＤＭＥＭ培地を１ｍｌ加えて培地交換する。その後、３７℃、５％ＣＯ_２下で２４時間インキュベートする。こうして上記種々のベシクルによる遺伝子導入実験を行う。▲３▼＜Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ（ｐＥＧＦＰ−ｌｕｃ）＞なお、この方法は本件の全ての遺伝子導入量の評価に用いた。▲１▼各ｗｅｌｌをＰＢＳで二回洗浄後Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ５００μｌ加え、上記の遺伝子導入された細胞を溶解する。▲２▼この細胞溶解液をセルスクレーパーで１．５ｍｌのチューブに回収し、氷上におく。▲３▼ＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓｅｒＪＮＲを立ち上げ、基質投入管を蒸留水で洗浄後、基質（ルシフェリン）でリンスする。▲４▼その氷上のサンプルを遠心処理（１３０００ｒｐｍ，４℃，１ｍｉｎ）して、不溶物を除去して、上澄みを９６ｗｅｌｌプレートに２０μｌずつ加え波長５６２ｎｍでＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓｅｒにより発光量を測定する。こうして、遺伝子導入量を評価した。

【実施例4】

【0017】

【実施例４】
上記のようにして行ったＯＳＴ細胞への遺伝子導入実験の結果を図４に、またＥＲＭ５−１への遺伝子導入の結果を図５に示す。図４では、二重ベシクルのＶＰＶの遺伝子導入はＶＰの約４倍、ＰＶの約４０倍になり、二重ベシクルＶＰＶの遺伝子ベクターとしての優位性が示された。一方、図５に示すように、ＥＲＭ５−１細胞では、二重ベシクルＶＰＶの遺伝子導入はＶＰの約２．７倍、ＰＶの１．５倍となり、やはりＶＰＶの優位性が示された。さらには、外側のベシクルに抗体を取り付けたＩＶＰＶではＶＰＶの約２．８倍となり、抗体固定化の効果が明らかになった。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】