特許 6094485 ビリルビン排泄促進剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6094485

(24)【登録日】2017年2月24日

(45)【発行日】2017年3月15日

(54)【発明の名称】ビリルビン排泄促進剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/00 20060101AFI20170306BHJP

   A61P 39/02 20060101ALI20170306BHJP

   C07K 14/765 20060101ALN20170306BHJP

【ＦＩ】

   A61K37/02ZNA

   A61P39/02

   !C07K14/765

【請求項の数】5

【全頁数】10

(21)【出願番号】特願2013-528062(P2013-528062)

(86)(22)【出願日】2012年8月9日

(86)【国際出願番号】JP2012070310

(87)【国際公開番号】WO2013022058

(87)【国際公開日】20130214

【審査請求日】2015年3月3日

(31)【優先権主張番号】特願2011-175403(P2011-175403)

(32)【優先日】2011年8月10日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000135036

【氏名又は名称】ニプロ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100163647

【弁理士】

【氏名又は名称】進藤 卓也

(74)【代理人】

【識別番号】100182084

【弁理士】

【氏名又は名称】中道 佳博

(74)【代理人】

【識別番号】100123489

【弁理士】

【氏名又は名称】大平 和幸

(72)【発明者】

【氏名】小田切 優樹

(72)【発明者】

【氏名】丸山 徹

(72)【発明者】

【氏名】異島 優

(72)【発明者】

【氏名】蓑毛 藍

【審査官】 光本 美奈子

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１０−１７２２７７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００８−５４３３２３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許第０５７８０５９４（ＵＳ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００７／００４１９８７（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 VEDROVA,D.，The influence of human albumin on hyperbiliaubin in the newborn，ACTA FAC.MED. UNIV. BRUN.，１９６５年，Vol.21, No.47，p.47-57

【文献】 ZUNSZAIN,P.A. et al，Crystallographic Analysis of Human Serum Albumin Complexed with 4Z,15E-Bilirubin-IXα，Journal of Molecular Biology，２００８年，Vol.381, No.2，p.394-406

【文献】 Ahmad B, et al.，Biochemical and Biophysical Research Communications，２００４年，Vol.314，p.166-173

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３８／００

Ａ６１Ｐ ３９／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

血清アルブミンサブドメインIIＡを含み、分子量が２２ｋＤａ以下である血清アルブミンドメインIIタンパク質を有効成分とするビリルビン排泄促進剤。

【請求項2】

前記血清アルブミンサブドメインIIＡが配列番号１のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のビリルビン排泄促進剤。

【請求項3】

前記血清アルブミンドメインIIが配列番号４のアミノ酸配列を有する、請求項１または２に記載のビリルビン排泄促進剤。

【請求項4】

尿中排泄促進剤である請求項１から３のいずれかに記載のビリルビン排泄促進剤。

【請求項5】

４Ｚ，１５Ｚ−ビリルビン−ＩＸα排泄促進剤である請求項１から４のいずれかに記載のビリルビン排泄促進剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明はビリルビン排泄促進剤に関し、より詳細には血清アルブミンのサブドメインIIＡを含む血清アルブミンドメインII様タンパク質を有効成分とするビリルビン排泄促進剤に関する。

【背景技術】

【0002】

ビリルビンは赤血球の構成成分であるヘムの最終分解産物である。様々な異性体が存在する中、生体内に最も豊富に存在する異性体は、４Ｚ，１５Ｚ−ビリルビン−ＩＸα（以下、４Ｚ，１５Ｚ−ＢＲという。）である。新生児は４Ｚ，１５Ｚ−ＢＲの代謝組織である肝臓が未発達なため、高ビリルビン血症になりやすく黄疸ができやすい。ビリルビンが高値になると脳神経に沈着し、脳症を引き起こすこともある。現在、新生児黄疸の第一選択療法は光療法である。光療法とは、新生児の皮膚に光を照射することで水溶性の低い４Ｚ，１５Ｚ−ＢＲから水溶性の高い異性体である４Ｚ，１５Ｅ−ビリルビン−ＩＸα（４Ｚ，１５Ｅ−ＢＲ）やＺ−ルミルビンなどへと変換し、ビリルビンの尿排泄や胆汁排泄を促す療法である。ビリルビンの光療法のメカニズムを図１に示す。しかし、光療法は皮膚に沈着したビリルビンには奏効するが、血液中のビリルビンには光が届かないため効果がない。また、成人の皮膚は光をほとんど透過しないため、光療法は新生児にしか適応されない。

【0003】

そこで、現状では、血液中の血漿を交換することによってビリルビン濃度を低減させる血漿交換や、ビリルビン吸着カラムを用いたビリルビンの吸着除去が行われている。しかし、吸着除去法は感染症のリスクが高く、生体に有用なタンパク質やビタミンも除去されてしまう。

【0004】

ヒト血清アルブミン（以下、ＨＳＡという。）は、成人の血清中に存在する主要な蛋白質であり、肝臓で生産され、種々の血清分子を運搬する担体としての機能をもっている。また、ビリルビンはＨＳＡと結合して肝臓に運ばれ、肝臓でビリルビンがグルクロン酸と結合してより水に溶けやすい抱合型ビリルビンとなる。この抱合型ビリルビンは肝臓から胆汁として分泌される。

【0005】

ＨＳＡは５８５個のアミノ酸からなる一本鎖の構造のタンパク質（配列番号１０）であり、その基本構造は相同性の高い３つのドメイン（ドメインＩ、IIおよびIII）からなり、それぞれサブドメイン（Ａ，Ｂ）に細分化される。ドメインＩは、アミノ酸１位〜１９７位であり、ドメインIIはアミノ酸１８７位〜３８５位であり、ドメインIIIはアミノ酸３８１位〜５８５位である。

【0006】

ビリルビンに関しては、サイトＩ（ドメインII）が高親和性結合サイトであることが報告されている。本発明者らは、高いビリルビン結合活性を有しているアルブミン変異体を得、１９５位および１９９位のアミノ酸がビリルビン結合に関与していることを見出した（特許文献１）。また、本発明者等は、ＨＳＡのドメインＩを含むタンパク質を遺伝子組換えにより生産した（特許文献２）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】特開２０１０−１７２２７７号公報

【特許文献2】特開２００５−２４５２６８号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明は、高ビリルビン血症の新たな治療方法の確立をめざして、ビリルビン排泄促進剤を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明者らは、上記課題を解決するために、ビリルビン、特に、４Ｚ，１５Ｚ−ＢＲを、直接排泄させる方法を鋭意研究した結果、血清アルブミンのサブドメインIIＡを含む血清アルブミンドメインII様タンパク質が、ビリルビンと結合して尿中に排出されることを見出し、本発明を完成した。

【0010】

本発明は、血清アルブミンサブドメインIIＡを含む血清アルブミンドメインII様タンパク質を有効成分とするビリルビン排泄促進剤を提供する。

【0011】

１つの実施態様では、上記血清アルブミンサブドメインIIＡが配列番号１のアミノ酸配列を有する。

【0012】

１つの実施態様では、上記血清アルブミンドメインII様タンパク質が血清アルブミンドメインIIである。

【0013】

１つの実施態様では、上記血清アルブミンドメインIIが配列番号４のアミノ酸配列を有する。

【0014】

１つの実施態様では、上記血清アルブミンドメインII様タンパク質が血清アルブミンサブドメインIＢを含む。

【0015】

１つの実施態様では、尿中排泄促進剤である。

【0016】

１つの実施態様では、４Ｚ，１５Ｚ−ビリルビン−ＩＸα排泄促進剤である。

【発明の効果】

【0017】

本発明のビリルビン排泄促進剤の有効成分である血清アルブミンドメインII様タンパク質は、ビリルビンに結合し、ビリルビンを尿中に速やかに排泄することができる。特に、通常尿中には排泄されない難水溶性の４Ｚ，１５Ｚ−ＢＲに結合して、腎排泄を促すことができる。よって、ビリルビン排泄促進剤、および高ビリルビン血症の治療剤として有効である。また、ＨＳＡは体内に存在するものであり、安全性にも優れており、大人はもちろん、新生児にも安心して投与可能である。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】ビリルビンの光療法のメカニズムを示す図である。

【図2】実施例１および実施例２で得られた血清アルブミンドメインII様タンパク質の４Ｚ，１５Ｚ−ＢＲ結合能を示すグラフである。

【図3】実施例１で得られたヒト血清アルブミンドメインII様タンパク質による４Ｚ，１５Ｚ−ＢＲの排泄促進効果を示すグラフである。

【図4】実施例１で得られたヒト血清アルブミンドメインII様タンパク質による４Ｚ，１５Ｚ−ＢＲの排泄促進効果を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0019】

本発明における血清アルブミンサブドメインIIＡとは、血清アルブミンのドメインIIのサブドメインＡを形成している領域、およびその領域からなる血清アルブミン断片をいう。

【0020】

本発明において血清アルブミンとは、血清中に含まれるアルブミンであり、例えば、ヒトまたは他の温血動物（例えば、ウシ、サル、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ニワトリ、ウズラ）由来であり得る。医薬への利用を考慮すると、ヒト血清アルブミンが好ましい。

【0021】

野生型のヒト血清アルブミン（以下ＨＳＡという。）は、分子量６６．５ｋＤａであり、配列表の配列番号１０の１位から５８５位までのアミノ酸配列を有する。本願発明の血清アルブミンは、ＨＳＡの遺伝子多型、および、これらの変異体を含む。ＨＳＡの遺伝子多型は現在までのところ、６０種以上が報告されている。変異体とは、ＨＳＡのアミノ酸の１つ以上が欠失、置換、または付加したものである。

【0022】

本発明における血清アルブミンサブドメインIIＡには、血清アルブミンのサブドメインIIＡ、その遺伝子多型、および、これらの変異体が含まれる。好ましくは、ＨＳＡのサブドメインIIＡ（以下、ＨＳＡサブドメインIIＡという。）である。血清アルブミンサブドメインIIＡにはビリルビン結合部位が含まれる。

【0023】

ＨＳＡサブドメインIIＡは、少なくとも、配列番号１（配列番号１０の１８７位〜２４８位）のアミノ酸配列を有する。より好ましくは、配列番号２（配列番号１０の１８７位〜２９５位）のアミノ酸配列を有する。さらに好ましくは、配列番号３（配列番号１０の１８７位〜２９８位）のアミノ酸配列を有する。

【0024】

ＨＳＡサブドメインIIＡには、ＨＳＡサブドメインIIＡの遺伝子多型、および、これらの変異体が含まれる。変異体とは、ＨＳＡサブドメインIIＡのアミノ酸の１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、または付加しているものであり、ビリルビンとの親和性を有する限り制限されるものではない。好ましくは、１〜２０個のアミノ酸、さらに好ましくは、１〜１０個のアミノ酸、より好ましくは、１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、または付加されたものである。好ましいＨＳＡサブドメインIIＡ変異体としては、Ｆ２１１Ｒ / Ｒ２１８Ｌ、Ｆ２１１Ｌ / Ｒ２１８Ｓ / Ｒ２２２Ｗが挙げられる。Ｆ２１１Ｒ / Ｒ２１８Ｌは２１１位のフェニルアラニンがアルギニンに、２１８位のアルギニンがロイシンに置換しているＨＳＡサブドメインIIＡ変異体であり、Ｆ２１１Ｌ / Ｒ２１８Ｓ / Ｒ２２２Ｗは２１１位のフェニルアラニンがロイシンに、２１８位のアルギニンがセリンに、２２２位のアルギニンがトリプトファンに置換しているＨＳＡサブドメインIIＡ変異体である。

【0025】

ＨＳＡサブドメインIIＡは、配列番号１、２または３のアミノ酸配列を有するＨＳＡのサブドメインIIＡとは異なる配列であるが、実質的に同一のアミノ酸配列を有し、かつ配列番号１、２または３のアミノ酸配列を有するＨＳＡのサブドメインIIＡと同等またはそれ以上のビリルビンとの親和性を有し、ビリルビンと結合して腎排泄作用を有するタンパク質を含む。

【0026】

本発明において、配列番号１、２または３のアミノ酸配列を有するＨＳＡのサブドメインIIＡと実質的に同一のアミノ酸配列とは、配列番号１、２または３のアミノ酸配列を有するＨＳＡのサブドメインIIＡと好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列である。

【0027】

ここで「相同性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列のアラインメントにおいて、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合（％）を意味する。「類似アミノ酸」とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ）、脂肪族アミノ酸（Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ）、極性アミノ酸（Ｇｌｎ、Ａｓｎ）、塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）、酸性アミノ酸（Ｇｌｕ、Ａｓｐ）、水酸基を有するアミノ酸（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）、側鎖の小さいアミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ）などの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換はタンパク質の表現型に変化をもたらさない（すなわち、保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は、当該技術分野で周知であり、種々の文献に記載されている（例えば、Bowieら，Science, 247: 1306-1310 (1990)を参照）。

【0028】

本発明の血清アルブミンドメインII様タンパク質は、血清アルブミンサブドメインIIＡを含む血清アルブミンの断片であり、分子量は血清アルブミンの２分の１以下である。好ましくは、３分の１以下である。ヒト血清アルブミンドメインII様タンパク質（以下、ＨＳＡドメインII様タンパク質という。）は、ＨＳＡサブドメインIIＡを含むＨＳＡ断片であり、分子量はＨＳＡの２分の１（３３ｋＤａ）以下であり、好ましくは、３分の１（２２ｋＤａ）以下である。

【0029】

本発明の血清アルブミンドメインII様タンパク質は、本発明における血清アルブミンサブドメインIIＡを含む血清アルブミンの断片である。好ましい血清アルブミンドメインII様タンパク質は、ＨＳＡドメインII様タンパク質である。ＨＳＡドメインII様タンパク質は、本発明におけるＨＳＡサブドメインIIＡを含むＨＳＡ断片である。例えば、サブドメインIIＡからなるＨＳＡ断片、ドメインIIからなるＨＳＡ断片、サブドメインＩＢとサブドメインIIＡからなるＨＳＡ断片、ドメインIIとサブドメインＩＢからなるＨＳＡ断片、ドメインＩとサブドメインIIＡからなるＨＳＡ断片などが挙げられる。本発明の血清アルブミンドメインII様タンパク質は、好ましくは、ドメインIIIを含有しない。

【0030】

血清アルブミンドメインII様タンパク質中のサブドメインIIＡは、血清アルブミン中のサブドメインIIＡと同様の立体構造を有していなくてもよく、サブドメインIIＡがその立体構造をほとんど保持していない構造も含む。また、血清アルブミンドメインII様タンパク質のサブドメインIIＡ領域以外の領域は、ドメインを形成していても形成していなくてもよく、サブドメインIIＡ領域を含んでいる限り、Ｎ末端、Ｃ末端の位置は制限されない。

【0031】

本発明の血清アルブミンドメインII様タンパク質の1つの実施態様である血清アルブミンドメインIIＡは、前記血清アルブミンドメインIIＡ領域からなるタンパク質である。

【0032】

本発明の血清アルブミンドメインII様タンパク質の1つの実施態様である血清アルブミンドメインIIには、血清アルブミンのドメインII、その遺伝子多型、および、これらの変異体が含まれる。好ましくは、ＨＳＡのドメインII（以下、ＨＳＡドメインIIという。）である。

【0033】

ＨＳＡドメインIIは、好ましくは、配列番号４（配列番号１０の１８７位〜３４１位）のアミノ酸配列を有する。より好ましくは、配列番号５（配列番号１０の１８７位〜３６１位）のアミノ酸配列を有する。さらに好ましくは、配列番号６（配列番号１０の１８７位〜３８５位）のアミノ酸配列を有する。

【0034】

ＨＳＡドメインIIには、ＨＳＡドメインIIの遺伝子多型、および、これらの変異体が含まれる。変異体とは、ＨＳＡドメインIIのアミノ酸の１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、または付加しているものであり、ビリルビンとの親和性を有する限り制限されるものではない。好ましくは、１〜２０個のアミノ酸、さらに好ましくは、１〜１０個のアミノ酸、より好ましくは、１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、または付加されたものである。

【0035】

ＨＳＡドメインIIには、配列番号４、５または６のアミノ酸配列を有するＨＳＡのドメインIIとは異なる配列であるが、実質的に同一のアミノ酸配列を有し、かつ配列番号４、５または６のアミノ酸配列を有するＨＳＡドメインIIと同等またはそれ以上のビリルビンとの親和性を有し、ビリルビンと結合して腎排泄作用を有するタンパク質を含む。

【0036】

本発明において、配列番号４、５または６のアミノ酸配列を有するＨＳＡのドメインIIと実質的に同一のアミノ酸配列とは、配列番号４、５または６のアミノ酸配列を有するＨＳＡのドメインIIと好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列である。相同性については、上述したとおりである。

【0037】

本発明の血清アルブミンドメインII様タンパク質は、サブドメインIIＡ領域を含み、さらに、ドメインＩ、サブドメインＩＢ、またはサブドメインIIＢを含んでいてもよい。これらには、その遺伝子多型およびその変異体が含まれる。

【0038】

本発明の血清アルブミンドメインII様タンパク質の1つの実施態様である血清アルブミンサブドメインＩＢを含むタンパク質は、サブドメインＩＢとサブドメインIIＡを含む。該タンパク質には、その遺伝子多型およびその変異体が含まれる。好ましくは、ＨＳＡドメインＩＢとＨＳＡサブドメインIIＡからなるＨＳＡ断片である。

【0039】

ＨＳＡドメインＩＢとＨＳＡサブドメインIIＡからなるＨＳＡ断片は、好ましくは、配列番号７（配列番号１０の１８７位〜２９８位）のアミノ酸配列を有する。より好ましくは、配列番号８（配列番号１０の１５０位〜２９８位）のアミノ酸配列を有する。さらに好ましくは、配列番号９（配列番号１０の１２４位〜２９８位）のアミノ酸配列を有する。

【0040】

ＨＳＡドメインＩＢとＨＳＡサブドメインIIＡからなるＨＳＡ断片には、その遺伝子多型およびその変異体が含まれる。変異体とは、ＨＳＡドメインＩＢとＨＳＡサブドメインIIＡからなるＨＳＡ断片の１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、または付加したものであり、ビリルビンとの親和性を有する限り制限されるものではない。好ましくは、１〜２０個のアミノ酸、さらに好ましくは、１〜１０個のアミノ酸、より好ましくは、１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、または付加されたものである。

【0041】

ＨＳＡドメインＩＢとＨＳＡサブドメインIIＡからなるＨＳＡ断片には、配列番号７、８または９のアミノ酸配列を有するＨＳＡ断片とは異なる配列であるが、実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号７、８または９のアミノ酸配列を有するＨＳＡ断片と同等またはそれ以上のビリルビンとの親和性を有し、ビリルビンと結合して腎排泄作用を有するタンパク質を含む。

【0042】

本発明において、配列番号７、８または９のアミノ酸配列を有するＨＳＡ断片と実質的に同一のアミノ酸配列とは、配列番号７、８または９のアミノ酸配列を有するＨＳＡ断片と好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列である。相同性については、上述したとおりである。

【0043】

本発明のビリルビン排泄促進剤の有効成分であるＨＳＡドメインII様タンパク質は、血漿から得られたＨＳＡを薬剤、例えば、ＣＮＢｒ等により切断して、サブドメインIIＡを含有する断片を精製して得ることができる。また、目的とするタンパク質をコ−ドするＤＮＡを、発現ベクタ−に組み込み、好適な宿主を形質転換して、宿主を培養する等、遺伝子組換え法により得ることができる。例えば、特開２０１０−１７２２７７号公報、および特開２００５−２４５２６８に記載されている方法に従い製造し、精製することにより得ることができる。

【0044】

本発明で排泄が促進されるビリルビンは、４Ｚ，１５Ｚ−ＢＲ、４Ｚ，１５Ｅ−ＢＲ等の立体異性体、および、Ｚ−ルミルビン等の構造異性体を含む。

【0045】

本発明のビリルビン排泄促進とは、体内のビリルビンの体外への排泄を促進し、体内、特に血中のビリルビン量を減少させることである。好ましくは、ビリルビンの尿への排泄を促進する。より具体的には、本発明のＨＳＡドメインII様タンパク質とビリルビンの結合体が腎臓で濾過を受けて排泄されることにより、ビリルビンの体外排泄が促進される。

【0046】

本発明のビリルビン排泄促進剤の製剤形態としては錠剤、丸剤、散剤、懸濁剤、カプセル剤、坐剤、注射剤、軟膏剤、貼付剤等が例示される。好ましくは、精製したＨＳＡドメインII様タンパク質から得られる液状製剤や、凍結乾燥して得られる凍結乾燥製剤である。凍結乾燥製剤は、溶解用液剤と共にキット製剤とすることもできる。

【0047】

製剤中には、糖、糖アルコ−ル、アミノ酸等の安定化剤やｐＨ調節剤、賦形剤を添加することができる。また、必要に応じて、製剤化する前または製剤化後にウイルス不活性化処理や滅菌処理を行うことができる。

【0048】

本発明のビリルビン排泄促進剤の投与経路は制限されない。経静脈、経動脈、経口、経皮、経粘膜などが挙げられる。患者の症状、年齢、性別、体重、食事などを考慮して症状を観察しながら、投与量、投与回数を調整する。例えば、注射剤の場合、一回の投与量、１０〜５０ｍｇ／体重を一日に１〜３回投与することができる。また、数日に一回投与とすることができる。必要時のみに投与することもできる。

【0049】

以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【実施例】

【0050】

（実施例１）
ＨＳＡは化学及血清療法研究所から恵与されたものを用いた。ＣＮＢｒとＨＳＡ中のメチオニン残基のモル濃度比が２００：１になるように、３０ｍｇのＨＳＡに７０％ギ酸溶液に溶解したＣＮＢrを１０ｍＬ加え、暗所にて２４時間室温でインキュベートした。その後、反応を停止させるためイオン交換水を４０ｍＬ加え、Ｓｐｅｅｄ ｖａｃ（登録商標） ｐｌｕｓ（Ｓａｖａｎｔ社）にて遠心濃縮し、バッファー置換後、ＡＫＴＡ Ｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケア社）を用いたＨｉＴｒａｐ Ｂｌｕｅ ＨＰによる精製を行った。平衡化は２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、溶出は２Ｍチオシアン酸カリウム＋２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）によるグラジエントによって行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって２０ｋＤａのタンパク質が溶出されているフラクションを確認し、実験に供した。

【0051】

得られた２０ｋＤａのタンパク質は、ドメインＩＢとIIＡからなるＨＳＡドメインII様タンパク質（配列番号９（配列番号１０のＣｙｓ１２４−Ｍｅｔ２９８））であることを非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。得られたＨＳＡドメインII様タンパク質を常法により凍結乾燥して、凍結乾燥製剤を得た。

【0052】

（実施例２）
特開２０１０−１７２２７７に記載の方法に従って、ＨＳＡドメインII遺伝子（配列番号１１）を得て、ピキア属酵母のゲノムに挿入し、ＨＳＡドメインIIの発現細胞を作製した。その後、当該酵母を培養し、ＨＳＡドメインIIの発現・精製を行った。精製したＨＳＡドメインIIをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。得られたＨＳＡドメインII様タンパク質は、ドメインIIからなるタンパク質であって、配列番号６（配列番号１０の１８７位〜３８５位）のアミノ酸配列を有し、分子量は２２ｋＤａであった。得られたＨＳＡドメインII様タンパク質を常法により凍結乾燥して、凍結乾燥製剤を得た。

【0053】

（試験例１）
実施例１で得られたＨＳＡドメインII様タンパク質（以下、２０ｋＤａフラグメントという。）と実施例２で得られたＨＳＡドメインII様タンパク質（以下、ドメインIIともいう。）について、４Ｚ，１５Ｚ−ＢＲとの結合能について測定した。

【0054】

遊離ＢＲ（４Ｚ，１５Ｚ−ＢＲ）濃度はBrodersenの方法（Brodersen et al. J Clin Invest 1974;54:1353-64）を改良して行った。６０μＭ ＢＲと３０μＭタンパク質の混合溶液２００μＬを９６穴イムノプレートに加え、３７℃、２０分間放置した。１．７５ｍＭ Ｈ_２Ｏ_２ １０μＬを加え、３分間放置した後、１μｇ/ｍＬペルオキシダーゼ(horseradish由来)(シグマ)１０μＬを加え反応を開始した。添加後１０分間、各ウェルの４５０ｎｍにおける吸光度をイムノプレートリーダーで測定した。初期酸化速度とＢＲ濃度をプロットした検量線を作成し、遊離ＢＲ濃度を算出した。結果を図２に示す。４Ｚ，１５Ｚ−ＢＲに対する２０ｋＤａフラグメントの結合能とドメインIIの結合能は、同等であった。

【0055】

（試験例２）
２０ｋＤａフラグメントによる４Ｚ，１５Ｚ−ＢＲの腎排泄促進効果を調べた。ラットを３匹ずつ３群に分けて第１群（ＢＲ群）には、４Ｚ，１５Ｚ−ＢＲ（５６０μｇ／体重）を投与し、第２群（ＢＲ−ＨＳＡ群）には、４Ｚ，１５Ｚ−ＢＲ（５６０μｇ／体重）およびＨＳＡ（６２８００μｇ／体重）を投与し、第３群（ＢＲ−２０ｋＤａ群）には、４Ｚ，１５Ｚ−ＢＲ（５６０μｇ／体重）および２０ｋＤａフラグメント（１８９００μｇ／体重）を投与した。２時間後に採血、採尿して、血清中の４Ｚ，１５Ｚ−ＢＲの濃度および尿０．７５〜２．２５ｍｌ中の４Ｚ，１５Ｚ−ＢＲ濃度を測定した。血清中、及び尿中ＢＲ濃度は、QuantiChrom^TM Bilirubin Assay Kit（BioAssay Systems社）を用いて測定した。キットの手順に従い、総ＢＲ、間接ＢＲ濃度を測定した。結果を図３に示す。血中総４Ｚ，１５Ｚ−ＢＲ濃度は、２０ｋＤａフラグメント併用投与でＨＳＡ併用投与と比べて有意に低下した。特にタンパク質結合型４Ｚ，１５Ｚ−ＢＲ濃度が顕著に低下した。尿中総４Ｚ，１５Ｚ−ＢＲ量は２０ｋＤａフラグメント併用投与でＨＳＡ併用投与と比べて有意に増加した。また、尿中のタンパク質量を測定した。結果を図４に示す。尿中タンパク質は２０ｋＤａフラグメント併用投与でＨＳＡ併用投与と比較して有意に増加した。これは、２０ｋＤａフラグメントは４Ｚ，１５Ｚ−ＢＲと結合して尿中に排泄されたことを示す。

【産業上の利用可能性】

【0056】

本発明のビリルビン排泄促進剤は、体内のビリルビンと結合して体外に排出されるので、体内のビリルビン排泄、除去に効果を有し、高ビリルビン血症などの治療に有効である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]