特許6095715 | 知財ポータル「IP Force」

知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」

▶ ワイス・エルエルシーの特許一覧

特許6095715二酸化炭素を用いて肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖の分子量を制御するための方法

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

目に優しい文字サイズ小中大 PDF Top

< >

1
2
3

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6095715

(24)【登録日】2017年2月24日

(45)【発行日】2017年3月15日

(54)【発明の名称】二酸化炭素を用いて肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖の分子量を制御するための方法

(51)【国際特許分類】

C12P 19/04 20060101AFI20170306BHJP

【ＦＩ】

C12P19/04 C

【請求項の数】9

【全頁数】15

(21)【出願番号】特願2015-80051(P2015-80051)

(22)【出願日】2015年4月9日

(62)【分割の表示】特願2011-542424(P2011-542424)の分割

【原出願日】2009年12月17日

(65)【公開番号】特開2015-144614(P2015-144614A)

(43)【公開日】2015年8月13日

【審査請求日】2015年4月24日

(31)【優先権主張番号】61/138,570

(32)【優先日】2008年12月18日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】309040701

【氏名又は名称】ワイス・エルエルシー

(74)【代理人】

【識別番号】100133927

【弁理士】

【氏名又は名称】四本能尚

(72)【発明者】

【氏名】ジーンヘザークリニーン

【審査官】中村勇介

(56)【参考文献】

【文献】特表２００３−５３１５８４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００８−５３５８３８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開平０５−１４８１５７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００８−５３５４９０（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２００８／１１８７５２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２００９−５２７２２２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Narahari S.Pujar，Base Hydrolysis of Phosphodiester Bonds in Pneumococcal Polysaccarides，Biopolymers，２００４年，Vol.75，p.71-84

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｐ１／００−４１／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

高分子量の単離肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）莢膜多糖を含有する溶液を生成するための方法であって、前記多糖が繰返し単位の間にホスホジエステル結合を含み、ここで前記肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）莢膜多糖が血清型１９Ａまたは１９Ｆであり、ａ）繰返し単位の間にホスホジエステル結合を含む莢膜多糖を生成する肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）細菌細胞の発酵培養物を調製するステップと、ｂ）前記発酵培養物にＣＯ_２を供給するステップであって、該ステップが発酵培養物の上部にＣＯ_２を通気するステップを含むステップと、ｃ）前記発酵培養物中で細菌細胞を溶解するステップと、ｄ）前記発酵培養物から肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）莢膜多糖を単離するステップとを含む、方法。

【請求項2】

前記発酵培養物にＣＯ_２を供給するステップが、発酵培養物に重炭酸イオン（ＨＣＯ_３⁻）を加えるステップを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

発酵培養物にＨＣＯ_３⁻を加えるステップが、ＮａＨＣＯ_３を加えるステップを含む、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記発酵培養物にＣＯ_２を供給するステップが、発酵培養物に炭酸イオン（ＣＯ_３^２−）を加えるステップを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

発酵培養物にＣＯ_３^２−を加えるステップが、Ｎａ_２ＣＯ_３を加えるステップを含む、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

さらに前記発酵培養物のｐＨが６．０〜６．６である、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記発酵培養物にＣＯ_２を供給するステップが、ＮａＨＣＯ_３の第１の添加およびＮａ_２ＣＯ_３の第２の添加を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記発酵培養物中で肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を溶解するステップが、前記発酵培養物にデオキシコール酸ナトリウムを加えるステップを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記単離肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）莢膜多糖の分子量が、少なくとも４８０ｋＤａである、請求項１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、糖の繰返し単位の間にホスホジエステル結合を有する単離肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）莢膜多糖の分子量を増大させる方法に関する。

【背景技術】

【0002】

生物の肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（肺炎球菌としても知られている）を原因とする侵襲性疾患の予防を対象とする多価結合型肺炎球菌ワクチンの調製では、選択された肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型を、ワクチンを生成するのに必要とされる多糖を供給するために増殖させる。細胞は、発酵槽で増殖させ、デオキシコール酸ナトリウムまたは代わりの溶解剤の添加によって発酵の終わりに溶解が誘導される。次いで、溶解物ブロスは、下流の精製および細菌細胞を取り囲む莢膜多糖の回収のために集められる。担体タンパク質との抱合後、多糖は最終ワクチン産物に含められ、選択された肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型に対する免疫を、ワクチンの標的集団に与える。

【0003】

多糖のサイズは、各調製バッチ中で分析した品質特性であり、適切に制御しなければならない。従来の処理では、発酵中に塩基滴定液としてＮａＯＨ（水酸化ナトリウム）を使用することを伴ってきた。ＮａＯＨの使用は、タンパク質を取り除き、ろ過を向上させるために、発泡させることなくデオキシコレート溶解物のｐＨを下げることができるという利点がある。この物質は、遠心分離にかけられ、続いてろ過されて０．４５μｍの呼び寸法まで大部分の固形物を取り除く。しかし、このような従来の処理方法は、糖の繰返し単位の間にホスホジエステル結合を有する血清型（例えば、６Ａ、６Ｂ、１９Ａ、および１９Ｆ）に関して低分子量の多糖（＜４５０ｋＤａ）をもたらす。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

したがって、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）細胞溶解物、特に肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型６Ａ、６Ｂ、１９Ａ、または１９Ｆ多糖を含有する溶解物から高分子量の莢膜多糖を回収するための改善された方法が必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0005】

糖の繰返し単位の間にホスホジエステル結合を有する血清型を含有する細胞性肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）溶解物から高分子量の莢膜多糖を回収するための改善された方法を提供する。１つの方法では、糖の繰返し単位の間にホスホジエステル結合を含有する肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の発酵培養物にＣＯ_２を供給する。したがって、本発明の一実施形態において、この方法には、１）繰返し単位の間にホスホジエステル結合を含む莢膜多糖を生成する肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）細菌細胞の発酵培養物を調製するステップと、２）発酵培養物にＣＯ_２を供給するステップと、３）発酵培養物中で細菌細胞を溶解するステップと、４）発酵培養物から肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）莢膜多糖を単離するステップとが含まれ、この場合、繰返し単位の間にホスホジエステル結合を含有する高分子量の単離肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）莢膜多糖を含有する溶液が生成される。

【0006】

特定の実施形態では、多糖血清型１９Ａ、６Ａ、１９Ｆ、６Ｂ、およびその組合せを生成する肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）細菌細胞の発酵培養物を調製する。別の特定の実施形態では、発酵培養物にＣＯ_２を供給することは、発酵培養物に重炭酸イオン（ＨＣＯ_３⁻）を加えるステップ、例えば、発酵培養物にＮａＨＣＯ_３（重炭酸ナトリウム）を加えるステップを含む。他の実施形態では、発酵培養物にＣＯ_２を供給するステップは、発酵培養物に炭酸イオン（ＣＯ_３^２−）を加えるステップ、例えば、発酵培養物にＮａ_２ＣＯ_３（炭酸ナトリウム）を加えるステップを含む。別の実施形態では、発酵培養物にＣＯ_２を供給するステップは、ＮａＨＣＯ_３の第１の添加およびＮａ_２ＣＯ_３の第２の添加を含む。さらに別の実施形態では、発酵培養物にＣＯ_２を供給するステップは、発酵培養物の上部にＣＯ_２を通気するステップを含む。別の実施形態では、単離肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）莢膜多糖の分子量が少なくとも７００ｋＤａである。別の実施形態では、繰返し単位の間にホスホジエステル結合を含む、高分子量の単離肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）莢膜多糖を含有する溶液が提供され、この場合、溶液は上記の方法によって生成される。

【0007】

本発明の別の実施形態では、高分子量の単離肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１９Ａ莢膜多糖を含有する溶液を生成するための方法を提供する。この方法には、１）血清型１９Ａ莢膜多糖を生成する肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）細菌細胞の発酵培養物を調製するステップと、２）発酵培養物にＣＯ_２を供給するステップと、３）発酵培養物中で細菌細胞を溶解するステップと、４）発酵培養物から肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１９Ａ莢膜多糖を単離するステップとが含まれ、それによって高分子量の単離肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１９Ａ莢膜多糖を含有する溶液が生成される。別の実施形態では、高分子量の単離肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１９Ａ莢膜多糖を含有する溶液が提供され、この場合、溶液は上記の方法によって生成される。

【0008】

本発明の別の実施形態では、高分子量の単離肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１９Ｆ莢膜多糖を含有する溶液を生成するための方法を提供する。この方法には、１）血清型１９Ｆ莢膜多糖を生成する肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）細菌細胞の発酵培養物を調製するステップと、２）発酵培養物にＣＯ_２を供給するステップと、３）発酵培養物中で細菌細胞を溶解するステップと、４）発酵培養物から肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１９Ｆ莢膜多糖を単離するステップとが含まれ、それによって高分子量の単離肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１９Ｆ莢膜多糖を含有する溶液が生成される。別の実施形態では、高分子量の単離肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１９Ｆ莢膜多糖を含有する溶液が提供され、この場合、溶液は上記の方法によって生成される。

【0009】

本発明の別の実施形態では、高分子量の単離肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型６Ａ莢膜多糖を含有する溶液を生成するための方法を提供する。この方法には、１）血清型６Ａ莢膜多糖を生成する肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）細菌細胞の発酵培養物を調製するステップと、２）発酵培養物にＣＯ_２を供給するステップと、３）発酵培養物中で細菌細胞を溶解するステップと、４）発酵培養物から肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型６Ａ莢膜多糖を単離するステップとが含まれ、それによって高分子量の単離肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型６Ａ莢膜多糖を含有する溶液が生成される。別の実施形態では、高分子量の単離肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型６Ａ莢膜多糖を含有する溶液が提供され、この場合、溶液は上記の方法によって生成される。

【0010】

本発明の別の実施形態では、高分子量の単離肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型６Ｂ莢膜多糖を含有する溶液を生成するための方法を提供する。この方法には、１）血清型６Ｂ莢膜多糖を生成する肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）細菌細胞の発酵培養物を調製するステップと、２）発酵培養物にＣＯ_２を供給するステップと、３）発酵培養物中で細菌細胞を溶解するステップと、４）発酵培養物から肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型６Ｂ莢膜多糖を単離するステップとが含まれ、それによって高分子量の単離肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型６Ｂ莢膜多糖を含有する溶液が生成される。別の実施形態では、高分子量の単離肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型６Ｂ莢膜多糖を含有する溶液が提供され、この場合、溶液は上記の方法によって生成される。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】３Ｌスケールにおける実験室試験の、滴定塩基としてＮａ_２ＣＯ_３を用いた発酵段階中の光学密度（ＯＤ）、塩基およびグルコースレベルを示す図である。グラム単位の塩基をプロット目的のために１０で割っている。

【図2】３Ｌスケールにおける実験室試験の、滴定塩基としてＮａＯＨを用いた発酵段階中の光学密度（ＯＤ）、塩基およびグルコースレベルを示す図である。グラム単位の塩基をプロット目的のために１０で割っている。

【図3】Ｎａ_２ＣＯ_３またはＮａＯＨの代わりの塩基供給に関する、異なるｐＨ調節における合計タンパク質および多糖の結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0012】

肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は、通常２個ずつ対になっている（双球菌）が、短連鎖または単一細胞としても見られる、グラム陽性、ランセット型の球菌である。これらは血液寒天培地プレート上で容易に増殖して光沢のあるコロニーを作り、β溶血を示す嫌気的環境で増殖させない限りα溶血を示す。ほとんどの肺炎球菌血清型の細胞は、各細胞を取り囲む多糖コーティングである莢膜を有する。この莢膜は、抗体が細菌細胞に付着するのを防ぐことによって食作用を妨害するので、ヒトにおける病原性の決定因子である。現在、９０種以上の既知の肺炎球菌莢膜血清型が確認されており、その２３種の最も一般的な血清型が世界中の侵襲性疾患の約９０％を占めている。

【0013】

ワクチンとして、肺炎球菌多糖被膜は、発達したまたは損なわれていない免疫系を持った個体において、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に対して妥当な程度の免疫を与えることができるが、多糖と抱合したタンパク質は、幼児および最も肺炎球菌感染の危険性がある高齢者にも免疫反応をもたらす。肺炎球菌細胞は、発酵槽で増殖させ、発酵の終わりに溶解を誘導する。次いで、下流の精製および莢膜多糖の回収のために溶解物ブロスを集める。

【0014】

多糖のサイズは、各調製バッチ中で分析した品質特性であり、適切に制御しなければならない。糖の繰返し単位の間にホスホジエステル結合を有する血清型（例えば、６Ａ、６Ｂ、１９Ａ、および１９Ｆ）の分子量は、発酵プロセスのパラメーターによって影響を受ける。本発明の方法は、糖の繰返し単位の間にホスホジエステル結合を有する血清型、例えば血清型６Ａ、血清型６Ｂ、血清型１９Ａ、血清型１９Ｆ、およびその組合せを含有する細胞性肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）溶解物からの高分子量の莢膜多糖の回収を可能にする。

【0015】

本方法の開発において、多糖の最終収量および分子量を変更しようとして、ＨｙＳｏｙの濃度および塩基滴定液の選択を変更した。４つの発酵スキームを試験した。第１では、２８ｇ／ＬＨｙＳｏｙでベースラインＮａＯＨプロセスを使用した。第２では、塩基滴定液として２０％炭酸ナトリウムおよび２０ｇ／ＬＨｙＳｏｙを使用した。第３では、重炭酸ナトリウムの回分処理によって炭酸塩を導入することおよび混合ＮａＯＨ／炭酸塩の塩基滴定液を用いることによって最初の２つの手法の利点を組合せた。第４の手法では、塩基滴定液として炭酸塩を使用し、増殖を強めるために１０ｍＭ重炭酸塩を添加した。

【0016】

発酵中に塩基滴定液としてＮａＯＨを用いることは、タンパク質を取り除き、ろ過を向上させるために、発泡させることなくデオキシコレート溶解物をｐＨ５．０に下げることができるという利点があったが、より低い分子量の多糖（＜４５０ｋＤａ）をもたらした。Ｎａ_２ＣＯ_３では、より高い分子量が得られたが、デオキシコレート溶解物のｐＨを下げた場合に発泡の問題点があった。高ｐＨ保持ステップの６．６では、Ｎａ_２ＣＯ_３を用いた発酵によりゲル様物質が形成し、その後のろ過問題が生じた。ｐＨ滴定液としてＮａＯＨとＮａ_２ＣＯ_３のブレンドを用いることによってＮａ_２ＣＯ_３の量を最小限に抑えることにより、大量のＣＯ_２の突然の放出が原因の発泡およびろ過問題を解消しながら、Ｎａ_２ＣＯ_３の分子量サイズの利益が得られた。増殖を強めるために１０ｍＭＮａＨＣＯ_３を添加した塩基滴定液としての２０％Ｎａ_２ＣＯ_３（ｗ／ｖ）の使用（第４の手法）は、安定した、高分子量の多糖を高収量でもたらした。

【0017】

本発明はこのように、糖の繰返し単位の間にホスホジエステル結合を有する血清型を含有する細胞性肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）溶解物から高分子量の莢膜多糖を回収するための改善された方法を提供する。１つの方法では、糖の繰返し単位の間にホスホジエステル結合を含有する肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の発酵培養物にＣＯ_２を供給する。例示的な糖の繰返し単位の間にホスホジエステル結合を含有する肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型には、血清型６Ａ、６Ｂ、１９Ａ、および１９Ｆが含まれる。したがって、本発明の一実施形態では、繰返し単位の間にホスホジエステル結合を含む高分子量の単離肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）莢膜多糖を含有する溶液を生成するための方法が提供され、この方法には、１）繰返し単位の間にホスホジエステル結合を含む莢膜多糖を生成する肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）細菌細胞の発酵培養物を調製するステップと、２）発酵培養物にＣＯ_２を供給するステップと、３）発酵培養物中で細菌細胞を溶解するステップと、４）発酵培養物から肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）莢膜多糖を単離するステップとが含まれ、これによって、繰返し単位の間にホスホジエステル結合を持つ高分子量の単離肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）莢膜多糖を含有する溶液が生成する。別の実施形態では、本発明は、繰返し単位の間にホスホジエステル結合を持つ高分子量の単離肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）莢膜多糖を含有する溶液に関し、この場合、溶液は上記の方法によって生成する。

【0018】

本発明の方法は、繰返し単位（例えば、血清型６Ａ、６Ｂ、１９Ａ、および１９Ｆ）の間にホスホジエステル結合を含む高分子量の肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）莢膜多糖を生成する。本明細書では、「高分子量」は、少なくとも約４８０ｋＤａ、約４９０ｋＤａ、約５００ｋＤａ、約５１０ｋＤａ、約５２０ｋＤａ、約５２５ｋＤａ、約５５０ｋＤａ、約５７５ｋＤａ、約６００ｋＤａ、約６２５ｋＤａ、約６５０ｋＤａ、約６７５ｋＤａ、約７００ｋＤａ、約７２５ｋＤａ、約７５０ｋＤａ、約７７５ｋＤａ、約８００ｋＤａ、約８２５ｋＤａ、約８５０ｋＤａ、約８７５ｋＤａ、約９００ｋＤａ、約９２５ｋＤａ、約９５０ｋＤａ、約９７５ｋＤａ、または約１０００ｋＤａの分子量を意味する。

【0019】

特定の方法では、発酵培養物にＣＯ_２を供給するステップには、発酵培養物に重炭酸イオン（ＨＣＯ_３⁻）を加えるステップ、例えば、発酵培養物にＮａＨＣＯ_３を加えるステップが含まれる。５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、または５０ｍＭなど、５〜５０ｍＭのＮａＨＣＯ_３の添加を利用することができる。他の方法では、発酵培養物にＣＯ_２を供給するステップには、発酵培養物に炭酸イオン（ＣＯ_３^２−）を加えるステップ、例えば、発酵培養物にＮａ_２ＣＯ_３を加えるステップが含まれる。０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．４Ｍ、０．６Ｍ、０．７Ｍ、０．９Ｍ、１．０Ｍ、１．５Ｍ、１．８Ｍ、または２．０Ｍなど、０．１Ｍ〜２．０ＭのＮａ_２ＣＯ_３の添加を利用することができる。５％（ｗ／ｖ）Ｎａ_２ＣＯ_３、１０％（ｗ／ｖ）Ｎａ_２ＣＯ_３または２０％（ｗ／ｖ）Ｎａ_２ＣＯ_３などの重量／体積（ｗ／ｖ）当量を利用することもできる。さらに他の方法では、発酵培養物にＣＯ_２を供給するステップには、発酵培養物へのＮａＨＣＯ_３の第１の添加およびＮａ_２ＣＯ_３の第２の添加が含まれる。さらなる方法では、発酵培養物にＣＯ_２を供給するステップには、発酵培養物の上部にＣＯ_２を通気するステップが含まれる。５％〜１００％、例えば、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％のＣＯ_２通気を使用してもよい。

【0020】

本発明の方法の範囲内では、細菌細胞は、任意の溶菌剤を使って溶解させることができる。「溶菌剤」は、例えば、洗浄剤を含む、細胞壁破壊および細胞溶解を引き起こす自己溶解素の放出を促進する任意の薬剤である。本明細書では、「洗浄剤」という用語は、細菌細胞の溶解を誘導することができる任意の陰イオンまたは陽イオン洗浄剤を意味する。本発明の方法の範囲内で使用するこのような洗浄剤の代表例には、デオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ）、Ｎ−ラウリルサルコシン（ＮＬＳ）、ケノデオキシコール酸ナトリウム、およびサポニンがある。

【0021】

本発明の一実施形態では、細菌細胞を溶解するのに使用する溶菌剤は、ＤＯＣである。ＤＯＣは、胆汁酸デオキシコール酸のナトリウム塩であり、一般に雌ウシまたは雄ウシなどの生物学的供給源に由来する。ＤＯＣは、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）における細胞壁成長および分裂に関与する自己溶解素であるＬｙｔＡタンパク質を活性化する。ＬｙｔＡタンパク質は、そのＣ末端部分にコリン結合領域を有しており、ｌｙｔＡ遺伝子の変異は、ＤＯＣによる溶解に耐性があるＬｙｔＡ変異体を生じることが知られている。

【0022】

肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖精製中のＤＯＣの使用が健康上のリスクを招くという証拠はないが、このような生物学的に由来する試薬の使用は、潜在的な規制問題を引き起こす可能性がある。したがって、本発明の一実施形態では、細菌細胞を溶解するために使用する溶菌剤は、非動物由来溶菌剤である。本発明の方法の範囲内で使用する非動物由来溶菌剤には、ＤＯＣの作用機構（すなわち、ＬｙｔＡ機能に影響を及ぼし、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）細胞の溶解をもたらす）に類似する作用機構を有する非動物供給源由来の薬剤が含まれる。このような非動物由来溶菌剤には、ＤＯＣの類似体、界面活性剤、洗浄剤、およびコリンの構造類似体があるが、それだけには限定されず、本明細書の以下の実験の項に記載されている手順を用いて決定することができる。一実施形態では、非動物由来溶菌剤は、デカンスルホン酸、ｔｅｒｔ−オクチルフェノキシポリ（オキシエチレン）エタノール（例えばＩｇｅｐａｌ（登録商標）ＣＡ−６３０、ＣＡＳ＃：９００２−９３−１、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓより入手可能）、オクチルフェノールエチレンオキシド縮合物（例えばＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓより入手可能）、Ｎ−ラウリルサルコシンナトリウム（ＮＬＳ）、ラウリルイミノジプロピオネート、ドデシル硫酸ナトリウム、ケノデオキシコレート、ヒオデオキシコレート、グリコデオキシコレート、タウロデオキシコレート、タウロケノデオキシコレート、およびコール酸塩からなる群から選択される。別の実施形態では、非動物由来溶菌剤は、ＮＬＳである。

【0023】

本発明の方法の範囲内で、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）莢膜多糖を、当業者に既知の標準的な技術を用いて単離する。例えば、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）莢膜多糖を生成する細菌細胞の発酵後に、細菌細胞を溶解して細胞溶解物を生成する。次いで莢膜多糖を、遠心分離、沈殿、限外ろ過、およびカラムクロマトグラフィーの使用（例えば、米国特許出願公開第２００６０２２８３８０号、第２００６０２２８３８１号、第２００７０１８４０７１号、第２００７０１８４０７２号、第２００７０２３１３４０号、および第２００８０１０２４９８号を参照のこと）を含む当技術分野で既知の精製技術を用いて、細胞溶解物から単離することができる。

【0024】

上記のプロセス変更は、糖の繰返し単位の間にホスホジエステル結合を有する血清型、例えば血清型６Ａ、血清型６Ｂ、血清型１９Ａ、血清型１９Ｆ、およびその組合せを含有する細胞性肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）溶解物からの高分子量の莢膜多糖の回収を可能にする。これは、肺炎球菌多糖の生成を大きく増進させることができる発酵／回収プロセスの強力な改善である。

【0025】

以下の実施例は、例示のために示しており、限定するためではない。

【実施例】

【0026】

選択された肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型を、ワクチンに含まれる莢膜血清型による肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を原因とする侵襲性疾患に対する能動免疫化のためのワクチンを生成するのに必要とされる多糖を供給するために増殖させた。細胞を発酵槽で増殖させ、発酵の終わりに溶解を誘導した。次いで溶解物ブロスを、下流の精製および莢膜多糖の回収のために集めた。多糖サイズは各調製バッチ中で分析される品質特性なので、多糖サイズは適切に制御しなければならない。糖の繰返し単位の間にホスホジエステル結合を有する血清型（例えば、６Ａ、６Ｂ、１９Ａ、および１９Ｆ）の分子量は、発酵プロセスのパラメーターによって影響を受けていることがわかった。以下の実施例は、多糖分子量を改善するために繰返し単位の間にホスホジエステル結合を有する肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型の発酵中のＣＯ_２の供給に関する試験について記載している。

【0027】

（実施例１）
多糖分子量に対する二酸化炭素供給効果
発酵
３ＬのＢｒａｕｎＢｉｏｓｔａｔＢ発酵槽（Ｂ．ＢｒａｕｎＢｉｏｔｅｃｈ、米国ペンシルベニア州Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ）で実験室での実験を行った。発酵槽にＨＹＳ培地（２０ｇ／ＬＨｙＳｏｙ、２．５ｇ／ＬＮａＣｌ、０．５ｇ／ＬＫＨ_２ＰＯ_４、０．０１３ｇ／ＬＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、０．１５ｇ／ＬＬ−システインＨＣｌ）１．８Ｌを充填した。次いで発酵槽を、１２１℃で６０分間加圧滅菌した。冷却した後、各ユニットに５０％グルコース＋１％硫酸マグネシウム（ｗ／ｖ）（ＤＭＳ）溶液４０または６０ｍＬ／Ｌを加えた。必要に応じて、接種の前に重炭酸ナトリウムを加えた。

【0028】

ＨＹＳ培地１Ｌを含有する２Ｌ種ボトル２本に、１９Ａ型または６Ａ型の凍結保存種菌を接種し、撹拌せずに３６℃で約６〜８時間インキュベートした。発酵槽の接種は、ＯＤ_６００が０．３〜０．９、ｐＨが４．７５〜５．６０のボトルから小分けにした１００ｍＬ（約５．２％ｖ／ｖ）の体積量で行った。発酵温度およびｐＨは、所望の設定値で制御した。３６℃、１Ｌ／分の空気通気、７に制御したｐＨおよび７５ｒｐｍの撹拌の標準条件を使用した。２枚のインペラーを、撹拌シャフト上の低位置および中央位置に配置した。適切な塩基滴定液（３ＮＮａＯＨ、種々の濃度のＮａＨＣＯ_３とブレンドした３ＮＮａＯＨ、種々の濃度のＮａ_２ＣＯ_３およびＮａＨＣＯ_３とブレンドした３ＮＮａＯＨ、ならびに２０％Ｎａ_２ＣＯ_３）を含有するボトルを、自動ｐＨ制御のために接続した。発酵槽を、外部ｐＨ、ＯＤ_６００、グルコース、多糖、およびタンパク質について種々の時点でサンプリングした。グルコース濃度がほとんど枯渇したら、あるいは時間が経つにつれてＯＤの増加が認められなくなったら、実験を終了した。

【0029】

光学密度（ＯＤ_６００）測定
Ｓｈｉｍａｄｚｕ（米国メリーランド州Ｃｏｌｕｍｂｉａ）ＵＶ−１６０１（２ｎｍ帯域幅）またはＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃｓ（米国ニューヨーク州Ｗｅｓｔｂｕｒｙ）Ｇｅｎｅｓｙｓ５分光光度計（５ｎｍ帯域幅）を用いて６００ｎｍで試料の吸光度を読み取ることによって、発酵ブロスの細胞密度を決定した。ユニットは、試料の要求される希釈度に合うように脱イオン（ＤＩ）水で希釈したＨＹＳ培地で対照をとった。吸光度の数値を、十分に分光光度計の直線領域の範囲内である０．４未満に維持するために試料を希釈した。

【0030】

グルコース濃度
細胞を遠心分離機で分離し、その上清をそのまま、もしくはＤＩ水で３倍希釈することによって、グルコースレベルを決定した。試料をＮｏｖａＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ（米国マサチューセッツ州Ｗａｌｔｈａｍ）ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ４００で分析した。

【0031】

多糖分析
試料を最終発酵読み取り値で採取し、０．１３％（ｗ／ｖ）の濃度まで１２％デオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ）で処理し、穏やかに撹拌した。それらを５℃で８〜２４時間保持し、次いで５０％酢酸でｐＨを５．０に調節して、大部分のＤＯＣおよびタンパク質を沈殿させた。５℃でのさらに１２〜２４時間の保持間隔の後、試料を遠心分離した（１４０００ｒｐｍ、Ｓｏｒｖａｌｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州Ｗａｌｔｈａｍ）ＳＳ３４ローター、１５℃で１０分）。上清のｐＨを６．０に調節した。次いで、上清を０．４５μｍＰａｌｌ（米国ニューヨーク州ＥａｓｔＨｉｌｌｓ）ＨＴＴｕｆｆｒｙｎ膜シリンジフィルター（低タンパク質結合）に通してろ過した。ろ過した生成物を、当技術分野でよく知られている標準的な方法を用いて高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ−ＳＥＣ）によって分析した（例えば、Ａｑｕｉｌａｒ、Ｍ．「ＨＰＬＣｏｆＰｅｐｔｉｄｅｓａｎｄＰｒｏｔｅｉｎｓ：ＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＰｒｏｔｏｃｏｌｓ」Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ：ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ（２００４）を参照のこと）。

【0032】

タンパク質分析
タンパク質レベルを、当技術分野でよく知られているドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）法によって分析した（例えば、Ｗａｌｋｅｒ、Ｊ．Ｍ．「ＴｈｅＰｒｏｔｅｉｎＰｒｏｔｏｃｏｌｓＨａｎｄｂｏｏｋ」Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ：ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ（２００２）を参照のこと）。上記で調製したろ過した細胞溶解物（上清）を分注して６５μＬ／チューブでマイクロチューブ中に入れた。還元剤（１０μＬジチオスレイトール（ＤＴＴ））およびＮｕＰＡＧＥ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）４倍ドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）試料バッファー（２５μＬ）の添加を各試料に行った。試料をボルテックスにかけて１０分間加熱してからＮｕＰＡＧＥ（登録商標）４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ１２ウェルゲルに１０μＬ／レーンを導入した。ゲルをＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ−ＳＤＳバッファー中１５０Ｖで約６０分間に限定して泳動し、続いてＺｏｉｏｎ染色プロトコル（ＺｏｉｏｎＢｉｏｔｅｃｈ、米国マサチューセッツ州Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ）を用いて染色した。ＬａｂＷｏｒｋｓ（商標）（ＵＶＰＩｎｃ．）Ｖ．３ソフトウェアを備えたＵＶＰＩｍａｇｅｒ（ＵＶＰＩｎｃ．、米国カリフォルニア州Ｕｐｌａｎｄ）を用いて試料分析を行って、目的とする特定のタンパク質バンドのおおよその濃度を得た。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）フラクションＶを使用してタンパク質の標準曲線を作って、試料（溶解した細胞ブロス中）のおおよそのタンパク質値を計算した。

【0033】

分子量分析
発酵試料１〜２リットルを、２００ｒｐｍで撹拌しながら１２％ナトリウムＤＯＣで処理して０．１３％（ｗ／ｖ）の濃度にした。試料を５℃または２０℃のいずれかで８〜２４時間保持した。次いで、５０％酢酸で試料のｐＨを５．０または６．６に調節して、大部分のＤＯＣおよびタンパク質を沈殿させた。５℃での１２〜２４時間の別の保持間隔の後、試料を遠心分離した（１１０００ｒｐｍ、Ｓｏｒｖａｌｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州Ｗａｌｔｈａｍ）ＳＬＡ−３０００ローター、１０℃で１５分）。次いで、３ＮＮａＯＨで上清試料のｐＨを６．０に調節し、０．４５μｍＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（米国マサチューセッツ州Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ）ＭＰ６０フィルターを用いてろ過した。次いで、試料を、１００Ｋ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）ダイアフィルトレーション（５倍濃度、続いてＤＩ水を用いた７．５倍ダイアフィルトレーション）、０．１％ＨＢ沈殿、および炭素ろ過で構成される改変精製プロセスにかけた。次いで、精製した物質を多角度光散乱（ＭＡＬＬＳ）分析にかけた。

【0034】

発酵プロセス試験
これまでの試験に基づいて、塩基滴定液としてＮａ_２ＣＯ_３からＮａＯＨに切り換えることによって発酵プロセスを最適化した。ＮａＯＨの使用により、回収ｐＨを５．０に下げることが可能になり、顕著なタンパク質沈殿が得られた。Ｎａ_２ＣＯ_３は、ＣＯ_２を低ｐＨ（＜６．６）で放出し、発泡体の形成をもたらす。１９Ａ型多糖およびタンパク質レベルに対する塩基滴定液の影響を調べた。３Ｌ発酵槽２台を設置し、１台の発酵槽は、塩基供給として２０％Ｎａ_２ＣＯ_３溶液（ｗ／ｖ）を用いて元のプロセスの対照とした。他の発酵槽は、塩基供給として３ＮＮａＯＨを使用した。

【0035】

回収段階の間に、発酵槽を３６℃で３０分間保持しながら、発酵槽中で細胞をＤＯＣ（最終濃度０．１３％（ｗ／ｖ））で溶解した。このステップに続いて、溶解物を周囲温度（２２℃）で撹拌しながら終夜保持した。溶解物保持の後、試料を種々のｐＨ設定値で取り出しながら、溶解物を未調整から４．５までの範囲にわたってｐＨ滴定した。これらの試料を周囲温度で終夜保持してからプロセスにかけ、多糖およびタンパク質濃度について分析した。発酵段階中のＯＤ、塩基およびグルコースレベルを図１および図２に示す。主な違いは、炭酸塩実験についての高い最終ＯＤであった。

【0036】

全タンパク質レベルに対するＤＯＣ溶解物ｐＨ調整後の影響も調べ、図３に示した。より低いｐＨレベルでは、ＮａＯＨ実験でもＮａ_２ＣＯ_３実験でも細胞を含まないブロスでタンパク質量が低減した。より低いｐＨ（＜６．６）は、多糖の収量に悪影響を与えなかった。発酵分析結果は、ＮａＯＨ塩基供給が、発酵中にＮａ_２ＣＯ_３塩基供給を用いるプロセスの許容できる代替法であったが、Ｎａ_２ＣＯ_３供給で得られたものよりも低い収量をもたらしたという指標となった。

【0037】

１９Ａおよび６Ａ分子量に対する塩基滴定液の影響
３Ｌスケールでの一連の発酵を行って、塩基滴定液、ＨｙＳｏｙ濃度およびｐＨ保持ステップが血清型１９Ａ分子量に影響を及ぼしたかどうかを決定した。改変精製プロセスとその後のＭＡＬＬＳアッセイを用いて分子量決定を行った。結果を表１に示す。血清型６Ａでは、塩基滴定液だけを評価した。結果を表２に示す。

【0038】

【表1】

【0039】

【表2】

【0040】

重炭酸塩および混合塩基ｐＨ滴定液の影響
第１の試験（実験Ｌ２９３３１−１２２および−１３９）では、ＤＯＣ保持ステップ後にｐＨ５．０保持ステップと共に異なるレベルの初期重炭酸ナトリウムおよび水酸化ナトリウムと炭酸ナトリウムの塩基ブレンドを使用した。初期の重炭酸塩添加は、１０〜５０ｍＭの範囲であり、塩基滴定液用の３Ｎ水酸化ナトリウムに加えた炭酸ナトリウムは、０．２〜１．８Ｍの範囲であった。１つの実験は、５０ｍＭ初期重炭酸塩を含有しており、塩基滴定液としてＮａＯＨを使用した。これらの発酵の終わりの炭酸塩レベルは、１４〜１１１ｍＭの範囲であった。血清型１９Ａ分子量は、５２０〜７１３ｋＤａの範囲であった。実験パラメーターおよび結果を表３に示す。

【0041】

【表3】

【0042】

第２の試験（Ｌ２９３３１−１５９および−１８５）は、１５〜３０ｍＭの初期重炭酸塩添加を使用し、塩基ブレンドは、０．４〜１．０ＭＮａ_２ＣＯ_３を使用した。発酵の終わりの炭酸塩レベルは、２４〜６２ｍＭの範囲であった。血清型１９Ａ分子量は、５０２〜７６３ｋＤａの範囲であった。実験パラメーターおよび結果を表４に示す。

【0043】

【表4】

【0044】

混合されたおよび純粋な炭酸塩滴定塩基発酵プロセスの比較
塩基ブレンドプロセス（０．７ＭＮａ_２ＣＯ_３／３ＮＮａＯＨ）と炭酸塩滴定液プロセス（２０％Ｎａ_２ＣＯ_３溶液、ｗ／ｖ）を比較するために実験を行った。結果（表５）は、炭酸塩滴定液プロセスの分子量が、塩基ブレンドプロセス（５６１−６７１ｋＤａ）の分子量よりも高く、より安定（７７８、７８１ｋＤａ）していたことを立証した。多糖収量も、Ｎａ_２ＣＯ_３プロセスでより高かった。

【0045】

【表5】