特許 6096661 ＤＮＡ混入物質が少ない精製されたＲＮＡを単離する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6096661

(24)【登録日】2017年2月24日

(45)【発行日】2017年3月15日

(54)【発明の名称】ＤＮＡ混入物質が少ない精製されたＲＮＡを単離する方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20170306BHJP

   C12Q 1/68 20060101ALN20170306BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 A

   !C12Q1/68 Z

【請求項の数】20

【全頁数】50

(21)【出願番号】特願2013-526508(P2013-526508)

(86)(22)【出願日】2011年9月6日

(65)【公表番号】特表2013-539367(P2013-539367A)

(43)【公表日】2013年10月24日

(86)【国際出願番号】EP2011065374

(87)【国際公開番号】WO2012032034

(87)【国際公開日】20120315

【審査請求日】2014年9月8日

(31)【優先権主張番号】10009219.6

(32)【優先日】2010年9月6日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】507214038

【氏名又は名称】キアゲン ゲーエムベーハー

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】クリストフェル， ガブリエル

【審査官】 厚田 一拓

(56)【参考文献】

【文献】 Biosci Biotechnol Biochem.,2008 Jul,72(7),p.1951-3,Epub 2008 Jul 7

【文献】 Mol Biotechnol.,2001 Oct,19(2),p.201-3

【文献】 Journal of Plant Biology,2007 Feb,50(1),p.60-4

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００ −１５／９０

Ｃ１２Ｑ １／６８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＲＮＡとＤＮＡとを含む試料から少なくともＲＮＡを単離する方法であって、
ａ）カオトロピック剤とフェノールとを含む酸性変性組成物を該試料に添加する工程；
ｂ）水不溶性の有機溶媒を添加し、得られる相を分離させ、これにより、水相および有機相を含む多相混合物を形成させる工程であって、ここで、該ＲＮＡは該水相中に濃縮され、ＤＮＡは該有機相中に濃縮される、工程；ならびに
ｃ）該水相から該ＲＮＡを単離する工程
を含み、ここで、最終的に該相を分離させる前に、少なくとも１種類の陽イオン性界面活性剤が添加される、方法。

【請求項2】

前記多相混合物が中間相を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ＤＮＡが前記有機相中および／または前記中間相中に濃縮される、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記少なくとも１種類の陽イオン性界面活性剤が以下の特徴：
ａ）永久的に電荷をもつ四級アンモニウム陽イオンを含む；
ｂ）臭化アンモニウムを含む；および／または
ｃ）ＣＴＡＢ、ＴＴＡＢ、およびＤＴＲＢからなる群より選択される、
のうちの１つ以上を有している、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

前記少なくとも１種類の陽イオン性界面活性剤が溶液の形態で添加される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

前記溶液が以下の特徴：
ａ）少なくとも１種類の陽イオン性界面活性剤を、０．１％〜１０％、０．１％〜５％、０．１％〜３％、および０．１％〜１％からなる群より選択される濃度で含む；
ｂ）塩を含む；ならびに／あるいは
ｃ）塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、酢酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、塩化リチウム、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸リチウム、硫酸カリウム、およびこれらの混合物からなる群より選択される塩を含む、
のうちの１つ以上を有している１つ以上のものを含む、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

工程ｂ）において、前記多相混合物が、≦１５℃の温度、≦１０℃の温度、≦７℃の温度、≦５℃の温度、および≦４℃の温度からなる群より選択される低温で前記得られる相を遠心分離することにより形成される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

前記ＲＮＡが、前記水相に対して少なくとも１種類のアルコールを添加することにより該水相から単離される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

前記水相がアルコールと混合され、前記混合物が前記ＲＮＡを結合させるために核酸結合固相と接触させられる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

前記アルコールが、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、およびブタノールからなる群より選択され、そして／または、少なくとも２０％ｖ／ｖ、少なくとも３０％ｖ／ｖ、少なくとも４０％ｖ／ｖ、少なくとも５０％ｖ／ｖ、および少なくとも６０％ｖ／ｖからなる群より選択される濃度で添加される、請求項８または９に記載の方法。

【請求項11】

カオトロピック剤とフェノールとを含む前記酸性変性組成物が以下の特徴：
ａ）該カオトロピック剤がカオトロピック塩である；
ｂ）該カオトロピック剤が、塩酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン、イソチオシアン酸グアニジン、チオシアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、トリクロロ酢酸ナトリウム、トリフルオロ酢酸ナトリウム、および尿素からなる群より選択される；
ｃ）該カオトロピック剤が、０．１〜６Ｍ、０．５〜４Ｍ、および０．５〜３Ｍからなる群より選択される濃度で含まれる；
ｄ）該フェノールが、１０％ｖ／ｖ〜７０％ｖ／ｖ、２０％ｖ／ｖ〜６０％ｖ／ｖ、および３０％ｖ／ｖ〜５０％ｖ／ｖからなる群より選択される濃度で含まれる；
ｅ）該酸性変性組成物が、該組成物を酸性ｐＨで維持するのに十分な量の緩衝剤を含む；
ｆ）該酸性変性組成物が、溶液中で該フェノールを維持するための可溶化剤を含む；
ｇ）該酸性変性組成物が、チオシアン酸塩成分を含む；
ｈ）該酸性変性組成物が、６未満のｐＨ値を有する；ならびに／あるいは
ｉ）該酸性変性組成物が、≦５のｐＨ値を有する、
のうちの１つ以上を有している、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

前記水不溶性の有機溶媒がクロロホルムである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

以下：
ａ）カオトロピック剤とフェノールとを含む酸性変性組成物；
ｂ）少なくとも１種類の陽イオン性界面活性剤を含む、ＲＮＡを含む水相中のＤＮＡの量を低減するための溶液、
を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法において使用するための、キット。

【請求項14】

以下の特徴：
ｃ）核酸結合相；および／または
ｄ）洗浄バッファおよび溶離バッファ
のうちの１つ以上をさらに含む、請求項１３に記載のキット。

【請求項15】

請求項１３〜１４のいずれか一項に記載のキットであって、前記酸性変性組成物が、以下の特徴：
ａ）前記カオトロピック剤がカオトロピック塩である；
ｂ）前記カオトロピック剤が、塩酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン、イソチオシアン酸グアニジン、チオシアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、トリクロロ酢酸ナトリウム、トリフルオロ酢酸ナトリウム、および尿素からなる群より選択される；
ｃ）前記カオトロピック剤が、０．１〜６Ｍ、０．５〜４Ｍ、および０．５〜３Ｍからなる群より選択される濃度で含まれる；
ｄ）前記フェノールが、１０％ｖ／ｖ〜７０％ｖ／ｖ、２０％ｖ／ｖ〜６０％ｖ／ｖ、および３０％ｖ／ｖ〜５０％ｖ／ｖからなる群より選択される濃度で含まれる；
ｅ）該酸性変性組成物が、組成物を酸性ｐＨで維持するのに十分な量の緩衝剤を含む；
ｆ）該酸性変性組成物が、溶液中で該フェノールを維持するための可溶化剤を含む；
ｇ）該酸性変性組成物が、チオシアン酸塩成分を含む；
ｈ）該酸性変性組成物が、６未満のｐＨ値を有する；ならびに／あるいは
ｉ）該酸性変性組成物が、≦５のｐＨ値を有する、
のうちの１つ以上を有し；前記溶液が、以下の特徴：
ａ）少なくとも１種類の陽イオン性界面活性剤を、０．１％〜１０％、０．１％〜５％、０．１％〜３％、および０．１％〜１％からなる群より選択される濃度で含む；
ｂ）塩を含む；ならびに／あるいは
ｃ）塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、酢酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、塩化リチウム、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸リチウム、硫酸カリウム、およびこれらの混合物からなる群より選択される塩を含む、
のうちの１つ以上を有する、キット。

【請求項16】

カオトロピック剤とフェノールとを含む酸性変性組成物の使用を含み、ここで、少なくとも１種類の陽イオン性界面活性剤が該酸性変性組成物中でホモジナイズされた試料に対して添加され、その後、水不溶性の有機溶媒の添加により得られた相が、水相および有機相とに分離される、核酸単離方法において形成された、ＲＮＡを含む水相中のＤＮＡの量を低減するための方法。

【請求項17】

前記得られた相が、水層、中間相、および、有機相とに分離される、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

以下の工程：
− カオトロピック剤とフェノールとを含む酸性変性組成物中で試料をホモジナイズする工程；
− 水不溶性の有機溶媒を添加して相を得る工程；ならびに
− 該得られる相を、水相および有機相とに分離させる工程、
により得られた、ＲＮＡを含む水相中のＤＮＡの量を低減するための少なくとも１種類の陽イオン性界面活性剤の使用であって、
ここで、該陽イオン性界面活性剤が、最終的に該相を分離させる前に添加される、使用。

【請求項19】

以下の工程：
− カオトロピック剤とフェノールとを含む酸性変性組成物中で試料をホモジナイズする工程；
− 水不溶性の有機溶媒を添加して相を得る工程；ならびに
− 該得られる相を、水相および有機相とに分離させる工程、
により得られた、ＲＮＡを含む水相中のＤＮＡの量を減少させることにより中間相および／または有機相中のＤＮＡの量を増加させるための、少なくとも１種類の陽イオン性界面活性剤の使用であって
ここで、該陽イオン性界面活性剤が、最終的に該相を分離させる前に添加される、使用。

【請求項20】

前記得られる相が中間相を含む、請求項１８または１９に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、精製されたＲＮＡ中のＤＮＡ混入物質の量が少ない、ＲＮＡとＤＮＡとを含む試料から精製されたＲＮＡを単離するための方法に関する。さらに、本発明は上記目的のために有用な組成物および方法に関する。

【背景技術】

【0002】

純粋な、完全なＲＮＡの単離は、分子生物学、臨床、およびバイオテクノロジーの適用において遺伝子発現の分析のための重要なステップである。この目的を達成するための多くの方法が先行技術において開発されてきた。最も頻繁に使用されるＲＮＡの単離方法は、フェノール抽出、カオトロピック塩溶液を使用することによる沈殿、およびシリカに対する吸着に基づく。カオトロピック塩を使用するフェノール−クロロホルムによる方法は、例えば、特許文献１および特許文献２に記載されている。それぞれの方法により、純粋なＲＮＡの単離、または同じ試料からのＲＮＡ、ＤＮＡ、および必要に応じてタンパク質の単離のいずれかが可能である。それぞれの方法の原理は、フェノールとカオトロピック剤を含む変性組成物中で試料をホモジナイズすることである。このホモジネートが、クロロホルムのような水不溶性の有機溶媒を添加することにより相分離させられる。遠心分離後、混合物は、ＲＮＡを含む水相、中間相、およびＤＮＡとタンパク質とを含む有機相に分離する。ＲＮＡを単離するために、水相が回収され、それからＲＮＡが、例えば、上記水相にアルコールが添加されることによりＲＮＡを沈殿させることによって単離される。

【0003】

それぞれの方法により、実質的に純粋な、分解していないＲＮＡが得られる。しかし、それぞれのフェノール−クロロホルムによる方法にしたがって単離されたＲＮＡには、例えば、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応アッセイ（ＲＴ−ＰＣＲ）により検出することができる量の残留ＤＮＡが含まれる。これらの残留ＤＮＡ混入物質は、精製されたＲＮＡの下流での利用を混乱させる可能性がある。これは、混入しているＤＮＡがＤＮＡポリメラーゼの鋳型となり、これにより、さらなる増幅産物が生じる可能性があり、したがってＲＮＡ依存性ＲＴ−ＰＣＲの性能を歪めるために、１つの問題となっている。したがって、それぞれの方法を使用して単離されたＲＮＡは、精製されたＲＮＡにＤＮＡが含まれないようにするためには、さらに精製されなければならない。

【0004】

したがって、精製されたＲＮＡ中のＤＮＡ混入物質の量を減らすことにより単離されたＲＮＡの質を改善する試みが先行技術において行われてきた。混入しているＤＮＡを取り除くための、１つの一般に行われていることは、ＤＮａｓｅでＲＮＡを含む試料を処理することである。しかし、これがコストを高め、処理工程を増やすこと、およびＤＮａｓｅに微量のＲＮａｓｅが含まれ得、これによりＲＮＡが分解のリスクに曝されることから、それぞれのＤＮａｓｅ処理の実行には欠点がある。ＤＮＡ混入物質を低減するためのさらなる試みには、水相からのさらなるＤＮＡの沈殿工程が含まれる。ＲＮＡを含む水相からＤＮＡ混入物質を取り除くための改良されたアプローチではさらに、核酸結合固相（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｈａｓｅ）と、上記固相にＤＮＡを結合させるために適している結合条件が使用された。しかし、さらなる核酸結合固相の使用の必要性およびさらなる処理工程が原因でコストが増大するために、それぞれの方法にもまた欠点がある。ＤＮＡ混入物質を低減するためのさらなるアプローチは、フェノール抽出の間にｐＨ値を４未満に下げることに基づいた（例えば、特許文献２を参照されたい）。しかし、この方法によっても、単離されたＲＮＡ中のＤＮＡ混入物質の満足できる低減は得られていない。

【0005】

したがって、とりわけ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、および必要に応じてタンパク質を含む試料からＲＮＡを単離するための方法を提供することが本発明の１つの目的である。この方法は、純粋なＲＮＡを与え、単離されたＲＮＡ中のＤＮＡ混入物質の量を低減する。

【0006】

さらに、特に、フェノール／クロロホルム抽出または同様の相生成方法の間に得られたＲＮＡを含む水相中のＤＮＡの量を低減することが本発明の１つの目的である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】米国特許第４，８４３，１５５号明細書

【特許文献2】米国特許出願公開第２００８／０５７５６０号明細書

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明は、カオトロピック剤とフェノールとを含む酸性変性組成物の添加により処理される試料に対して少なくとも１種類の陽イオン性界面活性剤を添加することにより、単離されたＲＮＡ中のＤＮＡの量がかなり減少するという研究結果に基づく。上記陽イオン性界面活性剤の添加は、目ざましいことに、例えば、クロロホルムのような水不溶性の有機溶媒が添加された場合に得られる、ＲＮＡを含む水相中のＤＮＡ残留量がかなり少なくなるという効果を有する。理論に束縛されずに、陽イオン性界面活性剤の添加には、ＲＮＡを含む水相からより多くのＤＮＡが取り除かれ、したがって、より多くのＤＮＡを相分離の間に形成される中間相および／または有機相に向かわせるという効果があると推定される。したがって、陽イオン性界面活性剤を添加することにより、ＤＮＡがＲＮＡを含む水相から効率よく取り除かれ、生じる中間相および／または有機相中に濃縮される。これにより、上記水相から続いて単離されるＲＮＡ中のＤＮＡ混入物質の量がかなり減少する。したがって、本発明は先行技術を上回るかなりの利点を提供し、例えば、ＤＮａｓｅ処理または特定の核酸結合相もしくは旧式のさらなる精製工程の使用によるＤＮＡ混入物質の除去のような、ＤＮＡ混入物質を取り除くためのＲＮＡを含む水相のさらなる処理を行なう。

【0009】

本発明の第１の態様にしたがうと、ＲＮＡとＤＮＡとを含む試料から少なくともＲＮＡを単離する方法であって、以下の工程：
ａ）カオトロピック剤とフェノールとを含む酸性変性組成物を上記試料に添加する工程；
ｂ）水不溶性の有機溶媒を添加し、得られる相を分離させ、これにより、水相、必要に応じて中間相および有機相を含む多相混合物を形成させる工程（ここでは、上記ＲＮＡは上記水相中に濃縮され、ＤＮＡは上記有機相中および／または上記中間相中に濃縮される）；および
ｃ）上記水相から上記ＲＮＡを単離する工程、
が含まれ、
ここで、少なくとも１種類の陽イオン性界面活性剤が、最終的に上記相を分離させる前に添加される、方法が提供される。

【0010】

上記で議論したように、個々の相を分離させる前の少なくとも１種類の陽イオン性界面活性剤の添加は、カオトロピック剤とフェノールとを含む酸性変性組成物が上記試料の調製のために使用される場合に、ＲＮＡを含む水相中のＤＮＡ混入物質がかなり低減されるという効果を有する。

【0011】

第２の態様にしたがうと、以下：
ａ）カオトロピック剤とフェノールとを含む酸性変性組成物；
ｂ）少なくとも１種類の陽イオン性界面活性剤を含む、ＤＮＡ混入物質を低減するための溶液；
ｃ）必要に応じて、核酸結合固相；ならびに
ｄ）必要に応じて、洗浄バッファおよび溶離バッファ、
を含む、本発明による方法で使用するためのキットが提供される。

【0012】

第３の態様にしたがうと、カオトロピック剤とフェノールとを含む酸性変性組成物の使用を含む、ＲＮＡ単離方法において形成されたＲＮＡを含む水相中のＤＮＡの量を低減するための方法であって、ここで、水不溶性の有機溶媒の添加により得られた相が、水相、必要に応じて、中間相および有機相に分離される前に、少なくとも１種類の陽イオン性界面活性剤が、上記酸性変性組成物中でホモジナイズされた試料に添加される、方法が提供される。

【0013】

第４の態様にしたがうと、本発明は、以下：
− カオトロピック剤とフェノールとを含む酸性変性組成物中で試料をホモジナイズする工程；
− 水不溶性の有機溶媒を添加する工程；および
− この混合物を、水相、必要に応じて、中間相および有機相に分離させる工程、
により得られる、ＲＮＡを含む水相中のＤＮＡの量を低減するための少なくとも１種類の陽イオン性界面活性剤の使用に関し、
ここで、上記陽イオン性界面活性剤が、最終的に相を分離させる前に添加される。

【0014】

第４の態様にしたがうと、本発明は、以下：
− カオトロピック剤とフェノールとを含む酸性変性組成物中で試料をホモジナイズする工程；
− 水不溶性の有機溶媒を添加する工程；ならびに
− この混合物を、水相、必要に応じて、中間相および有機相に分離させる工程、
により得られる、ＲＮＡを含む水相中のＤＮＡの量を減少させることにより、必要に応じた中間相および／または有機相中のＤＮＡの量を増加させるための少なくとも１種類の陽イオン性界面活性剤の使用に関し、
ここで、上記陽イオン性界面活性剤が、最終的に上記相を分離させる前に添加される。

【0015】

上記で議論したように、カオトロピック剤とフェノールとを含む酸性変性組成物中で試料を調製する場合には、上記相を分離させる前の上記陽イオン性界面活性剤の添加により、上記ＲＮＡを含む水相中のＤＮＡの量がかなり低減する。これにより、例えば、ＤＮＡ混入物質がより少ない純粋なＲＮＡの単離が可能となる。

【0016】

本願は特定の実施形態において例えば以下の項目を提供する：
（項目１）
ＲＮＡとＤＮＡとを含む試料から少なくともＲＮＡを単離する方法であって、
ａ）カオトロピック剤とフェノールとを含む酸性変性組成物を該試料に添加する工程；
ｂ）水不溶性の有機溶媒を添加し、得られる相を分離させ、これにより、水相、必要に応じて中間相および有機相を含む多相混合物を形成させる工程であって、ここで、該ＲＮＡは該水相中に濃縮され、ＤＮＡは該有機相中および／または該中間相中に濃縮される、工程；ならびに
ｃ）該水相から該ＲＮＡを単離する工程
を含み、ここで、最終的に該相を分離させる前に、少なくとも１種類の陽イオン性界面活性剤が添加される、方法。
（項目２）
前記少なくとも１種類の陽イオン性界面活性剤が以下の特徴：
ａ）永久的に電荷をもつ四級アンモニウム陽イオンを含む；
ｂ）臭化アンモニウムを含む；および／または
ｃ）ＣＴＡＢ、ＴＴＡＢ、およびＤＴＲＢからなる群より選択される、
のうちの１つ以上を有している、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記少なくとも１種類の陽イオン性界面活性剤が溶液の形態で添加される、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記溶液が以下の特徴：
ａ）少なくとも１種類の陽イオン性界面活性剤を、０．１％〜１０％、０．１％〜５％、０．１％〜３％、および０．１％〜１％からなる群より選択される濃度で含む；ならびに／あるいは
ｂ）好ましくは、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、酢酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、塩化リチウム、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸リチウム、硫酸カリウム、およびこれらの混合物からなる群より選択される塩を含む、
のうちの１つ以上を有している１つ以上のものを含む、項目３に記載の方法。
（項目５）
工程ｃ）において、前記多相混合物が、≦１５℃の温度、≦１０℃の温度、≦７℃の温度、≦５℃の温度、および≦４℃の温度からなる群より選択される低温で該混合物を遠心分離することにより形成される、項目１〜４の１つ以上に記載の方法。
（項目６）
前記ＲＮＡが、前記水相に対して少なくとも１種類のアルコールを添加することにより該水相から単離される、項目１〜５の１つ以上に記載の方法。
（項目７）
前記水相がアルコールと混合され、前記混合物が前記ＲＮＡを結合させるために核酸結合固相と接触させられる、項目１〜６の１つ以上に記載の方法。
（項目８）
前記アルコールが、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、およびブタノールからなる群より選択され、そして／または、少なくとも２０％、少なくとも３０％ｖ／ｖ、少なくとも４０％ｖ／ｖ、少なくとも５０％ｖ／ｖ、および少なくとも６０％ｖ／ｖからなる群より選択される濃度で添加される、項目１〜７の１つ以上に記載の方法。
（項目９）
カオトロピック剤とフェノールとを含む前記酸性変性組成物が以下の特徴：
ａ）該カオトロピック剤がカオトロピック塩である；
ｂ）該カオトロピック剤が、塩酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン、イソチオシアン酸グアニジン、チオシアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、トリクロロ酢酸ナトリウム、トリフルオロ酢酸ナトリウム、および尿素からなる群より選択される；
ｃ）該カオトロピック剤が、０．１〜６Ｍ、０．５〜４Ｍ、および０．５〜３Ｍからなる群より選択される濃度で含まれる；
ｄ）該フェノールが、１０％ｖ／ｖ〜７０％ｖ／ｖ、２０％ｖ／ｖ〜６０％ｖ／ｖ、および３０％ｖ／ｖ〜５０％ｖ／ｖからなる群より選択される濃度で含まれる；
ｅ）該酸性変性組成物が、該組成物を酸性ｐＨで維持するのに十分な量の緩衝剤を含む；
ｆ）該酸性変性組成物が、溶液中で該フェノールを維持するための可溶化剤を含む；
ｇ）該酸性変性組成物が、チオシアン酸塩成分を含む；ならびに／あるいは
ｈ）該酸性変性組成物が、６未満のｐＨ値を有し、好ましくは、該ｐＨは≦５である、
のうちの１つ以上を有している、項目１〜８の１つ以上に記載の方法。
（項目１０）
前記水不溶性の有機溶媒がクロロホルムである、項目１〜９の１つ以上に記載の方法。
（項目１１）
以下：
ａ）カオトロピック剤とフェノールとを含む酸性変性組成物；
ｂ）少なくとも１種類の陽イオン性界面活性剤を含む、ＲＮＡを含む水相中のＤＮＡの量を低減するための溶液；
ｃ）必要に応じて、核酸結合固相、および
ｄ）必要に応じて、洗浄バッファおよび溶離バッファ、
を含む、項目１〜１０の１つ以上に記載の方法において使用するための、キット。
（項目１２）
項目９で定義された酸性変性組成物、および／または項目４で定義された特徴を有している特徴ｂ）に記載の溶液を含む、項目１１に記載のキット。
（項目１３）
カオトロピック剤とフェノールとを含む酸性変性組成物の使用を含み、ここで、少なくとも１種類の陽イオン性界面活性剤が該酸性変性組成物中でホモジナイズされた試料に対して添加され、その後、水不溶性の有機溶媒の添加により得られた相が、水相、必要に応じて、中間相および有機相とに分離される、核酸単離方法において形成された、ＲＮＡを含む水相中のＤＮＡの量を低減するための方法。
（項目１４）
以下の工程：
− カオトロピック剤とフェノールとを含む酸性変性組成物中で試料をホモジナイズする工程；
− 水不溶性の有機溶媒を添加する工程；ならびに
− 該混合物を、水相、必要に応じて、中間相および有機相とに分離させる工程、
により得られた、ＲＮＡを含む水相中のＤＮＡの量を低減するための少なくとも１種類の陽イオン性界面活性剤の使用であって、
ここで、該陽イオン性界面活性剤が、最終的に相を分離させる前に添加される、使用。
（項目１５）
以下の工程：
− カオトロピック剤とフェノールとを含む酸性変性組成物中で試料をホモジナイズする工程；
− 水不溶性の有機溶媒を添加する工程；ならびに
− 該混合物を、水相、必要に応じて、中間相および有機相とに分離させる工程、
により得られた、ＲＮＡを含む水相中のＤＮＡの量を減少させることにより中間相および／または有機相中のＤＮＡの量を増加させるための、少なくとも１種類の陽イオン性界面活性剤の使用であって
ここでは、陽イオン性界面活性剤が、最終的に相を分離させる前に添加される、使用。
本出願の他の目的、特徴、利点、および態様は、以下の記載と添付の特許請求の範囲から当業者に明らかとなる。しかし、以下の記載、添付の特許請求の範囲、および具体的な実施例は、本出願の好ましい実施形態を示しているものの、例示する目的だけのために提供されると理解されるものとする。開示される本発明の趣旨および範囲内での様々な変更および改変は、以下を読むことにより当業者に容易に明らかとなる。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】図１は、陽イオン性界面活性剤を添加した、本発明により単離したＲＮＡには、対照標準法よりもかなり少ない量のＤＮＡ混入物質しか含まれていないことを示す。

【図2】図２は、本発明による方法により、様々な組織試料から単離したＲＮＡ中のＤＮＡ混入物質の量がかなり低減されたことを示す。

【図3】図３は、ＮａｎｏＤｒｏｐ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して分光学的に決定されたＲＮＡ濃度を示す。

【図4】図４は、ＮａｎｏＤｒｏｐ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して分光学的に決定されたＲＮＡ濃度を示す。

【図5】図５は、実施例３の工程８において得られたＣｔ値とΔＣｔ値とを示す。

【図6】図６は、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して決定されたＲＮＡ濃度を示す。

【図7】図７は、ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイの結果を示す。

【図8】図８は、実施例５の工程８において得られたＣｔ値とΔＣｔ値とを示す。

【発明を実施するための形態】

【0018】

（発明の詳細な説明）
本発明は、フェノール、カオトロピック剤、および例えば、クロロホルムのような水不溶性の有機溶媒の使用に基づくＲＮＡの単離方法に関する。それぞれの方法において、ＲＮＡを含む水相、必要に応じて中間相および有機相を含む多相混合物が形成される。ＤＮＡとタンパク質は（試料中に含まれる場合は）、中間相および／または有機相に含まれる。本発明は、少なくとも１種類の陽イオン性界面活性剤が最終的に上記相を分離させる前に添加される場合には、ＲＮＡを含む水相中のＤＮＡの量をかなり低減することができるという研究結果に基づく。少なくとも１種類の陽イオン性界面活性剤の添加は、ＲＮＡを含む水相からより多くのＤＮＡが取り除かれ、したがって、より多くのＤＮＡが中間相および／または有機相中に濃縮されるという効果を有する。ＤＮＡがＲＮＡを含む水相からより効率よく取り除かれるので、それぞれ、ＤＮＡが除去された水相から単離されたＲＮＡには、ＤＮＡ量はより少なく、したがってＤＮＡ混入物質の量は少ない。したがって、本発明により、有効であり、単純であり、そしてＲＮＡの質を犠牲にすることのない、精製されたＲＮＡ中のＤＮＡ混入物質の残留の問題の解決方法が提供される。むしろ、上記ＲＮＡの質は、陽イオン性界面活性剤が添加されない方法よりもはるかに改善される場合が多い。さらに、本発明の方法は、例えば、ＤＮＡ結合カラムまたはＤＮａｓｅのような固相または酵素のようなさらなる材料の使用を必要としないために、極めてコスト効果が高い。したがって、本発明はかなりの利点を有する。

【0019】

本発明の第１の態様にしたがうと、ＲＮＡとＤＮＡとを含む試料から少なくともＲＮＡを単離する方法であって、以下の工程：
ａ）カオトロピック剤とフェノールとを含む酸性変性組成物を上記試料に添加する工程；
ｂ）水不溶性の有機溶媒を添加し、得られる相を分離させ、これにより、水相、必要に応じて中間相および有機相を含む多相混合物を形成させる工程（ここで、上記ＲＮＡは上記水相中に濃縮され、ＤＮＡは上記有機相中および／または上記中間相中に濃縮される）；および
ｃ）上記水相から上記ＲＮＡを単離する工程、
が含まれ、
ここで、少なくとも１種類の陽イオン性界面活性剤が、最終的に上記相を分離させる前に添加される、方法が提供される。

【0020】

工程ａ）〜ｃ）は、ＲＮＡを単離するための先行技術において公知の方法でも行われる工程である。工程ａ）では、上記試料が、カオトロピック剤とフェノールとを含む酸性変性組成物中で処理され、通常は、溶解させられるおよび／またはホモジナイズされる。得られる混合物が、工程ｂ）においてクロロホルムのような水不溶性の有機溶媒を添加することにより、有機相、通常は（試料に応じて）中間相、および水相に分離される。上記相の形成は、遠心分離により促進することができる。工程ｃ）では、上記ＲＮＡが水相から単離される。本発明の改善は、最終的に上記相を分離させる前に、少なくとも１種類の陽イオン性界面活性剤がこの混合物に添加されることによる。目ざましいことに、カオトロピック剤とフェノールとを含む酸性変性組成物が上記試料の調製のために使用される場合には、上記陽イオン性界面活性剤の添加により、ＲＮＡを含む水相中のＤＮＡの量をかなり低減することが明らかになった。本発明による方法において使用される試薬のこの組み合わせ（具体的には、カオトロピック剤、フェノール、陽イオン性界面活性剤、および上記水不溶性の有機溶媒）が、本発明の利点を達成するために重要である。例えば、上記カオトロピック剤または上記陽イオン性界面活性剤だけが添加される場合には、これらの利点は得られない。したがって、本明細書中に記載されるような正確な組み合わせが明らかである。本発明により教示されるように、特定の工程の組み合わせにより達成される利点が、本明細書中に提供される実施例により実証される。

【0021】

１つの実施形態にしたがうと、以下の式：
ＹＲ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４Ｘ
（式中、
Ｙは、窒素またはリンであり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は独立して、分岐鎖または非分岐鎖のＣ１〜Ｃ２０アルキル残基、Ｃ３〜Ｃ６アルキレン残基、Ｃ３〜Ｃ６アルキニル残基、および／またはＣ６〜Ｃ２６アラルキル残基より選択され、そして、ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、またはＲ４のうちの少なくとも１つがＣ６〜Ｃ２０アルキル残基であることが好ましく、少なくとも１つのＣ１０アルキル残基が存在することがなおさらに好ましく；
Ｘ−は、無機または有機の一塩基酸もしくは多塩基酸の陰イオンである）を有している少なくとも１種類の陽イオン性界面活性剤が使用される。

【0022】

陽イオン性界面活性剤の例として、四級アンモニウム塩、アミド結合を持つアミン、ポリオキシエチレンアルキル、および脂環式アミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’テトラキスで置換されたエチレンジアミン、２−アルキル １−ヒドロキシエチル ２ イミダゾリンエトキシル化アミン、およびアルキルアンモニウム塩が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。

【0023】

１つの実施形態にしたがうと、永久的に電荷を持つ（ｐｅｒｍａｎｅｎｔｌｙ ｃｈａｒｇｅｄ）四級アンモニウム陽イオンを極性頭部基として含む陽イオン性界面活性剤が使用される。上記陽イオン性界面活性剤が、アルキルトリメチルアンモニウム塩であることが好ましい。上記陽イオン性界面活性剤に臭化アンモニウムまたは塩化アンモニウムが含まれることが好ましい。最も好ましくは、上記陽イオン性界面活性剤は、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、臭化テトラデシルトリメチルアンモニウム（ＴＴＡＢ）、および臭化ドデシルトリメチルアンモニウム（ＤＴＲＢ）、またはブロマイド（ｂｒｏｍｉｄｅ）の代わりにクロライド（ｃｈｌｏｒｉｄｅ）を含む対応する化合物からなる群より選択される。

【0024】

さらに、陽イオン性界面活性剤としては以下が挙げられるが、これらに限定されるわけではない：塩化ジデシルジメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、臭化ｎ−ドデシルトリメチルアンモニウム（ＤＴＡＢ）、臭化トリメチルテトラデシルアンモニウム、Ｎ，Ｎ’−ジメチルドデシルアミン−Ｎ−オキシドオクテニジン（ｃｔｅｎｉｄｉｎｅ）二塩酸塩（Ｎ，Ｎ’ｄｉｍｅｔｈｙｌｄｏｄｅｃｙｌａｍｉｎｅ−Ｎ−ｏｘｉｄｅ ｃｔｅｎｉｄｉｎｅ ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；アルキルトリメチルアンモニウム、塩である臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）、ポリエトキシ化獣脂アミン（ＰＯＥＡ）、塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ）、塩化ベンゼトニウム（ＢＺＴ）、５−ブロモ−５−ニトロ−１，３−ジオキサン、塩化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、臭化ジオクタデシルジメチルアンモニウム（ＤＯＤＡＢ）、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（ＨＴＡＢ）、塩化セチルピリジニウム、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、ココヤシの塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム、ココヤシの塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム、塩化アルキルヒドロキシエチルジメチルアンモニウム、ジオレイン酸トリエタノールアミンエステルクアト（ｅｓｔｅｒｑｕａｔ）、塩化ジステアリルジメチルアンモニウム、二獣脂酸トリエタノールアミン（ｄｉｔａｌｌｏｗ ａｃｉｄ ｔｒｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）エステルクアト、トリエタノールアミンエステルクアト。

【0025】

１つの実施形態にしたがうと、少なくとも１種類の陽イオン性界面活性剤は、工程ａ）のホモジナイズされた試料中、および／または工程ｂ）での上記水不溶性の有機溶媒の添加後に得られた混合物中の陽イオン性界面活性剤の濃度を、全容積に基づいて０．０１％〜１０％、０．０３％〜７．５％、０．０３％〜５％、０．０４％〜２．５％、０．０４％〜２％、および０．０３％〜１．７％からなる群より選択される濃度にする濃度で添加される。陽イオン性界面活性剤または陽イオン性界面活性剤の混合物が、少なくとも０．０３％、少なくとも０．０４％、少なくとも０．０５％、少なくとも０．０６％、少なくとも０．０８％、少なくとも０．０９％、少なくとも０．１％、および少なくとも０．１５％からなる群より選択される濃度で含まれることが好ましい。上記で議論されたように、陽イオン性界面活性剤の混合物（好ましくは、ＴＴＡＢと混合されたＣＴＡＢ）もまた使用することができる。

【0026】

好ましい実施形態にしたがうと、少なくとも１種類の上記陽イオン性界面活性剤は溶液の形態で添加される。上記溶液中には、上記陽イオン性界面活性剤が、その溶液の全容積に基づいて、好ましくは、０．１％〜２０％、０．５％〜１０％、０．１％〜５％、０．５％〜５％、０．１％〜３％、０．５％〜３％からなる群より選択される濃度で、そして最も好ましくは、０．１％〜１％および０．５％〜１％の濃度で含まれる。陽イオン性界面活性剤の混合物が使用される場合にも同じものが適用される。

【0027】

少なくとも１種類の上記陽イオン性界面活性剤を含む上記溶液には、例えば、塩のようなさらなる成分を含めることができる。上記溶液に含まれることが好ましい塩は、アルカリ金属塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化リチウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、酢酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸リチウム、硫酸カリウム、およびこれらの混合物）からなる群より選択することができる。それぞれの塩の添加は、特に、上記陽イオン性界面活性剤が溶液中に残るという利点を有する。好ましくは、上記塩は、０〜１０Ｍ、好ましくは０．５〜５Ｍ、より好ましくは０．５〜１．５Ｍからなる群より選択される濃度で上記溶液中に含まれる。

【0028】

上記相を分離させる前に上記陽イオン性界面活性剤を添加することができる方法についてはいくつかの選択肢がある。１つの実施形態にしたがうと、上記陽イオン性界面活性剤がそれぞれ、上記酸性変性組成物が上記試料に添加される前、その間、または添加後のいずれかで、工程ａ）の間に添加される。上記陽イオン性界面活性剤はまた、上記酸性変性組成物中にも含めることができる。さらに、上記水不溶性の有機溶媒が工程ｂ）において添加される場合は、上記陽イオン性界面活性剤が一緒に、それぞれが同時に添加される場合もある。しかし、ＲＮＡを含む水相中のＤＮＡの量を低減することに関して上記陽イオン性界面活性剤がその有用な効果を発揮できるように、陽イオン性界面活性剤が最後の相分離が行われる前に添加されることが重要である。上記最後の相分離が重要であるので、上記水相から上記有機相および／または上記中間相に上記陽イオン性界面活性剤と残留ＤＮＡを取り出すことができるように、最初の相分離を行うこと、その後、陽イオン性界面活性剤を水相に添加すること、そしてその後、最終的に上記相を分離させる（例えば、遠心分離により支援される）こともまた、本発明の範囲に含まれる。しかし、特に、処理（ｈａｎｄｌｉｎｇ）工程を割愛するためには、上記水不溶性の有機溶媒が添加される前、またはそれと同時に、陽イオン性の剤が添加されることが好ましい。好ましい実施形態にしたがうと、上記陽イオン性界面活性剤は別に、そして、したがって、上記試料が上記酸性変性組成物と混合された後であり、上記水不溶性の有機溶媒が添加される前に、添加される。実施例に示すように、特に優れた結果は、工程ａ）の後、および、工程ｂ）の前に少なくとも１種類の陽イオン性界面活性剤が添加される場合に達成される。

【0029】

相分離は沈降により達成することができる。１つの実施形態にしたがうと、上記多相混合物は、上記試料を遠心分離することにより形成される。ここでは、低温、したがって室温より低い温度で上記試料を遠心分離することが好ましい。好ましくは、上記温度は、≦１５℃、≦１０℃であり、≦７℃、≦５℃、および≦４℃のようなさらに低い温度が特に好ましい。低温での遠心分離が上記相分離を助け、さらに、陽イオン性界面活性剤が使用される場合には、ＲＮＡを含む水相中のＤＮＡの低減を促すことが明らかになった。

【0030】

上記水相からＲＮＡを単離するためには、水溶液からＲＮＡを単離するための先行技術において公知の、基本的にはあらゆる方法を使用することができる。好ましくは、上記ＲＮＡは、上記水相に対して少なくとも１種類のアルコールを添加し、それにより上記ＲＮＡを沈殿させることにより単離される。１つの実施形態にしたがうと、それぞれ沈殿したＲＮＡを、上記水相の遠心分離と上清の液体のデカントにより回収することができる。

【0031】

好ましくは、上記水相が少なくとも１種類のアルコールと混合され、次に、核酸の精製を助けるために、上記混合物が核酸結合固相と接触させられる。

【0032】

核酸結合固相としては、核酸を結合することができるあらゆる材料を使用することができ、したがってこれには、適切な条件下で核酸を結合することができる様々な材料が含まれる。本発明と組み合わせて使用することができる例示的な固相としては、シリカを含む化合物およびケイ酸質の（ｓｉｌｉｃｅｏｕｓ）固相が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。これには、シリカ粒子、二酸化ケイ素、珪藻土、ガラス、アルキルシリカ、ケイ酸アルミニウム、およびホウケイ酸塩；ニトロセルロース；ジアゾ化された紙（ｄｉａｚｏｔｉｚｅｄ ｐａｐｅｒ）；ヒドロキシアパタイト（ヒドロキシルアパタイトとも呼ばれる）；ナイロン；金属酸化物；ジルコニア；アルミナ；ポリマー支持体、ジエチルアミノエチル誘導体化支持体およびトリエチルアミノエチル誘導体化支持体、および疎水性クロマトグラフィー樹脂（例えば、フェニルセファロースまたはオクチルセファロース）などが含まれるが、これらに限定されるわけではない。固相という用語は、その形態またはデザインに関するいかなる限定をも暗に意図するように意図されるものではない。したがって、固相という用語には、多孔性であるかまたは非多孔性である；透過性であるかまたは不透過性である適切な材料が包含され、これには、メンブレン、フィルター、シート、粒子、磁性粒子、ビーズ、ゲル、粉末、および繊維などが含まれるが、これらに限定されるわけではない。１つの実施形態にしたがうと、上記固相の表面は修飾されておらず、例えば、官能基で修飾されていない。核酸結合メンブレン（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｅｍｂｒａｎｅ）が使用されることが好ましい。適切なメンブレンとしては、親水性メンブレン、疎水性メンブレン、およびイオン交換により核酸結合メンブレンが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。例として、シリカメンブレンおよびシリカを含む他のメンブレン、ナイロンメンブレン、セルロースメンブレン（例えば、ニトロセルロースメンブレン）が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。メンブレンは多孔性であることが好ましい。さらに、シリカを含むかまたはシリカからなるメンブレンを使用することが好ましい。

【0033】

アルコールとして、短鎖の分岐アルコールまたは非分岐アルコール（１〜５個の炭素原子を持つことが好ましい）を使用することが好ましい。例は、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、およびブタノールである。アルコールの混合物もまた使用することができる。アルコールは好ましくは、イソプロパノールおよびエタノールから選択される。なぜなら、上記アルコールがＲＮＡを沈殿させるために特に有効であるからである。

【0034】

上記ＲＮＡを単離するために使用されるアルコールの濃度は、単離された全ＲＮＡ中に低分子ＲＮＡが含まれることが意図されるかどうかに依存する。ｍｉＲＮＡのような低分子ＲＮＡもまた精製するように意図される場合は、より高いアルコール濃度を使用することが推奨される。単離された全ＲＮＡ中にそれぞれの低分子ＲＮＡ種が含まれることが望ましくない場合は、より低いアルコール濃度が好ましい。上記水相と混合される場合は、アルコールの濃度は、得られる混合物中の１０％ｖ／ｖ〜９０％ｖ／ｖの範囲にあり得る。低分子ＲＮＡを含む全ＲＮＡを単離するためには、≧４０％ｖ／ｖ、好ましくは、≧５０％ｖ／ｖのアルコール濃度を使用することが有利である。低分子ＲＮＡが含まれることが望ましくない場合は、アルコールの濃度は、≦４０％ｖ／ｖが好ましい。したがって、上記水相と混合される場合は、上記濃度は、少なくとも２０％、少なくとも３０％ｖ／ｖ、少なくとも４０％ｖ／ｖ、少なくとも５０％ｖ／ｖ、および少なくとも６０％ｖ／ｖからなる群より選択され得る。上記アルコール濃度は、上記水相と混合される場合は、２０％ｖ／ｖ〜９０％ｖ／ｖ、または３０％ｖ／ｖ〜８５％の範囲にあることが好ましく、３０％ｖ／ｖ〜７０％ｖ／ｖの範囲にあることが好ましい。

【0035】

用語「試料」は、本明細書中では広い意味で使用され、核酸を含む様々な供給源を含むように意図される。試料は生物学的試料であり得るが、この用語には、核酸を含む他の、例えば、人工的な試料も含まれる。例示的な試料としては、全血；血液生成物；赤血球；白血球；バフィーコート；スワブ（口腔スワブ、咽喉スワブ、膣スワブ、尿道スワブ、子宮頸スワブ、咽喉スワブ、直腸スワブ、病巣スワブ、膿瘍スワブ、および鼻咽頭スワブなどを含むがこれらに限定されるわけではない）；尿；痰；唾液；精液；リンパ液；羊水；脳脊髄液；腹膜滲出液；胸水；嚢胞由来の流体；滑液；硝子体液；房水；滑液包の流体（ｂｕｒｓａ ｆｌｕｉｄ）；洗眼液；眼吸引液；血漿；血清；肺洗浄液；肺吸引液；組織（肝臓、脾臓、腎臓、肺、腸、脳、心臓、筋肉、膵臓を含むがこれらに限定されるわけではない）、細胞培養物、ならびに、上記試料から、または上記試料上もしくは上記試料中に存在する可能性がある任意の細胞および微生物およびウイルスから得られた溶解物、抽出物、あるいは材料などが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。核酸を含む臨床状況または法医学の状況から得られた材料もまた、用語「試料」の意図される意味に含まれる。さらに、当業者は、上記の例示的な試料のいずれかから得られた溶解物、抽出物、または処理された材料もしくは一部もまた、用語「試料」の範囲に含まれることを理解する。上記試料は、ヒト、動物、植物、細菌、または真菌由来の生物学的試料であることが好ましい。上記試料は、細胞、組織、細菌、ウイルス、ならびに、体液、例えば、血液、血液生成物（例えば、バフィーコート、血漿、および血清）、尿、液（ｌｉｑｕｏｒ）、痰、便、ＣＳＦおよび精子、上皮スワブ、生検、骨髄試料および組織試料（好ましくは、肺、腎臓、または肝臓のような臓器組織試料）からなる群より選択されることが好ましい。本発明による方法は、組織試料、特に、臓器組織試料からＲＮＡを単離するのに特に適している。１つの実施形態にしたがうと、上記組織は血液ではない。１つの実施形態にしたがうと、上記試料は細菌試料でも細菌に由来する試料でもない。

【0036】

用語「低分子核酸（ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）」および「低分子核酸（ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）」は、具体的に、１０００ヌクレオチド未満、５００ヌクレオチド未満、４００ヌクレオチド未満、３００ヌクレオチド未満、１００ヌクレオチド未満、または７０ヌクレオチド未満の長さを有している核酸を意味し、これには、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよび他の短い（ｓｈｏｒｔ）干渉核酸、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、循環核酸、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡの断片、分解した核酸、リボザイム、ウイルスＲＮＡまたはウイルスＤＮＡ、感染起源の（ｉｎｆｅｃｔｉｏｓ ｏｒｉｇｉｎ）核酸、増幅産物、修飾された核酸、プラスミド核酸または細胞小器官の核酸、オリゴヌクレオチドのような人工的な核酸が含まれるが、これらに限定されるわけではない。

【0037】

カオトロピック剤とフェノールとを含む酸性変性組成物は、先行技術に（例えば、ＵＳ４，８４３，１５５またはＵＳ５，３４６，９９４に）記載されているような組成を有し得る。

【0038】

例えば、限定的ではないが、一次構造を完全な状態で残したまま、タンパク質または核酸の二次、三次、または四次構造を変化させることにより、タンパク質または核酸において無秩序（ｄｉｓｏｒｄｅｒ）を引き起こす任意のカオトロピック剤を、上記酸性変性組成物中で使用することができる。好ましくは、上記カオトロピック剤は、塩酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン、イソチオシアン酸グアニジン、チオシアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、トリクロロ酢酸ナトリウム、トリフルオロ酢酸ナトリウム、および尿素からなる群より選択される。カオトロピック塩が使用されることが好ましい。具体的には、塩酸グアニジンおよび／またはチオシアン酸グアニジンをカオトロピック剤として使用することができる。

【0039】

上記カオトロピック剤は、０．１Ｍから飽和限界まで、０．１〜６Ｍ、０．５〜４Ｍ、０．５〜３Ｍ、および０．５〜２Ｍからなる群より選択される濃度で上記酸性変性組成物中に含めることができる。

【0040】

フェノールは、上記酸性変性組成物の全容積に基づいて、１０％ｖ／ｖ〜７０％ｖ／ｖ、２０％ｖ／ｖ〜６０％ｖ／ｖ、および３０％ｖ／ｖ〜５０％ｖ／ｖからなる群より選択される濃度で上記酸性変性組成物中に含まれることが好ましい。フェノールの濃度は３５％ｖ／ｖ〜４０％ｖ／ｖの範囲にあることが好ましい。

【0041】

上記変性組成物のｐＨ値は酸性であり、≦６、好ましくは、≦５であり得る。好ましくは、上記酸性変性組成物のｐＨ値は３〜６の範囲にあることが好ましく、４〜５の範囲にあることがより好ましい。

【0042】

さらに、上記酸性変性組成物には、上記組成物を酸性のｐＨに維持するのに十分な量の緩衝剤が含まれ得る。上記緩衝剤は、酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、フタル酸塩、酒石酸塩、または乳酸塩のうちの少なくとも１つの塩であり得、例えば、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、およびクエン酸ナトリウムより選択することができる。酢酸ナトリウムが使用されることが好ましい。

【0043】

上記酸性変性組成物には、溶液中でフェノールを、特に、４℃で維持するため、およびこの溶媒を単相溶液とするか、または単相溶液として維持するために、可溶化剤を含めることができる。適切な可溶化剤はグリセロールである。１つの実施形態にしたがうと、上記可溶化剤は、約２〜１０％、好ましくは約５％の濃度で含まれる。

【0044】

さらに、上記酸性変性組成物には、チオシアン酸塩成分（好ましくは、チオシアン酸アンモニウムまたはチオシアン酸ナトリウム）を含めることができる。このさらなるチオシアン酸塩成分は、上記生物学的試料からのＲＮＡの抽出を促進すると考えられる。チオシアン酸塩成分は、０．１〜１Ｍ、好ましくは０．４Ｍの濃度で含めることができる。

【0045】

１つの実施形態にしたがうと、上記酸性変性組成物は以下の特徴を有する：
− ３０％を上回る、好ましくは、３５％を上回る、最も好ましくは、３５％〜４０％の濃度のフェノールを含む；
− ４．３〜６のｐＨ、好ましくは、４．５〜５のｐＨを有する；
− ０．５〜４Ｍ、好ましくは、０．５〜３Ｍの濃度のカオトロピック塩を含む；および
− 緩衝剤、可溶化剤、およびチオシアン酸塩化合物からなる群より選択される少なくとも１種類のさらなる剤を含むことが好ましい；好ましい例と濃度は上に記載されている。

【0046】

上記酸性変性組成物が上記の好ましい特徴の全てを併せ持つことが好ましい。

【0047】

適切な水不溶性の有機溶媒としては、カプロラクトン、エチレングリコールジアセテート、二ポリエチレングリコールジベンゾエート、クロロホルム、四塩化炭素、ブロモクロロプロパン、ブロモナフタレン、ブロモアニソール、臭化シクロヘキシル、ジブロモプロパン、ジクロロ安息香酸、またはこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。上記水不溶性の有機溶媒がクロロホルムであることが好ましい。

【0048】

本発明による方法にはまた、１つ以上のさらなる工程が含まれる場合があり、いくつかの限定的ではない選択肢が続いて記載される。

【0049】

所望される場合は、タンパク質（上記試料中に含まれる場合）および／または上記ＤＮＡもまた、本発明による方法により上記有機相および／または上記中間相から回収することができる。例えば、タンパク質は、上記有機相に低級アルコールを添加することによって沈殿させることができ、沈降により上記タンパク質を回収することができる。上記ＤＮＡは、例えば、予め決定された量の溶媒溶液での洗浄、上記ＤＮＡの沈降、および上記ＤＮＡからの全てのフェノールおよび塩混入物質の除去により、上記中間相および／または上記有機相から回収することができる。中間相および／または有機相からＤＮＡおよび／またはタンパク質を単離するための適切な方法は先行技術において公知であり、したがって、ここでさらに記載する必要はない。本発明による方法を実行することにはまた、上記ＤＮＡの単離に関しても、ＤＮＡが水相からより効率よく取り出され、したがって、上記中間相および／または有機相中に濃縮され、ここから上記ＤＮＡを単離することができるので、ＤＮＡの収量が増加するという有利な効果がある。

【0050】

さらに、上記水相から上記ＲＮＡが単離される場合は、１回以上の洗浄工程が行われ得る。好ましくは、固相が使用される場合は、上記洗浄工程が、上記ＲＮＡを上記核酸結合固相に結合させたまま行われる。この目的のためには、一般的な洗浄溶液を使用することができる。上記核酸結合固相からの上記ＲＮＡの遊離を生じない洗浄溶液を使用することが推奨される。さらに、結合相が使用されない場合は、上記ＲＮＡを含むペレットを洗浄することができる。１つの実施形態にしたがうと、洗浄に使用される溶液には、少なくとも１種類のカオトロピック剤、少なくとも１種類のアルコール、少なくとも１種類の界面活性剤、および／または少なくとも１種類の緩衝成分が含まれる。これには界面活性剤もまた含めることができる。洗浄溶液中で使用することができるカオトロピック剤としては、塩酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン、イソチオシアン酸グアニジン、およびヨウ化ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。さらに、トリクロロ酢酸塩、過塩素酸塩、およびトリフルオロ酢酸塩からなる群より選択されるカオトロピックアニオンを含むカオトロピック塩を使用することができる。それぞれのカオトロピック塩の例は、過塩素酸ナトリウム、トリクロロ酢酸ナトリウム、およびトリフルオロ酢酸ナトリウムのようなアルカリ塩である。洗浄用のアルコールとしては、短鎖の分岐アルコールまたは非分岐アルコール（１〜５個の炭素原子を持つことが好ましい）を洗浄のために、上記洗浄溶液中でそれぞれ、使用することができる。例は、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、およびブタノールである。イソプロパノールおよび／またはエタノールが使用されることが好ましい。上記洗浄溶液に、少なくとも１０％のアルコールと少なくとも９００ｍＭのカオトロピック塩、好ましくは、少なくとも２Ｍのカオトロピック塩が含まれることが好ましい。さらに、上記洗浄溶液に界面活性剤を含めることができる。

【0051】

本発明による方法での使用に適しているキットもまた提供される。上記キットには以下が含まれる：
ａ）カオトロピック剤とフェノールとを含む酸性変性組成物；
ｂ）少なくとも１種類の陽イオン性界面活性剤と、好ましくは塩とを含む、水相中のＤＮＡを低減するための溶液；
ｃ）必要に応じて、核酸結合固相；および
ｄ）必要に応じて、洗浄バッファおよび溶離バッファ。

【0052】

上記酸性変性組成物は、上に記載された特徴を有することが好ましい。これは上記開示に記載されたとおりである。さらに、ＤＮＡを低減するための溶液もまた、上に記載された特徴を有することが好ましい。これもまた、上記開示に記載されたとおりである。

【0053】

本発明のさらなる態様にしたがうと、カオトロピック剤とフェノールとを含む酸性変性組成物の使用を含むＲＮＡ単離方法において形成された、ＲＮＡを含む水相中のＤＮＡの量を低減するための方法が、提供され、ここで、水不溶性の有機溶媒の添加により得られた相が、水相、必要に応じて、中間相および有機相に分離される前に、少なくとも１種類の陽イオン性界面活性剤が、上記酸性変性組成物中でホモジナイズされた試料に添加される。

【0054】

本発明はまた、以下の工程：
− カオトロピック剤とフェノールとを含む酸性変性組成物中で試料をホモジナイズする工程；
− 水不溶性の有機溶媒を添加する工程、および
− この混合物を、水相、必要に応じて、中間相および有機相に分離させる工程、
により得られる、ＲＮＡを含む水相中のＤＮＡの量を低減するための、少なくとも１種類のイオン性界面活性剤の使用にも関し、
ここで、上記イオン性界面活性剤が、最終的に上記相を分離させる前に添加される。イオン性界面活性剤として、ＳＤＳのような陰イオン性界面活性剤、および好ましくは、陽イオン性界面活性剤が使用される。上記で議論したように、陽イオン性界面活性剤が、ＲＮＡを含む水溶液中のＤＮＡの量を低減することに関して最良の結果をもたらすので、上記界面活性剤が陽イオン性界面活性剤であることが好ましい。上記酸性変性組成物、上記界面活性剤についてのさらなる詳細、および記載される使用についてのさらなる詳細は、本発明による方法と組み合わせて上記で議論されている。これは上記開示に記載されている。上記酸性変性組成物が上に記載される好ましい特徴の全てを併せ持つことが好ましい。

【0055】

本発明はまた、以下の工程：
− カオトロピック剤とフェノールとを含む酸性変性組成物中で試料をホモジナイズする工程；
− 水不溶性の有機溶媒を添加する工程；および
− この混合物を、水相、必要に応じて、中間相および有機相とに分離させる工程、
により得られた、ＲＮＡを含む水相中のＤＮＡの量を減少させることにより中間相および／または有機相中のＤＮＡの量を増加させるための少なくとも１種類の陽イオン性界面活性剤の使用にも関し、
ここで、上記陽イオン性界面活性剤が、最終的に上記相を分離させる前に添加される。

【0056】

上記酸性変性組成物および上記陽イオン性界面活性剤についての詳細と、関連する利点は上に詳細に記載されている。これはそれぞれの開示に記載されており、ここでも適用される。

【実施例】

【0057】

（実施例１）
ラットの肝臓からのＲＮＡの単離の間のゲノムＤＮＡの排除に対する様々な界面活性剤の効果を以下の方法により評価した：
１．ＲＮＡｌａｔｅｒにより安定化した２７０ｍｇの肝臓組織を、ＴｉｓｓｕｅＲｕｐｔｏｒホモジナイザーを使用して、２７ｍｌの、Ｑｉａｚｏｌ試薬、酸性フェノール、およびカオトロピック塩を含む試薬の中でホモジナイズした。

【0058】

２．１０００μｌの得られたホモジネートを２ｍｌのエッペンドルフチューブにアリコートした。したがって、１つの試料について１０ｍｇの組織を使用した。

【0059】

３．８μｌ（５μｇ）のゲノムＤＮＡを、相分離の前に上記Ｑｉａｚｏｌ試薬に添加した。

【0060】

４．次の工程で、１００μｌの以下の界面活性剤をこのホモジネートに添加した（２連で）：
− Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００［１００％］
− Ｔｗｅｅｎ２０［２０％］
− 臭化セチルトリメチルアンモニウム［１％］、ＣＴＡＢ
− 臭化テトラデシルトリメチルアンモニウム［１％］、ＴＴＡＢ。

【0061】

対照標準（ｒｅｆｅｒａｎｃｅ）については界面活性剤を添加しなかった（「対照標準」）。

【0062】

続いて、２００μｌのクロロホルムを添加し、ボルテックスした。

【0063】

５．上記試料を、４℃にて、１２，０００×ｇで１５分間遠心分離し、得られた水相を新しいエッペンドルフチューブに移した。

【0064】

６．１．５倍容積の無水エタノールをそれぞれの水相に添加し、混合した。

【0065】

７．この混合物をＲＮｅａｓｙミニカラム（Ｑｉａｇｅｎ）に移し、８，２００×ｇで１５秒間遠心分離し、続いて、７００μｌのＲＷＴバッファ（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、続いて８，２００×ｇで１５秒間遠心分離して洗浄した。

【0066】

８．このカラムを５００μｌのＲＰＥバッファ（Ｑｉａｇｅｎ）で２回洗浄し、それぞれ８，２００×ｇで１５秒間および２分間遠心分離し、続いて最大速度で１分間の最後の遠心分離工程を行った。

【0067】

９．結合したＲＮＡを、８，２００×ｇで１分間の遠心分離により、３０μｌのＲＮａｓｅを含まない水に溶離させ、そのＲＮＡ濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して分光学的に決定した。その結果を表１に示す。

【0068】

【表1】

明らかであるように、プロトコールの全ての変形（ｖａｒｉａｎｔ）により良好なＲＮＡの収量が得られる。しかし、使用した分光学的方法は、ＲＮＡとＤＮＡを厳密に区別するものではなく、したがって、ＲＮＡと、さらにはＤＮＡも「ＲＮＡの収量」として決定される。表３および対応する図１に続いて示すように、単離されたＲＮＡ中のＤＮＡの量が、本発明による方法を使用する場合にはかなり減少するので、対照標準法、ならびに、非陽イオン性界面活性剤ＴｒｉｔｏｎおよびＴｗｅｅｎを使用する方法と比較して、本発明による方法を使用する場合には純粋なＲＮＡの収量が改善される。

【0069】

１０．ＲＮＡ完全性に対する試験した界面活性剤の影響を比較するために、ＲＮＡ完全性を、Ａｇｉｌｅｎｔ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ ２１００（登録商標）を使用して評価した。その結果を表２に示す。

【0070】

【表2】

表２は、最も高いＲＩＮ数が本発明による方法を用いた場合に得られたことを示している。したがって、本発明による方法を用いて単離したＲＮＡのＲＮＡ完全性が、対照標準法を使用して単離したＲＮＡのＲＮＡ完全性、または他の非陽イオン性界面活性剤を添加した場合のＲＮＡ完全性よりも優れている。

【0071】

１１．ＲＮＡ試料を、ＲＮＡｓｅを含まない水で１：５０に希釈し、その後、２５μｌの反応容積において、逆転写酵素を用いておよび逆転写酵素を用いることなく、それぞれＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、１０ピコモル（ｐｍｏｌｅ）の遺伝子特異的プライマーおよびプローブ（ＰＧＫ１プライマーミックス、ＰＧＫ１プローブ）を用いて逆転写させた：
（１）３０分間、５０℃で
（２）１５分間、９５℃で
（３）１５秒間、９５℃で
（４）１分間、６０℃で、工程（３）、（４）を４０サイクル繰り返す。

【0072】

得られたＣｔ値とΔＣｔ値を、表３と図１ａ）（Ｃｔ値）および１ｂ）（ΔＣｔ値）に示す。

【0073】

【表3】

「−ＲＴ」反応においては、ＤＮＡ混入物質だけが鋳型となることができ、したがって、上記ＰＣＲにおいて増幅される（ＲＮＡは「−ＲＴ」反応では逆転写されず、したがって鋳型となることができない）。したがって、少量のＤＮＡを含む試料においては、より多いサイクルの後に閾値に到達し、したがって上記Ｃｔ値はより高い。このように、「−ＲＴ」反応において上記Ｃｔ値が高ければ高いほど鋳型の量が少なく、よって単離されたＲＮＡ中のＤＮＡ混入物質の量がより少ない。最も高いＣｔ値は本発明による方法を用いた場合に得られる。より高いＣｔ値の原因が核酸の全収量がより少ないことではないことを確認するために、「＋ＲＴ」反応についてのＣｔ値を決定した。ここでは、上記ＲＮＡが逆転写され、したがって上記ＰＣＲの鋳型となることができる。上記Ｃｔ値は全ての「＋ＲＴ」反応においてより低い。なぜなら、ここでは、逆転写された上記ＲＮＡ（および上記ＤＮＡ混入物質）がＰＣＲの鋳型となることができ、したがって、上記「−ＲＴ」反応においてより早い段階で閾値に到達するからである。結果から明らかであるように、得られた上記Ｃｔ値は全ての試験した試料においてほぼ等しい。

【0074】

ΔＣｔ値（ΔＣｔ＝（上記「−ＲＴ」反応のＣｔ）−（上記「＋ＲＴ」反応）のＣｔ）は、その２つの反応間の差を示しており、したがって、単離された上記ＲＮＡ中のＤＮＡ混入物質の量を示す。上記ΔＣｔ値が高ければ高いほど、単離された上記ＲＮＡ中のＤＮＡ混入物質の量はより少ない。表３と図１ａ）およびｂ）は、陽イオン性界面活性剤を添加した、本発明により単離したＲＮＡには、対照標準法よりもかなり少ない量のＤＮＡ混入物質しか含まれていないことを示している。したがって、ＤＮＡ混入物質は本発明の教示により効率よく低減される。他の非陽イオン性界面活性剤はＤＮＡ混入物質の量を減らすことはできなかった。逆に、上記対照標準法のΔＣｔ値よりもなおも低いΔＣｔ値から明らかであるように、これらは、単離された上記ＲＮＡ中のＤＮＡの増加をさらに導く。

【0075】

（実施例２）
上記界面活性剤を上記ホモジネートに直接添加する一方で、上記Ｑｉａｚｏｌ試薬を使用した様々な組織からのＲＮＡの単離の間に共精製された（ｃｏ−ｐｕｒｉｆｉｅｄ）ゲノムＤＮＡの量を評価するために、以下の実験を行った：
１．２００ｍｇの、ＲＮＡｌａｔｅｒにより安定化した肺、腎臓、心臓、脾臓、および脳組織を、ＴｉｓｓｕｅＲｕｐｔｏｒホモジナイザーを使用して、８ｍｌのＱｉａｚｏｌ試薬中でホモジナイズした。
２．それぞれ１０００μｌのホモジネート（１つの試料あたり２５ｍｇの組織に相当する）を２ｍｌのエッペンドルフチューブにアリコートし、１００μｌの以下の界面活性剤ストック溶液をこれに添加した：
− 臭化セチルトリメチルアンモニウム［１％］、ＣＴＡＢ
− 臭化テトラデシルトリメチルアンモニウム［１％］、ＴＴＡＢ。

【0076】

対照標準については界面活性剤を添加しなかった（「対照標準」）。

【0077】

続いて、２００μｌのクロロホルムを添加し、ボルテックスした。

【0078】

３．上記試料を、４℃にて、１２，０００×ｇで１５分間遠心分離し、得られた水相を新しいエッペンドルフチューブに移した。

【0079】

４．その上清を１．５倍容積の無水エタノールと混合し、水相をＲＮｅａｓｙミニカラム（Ｑｉａｇｅｎ）に移し、８，２００×ｇで１５秒間遠心分離し、続いて７００μｌのＲＷＴバッファ（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、その後、８，２００×ｇで１５秒間遠心分離して洗浄した。

【0080】

５．その後、このカラムを５００μｌのＲＰＥバッファ（Ｑｉａｇｅｎ）で２回、それぞれ８，２００×ｇで１５秒間および２分間洗浄し、続いて最大速度で１分間の最後の遠心分離工程を行った。

【0081】

６．結合したＲＮＡを、８，２００×ｇで１分間の遠心分離により３０μｌのＲＮａｓｅを含まない水に溶離させ、ＲＮＡ濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して分光学的に決定した。その結果を表４に示す。

【0082】

【表4-1】

【0083】

【表4-2】

明らかであるように、いずれのプロトコールを用いた場合にもその収量は良好であったが、本発明による方法により単離したＲＮＡにはＤＮＡは極少量しか含まれておらず、したがって、多くの場合は、純粋なＲＮＡの収量が、続いて表６においても明らかにするように、なおさらに多かった。

【0084】

７．ＲＮＡ完全性を、Ａｇｉｌｅｎｔ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ ２１００を使用して評価した。その結果を表５に示す。

【0085】

【表5】

先と同様に、上記ＲＩＮは、本発明による方法を用いる場合には、対照標準法と等しいか、またはなおさらに優れているかのいずれかである。

【0086】

８．ＲＮＡ試料を、以下のようにＲＮａｓｅを含まない水で希釈した：肺１：８０、腎臓１：１００、心臓１：５０、脾臓１：１００、脳１：５０。２μｌのそれぞれの希釈物を、２５μｌの反応容積において、逆転写酵素を用いておよび逆転写酵素を用いることなく、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、１０ピコモルの遺伝子特異的プライマーおよびプローブ（ＰＧＫ１プライマーミックス、ＰＧＫ１プローブ）を用いて逆転写させた：
（１）３０分間、５０℃で
（２）１５分間、９５℃で
（３）１５秒間、９５℃で
（４）１分間、６０℃で、工程（３）、（４）を４０サイクル繰り返す。

【0087】

得られたＣｔ値とΔＣｔ値を、表６と、対応する図２ａ）および２ｂ）に示す。

【0088】

【表6】

より高いΔＣｔ値（図２ｂもまた参照のこと）から導くことができるように、本発明による方法により、様々な組織試料から単離したＲＮＡ中のＤＮＡ混入物質の量がかなり低減された。したがって、本発明による方法は、様々な組織からの純粋なＲＮＡの単離に特に適している。

【0089】

（実施例３）
ＲＮＡを、上記Ｑｉａｚｏｌ試薬を使用して漸増量の組織から単離した。ここでは、以下の手順にしたがって上記陽イオン性界面活性剤をホモジネートに直接添加した。：
１．５ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、および５０ｍｇの、（ａ）ＲＮＡｌａｔｅｒにより安定化した肝臓または（ｂ）凍結した肝臓を、ＴｉｓｓｕｅＲｕｐｔｏｒホモジナイザーを使用して１ｍｌのＱｉａｚｏｌ試薬中でホモジナイズした。

【0090】

２．１００μｌの以下の界面活性剤ストック溶液を添加した：
− 臭化セチルトリメチルアンモニウム［１％］、ＣＴＡＢ
− 臭化テトラデシルトリメチルアンモニウム［１％］、ＴＴＡＢ。

【0091】

上記対照標準については界面活性剤を添加しなかった（「対照標準」）。

【0092】

続いて、２００μｌのクロロホルムを添加し、ボルテックスした。

【0093】

３．上記試料を、４℃にて、１２，０００×ｇで１５分間遠心分離し、得られた水相を新しいエッペンドルフチューブに移した。

【0094】

４．その上清を１．５倍容積の無水エタノールと混合し、水相をＲＮｅａｓｙミニカラム（Ｑｉａｇｅｎ）に移し、８，２００×ｇで１５秒間遠心分離し、続いて７００μｌのＲＷＴバッファ（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、その後、８，２００×ｇで１５秒間遠心分離して洗浄した。

【0095】

５．このカラムを、５００μｌのＲＰＥバッファ（Ｑｉａｇｅｎ）で２回、それぞれ、８，２００×ｇで１５秒間および２分間洗浄し、続いて最大速度で１分間の最後の遠心分離工程を行った。

【0096】

６．結合したＲＮＡを、８，２００×ｇで１分間の遠心分離により３０μｌのＲＮａｓｅを含まない水に溶離させ、上記ＲＮＡ濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して分光学的に決定する。その結果を表７および表８と、図３および図４に示す。

【0097】

【表7-1】

【0098】

【表7-2】

【0099】

【表8-1】

【0100】

【表8-2】

７．ＲＮＡ完全性を、Ａｇｉｌｅｎｔ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ ２１００を使用して評価した。その結果を表９および表１０に示す。

【0101】

【表9】

【0102】

【表10】

明らかであるように、本発明による方法により単離したＲＮＡについてのＲＩＮ値は優れている。

【0103】

８．ＲＮＡ試料を、ＲＮａｓｅを含まない水で１：７０に希釈した。その後、２μｌのこの希釈液を、２５μｌの反応容積において、逆転写酵素を用いておよび逆転写酵素を用いることなく、それぞれＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、１０ピコモルの遺伝子特異的プライマーおよびプローブ（ＰＧＫ１プライマーミックス、ＰＧＫ１プローブ）を用いて逆転写させた：
（１）３０分間、５０℃で
（２）１５分間、９５℃で
（３）１５秒間、９５℃で
（４）１分間、６０℃で、工程（３）、（４）を４０サイクル繰り返す。

【0104】

得られたＣｔ値とΔＣｔ値を表１１ａ）およびｂ）に列挙し、図５ａ）およびｂ）において棒グラフとしてプロットする。

【0105】

【表11-1】

【0106】

【表11-2】

（実施例４）
ＲＮＡの単離の間のゲノムＤＮＡの共精製に対する効果を、１つの条件について４つの個別のＲＮＡ調製物を用いて以下の手順にしたがい上記ホモジネートに直接添加した、様々な量の陽イオン性界面活性剤を使用して評価した：
１．９３０ｍｇの、ＲＮＡｌａｔｅｒにより安定化した肝臓を、ＴｉｓｓｕｅＲｕｐｔｏｒホモジナイザーを使用して３１ｍｌのＱｉａｚｏｌ試薬中でホモジナイズした。

【0107】

２．それぞれ１０００μｌのホモジネート（３０ｍｇの肝臓に相当する）を２ｍｌのエッペンドルフチューブにアリコートし、この試料に対して、界面活性剤を添加しなかったか、または漸増量（５０μｌ、１００μｌ、１５０μｌ、２００μｌ）の１％のＣＴＡＢストック溶液を添加したかのいずれかを行い、続いて、２００μｌのクロロホルムを添加し、ボルテックスした。

【0108】

３．試料を４℃にて、１２，０００×ｇで１５分間遠心分離し、得られた水相を新しいエッペンドルフチューブに移した。

【0109】

４．その上清を１．５倍容積の無水エタノールと混合し、水相をＲＮｅａｓｙミニカラム（Ｑｉａｇｅｎ）に移し、８，２００×ｇで１５秒間遠心分離し、続いて７００μｌのＲＷＴバッファ（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、その後、８，２００×ｇで１５秒間遠心分離して洗浄した。

【0110】

５．その後、このカラムを５００μｌのＲＰＥバッファ（Ｑｉａｇｅｎ）で２回、それぞれ８，２００×ｇで１５秒間および２分間洗浄し、続いて最大速度で１分間の最後の遠心分離工程を行った。

【0111】

６．結合したＲＮＡを、８，２００×ｇで１分間の遠心分離により３０μｌのＲＮａｓｅを含まない水に溶離させ、上記ＲＮＡ濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して決定した。その結果を表１２と図６に示す。

【0112】

【表12】

その結果はまた、図６にもまとめる。上記対照標準法と本発明による方法との間でのＲＮＡの収量における推定される減少は、主に、単離されたＲＮＡ中のゲノムＤＮＡの減少にその原因があり、ＲＮＡの減少に原因があるのではない。これは、とりわけｑＲＴ−ＰＣＲアッセイ（図７を参照のこと）および本明細書中に示す他の実施例によりサポートされる。

【0113】

７．ＲＮＡ完全性をＡｇｉｌｅｎｔ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ ２１００を使用して評価した。その結果を表１３に示す。

【0114】

【表13】

８．ＲＮＡ試料をＲＮａｓｅを含まない水で１：９０に希釈し、２５μｌの反応容積において、逆転写酵素を用いておよび逆転写酵素を用いることなく、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、それぞれ１０ピコモルの遺伝子特異的プライマーおよびプローブ（ＰＧＫ１プライマーミックス、ＰＧＫ１プローブ）を用いて逆転写させた：
（１）３０分間、５０℃で
（２）１５分間、９５℃で
（３）１５秒間、９５℃で
（４）１分間、６０℃で、工程（３）、（４）を４０サイクル繰り返す。

【0115】

得られたＣｔ値とΔＣｔ値を、表１４と対応する図７に示す。

【0116】

【表14】

その結果はまた、図７によっても例証される。明らかであるように、ＣＴＡＢの量を増加させることにより、単離された上記ＲＮＡ中のＤＮＡ混入物質の低減の増加がもたらされた。

【0117】

（実施例５）
組織からのＲＮＡの単離の間のゲノムＤＮＡの共精製に対する効果を比較するために、２種類の陽イオン性界面活性剤溶液（ＣＴＡＢとバッファ「ＢＢ」（Ｑｉａｇｅｎ、１％のＣＴＡＢと塩とを含む））を使用して、以下の実験を行った：
１．４２５ｍｇのＲＮＡｌａｔｅｒにより安定化した脾臓、および４２５ｍｇの凍結した脾臓を、ＴｉｓｓｕｅＲｕｐｔｏｒホモジナイザーを使用して、それぞれ、３１ｍｌのＱｉａｚｏｌ試薬中でホモジナイズした。

【0118】

２．それぞれ１０００μｌのホモジネートを２ｍｌのエッペンドルフチューブにアリコートし、１００μｌの以下のストック溶液をこのホモジネートに直接添加した：
− 臭化セチルトリメチルアンモニウム［１％］、ＣＴＡＢ
− ＱｉａｇｅｎバッファＢＢ（ＮａＣｌ中の１％のＣＴＡＢ）。

【0119】

上記対照標準については界面活性剤を添加しなかった（「対照標準」）。

【0120】

続いて、２００μｌのクロロホルムを添加し、ボルテックスした。

【0121】

３．上記試料を、４℃にて、１２，０００×ｇで１５分間遠心分離し、得られた水相を新しいエッペンドルフチューブに移した。

【0122】

４．その上清を１．５倍容積の無水エタノールと混合し、水相をＲＮｅａｓｙミニカラム（Ｑｉａｇｅｎ）に移し、８，２００×ｇで１５秒間遠心分離し、続いて７００μｌのＲＷＴバッファ（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、その後、８，２００×ｇで１５秒間遠心分離して洗浄した。

【0123】

５．その後、このカラムを５００μｌのＲＰＥバッファ（Ｑｉａｇｅｎ）で２回、それぞれ８，２００×ｇで１５秒間および２分間洗浄し、続いて最大速度で１分間の最後の遠心分離工程を行った。

【0124】

６．結合したＲＮＡを、８，２００×ｇで１分間の遠心分離により３０μｌのＲＮａｓｅを含まない水に溶離させ、上記ＲＮＡ濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して分光学的に決定した。その結果を表１５に示す。

【0125】

【表15-1】

【0126】

【表15-2】

７．ＲＮＡ完全性を、Ａｇｉｌｅｎｔ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ ２１００を使用して評価した。表１６を参照のこと。

【0127】

【表16】

明らかであるように、上記ＲＮＡ完全性は、本発明による方法を使用して上記組織からＲＮＡを単離する場合に改善される。

【0128】

８．ＲＮＡ試料をＲＮａｓｅを含まない水で１：１００に希釈し、２５μｌの反応容積において、逆転写酵素を用いておよび逆転写酵素を用いることなく、それぞれＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、１０μＭの濃度の遺伝子特異的プライマー（ＰＧＫ１プライマーミックスおよびＰＧＫ１プローブ）を用いて逆転写させた：
（１）３０分間、５０℃で
（２）１５分間、９５℃で
（３）１５秒間、９５℃で
（４）１分間、６０℃で、工程（３）、（４）を４０サイクル繰り返す。

【0129】

得られたＣｔ値とΔＣｔ値を、表１７と、対応する図８に示す。

【0130】

【表17】

表１７および図８から導くことができるように、本発明による方法は、ＤＮＡ混入物質の量を減少させることにより、それぞれの組織から単離されたＲＮＡの純度を改善する。これは、増大したΔＣｔ値から導くことができる。

【0131】

（実施例６）
本明細書中では、ＲＮＡの単離を、ＱＩＡｚｏｌ（フェノールとカオトロピック剤とを含むが、ＣＴＡＢは含まない）を使用する対照標準プロトコールにしたがって、本発明にしたがって（ここでは、ＣＴＡＢをそのホモジネートに添加する）、および先行技術（ここでは、フェノールとＣＴＡＢだけが使用され、カオトロピック剤は使用されない（例えば、ＥＰ１２１９７０７を参照のこと））にしたがって行った。この実施例は、カオトロピック剤とフェノールとを含む酸性変性組成物の陽イオン性界面活性剤との組み合わせが、試料（特に、組織試料のような難しい試料）から、ＤＮＡ混入物質の量を減らしながら、純粋なＲＮＡを効率よく単離するために重要であることを示している。上記ＲＮＡを、２種類の方法（沈殿による方法、ならびにシリカメンブレンを含むＲＮＡｅａｓｙミニカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用した精製による方法）を使用してＲＮＡを含む水相から単離した。

【0132】

６．１．ＱＩＡｚｏｌを使用してＲＮＡを単離するために、ＲＮＡを含む水相を以下のようにして得た：
１．この実験のために、２×１００ｍｇの、ＲＮＡｌａｔｅｒにより安定化した脾臓および肺組織をＴｉｓｓｕｅＲｕｐｔｏｒを使用して９ｍｌのＱｉａｚｏｌ試薬中でホモジナイズした。

【0133】

２．ホモジネートを、２ｍｌのエッペンドルフチューブ上の９００μｌのアリコート、または１０００μｌのアリコート中のいずれかに分けた。

【0134】

３．１００μｌのＱＩＡＧＥＮバッファＢＢ（１％のＣＴＡＢと塩とを含む）をそれぞれ、９００μｌの試料に添加した。ＱＩＡｚｏｌだけを使用する対照標準法については、界面活性剤は添加しなかった。１８０μｌのクロロホルムを全ての試料に対して添加し、ボルテックスし、続いて、室温で２〜３分間インキュベートした。その後、その試料を、４℃にて１２，０００×ｇで１５分間遠心分離し、得られた水相を新しいエッペンドルフチューブに移した。

【0135】

６．２．ＲＮＡを単離するためのＲＮＡを含む水相を、ＥＰ１２１９７０７による方法を使用して以下のようにして得た：
１．２×１００ｍｇの、ＲＮＡｌａｔｅｒにより安定化した肺および脾臓組織を、８ｍｌのフェノール（ｐＨ４．３）、２ｍｌの１０％のＣＴＡＢ、５００μｌの２Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）、９．４８ｍｌのＲＮａｓｅを含まない水を含む、それぞれ９ｍｌの溶液中でホモジナイズした。

【0136】

２．その後、ホモジネート（１０００μｌ）を２ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。上記ホモジネートにおける組織の量は他の方法と同じとした。２００μｌのクロロホルムを添加し、続いてボルテックスし、室温で２〜３分間インキュベートした。その後、その試料を、４℃にて、１２，０００×ｇで１５分間遠心分離した。

【0137】

３．水相を新しいエッペンドルフチューブに移し、さらなる処理まで、−２０℃で一晩保存した。

【0138】

６．３．沈殿によるＲＮＡを含む水相からのＲＮＡの単離
６．１および６．２にしたがって得た水相を、以下の通りに同じようにさらに処理した：
１．５００μｌのイソプロパノールを添加し、混合し、室温で１０分間インキュベーションし、続いて、４℃にて１２，０００×ｇで１５分間の遠心分離工程を行うことにより、ＲＮＡを沈殿させた。

【0139】

２．その上清を廃棄し、ＲＮＡペレットを、１ｍｌの７５％のエタノールを添加し、ボルテックスし、続いて４℃にて７５００×ｇで５分間遠心分離することにより１回洗浄した。

【0140】

３．その上清を廃棄し、ペレットを風乾させ、６０℃で１０分間、３０μｌのＲＮＡｓｅを含まない水に再度懸濁させた。

【0141】

４．得られたＲＮＡをＮａｎｏｄｒｏｐ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量化した。表１９を参照のこと。

【0142】

【表18-1】

【0143】

【表18-2】

その結果は、フェノールとＣＴＡＢとを使用し、カオトロピック剤を使用しないＥＰ１２１９７０７にしたがう方法が、組織試料からＲＮＡを単離するためには適していないことを示している。

【0144】

６．４．ＲＮｅａｓｙミニカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用することによるＲＮＡを含む水相からのＲＮＡの単離：
水相は、６．１および６．２において上に記載したとおりに得た。その後、この水相を以下のように処理した：
１．水相を１．５倍容積の無水エタノールと混合し、ＲＮｅａｓｙミニカラム（Ｑｉａｇｅｎ）上に移し、８，２００×ｇで１５秒間遠心分離した。続いてこれを７００μｌのＲＷＴバッファ（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、その後、８，２００×ｇで１５秒間遠心分離して洗浄した。

【0145】

２．その後、そのカラムを、５００μｌのＲＰＥバッファ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて２回、それぞれ８２００ｇで１５秒間および２分間洗浄し、続いて最大速度で１分間の最後の遠心分離工程を行った。

【0146】

３．結合したＲＮＡを、８，２００ｇで１分間の遠心分離により３０μｌのＲＮａｓｅを含まない水に溶離させた。上記ＲＮＡ濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して分光学的に決定した。表１９を参照のこと。

【0147】

【表19】

６．５．単離されたＲＮＡ中のゲノムＤＮＡ含量の決定
６．３または６．４にしたがって単離したＲＮＡ中のゲノムＤＮＡ混入物質の含量を評価するために、以下の工程にしたがってｑＲＴ−ＰＣＲを行った：
１．脾臓由来のＲＮＡ試料をおよそ３０ｎｇ／μｌに希釈し、肺由来のＲＮＡ試料は約１０ｎｇ／μｌに希釈した。

【0148】

ＥＰ１２１９７０７にしたがってフェノール調合物を使用して調製したＲＮＡ試料は、その後のｑＲＴ−ＰＣＲのためには希釈しなかった。

【0149】

２．ｑＲＴ−ＰＣＲを、２μｌのＲＮＡ試料を鋳型として用い、２０μｌの反応容積中でそれぞれ１０ピコモルのプライマーおよびプローブ（ＰＧＫ１プライマーミックス、ＰＧＫ１プローブ）を用いて「ＱｕａｎｔｉＦａｓｔプローブＲＴ ＰＣＲマスターミックス」を使用してＲｏｔｏＧｅｎｅ ＱリアルタイムＰＣＲ機器（Ｑｉａｇｅｎ）で行った。数回の独立したｑＲＴ−ＰＣＲ反応をそれぞれの試料について行った。サイクル条件は以下のとおりとした：
（１）１０分間、５０℃で
（２）５分間、９５℃で
（３）１０秒間、９５℃で
（４）３０秒間、６０℃で、工程（３）、（４）を４０回繰り返す。

【0150】

Ｃｔ値およびΔＣｔ値の平均を表２０に示す。

【0151】

【表20】

明らかであるように、単離された（純粋な）ＲＮＡの量を増やしつつ、単離されたＲＮＡ中のＤＮＡの量のかなりの低減をもたらす最良の結果は、本発明による方法を用いて達成される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】