特許 6096677 同種造血幹細胞移植の増強

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6096677

(24)【登録日】2017年2月24日

(45)【発行日】2017年3月15日

(54)【発明の名称】同種造血幹細胞移植の増強

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/17 20150101AFI20170306BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20170306BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20170306BHJP

【ＦＩ】

   A61K35/17ZMD

   A61P35/00

   A61P35/02

【請求項の数】15

【全頁数】22

(21)【出願番号】特願2013-549494(P2013-549494)

(86)(22)【出願日】2012年1月10日

(65)【公表番号】特表2014-502637(P2014-502637A)

(43)【公表日】2014年2月3日

(86)【国際出願番号】US2012020800

(87)【国際公開番号】WO2012096974

(87)【国際公開日】20120719

【審査請求日】2015年1月6日

(31)【優先権主張番号】61/460,981

(32)【優先日】2011年1月10日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】503115205

【氏名又は名称】ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー

(74)【代理人】

【識別番号】100078868

【弁理士】

【氏名又は名称】河野 登夫

(74)【代理人】

【識別番号】100114557

【弁理士】

【氏名又は名称】河野 英仁

(72)【発明者】

【氏名】ストロベール，サミュエル

(72)【発明者】

【氏名】ダット，スパーナ

(72)【発明者】

【氏名】ロウスキー，ロバート

【審査官】 伊藤 基章

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１３−５３７１８７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１２／０３２５２６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 DUTT S. et al，Memory Phenotype CD8+T Cells Are Superior to Naive CD8+T Cells in Separating Graft Anti-Tumor Activity From Gvhd After Bone Marrow Transplantation; Application to DLI，51st ASH ANNUAL MEETING AND EXPOSITION Online Program and Abstracts，２００９年，Abstract No.2452

【文献】 SUZUKI H. et al，Are CD8+CD122+ cells regulatory T cells or memory T cells?，Hum Immunol，２００８年，Vol.69, No.11，p.751-4

【文献】 TOUGH D.F.，Deciphering the relationship between central and effector memory CD8+ T cells，Trends Immunol，２００３年，Vol.24, No.8，p.404-7

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３５／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒト対象における同種造血細胞移植に使用する供与物であって、
前記供与物は、セントラル及びエフェクターメモリーＴ細胞を含むドナー由来メモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞を含んでおり、該ドナー由来メモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞はＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＡ⁻及びＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＯ^＋細胞から選択されており、前記供与物は、同種造血細胞移植後のがんの再発に先立って少なくとも２か月間にわたるホストヒト対象への投与のためのものであり、前記ドナー由来メモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞は、少なくとも１×１０^６の量であって、少なくとも８０％の純度であり、前記供与物は、前記ホストヒト対象におけるがんの再発を防止するためのものであり、前記供与物は、移植片対宿主病無しに前記ホストヒト対象における残留するがん細胞の死滅を促進するのに有効であることを特徴とする供与物。

【請求項2】

前記ホストヒト対象ががん治療をなされていることを特徴とする請求項１に記載の供与物。

【請求項3】

前記供与物の投与は完全キメリズムを促進することを特徴とする請求項１に記載の供与物。

【請求項4】

前記ホストヒト対象は、化学療法剤で治療されていることを特徴とする請求項２に記載の供与物。

【請求項5】

前記ホストヒト対象は、少なくともがんから部分寛解であることを特徴とする請求項２に記載の供与物。

【請求項6】

前記ホストヒト対象は、前記供与物の投与に先立って、実質的に造血系を切断するために、化学療法剤又は放射線剤で治療されていることを特徴とする請求項１に記載の供与物。

【請求項7】

前記供与物は、同種造血細胞のドナーから得られることを特徴とする請求項１に記載の供与物。

【請求項8】

前記供与物は、直接的に使用されることを特徴とする請求項１に記載の供与物。

【請求項9】

前記供与物は、凍結されるか、又は特定の培養媒体内でビボ外に維持されることを特徴とする請求項１に記載の供与物。

【請求項10】

前記がんは、血液悪性腫瘍である請求項１に記載の供与物。

【請求項11】

前記ホストヒト対象は、小児患者である請求項１に記載の供与物。

【請求項12】

前記ホストヒト対象は、成人患者である請求項１に記載の供与物。

【請求項13】

前記がんは、リンパ腫である請求項１に記載の供与物。

【請求項14】

前記がんは、白血病である請求項１に記載の供与物。

【請求項15】

前記供与物は前記ホストヒト対象に投与され、前記ドナー由来メモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞は、少なくとも１×１０⁸ の量であって、少なくとも８０％の純度である請求項１４に記載の供与物。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

悪性腫瘍の別名でも知られるがんは、制御されない細胞分裂、隣接する組織の浸潤と破壊、及び、時に体の他の部位への転移、を示す細胞の異常な増殖により特徴付けられる。がんには１００を超える型があり、乳がん、皮膚がん、肺がん、結腸がん、前立腺がん及びリンパ腫などが含まれる。がんはアメリカにおいて死因の第二位であり、死全体のおよそ１３％ががんによるものである。がんは胎児までもの全ての年齢の人々を冒し得るが、ほとんどの形態のがんの危険性は年齢と共に上昇する。がんはすべての動物を冒し得る。

【0002】

化学療法は多くのがんに対する治療の標準となっている。化学療法とは抗悪性腫瘍薬をがん治療に用いること又は細胞毒性の標準化された投与計画にこれらの薬を組み合わせることを指す。最も一般的には、化学療法は、速く分裂する細胞を殺すことによって効を奏す。急速な分裂はがん細胞の主な特徴の一つである。このことは、化学療法は正常な環境において早く分裂する細胞もまた害するということを意味する。骨髄、消化管、そして毛包中の細胞である。このことにより、化学療法で最も一般的な副作用が引き起こされる。骨髄抑制（血液細胞の生成減少）、粘膜炎（消化管の裏層の炎症）、そして脱毛（抜け毛）である。より新しい抗がん剤はがん細胞の異常タンパク質に対して直接働く。これは標的療法と名付けられている。

【0003】

同種造血細胞移植（ＨＣＴ）は、白血病及びリンパ腫の患者にとって、特に患者が移植の時に完全寛解であるときは、根治的な治療となり得る。しかしながら、移植の時に患者が部分寛解であったり、骨髄非破壊的な移植前治療が行われた時に完全キメリズムよりもむしろ混合キメリズムが発生する場合、進行性疾患又は再発の危険性は相当に高くなる。

【0004】

これらの新しい薬及び改良された組み合わせにも関わらず、現在の治療は未だ多くの型のがん又は異なったステージのがんに有効でない。改良された投与計画と治療が、がん治療に大いに求められている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】欧州特許第１１２３３８４号明細書

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明の一つの態様において、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の主な合併症を引き起こすことなく腫瘍細胞を殺すことのできる、精製されたドナーのリンパ球サブセットを加える同種造血細胞移植の後に、がん（白血病、リンパ腫が含まれるがこれらに限定されない）の治療を増強するための組成と方法が開示される。

【課題を解決するための手段】

【0007】

関連する態様において、同種造血細胞移植（ＨＣＴ）の後、混合造血細胞キメリズムから完全ドナー細胞キメリズムへの変換を増強する方法と組成が開示される。このような移植はがん又は、その他の、造血系の再構成が必要な状態の治療に利用できる。例えば、貧血、地中海貧血症、自己免疫状態の治療などである。混合キメリズムは、同種ＨＣＴの後、完全ドナーキメリズムを果たした患者と比べてずっと高いがんの進行又は再発の割合と関連がある。ドナーリンパ球輸注（ＤＬＩ）は慣習的に移植後の時点で行われるが、ＤＬＩは通常末梢血単核球でできており、末梢血単核球は血液中のすべてのＴ細胞サブセットを含んでいるので、重篤なＧＶＨＤを引き起こす主要な危険因子となる。

【0008】

本発明は、実質的に精製されたドナーのメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞をＤＬＩとして同種ＨＣＴの後に利用することで従来のＤＬＩを進歩させる。細胞はヒトの移植後適切なときに、例えば、腫瘍の再発を防ぐために約２か月から約６か月、又は腫瘍の再発時に再発を治療するために投与される。これらの方法はより完全なドナーキメリズムを提供し、腫瘍細胞を殺す更なる利点がある。メモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞はセントラルメモリーＴ細胞とエフェフクターメモリーＴ細胞の一つもしくは両方を含み、通常両方を含む。ドナーのメモリーＴ細胞は通常精製され、単独で、又は当業者に知られるこのような細胞の他のマーカー（ＣＤ８^＋ＣＤ４４^＋ポピュレーションを含むがこれらに限定されない）との組み合わせで、ＣＤ８に特異的な親和剤とともに選ばれても良い。Ｔ細胞は完全キメリズムを促進する、また適切な場合、腫瘍細胞の死滅を増強させるのに有効な用量で投与される。

【0009】

いくつかの態様において、がんは固形腫瘍である。本発明にかかる方法を用いて治療される固形腫瘍の例として、結腸直腸がん、肺がん、乳がん、膵臓がん、肝臓がん、前立腺がん、卵巣がんがあるがこれらに限定されるものではない。他の態様において、がんは白血病又はリンパ腫であり、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病、（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫などのリンパ腫等を含むがこれらに限定されない。いくつかの態様において、腫瘍細胞は原発又は転移腫瘍である。

【0010】

本発明の新規特徴は、添付の特許請求の範囲に具体的に記載される。後述の、本発明の原理を利用した具体的な態様を記載した詳細な説明と、付随する図面を参照することにより、本発明の利点と特徴をよりよく理解することができるだろう。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】ドナーのＣ５７ＢＬ／６ ＴＣＤ ＢＭ細胞を、全Ｔ細胞又はＴ細胞サブセットと共に、又はこれら無しで移植されたＢＡＬＢ／ｃホストの生存率を示す図である。 Ａ；致死的な放射線を浴びた（８００ｃＧｙ）ホストは、ドナーからの２×１０^６のＴＣＤ ＢＭ細胞を、脾臓由来の、０．５×１０^６の選別された全Ｔ細胞（Ｎ＝１０）又は全ＣＤ４^＋Ｔ細胞（Ｎ＝１０）と共に、又はこれら無しで（Ｎ＝１２）与えられた。データは、独立した２回の実験より貯えられた。 Ｂ；連続的な体重測定がパネルＡのマウスにおいて行われた。＋は、体重測定がグループに二匹しかマウスが残らない時点で終了したことを示す。 Ｃ；ホストは、照射６時間後に５００のＢＣＬ_１リンパ腫細胞を与えられた。致死的な放射線を浴びたホストは２×１０^６のＴＣＤ ＢＭ細胞を、０．５×１０^６の選別されたＣＤ６２Ｌ^ｈｉＣＤ４４^ｌｏｗナイーブ（Ｎ＝１０）又はＣＤ４４^ｈｉメモリー表現型ＣＤ４^＋Ｔ細胞（Ｎ＝１０）と共に、又はこれら無し（Ｎ＝８）で与えられた。コントロールの無処置のホストも腫瘍細胞を与えられた（Ｎ＝８）。データは、独立した２回の実験より貯えられた。 ＤとＦ；ＴＣＤ ＢＭのみ、又はメモリーＣＤ４^＋Ｔ細胞と共に、又はメモリー全Ｔ細胞と共にそれぞれ移植を行った２８日後の、ＣとＥにおいて進行性の腫瘍増殖のあるレシピエントの末梢血液中のＣＤ１９対ＢＣＬ_１-イディオタイプマーカーの代表的な二色フローサイトメトリー分析がそれぞれ示されている。

【図2】ナイーブ及びメモリー表現型ＣＤ８^＋Ｔ細胞の性質決定を示す図である。 Ａ；Ｃ５７ＢＬ／６脾細胞は抗ＣＤ８、抗ＣＤ４４及び抗ＣＤ６２Ｌ ｍＡｂで染色された。ゲートされたＣＤ６２Ｌ^ｈｉＣＤ４４^ｌｏｗとＣＤ４４^ｈｉＣＤ８^＋ＴはＣＣＲ９、α_４β_７、ＣＤ１２２及びＣＸＣＲ３の発現をみるため分析された。ゲートはアイソタイプ染色で決定された。それぞれのマーカーのヒストグラムプロットが重ねてある。ＣＤ４４^ｌｏｗＣＤ８^＋Ｔ細胞（太線）、ＣＤ４４^ｈｉＣＤ８^＋Ｔ（濃淡をつけた領域）。 Ｂ；それぞれの細胞の組み合わせに３個の複製ウェルを用いたＭＬＲ５日目における、Ｃ５７ＢＬ／６応答ナイーブ又はメモリー表現型ＣＤ８^＋Ｔ細胞(２×１０^５)のＢＡＬＢ／ｃ刺激細胞（８×１０^５）に対する^３Ｈ−チミジン取り込み（平均±標準誤差）結果は少なくとも３回のＭＬＲ実験の代表的なものである。AlloとSynはそれぞれＢＡＬＢ／ｃとＣ５７ＢＬ／６の刺激細胞を示す。＋は^３Ｈ−チミジン取り込みが５，０００ｃｐｍ未満であった事を示す。 Ｃ；ＭＬＲ６０時間における、Ｃ５７ＢＬ／６ドナーナイーブ又はメモリー表現型ＣＤ８^＋Ｔ細胞（１×１０^５）の、放射線照射されたＢＡＬＢ／ｃ（５×１０^５）刺激細胞に対するサイトカイン反応が示されている。左のパネルは、ＩＬ−２の平均±標準誤差の濃度を示す。右はＩＦＮ−γの平均±標準誤差の濃度を示す。＃はサイトカインの濃度が＜１０ｐｇ／ｍｌであった事を示す。結果は少なくとも３回のＭＬＲ培養の代表的なものである。 Ｄ；選別されたナイーブ又はメモリー細胞は、ルシフェラーゼ発現−ＢＣＬ_１細胞に対する細胞毒性試験に用いられた。選別されたナイーブ又はメモリー表現型ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、放射線照射されたＢＡＬＢ／ｃの脾細胞で９６時間刺激された。ルシフェラーゼを発現したＢＣＬ_１リンパ腫細胞は、様々なエフェクター：ターゲットの割合で、刺激されたナイーブ又はメモリー表現型細胞と混合された。ルシフェラーゼのシグナルは１６時間後に測定された。そして％細胞毒性が、それぞれの時点でのエフェクター細胞なしの同じターゲット数と比べて決定された。

【図3】選別された全、ナイーブ又はメモリー表現型ＣＤ８^＋Ｔ細胞と共に、又はこれら無しでドナーＣ５７ＢＬ／６のＴＣＤ ＢＭ細胞を移植された、ＢＡＬＢ／ｃレシピエントの生存率と体重変化を示す図である。 ＡとＣ；致死的な放射線を浴び、１．０×１０^６ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞、１．０×１０^６メモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞、０．５×１０^６ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞、０．５×１０^６メモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞、又は０．５×１０^６全ＣＤ８^＋ドナーＴ細胞（Ｎ＝８−１１）と共に、又はこれら無しでドナーから２×１０^６のＴＣＤ ＢＭ細胞を与えられたＢＡＬＢ／ｃホストの生存率が示されている。データは、独立した２回の実験より貯えられた。 ＢとＤ；ＡとＣに示されている、選別されたナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞、メモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞、又は全ＣＤ８^＋Ｔ細胞と共に、又はこれら無しでＴＣＤ ＢＭを与えられた、ホストマウスの開始時体重のパーセンテージ。括弧内は平均の標準誤差を示す。

【図4】５００のＢＣＬ_１リンパ腫細胞を与えられた後、選別されたナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞、メモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞、又は全ＣＤ８^＋Ｔ細胞と共に、又はこれら無しでＣ５７ＢＬ／６ドナーのＴＣＤ ＢＭを移植されたＢＡＬＢ／ｃホストの生存率、体重変化及び器官の病理学スコアを示す図である。 ホストは放射線照射６時間後に５００のＢＣＬ_１リンパ腫細胞を与えられた。 Ａ；０．５×１０^６の選別されたナイーブＣＤ８^＋Ｔ（Ｎ＝１４）、メモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞（Ｎ＝１２）、又は全ＣＤ８^＋Ｔ細胞（Ｎ＝１０）と共に、又はこれら無しで（Ｎ＝１０）、２×１０^６のＣ５７ＢＬ／６ドナー由来ＴＣＤ ＢＭ細胞を与えられた、照射されたホストの生存率。データは、独立した２から４回の実験より貯えられた。 Ｂ；Ａにある通り選別されたナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞、メモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞、又は全ＣＤ８^＋Ｔ細胞と共に、又はこれら無しでＣ５７ＢＬ／６ドナーのＴＣＤ ＢＭを与えられたホストマウスの、開始時体重のパーセンテージ。括弧内は平均の標準誤差を示す。 Ｃ；ナイーブ、メモリー表現型又は全ＣＤ８^＋Ｔ細胞及びＴＤＣ ＢＭのみが引き起こした病理組織学的な変化。代表的な組織片はＡのホストから得られた。ホストの肝臓及び大腸由来の病理組織学的な試料は移植１００日後に得られ、パラフィンブロックに包埋される前にホルマリンで固定された。４−５ｍｍ厚の組織片はヘマトキシリンとエオシンで染色された。全ての画像について、顕微鏡画像はＳＰＯＴ ＲＴデジタルカメラ及びacquisition software (Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI)を備えたEclipse E1000M microscope (Nikon, Melville, NY)を用いて最終倍率３００倍で得られた。全体の画像に対して、画像処理はPhotoshop CS (Adobe, San Jose, CA)で、明るさ、コントラスト及びカラーバランスの標準調節が行われた。ＴＣＤ ＢＭグループ２１日目の病理組織診断（上の写真）。稀なアポトーシスを除いて（矢印、左の写真）、結腸にＧＶＨＤの証拠は無かったが、肝臓のリンパ腫（矢頭、右の写真）は明らかであった。ナイーブグループにおいて（２段目写真）、結腸にＧＶＨＤの証拠は無かった。肝臓の門脈管には顕著なリンパ球浸潤が見られグレード２のＧＶＨＤと一致した（アスタリスク、右の写真）。メモリーグループ（３段目写真）において、結腸にも肝臓にもＧＶＨＤ又はリンパ腫の証拠は無かった。ＴＣＤ ＢＭと全ＣＤ８^＋Ｔ細胞のグループにおいて、結腸の陰窩（矢印）にアポトーシスの増加と粘膜固有層の炎症（塗りつぶされていない矢頭、左の写真、４段目）が見られた。同じように、肝臓に門脈の炎症と胆管の損傷（アスタリスク）が見られ、ＧＶＨＤと一致した。組織片はＨ＆Ｅで染色された。それぞれの写真は試験された５−１０のホストの代表的なものである。 Ｄ；４つのグループ（グループあたりＮ＝６）由来の肝臓、小腸、及び結腸病理組織学的ＧＶＨＤスコアの平均（±標準誤差）。ＮＳ＝有意差なし（ｐ＞０．０５）。

【図5】選別されたナイーブ又はメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞と共に、又はこれら無でＴＣＤ ＢＭ移植された後の生存率、キメリズム及びＢＣＬ_１腫瘍細胞の除去を示す図である。 Ａ；全身照射（ＴＢＩ、８００ｃＧｙ)、ＢＣＬ_１細胞、及び５０万のナイーブ又はメモリー表現型ＣＤ８^＋Ｔ細胞とともに、又はこれら無しの２×１０^６ＴＣＤ ＢＭ細胞の移植後２８日のレシピエントの末梢血液中のＣＤ１９対ＢＣＬ_１-イディオタイプマーカーの代表的な二色フローサイトメトリー分析。未処理のコントロールレシピエントはＢＣＬ_１のみ与えられた。箱にＢＣＬ_１-イディオタイプ陽性ＣＤ１９^＋細胞を封入し、箱中の細胞のパーセンテージが示されている。 Ｂ；ゲートされたＴＣＲβ^＋細胞中のドナー（Ｈ−２Ｋ^ｂ＋）細胞のパーセンテージを示す代表的な２８日後の末梢血液の二色フローサイトメトリー分析。 ＣとＤ；０．５×１０^６、０．１×１０^６、０．０５×１０^６の選別されたナイーブ細胞（Ｎ＝１５；Ｎ＝９；Ｎ＝８）と共に、又はそれ無しで（Ｎ＝８）Ｃ５７ＢＬ／６ドナーから２×１０６のＴＣＤ ＢＭ細胞を与えられた、致死的な放射線を浴びたＢＡＬＢ／ｃホストの生存率。（Ｃ）メモリー表現型（Ｄ）ＣＤ８^＋Ｔ細胞（Ｎ＝１２；Ｎ＝９；Ｎ＝８）データは独立した２回の実験より貯えられた。

【図6】形質転換していないＴＣＤ ＢＭの移植後の、ルシフェラーゼ形質転換ナイーブ又はメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞の輸送及び増殖の比較を示す図である。 ＢＡＬＢ／ｃホストは致死的な放射線照射をされ、５００のＢＣＬ_１リンパ腫細胞を与えられ、Ｂ６−Ｌ２Ｇ８５（Ｈ−２^ｂ）ｌｕｃ^＋マウス由来のメモリー表現型ＣＤ８^＋Ｔ細胞と共に２×１０^６のＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２^ｂ）野生型ＴＣＤ ＢＭ細胞を注入された。 Ａ；移植後連続的な時点でのＢＬＩイメージ。 Ｂ；継時的なＢＬＩの光子放出定量分析。ＴＣＤ ＢＭグループのレシピエントは２８日目までに死亡した。 Ｃ；移植後３日目以降及び５日目以降の、in vivoでのマウスのイメージング及びex vivoでの腸管（中間部位）、肝臓（左上部位）、脾臓（右下部位）及び肺（右上部位）のイメージング。 Ｄ；致死的な放射線を浴びたＢＡＬＢ／ｃレシピエントマウスは、ＣＦＳＥ標識された０．５×１０^６の類遺伝子性Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２^ｂ、Ｔｈｙ１．１）の選別されたナイーブ又はメモリー表現型ＣＤ８^＋Ｔ細胞のいずれかと共に、２×１０^６のＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２^ｂ、Ｔｈｙ１．２）ＴＣＤ ＢＭ細胞を注入された。３日目以降、脾臓中のナイーブ及びメモリー表現型細胞のＴｈｙ１．１^＋からのＣＦＳＥの染色強度が分析された。影付きのプロファイルは移植前の染色を示し、オープンになっているプロファイルは染色後を示す。

【図7】全Ｔ細胞又はメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞を注入された、進行性の腫瘍増殖のあるレシピエントの生存率、体重変化、キメリズム及び血液由来のＢＣＬ_１細胞を示す図である。 Ａ；実験スキームとして致死的な放射線を浴びたＢＡＬＢ／ｃレシピエントマウスは照射６時間後に１００のＢＣＬ_１細胞を注入された。翌日（０日目）２×１０^６のＣ５７ＢＬ／６のＴＣＤ ＢＭ細胞が与えられた（Ｎ＝１０）。骨髄移植後１６日目にいくつかのマウスは０．５×１０^６の選別されたメモリー表現型ＣＤ８^＋Ｔ細胞の静脈内注射を受けた（Ｎ＝８）。 Ｂ；注入を受けたレシピエントと受けていないレシピエントの生存率。 Ｃ；ＡとＤに示されている、ＴＣＤ ＢＭを与えられ、注入をされた、又はされなかったホストマウスの開始時体重のパーセンテージ。 Ｄ；上のパネルは、２×１０^６のＴＣＤ ＢＭ髄細胞を移植され、注入を受けた（右のパネル）又は注入を受けなかった（左のパネル）レシピエントの末梢血液中の、移植後２８日目のＣＤ１９対ＢＣＬ_１-イディオタイプマーカーの代表的な二色フローサイトメトリー分析を示す。箱はＢＣＬ_１イディオタイプ陽性ＣＤ１９^＋細胞を封入している。下のパネルは、２８日目における末梢血液のゲートされたＴＣＲβ^＋細胞中のドナー（Ｈ−２Ｋ^ｂ＋）細胞対ＴＣＲβ^＋細胞が染色された代表的なフローサイトメトリー分析を示す。 Ｅ；注入を受けたマウス、受けなかったマウスにおけるリンパ腫増殖のＢＬＩの代表的な例。全身照射の後、１００ＢＣＬ_１−ルシフェラーゼ＋形質転換リンパ腫細胞がＢＡＬＢ／ｃホストに注入され、翌日２×１０^６ＴＣＤ ＢＭが注入された（０日目）。骨髄移植から１６日後、実験用マウスは０．５×１０^６メモリー表現型ＣＤ８^＋Ｔ細胞を与えられた。コントロールは注入を受けなかった。イメージングは骨髄移植後１６日目及び３０日目に行われた。５匹からなるグループそれぞれからの、２匹の代表的なマウスが示されている。 Ｆ；注入を受けた、又は受けなかった骨髄移植レシピエントの血液における、ＴＣＲβ^＋及びＭａｃ１／Ｇｒ１^＋細胞中のドナータイプ細胞のパーセンテージ。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本発明の理解を容易にするため、いくつかの用語が以下に定義される。
存在する有効な薬剤と方法が述べられる前に、このような方法、装置及び処方は当然変化する可能性があり、本発明は記載された特定の方法論、製品、装置及び要素に限定されないという事が理解されるべきである。また、本明細書で用いられる用語は特定の態様を説明するために用いられているにすぎず、本発明の範囲を限定するものではないという事も理解されるべきである。発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。

【0013】

本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いられている単数形"a,"（１つ）、"and,"（及び）及び"the"（その）は、文中に明確にそうでないことを述べていない限り、複数の指示対象を含む事に留意しなければならない。例えば、"a drug candidate"（ある薬剤候補）は、一つ又はこのような候補の混合物を指し、"the method"（この方法）は、当業者に知られる同等の工程及び方法を指す、などである。

【0014】

他に定義されていない限り、本明細書で用いられる全ての技術及び科学用語は、本発明の属する分野の当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。刊行物に記載され、ここで述べる発明に関連して用いられる可能性のある装置、処方及び方法論を記述及び開示する目的のために本明細書で述べられた全ての刊行物は、参照することにより本明細書に組み込まれる。

【0015】

値の範囲が示されている箇所において、その範囲の間に存在する各々の値は、範囲の上限と下限の間、他に述べられた範囲とその述べられた範囲の間の値もまた、他に明確な記載がない限り下限の１０分の１の単位まで、本発明の範囲に含まれる。これらのより小さい範囲での上限と下限が独立してより小さい範囲に含まれることがあり、これらも本発明の範囲に含まれるが、述べられた範囲で特に除かれる限度がある場合がある。述べられた範囲が一方もしくは両方の限界を含む場合、これら含まれる限界のいずれも除いた範囲もまた、本発明に含まれる。

【0016】

後述の説明において、本発明の十分な理解のために多くの特定の詳細が記載される。しかし、本発明が一つ又はそれ以上のこれら特定の詳細なしに実施できることは当業者にとって明らかとなるだろう。他の例では、当業者に良く知られる特徴及び手順については、本発明が不明瞭になるのを避けるために記載していない。

【0017】

通常、本発明ではタンパク質合成、組換え細胞培養とタンパク質単離、組換えＤＮＡ技術について当該技術分野における従来の方法が用いられる。このような技術は文献に十分な説明がある。例えば以下を参照のこと。Maniatis, Fritsch & Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); Sambrook, Russell and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2001); Harlow, Lane and Harlow, Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol No. I, Cold Spring Harbor Laboratory (1998); 及び Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; (1988)。

【0018】

本明細書において"purified"（精製された）又は"to purify"（精製する）という用語は、サンプルから夾雑物を除くことを指す。例えば、潜在的にホストと反応する可能性があるエフェクター（非メモリー）Ｔ細胞は、細胞表面の表現型に基づいて除去される。望ましくない細胞を除くことでサンプル中の望ましい細胞のパーセンテージが上昇する。

【0019】

本明細書において"treat, "（治療する）、"treatment,"（治療）、"treating,"（治療）等の用語は、望ましい薬理学的及び／又は生理学的効果を得る事を指す。この効果は、完全に又は部分的に疾患又はその疾患の症状を防ぐという観点から予防的であり得、及び／又は、部分的又は完全に疾患とそれに起因する悪影響を治癒するという観点から治療的であり得る。本明細書において"Treatment,"（治療）という用語は、哺乳類、特にヒトにおける疾患の治療を包含し、以下のものを含んでいる。（ａ）ある疾患が起こりやすくなっているがまだ起きていると診断されていない対象に、疾患が起きるのを防ぐこと。（ｂ）疾患の抑制、すなわち進行抑止、及び（ｃ）疾患の緩和。例えば病気の退行や、完全に又は部分的に疾患の症状を除くこと。

【0020】

がんが緩和された、終結した、遅れた、又は防がれた場合に、がんは抑制されたという。本明細書において、がんの再発又は転移が減少、減速、遅延した、又は防がれた場合もまた、がんは抑制されたという。同様に、がんが緩和された、終結した、遅れた、又は防がれた場合、がんを患う人がその治療に対して“応答性である”という。本明細書において、がんの再発又は転移が減少、減速、遅延した、又は防がれた場合もまた、がんを患う人がその治療に対して“応答性である”という。

【0021】

メモリーＴ細胞
当該分野において、表現型的に明確に異なる多くのメモリーＴ細胞が説明され表現型的に特性づけられてきた。本発明の方法において関心の対象となるのはＣＤ８^＋細胞であり、これはセントラルメモリー細胞とエフェクターメモリー細胞との一方又は両方、通常両方を含む。セントラルメモリーＴ細胞はＬ−セレクチン及びＣＣＲ７陽性でありＩＬ−２を分泌するがＩＦＮγ又はＩＬ−４を分泌しない。エフェクターメモリーＴ細胞はＬ−セレクチン及びＣＣＲ７の発現が欠けているが、ＩＦＮγとＩＬ−４を含むエフェクターサイトカインを産生することが報告されている。

【0022】

このような細胞はドナーの末梢血単核球から単離することができ、典型的にＣＤ８の発現のために選ばれる。これらの細胞は１又はそれ以上の、マウスのＣＤ４４陽性として任意に選ばれるＣＤ５６陰性、ＣＤ５７陰性などであり、ヒトのＣＤ４５マーカー発現によりさらに細分化され得る。例えばＣＤ４５ＲＯ^＋ＣＤ４５ＲＡ⁻である。例として以下を参照のこと。Cui et al. (2010) Immunol Rev. 236:151-66; Lefrancois et al. (2010) Immunol Rev. 235(1):206-18; Zanetti et al. (2010) Adv Exp Med Biol. 684:108-25; Suzuki et al. (2008) Hum Immunol. 69(11):751-4; Tough (2003) Trends Immunol. 24(8):404-7。これらは参照することにより明確に組み込まれる。

【0023】

メモリーＴ細胞はヒト末梢血液、骨髄、リンパ節、臍帯、in vitroの細胞培養など、適した源から得られる。このようなサンプルは、分析に先立って遠心分離、水簸、密度勾配遠心分離法、アフェレーシス（成分除去）、親和性選択、パニング法、ＦＡＣＳ、Hypaque（ハイパック）を加えた遠心分離などで分離することができ、通常単核の画分（ＰＢＭＣ）が用いられる。サンプルが得られると、そのサンプルは直接使用するか、凍結又は短期間適切な培養液中で保持することもできる。細胞を保持するのに種々の培養液を用いることが出来る。サンプルは任意の都合の良い手順で得ることが出来る。例えば採血、アフェレーシス（成分除去）、静脈穿刺、バイオプシーなどである。細胞サンプルを分散又は懸濁するのに適切な溶液が用いられる。このような溶液は一般的には平衡塩類溶液、例えば生理食塩水、ＰＢＳ、ハンクス平衡塩類溶液などである。これらは都合に応じて低濃度（通常５−２５ｍＭ）を許容できる緩衝液とともに、ウシ胎仔血清又はその他の天然起源の要素を補充される。便利な緩衝液にはＨＥＰＥＳ、リン酸緩衝液、乳酸緩衝液などがある。

【0024】

望ましいメモリーＴ細胞ポピュレーションの濃縮のための細胞の染色と選別には従来の方法が用いられる。精密な選別を提供する技術としては、蛍光活性化セルソーター、磁気選別、アフィニティーカラムなどがある。

【0025】

親和剤は前述した細胞表面の分子に対する特定の受容体又はリガンドであり得る。特に関心の対象となるのは抗体の親和剤としての使用である。好都合なことに、分離の際これらの抗体は標識と結合している。特性の細胞型を分離しやすくするための標識には、直接分離が出来る磁性ビーズ、アビジン又は担体に結合したストレプトアビジンで除くことが出来るビオチン、蛍光活性化セルソーターに用いることの出来る蛍光色素、などがある。 使用できる蛍光色素としてはフィコビリンタンパク質があり、例えばフィコエリトリン、アロフィコシアニン、フルオレセイン、テキサスレッドなどである。各マーカーを独立してソートするために、しばしば各抗体は異なる蛍光色素で標識される。

【0026】

抗体は細胞の懸濁液に加えられ、細胞表面の有効な抗原に結合するのに十分な時間インキュベートされる。インキュベーションは通常少なくとも約５分で通常約３０分未満である。抗体の不足により分離の効率が制限されないよう、反応液中に十分な抗体濃度があることが望ましい。適切な濃度は滴定により決定される。細胞を分離する培養液は細胞の生存を維持出来るものであればどの培養液でも良い。好ましい培養液は０．１から０．５％のＢＳＡを含むリン酸緩衝食塩水である。多様な培養液が市販されており、細胞の性質に従って使用することが出来る。このような培養液にはダルベッコ変法イーグル培地（ｄＭＥＭ）、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）、ダルベッコリン酸緩衝食塩水（ｄＰＢＳ）、ＲＰＭＩ、イスコフ培地、５ｍＭ ＥＤＴＡ-ＰＢＳなどがあり、しばしばウシ胎仔血清、ＢＳＡ、ＨＳＡなどが補充される。

【0027】

前述の通り、細胞は表面のマーカーの発現のために選別される。通常、患者に提供される細胞は少なくとも約５０％の選別された表現型であり、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも９５％又はそれより多くの望ましい表現型である。

【0028】

細胞は、レシピエントの造血系からドナーの細胞遺伝子型への実質的に完全なキメリズムに有効な量投与される。更に、腫瘍細胞が存在する場合、用量はこれら腫瘍細胞を抑制する又は殺すのに十分であり得る。例として、ヒトの成人への細胞用量は少なくとも約１０^６の細胞、少なくとも約１０^７の細胞、少なくとも約１０^８の細胞、又はそれ以上である。小児科の患者には、用量は適切に減らされる。例えば、少なくとも５×１０^５、少なくとも１０^６、少なくとも１０^７、又はそれ以上である。

【0029】

細胞は同種造血細胞移植（ＨＣＴ）の後適切な時期、例えば、腫瘍の再発を防ぐために約２か月から約６か月、又は腫瘍の再発時に再発を治療するために患者に投与される。このような移植はがん又はその他の造血系の再構成が必要な状態の治療に利用することが出来る。例えば、貧血、地中海貧血症、自己免疫状態の治療などである。

【0030】

本発明の一つの態様において、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の主な合併症を引き起こすことなく腫瘍細胞を殺すことができる、精製されたドナーのリンパ球サブセットを加える同種造血細胞移植の後に、がん（白血病、リンパ腫が含まれるがこれらに限定されない）の治療を増強するための組成と方法が開示される。

【0031】

関連する態様において、同種造血細胞移植（ＨＣＴ）の後、混合造血細胞キメリズムから完全ドナー細胞キメリズムへの変換を増強する方法と組成が開示される。このような移植はがん又はその他の造血系の再構成が必要な状態の治療に利用できる。例えば、貧血、地中海貧血症、自己免疫状態の治療などである。混合キメリズムは、同種ＨＣＴの後、完全ドナーキメリズムを果たした患者と比べてずっと高いがんの進行又は再発の割合と関連がある。ドナーリンパ球輸注（ＤＬＩ）は慣習的に移植後の時点で行われるが、ＤＬＩは通常末梢血単核球でできており、末梢血単核球は血液中のすべてのＴ細胞サブセットを含んでいるので、重篤なＧＶＨＤを引き起こす主要な危険因子となる。

【0032】

いくつかの態様において、本発明はがんを治療する方法を提供する。当該方法は、化学療法剤又は放射線剤による患者の治療、続くレシピエントの造血系の切断、幹細胞を含む同種造血細胞移植の実施、そして移植の後、上述したドナー由来のメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞ポピュレーションの患者への注入、を含む。本発明の方法で治療されるがんの例として、リンパ腫、白血病、そして結腸直腸がん、肺がん、乳がん、膵臓がん、肝臓がん、前立腺がん、卵巣がんなどの固形腫瘍があるがこれらに限定されるものではない。腫瘍細胞は原発又は転移腫瘍である。

【0033】

マウスでの研究で、Ｔ細胞除去骨髄移植片がＢ細胞リンパ腫とともに、全身照射の前処理をされたレシピエントに与えられた。レシピエントは混合キメラとなり、腫瘍は進行的に増殖した。レシピエントは２−３週間後に、フローサイトメトリーにより精製された全Ｔ細胞又はメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞（ＣＤ８＋ＣＤ４４^ｈｉ）のいずれかからなるＤＬＩを与えられた。全Ｔ細胞ＤＬＩは致死的なＧＶＨＤを引き起こしたが、メモリーＣＤ８^＋ＤＬＩはＧＶＨＤを起こさずに腫瘍を根絶した。ＣＤ８^＋Ｔ細胞はまた、完全なドナーキメリズムを促進した。マウスのメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞は増殖とＩＦＮ−γ分泌、少量のＩＬ−２分泌により試験管内でアロ抗原に応答した。同様に、ヒトメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞（ＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＯ^＋）は増殖とＩＦＮ−γ分泌、少量のＩＬ−２分泌により試験管内でアロ抗原に応答した。

【0034】

刺激されていないドナーから単離されたばかりの、組み合わされたＣＤ８^＋セントラル及びエフェクターメモリー（ＣＤ８^＋ＣＤ４４^ｈｉ）Ｔ細胞、又はドナーのＣＤ８^＋Ｔ細胞をホストの樹状細胞と共に培養した後に発生させたエフェクターメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞は、以前のＭＨＣマッチしたマウスの研究においてＧＶＨＤを引き起こさなかった。

【0035】

骨髄移植は悪性疾患の治療において確立されている。血液悪性腫瘍に対して、またいくつかの固形腫瘍に対しても、造血幹細胞を支えながら高用量の化学療法が広く用いられている。最近の血液前駆細胞収集の進歩、特に、顆粒球結腸刺激因子で動員され白血球除去により集められた多くの血液幹細胞が使える事を考慮すると、ＨＬＡがマッチしない患者の組織適合性バリアを乗り越える事が可能である。他の最近の進歩として血液前駆細胞動員と前駆細胞及び免疫細胞の生体外拡張の新しい方法、臍帯血を幹細胞の代替源として使うこと、その他の分子技術があり、造血細胞、免疫細胞の同種移植を通したがんの効果的な治療を支えている。

【0036】

臨床効果
本発明の方法によるがんの治療中及びその後の腫瘍増殖と疾患の進行が監視された。臨床効果はこの分野に既知の任意の方法で測定出来る。いくつかの態様において、対象となる治療方法の臨床効果は臨床的有効率（ＣＢＲ）で決定される。

【0037】

臨床的有効率は、完全寛解（ＣＲ）の患者、部分寛解（ＰＲ）の患者数、治療後少なくとも６月の時点で安定状態（ＳＤ）の患者数、のパーセンテージの合計で求められる。この式を簡略的に表すとＣＢＲ＝ＣＲ＋ＰＲ＋ＳＤ月である。いくつかの態様において、対象となる治療法のＣＢＲは少なくとも約５０％である。他のいくつかの態様において、対象となる治療法のＣＢＲは少なくとも約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又はそれ以上である。

【0038】

本発明において、前臨床のデータは、同種造血細胞移植に続くドナー由来のメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞を注入する治療による腫瘍死滅の増加と移植片対宿主病の減少を示す。

【0039】

同種ＨＣＴの重要な限界は移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の発生である。ＧＶＨＤはこの治療を受けたヒトの約３０−５０％に重症型で起きる。ＧＶＨＤは本発明の方法を用いてメモリーＴ細胞の注入を行うことで実質的に減少する。

【0040】

本明細書において、"subject"（対象）という用語はヒトの他、他のほ乳類も含む。本明細書において"treating"（治療）という用語は治療上及び／又は予防的な利点を得る事を含む。治療上の利点とはがんの根絶と寛解を意味する。また、動物対象においてその動物が未だがんを患っているにもかかわらず好転が見られたように、治療上の利点は一つ又はそれ以上の、がんに伴う生理学的な症状の根絶と寛解でも得られる。

【0041】

本発明の方法で治療できるがんとしては以下のものが含まれるがこれらに限定されない。白血病、リンパ腫、副腎皮質がん、肛門がん、再生不良性貧血、胆管がん、膀胱がん、骨がん、骨転移、脳腫瘍、中枢神経系（ＣＮＳ）がん、末梢神経系（ＰＮＳ）がん、乳がん、子宮頸がん、小児非ホジキンリンパ腫、結腸及び直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍（例えばユーイング肉腫）、眼がん、胆嚢がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、有毛細胞白血病、ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、腎臓がん、喉頭及び咽頭がん、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、小児白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、肝臓がん、肺がん、肺カルチノイド腫瘍、男性乳がん、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患、鼻腔及び鼻傍がん、上咽頭がん、神経芽細胞腫、口腔及び口腔咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、陰茎がん、脳下垂体腫瘍、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫、黒色腫皮膚がん、非黒色腫皮膚がん、胃がん、精巣がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮がん（例えば子宮肉腫）、移行上皮がん、膣がん、外陰がん、中皮腫、扁平細胞及び類表皮がん、気管支腺腫、絨毛がん、頭部及び頸部がん、奇形腫、ワルデンストローム・マクログロブリン血症。

【0042】

いくつかの態様において、本発明の方法は更に、抗腫瘍薬又はその薬剤的に許容できる塩若しくはプロドラッグをそれが必要な対象に投与することを含む。いくつかの態様において、抗腫瘍薬は抗腫瘍アルキル化剤、抗腫瘍代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、植物由来抗腫瘍剤、抗腫瘍有機白金化合物、抗腫瘍カンプトテシン誘導体、抗腫瘍チロシンキナーゼ阻害剤、モノクローナル抗体、インターフェロン、生物学的応答調節物質、及び抗腫瘍活性を持つ他の薬剤とそれらの薬剤的に許容できる塩が含まれるがこれらに限定されない。

【0043】

（実施例１）
ＣＤ８^＋ＣＤ４４^ｈｉメモリーＴ細胞はＧＶＨＤなく有力な移植抗リンパ腫活性を媒介するがＣＤ４^＋ＣＤ４４^ｈｉメモリーＴ細胞は媒介しない。

【0044】

刺激されていないドナーから単離されたばかりの、ナイーブ、ＣＤ４^＋、ＣＤ８^＋，又は全Ｔ細胞、及び／又はメモリーＣＤ４^＋ＣＤ４４^ｈｉ、ＣＤ８^＋ＣＤ４４^ｈｉ及び全Ｔ ＣＤ４４^ｈｉ細胞について、ＧＶＨＤを引き起こす能力、完全キメリズム促進能力、ＭＨＣミスマッチのモデルにおける自然発生のＢ細胞リンパ腫（ＢＣＬ_１）に対する抗腫瘍活性を媒介する能力が比較された。セントラル及びエフェクターメモリー細胞の両方を有するＣＤ８^＋ＣＤ４４^ｈｉメモリーＴ細胞サブセットだけが、ＧＶＨＤを引き起こすことなくリンパ腫細胞を根絶する能力を有していた。対照的に、ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋ナイーブＴ細胞、メモリーＣＤ４４^ｈｉＣＤ４^＋Ｔ細胞、ナイーブ全Ｔ細胞及びメモリー全Ｔ ＣＤ４４^ｈｉ細胞はいずれも、致死的なＧＶＨＤを引き起こすか、有力な抗腫瘍活性を持たなかった。腫瘍を有するＣＤ８^＋ＣＤ４４^ｈｉＴ細胞のレシピエントは、ＣＤ８^＋ナイーブＴ細胞を与えられたレシピエントに対して有意な生存優位性を示した。これはＣＤ８^＋ナイーブＴ細胞を与えられたレシピエントが後者の細胞により致死的なＧＶＨＤが引き起こされたことによる。ＣＤ８^＋ＣＤ４４^ｈｉＴ細胞は骨髄移植後の進行性リンパ腫増殖の治療モデルにも用いられ、完全キメリズムを促進しＧＶＨＤなしに腫瘍を根絶することができた。

【0045】

材料と方法
動物
８から１２週齢の野生型Ｔｈｙ１．２ Ｃ５７ＢＬ／６ （Ｈ−２^ｂ）雄マウスと８から１２週齢のＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２^ｂ）Ｔｈｙ１．２雄マウスはスタンフォード大学Department of Comparative Medicineのbreeding facility又はジャクソン研究室（Bar Harbor, ME, USA)から購入された。ルシフェラーゼ発現（ｌｕｃ^＋）形質転換Ｂ６−Ｌ２Ｇ８５(Ｈ−２^ｂ、Ｔｈｙ１．１)マウスは以前報告がある通り用いられた。全てのマウスは特定の病原菌無しの施設に収容された。試験用の全ての動物の世話は原則通りで国立衛生研究所のガイドラインに従った。

【0046】

抗体とフローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）
結合されていない抗ＣＤ１６／３２（２．４Ｇ２）、抗ＣＤ８ＰＥ（５３−６．７）、抗ＴＣＲβ ＡＰＣ （Ｈ５７−５９７）、抗ＣＤ６２Ｌ ＦＩＴＣ （Ｍｅｌ−１４）、抗ＣＤ４４ ＰＥ （ＩＭ７）、抗ＬＰＡＭ−１ ＰＥ (α_４β_７インテグリン複合体) （ＤＡＴＫ３２）、抗Ｈ−２Ｋ^ｂ ＦＩＴＣ （ＡＦ６−８８．５）、抗ＣＤ１９ ＡＰＣ （１Ｄ３）、抗Ｂ２２０ パシフィックブルー（ＲＡ３６Ｂ２） モノクローナル抗体 （ｍＡｂｓ）はＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（San Diego, CA)から購入された。抗ＣＤ８ Ａｌｅｘａ ７００ （５３−６．７） 及び 抗Ｔｈｙ１．１ パシフィックブルー （ＯＸ−７）はＢｉｏｌｅｇｅｎｄ （San Diego, CA)から得られた。抗ＣＣＲ９ ＰＥ （２４２５０３） 及び 抗ＣＸＣＲ３ ＰＥ （２２０８０３） はＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ（Minneapolis, MN)から購入された。抗イディオタイプＢＣＬ_１抗体はハイブリドーマ分泌ラットＩｇＧ２ａから精製された。抗体はＦＡＣＳ染色のためAlexa- Fluor-488に結合された。染色とフローサイトメトリー分析については以前に詳細な記述がある。

【0047】

細胞の準備
脾臓の単細胞懸濁液のＣＤ４^＋、ＣＤ８^＋又はＴＣＲβ⁺全Ｔ細胞は、抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８磁気マイクロビーズで、ＭｉｄｉＭＡＣＳ（登録商標）システム（Miltenyi Biotech, Auburn, CA)により濃縮された。細胞は抗ＣＤ８ ＰＥ、抗ＣＤ４、抗ＣＤ６２Ｌ ＦＩＴＣ及び抗ＣＤ４４ ＡＰＣで染色された後、Ａｒｉａフローサイトメーター（Becton-Dickinson, Mountain View, CA)によりＣＤ６２Ｌ^ｈｉＣＤ４４^ｌｏナイーブ又は全 ＣＤ４４^ｈｉ（メモリー)ポピュレーションに選別された。選別されたナイーブ及びメモリー細胞を再分析して評価したところ純度≧９８％であった。Ｔ細胞除去骨髄 （ＴＣＤ ＢＭ） 細胞の準備は以前に報告がある。移植されたマウスの末梢血液中のBCL₁腫瘍細胞とドナーキメリズムを監視するため、赤血球は溶解され濃縮された白血球がＦＡＣＳ染色に用いられた。

【0048】

混合白血球反応、サイトカインアッセイ、細胞毒性試験
既に記述したように、混合白血球反応（ＭＬＲ）において、Ｃ５７ＢＬ／６ドナーマウスから選別されたナイーブ又はメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞サブセットは応答細胞として用いられ、刺激細胞である照射（３０００ｃＧｙ）された同種ＢＡＬＢ／ｃ脾細胞と混合された。^３Ｈチミジンの取り込みは５日後に測定され、上清におけるサイトカインの分泌は６０時間後に微粒子ビーズを用いたマルチプレックスアッセイシステムにより分析された。選別されたナイーブ又はメモリー表現型ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、１：２の割合で、放射線照射された（３０００ｒａｄｓ）ＢＡＬＢ／ｃ脾細胞により９６時間刺激された。培養された細胞はエフェクター細胞として用いられ、ルシフェラーゼ発現ＢＣＬ_１ｌｕｃ／ｇｆｐリンパ腫ターゲット細胞と混合された。細胞溶解は前述の通り生物発光画像法により評価された。

【0049】

ＧＶＨＤモデル、ＧＶＨＤ重症度の病理組織学的スコアリング、ＢＣＬ_１腫瘍モデル
前述の通り急性ＧＶＨＤが引き起こされた。手短に述べると、ＢＡＬＢ／ｃホストは２００ＫｖのＸ線源から８００ｃＧｙの全身照射を受け、２４時間以内に尾の静脈からドナー細胞を注入された。Kaplanらにより表された病理組織学的スコアリングシステムを用いて、肝臓、小腸、及び結腸の組織学的評価が盲検的に行われた。ＢＣＬ_１はＩｇＭγ表面Ｉｇ表現型を持つＢＡＬＢ／ｃマウス由来の自然発生したＢ細胞白血病／リンパ腫である。前述の通り、この細胞株はＢＡＬＢ／ｃにおける連続継代により維持された。ＢＣＬ_１腫瘍細胞とｌｕｃ−ｇｆｐ遺伝子コンストラクトの使用に関しては以前に報告がある。

【0050】

生体内と生体外の生物発光画像法
生体内の生物発光画像法はEdingerらに従って行われた。簡潔に述べると、マウスは腹腔内にルシフェリン（１０μｇ／ｇ体重）を注入された。１０分後、マウスはＩＶＩＳ１００電荷結合素子イメージングシステム（Xenogen, Alameda, CA)で５分間イメージングされた。画像データは分析されLiving Image Software (Xenogen)で定量化された。生体外の生物発光画像法はBeilhackらにより表された方法に従って行われた。

【0051】

生体内のＦＳＥ増殖試験
細胞の増殖分析のために、Ｔｈｙ１．１ Ｃ５７ＢＬ/６ドナー由来の選別されたナイーブ又はメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞は、前述の通りVybrant CDDA SE (カルボキシフルオレセインジアセテート, スクシニミジルエステル)トレーサーキット(Invitrogen, Carlsbad, CA)にロードされた。Ｔｈｙ１．１ ＣＦＳＥ標識されたナイーブ及びメモリー細胞（０．５×１０^６）と２×１０^６ＴＣＤ ＢＭ細胞(Ｃ５７ＢＬ／６, Ｔｈｙ１．２)は致死的な放射線を浴びたＢＡＬＢ／ｃマウスに注入された。ＢＭＴ後３日目に、注入された脾臓由来のThy1.1細胞のＣＦＳＥ染色はＦＡＣＳで分析され、Flowjoソフトウェアを用いて細胞分裂の数が比較された。

【0052】

統計分析
Prism (GraphPad Software, San Diego, CA)を用いてKaplan-Meierの生存率曲線が作られた。動物の生存率の統計的な違いはログランク検定により解析された。^３Ｈチミジン取り込み平均の違いと反復した試験管内アッセイのサイトカイン産生は両側student t 検定を用いて解析された。ＧＶＨＤスコアの比較にマン・ホイットニーＵ検定が用いられた。全ての検定において、ｐ£０．０５が有意と判断された。

【0053】

結果
ドナーＴサブセットのＧＶＨＤと抗リンパ腫活性
我々は、単離されたばかりのドナーＴ細胞で、重症のＧＶＨＤを引き起こすことなく移植抗リンパ腫活性を持つものを探した。最初に、致死的な放射線を浴びＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２^ｂ）ホストは、一定数（０．５×１０^６）の全Ｔ細胞（ナイーブとメモリー未分離）又はＣＤ４＋Ｔ細胞（ナイーブとメモリー未分離）とともに、２×１０^６のＣ５７ＢＬ/６（Ｈ−２^ｂ）ドナーＴＣＤ ＢＭ細胞を移植された。ＴＣＤ ＢＭのみを移植されたホストは１００日を超えて生存しそれらの体重は移植前のレベルに戻った（図１Ａ）。ＴＣＤ ＢＭに加えられたＣＤ８^＋と全Ｔ細胞は移植後１週間以内に急性ＧＶＨＤを誘発し、下痢、進行性の体重減少、移植後３週間までの全てのレシピエントの死を引き起こした（図１）。ＴＣＤ ＢＭのみを移植されたレシピエントと比較して体重と生存率は有意に減少した(それぞれ、ｐ≦０．０００１、ｐ＜０．００１)（図１Ａ及びＢ）。

【0054】

我々の研究を含む以前のいくつかの研究において、ＣＤ４４^ｈｉメモリーＣＤ４^＋Ｔ細胞は致死的なＧＶＨＤを引き起こさないことが示されている。我々はＣ５７ＢＬ／６ＣＤ４４^ｈｉメモリーＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＴＣＤ ＢＭ及びBCL₁リンパ腫細胞を与えられたＢＡＬＢ／ｃ移植レシピエントの生存率と血液中の腫瘍細胞の出現を測定した。他のグループはメモリーＣＤ４^＋Ｔ細胞でなく、同用量のナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞、ナイーブ全Ｔ細胞、メモリー全Ｔ細胞を与えられた(図１Ｃ−Ｆ)。ＴＣＤ ＢＭのみを与えられたすべての動物は死亡し、２８日後までに血液中にリンパ腫細胞が発生した（図１Ｄ）。ＧＶＨＤの兆候はなかった。ＴＣＤ ＢＭと共にナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞又はナイーブ全Ｔ細胞を与えられた動物は致死的なＧＶＨＤと重症の下痢及び移植後１０日以内の体重減少に屈した（図１Ｃ及びＥ）。メモリーＣＤ４^＋Ｔ細胞とＴＣＤ ＢＭのレシピエントにＧＶＨＤの兆候はなかったが、リンパ腫の増殖を制御することはできず全てが末梢血液中のＢＣＬ₁イディオタイプ陽性細胞の移植後３０日以内に死亡した（図１Ｄ）。興味深いことに、メモリー全細胞を与えられたホストの４０％が死亡時血液中にリンパ腫細胞を有していた（図１Ｆ）。残り６０％のホストは血液中にリンパ腫を発生させておらず、ＧＶＨＤの臨床的な兆候なく１００日を超えて生存した（図１Ｅ）。

【0055】

未免疫のドナー由来のＣＤ８^＋ナイーブ及びメモリーＴ細胞はアロ反応性
続いて我々は、分離されたナイーブ及びメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞の試験管内でのアロ反応性とＧＶＨＤ及びＧＶＴに対する反応性を調べた。最初に、我々はゲートされた、未処置のＣ５７ＢＬ／６マウス由来のナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞及びメモリーＣＤ４４^ｈｉＣＤ８^＋Ｔ細胞についてＣＣＲ９、α_４β_７、ＣＸＣＲ３及びＣＤ１２２の発現を分析した。ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞はＣＣＲ９に対して強い染色を示し、α_４β_７に対して鈍い染色を示した一方で、メモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞はネガティブ染色を示した（図２Ａ）。メモリー表現型細胞はナイーブ細胞より高いレベルのＣＸＣＲ３とＣＤ１２２を示し（図２Ａ）、前述の通りこれらがメモリーマーカーであることが確認された。

【0056】

細胞サブセットのアロ反応性を評価するため、選別されたナイーブ又はメモリーＣ５７ＢＬ／６ ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、同種刺激細胞としての放射線照射されたＢＡＬＢ／ｃ脾臓細胞と共にインキュベートされた。一定数の選別された応答細胞（１×１０^５）が一定数の刺激細胞（４×１０^５）と共にインキュベートされた。増殖は培養５日後に測定され、上清中のＩＬ−２及びＩＦＮ−γサイトカイン分泌は培養６０時間後に測定された。この培養システムを用いた我々の以前の研究では、ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞はアロ反応性であるが、メモリーＣＤ４^＋Ｔ細胞はアロ反応性でないと判断されている。メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖及びサイトカイン分泌はバックグラウンドと同程度であったためである。ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞はメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞の７倍の^３Ｈチミジンを取り込んだ（ｐ＝０．０００４）（図２Ｂ）。両方のサブセットは、同系刺激細胞と比較して、有意に同種刺激細胞を持つ^３Ｈチミジンを多く取り込んだ。図２Ｃは、選別されたＣＤ８^＋Ｔ細胞が分泌したＩＬ−２の平均濃度は同種刺激細胞と培養された後１５０−２００ｐｇ／ｍｌであったこと、同種と同系の培養は有意に異なることを示している（ｐ＜０．０１）。対照的に、選別されたメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞により分泌されたＩＬ−２の平均濃度は同種及び同系培養のどちらにおいても、５０ｐｇ／ｍｌよりも低かった（ｐ＝０．０２、アロのためのメモリー対ナイーブ）（図２Ｃ)。図２Ｃは、選別されたメモリー細胞ＣＤ８^＋Ｔ細胞との同種培養組織はＩＦＮ−γ(平均約１０００ｐｇ／ｍｌ)を分泌し、これはナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞との同種培養組織と比較して(ｐ＝０．０４)又は同系培養と比較して（ｐ＜０．００５）有意に増加したことを示している。全ての培養液上清のＩＬ−４、ＩＬ−１０、及びＴＮＦαも分析されたが、マルチプレックスサイトカインアッセイで検出されなかった。

【0057】

細胞が媒介するメモリー及びナイーブ表現型ＣＤ８^＋Ｔ細胞の細胞毒性を調べるため、我々はルシフェラーゼ遺伝子コンストラクトで形質導入されたＢＣＬ_１リンパ腫ターゲット細胞を用いた。ナイーブ及びメモリーＣＤ８^＋Ｔは、放射線照射されたＢＡＬＢ／ｃ刺激細胞との同種培養で９６時間活性化された。これらの活性化された細胞は、エフェクター細胞として、ＢＣＬ_１ターゲット細胞に対して異なる割合で用いられた。ルシフェラーゼの酵素活性をＢＣＬ_１細胞の生存の物差しとして用いた。ＢＣＬ_１細胞の細胞溶解のパーセンテージは、試験された全ての割合の細胞においてナイーブ及びメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞に類似していた（図２Ｄ）。よって両方のサブセットは類似の腫瘍細胞死滅能力を示した。

【0058】

メモリーＴ細胞ではないＣＤ８^＋ナイーブＴ細胞による致死的なＧＶＨＤの引き起こし
更なる実験において、放射線照射されたＢＡＬＢ／ｃホストは１．０×１０^６又は０．５×１０^６のナイーブ又はメモリーＣ５７ＢＬ／６ドナーＣＤ８^＋Ｔ細胞及び／又は１２×１０^６のＴＣＤ ＢＭ細胞を与えられた。図３Ａ及び３Ｃは、ＴＣＤ ＢＭ細胞のみを与えられた、全ての放射線照射されたレシピエントは、１００日生存したことを示す。照射後一週間に一時的な体重減少はあったものの、三週間目にベースラインに戻りその後安定した（図３Ｂ）。これらのマウスは、下痢、背中の湾曲、ひだ状の毛、脱毛、顔の肥大など、ＧＶＨＤの典型的な臨床的特徴を示さなかった。対照的に、１×１０^６のナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞を与えられたホストの約５０％に４０日目前後で下痢が発生し、移植後６０−１００日の死亡まで進行的な体重減少が見られた（図３Ａ及び３Ｂ）。対照的に、メモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞グループの全てのレシピエントは生存した（図３Ａ）。ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞とメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞の間で、生存率（ｐ＜０．０５）及び体重減少（ｐ＜０．０１）に有意な違いが見られた。ホストが０．５×１０^６よりも低い用量のナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞を与えられた場合、約４０％はＧＶＨＤの臨床的特徴に屈した（図３Ｃ）。０．５×１０^６の全ＣＤ８^＋Ｔ細胞を与えられたレシピエントの生存率は同じ用量のナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞を与えられたレシピエントの生存率と類似していた。全ＣＤ８^＋Ｔ細胞とナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞は、メモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞と比較して有意に生存率を下げた（ｐ＝０．０４）（図３Ｃ）。検死解剖によりＧＶＨＤの病理組織学的な証拠が示された（図なし）。この用量のメモリー表現型ＣＤ８^＋Ｔ細胞の全てのレシピエントは１００日を超えて生存し、ＴＣＤ ＢＭのグループと類似した体重減少を示した（図３Ｄ）。ナイーブグループとメモリーグループの間の違いは有意であった（ｐ＜０．０５）（図３Ｄ）。

【0059】

ＣＤ８^＋メモリーＴ細胞は最小限のＧＶＨＤで抗リンパ腫活性を媒介
我々は致死的な放射線を浴びたＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるドナー細胞の抗腫瘍活性を評価した。ＢＡＬＢ／ｃマウスは５００のＢＣＬ_１リンパ腫細胞（非形質導入）を与えられた後に、２×１０^６のＴＣＤ ＢＭを、０．５×１０^６の全ＣＤ８^＋Ｔ細胞、選別されたナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞、又は選別されたメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞有り又は無しで与えられた。ＴＣＤ ＢＭのみを与えられたマウスの殆どは移植後３０日までに死亡した（図４Ａ）。これは血液中のＢＣＬ_１−イディオタイプ陽性腫瘍細胞の存在と関係している（図５Ａ）。ＴＣＤ ＢＭのみを与えられたホストと比較して、全ＣＤ８^＋Ｔ細胞（ｐ＜０．０００１）、ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞（ｐ＜０．０００１）、又はメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞（ｐ＜０．０００１）のグループにおけるホストの生存率は有意に向上した（図４Ａ）。全ＣＤ８^＋Ｔ細胞及びナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞のグループにおいて、約２５％のホストが６０日後までに死亡し、このグループの全てのホストは血液中に検出できる腫瘍細胞を有していなかった（図４Ａ及び図５Ａ）。メモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞を与えられた全てのマウスは血液中に腫瘍細胞なく１００日を超えて生存した（図４Ａ及び５Ａ）。全ＣＤ８^＋Ｔ細胞又はナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞を与えられたグループの生存率は、メモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞を与えられたグループと比較して有意に減少した（それぞれｐ＝０．０３、ｐ＝０．０４）体重減少にも有意に差があった（ｐ＝０．０３、ｐ＝０．００４）。ＢＣＬ_１腫瘍細胞を与えられた未治療のマウスは全て５０日後までに死亡した。

【0060】

図４Ｃは骨髄移植されたレシピエントの結腸及び肝臓の代表的な組織切片を示している。メモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞有り又は無しでＴＣＤ ＢＭを与えられたレシピエントの結腸が最小のリンパ球浸潤で陰窩及び杯細胞の保存を示しているのに対して、ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞又は全ＣＤ８^＋Ｔ細胞を与えられたレシピエントは陰窩の脱落と杯細胞の損失、かなりの浸潤が見られた。ＴＣＤ ＢＭを与えられたレシピエントの肝臓では血管を囲んで腫瘍細胞が見られた。一方ナイーブ又は全ＣＤ８^＋Ｔ細胞のレシピエントでは門脈周囲のリンパ球浸潤が見られた。メモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞のレシピエントにはどちらの異常も見られなかった。図４Ｄは肝臓、結腸、及び小腸におけるＧＶＨＤ病変の病理組織学的なスコアを示している。メモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞有り又は無しでＴＣＤ ＢＭを与えられたレシピエントの間には有意な差がなかったが（ｐ＞０．０５）、ＴＣＤ ＢＭとナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞又は全ＣＤ８^＋Ｔ細胞を与えられたグループはＴＣＤ ＢＭのみ与えられたグループに対して有意に高いスコアとなった（ｐ＝０．０２−０．００８）。メモリーグループに対するナイーブグループの肝臓中のＧＶＨＤスコアは有意に高かった（ｐ＝０．０４）

【0061】

我々は２８日後におけるレシピエントの３つのグループの末梢血液中のＴ細胞におけるドナー細胞のキメリズムを評価した（図５Ｂ）。ＴＣＲβ^＋Ｔ細胞中でのドナータイプ（Ｈ−２Ｋ^ｂ＋）細胞の代表的な染色に見られる通り、ＴＣＤ ＢＭを移植された全てのホストは混合キメラであった（図５Ｂ）。０．５×１０^６のナイーブ又はメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞を与えられた全てのレシピエントはドナータイプの細胞が９９％を超えており、１００日後まで安定したドナーキメリズムを維持した（データは示されていない）。よって、ナイーブ又はメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞を加えることで混合キメリズムが完全キメリズムに変化したと言える。混合キメラにおいては血液中に腫瘍が発生したが、完全キメラでは発生しなかった（図５Ａ）。

【0062】

我々は、ＴＣＤ ＢＭ及びＢＣＬ_１細胞とともにより低い用量のナイーブ又はメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞を与えられたホストの生存率を測定した。０．５×１０^６又は０．１×１０^６のナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞を与えられたホストの約７０％は１００日を超えて生存し（図５Ｃ）、血液中にＢＣＬ_１リンパ腫はなかった（データは示されていない）。細胞の用量が０．０５×１０^６のとき、ホストの約３０％が腫瘍細胞なしに１００日を超えて生存し、７０％が血液中に腫瘍細胞を有して死亡した。０．５×１０^６又は０．１×１０^６のメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞を与えられたホストは１００％が血液中にリンパ腫の証拠なく１００日を超えて生存することができたが、用量が０．０５×１０^６に減ると８０％がリンパ腫で死亡した（図５Ｄ）。０．１×１０^６のメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞を与えられたグループの生存率は、図１Ｅに示される０．５×１０^６の全メモリーＴ細胞を与えられたグループと比較して有意に向上した（ｐ＜０．０５）。

【0063】

メモリーＴ細胞ではないＣＤ８^＋ナイーブＴ細胞によるＧＶＨＤのターゲットの器官への急速な蓄積
ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞とメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞間の、ＧＶＨＤにおける重症度の違いの原因を確かめるために、我々はリンパ組織とＧＶＨＤのターゲット器官においてこれらの細胞の蓄積範囲と速度に違いがあるかを調べた。ナイーブ及びメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞の輸送と生存は０．５×１０^６のナイーブ又はメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞をＣ５７ＢＬ／６ −Ｌ２Ｇ８５ ｌｕｃ^＋マウスから、野生型Ｃ５７ＢＬ／６ドナーからの２×１０^６のＴＣＤ ＢＭと一緒に、放射線照射され、５００のＢＣＬ_１腫瘍を与えられたＢＡＬＢ／ｃレシピエントに細胞移植することにより評価された。ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞は３日後までに脾臓と頸部リンパ節に帰巣し、５日後までには消化管と皮膚に強いシグナルが観察された（図６Ａ）メモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞を与えられたマウスの器官においてシグナルはずっと弱かった（図６Ａ）。ＴＣＤ ＢＭのコントロールはシグナルが見られず、既に示されたように、これらのマウスは２８日後までにリンパ腫で死亡した。ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞由来のシグナルは、８４日間の観察期間ずっと消化管領域にとどまり続けた。一方メモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞由来のシグナルはこの期間、より弱かった。ＢＬＩによる光子放出の定量化により以下のことが示された。ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞のシグナルは７日後まで急速に増加し、その後減少して７０日後までにバックグラウンドに近づいた（図６Ｂ）。６０日後まで、シグナル強度はメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞よりも高くあり続けた（ｐ＝０．００２）（図５Ｂ）。我々はシグナルの器官分布を分析するため、ＢＭＴ後３日目及び５日目に、準備されたばかりの肝臓、脾臓及び消化管のような臓器で生体外のＢＬＩイメージングを行った。生体外のイメージにより、ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞は３日以降までに、脾臓、腸間膜リンパ節及びパイエル板を含む二次リンパ組織に帰巣し、５日以降までに消化管に浸透するということが分かった（図６Ｃ）。メモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞は類似のパターンを示したが、メモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞のレシピエントの小腸及び大腸からのシグナルはナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞よりもずっと弱く遅いものであった（図６Ｃ、５日後）。

【0064】

脾臓におけるＣＤ８^＋ナイーブ対メモリーＴ細胞の細胞分裂の増強
ＢＬＩ試験の観察から、我々はナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞とメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞の、ＢＭＴ後の増殖の違いを調べることにした。移植後のこれら二つの細胞ポピュレーションの増殖を評価するため、我々は０．５×１０^６のＣＦＳＥ標識された、Ｃ５７ＢＬ／６−Ｌ２Ｇ８５ ｌｕｃ^＋ Ｔｈｙ１．１マウス由来の選別されたナイーブ又はメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞を野生型Ｃ５７ＢＬ/６ Ｔｈｙ１．２ ＴＣＤ ＢＭと共に、放射線照射されたＢＡＬＢ／ｃマウスに注入した。我々は、ＣＦＳＥの染色の強度変化により、ＢＭＴ後３日以降のホスト脾臓におけるナイーブ及びメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞の細胞分裂の速度を分析した（図６Ｄ）。代表的な増殖アッセイは、Flowjo softwareを用いた増殖分析での判定により、ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞の約１０％とその約５倍のメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞が２又はそれより少ない細胞分裂を起こしたことを示した。これらの結果は、アロ抗原刺激後メモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞はナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞に対して^３Ｈチミジンの取り込みが７倍少なかったというＭＬＲデータと一致する（図２Ｂ）。

【0065】

ＣＤ８^＋メモリーＴ細胞はＢＭＴ後の進行性リンパ腫に対して有効な治療
我々は１６日後に注入されたメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞が、０日目にドナーＴＣＤ ＢＭ細胞の移植とともに注入されたＢＣＬ_１腫瘍細胞を根絶できるかどうかを調べた（図７Ａ）。予備実験でその時期にｌｕｃ^＋の腫瘍細胞が既に移植レシピエントのリンパ組織に拡がっていたため、注入に１６日後が選ばれた（図７Ｅ）が、血液中ではまだ検出されなかった。続く実験において、ホストは血液中の非形質導入ＢＣＬ_１腫瘍とＧＶＨＤの兆候を連続的に監視された。注入されなかった全てのホストは３５日後までに血液中に腫瘍を有して死亡した（図７Ｂ及びＤ）。０．５×１０^６のメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞を注入された全てのホストは１００日を超えて生存し（ｐ＜０．００１）、腫瘍細胞は血液中に現れなかった（図７Ｂ及びＤ）。注入を受けたグループの生存したマウスは１００日後の終わりに最初の体重の少なくとも９０％まで体重が増加し、ＧＶＨＤの臨床的兆候は見られなかった（図７Ｃ）。ＣＤ８^＋メモリーＴ細胞でなく、等しい数の全Ｔ細胞を含む注入がなされた場合、全てのホストはＧＶＨＤの兆候を見せて４０日後までに死亡した。ＣＤ８^＋メモリーＴ細胞グループよりも体重は有意に減少した（ｐ＝０．００４）(図7Ｂ及びＣ)。メモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞を与えられたグループは全てのホストの９９％より多くのドナーＴ細胞キメリズムを示した。一方注入治療を受けなかったコントロールグループは混合ドナーＴ細胞キメリズムを示した（図７Ｄ）。図７Ｆは、注入治療を受けたレシピエントの５／５がＴ細胞系統及び顆粒球／マクロファージ系統において完全キメラであった一方、注入のなかったグループはこれらの系統において全て混合キメラであったことを示している。Ｂ細胞の収率は低すぎてＢ２２０^＋細胞の正確な測定は出来なかった。全Ｔ細胞を注入されたグループは致死的なＧＶＨＤを発症し９９％より多くのＴ細胞キメリズムであった。また血液中にＢＣＬ_１腫瘍細胞は現れなかった。

【0066】

ＢＣＬ_１−ｌｕｃ^＋細胞を与えられたレシピエントの追加グループにおいて、ＢＬＩによりＢＣＬ_１リンパ腫の進行も評価された。図７Ｅは、メモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞注入治療有り又は無しでＴＣＤ ＢＭ移植した後の、ホストにおけるルシフェラーゼ発現ＢＣＬ_１細胞のリンパ腫の成長を示している。注入のなかったホストにおいて１６日後に、容易に検出することが出来るリンパ腫の蓄積が見られ、３０日後に腫瘍は強度を増加し他の組織へ拡がりながら成長した。対照的に、メモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞を注入されたマウスは３０日後において検出できるＢＬＩの兆候はなかった。

【0067】

以前のマウス研究において、メモリーＴ細胞はナイーブＴ細胞よりも引き起こすＧＶＨＤが重篤でないということが示されている。それに基づいて、我々はドナーの全Ｔ細胞、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、及び、生成されたナイーブと致死的ＧＶＨＤの誘導のためのメモリーサブセットに分離されていないＣＤ８^＋Ｔ細胞を比較した。我々はまた、ハプロタイプミスマッチ移植に最も関連がある、同じＭＨＣミスマッチ移植モデル（Ｃ５７ＢＬ／６→ＢＡＬＢ／ｃ）において、抗ＢＣＬ_１リンパ腫活性を知るためにサブセットをアッセイした。全Ｔ細胞、ナイーブ全Ｔ細胞、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、及びＣＤ８^＋Ｔ細胞はＴＣＤ ＢＭのみと比較して有意な致死的ＧＶＨＤの増加を引き起こした。５分の１の量のメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞がメモリー全Ｔ細胞よりも高いパーセンテージのレシピエントで完全な腫瘍の寛解を引き起こしたので、メモリー全Ｔ細胞は強い抗腫瘍活性を持たないと言える。その結果、メモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞が本研究の焦点となった。

【0068】

Ｃ５７ＢＬ／６→ＢＡＬＢ／ｃ系の組み合わせにおいて、ＣＤ４^＋全Ｔ細胞及びナイーブＴ細胞はＣＤ８^＋全Ｔ細胞及びＣＤ８^＋ナイーブＴ細胞よりも大幅に重症のＧＶＨＤを引き起こす。０．５×１０^６ＣＤ４＋全Ｔ細胞が３０日後までに一様に致死的なＧＶＨＤを引き起こした一方、同じ数のＣＤ８^＋全Ｔ細胞は７５日後までにレシピエントの約４０％の死亡を引き起こした。我々はＣＤ４^＋全Ｔ細胞及びナイーブＴ細胞の移植片抗腫瘍活性について調べなかった。ＧＶＨＤによる死が、血液中の腫瘍細胞の発現とそれに続く腫瘍による死よりも相当に急速であったからである。

【0069】

メモリーＣＤ４^＋Ｔ細胞は試験管内においても生体内においてもアロ反応性を持たなかったが、メモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞は本研究において、増殖及びサイトカイン分泌から判断すると、同種刺激細胞に応答した。しかし、メモリー細胞の増殖とＩＬ−２分泌はナイーブ細胞と比較して有意に減少した（約７倍）。しかしＩＦＮ−γ分泌は有意に増加した。両方のサブセットは、最初のアロ抗原の刺激後、同種ターゲット細胞を有効に殺すことを示した。我々の以前の研究においてメモリーＣＤ４^＋Ｔ細胞がアロ反応性でなかったのに対して、何故メモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞がアロ反応性なのかは明らかでない。未処置のマウス由来のメモリーＣＤ４４^ｈｉＣＤ８^＋Ｔ細胞の大多数はセントラルメモリーＴ細胞であった。一方メモリーＣＤ４^＋ＣＤ４４^ｈｉＴ細胞の大多数はエフェクターメモリーＴ細胞であった。

【0070】

ＣＤ８^＋ＣＤ４４^ｈｉメモリーＴ細胞は放射線照射されたホストにおいて致死的ＧＶＨＤを引き起こさなかった。一方、同じ数の１×１０^６又は０．５×１０^６ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞又は全ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、腫瘍細胞なしのレシピエントの約４０から５０％に致死的なＧＶＨＤを引き起こした。ＴＣＤ ＢＭとＢＣＬ_１腫瘍細胞を与えられたコントロールレシピエントは、全て進行性の腫瘍増殖により死亡した。後者のレシピエントが０．５×１０^６のナイーブ又は全ＣＤ８^＋Ｔ細胞を与えられたとき、腫瘍増殖による死亡はなかった。しかしながら、約２５％がＧＶＨＤにより死亡し、ナイーブ細胞又は全ＣＤ８^＋Ｔ細胞を与えられたこれらのレシピエントの肝臓、結腸、及び小腸におけるＧＶＨＤの病理組織的スコアはＴＣＤ ＢＭ細胞のみを与えられたレシピエントと比較して有意に増加した。対照的に、メモリーＣＤ８^＋ＣＤ４４^ｈｉＴ細胞を与えられたレシピエントで１００日の観察期間に死亡した個体はなく、ＧＶＨＤスコアはＴＣＤ ＢＭのみを与えられたレシピエントと有意な違いがなかった。ナイーブ細胞を与えられたホストにおける肝臓のＧＶＨＤスコアはＣＤ８^＋細胞と比較して有意に高かった。後者の結果はＣＤ８^＋ＣＤ４４^ｈｉ細胞がＧＶＨＤを起こさないとする以前の報告と一致するが、最近の研究による報告とは異なる。その最近の研究では、精製されたセントラルメモリーＣＤ６２Ｌ^ｈｉＣＤ４４^ｈｉＣＤ８^＋Ｔ細胞を致死的な放射線を浴びたＭＨＣミスマッチの骨髄移植レシピエントに注入したところ、セントラルメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞はＴＣＤ ＢＭのコントロールよりも有意に高いＧＶＨＤを引き起こした。この説明として、セントラル及びエフェクターメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞の組み合わせが今回のＣＤ８^＋ＣＤ４４^ｈｉ研究で用いられ、エフェクターメモリー細胞の添加がメモリー細胞のＧＶＨＤ作用を弱めたということが考えられる。これまでエフェクターメモリーＴ細胞は、アロ抗原への曝露の後でさえ、ＧＶＨＤを引き起こす程度が小さい、又は引き起こさないと報告されてきており、このサブセットによるＧＶＨＤの制御については研究されていなかった。最近の研究で、メモリー表現型を発現するＣＤ８^＋ＣＤ１２２^ｈｉ細胞に有効な制御活性があることが示されている。

【0071】

ナイーブ及びメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞の両方は、メモリー細胞によるＧＶＨＤがないにも関わらず、完全キメリズムの達成を促進する能力及び腫瘍を根絶する能力を有した。生物発光画像法とＣＦＳＥ染色により判断したところでは、リンパ系組織、肝臓、腸におけるナイーブ細胞のより素早い蓄積と拡散が、メモリー細胞と比較してナイーブ細胞のＧＶＨＤ効力が強いことに関連していた。ナイーブＴ細胞のＩＬ−２分泌の増加が初期の増殖増大に寄与している可能性があり、ＣＣＲ９の発現増加とα_４β_７インテグリン腸ホーミング受容体がナイーブＴ細胞の初期の腸への輸送増加に寄与している可能性がある。

【0072】

メモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞の腫瘍細胞を根絶する能力はアロ反応性に依存しているようである。ＢＡＬＢ／ｃアロ抗原に対して耐性化したＣ５７ＢＬ／６ＣＤ８^＋Ｔ細胞はＢＣＬ_１リンパ腫に対する移植片抗腫瘍活性を失ったからである。メモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞のアロ反応性は、臓器移植におけるアロ抗原に対する免疫反応を強めることが示されている環境下におけるウイルス抗原との交差反応性により説明できる。加えて、恒常的増殖の後、ナイーブＴ細胞ＴＣＲレパートリーを維持しながら、ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞はメモリー表現型細胞に見せかけることが出来る。

【0073】

本研究は０日目にＴＣＤ ＢＭ細胞と腫瘍細胞を与えられたレシピエントにおける移植後の注入治療としてＣＤ８^＋ＣＤ４４^ｈｉメモリーＴ細胞及び分離されていない全Ｔ細胞についても調べた。注入は生体発光画像法においてリンパ系組織の腫瘍の拡大が現れた時点である１６日目に行われた。分離されていない全Ｔ細胞が注入に用いられた場合、全てのレシピエントにおいて急性の致死的ＧＶＨＤが見られた。対照的に、精製されたＣＤ８^＋メモリーＴ細胞は１００％のレシピエントを生存させ、生存したレシピエントは少なくとも１００日間腫瘍なく残った。注入なしにＴＣＤ骨髄を与えられたコントロールは全て腫瘍増殖に屈した。結論として、セントラル及びエフェクター両方のメモリーサブセットを含むＣＤ８^＋メモリーＴ細胞は、ＴＣＤ ＢＭ移植に加えられた場合、ＧＶＨＤと抗リンパ腫活性を分けることが出来た。

【0074】

政府の権利
本発明は、国立衛生研究所により授与された助成金番号ＣＡ４９６０５及び白血病とリンパ腫協会により授与された助成金番号６０３８−０９のもとで、政府の支援を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】