特許 6097907 イソフタル酸輸送タンパク質を保有する微生物及びその利用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6097907

(24)【登録日】2017年3月3日

(45)【発行日】2017年3月22日

(54)【発明の名称】イソフタル酸輸送タンパク質を保有する微生物及びその利用

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/21 20060101AFI20170313BHJP

   C12N 1/20 20060101ALI20170313BHJP

   C12P 7/42 20060101ALI20170313BHJP

   C12N 1/00 20060101ALI20170313BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20170313BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/21ZNA

   C12N1/20 D

   C12N1/20 F

   C12P7/42

   C12N1/00 R

   !C12N15/00 A

【請求項の数】8

【全頁数】19

(21)【出願番号】特願2012-198853(P2012-198853)

(22)【出願日】2012年9月10日

(65)【公開番号】特開2014-50373(P2014-50373A)

(43)【公開日】2014年3月20日

【審査請求日】2015年9月10日

【微生物の受託番号】NPMD  NITE P-1400

【微生物の受託番号】NPMD  NITE BP-1209

(73)【特許権者】

【識別番号】505232346

【氏名又は名称】学校法人星薬科大学

(74)【代理人】

【識別番号】100100549

【弁理士】

【氏名又は名称】川口 嘉之

(74)【代理人】

【識別番号】100126505

【弁理士】

【氏名又は名称】佐貫 伸一

(72)【発明者】

【氏名】岩崎 卓己

(72)【発明者】

【氏名】西 達也

(72)【発明者】

【氏名】武田 尚

【審査官】 森井 文緒

(56)【参考文献】

【文献】 特開平０２−２３４６８２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１０−２０７０９４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Database GenBank [online], Accessin No. EHK83601, <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/359734629?sat=37&satkey=84682038> 08-Dec-2011 uploaded, Kriszt, B., et al., Definition: transport protein [Rhodococcus pyridinivorans AK37]

【文献】 Database GenBank [online], Accessin No. EID80520, <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/383841232?sat=37&satkey=98799843> 10-Apr-2012 uploaded, Virkram, S., et al., Definition: transport protein [Rhodococcus imtechensis RKJ300 = JCM 13270]

【文献】 Appl. Environ. Microbiol. (2010) vol.76, no.2, p.519-527

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＰｕｂＭｅｄ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）に示すＤＮＡを保有する微生物。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加された配列を含み、かつイソフタル酸の該細胞内への取り込み機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｄ）配列番号１に示される塩基配列の全部の配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソフタル酸の該細胞内への取り込み機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。

【請求項2】

前記ＤＮＡで形質転換され、非改変株と比較してイソフタル酸の細胞内への取り込み機能が高められた、請求項１に記載の微生物。

【請求項3】

前記微生物がエシェリヒア・コリである、請求項２に記載の微生物。

【請求項4】

請求項１〜３のいずれかに記載の微生物を用いて、細胞内に取り込まれたイソフタル酸をイソフタル酸代謝物に転換し、これを採取することを特徴とする、イソフタル酸代謝物の製造方法。

【請求項5】

前記微生物がさらにイソフタル酸３，４−ジオキシゲナーゼのオキシゲナーゼ・コンポーネントおよびレダクターゼ・コンポーネントならびにイソフタル酸３，４−シス−ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼを保有する微生物であり、前記イソフタル酸代謝物がプロトカテク酸である、請求項４に記載のイソフタル酸代謝物の製造法。

【請求項6】

請求項１〜３のいずれかに記載の微生物を用いることを特徴とする、イソフタル酸を微生物の細胞内に取り込ませる方法。

【請求項7】

請求項１〜３のいずれかに記載の微生物または該培養物の処理物を、イソフタル酸が成分として含まれる水性媒体に添加することを特徴とする、水性媒体中のイソフタル酸を減少させる方法。

【請求項8】

前記イソフタル酸は、ポリエステル繊維またはポリエステル樹脂の分解によって得られる、請求項７に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、イソフタル酸輸送タンパク質を保有することによりイソフタル酸の細胞内への取り込みが向上した微生物を用いてイソフタル酸を原料として他の化学品を効率よく製造する方法、および該微生物を用いてポリエステル繊維やポリエステル樹脂の分解物中などに含まれるイソフタル酸の含量を減少させる方法に関する。

【背景技術】

【0002】

微生物を用いてイソフタル酸を原料としてプロトカテク酸や３−ヒドロキシ安息香酸などの有用化学品を製造できる合成ルートは知られているが〔特許文献１、特許文献２〕、生産性も不十分なために工業生産には至っていない。また微生物を用いて５−スルホイソフタル酸ナトリウムを原料としてポリマー素材などとして有用な５−ヒドロキシイソフタル酸を製造する方法も報告されているが〔特許文献３〕、原料が高価であり、また生産性も優れていないので、工業生産には至っていない。一方、環境志向の高まりから、廃棄ポリエステル樹脂のリサイクル事業が注目を集めているが、ペットボトルなどのポリエステル樹脂にはイソフタル酸が含まれていることが多く、廃棄ポリエステル樹脂の分解によって生成したテレフタル酸含有標品から純粋なテレフタル酸を安価なコストで分離することは容易でない。

【0003】

微生物によるイソフタル酸の取り込みについては、コマモナス（Comamonas）属細菌 E6株において、トリパルテイト・トリカルボン酸・トランスポーター（Tripartate Tricarboxylate Transporter、以下、ＴＴＴと略記する）ファミリーに属するタンパク質が関与
していることが報告されているが、確実な証明はなされていない〔非特許文献１〕。このＴＴＴファミリーに属する輸送タンパク質の場合、微生物を用いて細胞内でイソフタル酸を取り込ませるには、３種類のタンパク質が必要であることがわかっているが、１種類のタンパク質で効率よくイソフタル酸を取り込める輸送タンパク質の利用が望ましいが、ＴＴＴファミリー以外のイソフタル酸輸送タンパク質を同定したという報告はなされていない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特開平7-236472

【特許文献2】特開平7-184671

【特許文献3】特開2002-78496

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Appl. Environ. Microbiol. 76, 519 (2010)

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明の課題は、微生物を用いてイソフタル酸を原料としてプロトカテク酸などのイソフタル酸代謝物を製造する際、またはポリエステル繊維もしくはポリエステル樹脂の分解物などを含む水性媒体中のイソフタル酸の濃度を減少させる際に、イソフタル酸輸送タンパク質を発現した微生物を用いることによりイソフタル酸の取り込み能を増強させてその効率を上げる方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、東京都千代田区で採
取したコンポストからテレフタル酸を炭素源とする集積培養法により単離したロドコッカス（Rhodococcus）属細菌HAL1831株のゲノム配列を決定することにより、メジャー・ファシリテーター・スーパーファミリー（Major facilitator superfamily）に属する新規タ
ンパク質を同定し、該タンパク質を大腸菌に発現させたところ、該タンパク質がイソフタル酸輸送能を有することを発見した。次に、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）K-12 JM109株にコマモナス・テストステロニ（Comamonas testosteroni）72W2株由来のイ
ソフタル酸３，４−ジオキシゲナーゼのオキシゲナーゼ・コンポーネント・タンパク質およびレダクターゼ・コンポーネント・タンパク質ならびにイソフタル酸３，４−シス−ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼを発現させ、さらに該イソフタル酸輸送タンパク質を発現させると、イソフタル酸の取り込み能が増強され、その結果、プロトカテク酸の生成量が増加することを見出した。また、該イソフタル酸輸送タンパク質を発現する該菌株をテレフタル酸にイソフタル酸が混合した水性媒体中に入れると、該水性媒体中のイソフタル酸の濃度が大きく減少することを見出し、本発明を完成するに至った。

【0008】

すなわち、本発明は以下の[１]〜[８]に関する。
[１] 以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）に示すＤＮＡを保有する微生物。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加された配列を含み、かつイソフタル酸の該細胞内への取り込み機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｄ）配列番号１に示される塩基配列の全部もしくは一部の配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソフタル酸の該細胞内への取り込み機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
[２] 前記ＤＮＡで形質転換され、非改変株と比較してイソフタル酸の細胞内への取り込み機能が高められた、[１]に記載の微生物。
[３] 前記微生物がエシェリヒア・コリである、[２]に記載の微生物。
[４] [１]〜[３]のいずれかに記載の微生物を用いて、細胞内に取り込まれたイソフタル酸をイソフタル酸代謝物に転換し、これを採取することを特徴とする、イソフタル酸代謝物の製造方法。
[５] 前記微生物がさらにイソフタル酸３，４−ジオキシゲナーゼのオキシゲナーゼ・コンポーネントおよびレダクターゼ・コンポーネントならびにイソフタル酸３，４−シス−ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼを保有する微生物であり、前記イソフタル酸代謝物がプロトカテク酸である、[４]に記載のイソフタル酸代謝物の製造法。
[６] [１]〜[３]のいずれかに記載の微生物を用いることを特徴とする、イソフタル酸を微生物の細胞内に取り込ませる方法。
[７] [１]〜[３]のいずれかに記載の微生物または該培養物の処理物を、イソフタル酸が成分として含まれる水性媒体に添加することを特徴とする、水性媒体中のイソフタル酸を減少させる方法。
[８] 前記イソフタル酸は、ポリエステル繊維またはポリエステル樹脂の分解によって得られる、[７]に記載の方法。

【発明の効果】

【0009】

本発明によれば、微生物を用いてイソフタル酸からプロトカテク酸などの有用化学品を生産するときに、該有用化学品の生産効率を高めることができる。また、本発明によれば、本発明の微生物または該培養物の処理物をポリエステル繊維またはポリエステル樹脂の分解物などを含む水性媒体に添加することにより該水性媒体中のイソフタル酸を減少させることができる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】MFS2タンパク質により細胞内に取り込まれたイソフタル酸のプロトカテク酸への変換に関してJM109-mfs2株とJM109-lacZ株との間の差異を示す図。

【図2】イソフタル酸を低濃度で含むテレフタル酸水溶液からのイソフタル酸の選択的減少に関してJM109-mfs2株とJM109-lacZ株との間の差異を示す図。

【発明を実施するための形態】

【0011】

以下に本発明を詳細に説明する。

【0012】

本発明に用いられるイソフタル酸輸送タンパク質とは、例えば、配列番号２で表わされる、ロドコッカス属細菌HAL1831株のアミノ酸配列を有するタンパク質があげられる。ま
た、本発明で用いられるイソフタル酸輸送タンパク質としては、配列番号２のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつイソフタル酸の細胞内への取り込み機能を有するタンパク質をあげることができる。また、該タンパク質として、配列番号２のアミノ酸配列と75％以上の同一性、好ましくは90％以上、特に好ましくは95％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイソフタル酸の細胞内への取り込み機能を有するタンパク質をあげることができる。

【0013】

「イソフタル酸の細胞内への取り込み機能を有する」とは、該タンパク質を発現する微生物のイソフタル酸の取り込みが、該タンパク質を発現していない微生物のイソフタル酸の取り込みと比べて向上していることで確認することができる。例えば、微生物を、イソフタル酸を含む水性媒体中に存在させ、一定時間経過した後、水性媒体中のイソフタル酸濃度の減少を見ることで取り込み機能を確認することができる。

【0014】

上記のイソフタル酸輸送タンパク質において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつイソフタル酸の細胞内への取り込み機能を有するタンパク質は、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold
Spring Harbor Laboratory Press (1989)（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)（
以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Nucleic Acids Res., 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6409 (1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Res., 13, 4431 (1985)、Proc.Natl. Acad. Sci., USA, 82, 488 (1985)等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質において特定の位置に欠失、置換もしくは付加が導入されるように、それぞれコードする配列番号１に表わされるＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより取得することができる。欠失、置換または付加される１または数個というアミノ酸の数は、イソフタル酸の細胞内輸送能が維持される限り特に限定されないが、１〜２０個が好ましく、１〜１０個がより好ましく、１〜５個が特に好ましい。

【0015】

本発明で用いられるイソフタル酸輸送タンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号１で表わされる塩基配列を有するＤＮＡがあげられる。

【0016】

本発明のＤＮＡには、コードするタンパク質がイソフタル酸の細胞内取り込み機能を失わない範囲内で置換変異、欠失変異、挿入変異などの変異が導入されたＤＮＡ、例えば、配列番号１に表わされるＤＮＡの全部もしくは一部をプローブとして、ハイブリダイゼーション法によってストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡも包含する。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、具体的には、ＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、0.7 〜1.0 M のNaClの存在下で65℃でハイブリダイゼーションを行った後、0.1 倍濃度から２倍濃度（特に好ましくは0.1倍）までの間の濃度のＳＳＣ
溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、150 mM NaCl 、15 mM クエン酸ナトリウムである）の中、65℃でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡを意味する。なお、ハ
イブリダイゼーションの実験法は、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル(Molecular Cloning, A laboratory manual)、第２版〔サンブルック(Sambrook)、フリッチ(Fritsch) 、マニアチス(Maniatis)編集、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press) 、1989年刊〕に記載されている。

【0017】

本発明のイソフタル酸輸送タンパク質をコードするＤＮＡを保有する微生物は、たとえば、テレフタル酸やイソフタル酸を炭素源とする集積培養法を用いて取得した微生物の中から、前記（１）に記載したＤＮＡを有する微生物を選択することによって得られる。具体的には、東京都千代田区で採取したコンポストからテレフタル酸を唯一炭素源とする集積培養法により単離したロドコッカス属細菌HAL1831株があげられる。ロドコッカス属細
菌HAL1831株は、2012年８月７日に独立行政法人製品評価技術基盤機構 NITE特許微生物
寄託センター（〒292-0818 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）に受託番号NITE P-1400として寄託されており、分譲を受けることができる。

【0018】

上記性質を有する微生物は、前記（１）に記載したＤＮＡのうち１つ以上のＤＮＡを組換え技術を用いて宿主細胞に導入した形質転換体であってもよい。すなわち、上記性質を有する微生物から、イソフタル酸の細胞内取り込み機能を有するタンパク質をコードする該ＤＮＡをモレキュラー・クローニング第２版に記載の方法に従ってクローニングし、ベクターＤＮＡと連結することで組換えＤＮＡを作製し、該組換えＤＮＡを作製し、該組換えＤＮＡを用いて宿主細胞を形質転換することにより取得することができる。これにより、親株などの非改変株と比較してイソフタル酸の細胞内への取り込み機能が高められた微生物を得ることができる。

【0019】

以下に、ＤＮＡのクローニングと形質転換株の作製方法について詳しく述べる。なお、その他の形質転換体も同様の方法により取得することができる。

【0020】

上記のロドコッカス属細菌HAL1831株をロドコッカス属細菌の培養に通常用いられる公
知の方法により培養する。培養後、公知の方法（例えば、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載の方法）により、該微生物の染色体ＤＮＡを単離・精製する。この染色体ＤＮＡから合成ＤＮＡを用いて、ハイブリダイゼイション法またはＰＣＲ法などにより、本発明のイソフタル酸輸送タンパク質をコードするＤＮＡを含む断片を取得することができる。

【0021】

上記ＤＮＡを連結するベクターとしては、エシェリヒア・コリK-12株などにおいて自立複製可能なベクターであればプラスミドベクター、ファージベクター等いずれも使用可能であるが、具体的には、pUC19〔Gene, 33, 103 (1985)〕、pUC18、pBR322、pHelix1（ロ
シュ・ダイアグノスティクス社製）、ZAP Express〔ストラタジーン社製、Strategies, 5, 58 (1992)〕、pBluescript II SK(+)〔ストラタジーン社製、Nucleic Acids Res., 17,
9494 (1989)〕、pUC118（タカラバイオ社製）等を用いることができる。

【0022】

該ベクターに上記で取得したＤＮＡを連結して得られる組換えＤＮＡの宿主に用いるエシェリヒア・コリは、エシェリヒア・コリに属する微生物であればいずれでも用いることができるが、具体的には、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli） XL1-Blue MRF'〔ストラタジーン社製、Strategies, 5, 81 (1992)〕、エシェリヒア・コリC600〔Genetics, 39, 440 (1954)〕、エシェリヒア・コリY1088〔Science, 222,778 (1983)〕、エシェリヒア・コリY1090〔Science, 222, 778 (1983)〕、エシェリヒア・コリNM522〔J. Mol. Biol., 166, 1 (1983)〕、エシェリヒア・コリK802〔J. Mol. Biol., 16, 118 (1966)〕、エ
シェリヒア・コリJM105〔Gene, 38, 275 (1985)〕、エシェリヒア・コリJM109、エシェリヒア・コリBL21等をあげることができる。

【0023】

ロドコッカス属、アシネトバクター（Acinetobacter）属、ブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属、シノリゾビウム（Sinorhizobium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、ノボスフィンゴビウム（Novosphingobium）属またはラルストニア（Ralstonia）属に属する微生物の中に、上記ＤＮＡを導入するときは、これら微生物の中で自立複製可能なベクターを用いる。好ましくは、該微生物のいずれかとエシェリヒア・コリK-12株の両方の微生物の中で自立複製可能なシャトル・ベクターを用いて、組換えＤＮＡを宿主となる該微生物に導入することができる。

【0024】

組換えＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)〕、エレクトロポレーション法〔Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)〕等をあげることができる。

【0025】

上記のようにして得られた形質転換体から組換えＤＮＡを抽出し、該組換えＤＮＡに含まれる本発明のＤＮＡの塩基配列を決定することができる。塩基配列の決定には、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)〕または3730xl型ＤＮＡアナライザー（アプライド・バイオシステムズ社製）
等の塩基配列分析装置を用いることができる。

【0026】

また、上記において決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製8905型ＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することによっても目的とするＤＮＡを調製することもできる。

【0027】

上記のイソフタル酸輸送タンパク質を発現する形質転換体は、下記の方法を用いて上記のＤＮＡを宿主細胞中で発現させることによって得られる。

【0028】

上記タンパク質をコードするＤＮＡを用いる際には、必要に応じて、本発明のタンパク質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製することができる。また、該タンパク質をコードする部分の塩基配列を、宿主での発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、該タンパク質の生産率を向上させることもできる。本発明のＤＮＡを発現する形質転換体は、上記ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えＤＮＡを作製し、該組換えＤＮＡを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより取得することができる。

【0029】

本発明のタンパク質を発現させる宿主としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。好ましくは、エシェリヒア属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ロドコッカス属、コリ
ネバクテリウム（Corynebacterium）属、コマモナス（Comamonas）属、バチルス（Bacillus）属、マイコバクテリウム（Mycobacterium）属、ノボスフィンゴビウム（Novosphigobium）属またはバークホルデリア（Burkholderia）属の細菌をあげることができる。さら
に好ましくは、エシェリヒア・コリをあげることができ、具体的にはエシェリヒア・コリ
K-12株をあげることができる。

【0030】

このような微生物に本発明のタンパク質を発現させることにより造成した組換え微生物を、培地中または水性媒体中に混入させることにより、培地中または水性媒体中のイソフタル酸を細胞内に取り込むことができる。該組換え微生物がイソフタル酸代謝酵素を発現している場合には、細胞内に取り込まれたイソフタル酸代謝物に変換することができる。

【0031】

イソフタル酸代謝物としては、イソフタル酸の代謝により生成する物質であれば特に制限されないが、例えば、プロトカテク酸、３−ヒドロキシ安息香酸、５−ヒドロキシイソフタル酸、イソフタル酸３，４−シス−ジヒドロジオール、没食子酸などが挙げられる。

【0032】

本発明の微生物を用いてイソフタル酸代謝物を生産する際に、本発明の微生物が目的のイソフタル酸代謝物を生成するイソフタル酸代謝酵素をコードするＤＮＡを保有していない場合には、上述の組換えＤＮＡ技術を用いて当該酵素をコードする組換えＤＮＡで本発明の微生物を形質転換することにより、イソフタル酸代謝酵素を発現する本発明の微生物を取得することができる。

【0033】

本発明に用いられるイソフタル酸代謝酵素とは、イソフタル酸を修飾したり、分解したりする酵素であれば、いかなる酵素でも用いることができる。
たとえば、イソフタル酸の３位と４位に酸素原子を添加することによりイソフタル酸３，４−シス−ジヒドロジオールを生成するイソフタル酸３，４−ジオキシゲナーゼが挙げられる。これまで報告されているイソフタル酸３，４−ジオキシゲナーゼはオキシゲナーゼ・コンポーネントとレダクターゼ・コンポーネントの２種類のタンパク質からなることが知られており、これにより、イソフタル酸からイソフタル酸３，４−シス−ジヒドロジオールが生成する。
さらに、イソフタル酸３，４−ジオキシゲナーゼはオキシゲナーゼ・コンポーネントとレダクターゼ・コンポーネントに加えてイソフタル酸３，４−シス−ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼが共存すると、イソフタル酸からイソフタル酸３，４−シス−ジヒドロジオールを経てプロトカテク酸が生成する。
したがって、イソフタル酸代謝酵素とは、１種類のタンパク質である必要はなく、イソフタル酸３，４−ジオキシゲナーゼ・オキシゲナーゼ・コンポーネントおよびレダクターゼ・コンポーネントならびにイソフタル酸３，４−シス−ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼの３種類のタンパク質から構成されるものであってもよい。

【0034】

イソフタル酸３，４−ジオキシゲナーゼ・オキシゲナーゼ・コンポーネント遺伝子としては以下のようなＤＮＡが包含される。
（ｅ）配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするＤＮＡ。
（ｆ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加された配列を含み、かつイソフタル酸３，４−ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ・コンポーネントとともに、イソフタル酸からイソフタル酸３，４−シス−ジヒドロジオールを生成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（ｇ）配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｈ）配列番号３に示される塩基配列の全部もしくは一部の配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソフタル酸３，４−ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ・コンポーネントとともに、イソフタル酸からイソフタル酸３，４−シス−ジヒドロジオールを生成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。

【0035】

また、イソフタル酸３，４−ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ・コンポーネント遺伝子としては以下のようなＤＮＡが包含される。
（ｉ）配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするＤＮＡ。
（ｊ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加された配列を含み、かつイソフタル酸３，４−ジオキシゲナーゼ・オキシゲナーゼ・コンポーネントとともに、イソフタル酸からイソフタル酸３，４−シス−ジヒドロジオールを生成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（ｋ）配列番号５に示される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｌ）配列番号５に示される塩基配列の全部もしくは一部の配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソフタル酸３，４−ジオ
キシゲナーゼ・オキシゲナーゼ・コンポーネントとともに、イソフタル酸からイソフタル酸３，４−シス−ジヒドロジオールを生成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。

【0036】

また、イソフタル酸３，４−シス−ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼ遺伝子としては以下のようなＤＮＡが包含される。
（ｍ）配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするＤＮＡ。
（ｎ）配列番号８に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加された配列を含み、かつイソフタル酸３，４−シス−ジヒドロジオールからプロトカテク酸を生成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（ｏ）配列番号７に示される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｐ）配列番号７に示される塩基配列の全部もしくは一部の配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソフタル酸３，４−シス−ジヒドロジオールからプロトカテク酸を生成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。

【0037】

配列番号３，５および７で表わされる塩基配列を有するＤＮＡは、例えば、コマモナス・テストステロニ（Comamonas testeroni）72W2株の染色体ＤＮＡをもとに合成ＤＮＡ（
プライマー）を用いて、ハイブリダイゼイション法やＰＣＲ法により得ることができる。なお、本菌株は独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（NPMD）（〒292-0818 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）に受託番号NITE BP-1209として国
際寄託されており、分譲を受けることができる。

【0038】

発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込みが可能で、本発明のＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。

【0039】

細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明のＤＮＡを含有してなる組換えＤＮＡは原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列、より構成された組換えＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。

【0040】

本発明のタンパク質、または、該タンパク質と他のタンパク質との融合タンパク質をコードするＤＮＡを大腸菌などの微生物に導入し、発現するためのベクターとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、ColE1由来の複製開始点を有するプラスミド、例
えばpUC系のプラスミドやpBR322系のプラスミドあるいはその誘導体が挙げられる。ここ
で、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。なお、ここでいう改変とは、変異剤やＵＶ照射などによる変異処理、あるいは自然変異などによる改変をも含む。より具体的には、ベクターとしては、例えば、pUC19〔Gene, 33, 103 (1985)〕、pUC18、pBR322、pHelix1（ロ
シュ・ダイアグノスティクス社製）、pKK233-2（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）、pSE280（インビトロジェン社製）、pGEMEX-1（プロメガ社製）、pQE-8（キアゲ
ン社製）、pET-3（ノバジェン社製）pBluescriptII SK(+)、pBluescript II KS(+)（ストラタジーン社製）、pSTV28（タカラバイオ社製）、pUC118（タカラバイオ社製）等を用いることができる。

【0041】

プロモーターとしては、エシェリヒア・コリ等の宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター（Ｐlac）、ＰLプロモーター、ＰRプロモーター等の、T7プロモーターなどの大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、およびtacプロモーター、lacT7プロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等、およびシュードモナス・プチダのTOLプラスミドのXylSタ
ンパク質により制御されるPmプロモーターを用いることができる。

【0042】

リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば5〜18塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
本発明の組換えＤＮＡにおいては、本発明のＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。

【0043】

組換えＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972) 〕、エレクトロポレーション法〔Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)〕、接合伝達法〔J. G. C. Ottow, Ann. Rev. Microbiol., Vol.29, p.80 (1975)〕、細胞融合法〔M.H. Gabor, J. Bacteriol., Vol.137, p.1346 (1979)〕等をあげることができる。

【0044】

組換えＤＮＡ技術などを用いて、上記のイソフタル酸輸送タンパク質の発現量を増強した微生物を作製し、イソフタル酸の取り込み効率を向上させることができる。
また、イソフタル酸輸送タンパク質の発現に加えて、組換えＤＮＡ技術などを用いて、上記のイソフタル酸代謝酵素の発現量を増強した微生物を作製し、イソフタル酸代謝物の生産量を向上させることもできる。
具体的には、上記イソフタル酸輸送タンパク質遺伝子または上記のイソフタル酸代謝酵素遺伝子を発現させるためのプロモーターとして天然のプロモーターよりも転写活性が強いプロモーターを用いる、あるいは該タンパク質をコードする遺伝子の転写を終結するためのターミネーターとして天然のターミネーターよりも転写終結活性が強いターミネーターを用いる、あるいは発現ベクターとして高コピー数ベクターを利用すること、相同組換えで染色体上に組み込むことなどがあげられる。

【0045】

なお、イソフタル酸代謝物としてプロトカテク酸を製造する場合は、イソフタル酸輸送タンパク質、イソフタル酸３，４−ジオキシゲナーゼ・オキシゲナーゼ・コンポーネントおよびレダクターゼ・コンポーネントならびにイソフタル酸３，４−シス−ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼを保有する微生物において、プロトカテク酸５位酸化酵素活性が低下または欠損するような改変、例えば、プロトカテク酸５位酸化酵素をコードする遺伝子の破壊などを施してもよい（特開2010-207094）。

【0046】

以上のようにして得られる本発明のイソフタル酸輸送タンパク質とイソフタル酸代謝酵素を発現する微生物を用いて、好ましくは0.1 mM〜1 Mのイソフタル酸を含有する培地で
培養し、培養物中にイソフタル酸代謝物を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、プロトカテク酸などのイソフタル酸代謝物を製造することができる。また、本発明のイソフタル酸輸送タンパク質を発現するイソフタル酸代謝物生産微生物を培養した後、イソフタル酸を含む水性媒体中に、該微生物の培養物もしくは該培養物の処理物を加えることにより、該媒体中にイソフタル酸代謝物を生成、蓄積させ、該媒体からイソフタル酸代謝物を採取することもできる。

【0047】

イソフタル酸代謝物として３−ヒドロキシ安息香酸を製造する場合は、イソフタル酸代謝酵素としてイソフタル酸３，４−ジオキシゲナーゼ・オキシゲナーゼ・コンポーネントおよびレダクターゼ・コンポーネントを用いることが好ましい。なお、本代謝酵素の反応により生成するイソフタル酸３，４−シス−ジヒドロジオールについては、自発的に脱水反応が起こりやすく、３−ヒドロキシ安息香酸が生成され、加熱により３−ヒドロキシ安息香酸の生成が増大する。
イソフタル酸代謝物として没食子酸を製造する場合は、イソフタル酸代謝酵素として、イソフタル酸３，４−ジオキシゲナーゼ・オキシゲナーゼ・コンポーネントおよびレダク
ターゼ・コンポーネントならびにイソフタル酸３，４−シス−ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼに加えて、プロトカテク酸の５位を酸化する酵素を用いることが好ましい（特開2009-065839および特開2009-213392）。

【0048】

本発明の微生物を培地で培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。

【0049】

本発明の微生物の培養は、炭素源、窒素源、無機塩、各種ビタミン等を含む通常の栄養培地で行うことができ、炭素源としては、例えばブドウ糖、ショ糖、果糖等の糖類、エタノール、メタノール等のアルコール類、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸等の有機酸類、廃糖蜜等が用いられる。窒素源としては、例えばアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等がそれぞれ単独または混合して用いられる。また、無機塩としては、例えばリン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この他にペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンステイープリカー、カザミノ酸、ビオチン等の各種ビタミン等の栄養素を培地に添加することができる。イソフタル酸代謝物を生産するための原料としては、イソフタル酸を添加する。

【0050】

培養は、通常、通気攪拌、振とう等の好気条件下で行う。培養温度は、本発明の微生物が生育し得る温度であれば特に制限はなく、また、培養途中のｐＨについても本発明の微生物が生育し得るｐＨであれば特に制限はない。培養中のｐＨ調整は、酸またはアルカリを添加して行うことができる。

【0051】

該培養物の処理物として、本発明の微生物を担体に固定化したものを用いてもよい。その場合には、培養物から回収されたまま、あるいは適当な緩衝液、例えば0.02〜0.2 M程
度のリン酸緩衝液（pH6〜10）等で洗浄された菌体を使用することができる。菌体の固定
化は、それ自体既知の通常用いられている方法に従い、アクリルアミドモノマー、アルギン酸、またはカラギーナン等の適当な担体に菌体等を固定化させる方法により行うことができる。

【0052】

本発明の微生物を用いてイソフタル酸からイソフタル酸代謝物を製造する際に、水性媒体中の反応原料となるイソフタル酸の濃度は、0.1 mM〜1 M程度が適当である。上記の水
性媒体における酵素反応温度およびｐＨは特に限定されないが、通常10〜60℃、好ましくは15〜50℃が適当であり、反応液中のpHは5〜10、好ましくは6〜9付近とすることができ
る。また、ｐＨの調整は、酸またはアルカリを添加して行うことができる。

【0053】

また、上記水性媒体に、反応時に抗酸化剤または還元剤を添加すると、イソフタル酸代謝物の生成収率が一層向上する場合がある。抗酸化剤／還元剤としては、アスコルビン酸、イソアスコルビン酸、システイン、亜硫酸ナトリウムや亜硫酸水素ナトリウムなどの亜硫酸塩、チオ硫酸ナトリウムなどのチオ硫酸塩が挙げられる。添加濃度は、抗酸化剤／還元剤の種類によって異なるが、イソフタル酸代謝物の生成を阻害しない濃度で加えることが望ましく、通常0.001〜5％（Ｗ/Ｖ）、好ましくは0.005〜1％である。

【0054】

また、上記水性媒体に、反応時に酸化剤を添加すると、イソフタル酸代謝物の生成収率が一層向上する場合がある。酸化剤としては、亜硝酸ナトリウム、亜硝酸カリウム等の硝酸塩、塩化第二鉄等の金属塩、ハロゲン、ペルオクソ酸等が挙げられ、好ましくは、亜硝酸ナトリウム、塩化第二鉄が挙げられる。添加濃度は、酸化剤の種類によって異なるが、イソフタル酸代謝物の生成を阻害しない濃度で加えることが望ましく、通常0.001〜0.05
％（Ｗ/Ｖ）、好ましくは0.005〜0.02％である。

【0055】

培養終了後の培養液または反応液中からのイソフタル酸代謝物は、酢酸エチル等の有機
溶剤によって抽出することにより単離・精製することができる。また、必要に応じて遠心分離等により該培養液から菌体等の不溶成分を除いた後、例えば、活性炭を用いる方法、イオン交換樹脂を用いる方法、結晶化法、沈殿法等の方法を単独でまたは組み合わせることによってイソフタル酸代謝物を採取することができる。

【0056】

また、本発明のイソフタル酸輸送タンパク質を発現する微生物を水性媒体中のイソフタル酸の量を減少させたいときには、本発明の微生物の培養物を該水性溶媒に混入させ、一定時間放置することにより、該水性媒体中のイソフタル酸含量を減少させることができる。

【実施例】

【0057】

以下に本発明の方法を実施例により具体的に述べるが、本発明はこれに限定されるものではない。

【0058】

実施例１．イソフタル酸輸送タンパク質をコードする遺伝子のクローニング
１．イソフタル酸輸送タンパク質候補をコードする遺伝子の同定
ロドコッカス属細菌HAL1831株のゲノムＤＮＡ配列をもとに、翻訳領域予測プログラム
であるGeneLook〔Gene 346, 115 (2005)〕を用いて翻訳領域を予測した。続いて、予測された翻訳領域に対してBLAST相同性解析を用いて既存のタンパク質のアミノ酸配列との相
同性解析を行った。その結果、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するメジャー・ファシリテーター・スーパーファミリーに属する輸送タンパク質（MFS2タンパク質と命名）をコードするＤＮＡ（配列番号１）をイソフタル酸輸送タンパク質候補として同定した。なお、ロドコッカス属細菌HAL1831株のMFS2タンパク質をコードする遺伝子をmfs2遺伝子
と名付ける。

【0059】

２．mfs2遺伝子の大腸菌内での発現
（１）遺伝子クローニング用のＰＣＲプライマーの設計と合成
上記で同定したMFS2タンパク質をコードするmfs2遺伝子のＤＮＡ配列情報をもとに、ＰＣＲ法を用いてmfs2遺伝子のＤＮＡをクローニングするためのＰＣＲプライマーを設計し、合成した。ＰＣＲプライマーの塩基配列は配列番号９と１０に示した。なお、プライマーの合成は株式会社グライナー・ジャパンに外注した。

【0060】

（２）ＰＣＲ法によるMFS2タンパク質をコードするＤＮＡの増幅
上記（２）で得た染色体ＤＮＡを鋳型にし、配列番号９と１０に示されるＰＣＲプライマーを用いて、添付の説明書に従ってPrimeSTAR ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオから購入）を用いてmfs2遺伝子を増幅した。

【0061】

（３）低コピー発現プラスミドの構築
低コピー発現ベクターpRTCPmc8は、プラスミドベクターpREP4（インビトロジェン社か
ら製品番号V004-50として入手）をもとに下記の手順で造成した。pREP4を制限酵素HindIIIで切断した後、平滑末端にし、再結合することによりpREP4DHを造成した。さらにpREP4DHを制限酵素XbaIで切断した後、平滑末端にし、再結合することによりpREP4DHXを造成し
た。pREP4DHXを鋳型として、配列番号１１と１２で表わされる１組の合成DNAを用いるＰ
ＣＲ法により、制限酵素SfiI部位を導入したＰＣＲ増幅断片を得た。得られたＰＣＲ増幅断片を制限酵素BamHIで消化し、連結することにより、プラスミドpRTC_SfiIを造成した。続いて、プラスミドベクターpRTC_SfiIのSfiIサイトに配列番号１３に示す配列を有する
合成ＤＮＡ由来の２本鎖ＤＮＡを挿入することにより、低コピー発現ベクターpRTCPmc8を造成した。なお、配列番号１３に示したＤＮＡの配列は、その両末端にpRTC_SfiI由来のSfiIサイトの配列も含んでいる。目的遺伝子の挿入に利用する制限酵素PacI部位と制限酵
素NotI部位は、配列番号１３に示す配列においては、それぞれ塩基番号199と塩基番号217
に存在する。

【0062】

（４）MFS2タンパク質をコードする遺伝子のクローニング
上記（２）で得られたMFS2タンパク質をコードするＤＮＡを精製した。精製した目的ＤＮＡを制限酵素PacIと制限酵素NotIで消化した後、上記（３）で造成した低コピー発現ベクターpRTCPmc8の制限酵素PacI-NotI部位に組み込むことによりプラスミドpRTCPmc8_MFS
を造成した。

【0063】

実施例２．MFS2タンパク質を用いたイソフタル酸の微生物細胞内への取り込み試験
（１）mfs2遺伝子のクローニング用ＰＣＲプライマーの設計と合成
細胞内に取り込まれたイソフタル酸をイソフタル酸３，４−ジオキシゲナーゼのオキシゲナーゼ・コンポーネント・タンパク質およびレダクターゼ・コンポーネント・タンパク質ならびにイソフタル酸３，４−シス−ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼ・タンパク質によりプロトカテク酸に転換することにより、MFS2タンパク質によるイソフタル酸の細胞内への取り込みとイソフタル酸代謝物の生産を下記のようにして調べた。

【0064】

コマモナス属細菌E6株とコマモナス・テストステロニYZW-D株は、これらタンパク質を
コードする遺伝子（以下、イソフタル酸代謝遺伝子群という）を保有していることから、両菌株のゲノムＤＮＡ配列を、ナショナル・センター・フォア・バイオテクノロジー・インフォメーション（以下、ＮＣＢＩと略記する）のジェンバンク（GenBank；ＧＢと略記
する）のデータベースからＧＢアクセッション番号AB501291ならびにＧＢアクセッション番号AY923836として得た。また、これらイソフタル酸代謝遺伝子群と高い相同性を示すＤＮＡ配列として、コマモナス・テストステロニ KF-1株のゲノムＤＮＡ配列（ＧＢアクセ
ッション番号NZ_AAUJ02000001）から塩基番号2321357〜2325424の塩基配列を得た。

【0065】

これらの配列をもとに、コマモナス・テストステロニ72W2株のイソフタル酸代謝遺伝子群をコードするＤＮＡをクローニングするためにＰＣＲプライマーを設計した。具体的には、イソフタル酸３，４−ジオキシゲナーゼ・オキシゲナーゼ・コンポーネント・タンパク質をコードするiphA遺伝子、イソフタル酸３，４−ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ・コンポーネント・タンパク質をコードするiphD遺伝子、およびイソフタル酸３，４−シス−ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼ遺伝子をコードするiphB遺伝子をそれぞれ増幅させるために、配列番号１４と１５、配列番号１６と１７、ならびに配列番号１８と１９で表わされるＰＣＲプライマーセットを設計し、合成した。なお、各ＰＣＲプライマーの合成は株式会社グライナー・ジャパンに外注した。これらプライマーのうち、iphD遺伝子の５'プライマー（配列番号１６）にはPacI認識部位を付加し、iphA遺伝子とiphB遺伝子の
５'プライマー（配列番号１４と１８）にはSwaI認識部位を付加した。また、全ての３'プライマー（配列番号１５と１７と１９）にはPmeI認識部位とNotI認識部位を付加した。

【0066】

（２）コマモナス・テストステロニ 72W2株の染色体ＤＮＡの取得
テレフタル酸またはイソフタル酸を唯一炭素源として生育できるコマモナス・テストステロニ 72W2株を10 mM テレフタル酸を含有する5 mlのＷ液体培地に接種し、30℃で24時
間振とう培養を行った後、菌体を集菌し、ゲノムＤＮＡ調製キット（QIAGEN社製Gentra Puregene Yeast/Bactキット）を用いて72W2株の染色体ＤＮＡを調製した。コマモナス・テストステロニ 72W2株は独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（NPMD）（〒292-0818 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）に受託番号NITE BP-1209として寄託されており、分譲を受けることができる。Ｗ液体培地の組成は、リン酸二水素カリウム0.85 g/L、リン酸水素二ナトリウム4.9 g/L、硫酸アンモニウム0.5 g/L、硫酸マグネシウム七水和物9.5 mg/L、硫酸鉄（II）七水和物9.5 mg/L、酸化マグネシウム10.75 mg/L、炭酸カルシウム2 mg/L、硫酸亜鉛 七水和物4.5 mg/ml、硫酸マンガン(II) 四水和物1.12mg/L、硫酸銅(II)五水和物0.25 mg/L、硫酸コバルト(II)七水和物0.28 g/L、ホウ酸0.
06 mg/Lである。

【0067】

（３）ＰＣＲ法によるイソフタル酸代謝遺伝子群のＤＮＡの増幅
上記（２）で得た72W2株の染色体ＤＮＡを鋳型にし、配列番号１４と１５、配列番号１６と１７、ならびに配列番号１８と１９で表わされるＰＣＲプライマーを用いて、添付の説明書に従ってPrimeSTAR ＤＮＡポリメラーゼを用いてイソフタル酸代謝遺伝子群のＤＮＡを増幅した。

【0068】

（４）イソフタル酸代謝遺伝子群のクローニング
上記（３）で増幅した72W2株のiphA遺伝子のＤＮＡ、iphB遺伝子のＤＮＡおよびiphD遺伝子のＤＮＡをTaq DNAポリメラーゼによって各ＤＮＡ断片の３'末端にＡ残基を付加した後、各ＤＮＡ断片をゲル電気泳動法により精製し、pT7Blue（Novagen社製）由来のＴベクターに組み込むことにより、それぞれの遺伝子を運ぶプラスミドpT7Blue_iphA、pT7Blue_iphBおよびpT7Blue_iphDを造成した。

【0069】

（５）72W2株のイソフタル酸代謝遺伝子の配列決定
上記（４）でクローニングした72W2株のiphA遺伝子、iphB遺伝子およびiphD遺伝子の塩基配列情報を得るため、ジデオキシヌクレオチド酵素法（dideoxychain termination法）〔Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74, 5463 (1977)〕により塩基配列の決定を行い、それぞれのプラスミドが目的の遺伝子を含むことを確認した。なお、塩基配列の決定は株式会社マクロジェンジャパンに外注した。

【0070】

（６）ポリシストロン型発現プラスミドの構築
エシェリヒア・コリMG1655株、JM109株、JM109（DE3）株およびBL21（DE3）株を用いて上記遺伝子を効率よく発現させるために、目的遺伝子の転写は疑似遺伝子に依存し、疑似遺伝子の翻訳効率を維持した状態で目的遺伝子も翻訳される発現系の構築を行った。

【0071】

まず、ベクターpUC19（タカラバイオ社製）にターミネーター配列を挿入するため、配
列番号２０〜２５で表わされる６本の合成ＤＮＡを合成した。これら合成ＤＮＡをpUC19
のKpnI部位とEcoRI部位の間に挿入することによりプラスミドpUC1LT1を構築した。次いで、pUC1LT1のPvuII部位とHindIII部位の間を削除したpULTDL1を構築した。pULTDL1にT7プ
ロモーター配列ならびに疑似遺伝子および目的遺伝子を連結するための制限酵素PacI部位を挿入するために、配列番号２６〜３１で表わされる６本の合成ＤＮＡを合成した。これら合成ＤＮＡをpULTDL1のSpHI部位とSalI部位の間に挿入することにより発現プラスミドpUTPELT19を構築した。次いで、pUTPELT19のBglII部位とPacI部位の間を配列番号３２で表わされる配列にＰＣＲ法を用いて変換した発現プラスミドpUTPEaLT19を構築した。

【0072】

次に、下記のようにして、XylS-Pmプロモーターを利用した誘導発現系を構築した。ま
ず、XylS-Pmプロモーター領域は国立遺伝学研究所から入手したプラスミドpJB866を鋳型
として、１組のＤＮＡプライマー（配列番号３３と３４）を用いて、XylS-Pmプロモータ
ーの全領域をPrimeSTAR DNAポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応により増幅した。Taq DNAポリメラーゼによって増幅ＤＮＡ断片の３’末端にＡ残基を付加した後、増幅ＤＮＡ断片をゲル電気泳動法により精製し、pT7Blue由来のＴベクターに組み込むことにより、XylS-Pmプロモーターの全領域を保持するプラスミドpT7-xylS_Pmを構築した。pT7-xylS_Pmから制限酵素SbfIと制限酵素BamHIによりXylS-Pmプロモーター領域を切り出し、pUTPEaLT19のSbfI部位とBglII部位の間に組み込むことにより、pUXPEaLT19を造成した。

【0073】

（７）iphD遺伝子内部のNotI部位の破壊とレアコドン連続部位の改変
iphD遺伝子の内部に存在するNotI部位を破壊するために、配列番号３５と３６に示す１組の合成ＤＮＡを用いたＰＣＲ法によりNotI部位を破壊したプラスミドpT7Blue_iphDdNを
造成した。次いで、pT7Blue_iphDdNから遺伝子内部のNotI部位が破壊されたiphD遺伝子を制限酵素PacIと制限酵素NotIにより切り出し、上記（６）で造成した発現ベクターpUXPEaLT19のNotI部位とPacI部位の間に挿入することにより、iphD遺伝子発現プラスミドpUXPEaLT_iphDdNを造成した。さらに、配列番号１６と３７、配列番号３８と３９、ならびに配
列番号１７と４０で表わされる３組の合成ＤＮＡを用いたＰＣＲ法により、iphD遺伝子内部に存在する大腸菌のレアコドン（ＡＧＧ）の連続部位の配列を改変した。得られた３種類のＰＣＡ増幅断片をそれぞれ制限酵素SacIと制限酵素MluI、制限酵素MluIと制限酵素NsiI、ならびに制限酵素NsiIと制限酵素BsrGIで処理した後、これら３種類の断片をpUXPEaLT_iphDdNのSacI部位とBsrGi部位の間に挿入することにより、iphD遺伝子のレアコドンの
連続部位を改変したプラスミドpUXPEaLT_iphDdNR12を造成した。

【0074】

（８）各イソフタル酸代謝酵素遺伝子を発現するプラスミドの構築
上記のようにして構築したプラスミドにおいては、iphA遺伝子とiphB遺伝子は、それぞれ翻訳開始コドンの上流にSwaI部位を、終止コドン下流にPmeI部位とNotI部位を有している。したがって、各遺伝子は制限酵素SwaIと制限酵素NotIにより切り出すことができ、各遺伝子の終止コドン下流の制限酵素PmeIとNotIに挿入することができる。上記（７）で造成したpUXPEaLT_iphDdNR12のPmeI部位とNotI部位の間にiphA遺伝子を挿入することによりpUXPEaLT_iphDdNR12Aを造成した。続いて、造成したpUXPEaLT_iphDdNR12AのPmeI部位とNotI部位の間にiphB遺伝子を挿入することにより、iphD遺伝子、iphA遺伝子およびiphB遺伝子を発現するプラスミドpUXPEaLT_iphDdNR12ABを造成した。続いて、プラスミドpUXPEaLT_iphDdNR12ABをエシェリヒア・コリ JM109株に導入した菌株を造成し、本菌株をJM109-MFS2株と命名した。

【0075】

（９）lacZ遺伝子のクローニング用のＰＣＲプライマーの設計と合成
イソフタル酸の取り込みとは関係のない遺伝子であるエシェリヒア・コリMG1655株のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子（以下、lacZ遺伝子と略記する）を対照実験に用いることにし
た。lacZ遺伝子の塩基配列としてはＮＣＢＩのＧＢデータベースからＧＢアクセッション番号JF300162の塩基番号1〜3075の配列を得て、この配列をもとにlacZ遺伝子をクローニ
ングするためにＰＣＲプライマー（配列番号４１と４２）を設計した。各ＰＣＲプライマーの合成は株式会社グライナー（ファスマック）に外注した。該プライマーのうち、lacZ遺伝子の５'プライマー(配列番号４１)にはPacI部位を付加し、lacZ遺伝子３'プライマー(配列番号４２)にはPmeI部位とNotI部位を付加した。

【0076】

（１０）エッシェリヒア・コリMG1655株の染色体ＤＮＡの取得
国立遺伝学研究所・ナショナルバイオリソースプロジェクト大腸菌より入手したエッシェリヒア・コリMG1655株をＬＢ液体培地に接種し、37℃で一晩振とう培養を行った。集菌した菌体をもとに、染色体ＤＮＡ調製キット（QIAGEN社製Gentra Puregene Yeast/Bact Kit）用いて染色体ＤＮＡを調製した。

【0077】

（１１）ＰＣＲ法によるlacZ遺伝子の増幅
PrimeSTAR ＤＮＡポリメラーゼを用いて、上記（１０）で得た染色体ＤＮＡを鋳型にし、ＰＣＲプライマー（配列番号４１と４２）を用いて、添付の説明書に従ってlacZ遺伝子を増幅させた。

【0078】

（１２）lacZ遺伝子のクローニング
上記（１１）で得たＰＣＲ増幅産物を精製し、制限酵素PacIと制限酵素NotIで消化した後、上記（３）で造成した低コピー発現ベクターpRTCPmc8のPacI部位とNotI部位の間に組み込むことによりプラスミドpRTCPmc8_lacZを造成した。続いて、プラスミドpRTCPmc8_lacZをエシェリヒア・コリ JM109株に導入した菌株を造成し、本菌株をJM109-lacZ株と命名した。

【0079】

（１３）MFS2タンパク質による細胞内へのイソフタル酸の取り込み
実施例１（４）で造成したpRTCPmc8_MFSと実施例２（６）で造成したpUXPEaLT19を保持するJM109-MFS2株を用いて、MFS2タンパク質がイソフタル酸の細胞内輸送を促進するかどうかを次のようにして調べた。JM109-MFS2株の対照としては、JM109-lacZ株を用いた。それぞれの菌株を100 mg/lのアンピシリンと50 mg/lのカナマイシンを含むＬＢ液体培地〔10 g/l トリプトン（Difco社製）、5 g/l 乾燥酵母エキス（Difco社製）、10 g/l 塩化ナ
トリウム〕1 mlで一晩培養した後、培養液を100 mg/lのアンピシリンと50 mg/lのカナマ
イシンを含むＬＢ液体培地20 mlに２％接種し、37℃で培養を行った。対数増殖期にｍ−
トルイル酸を終濃度1 mMになるように添加した後、30℃で３時間を続けることにより、MFS2タンパク質とLacZタンパク質を誘導発現させた。

【0080】

吸光度600 nmで10.0となる溶液200μlを調製するのに必要な菌体量に相当する培養液を採取し、集菌した後、50 mM リン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）で２回洗浄した後、菌体を１％グルコースを含む50 mM リン酸カリウム緩衝液198μlに懸濁した。この懸濁液を30℃、1000 rpmの条件で5分間加温した。その後、イソフタル酸（シグマアルドリッチジャパ
ン株式会社より購入）の100 mM水溶液を2μlだけ添加し、30℃、1000 rpmの条件で1時間
反応させた。反応後、菌体を50 mM リン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）で5回洗浄した。洗
浄後、50 mM リン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）100μlに懸濁し、酢酸エチル500μl−1N
塩酸 10μlを加えた。遠心分離後、上清を450μlとり、新しい1.5 mlチューブに移した。減圧乾燥器で乾固した後、4μlのアセトニトリルと196μlの水を加えた後、チューブの底にある残留物をアセトニトリル−水に懸濁した。この懸濁液を孔径0.2μmのフィルターで濾過した後、表１に示す高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の分離条件でＬＣ−ＴＯＦ型質量分析計（Waters社、LCT Premier XE）による分析を行った。イソフタル酸とプロトカテク酸の同定は、標品のイソフタル酸（シグマアルドリッチジャパン株式会社より購入）とプロトカテク酸（和光純薬工業株式会社より購入）と比較して、ＨＰＬＣの保持時間と質量分析計からの精密質量値を合わせて行った。

【0081】

その結果、mfs2遺伝子を発現するJM109-mfs2株では約1.9μMのイソフタル酸が検出された。一方、mfs2遺伝子の代わりにlacZ遺伝子を発現するJM109-lacZ株ではイソフタル酸は検出されなかった。したがって、イソフタル酸輸送蛋白質によって菌体内へのイソフタル酸輸送が促進されたことが明らかになった。

【0082】

【表1】

【0083】

実施例３．MFS2タンパク質により細胞内に取り込まれたイソフタル酸のプロトカテク酸への変換
以下のようにして、JM109-mfs2株を用いて細胞内に取り込まれたイソフタル酸がイソフタル酸代謝酵素遺伝子群のタンパク質によってプロトカテク酸に変換できるかどうかを調べた。

【0084】

JM109-mfs2株とJM109-lacZ株を、それぞれアンピシリン100 mg/Lを含むＬＢ液体培地2 mlで一晩培養した。この培養液をアンピシリン100 mg/Lを含むＬＢ液体培地20 mlに３％
接種し、37℃で培養を行った。次に、対数増殖期にｍ−トルイル酸を終濃度1 mMになるように添加して30℃で３時間培養を続けた。MFS2タンパク質またはlacZタンパク質、ならびにイソフタル酸代謝酵素遺伝子群のタンパク質を発現させた菌体を集菌し、１％グルコースを含む50 mM リン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）で洗浄した後、菌体を吸光度600 nmで10.0になるように50 mM リン酸カリウム緩衝液に懸濁した。この菌体懸濁液に対してイソフタル酸を終濃度で5 mMになるように添加した後、1000 rpmの振とう条件で30℃、2時間反
応させた。反応開始後0時間目、1時間目、2時間目に反応液を採取した。それぞれの反応
液2 μlに対して8 μlのアセトニトリルを加えて激しく懸濁した後、遠心にかけた。上清を10 μlとり、新しい1.5 mlチューブに移し、390 μlの水を加えた後、懸濁した。孔径0.2 μmのフィルターで濾過した後、表１に示す高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の分離条件でＬＣ−ＴＯＦ型質量分析計（Waters社、LCT Premier XE）による分析を行った。なお、イソフタル酸とプロトカテク酸の同定は、標品のイソフタル酸（シグマアルドリッチジャパン株式会社より購入）とプロトカテク酸（和光純薬工業株式会社より購入）と比較して、ＨＰＬＣの保持時間と質量分析計からの精密質量値を合わせて行った。分析結果を図１のグラフに示す。

【0085】

図１に示すように、JM109-mfs2株では反応２時間目に4.9 mMのプロトカテク酸が検出された。したがって、JM109-mfs2株ではほぼ全量のイソフタル酸が細胞内に取り込まれ、そのほぼ全量がプロトカテク酸に転換されたことがわかった。一方、JM109-lacZ株では反応２時間目に0.1 mMのプロトカテク酸と4.6 mMのイソフタル酸が検出された。以上の結果から、MFS2タンパク質がイソフタル酸の細胞内への取り込みを促進し、３種類のイソフタル酸代謝酵素により取り込まれたイソフタル酸がプロトカテク酸に変換したことが明らかになった。

【0086】

実施例４．イソフタル酸を低濃度で含むテレフタル酸水溶液からのイソフタル酸の選択的減少
実施例２（９）で造成したMFS2タンパク質を発現するエッシェリヒアJM109-mfs2株を用いて、イソフタル酸を低濃度で含むテレフタル酸水溶液からイソフタル酸を選択的に取り込んで、該水溶液中のイソフタル酸濃度を減少させることができるかどうかを調べた。JM109-mfs2株の対照としては、JM109-lacZ株を用いた。
JM109-mfs2株とJM109-lacZ株を、それぞれ1 mlのＬＢ液体培地で一晩培養した後、培養液を3 mlのF6.6W培地に吸光度600 nmで0.1になるように接種した。なお、F6.6W/P10/G2培地とは、リン酸二水素カリウム1.36 g/L、クエン酸一水和物 2.1 g/L、硫安 9.9 g/L、硫酸鉄（II）七水和物 1.703 g/L、グルコース 20 g/L、硫酸マグネシウム七水和物 246 mg/ml、塩化カルシウム二水和物 12.9 mg/L、チアミン 10 mg/L、酸化マグネシウム 10.75 mg/L、炭酸カルシウム 2 mg/L、硫酸亜鉛七水和物 4.5 mg/ml、硫酸マンガン四水和物 1.12 mg/L、硫酸銅五水和物 0.2 5mg/L、硫酸コバルト七水和物 0.28 g/L、ホウ酸 0.06 mg/Lを含む水溶液である。

【0087】

30℃、290 rpmの条件で振とう培養し、対数増殖期にｍ−トルイル酸を終濃度1 mMにな
るように添加した後、さらに３時間培養を続けた。培養液を1.185 mlずつ２本の試験管に分注した。一方の試験管には、0.3 ml の0.5 Mテレフタル酸水溶液と15 μl の0.5 Mイソ
フタル酸水溶液を添加することにより、5 mM イソフタル酸を含む100 mMテレフタル酸水
溶液に細胞を懸濁した反応液を調製した。もう一方の試験管には、0.3 ml の滅菌水と15 μl の0.5 Mイソフタル酸水溶液を添加することにより、5 mM イソフタル酸水溶液に細胞を懸濁した反応液を調製した。

【0088】

これらの試験管を30℃、290 rpmの条件で18時間振とうすることによりイソフタル酸の
取り込み反応とイソフタル酸のプロトカテク酸への転換反応を行った。反応開始後0時間
目、1時間目、2時間目に反応液を採取した。それぞれの反応液10 μlに対して40μlの水
を加えた後、２μlを分注し、8 μlのアセトニトリルを加えて激しく懸濁した後、遠心にかけた。上清を10μlとり、新しい1.5 mlチューブに移し、390μlの水を加え、懸濁した
。孔径0.2μmのフィルターで濾過した後、ＬＣ−ＴＯＦ型質量分析計を用いて、表１に示すＨＰＬＣ分離条件で代謝産物の分析を行った。なお、テレフタル酸の同定は、標品のテレフタル酸（シグマアルドリッチジャパン株式会社より購入）と比較して、ＨＰＬＣの保持時間と質量分析計からの精密質量値を合わせて行った。その分析結果を図２に示す。

【0089】

JM109-mfs2株では反応18時間目に4.2 mMのプロトカテク酸が検出されたが、JM109-lacZ株では微量のプロトカテク酸（0.05 mM）が検出された。なお、テレフタル酸の濃度を測
定したところ、反応時間によってテレフタル酸の濃度はほとんど変わらなかった。これらの結果から、MFS2タンパク質を発現させると、イソフタル酸を低濃度で含むテレフタル酸水溶液からイソフタル酸を選択的に取り込み、さらに取り込まれたプロトカテク酸はプロトカテク酸に転換されることが明らかになった。

【図1】

【図2】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]