特許 6098538 糖ペプチドの分析方法、および糖鎖構造解析用プログラム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6098538

(24)【登録日】2017年3月3日

(45)【発行日】2017年3月22日

(54)【発明の名称】糖ペプチドの分析方法、および糖鎖構造解析用プログラム

(51)【国際特許分類】

   G01N 27/62 20060101AFI20170313BHJP

   G01N 33/68 20060101ALI20170313BHJP

【ＦＩ】

   G01N27/62 V

   G01N27/62 D

   G01N33/68

【請求項の数】15

【全頁数】32

(21)【出願番号】特願2014-18927(P2014-18927)

(22)【出願日】2014年2月3日

(65)【公開番号】特開2015-145840(P2015-145840A)

(43)【公開日】2015年8月13日

【審査請求日】2016年4月27日

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 開催日 平成２５年９月１１日 集会名、開催場所 第６１回質量分析総合討論会 つくば国際会議場エポカルつくば（茨城県つくば市竹園２−２０−３）

(73)【特許権者】

【識別番号】000001993

【氏名又は名称】株式会社島津製作所

(74)【代理人】

【識別番号】100152571

【弁理士】

【氏名又は名称】新宅 将人

(74)【代理人】

【識別番号】100141852

【弁理士】

【氏名又は名称】吉本 力

(72)【発明者】

【氏名】西風 隆司

【審査官】 伊藤 裕美

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００８−０５１５５２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００８／００４８１１０（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特開２００５−３００４２０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００５／０２３４６５１（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００９／００８３８１（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 特開２０１３−０９２４９５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１０−２５６１０１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１５−０３４７１２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００６／００５７６３８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特開２０１４−００６１４２（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ２７／６２

Ｇ０１Ｎ ３３／６８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

アスパラギンにＮ‐結合型糖鎖が結合した糖ペプチドを、質量分析法を用いて分析する方法であって、
糖ペプチドの負イオン由来のフラグメントイオンの中からＭＳ^ｎプリカーサを選定するＭＳ^ｎプリカーサ選定ステップ；および
前記ＭＳ^ｎプリカーサ選定ステップで選定されたＭＳ^ｎプリカーサを開裂させ、ＭＳ^ｎ分析を実行するＭＳ^ｎ分析ステップ、
をこの順に有し、
前記ＭＳ^ｎプリカーサ選定ステップにおいて、（Ｇ＋９７−ｚ）／ｚの質量電荷比を有するフラグメントイオンがＭＳ^ｎプリカーサとして選定される、糖ペプチドの分析方法（ただし、ｎは２以上の整数であり、Ｇは糖鎖残基の質量であり、ｚはフラグメントイオンの電荷数であり自然数である）。

【請求項2】

前記ＭＳ^ｎプリカーサ選定ステップにおいて、
糖ペプチドの負イオン由来のフラグメントイオンのピークリストと、任意の既知の糖鎖のデータベースにおける各糖鎖の質量Ｓｘとを照合して、
前記ピークリストの中から、（Ｓｘ＋７９−ｚ）／ｚの質量電荷比を有するフラグメントイオンが、前記ＭＳ^ｎプリカーサとして選定される、請求項１に記載の分析方法。

【請求項3】

前記ＭＳ^ｎプリカーサ選定ステップにおいて、
糖ペプチドの負イオン由来のフラグメントイオンのピークリストから、２つのピークが抽出され、
抽出されたピークの質量電荷比の差が、予め設定された１以上の所定値のいずれかと一致するピークの組み合わせから、前記ＭＳ^ｎプリカーサが選定される、請求項１に記載の分析方法。

【請求項4】

前記１以上の所定値が、２４０および３８６であり、抽出された２つのピークのうち、質量電荷比が大きい方のフラグメントイオンが、前記ＭＳ^ｎプリカーサとして選定される、請求項３に記載の分析方法。

【請求項5】

前記ＭＳ^ｎプリカーサ選定ステップの前に、
アスパラギンにＮ‐結合型糖鎖が結合した糖ペプチドを負イオン化し、ＭＳ^１分析を実行するＭＳ^１分析ステップ；および
前記ＭＳ^１分析ステップで得られた糖ペプチドの負イオン、または前記ＭＳ^１分析ステップで得られた糖ペプチドの負イオンを開裂させて得られたフラグメントイオンを、ＭＳ^ｎ−１プリカーサとして開裂させ、ＭＳ^ｎ−１分析を実行するＭＳ^ｎ−１分析ステップ、を有し
前記ＭＳ^ｎプリカーサ選定ステップにおいて、前記ＭＳ^ｎ−１分析ステップで得られた糖ペプチドの負イオン由来のフラグメントイオンの中から前記ＭＳ^ｎプリカーサが選定される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の分析方法（ただし、ｎは３以上の整数である）。

【請求項6】

前記ＭＳ^１分析に供されるアスパラギンにＮ‐結合型糖鎖が結合した糖ペプチドが、ペプチドのＣ末端のアスパラギン残基、またはＣ末端のアミノ酸残基に隣接するアスパラギン残基に、Ｎ‐結合型糖鎖が結合している糖ペプチドである、請求項５項に記載の糖ペプチドの分析方法。

【請求項7】

前記ＭＳ^１分析よりも前に、プロテアーゼ消化により前記糖ペプチドを調製する試料調製ステップを有し、
前記試料調製ステップにおいて、ペプチドのＣ末端アスパラギン残基、またはＣ末端のアミノ酸残基に隣接するアスパラギン残基に、Ｎ‐結合型糖鎖が結合している糖ペプチドが生成される、請求項６に記載の糖ペプチドの分析方法。

【請求項8】

前記試料調製ステップにおいて、前記プロテアーゼとして、エンドペプチダーゼおよびエキソペプチダーゼの両方が用いられる、請求項７に記載の分析方法。

【請求項9】

前記ＭＳ^ｎ分析ステップで得られたＭＳ^ｎスペクトルに基づいて、Ｎ‐結合型糖鎖の構造情報を抽出する解析ステップ、をさらに有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の分析方法。

【請求項10】

前記解析ステップにおいて、
前記ＭＳ^ｎ分析ステップで得られたＭＳ^ｎスペクトルと、
任意の既知のＮ‐結合型糖鎖の質量をＧｘとした場合に、（Ｇｘ＋９７−ｚｘ）／ｚｘの質量電荷比を有するプリカーサイオン（ただし、ｚｘは電荷数であり自然数である）を開裂させて得られるフラグメントイオンの、既知のＭＳ^ＮスペクトルまたはＭＳ^Ｎピークリストのデータベース（ただし、Ｎは２以上の整数である）と、
を照合することにより、前記構造情報の抽出が行われる、請求項９に記載の分析方法。

【請求項11】

前記解析ステップにおいて、
前記ＭＳ^ｎ分析ステップで得られたＭＳ^ｎスペクトルと、
任意の糖鎖データベースに格納されている糖鎖構造に基づいて計算された、（Ｓｘ＋７９−ｚｘ）／ｚｘの質量電荷比を有するフラグメントイオンの仮想ＭＳ^Ｎスペクトルまたは仮想ＭＳ^Ｎピークリスト（ただし、Ｎは２以上の整数であり、Ｓｘは既知のＮ‐結合型糖鎖の質量であり、ｚｘは電荷数であり自然数である）と、
を照合することにより、前記構造情報の抽出が行われる、請求項９に記載の分析方法。

【請求項12】

アスパラギンにＮ‐結合型糖鎖が結合した糖ペプチドを、質量分析法を用いて分析する方法であって、
糖ペプチドの負イオンまたは糖ペプチドの負イオン由来のフラグメントイオンをプリカーサとして開裂させて得られたマススペクトルに基づいて、Ｎ‐結合型糖鎖の還元末端単糖へのコアフコースの付加の有無の判別を行う判別ステップを有し、
前記判別ステップにおいて、所定の糖鎖由来フラグメントイオンと、（Ｇ＋９７−ｚ）／ｚの質量電荷比を有するフラグメントイオンとの、質量電荷比の差に基づいて、糖鎖還元末端単糖へのコアフコースの付加の有無が判別される、糖ペプチドの分析方法。

【請求項13】

前記判別ステップにおいて、前記所定の糖鎖由来フラグメントイオンは、Ｎ‐アセチルグルコサミンの２−３位および４−５位のＣ−Ｃ結合で開裂した非還元末端側のフラグメントイオンであり、
前記所定の糖鎖由来フラグメントイオンと（Ｇ＋９７−ｚ）／ｚの質量電荷比を有するフラグメントイオンとの質量電荷比の差が２４０である場合は、コアフコースの付加無し、
前記所定の糖鎖由来フラグメントイオンと（Ｇ＋９７−ｚ）／ｚの質量電荷比を有するフラグメントイオンとの質量電荷比の差が３８６である場合は、コアフコースの付加有り、
として、前記判別が行われる、請求項１２に記載の糖ペプチドの分析方法。

【請求項14】

質量分析により得られた分析データが記憶される分析データ記憶部；既存の糖鎖構造データベースから得られる構造情報が記憶されるデータベース記憶部；および前記分析データ記憶部のデータと前記データベース記憶部のデータの照合を行うためのコンピュータを備えるデータ処理部、を備える糖鎖構造解析システムを用いて、アスパラギンにＮ‐結合型糖鎖が結合した糖ペプチドのＮ‐結合型糖鎖の構造を同定するための糖鎖構造解析用プログラムであって、
前記分析データ記憶部には、糖ペプチドの負イオン由来の（Ｇ＋９７−ｚ）／ｚの質量電荷比を有する負のフラグメントイオンをプリカーサとして、ＭＳ^ｎ分析を実行することにより取得されたＭＳ^ｎスペクトルまたはＭＳ^ｎピークリストを含むデータが記憶され、
前記データベース記憶部には、任意の既知のＮ‐結合型糖鎖の質量をＧｘとした場合に、（Ｇｘ＋９７−ｚｘ）／ｚｘの質量電荷比を有するプリカーサイオン（ただし、ｚｘは負イオンの電荷数であり自然数である）を開裂させて得られるフラグメントイオンの、既知のＭＳ^ＮスペクトルまたはＭＳ^Ｎピークリスト（ただし、Ｎは２以上の整数である）を含むデータが記憶され、
前記分析データ記憶部のデータと前記データベース記憶部のデータとを照合することにより、両者が一致するか否かの判断、または両者の類似度のスコア付けを行うステップを、前記データ処理部のコンピュータに実行させることを特徴とする、糖鎖構造解析用プログラム。

【請求項15】

質量分析により得られた分析データが記憶される分析データ記憶部；既存の糖鎖構造データベースから得られる構造情報が記憶されるデータベース記憶部；および前記分析データ記憶部のデータと前記データベース記憶部のデータの照合を行うためのコンピュータを備えるデータ処理部、を備える糖鎖構造解析システムを用いて、アスパラギンにＮ‐結合型糖鎖が結合した糖ペプチドのＮ‐結合型糖鎖の構造を同定するための糖鎖構造解析用プログラムであって、
前記分析データ記憶部には、糖ペプチドの負イオン由来の（Ｇ＋９７−ｚ）／ｚの質量電荷比を有する負のフラグメントイオンをプリカーサとして、ＭＳ^ｎ分析を実行することにより取得されたＭＳ^ｎスペクトルまたはＭＳ^ｎピークリストを含むデータが記憶されており、
前記データベース記憶部には、任意の糖鎖データベースに格納されている糖鎖構造に基づいて計算された、（Ｓｘ＋７９−ｚｘ）／ｚｘの質量電荷比を有するフラグメントイオンの仮想ＭＳ^Ｎスペクトルまたは仮想ＭＳ^Ｎピークリスト（ただし、Ｓｘは既知のＮ‐結合型糖鎖の質量であり、ｚｘは電荷数であり自然数であり、Ｎは２以上の整数である）を含むデータが記憶されており、
前記分析データ記憶部のデータと前記データベース記憶部のデータとを照合することにより、両者が一致するか否かの判断、または両者の類似度のスコア付けを行うステップ を、前記データ処理部のコンピュータに実行させることを特徴とする、糖鎖構造解析用プログラム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、糖ペプチドの分析方法、および当該分析方法を実現するための糖鎖構造解析用プログラムに関する。

【背景技術】

【0002】

ペプチド鎖への糖鎖付加は、翻訳後修飾の中で最も重要なプロセスの１つである。ペプチド鎖に糖鎖が付加した糖タンパク質は、様々な生命現象に関わっている。生体内では、糖鎖のわずかな構造の違いが精密に認識されることによって、細胞間のシグナル伝達や分子認識等が制御されていると考えられており、糖タンパク質や糖ペプチドの構造解析は、生命現象の解明や、創薬、バイオマーカー開発等に大きな貢献をもたらすことが期待される。

【0003】

タンパク質やＤＮＡの構造解析においては、ＩＳＤ，ＣＩＤ、ＩＲＭＰＤ、ＥＣＤ、ＥＴＤ等のイオン開裂法を用いた多段階質量分析（ＭＳ／ＭＳ分析、またはｎが２以上のＭＳ^ｎ分析）の応用が進んでおり、糖鎖の構造解析においても、多段階質量分析の応用が進んでいる。

【0004】

糖鎖の質量分析では、糖鎖の標準試料のＭＳ^２あるいはＭＳ^ｎ（ｎは３以上）のスペクトルをデータベースとして蓄積しておき、分析対象のマススペクトルとデータベースのマススペクトルとをマッチングさせることにより、糖鎖構造を同定する方法が応用されている。また、既存の糖鎖構造データベースを基に、生成し得る糖鎖の理論フラグメントのリストをデータベース化し、分析対象から得られたマススペクトルと理論フラグメントとをマッチングさせて糖鎖構造を推定する方法も開発されている。

【0005】

従来の質量分析による糖鎖構造解析は、糖タンパク質や糖ペプチドから遊離させた遊離糖鎖の分析が主流であった。遊離糖鎖は、ペプチド由来の構造を含有していないため、上記のようなデータベースとのマッチングによる構造の同定が容易である。しかし、遊離糖鎖の分析は、糖鎖構造の解析が容易である反面、糖鎖の由来が明確ではなく、例えば、夾雑物に由来する糖鎖を分析している可能性が否定できない等の問題がある。

【0006】

これに対して、糖ペプチド分析は、糖鎖の由来が明確であり、ペプチド中の糖鎖の付加位置に関する情報も得られる。糖ペプチド分析は、付加部位ごとのヘテロな糖鎖構造解析が可能であり、従来の遊離糖鎖分析では得られない情報が得られることから、近年特に注目されている分野である。

【0007】

糖ペプチドのＭＳ^２分析では、ペプチド由来のフラグメント、糖鎖由来のフラグメント、およびペプチドと糖鎖の両方を含むフラグメントが生成し得る。一般に、糖ペプチドのＭＳ^２分析では、糖鎖由来のフラグメントの生成量が少なく、糖鎖由来のフラグメントが全く生成されない場合もあり、糖鎖構造の解析が困難なことが多い。また、糖ペプチドのＭＳ^２分析では、ペプチド部分のアミノ酸配列等が糖鎖部分の開裂に大きく影響する。そのため、糖ペプチドのＭＳ^２あるいはＭＳ^ｎのデータベースは、各糖ペプチドの糖鎖構造とアミノ酸配列の両方のデータを含む必要がある。アミノ酸配列の多様性を考慮すると、従来の分析方法では、糖ペプチドのマススペクトルやフラグメントをデータベース化して、マッチングにより構造を同定することは困難を極める。

【0008】

このような糖ペプチドの構造解析に関わる課題に鑑みて、ＭＳ^ｎ分析において糖鎖由来のフラグメントを優先的に生成させるイオン化法を採用することにより、糖鎖の構造解析を行う試みがなされている。例えば、特許文献１では、ナトリウム等の金属付加体の正イオンモードＭＳ^ｎ分析により、糖鎖の一次構造を解析できることが示されている。

【0009】

しかし、正イオンモードの質量分析では、糖鎖の分枝構造の同定が困難であることが多い。糖鎖では、構成素材である単糖のヒドロキシ基の全てがグリコシド結合に関与し得るため、分枝構造を有する場合が多い。例えば、アスパラギン残基に結合したＮ‐結合型糖鎖は、少なくとも１か所の分枝を有している。また、糖鎖の還元末端のＮ‐アセチルグルコサミン（GlcNAc）には、α1,6フコース転移酵素（Fut8）等の作用により、フコースが転移されることが知られている。フコース転移では、GlcNAcの６位にフコースの１位がα結合して、分枝構造が形成される。糖鎖還元末端のGlcNAcに転移されたフコース（コアフコース）は、多くの糖タンパク質の機能制御に関与しており、例えば、細胞接着や癌化等の過程でコアフコースの有無が変化することが報告されている。正イオンモードの質量分析では、ＣＩＤ等による開裂の際にコアフコースが容易に脱離するため、コアフコースの有無の特定が困難である。

【0010】

一方、糖ペプチドの負イオンモードの質量分析では、ペプチド部分を含まない糖鎖由来のフラグメントが優先的に得られることが報告されている。そのため、負イオンモードの質量分析は、糖鎖のマススペクトルやフラグメントのデータベース化が容易であり、糖ペプチドの糖鎖構造解析手法として注目されている。

【0011】

例えば、非特許文献１および非特許文献２では、正イオンモードと負イオンモードの質量分析を併用して糖ペプチドの構造解析が行われており、負イオンモードＭＳ^２で生成した^２，４Ａ_Ｒ等のフラグメントをＭＳ^３で分析した例が報告されている。なお、^２，４Ａ_Ｒとは、ペプチド部分を含まない糖鎖の非還元末端側フラグメントであり、糖鎖の還元末端単糖の２−３位および４−５位のＣ−Ｃ結合で開裂が生じることにより生成するフラグメントである。

【0012】

また、特許文献２にも、正イオンモードと負イオンモードとを併用して糖ペプチドの構造解析を行う方法が開示されており、負イオンモードで糖鎖の構造解析が可能であることが示されている。さらに、特許文献２では、セリン残基あるいはスレオニン残基に結合したＯ‐結合型糖鎖を含む糖ペプチドの負イオンモードの質量分析では、ＣＩＤによる開裂の際にコアフコースの脱離が生じ難く、コアフコースの有無を特定可能であることが報告されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0013】

【特許文献1】特開２００５−３００４２０号公報

【特許文献2】特開２００８−５１５５２号公報

【非特許文献】

【0014】

【非特許文献1】Ito, H. et al., Rapid Commun. Mass Spectrom., vol. 20, pp. 3357‐3565 （２００６年）

【非特許文献2】Deguchi, K. et al., Rapid Commun. Mass Spectrom., vol. 20, pp.741‐746 （２００６年）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0015】

上記のように、負イオンモードの多段階質量分析による、糖ペプチドの糖鎖構造解析方法がいくつか提案されている。しかしながら、特許文献２にも記載されているように、Ｎ‐結合型糖鎖のＭＳ^２分析では、ＣＩＤ開裂の際にコアフコースの脱離が生じる可能性があり、コアフコースの有無の同定は困難であった。また、非特許文献１，２において、負イオンモードＭＳ^２で検出される^２，４Ａ_Ｒフラグメントは、糖鎖構造の大部分を含んでいるが、糖鎖還元末端のGlcNAcの１，２，５，６位の炭素を含んでいない。コアフコースは、GlcNAcの６位に付加するため、糖鎖がコアフコースを含むか否かに関わらず、^２，４Ａ_Ｒフラグメントはコアフコースを含んでいない。そのため、^２，４Ａ_Ｒフラグメントをさらに開裂させＭＳ^３以上の多段階質量分析を行っても、コアフコースの有無を判断することはできない。

【0016】

このように、従来技術では、Ｎ‐結合型糖鎖を含む糖ペプチドの多段階質量分析によって、糖鎖の分枝構造やコアフコースの有無等を反映した糖鎖由来フラグメントを得ることは困難である。すなわち、ペプチド部分の構造に大きな影響を受けることなく、データベースとのマッチング等を用いて、詳細な糖鎖構造を容易に同定し得るユニバーサルな糖鎖構造の分析方法は未だ開発されていない。このような現状に鑑み、本発明は、多段階質量分析により、複雑な糖鎖構造やコアフコースの有無をも同定し得る糖ペプチドの分析方法の提供を目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0017】

本発明者は、Ｎ‐結合型糖鎖を含む糖ペプチドの負イオンＭＳ^２スペクトルを数多く取得して、糖鎖構造の解析方法について検討を進める中で、糖鎖残基＋９６の質量電荷比（ｍ／ｚ）を有するＭＳ^２フラグメントが生成することを見出した。この［糖鎖残基＋９６］⁻フラグメントをＭＳ^３で詳細に解析したところ、完全な糖鎖残基構造を含んでおり、ＭＳ^３分析により、コアフコースの有無も解析可能であることが判明した。また、［糖鎖残基＋９６］⁻フラグメントは、ペプチド部分のアミノ酸配列に依存することなく、同一のＭＳ^３ピークを示すことが判明した。

【0018】

本発明は、上記知見に基づいてなされたものであり、アスパラギンにＮ‐結合型糖鎖が結合した糖ペプチドを、質量分析装置を用いて分析する方法に関する。本発明の分析方法では、糖ペプチドの負イオンＭＳ^ｎ分析（ｎは２以上の整数）が行われる。本発明の分析方法は、糖ペプチドの負イオン由来のフラグメントイオンの中からＭＳ^ｎプリカーサを選定するＭＳ^ｎプリカーサ選定ステップ；およびＭＳ^ｎプリカーサ選定ステップで選定されたＭＳ^ｎプリカーサを開裂させ、ＭＳ^ｎ分析を実行するＭＳ^ｎ分析ステップ、をこの順に有する。

【0019】

本発明の分析方法では、ＭＳ^ｎプリカーサ選定ステップにおいて、（Ｇ＋９７−ｚ）／ｚの質量電荷比を有するフラグメントイオンが、ＭＳ^ｎプリカーサとして選定される。ここで、Ｇは糖鎖残基の質量である。糖鎖残基の質量とは、糖鎖を構成する単糖残基の質量の総和である。単糖残基の質量とは、単糖の質量から水一分子の質量を引いた値である。ｚは自然数であり、ＭＳ^ｎプリカーサの電荷数である。例えば、ＭＳ^ｎ−１で得られるフラグメントイオンが１価の負イオンである場合、ｚ＝１であり、選定されるＭＳ^ｎプリカーサは、ｍ／ｚ＝（Ｇ＋９６）である。

【0020】

なお、基準とする糖鎖残基の質量計算にはモノアイソトピックマスが好適に用いられる。この場合ＭＳ^ｎプリカーサとして選択されるのはモノアイソトピックマスで計算した（Ｇ＋９７−ｚ）／ｚに一致するピークのみでも良いし、その同位体ピークを含んでいてもよく、同位体ピークのみであっても良い。質量分析装置の性能（分解能）によっては、モノアイソトピックピークとその同位体ピークとを分離できない場合がある。このような場合は、糖鎖残基の質量の計算に平均質量が用いられても良い。ＭＳ^ｎプリカーサを選定する際の選択幅は質量分析装置の性能に応じて適宜選択され、例えば、モノアイソトピックマスで計算した値の±１０の範囲内、好ましくは±５の範囲内、より好ましくは±２の範囲内である。

【0021】

本発明の分析方法の一形態では、ＭＳ^ｎプリカーサ選定ステップの前に、アスパラギンにＮ‐結合型糖鎖が結合した糖ペプチドを負イオン化し、ＭＳ^１分析を実行するＭＳ^１分析ステップ；およびＭＳ^１分析ステップで得られた糖ペプチドの負イオン、またはＭＳ^１分析ステップで得られた糖ペプチドの負イオンを開裂させて得られたフラグメントイオンを、ＭＳ^ｎ−１プリカーサとして開裂させ、ＭＳ^ｎ−１分析を実行するＭＳ^ｎ−１分析ステップ、を有する。ここでは、ｎは３以上の整数である。例えば、ｎ＝３の場合は、ＭＳ^１分析ステップで得られた糖ペプチドの負イオンをＭＳ^２プリカーサ（ＭＳ^ｎ−１プリカーサ）として、ＭＳ^２分析が実行され、ＭＳ^２分析で得られた糖ペプチドの負イオン由来のフラグメントの中から（Ｇ＋９７−ｚ）／ｚの質量電荷比を有するフラグメントイオンがＭＳ^３プリカーサ（ＭＳ^ｎプリカーサ）として選定される。

【0022】

本発明の好ましい形態において、ＭＳ^ｎ−１分析ステップに供されるＭＳ^ｎ−１プリカーサは、ペプチドのＣ末端アスパラギン残基、またはＣ末端のアミノ酸残基に隣接するアスパラギン残基に、Ｎ‐結合型糖鎖が結合している糖ペプチド由来の負イオンである。Ｃ末端付近のアスパラギンに糖鎖が結合したペプチドの負イオンをＭＳ^ｎ−１プリカーサとしてＭＳ^ｎ−１分析を行った場合、ＭＳ^ｎ−１スペクトルにおいて、［糖鎖残基＋９６］⁻フラグメント（質量電荷比がＧ＋９６のフラグメントイオン）の強いピークが現れる傾向がある。そのため、ＭＳ^ｎ分析ステップに供されるＭＳ^ｎプリカーサの量が多くなり、低濃度試料でも高精度の分析が可能となる。例えば、ｎ＝２の場合は、ＭＳ^２分析の前に、ＭＳ^１分析で得られたＭＳ^１スペクトルに現れる糖ペプチド由来の負イオンの中から、Ｃ末端付近のアスパラギンに糖鎖が結合した負イオンをＭＳ^２プリカーサとして選定すればよい。

【0023】

ＭＳ^１分析において、Ｃ末端付近のアスパラギンに糖鎖が結合した負イオンを得るためには、例えば、糖ペプチドをＭＳ^１分析ステップに供する前の試料調製ステップにおいて、糖鎖が結合したアスパラギンのＣ末端、糖鎖が結合したアスパラギンのＣ末端側に隣接するアミノ酸残基等で、ペプチド結合が切断されるように、プロテアーゼを選択すればよい。本発明の一形態では、試料調製ステップにおいて、プロテアーゼとして、エンドペプチダーゼとエキソペプチダーゼの両方が用いられる。

【0024】

本発明の分析方法において、ＭＳ^ｎプリカーサとして、（Ｇ＋９７−ｚ）／ｚの質量電荷比を有するフラグメントイオンを選定する方法は特に限定されない。例えば、ＭＳ^ｎ−１ステップで得られたＭＳ^ｎ−１スペクトルのピークリストと、任意の既知の糖鎖のデータベースにおける各糖鎖の質量Ｓｘとを照合することにより、ＭＳ^ｎプリカーサを選定できる。この場合、既知の糖鎖の質量Ｓｘに対して、（Ｓｘ＋７９−ｚ）／ｚの質量電荷比を有するフラグメントイオンをＭＳ^ｎプリカーサとして選択すればよい。

【0025】

また、ＭＳ^ｎ−１分析ステップで得られたＭＳ^ｎ−１スペクトルのピークリストから、２つ以上のピークを抽出し、抽出されたピークのｍ／ｚの差が、予め設定された所定値と一致するピークの組み合わせから、ＭＳ^ｎプリカーサを選定することもできる。予め設定される所定値は、１つでもよく、２つ以上でもよい。例えば、上記所定値は、２４０および３８６である。この場合は、ｍ／ｚの差が２４０または３８６である２つのピークが抽出され、ｍ／ｚの大きい方のフラグメントイオンが、ＭＳ^ｎプリカーサとして選定される。

【0026】

なお、本明細書において、質量電荷比ｍ／ｚが「一致する」との記載、あるいは等号（＝）は、ｍ／ｚが完全に一致することを要するものではなく、質量分析装置の性能等に応じて、±１（好ましくは±０．５以内、より好ましくは±０．１以内）の範囲の誤差を許容する。

【0027】

上記のように、２つのピークのｍ／ｚの差が２４０および３８６である場合、ｍ／ｚが小さい方のフラグメントイオンは、^２，４Ａ_Ｒ（還元末端のＮ‐アセチルグルコサミンの２−３位および４−５位のＣ−Ｃ結合で開裂した非還元末端側のフラグメントイオン）である。ｍ／ｚが大きい方のフラグメントイオンは、ｍ／ｚ＝Ｇ＋９６（ただし、ｚ＝１である）のフラグメントイオンであり、２つのピークのｍ／ｚの差が２４０の場合はコアフコースを有しておらず、ｍ／ｚの差が３８６の場合はコアフコースを有している。

【0028】

なお、ＭＳ^ｎ分析を実行しなくとも、ＭＳ^ｎ−１スペクトルにおける、所定の糖鎖由来フラグメントイオンと、（Ｇ＋９７−ｚ）／ｚの質量電荷比を有するフラグメントイオンとの、質量電荷比の差に基づいてコアフコースの有無を判別することもできる。例えば、^２，４Ａ_Ｒと、（Ｇ＋９７−ｚ）／ｚの質量電荷比を有するフラグメントイオンとの、質量電荷比の差を算出し、質量電荷比の差が２４０である場合は「コアフコース無し」、質量電荷比の差が３８６である場合は「コアフコース有り」と判別することができる。

【0029】

解析ステップにおいて、Ｎ‐結合型糖鎖の構造情報の抽出は、例えば、ＭＳ^ｎ分析ステップで得られたＭＳ^ｎスペクトルと、既知の糖鎖由来フラグメントのＭＳ^Ｎデータベースとを照合することにより行われる。ここで、Ｎは２以上の整数であり、ｎと同一でもよく異なっていてもよい。一形態において、既知の糖鎖由来フラグメントイオンのＭＳ^Ｎデータベースは、（Ｇｘ＋９７−ｚｘ）／ｚｘの質量電荷比を有するプリカーサイオンを開裂させて得られるフラグメントイオンの、既知のＭＳ^ＮスペクトルまたはＭＳ^Ｎピークリストを含むデータベースである。別の形態において、既知の糖鎖由来フラグメントイオンのＭＳ^Ｎデータベースは、任意の糖鎖データベースに格納されている糖鎖構造に基づいて計算された、（Ｓｘ＋７９−ｚｘ）／ｚｘの質量電荷比を有するフラグメントイオンの仮想ＭＳ^Ｎスペクトルまたは仮想ＭＳ^Ｎピークリストを含むデータベースである。ここで、Ｓｘは既知のＮ‐結合型糖鎖の質量である。ｚｘは自然数であり、フラグメントイオン（プリカーサ）の電荷数である。

【0030】

さらに、本発明は、上記の質量分析を行うための質量分析装置に関する。本発明の質量分析装置は、質量分析部；データベース部；および前記分析対象の糖ペプチドの糖鎖構造の同定を行うデータ処理部、を備える。質量分析部は、質量分離手段およびイオン開裂手段を備え、分析対象の糖ペプチドのＭＳ^ｎ分析を行う。データ処理部は、質量分析部でのＭＳ^ｎ分析により得られた分析対象の糖ペプチドのＭＳ^ｎスペクトルと、データベース部に格納されたＭＳ^ＮスペクトルもしくはＭＳ^Ｎピークリスト、またはデータベース部に格納された仮想ＭＳ^Ｎスペクトルもしくは仮想ＭＳ^Ｎピークリストとを照合し、糖鎖構造を同定する。

【0031】

また、本発明は、既存のデータベースや、既存のデータベースに基づいて計算される仮想ＭＳ^Ｎスペクトル等と、上記の負イオンＭＳ^ｎ分析で得られたＭＳ^ｎスペクトルとを照合することにより、糖ペプチドのＮ‐結合型糖鎖の構造を同定するための糖鎖構造解析用プログラムに関する。

【0032】

［用語の定義］
本明細書において、「質量」とは、統一原子質量単位(unified atomic mass unit: u) またはDa, およびそれに準ずる単位によって表される値であり、無次元数である。また、質量電荷数比（ｍ／ｚ）は、上記の質量ｍをイオンの電荷数ｚで割ったものである。

【0033】

本明細書において、「糖ペプチドの負イオン」とは、糖ペプチドからのプロトンの脱離等によって糖ペプチドが負イオン化されたものである。「糖ペプチドの負イオン由来のフラグメントイオン」とは、糖ペプチドの負イオンのイオン開裂により生成するフラグメントイオンである。なお、糖ペプチドの負イオン由来のフラグメントイオンは、必ずしも糖ペプチドが負イオン化された後に開裂されるとの順により生成するものである必要はない。例えばある種のインソース分解のように、糖ペプチドの開裂を生じた後に負イオン化されたものであっても、糖ペプチドが負イオン化された後に開裂されたものと同一の構造を有していれば「糖ペプチドの負イオン由来のフラグメントイオン」に該当する。

【0034】

「ＭＳ^ｎ分析」とは、１段階目（ＭＳ^１）で試料がイオン化され、２段階目（ＭＳ^２）以降でイオンが開裂され、開裂されたイオン（フラグメントイオン）を検出する分析方法である。本明細書では、試料をイオン化して得たマススペクトルを「ＭＳ^１スペクトル」、ＭＳ^１スペクトルで観測された特定のイオンをプリカーサとして取得したプロダクトイオンスペクトルを「ＭＳ^２スペクトル」、ＭＳ^２スペクトルで観測された特定のイオンをプリカーサとして取得したプロダクトイオンスペクトルを「ＭＳ^３スペクトル」と表記する。また、ＭＳ^ｎスペクトルで観測された特定のイオンをプリカーサとして取得したプロダクトイオンスペクトルを「ＭＳ^ｎ＋１スペクトル」と表記する。

【0035】

なお、インソース開裂（ＩＳＤ）では、イオン化と略同時に開裂が生じ、フラグメントイオンが生成する。本明細書においては、ＩＳＤのように、イオン化（ｎ＝１）と開裂（ｎ＝２）とが略同時に生じるものを２段階であるとみなし、ＩＳＤにより略同時に生じるイオン化と開裂は、イオン化（１段階目）と開裂（２段階目）が生じているとみなす。ＩＳＤによって、イオン化（ｎ＝１）と開裂（ｎ＝２）が略同時に生じ、これによって得られるフラグメントイオンをプリカーサとして、さらにイオン開裂を行う場合、ＩＳＤによるイオン化および開裂の時点で、一般的な質量分析（ポストソース開裂）によるＭＳ^２と等価のフラグメントイオンが得られていると解釈できる。そのため、ＩＳＤによるイオン化および開裂で得られたフラグメントイオンをプリカーサイオンとして、これをさらに開裂させる場合は、ＭＳ^３分析であるとみなす。

【発明の効果】

【0036】

糖ペプチドの負イオンを開裂させたときに生じるｍ／ｚ＝（Ｇ＋９７−ｚ）／ｚのフラグメントイオンは、糖ペプチドの糖鎖の完全な構造を含んでおり、コアフコースの有無等の糖鎖構造情報を反映している。このフラグメントイオンをＭＳ^３プリカーサとして開裂させることにより得られるＭＳ^３スペクトルは、ペプチド部分の構造に大きな影響を受けず、糖鎖構造が同一であれば、同一のＭＳ^３ピークが得られる。そのため、本発明によれば、データベースとのマッチング等を用いて、詳細な糖鎖構造を容易に同定することができる。

【図面の簡単な説明】

【0037】

【図1】ＭＳ^３スペクトルから糖鎖構造を同定する方法の一例を示すフローチャートである。

【図2】ＭＳ^３スペクトルから糖鎖構造を同定する方法の一例を示すフローチャートである。

【図3】分析１（実施例１）のＩｇＧ（コアフコース無し）由来糖ペプチドのマススペクトルであり、（Ａ）はＭＳ^２、（Ｂ１）は^２，４Ａ_ＲフラグメントイオンのＭＳ^３、（Ｂ２）はｍ／ｚが糖鎖残基＋９６のフラグメントイオンのＭＳ^３スペクトルである。

【図4】分析２（実施例１）のＩｇＧ（コアフコース有り）由来糖ペプチドのマススペクトルであり、（Ａ）はＭＳ^２、（Ｂ１）は^２，４Ａ_ＲフラグメントイオンのＭＳ^３、（Ｂ２）はｍ／ｚが糖鎖残基＋９６のフラグメントイオンのＭＳ^３スペクトルである。

【図5】分析３（実施例１）のＩｇＧ（コアフコース有り）由来糖ペプチドのマススペクトルであり、（Ａ）はＭＳ^２、（Ｂ）はｍ／ｚが糖鎖残基＋９６のフラグメントイオンのＭＳ^３スペクトルである。

【図6】分析４（実施例１）のＩｇＧ由来糖ペプチドのＭＳ^２スペクトルである。

【図7】分析５（実施例２）のトランスフェリン由来糖ペプチドのマススペクトルであり、（Ａ）はＭＳ^２、（Ｂ）はｍ／ｚが糖鎖残基＋９６のフラグメントイオンのＭＳ^３スペクトルである。

【図8】（Ａ）は分析６（実施例３）のα１−酸性糖タンパク質由来糖ペプチドのマススペクトルである。（Ｂ）および（Ｃ）は、それぞれ分析１および分析２のマススペクトルである。（Ａ）〜（Ｃ）のそれぞれにおいて、上段はＭＳ^２、下段はｍ／ｚが糖鎖残基＋９６のフラグメントイオンのＭＳ^３スペクトルである。

【図9】分析７（実施例４）のラクトフェリン由来糖ペプチドのマススペクトルであり、（Ａ）はＭＳ^２、（Ｂ）はｍ／ｚが糖鎖残基＋９６のフラグメントイオンのＭＳ^３スペクトルである。

【図10】分析８（実施例４）のラクトフェリン由来糖ペプチドのＭＳ^２スペクトルである。

【発明を実施するための形態】

【0038】

本発明の糖ペプチドの分析方法では、アスパラギン（Ａｓｎ）にＮ‐結合型糖鎖が結合した糖ペプチドを分析対象として、質量分析法により糖鎖構造の解析が行われる。糖ペプチドは、Ｎ‐結合型糖鎖を含むものであれば、特に限定されない。分析対象の糖ペプチドは、予め調製されたものをそのまま用いてもよい。好ましくは、本発明の分析方法に適するように試料調製が行われる。

【0039】

以下では、ＭＳ^１で糖ペプチドを負イオン化し、ＭＳ^１分析で得られた糖ペプチドの負イオンをＭＳ^２プリカーサとしてＭＳ^２分析を行い、ＭＳ^２分析で得られた糖ペプチドの負イオン由来のフラグメントイオンの中からＭＳ^３プリカーサを選定し、ＭＳ^ｎ分析（ｎ＝３）が行われる場合を中心に、本発明の実施形態について説明する。

【0040】

［試料調製］
一般に、質量分析によるペプチドの構造解析において、ペプチド部分のアミノ酸残基数が多いと、ＭＳ^１でのイオン化が困難となったり、ＭＳ^２スペクトルにおけるピーク数が増大し、解析が困難となる傾向がある。そのため、プロテアーゼ消化や化学処理を行い、ペプチド部分を質量分析に適した長さ（アミノ酸残基数）に切断したペプチド断片を用いて分析が行われる。同様に、本発明の糖ペプチドの分析方法においても、質量分析を実行する前の試料調製において、プロテアーゼ消化等により、質量分析に適した長さを有する糖ペプチド断片が生成されることが好ましい。質量分析に適した長さとは、例えば、アミノ酸残基数が３０以下、好ましくは２０以下、より好ましくは１５以下である。一方、糖ペプチドの由来を明確とする観点から、ペプチド部分のアミノ酸残基数は２以上が好ましい。

【0041】

試料調製に用いられるプロテアーゼは特に限定されず、エンドペプチダーゼ（特定の配列の特定の結合を選択的に切断する）およびエキソペプチダーゼ（Ｃ末端またはＮ末端のアミノ酸のペプチド結合を切断する）のいずれも使用できる。

【0042】

エンドペプチダーゼとしては、トリプシン（塩基性アミノ酸残基（ＡｒｇおよびＬｙｓ）のＣ末端側でペプチドを切断する）、Ｌｙｓ‐Ｃ（ＬｙｓのＣ末端側でペプチドを切断する）、アルギニンエンドペプチダーゼ（ＡｒｇのＣ末端側でペプチドを切断する）、キモトリプシン（芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐ）のＣ末端側でペプチドを切断する）、ペプシン（芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐ）のＮ末端側でペプチドを切断する）等が広く知られている。また、レグマチュレインのように、ＡｓｎのＣ末端側でペプチドを切断するアスパラギンエンドペプチダーゼ（Ａｓｎ−Ｃ）も好適に用いられる。上記の他、サーモリシンやプロテイナーゼＫのような特異性の低いエンドペプチダーゼを用いることもできる。

【0043】

エキソペプチダーゼとしては、ペプチドのＮ末端から順次ペプチド結合を切断するアミノペプチダーゼ、Ｃ末端から順次ペプチド結合を切断するカルボキシペプチダーゼのいずれも用いることができる。

【0044】

後に詳述するように、本発明の分析方法の一形態では、Ｃ末端付近のＡｓｎに糖鎖が結合した糖ペプチドの負イオンをＭＳ^２プリカーサとしてＭＳ^２分析が行われる。この場合、ＭＳ^２プリカーサは、ペプチドのＣ末端のＡｓｎ、またはＣ末端のアミノ酸残基に隣接するＡｓｎに、Ｎ‐結合型糖鎖が結合していることが好ましい。そのため、プロテアーゼ消化による試料調製では、Ｃ末端付近のＡｓｎに糖鎖が結合した糖ペプチド断片が生成されることが好ましい。換言すれば、本発明においては、試料調製の際に、Ｃ末端付近のＡｓｎに糖鎖が結合した糖ペプチドが生成されるように、プロテアーゼが選択されることが好ましい。

【0045】

プロテアーゼは、ペプチドのアミノ酸配列を考慮して選択される。例えば、上述のアスパラギンエンドペプチダーゼを単独で用いることにより、Ｃ末端のＡｓｎに糖鎖が結合している糖ペプチドが得られる。また、糖鎖が結合したＡｓｎのＣ末端側に隣接してＡｒｇまたはＬｙｓが存在する場合は、トリプシンを単独で用いることにより、Ｃ末端のアミノ酸残基に隣接するアスパラギン残基に糖鎖が結合している糖ペプチドが得られる。

【0046】

また、試料調製に用いるプロテアーゼとして、エンドペプチダーゼとエキソペプチダーゼの両方を用いてもよい。例えば、エンドペプチダーゼ単独では、Ｃ末端付近のＡｓｎに糖鎖が結合した糖ペプチドを得ることが困難な場合は、エンドペプチダーゼとエキソペプチダーゼの両方を用いることで、Ｃ末端付近のＡｓｎに糖鎖が結合した糖ペプチドを生成させることができる。エンドペプチダーゼによる消化とエキソペプチダーゼによる消化は、両方を同時に行ってもよく、順次行ってもよい。また、プロナーゼＥのような、エキソペプチダーゼとエンドペプチダーゼの混合物を用いることもできる。

【0047】

プロテアーゼ消化の条件は特に限定されず、使用するプロテアーゼに応じた適宜のプロトコールが採用される。例えば、プロテアーゼの至適ｐＨ近傍に調製された緩衝溶液中で、通常３７℃程度の温度で、４時間〜２０時間程度インキュベートすることが好ましい。プロテアーゼ消化に先立って、試料中のタンパク質およびペプチドの変性処理やアルキル化処理が行われてもよい。変性処理やアルキル化処理の条件は特に限定されず、公知の条件が適宜に採用される。

【0048】

プロテアーゼ消化後の糖ペプチド試料は、必要に応じて、精製、脱塩、可溶化、濃縮、乾燥等の処理が行われても良い。これらの処理は、公知の方法を利用して行うことができる。特に、複数の糖ペプチドが含まれる試料や、他のペプチドとの混合物等の複雑な試料の分析を行う場合は、質量分析に供する前に、液体クロマトグラフ（liquid chromatography: LC）や、固相抽出（solid-phase extraction: SPE）等により、糖ペプチドを分離・濃縮することが好ましい。

【0049】

ＬＣにより試料の分離を行う場合、質量分析の前段としてＬＣを備えるＬＣ／ＭＳを用い、ＬＣからの溶出液を直接イオン化しイオン開裂に供しても良い。また、ＬＣからの溶出液を一度分取してから、質量分析に供してもよい。ＬＣのカラムやＳＰＥの担体は特に限定されず、ペプチドの分析に一般的に用いられるＣ３０，Ｃ１８，Ｃ８，Ｃ４等の疎水カラムや、親水性アフィニティークロマトグラフィー用の担体等を適宜に選択して用いることができる。また、糖ペプチドの異性体を分離する目的で、カーボンカラムやカーボン担体が用いられてもよい。

【0050】

［質量分析］
糖ペプチド試料は、多段階質量分析に供される。多段階質量分析の２段階目（ＭＳ^２）以降は、フラグメントイオンの開裂を生じさせる分析法であり、イオン開裂法は、ポストソース型とインソース型に分類される。ポストソース型のイオン開裂法としては、ポストソース分解(Post Source Decay; PSD)、衝突誘起解離(Collision Induced Dissociation; CID)、赤外多光子解離(infrared multiphoton dissociation; IRMPD)、表面誘起解離(surface-induced dissociation; SID)、および光誘起解離(photo-induced dissociation; PID)等が挙げられる。また、電子捕獲解離(electron-capture dissociation; ECD)、電子移動解離(electron-transfer dissociation; ETD) 、電子脱離解離(electron-detachment dissociation; EDD)およびそれらに準じる奇数電子誘発型の解離技術が用いられても良い。ＭＳ^３分析により糖ペプチドの構造解析を行う場合は、ＭＳ^２およびＭＳ^３におけるイオン開裂が、衝突誘起解離(collision induced dissociation; CID)、ならびに赤外多光子解離(infrared multiphoton dissociation; IRMPD)およびこれに準ずる振動励起を伴うイオン活性化法であることが好ましい。ＣＩＤやＩＲＭＰＤによるイオン開裂を実施可能な質量分析装置としては、衝突室、又は衝突室の機能を持つ四重極もしくはイオントラップを有する質量分析装置が挙げられる。具体的には、イオントラップ型質量分析計、二重収束型質量分析計、三連四重極型質量分析計、四重極飛行時間型質量分析計、四重極−イオントラップ型質量分析計、四重極−フーリエ変換型質量分析計、四重極−オービトラップ型質量分析計、イオントラップ−飛行時間型質量分析計、飛行時間型−飛行時間型質量分析計等が挙げられる。

【0051】

なお、ＭＳ^ｎ（ｎは４以上）の多段階質量分析が行われる場合は、（ｎ−２）段階目あるいはそれよりも前の段階のＭＳにおいて、ペプチド部分を特異的に開裂させる開裂法を用いることも好ましい。例えば、ＭＳ^２において、電子脱離解離(electron-detachment dissociation; EDD)のように、ペプチド部分を特異的に開裂させる開裂法を採用することにより、ペプチドのＣ末端付近のＡｓｎに糖鎖が結合した糖ペプチドの負イオン由来のフラグメントイオンが得られる。この場合は、Ｃ末端付近のＡｓｎに糖鎖が結合した糖ペプチドの負イオンをＭＳ^２プリカーサとしてＭＳ^２分析を行う場合と同様のフラグメントイオンが得られ、分析精度の向上が期待できる（詳細後述）。

【0052】

インソース開裂（in-source dissociation; ISD）としては、イオン化の際に用いるイオン化補助物質（例えばＭＡＬＤＩ法の際のマトリックス等）との相互作用に基づいて開裂させる方法、イオン化の際に用いるレーザーや電圧の付加を高めることによって開裂を誘発する方法、イオン化直後にイオン化室内で残存ガスとの衝突により開裂を誘発する方法等が挙げられる。ＩＳＤではイオン化の際に１段階でフラグメントイオンが生じる。

【0053】

上記の中でも、ＭＡＬＤＩ法の際のマトリックスをイオン化及び開裂補助物質とするＭＡＬＤＩ−ＩＳＤ法では、マトリックスを選択することにより、糖ペプチドのペプチド部分を特異的に開裂させることができる。そのため、ＭＡＬＤＩ−ＩＳＤ法等では、イオン化と略同時に生じる開裂によって、Ｃ末端付近のＡｓｎに糖鎖が結合した糖ペプチド由来の負イオン、すなわち、Ｃ末端付近のＡｓｎに糖鎖が結合した糖ペプチドの負イオンをＭＳ^２プリカーサとしてＭＳ^２分析を行う場合と同様のフラグメントイオンが得られる場合があり、分析精度の向上が期待できる（詳細後述）。

【0054】

ＩＳＤを実施する場合、上記の衝突室または衝突室の機能を有する質量分析装置に加えて、四重極型、飛行時間型質量分析計、磁場型質量分析計等のように衝突室の機能を持たない質量分析計を用いても良い。

【0055】

ＩＳＤにより生じたフラグメントイオンをプリカーサとして、さらにイオン開裂を生じさせることもできる。この場合、インソース型とポストソース型を組み合わせても良い。前述のように、ＩＳＤによるイオン化および開裂で得られたフラグメントイオンをプリカーサイオンとして、これをさらに開裂させる場合は、ＭＳ^３分析であるとみなす。

【0056】

＜ＭＳ^１分析＞
糖ペプチドの質量分析においては、ＭＳ^１分析ステップにおいて、糖ペプチドが負イオン化され、ＭＳ^１分析が実行される。第一質量分析（ＭＳ^１）のイオン化法としては、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）やナノエレクトロスプレーイオン化（ｎａｎｏ−ＥＳＩ）法等が挙げられる。特に、ＭＡＬＤＩ法が好適である。

【0057】

＜ＭＳ^２プリカーサ選定、およびＭＳ^２分析＞
次いで、ＭＳ^２分析（ＭＳ^ｎ−１分析ステップ）において、ＭＳ^１で得られた負イオンがＣＩＤやＩＲＭＰＤ等により開裂され、ＭＳ^２分析が実行される。ＭＳ^２分析では、ＭＳ^１で得られた全てのピークを網羅的にＭＳ^２に供することもできるが、ＭＳ^１スペクトルに現れる糖ペプチド由来の負イオンをＭＳ^２プリカーサとして選定し、選定された負イオンを選択的にＭＳ^２に供することが好ましい。

【0058】

分析対象の糖ペプチドの質量が既知の場合は、当該質量から算出される負イオンのｍ／ｚに基づいて、ＭＳ^２プリカーサを選定できる。また、ほぼ全てのＮ‐結合型糖鎖は、還元末端に、Manα1-6（Manα1-3）Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcの構造（トリマンノシルコア）を有しており、トリマンノシルコアの非還元末端に付加する単糖の種類も有限であるため、Ｎ‐結合型糖鎖が採り得る質量は有限である。そのため、糖鎖部分の質量が未知の場合でも、［ペプチド部分の質量＋Ｎ‐結合型糖鎖残基の採り得る質量］に基づいて、糖ペプチドの負イオンが採り得るｍ／ｚの候補を算出することができ、これらの候補と、ＭＳ^１スペクトルに現れるピークのｍ／ｚとを照合することにより、ＭＳ^２プリカーサを選定できる。なお、Ｎ‐結合型糖鎖残基の採り得る質量は、既存の糖鎖データベース等を利用して算出できる。

【0059】

本発明においては、Ｃ末端付近のＡｓｎに糖鎖が結合した糖ペプチドの負イオンが、ＭＳ^２プリカーサとして選定されることが好ましい。中でも、選定されるＭＳ^２プリカーサは、ペプチドのＣ末端のＡｓｎ、またはＣ末端のアミノ酸残基に隣接するＡｓｎに、Ｎ‐結合型糖鎖が結合していることが特に好ましい。

【0060】

本発明者は、Ｎ‐結合型糖鎖を有する糖ペプチドの負イオンＭＳ^２分析において、質量電荷比ｍ／ｚ＝（Ｇ＋９７−ｚ）／ｚのフラグメントイオンが生成しており、特に、ｚ＝１、すなわちｍ／ｚ＝Ｇ＋９６のフラグメントイオンの生成量が多い傾向があることを見出した。ここで、Ｇは糖鎖残基の質量であり、ｚはイオンの電荷数である。さらに、このｍ／ｚ＝（Ｇ＋９７−ｚ）／ｚのフラグメントイオンをプリカーサとしてＭＳ^３分析を行った場合、ペプチド部分の構造に関係なく、糖鎖構造が同一であれば、同一のＭＳ^３ピークを有するＭＳ^３スペクトルが得られることが見出された。また、糖鎖の骨格が同一であり、還元末端のＮ‐アセチルグルコサミン（GlcNAc）にコアフコースが付加している糖鎖とコアフコースが付加していない糖鎖とでは、ＭＳ^２で検出される、ｍ／ｚ＝（Ｇ＋９６）のフラグメントイオン（ただし、ｚ＝１である）のｍ／ｚの差が１４６である。この差は、フコース（分子量１６４）から水分子が脱離したフコース残基の質量と同一であり、ｍ／ｚ＝（Ｇ＋９６）のフラグメントイオンは、コアフコースの有無も含めた完全な糖鎖構造を反映している。

【0061】

（フラグメントの推定構造）
現段階では、ｍ／ｚ＝（Ｇ＋９７−ｚ）／ｚのフラグメントイオンの分子構造は明らかではないが、このフラグメントイオンは糖鎖残基よりも質量が大きく、かつペプチド部分のアミノ酸配列に影響を受けないことから、Ｎ‐結合型糖鎖残基と、糖鎖が結合しているアスパラギン（分子量：１３２）の一部とを含む負イオンと考えられる。アスパラギンの分子量が１３２であることから、Ｇ＋９７は、Ｇ＋Ａｓｎ−３５と表すことができ、質量３５に相当する化学種がＡｓｎから脱離したものであると考えられる。アスパラギンの化学式を考慮すると、ＯＮＨ_５＝３５が脱離している可能性が高く、ｍ／ｚ＝（Ｇ＋９７−ｚ）／ｚのフラグメントイオンは、アスパラギンからＨ_２ＯおよびＮＨ_３が脱離した化学構造と糖鎖残基とを含むものと推定される。なお、電荷数ｚの負のフラグメントイオンでは、ｚ個のプロトンが脱離しているため、フラグメントイオンの質量電荷比ｍ／ｚは（Ｇ＋９７−ｚ）／ｚとなり、ｚ＝１の場合、ｍ／ｚ＝Ｇ＋９６である。

【0062】

Ｇ＋９７（＝Ｇ＋Ａｓｎ−３５）の質量を有する分子構造としては、例えば、下記式で表されるように、マレイミドの窒素原子に糖鎖残基が付加した構造が推定される。

【0063】

【化1】

【0064】

タンパク質の翻訳後修飾では、以下の化学式で表されるように、ＡｓｎのＣ末端側のペプチド結合を構成する窒素原子の不対電子がＡｓｎの側鎖を求核攻撃し、スクシンイミド中間体を経てアスパラギン酸（Ａｓｐ）を生じることが知られている（生化学的脱アミド）。

【0065】

【化2】

【0066】

ペプチドの負イオン開裂では、以下の化学式で表されるように、Ａｓｐの不斉炭素とアミノ基との間のＣ−Ｎ結合における優先的な開裂が生じ、ＡｓｐのＮ末端側のペプチド（下記式のｃ）が脱離することが知られている。また、この開裂に伴って、ＡｓｐのＣ末端側のペプチド結合を構成する窒素原子の不対電子がＡｓｐの側鎖を求核攻撃し、Ｎ‐置換マレイミド構造を有するｚ−Ｈ_２Ｏタイプの負イオンが生成することが知られている。

【0067】

【化3】

【0068】

上記のように、ＡｓｎおよびＡｓｐの側鎖は、いずれも窒素原子の求核反応により五員環イミド構造を生じやすいこと、および負イオン開裂の際に、五員環イミド（マレイミド）構造とともにＮ末端側での開裂が生じやすいことが知られている。これらを勘案すると、糖鎖が付加したＡｓｎ（（ｇ）Ａｓｎ）を含む糖ペプチドの負イオンＭＳ^２においても、Ａｓｐを含むペプチドの負イオン開裂の際と同様に、ＡｓｎのＣ−Ｎ結合での開裂が生じ、以下の推定メカニズムで表されるように、ｚ−Ｈ_２Ｏタイプの負イオンが生成すると推定される。

【0069】

【化4】

【0070】

上記のように、Ａｓｎの不斉炭素とアミノ基との間で開裂が生じるとの推定メカニズムによれば、ｍ／ｚ＝（Ｇ＋９７−ｚ）／ｚのフラグメントイオンにおいて、アスパラギンから１個の窒素原子が脱離していることを合理的に説明できる。また、糖鎖が結合したＡｓｎのＮ末端側のペプチドのアミノ酸配列とは無関係に、同一の化学種（負イオン）が生じることも合理的に説明可能である。

【0071】

なお、上記の推定メカニズムでは、糖ペプチドのＣ末端アミノ酸として、糖鎖の付加したＡｓｎ（（ｇ）Ａｓｎ）が示されているが、本発明者の検討によれば、（ｇ）ＡｓｎのＣ末端側にアミノ酸を有する糖ペプチドの負イオンのＭＳ^２においても、ｍ／ｚ＝（Ｇ＋９７−ｚ）／ｚのフラグメントイオンが検出されることが確認されている（例えば、図７（Ａ）参照）。ペプチドの負イオン開裂では、上述のようにＡｓｎのＣ−Ｎ結合で選択的な開裂が生じやすいことに加えて、ペプチドのＣ末端アミノ酸のＮ末端側のペプチド結合での開裂が生じ、Ｃ末端アミノ酸残基の脱離が生じることも報告されている（Journal of Mass Spectrometry, 41 (2006), pp. 939-949）。そのため、（ｇ）ＡｓｎのＣ末端側にアミノ酸を有する糖ペプチドの負イオンがＭＳ^２プリカーサである場合は、ＭＳ^２の負イオン開裂によって、先に、Ｃ末端側のアミノ酸の脱離が生じてＣ末端が（ｇ）Ａｓｎとなり、その後、上記推定メカニズムと同様に、ｍ／ｚ＝（Ｇ＋９７−ｚ）／ｚのフラグメントイオンが生成する等のメカニズムが考えられる。

【0072】

なお、上記報告では、Ｃ末端アミノ酸が、酸性アミノ酸（ＧｌｕもしくはＡｓｐ）またはＳｅｒである場合に、Ｃ末端の脱離が顕著であることが報告されている。一方、本発明における糖ペプチドの質量分析方法では、後の実施例で示すように、（ｇ）ＡｓｎのＣ末端側に隣接するアミノ酸が、塩基性アミノ酸であるＬｙｓの場合にもＣ末端アミノ酸の脱離が生じることが示されている。そのため、ＭＳ^２プリカーサが、（ｇ）ＡｓｎのＣ末端側にアミノ酸を有する糖ペプチドの負イオンである場合、（ｇ）ＡｓｎのＣ末端側のアミノ酸が、Ｇｌｕ，Ａｓｐ，Ｓｅｒ以外でも、ｍ／ｚ＝（Ｇ＋９７−ｚ）／ｚのＭＳ^２ピークが検出されることがわかる。

【0073】

前述のように、（ｇ）Ａｓｎの不斉炭素とアミノ基のＣ−Ｎ結合の開裂は、位置選択的（アミノ酸選択的）であり、（ｇ）ＡｓｎのＮ末端側に多数のアミノ酸を有するペプチドでも、当該開裂が生じると考えられる。一方、（ｇ）ＡｓｎのＣ末端側の脱離は、Ｃ末端アミノ酸からの順次脱離であると考えられる。そのため、ＭＳ^２プリカーサは、（ｇ）ＡｓｎのＮ末端側に多数のアミノ酸を有していてもよいが、（ｇ）ＡｓｎのＣ末端側のアミノ酸残基数が多くなると、ｍ／ｚ＝（Ｇ＋９７−ｚ）／ｚのＭＳ^２ピーク強度が急激に小さくなる傾向がある。したがって、本発明の分析方法におけるＭＳ^２プリカーサは、Ｃ末端付近に（ｇ）Ａｓｎを有することが好ましく、Ｃ末端アミノ酸またはＣ末端のアミノ酸に隣接するアミノ酸が（ｇ）Ａｓｎであることが特に好ましい。なお、ＭＳ^ｎ分析（ｎは４以上）により糖ペプチドの糖鎖構造の解析が行われる場合は、ＭＳ^ｎ−１プリカーサが、Ｃ末端付近に（ｇ）Ａｓｎを有することが好ましい。

【0074】

＜ＭＳ^３プリカーサ選定、およびＭＳ^３分析＞
ＭＳ^３分析（ＭＳ^ｎ分析ステップ）では、ＭＳ^２で得られた負のフラグメントイオンがＣＩＤやＩＲＭＰＤ等により開裂され、ＭＳ^３分析が実行される。ＭＳ^３分析は、糖ペプチドにおける糖鎖構造の解析を目的として行われる。そのため、ＭＳ^２ピークの中から、質量電荷比ｍ／ｚ＝（Ｇ＋９７−ｚ）／ｚを有するフラグメントイオンをＭＳ^３プリカーサとして選定した上で、ＭＳ^３分析が行われる。

【0075】

糖鎖の質量（または分子量）が既知の場合は、Ｇ＋９６（電荷数ｚ＝１の場合）、（Ｇ＋９５）／２（ｚ＝２の場合）、（Ｇ＋９４）／３（ｚ＝３の場合）等のｍ／ｚを有するＭＳ^３プリカーサ候補を容易に選定できる。糖鎖の質量（または分子量）が未知の場合は、（Ｇ＋９７−ｚ）／ｚの取り得る値を推測することにより、ＭＳ^３プリカーサ候補を選定できる。

【0076】

（Ｇ＋９７−ｚ）／ｚの取り得る値は、例えば、既知の糖鎖の質量から算出できる。この場合、ＭＳ^２スペクトルのピークリストと、既知の糖鎖データベースに格納された各糖鎖の質量Ｓｘとを照合して、ＭＳ^２スペクトルのピークリストの中から、（Ｓｘ＋７９−ｚ）／ｚの質量電荷比を有する一次フラグメントイオンをＭＳ^３プリカーサ候補として選定できる。なお、糖鎖残基の質量は、糖鎖を構成する単糖残基の質量の総和であり、糖鎖の質量から水一分子の質量を引いた値であるため、糖鎖の質量をＳとした場合、（Ｇ＋９７−ｚ）／ｚ＝（Ｓ＋７９−ｚ）／ｚである。

【0077】

また、ＭＳ^２スペクトルのピークリストから、質量電荷比の差が所定値である２つのピークを抽出することにより、ＭＳ^３プリカーサを選定することもできる。糖ペプチドの負イオンＭＳ^ｎ（ｎは２以上）では、特定のフラグメントイオンが大きなピーク強度で検出される傾向があることが知られている。本発明の分析方法においても、ＭＳ^２スペクトルにおいて、ｍ／ｚ＝（Ｇ＋９７−ｚ）／ｚのフラグメントイオン以外に、従来知られているのと同様の糖鎖由来のフラグメントイオン（^２，４Ａ_Ｒ，^２，４Ａ_Ｒ−１，Ｂ_Ｒ−１等）が検出される。Ｎ‐結合型糖鎖の非還元末端側の構造は多様性を有しているが、前述のように、ほぼ全てのＮ‐結合型糖鎖の還元末端は、トリマンノシルコアであり、コアフコースの有無のみが異なる。そのため、ｍ／ｚ＝（Ｇ＋９７−ｚ）／ｚのフラグメンイオントと、^２，４Ａ_Ｒ，^２，４Ａ_Ｒ−１，Ｂ_Ｒ−１等の所定の糖鎖由来のフラグメントイオンのｍ／ｚの差が採り得る値は一定である。

【0078】

例えば、負イオンＭＳ^ｎ（ｎは２以上）では、^２，４Ａ_Ｒフラグメントイオンの強いピークが現れることが知られている。^２，４Ａ_Ｒフラグメントイオンおよびｍ／ｚ＝Ｇ＋９６のフラグメントイオンの両者がいずれも１価の負イオンである場合、これらのｍ／ｚの差は、糖鎖の還元末端単糖にコアフコースを有していない場合は２４０、コアフコースを有している場合は３８６である。そのため、ＭＳ^２ピークリストの中から、ｍ／ｚの差が、２４０あるいは３８６である２つのピークを抽出し、これら２つのピークのうちｍ／ｚの大きい方のフラグメントイオンがｍ／ｚ＝（Ｇ＋９７−ｚ）／ｚ（ただし、ｚ＝１）であると判断して、ＭＳ^３プリカーサ候補として選定できる。

【0079】

なお、上記では、ｍ／ｚ＝（Ｇ＋９７−ｚ）／ｚのＭＳ^３プリカーサが１価の負イオン（ｚ＝１）である場合を例示したが、ＭＳ^３プリカーサは２価以上の負イオンであってもよい。また、ＭＳ^３プリカーサ選定の基準となる^２，４Ａ_Ｒ等の糖鎖由来フラグメントイオンも、２価以上の負イオンであってもよい。フラグメントイオンの電荷数が２以上の場合は、ＭＳ^３プリカーサ選定のための「予め設定された１以上の所定値」は、電荷数を考慮して設定する必要がある。

【0080】

例えば、抽出された２つのフラグメントイオンのｍ／ｚが、それぞれａ_１およびａ_２であり、前者の電荷数がｚ_１、後者の電荷数がｚ_２である場合、それぞれのフラグメントの負イオン化（脱プロトン化）前の化学種の質量を、Ａ_１およびＡ_２とすると、
ａ_１＝（Ａ_１−ｚ_１）／ｚ_１ …（式１）
ａ_２＝（Ａ_２−ｚ_２）／ｚ_２ …（式２）
と表すことができる。

【0081】

これら２つのフラグメントイオンが、ｍ／ｚ＝（Ｇ＋９７−ｚ）／ｚのフラグメントイオンと、^２，４Ａ_Ｒフラグメントイオンの組み合わせである場合、Ａ_１とＡ_２の差は、２４０（コアフコース無しの場合）または３８６（コアフコース有の場合）に等しい（ただし、Ａ_１＞Ａ_２）。

【0082】

上記（式１）および（式２）を整理すると、
Ａ_１＝ａ_１ｚ_１＋ｚ_１ …（式１ａ）
Ａ_２＝ａ_２ｚ_２＋ｚ_２ …（式２ａ）
であるから、
Ａ_１−Ａ_２＝ａ_１ｚ_１+ｚ_１−ａ_２ｚ_２−ｚ_２ …（式３）
となる。

【0083】

これらの関係から、Ａ_１−Ａ_２の値（上記式３の左辺）が、２４０または３８６に等しいことは、抽出された２つのピーク（ｍ／ｚ＝ａ_１およびｍ／ｚ＝ａ_２）に関して、ａ_１ｚ_１+ｚ_１−ａ_２ｚ_２−ｚ_２の値（上記式３の右辺）が、２４０または３８６となるｚ_１およびｚ_２（いずれも自然数）の組合せが存在することと等価であるといえる。すなわち、ａ_１ｚ_１＋ｚ_１−ａ_２ｚ_２−ｚ_２の値が２４０または３８６となるｚ_１とｚ_２の組合せが存在することを基準として、ＭＳ^３プリカーサ候補の選定を行い得ることが分かる。このような組み合わせが存在する場合に、ｍ／ｚ＝ａ_１＝（Ａ_１−ｚ_１）／ｚ_１のフラグメントイオンを、ＭＳ^３プリカーサ候補として選定できる。

【0084】

なお、^２，４Ａ_Ｒフラグメントイオンは、そのほとんどが１価の負イオンであるため、検出および選定の精度を高めるためには、１価の^２，４Ａ_Ｒフラグメントイオンを基準として、ｍ／ｚの差が、予め設定された１以上の所定値と等しいか否かによって、ＭＳ^３プリカーサ選定が行われることが好ましい。この場合、上記（式２）において、ｚ_２＝１であるから、ａ_１ｚ_１＋ｚ_１−ａ_２の値が、２４１または３８７となる自然数ｚ_１が存在することを基準として、ＭＳ^３プリカーサ候補を選定できる。

【0085】

２つのフラグメントイオンがいずれも１価の負イオンの場合、ｚ_１＝１，ｚ_２＝１であるから、ａ_１−ａ_２の値が２４０または３８６となることを基準として、ＭＳ^３プリカーサ候補が選定される。この場合は、前述のように、ｍ／ｚの大きい方（ｍ／ｚ＝ａ_１）のフラグメントイオンが、ｍ／ｚ＝（Ｇ＋９７−ｚ）／ｚ（ただし、ｚ＝１）であると判断して、ＭＳ^３プリカーサ候補が選定される。

【0086】

ＭＳ^３プリカーサ選定のための「予め設定された１以上の所定値」は、^２，４Ａ_Ｒ以外の糖鎖由来フラグメントイオンを基準として設定することもできる。例えば、^２，４Ａ_Ｒ−１フラグメントイオンとｍ／ｚ＝Ｇ＋９６のフラグメントイオン（いずれも１価の負イオン）のｍ／ｚの差は、糖鎖がコアフコースを有していない場合は４４３、コアフコースを有している場合は５８９である。そのため、ｍ／ｚの差がこれらのいずれかと一致する２つのピークを抽出することによっても、ＭＳ^３プリカーサ候補を選定できる。

【0087】

また、ＭＳ^２スペクトルから、３つ以上のピークを抽出し、各ピークのｍ／ｚの差に基づいてＭＳ^３プリカーサ候補の選定、あるいは絞り込みを行うこともできる。例えば、抽出された３つのピーク（いずれも１価の負イオンフラグメント）のそれぞれのｍ／ｚの差を算出し、ｍ／ｚが最も大きいフラグメントイオンと、ｍ／ｚが２番目に大きいフラグメントイオンのｍ／ｚの差が、２４０または３８６であれば、上述のようにｍ／ｚが最も大きいフラグメントイオンをＭＳ^３プリカーサ候補として抽出できる。

【0088】

ここで、^２，４Ａ_Ｒフラグメントイオンと^２，４Ａ_Ｒ−１フラグメントイオンのｍ／ｚの差は、コアフコースの有無に関わらず２０３である。そのため、抽出された３つのピークのうち、ｍ／ｚが最も大きいフラグメントイオンと、ｍ／ｚが２番目に大きいフラグメントイオンのｍ／ｚの差が、２４０または３８６であり、かつ、ｍ／ｚが２番目に大きいフラグメントイオンとｍ／ｚが最も小さいフラグメントイオンのｍ／ｚの差が２０３であれば、３つのピークが、ｍ／ｚ＝（Ｇ＋９７−ｚ）／ｚのフラグメントイオン、^２，４Ａ_Ｒフラグメントイオンおよび^２，４Ａ_Ｒ−１フラグメントイオンの組み合わせに対応している蓋然性が高いといえる。一方、ｍ／ｚの差が、２４０または３８６である２つのピークが抽出された場合でも、ｍ／ｚの差が２０３である３番目のピークが存在しない場合は、抽出された２つのピークは、ｍ／ｚ＝（Ｇ＋９７−ｚ）／ｚのフラグメントイオンと^２，４Ａ_Ｒフラグメントイオン以外の組み合わせである可能性が高いため、ＭＳ^３プリカーサ候補から除外できる。

【0089】

このように、３つ以上のピークのｍ／ｚの差に基づいてＭＳ^３プリカーサ候補の選定を行うことにより、ＭＳ^３プリカーサ候補の絞り込みを行うことができ、プリカーサ選定の信頼性を高めることができる。なお、３つ以上のピークのｍ／ｚの差に基づいてＭＳ^３プリカーサの選定を行う場合も、３つ以上のピークの中から、２つを抜き出して、そのｍ／ｚの差の算出が行われる。そのため、当該形態は、「２つのピークの抽出結果に基づいてＭＳ^３プリカーサ（ＭＳ^ｎプリカーサ）が選定される」形態に包含される。

【0090】

ＭＳ^３プリカーサの選定において、プリカーサ候補は必ずしも１つに絞り込む必要はない。上記のようなプリカーサ選定方法を単独で、あるいは複数を組み合わせて、ＭＳ^３プリカーサの選定を行った結果として、複数のＭＳ^３プリカーサ候補が選定された場合は、複数のＭＳ^３プリカーサを順次ＭＳ^３分析に供してもよい。

【0091】

選定されたＭＳ^３プリカーサが、ｍ／ｚ＝（Ｇ＋９７−ｚ）／ｚのフラグメントイオンとして適切であるか否かは、そのフラグメントのＭＳ^３スペクトルからも確認することができる。ｍ／ｚ＝（Ｇ＋９７−ｚ）／ｚは、糖鎖の完全な構造を含んでいるため、このフラグメントイオンをＭＳ^３プリカーサとして負イオン開裂させたＭＳ^３スペクトルは、^２，４Ａ_Ｒ等の糖鎖由来フラグメントイオンのピークを含む。そのため、ＭＳ^３スペクトルにこれらの糖鎖由来フラグメントが予想されるｍ／ｚに検出されているか否かにより、ＭＳ^３プリカーサの選定が適切であったか否かを判断できる。

【0092】

例えば、ＭＳ^３プリカーサとそのフラグメントイオンが共に一価のイオンであり、糖鎖がコアフコースを含有している場合は、ＭＳ^３プリカーサよりもｍ／ｚが３８６小さいフラグメントイオン（^２，４Ａ_Ｒ）、ＭＳ^３プリカーサよりもｍ／ｚが４４６小さいフラグメントイオン（Ｂ_Ｒ−１）、ＭＳ^３プリカーサよりもｍ／ｚが５８９小さいフラグメントイオン（^２，４Ａ_Ｒ−１）等の強いピークが、ＭＳ^３スペクトルで検出されることが多い。また、糖鎖がコアフコースを含有していない場合は、ＭＳ^３プリカーサよりもｍ／ｚが２４０小さいフラグメントイオン（^２，４Ａ_Ｒ）、ＭＳ^３プリカーサよりもｍ／ｚが４４３小さいフラグメントイオン（^２，４Ａ_Ｒ−１）等の強いピークが、ＭＳ^３スペクトルで検出されることが多い。

【0093】

このような、ＭＳ^ｎプリカーサとＭＳ^ｎフラグメントイオンのｍ／ｚの差を「ニュートラルロス」と称する場合がある。上記のように、ｍ／ｚ＝（Ｇ＋９７−ｚ）／ｚのフラグメントをＭＳ^３プリカーサとして、ＭＳ^３分析を実行すれば、^２，４Ａ_Ｒ、^２，４Ａ_Ｒ−１、Ｂ_Ｒ−１等の糖鎖由来のフラグメントイオンを生成する場合のニュートラルロスは、糖鎖構造の異同に関わらず普遍的である。そのため、ＭＳ^３スペクトルにおいてこれらのニュートラルロスに相当するピークが検出されているか否かによって、ＭＳ^３プリカーサの選定が適切であったか否かを判断できる。ｍ／ｚ＝（Ｇ＋９７−ｚ）／ｚ以外のフラグメントをプリカーサとしてＭＳ^３分析を実行した場合、ＭＳ^３スペクトルにおいて、これらのフラグメント群は検出されない。あるいは、仮に、これらのフラグメント群が検出されたとしても、（Ｇ＋９７−ｚ）／ｚのｍ／ｚからニュートラルロスを差し引いたｍ／ｚにピークが観測されないため、ＭＳ^３プリカーサの選定が不適切であったと判断できる。この場合は、再度ＭＳ^３プリカーサの選定を実施して、ＭＳ^３分析を実行すればよい。なお、二価の（Ｇ＋９７−ｚ）／ｚから一価の^２，４Ａ_Ｒ、Ｂ_Ｒ−１、^２，４Ａ_Ｒ−１が生成する場合もあるため、プリカーサもしくはフラグメントイオンまたはその両方の電荷数が２以上の場合は、ＭＳ^３プリカーサの選定が適切であったか否かを判断するためのニュートラルロスの値を、電荷数を考慮して設定する必要がある。

【0094】

［糖鎖構造情報の抽出］
本発明の分析方法では、得られた質量分析結果（ＭＳ^１，ＭＳ^２およびＭＳ^３スペクトル）に基づいて、Ｎ‐結合型糖鎖の構造情報が抽出され、糖鎖構造の解析が行われることが好ましい。抽出される糖鎖の構造情報は特に限定されない。

【0095】

例えば、分析前に糖鎖の質量が未知の場合、ＭＳ^２スペクトルから、ｍ／ｚ＝（Ｇ＋９７−ｚ）／ｚのフラグメントイオンのｍ／ｚの値に基づいて、糖鎖残基の質量Ｇを算出できる。糖鎖残基の質量Ｇは、Ｎ‐結合型糖鎖の構造情報の一例である。また、前述のように、ＭＳ^２スペクトルのピークリストに基づいて、所定の糖鎖由来フラグメントイオン（例えば、^２，４Ａ_Ｒ）とｍ／ｚ＝（Ｇ＋９７−ｚ）／ｚのフラグメントイオンのｍ／ｚの差を算出することにより、糖鎖還元末端単糖へのコアフコースの付加の有無を判別できる。

【0096】

なお、フラグメントイオンが２価以上の場合は、ＭＳ^３プリカーサの選定に関して前述したように、ａ_１ｚ_１＋ｚ_１−ａ_２ｚ_２−ｚ_２の値（上記式３の右辺）が、２４０または３８６となるｚ_１およびｚ_２の組合せが存在するか否かによって、糖鎖還元末端単糖へのコアフコースの付加の有無を判別することもできる。また、３つ以上のフラグメントイオン（例えば、ｍ／ｚ＝（Ｇ＋９７−ｚ）／ｚのフラグメントイオン、^２，４Ａ_Ｒフラグメントイオンおよび^２，４Ａ_Ｒ−１フラグメントイオン）を抽出し、それぞれのｍ／ｚの差を算出することにより、コアフコースの有無を判別することもできる。このように、３つ以上のフラグメントイオンのｍ／ｚを基準として判別を行えば、ｍ／ｚ＝（Ｇ＋９７−ｚ）／ｚのフラグメントイオンと^２，４Ａ_Ｒフラグメントイオンの組み合わせ以外に、ｍ／ｚの差が２４０あるいは３８６であるピークの組み合わせが存在する場合等においても、誤判断が抑止され、分析の信頼性を高めることができる。

【0097】

なお、糖鎖（残基）の質量やコアフコース有無等の糖鎖構造情報は、ＭＳ^３分析を実行しない場合でも抽出可能である。また、前述のように、ＭＳ^３分析を実施して、ＭＳ^２スペクトルとＭＳ^３スペクトルとを照合することにより、ｍ／ｚ＝（Ｇ＋９７−ｚ）／ｚのフラグメントイオンが正しく選定されているか否かを確認することができ、ＭＳ^２スペクトルから抽出される糖鎖構造情報の信頼性を高めることができる。

【0098】

ＭＳ^３スペクトルからも、種々の糖鎖構造情報を抽出できる。ＭＳ^２のｍ／ｚ＝（Ｇ＋９７−ｚ）／ｚのフラグメントイオンは、完全な糖鎖残基構造を含んでいるため、これをプリカーサとして得られるＭＳ^３スペクトルは、^２，４Ａ_Ｒ等の糖鎖由来フラグメントイオンをプリカーサとして得られるＭＳ^３スペクトルよりも、多数の糖鎖構造情報（例えばコアフコースの有無に関する情報）を有している場合が多い。さらに、ｍ／ｚ＝（Ｇ＋９７−ｚ）／ｚのフラグメントイオンは、糖ペプチドのペプチド部分のごく一部（糖鎖が結合したアスパラギンの一部）のみを含むため、^２，４Ａ_Ｒ等の糖鎖由来フラグメントイオンを開裂させた場合と同様に、糖鎖構造に関する情報を選択的にかつ精度高く抽出できる。

【0099】

また、ペプチドのＣ末端アスパラギン残基、またはＣ末端のアミノ酸残基に隣接するアスパラギン残基に、Ｎ‐結合型糖鎖が結合している糖ペプチドを、ＭＳ^２プリカーサとして選定すれば、ＭＳ^２スペクトルにおいて、ｍ／ｚ＝Ｇ＋９６（ただし、ｚ＝１）のフラグメントイオンが、^２，４Ａ_Ｒ等の糖鎖由来フラグメントイオンよりも、大きなピーク強度で検出される傾向がある。そのため、ｍ／ｚ＝Ｇ＋９６のフラグメントをＭＳ^３プリカーサとして得られるＭＳ^３スペクトルからは、他の糖鎖由来フラグメントイオンをプリカーサとするＭＳ^３に比して、より精度の高い糖鎖構造情報の抽出が期待できる。

【0100】

＜データベースとの照合による糖鎖構造情報の抽出＞
さらには、ＭＳ^２におけるｍ／ｚ＝（Ｇ＋９７−ｚ）／ｚのフラグメントイオンは、ペプチド部分の糖鎖が結合したアスパラギンの一部のみを含むため、糖ペプチドにおけるＮ‐結合型糖鎖の構造が同一であれば、このフラグメントイオンの化学構造は、ペプチドのアミノ酸配列に依存することなく、同一である。そのため、このフラグメントイオンをＭＳ^３プリカーサとしてＭＳ^３分析を実施した場合は、糖鎖の構造が同一であれば、同一のＭＳ^３スペクトルが得られる。すなわち、本発明の分析方法により得られるＭＳ^３スペクトルは、ペプチド部分の構造に大きな影響を受けないため、ＭＳ^３スペクトルやＭＳ^３ピークリストのデータベース化が容易である。

【0101】

例えば、糖鎖構造が既知である糖タンパク質や糖ペプチドを試料として、ＭＳ^Ｎ分析（Ｎは２以上）を行い、（Ｇｘ＋９７−ｚｘ）／ｚｘの質量電荷比を有するプリカーサイオンを開裂させて得られるフラグメントイオンのＭＳ^Ｎスペクトルを取得し、そのＭＳ^ＮスペクトルやＭＳ^Ｎピークリストをデータベース化することができる。ここで、Ｇｘは既知の糖鎖残基の質量である。ｚｘはプリカーサイオンの電荷数であり、自然数である。

【0102】

このように、（Ｇｘ＋９７−ｚｘ）／ｚｘの質量電荷比を有するプリカーサイオンを開裂させて得られるフラグメントイオンのＭＳ^ＮスペクトルまたはＭＳ^Ｎピークリストをデータベース化しておけば、分析対象の糖ペプチドの質量分析により得られたＭＳ^３スペクトルと、当該データベースとを照合することにより、糖鎖の構造情報の抽出、より具体的には糖鎖構造の同定を行い得る。

【0103】

糖ペプチドのＭＳ^３スペクトル（またはピークリスト）とデータベースに格納されたＭＳ^Ｎスペクトル（またはピークリスト）との照合は、実験者の目視等により実行してもよく、糖鎖構造解析用プログラムを用いて実行してもよい。

【0104】

糖鎖構造の解析を行う糖鎖構造解析システムは、分析データ記憶部とデータベース記憶部とデータ処理部とを備える。糖鎖構造解析用プログラムを用いて、糖ペプチドのＮ‐結合型糖鎖の構造解析（同定）を行う場合、当該プログラムは、データ処理部のコンピュータに、分析データ記憶部のデータとデータベース記憶部のデータとの照合を実行させる。データの照合においては、例えば２つのデータを対比し、両者が一致するか否かの判断、または両者の類似度のスコア付けが実行される。

【0105】

分析データ記憶部には、質量分析により得られた、糖ペプチドのＭＳ^３スペクトルまたはＭＳ^３ピークリストを含むデータが記憶される。分析データ記憶部には、ＭＳ^３のデータに加えて、糖鎖残基の質量やコアフコースの有無等のＭＳ^２分析で得られた情報や、分析情報等が記憶されてもよい。

【0106】

データベース記憶部には、任意の既知のＮ‐結合型糖鎖の質量をＧｘとした場合に、（Ｇｘ＋９７−ｚｘ）／ｚｘの質量電荷比を有するプリカーサイオン（ただし、ｚｘは電荷数であり自然数である）を開裂させて得られるフラグメントイオンの、既知のＭＳ^ＮスペクトルまたはＭＳ^Ｎピークリストを含むデータが記憶される。当該データは、（Ｇｘ＋９７−ｚｘ）／ｚｘの質量電荷比を有するプリカーサを開裂させて得られるフラグメントイオンのＭＳ^Ｎスペクトルまたはピークリストのデータベースから取得できる。データベース記憶部には、ＭＳ^Ｎプリカーサイオン（ＭＳ^Ｎ−１スペクトルのピークに相当）における、Ｎ‐結合型糖鎖の質量Ｇｘや、コアフコースの有無等の情報が記憶されてもよい。

【0107】

図１は、質量分析データとデータベースとを照合して、糖鎖の構造解析を行う方法の一例を示すフローチャートである。まず、質量分析により得られたＭＳ^３の結果が、分析データ記憶部に記憶される（Ｓ１０１）。この際、糖鎖残基の質量Ｇ、あるいは糖鎖の質量Ｓ等の質量に関するデータも分析データ記憶部に記憶されることが好ましい。

【0108】

次いで、データベースに格納されている既知糖鎖残基の質量Ｇｘと、分析データ記憶部に記憶された質量Ｇとを対比し、一致するものが抽出される（Ｓ１０２）。このように、質量に基づいて一次判断を行うことにより、照合の対象を絞り込むことができ、解析精度が高められるとともに、データの処理を簡略化できる。なお、既知の糖鎖のＭＳ^Ｎスペクトルや質量等の情報を格納したデータベースは、プログラムを実行するためのコンピュータ内に予め記憶されていてもよく、記憶媒体や電気通信回線等を通じて外部から取得されてもよい。

【0109】

分析データにおける糖鎖残基の質量Ｇと、既知の糖鎖残基の質量Ｇｘとが一致するもの（すなわち、照合を行うべき糖鎖（残基）の候補）がＫ個抽出され（Ｓ１０３）、各候補（ｋ＝１〜Ｋ）のＭＳ^ＮスペクトルまたはＭＳ^Ｎピークリストのデータが、データベース記憶部に記憶される。既知の糖鎖のＭＳ^ＮスペクトルやＭＳ^Ｎピークリストは、予め分析データ記憶部に記憶されていてもよく、ｋ番目の候補に対応するＭＳ^ＮスペクトルやＭＳ^Ｎピークリストを、その都度データベースから取得して、データベース記憶部に記憶させてもよい。

【0110】

データ処理部において、分析データ記憶部に記憶された糖ペプチドのＭＳ^３スペクトルまたはＭＳ^３ピークリストと、データベース記憶部に記憶されたｋ番目の糖鎖のＭＳ^ＮスペクトルまたはＭＳ^Ｎピークリストとの照合が行われる（Ｓ１１４）。本発明のプログラムは、マススペクトルまたはピークリストの照合を、データ処理部のコンピュータに実行させる。

【0111】

ここでの照合は、例えば、両者が一致するか否か（糖鎖の同一性）の判断、あるいは両者の類似度のスコア付け（Ｓ１１５）である。マススペクトルあるいはピークリストの同一性や類似度は、ピークのｍ／ｚの値や、ピーク強度比に基づいて判断することができ、その方法は特に制限されない。その後、必要に応じて照合結果（例えば類似度のスコア）が、任意の記憶部に記憶される（Ｓ１１６）。

【0112】

ｋ＝１番目からＫ番目までのすべての糖鎖（残基）の候補に対して、この照合（Ｓ１１４〜Ｓ１１８）が行われた後、ディスプレイや印刷媒体等の表示部や、適宜の記憶部に、照合結果が出力される（Ｓ１２２）。類似スコア等の解析結果は、必要に応じてスコア順等の順番に並べ替えを行った後（Ｓ１２１）、データ出力が行われる（Ｓ１２２）。

【0113】

なお、図１および上記の説明は、糖鎖構造解析用プログラムを用いた、Ｎ‐結合型糖鎖の構造解析（同定）の形態の一例を示すものである。糖ペプチドの質量分析により得られたＭＳ^３データと、糖ペプチド由来の（Ｇ＋９７−ｚ）／ｚの質量電荷比を有する負のフラグメントイオンをプリカーサとして、ＭＳ^３分析を実行することにより取得されたＭＳ^ＮスペクトルまたはＭＳ^Ｎピークリストとを照合することにより、糖鎖の同定を行う方法は上記に限定されない。

【0114】

図１では、予め質量が一致するか否かを基準として、照合を行う糖鎖の数の絞り込みを行っているが、データベースに格納されている全ての糖鎖のＭＳ^Ｎと分析により得られたＭＳ^３との対比が行われてもよい。また、図１では、ｋ＝１番目からＫ番目の候補の全てに対して類似度のスコア付けが行われているが、所定のスコアを超える照合結果が得られた時点で、照合を終了してもよい。データベースに格納されている糖鎖と、分析対象の糖鎖とが一致するか否かの判断により、照合が行われる場合は、ｋ＝ｘ番目の候補が一致すると判断された段階で、照合を終了してもよい。

【0115】

上記では、糖ペプチドの分析により得られたＭＳ^３スペクトルと、予め測定された糖鎖のＭＳ^Ｎスペクトルとの照合による糖鎖の同定方法について説明したが、既存の糖鎖構造データベースを基に、生成し得る糖鎖の理論フラグメントの仮想ＭＳ^Ｎスペクトルや、仮想ＭＳ^Ｎピークリストとの照合により、分析データから糖鎖構造を同定する方法も採用し得る。

【0116】

仮想ＭＳ^ＮスペクトルやＭＳ^Ｎピークリストは、任意の糖鎖データベースに格納されている糖鎖構造に基づいて計算することができる。例えば、質量がＳｘであるＮ‐結合型糖鎖の構造から、上記の推定メカニズムに記載されているような、マレイミドの窒素原子に糖鎖残基が付加したｚ_１−Ｈ_２Ｏ化学種を生成させる。この化学種の脱プロトンにより得られる仮想負イオンは、（Ｓｘ＋７９−ｚｘ）／ｚｘの質量電荷比を有する。なお、ｚｘは仮想負イオン（フラグメントイオン）の電荷数である。

【0117】

この仮想負イオンをＭＳ^Ｎプリカーサとして開裂させた場合に生じる理論フラグメントは、種々の手法（理論フラグメント予測プログラムの利用等）により計算することができ、理論フラグメントのリストから、仮想ＭＳ^Ｎスペクトまたは仮想ＭＳ^Ｎスペクトルを生成できる。

【0118】

仮想ＭＳ^Ｎスペクトルまたは仮想ＭＳ^Ｎピークリストと、分析により得られたＭＳ^３スペクトルとの照合は、実験者の目視等により実行してもよく、糖鎖構造解析用プログラムを用いて実行してもよい。

【0119】

糖鎖構造解析用プログラムが用いられる場合、糖鎖構造解析システムのデータベース記憶部には、（Ｓｘ＋７９−ｚｘ）／ｚｘの質量電荷比を有するフラグメントイオンの仮想ＭＳ^Ｎスペクトルまたは仮想ＭＳ^Ｎピークリスト含むデータが記憶される。データ処理部のコンピュータにより、分析データ記憶部に記憶されたＭＳ^３スペクトルまたはＭＳ^３ピークリストを含むデータと、データベース記憶部に記憶されたデータとの照合が行われる。糖鎖構造解析用プログラムはコンピュータに上記の照合を実行させる。この場合における照合は、上記の図１の例と同様であり、例えば、２つのデータの対比により、両者が一致するか否かの判断や両者の類似度のスコア付けが行われる。

【0120】

図２は、このプログラムを用いて、質量分析データと仮想ＭＳ^Ｎとを照合して、糖鎖の構造解析を行う方法の一例を示すフローチャートである。図２のフローチャートは図１と類似であるため、以下では、図１と図２で共通する部分の説明は省略する。

【0121】

質量分析により得られたＭＳ^３の結果が、分析データ記憶部に記憶される（Ｓ２０１）。糖鎖残基の質量Ｇと、糖鎖データベースにおける糖鎖の質量Ｓｘとを対比し、両者の差が１８（糖鎖残基で脱離した水分子の質量）に等しいものが抽出される（Ｓ２０２）。なお、糖鎖データベースにおける糖鎖の質量Ｓｘに基づいて糖鎖残基の質量Ｇｘを算出し、これと質量分析により得られた糖鎖残基の質量Ｇとを対比して、一致するものを抽出してもよい。

【0122】

質量が一致する糖鎖（残基）の候補がＫ個抽出され（Ｓ２０３）、各候補（ｋ＝１〜Ｋ）の仮想ＭＳ^Ｎスペクトルまたは仮想ＭＳ^Ｎピークリストのデータが、データベース記憶部に記憶される。データ処理部では、分析データ記憶部に記憶された糖ペプチドのＭＳ^３スペクトルまたはＭＳ^３ピークリストと、データベース記憶部に記憶されたｋ番目の糖鎖の仮想ＭＳ^３スペクトルまたは仮想ＭＳ^３ピークリストとの照合が行われる（Ｓ２１３）。照合の前に、糖鎖の仮想負イオンから、仮想ＭＳ^ＮスペクトルまたはＭＳ^Ｎピークリストが生成される（Ｓ２１２）。

【0123】

なお、図２では、質量ＳｘがＧ＋１８と一致する糖鎖を抽出し（Ｓ２０２）、抽出された糖鎖構造から、都度、仮想ＭＳ^Ｎを生成させるフローが示されているが、仮想ＭＳ^Ｎスペクトルや仮想ＭＳ^Ｎピークリストは、任意の糖鎖データベースから予め生成させておき、データベース化しておいてもよい。図２のフローにおいて、データの照合方法、および照合後のフローは、図１の場合と同様である。

【0124】

［質量分析装置］
本発明の分析方法は、上記のプログラム、あるいはその他のデータ照合手段を備える糖ペプチドの糖鎖構造解析用質量分析装置を用いて実施することもできる。この質量分析装置は、質量分析部、質量分析部で得られた分析データが記憶される分析データ記憶部、既存の糖鎖構造データベースから得られる構造情報が記憶されるデータベース記憶部、および分析対象の糖ペプチドの糖鎖構造の同定を行うデータ処理部を備える。

【0125】

質量分析部は、質量分離手段およびイオン開裂手段を備える。質量分離手段は、質量電荷比に基づいて、イオンを分離する。イオン開裂手段は、選定されたイオンを、ＣＩＤやＩＲＭＰＤなどの手法により開裂させ、フラグメントイオンを生成させる。この質量分析部において、分析対象の糖ペプチドのＭＳ^３分析が行われる。

【0126】

データ処理部はコンピュータを備える。このコンピュータは、質量分析部における分析を制御するためのコンピュータと同一でもよい。データ処理部は、分析データ記憶部に記憶されている分析データと、データベース記憶部に記憶されているＭＳ^ｎスペクトルまたはＭＳ^ｎピークリストとを照合することにより、糖鎖構造の同定を行い得るように構成されている。

【0127】

データ処理部で、糖鎖構造の同定を行うためのプログラムは、先に説明したように、既存のデータベース等から得られるＭＳ^ＮスペクトルやＭＳ^Ｎピークリストと、質量分析結果との照合を、コンピュータに実行させる。なお、ここでの、ＭＳ^ＮスペクトルやＭＳ^Ｎピークリストは、計算により生成された仮想ＭＳ^ＮスペクトルまたはＭＳ^Ｎピークリストでもよい。

【0128】

上記プログラムや、糖鎖データベース、あるいは糖鎖のＭＳ^Ｎスペクトルデータベース等は、質量分析部とは別個に提供されてもよく、例えば、記憶媒体に記憶された状態で入手することや、インターネット等の通信手段を介して入手することができる。

【0129】

［ｎが４以上の場合のＭＳ^ｎ分析］
以上、ＭＳ^１で負イオン化された糖ペプチドを、ＭＳ^２で開裂させ、ＭＳ^２スペクトルにおける糖ペプチドの負イオン由来のフラグメントイオンの中から、（Ｇ＋９７−ｚ）／ｚの質量電荷比を有するフラグメントイオンをＭＳ^３プリカーサとして選定する場合、すなわち、ｎ＝３のＭＳ^ｎ分析を中心に、本発明の実施形態を説明した。なお、糖ペプチドの負イオン由来のフラグメントイオンの中から、（Ｇ＋９７−ｚ）／ｚの質量電荷比を有するフラグメントイオンをプリカーサとしてＭＳ^ｎ分析を実行することによる糖ペプチドの分析は、ｎが４以上のＭＳ^ｎ分析にも適用できる。

【0130】

例えば、ＭＳ^２で得られた糖ペプチドの負イオン由来のフラグメントイオンを、ＭＳ^３（ＭＳ^ｎ−１）で開裂させ、ＭＳ^３で得られた（Ｇ＋９７−ｚ）／ｚの質量電荷比を有するフラグメントイオンをプリカーサとしてＭＳ^４（ＭＳ^ｎ）分析が行われてもよい。この場合、ＭＳ^２のイオン開裂法として、ＥＤＤのように、ペプチド部分を優先的に開裂し得る開裂法を採用すれば、ＭＳ^２プロダクトイオンとして、ペプチドのＣ末端付近のＡｓｎに糖鎖が結合した糖ペプチドの負イオン由来のフラグメントイオンを得ることもできる。このように、質量分析のイオン開裂によりペプチド部分を開裂させれば、試料調製（プロテアーゼ消化）によって、Ｃ末端付近のアスパラギンに糖鎖が結合したペプチド断片が得られていない場合でも、ペプチドのＣ末端付近のＡｓｎに糖鎖が結合した糖ペプチドの負イオン由来のフラグメントイオンが得られる。このフラグメントイオンを、ＭＳ^ｎ−１プリカーサとしてＭＳ^ｎ−１分析を実行することで、（Ｇ＋９７−ｚ）／ｚの質量電荷比を有するフラグメントイオンの生成量が増加するため、分析精度の向上が期待できる。

【実施例】

【0131】

以下に、実施例を示して、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。なお、以下において、％の記載は特に断りがない限り重量％を表す。

【0132】

＜セルロースマイクロチップの作製＞
２００μＬのマイクロピペットチップの先端に、少量のコットンを詰め、その上に１ｍｇのセルロースパウダーを加えた。得られたセルロースマイクロチップに、上から水１００μＬを加え、上方からシリンジで空気を送り、下方（チップ先端）から排出した。これを２回繰り返した。さらに５０％アセトニトリル（ＡＣＮ）、０．１％ＴＦＡ水溶液１００μＬで２回、８０％ＡＣＮ、０．１％ＴＦＡ水溶液で２回、同様の操作を行い、セルロースマイクロチップの洗浄および平衡化を行った。

【0133】

［実施例１：ＩｇＧ由来糖ペプチドの分析］
＜測定用糖ペプチドの調製＞
ＳＩＧＭＡより購入したヒト免疫グロブリンＧ（IgG）を、尿素：６Ｍ、重炭酸アンモニウム：５０ｍＭ、およびトリス（２‐カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）：５ｍＭの存在下、室温で４５分反応させ、変性および還元を行った。次いで、ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）：１０ｍＭの存在下、室温遮光条件下で４５分反応させアルキル化を行った後、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）：１０ｍＭ存在下、室温遮光条件下で４５分反応させ、余剰のＩＡＡを不活性化した。その後、プロナーゼＥを加え、３７℃で一夜反応させ、プロテアーゼ消化を行った。消化後、カーボンカラムを用いて脱塩を行った。

【0134】

脱塩後のＩｇＧ消化物に、８０％ＡＣＮ，０．１％ＴＦＡ水溶液を１００μＬ加えて溶解させた。これを、洗浄および平衡化後のセルロースマイクロチップに加え、上方からシリンジで空気を送り、下方から排出した。排出した溶液を、再度セルロースマイクロチップに加えて同様に排出し、これをさらにもう１回繰り返した。最後に、５０％ＡＣＮ，０．１％ＴＦＡ水溶液を２０μＬ加えて、セルロースマイクロチップから、糖ペプチドを溶出した。これを２回繰り返し、これらの溶出液をあわせて乾固した。

【0135】

＜質量分析＞
得られた試料を水に再溶解し、ＭＡＬＤＩプレート上で、３−アミノキノリンとα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸からなる液体マトリックス（３ＡＱ／ＣＨＣＡ）と混合し、ＭＡＬＤＩ‐ＭＳ分析装置（島津製作所製、ＡＸＩＭＡ（登録商標）‐Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）により負イオンＣＩＤによる多段階質量分析を行った。

【0136】

＜分析１および分析２＞
分析１および分析２では、ＭＳ^１で得られたｍ／ｚ＝１９００．７の負イオン（コアフコースを含まない糖ペプチドの脱プロトン化体）、およびｍ／ｚ＝２０４６.８の負イオン（コアフコースを含む糖ペプチドの脱プロトン化体）のそれぞれをプリカーサとして、負イオンＣＩＤにより開裂させ、ＭＳ^２分析を行い、図３（Ａ）および図４（Ａ）に示すＭＳ^２スペクトルを得た。なお、ＭＳ^１で得られた上記の脱プロトン化体は、いずれもペプチド部分がＰｈｅ‐Ａｓｎのアミノ酸配列を有しており、アスパラギンに糖鎖が付加した糖ペプチドの脱プロトン化体である。

【0137】

（分析１：コアフコースを含まない糖ペプチドのＭＳ^３分析）
コアフコースを含まない糖ペプチドから１個のプロトンが脱離した負イオン（ｍ／ｚ＝１９００．７）のＭＳ^２（図３（Ａ））で得られた、ｍ／ｚ＝１４７８．５のフラグメントイオン（^２，４Ａ_Ｒ）およびｍ／ｚ＝１７１８.５のフラグメントイオン（［Ｇｌｙｃａｎ＋９６］⁻）のそれぞれをプリカーサとして、さらにＣＩＤにより開裂させＭＳ^３分析を行い、図３（Ｂ１）および図３（Ｂ２）に示すＭＳ^３スペクトルを得た。なお、^２，４Ａ_Ｒと［Ｇｌｙｃａｎ＋９６］⁻とのｍ／ｚの差は２４０である。

【0138】

（分析２：コアフコースを含む糖ペプチドのＭＳ^３分析）
コアフコースを含む糖ペプチドから１個のプロトンが脱離した負イオン（ｍ／ｚ＝２０４６.８）のＭＳ^２（図４（Ａ））で得られた、ｍ／ｚ＝１４７８．５のフラグメントイオン（^２，４Ａ_Ｒ）およびｍ／ｚ＝１８６４．７のフラグメントイオン（［Ｇｌｙｃａｎ＋９６］⁻）のそれぞれをプリカーサとして、さらに負ＣＩＤにより開裂させＭＳ^３分析を行い、図４（Ｂ１）および図４（Ｂ２）に示すＭＳ^３スペクトルを得た。なお、^２，４Ａ_Ｒと［Ｇｌｙｃａｎ＋９６］⁻とのｍ／ｚの差は３８６である。

【0139】

＜分析３および分析４＞
ＭＳ^１で得られたｍ／ｚ＝２９３１．２の負イオン（分析３）およびｍ／ｚ＝３１１９．３の負イオン（分析４）のそれぞれをプリカーサとして、ＣＩＤにより開裂させ、ＭＳ^２分析を行い、図５（Ａ）および図６に示すＭＳ^２スペクトルを得た。なお、ｍ／ｚ＝２９３１．２の負イオン、およびｍ／ｚ＝３１１９．３の負イオンは、それぞれ、Ｔｈｒ‐Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ、およびＴｈｒ‐Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒのアミノ酸配列を有しており、アスパラギンに糖鎖が付加した糖ペプチドの脱プロトン化体である。これらは、いずれも分析２の糖ペプチドと同一構造の糖鎖を有している。

【0140】

図５（Ａ）および図６のＭＳ^２スペクトルでは、いずれも分析２（図４（Ａ））と同様に、ｍ／ｚ＝１４７８．５のフラグメントイオン（^２，４Ａ_Ｒ）およびｍ／ｚ＝１８６４．６のフラグメントイオン（［Ｇｌｙｃａｎ＋９６］⁻）が得られた。分析３（図５（Ａ））における［Ｇｌｙｃａｎ＋９６］をプリカーサとして、さらにＣＩＤにより開裂させＭＳ^３分析を行い、図５（Ｂ）に示すＭＳ^３スペクトルを得た。

【0141】

＜分析１〜４の評価＞
図３（Ａ）のＭＳ^２スペクトルおよび図４（Ａ）のＭＳ^２スペクトルでは、いずれも^２，４Ａ_Ｒ、Ｂ_Ｒ−１、^２，４Ａ_Ｒ‐１、Ｄ等のフラグメントイオンが同一のｍ／ｚを有しており、^２，４Ａ_Ｒのｍ／ｚは１４７８．５である。また、図３（Ａ）および図４（Ａ）のいずれにおいても、^２，４Ａ_Ｒよりも大きいもピーク強度の大きい［Ｇｌｙｃａｎ＋９６］⁻フラグメントイオンが検出されている。図３（Ａ）および図４（Ａ）のいずれにおいても、［Ｇｌｙｃａｎ＋９６］⁻フラグメントイオンは、糖ペプチド負イオン［Ｍ−Ｈ］⁻よりもｍ／ｚが１８２小さく、［Ｍ−Ｈ］⁻から同一の化学種が脱離したものであることがわかる。［Ｇｌｙｃａｎ＋９６］⁻および［Ｍ−Ｈ］⁻のｍ／ｚは、いずれも、分析２（図４（Ａ））が分析１（図３（Ａ））よりも１４６大きく、この差は、フコース（分子量１６４）から水分子が脱離したものと同一である。これらの結果から、図３（Ａ）と図４（Ａ）のＭＳ^２スペクトルの相違（［Ｇｌｙｃａｎ＋９６］⁻フラグメントイオンのｍ／ｚの相違）は、糖鎖構造におけるコアフコースの有無を反映したものであるといえる。

【0142】

^２，４Ａ_ＲのＣＩＤ開裂により得られた図３（Ｂ１）と図４（Ｂ１）のＭＳ^３スペクトルは略同一であり、いずれも同一の糖鎖構造に由来していることが分かる。また、［Ｇｌｙｃａｎ＋９６］⁻のＣＩＤ開裂により得られた図３（Ｂ２）および図４（Ｂ２）では、いずれのＭＳ^３スペクトルにおいても、ｍ／ｚ＝１４７８．５を有する^２，４Ａ_Ｒのピークや、Ｄ，Ｅ，^１，３Ａ_３等のフラグメントイオンが、ＭＳ^２スペクトルと共通している。これらの結果から、ＭＳ^２の［Ｇｌｙｃａｎ＋９６］フラグメントイオンは、^２，４Ａ_Ｒよりもさらに還元末端側の糖鎖構造、すなわち、糖鎖残基の全構造を含有するフラグメントイオンであることが分かる。

【0143】

分析２（図４）、分析３（図５）および分析４（図６）では、糖ペプチドの糖鎖の構造はいずれも同一であり、ペプチド部分のアミノ酸配列のみが相違している。これらのＭＳ^２分析では、共通の^２，４Ａ_Ｒおよび［Ｇｌｙｃａｎ＋９６］⁻が得られている。また、分析２の［Ｇｌｙｃａｎ＋９６］⁻のＭＳ^３スペクトル（図４（Ｂ２））と、分析３の［Ｇｌｙｃａｎ＋９６］⁻のＭＳ^３スペクトル（図５（Ｂ））は略同一であり、いずれも同一の糖鎖構造に由来していることが分かる。一方、糖鎖がコアフコースを有していない分析１のＭＳ^３スペクトル（図３（Ｂ））は、図４（Ｂ２）や図５（Ｂ）と共通のフラグメントイオンが観測されているものの、スペクトルのパターンは明らかに異なっている。

【0144】

これらの結果から、ｍ／ｚが糖鎖残基＋９６であるフラグメントイオンをプリカーサとしてＭＳ^３分析を行うことにより得られるＭＳ^３スペクトルは、ペプチド部分のアミノ酸配列が異なっていても、糖鎖構造が同一であれば、略同一のスペクトル形状を有することが分かる。また、糖鎖の還元末端のGlcNAcへのコアフコース付加の有無によって、ＭＳ^３スペクトルの形状（ピークリスト）が変化するため、ＭＳ^３からもコアフコースの有無の同定が可能である。

【0145】

ペプチドのＣ末端のアスパラギンに糖鎖が付加した糖ペプチドに関する分析１〜３のＭＳ^２（図３（Ａ）、図４（Ａ）および（図５（Ａ））では、^２，４Ａ_Ｒよりもピーク強度の大きい［Ｇｌｙｃａｎ＋９６］⁻フラグメントイオンが検出されている。そのため、［Ｇｌｙｃａｎ＋９６］⁻をプリカーサとするＭＳ^３分析は、低濃度の試料でも実施可能であり、糖ペプチドの分析方法として優れているといえる。

【0146】

一方、糖鎖修飾されたアスパラギンのＣ末端側に２アミノ酸残基（Ｓｅｒ−Ｔｈｒ）を有する糖ペプチドを用いた分析４では、分析１〜３に比してＭＳ^２における［Ｇｌｙｃａｎ＋９６］⁻のピーク強度が小さくなっている（図６）。この結果から、本発明の分析方法では、ペプチドのＣ末端付近のアスパラギンが糖鎖修飾された糖ペプチドの負イオンをＭＳ^２プリカーサとすることにより、［Ｇｌｙｃａｎ＋９６］⁻フラグメントイオンの生成量（ピーク強度）が増大し、分析精度の向上が可能であるといえる。

【0147】

また、分析３（図５）に用いた糖ペプチドは、糖鎖が付加しているアスパラギンのＮ末端側に８個のアミノ酸残基を有しているが、分析２等と同様に、ＭＳ^２スペクトルにおいて、［Ｇｌｙｃａｎ＋９６］⁻の強いピークが検出されている。この結果から、本発明の分析方法において、ＭＳ^２プリカーサとして選択される糖ペプチド負イオンは、ペプチドのＣ末端付近のアスパラギンに糖鎖が結合していることが好ましいが、糖鎖が付加しているアスパラギンのＮ末端側のアミノ酸配列は特に制限されず、２または３以上のアミノ酸を有していてもよいことが分かる。

【0148】

［実施例２：トランスフェリン由来糖ペプチドの分析］
＜測定用糖ペプチドの調製＞
ＳＩＧＭＡより購入したヒトトランスフェリンを、実施例１に準じて、トリプシンで消化した後、カーボンカラムを用いて脱塩を行った。脱塩後のトランスフェリン消化物を、８０℃の０．８％ＴＦＡ水溶液中で４０分処理し、糖鎖還元末端のシアル酸を除去した。実施例１と同様に、セルロースマイクロチップにより精製および濃縮を行った試料を用いて、負イオンＣＩＤによる多段階質量分析を行った。

【0149】

＜分析５＞
分析５では、ＭＳ^１で得られたｍ／ｚ＝３０９７．３の負イオン（［Ｍ−Ｈ］⁻）をプリカーサとしてＣＩＤ開裂させたＭＳ^２スペクトル（図７（Ａ））、およびＭＳ^２で得られたｍ／ｚ＝１７１８.６の［Ｇｌｙｃａｎ＋９６］⁻をプリカーサとしてさらにＣＩＤ開裂させたＭＳ^３スペクトル（図７（Ｂ））を得た。なお、ｍ／ｚ＝３０９７．３の負イオンは、ペプチド部分がＣｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓのアミノ酸配列（Ｃｙｓ残基はカルバミドメチル化されている）を有しており、Ｃ末端から２残基目のＡｓｎに糖鎖が付加した糖ペプチドの脱プロトン化体である。ＭＳ^２スペクトル（図７（Ａ））において、^２，４Ａ_Ｒと［Ｇｌｙｃａｎ＋９６］⁻とのｍ／ｚの差は２４０であった。

【0150】

［実施例３：α１−酸性糖タンパク質由来糖ペプチドの分析］
＜測定用糖ペプチドの調製＞
ＳＩＧＭＡより購入したヒトα１−酸性糖タンパク質（α-Acid glycoprotein）を、実施例１と同様にプロナーゼＥで消化した後、カーボンカラムによる脱塩およびセルロースマイクロチップによる精製および濃縮を行い、この試料を用いて、負イオンＣＩＤによる多段階質量分析を行った。

【0151】

＜分析６＞
分析６では、ＭＳ^１で得られたｍ／ｚ＝２４４５．０の負イオンをＭＳ^２プリカーサとしてＣＩＤ開裂させてＭＳ^２分析を実施し、ＭＳ^２おけるｍ／ｚ＝１７１８.６の［Ｇｌｙｃａｎ＋９６］⁻フラグメントイオンをＭＳ^３プリカーサとしてさらにＣＩＤ開裂させ、ＭＳ^３スペクトルを得た（図８（Ａ））。なお、ｍ／ｚ＝２４４５．０の負イオンは、ペプチド部分がＡｒｇ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｎのアミノ酸配列を有しており、Ｃ末端のＡｓｎに糖鎖が付加した糖ペプチドの脱プロトン化体である。ＭＳ^２スペクトル（図８（Ａ））において、^２，４Ａ_Ｒと［Ｇｌｙｃａｎ＋９６］⁻とのｍ／ｚの差は２４０であった。

【0152】

＜分析５および分析６の評価＞
図８（Ａ）、図８（Ｂ）および図８（Ｃ）は、それぞれ、分析６（α１−酸性糖タンパク質）、分析１（ＩｇＧ）および分析５（トランスフェリン）のマススペクトルであり、各図において上段はＭＳ^２スペクトル、下段はｍ／ｚ＝１７１８.６の［Ｇｌｙｃａｎ＋９６］⁻フラグメントイオンをプリカーサとして得られたＭＳ^３スペクトルである。図８の各ＭＳ^３スペクトルは、いずれも略同一であることから、糖鎖がコアフコースを有していない場合も、コアフコースを有する場合（分析２および分析３）と同様に、ｍ／ｚが糖鎖残基＋９６であるフラグメントイオンをＭＳ^３プリカーサとして得られるＭＳ^３スペクトルは、ペプチド部分の構造とは無関係に、同一のスペクトルパターンを示すことが分かる。

【0153】

分析５（図７（Ａ）、（Ｂ）および図８（Ｃ））では、糖鎖修飾されたアスパラギンのＣ末端側に１アミノ残基（Ｌｙｓ）を有する糖ペプチドを用いているが、分析１および分析６と同様に、ＭＳ^２において、ｍ／ｚ＝１７１８．５の［Ｇｌｙｃａｎ＋９６］⁻フラグメントイオンの強いピークが現れている。この結果から、本発明の分析方法の対象となる糖ペプチドは、Ｃ末端のアスパラギンが糖鎖修飾された糖ペプチドに限定されず、糖鎖修飾されたアスパラギンのＣ末端側に１アミノ酸残基を有する糖ペプチドにおいても、高い分析精度で実施可能であることが分かる。

【0154】

［実施例４：ラクトフェリン由来糖ペプチドの分析］
＜測定用糖ペプチドの調製＞
ＳＩＧＭＡより購入したヒトラクトフェリンを、実施例１と同様にプロナーゼＥで消化した後、カーボンカラムによる脱塩およびセルロースマイクロチップによる精製および濃縮を行い、この試料を用いて、負イオンＣＩＤによる多段階質量分析を行った。

【0155】

＜分析７および分析８＞
ＭＳ^１で得られたｍ／ｚ＝１６１９．６の負イオン（分析７）およびｍ／ｚ＝１８１９．７の負イオン（分析８）のそれぞれをＭＳ^２プリカーサとして、ＣＩＤにより開裂させ、ＭＳ^２分析を行い、図９（Ａ）および図１０に示すＭＳ^２スペクトルを得た。分析７では、さらにＭＳ^２におけるｍ／ｚ＝１３１２．４の［Ｇｌｙｃａｎ＋９６］⁻フラグメントイオンをＭＳ^３プリカーサとしてＣＩＤ開裂させたＭＳ^３スペクトル（図９（Ｂ））を得た。なお、ｍ／ｚ＝１６１９．６の負イオンは、ペプチド部分がＳｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｓｎのアミノ酸配列を有しており、ｍ／ｚ＝１８１９．７の負イオンは、ペプチド部分がＳｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｔｈｒのアミノ酸配列を有しており、いずれもアスパラギンに糖鎖が付加した糖ペプチドの脱プロトン化体である。分析７および分析８のいずれも、ＭＳ^２スペクトル（図９（Ａ）および図１０）において、^２，４Ａ_Ｒと［Ｇｌｙｃａｎ＋９６］⁻とのｍ／ｚの差は２４０であった。

【0156】

＜分析７および分析８の評価＞
分析７および分析８のいずれも、ＭＳ^２スペクトルにおいて、ｍ／ｚ＝１０７２．４の^２，４Ａ_Ｒに加えて、ｍ／ｚ＝1３１２．４の［Ｇｌｙｃａｎ＋９６］⁻フラグメントイオンが得られている。また、分析７のＭＳ^３（図９（Ｂ））では、ｍ／ｚ＝１０７２.４を有する^２，４Ａ_Ｒのピークの他、Ｂ_Ｒ−１、^２，４Ａ_Ｒ−１、Ｄ、^０，３Ａ_Ｒ−１、Ｃ_２等のＭＳ^２スペクトルと共通するフラグメントイオンが得られている。この結果から、ＭＳ^２の［Ｇｌｙｃａｎ＋９６］フラグメントイオンは、^２，４Ａ_Ｒよりもさらに還元末端側の糖鎖構造を有するフラグメントイオンであることが分かる。このＭＳ^３スペクトルは、上記の分析１〜３、５、６のＭＳ^３スペクトルとは明らかにパターンが相違しており、糖鎖構造の相違を反映していることが分かる。

【0157】

実施例４で用いたラクトフェリン由来の糖ペプチドは、実施例１〜３で用いた糖ペプチドとは糖鎖構造が異なっているが、上記分析１〜６と同様に、［Ｇｌｙｃａｎ＋９６］⁻のＭＳ^２フラグメントイオンが生成している。上記の結果から、本発明の分析方法は、種々のＮ‐結合型糖鎖を有する糖ペプチドに適用可能であることが分かる。

【0158】

糖鎖修飾されたアスパラギンのＣ末端側に２アミノ酸残基（Ｖａｌ−Ｔｈｒ）を有する糖ペプチドを用いた分析８（図１０）では、分析７（図９（Ａ））に比してＭＳ^２における［Ｇｌｙｃａｎ＋９６］⁻のピーク強度が小さくなっている。このように、糖鎖修飾されたアスパラギンのＣ末端側に２アミノ酸残基を有する糖ペプチドの負イオンをＭＳ^２プリカーサとした場合に、［Ｇｌｙｃａｎ＋９６］⁻フラグメントイオンのＭＳ^２ピーク強度が低下するとの結果は、上記分析４（図６）と同様の傾向である。

【0159】

この結果から、本発明の分析方法では、糖鎖の構造に関わらず、ＭＳ^２プリカーサとして選択される糖ペプチド負イオンは、ペプチドのＣ末端付近のアスパラギンに糖鎖が結合していることが好ましいが、糖鎖が付加しているアスパラギンのＮ末端側のアミノ酸配列は特に制限されず、２または３以上のアミノ酸を有していてもよいことが分かる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】