特許 6099069 シャペロニン複合体及びその製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6099069

(24)【登録日】2017年3月3日

(45)【発行日】2017年3月22日

(54)【発明の名称】シャペロニン複合体及びその製造方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 1/02 20060101AFI20170313BHJP

   C07K 14/195 20060101ALI20170313BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20170313BHJP

【ＦＩ】

   C07K1/02ZNA

   C07K14/195

   !C12N15/00 A

【請求項の数】2

【全頁数】17

(21)【出願番号】特願2012-70329(P2012-70329)

(22)【出願日】2012年3月26日

(65)【公開番号】特開2013-199457(P2013-199457A)

(43)【公開日】2013年10月3日

【審査請求日】2015年2月18日

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】391022614

【氏名又は名称】学校法人幾徳学園

(74)【代理人】

【識別番号】100079049

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 淳

(74)【代理人】

【識別番号】100084995

【弁理士】

【氏名又は名称】加藤 和詳

(74)【代理人】

【識別番号】100099025

【弁理士】

【氏名又は名称】福田 浩志

(72)【発明者】

【氏名】小池 あゆみ

(72)【発明者】

【氏名】依田 ひろみ

(72)【発明者】

【氏名】山本 修

【審査官】 戸来 幸男

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１０−１１９３２２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Nature，２００３年，vol.423, no.6940，pp.628-632

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １４／００−１４／８２５

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／

ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１のアミノ酸配列からなる第一のＧｒｏＥＬサブユニット変異体、及び配列番号１のアミノ酸配列中、５２番および３９８番のアラニン残基以外の１もしくは２以上のアミノ酸残基が置換、欠失、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、分子シャペロン活性を有する第二のＧｒｏＥＬサブユニット変異体からなる群より選ばれる少なくとも１種のＧｒｏＥＬサブユニット変異体を含む複数のＧｒｏＥＬサブユニットからなるシャペロニン変異体と、
金属ナノ粒子と、
ＧｒｏＥＳサブユニットと、
を接触させて、ＡＤＰ、ＡＴＰ、及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種のヌクレオチドを加えて、前記複数のＧｒｏＥＬサブユニットで前記金属ナノ粒子を包囲することを含むシャペロニン複合体の製造方法。

【請求項2】

前記シャペロニン変異体と前記金属ナノ粒子との接触は、ＡＤＰ、ＡＴＰ、及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種のヌクレオチドと、ＧｒｏＥＳサブユニットとの存在下に行われる請求項１に記載のシャペロニン複合体の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、シャペロニン複合体及びその製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

シャペロニンは、基質タンパク質の正しいフォールディングを介助するいわゆる分子シャペロンの１種である。シャペロニンファミリーは、分子量５０ｋＤａ〜６０ｋＤａのタンパク質であり、リング状の複合体構造をとり、ＡＴＰ依存的に基質タンパク質のフォールディングを介助するという共通の特徴を有している。シャペロニンの中でも、ＧｒｏＥＬは大腸菌が有するシャペロニンであり、ＡＴＰとＧｒｏＥＳ依存的に基質タンパク質のフォールディングを介助することが明らかにされている。
野生型シャペロニンＧｒｏＥＬは、ＧｒｏＥＬサブユニットの７量体が１つのリングを構成し、このリングがさらに背中合わせに２つ重なった状態の合計で１４量体の構造をしている。すなわち野生型シャペロニンＧｒｏＥＬは、７つのＧｒｏＥＬサブユニットで包囲されてなり、基質タンパク質を内包可能な空洞を、２つ有している。また、ひとつのＧｒｏＥＬサブユニットはＡＴＰ結合部位を含む赤道ドメインと、基質タンパク質とＧｒｏＥＳの結合部位を含む頂点ドメインと、その両ドメインをつなぐ中間ドメインとから構成されている。

【0003】

基質タンパク質のフォールディングにおいては、まずシャペロニンＧｒｏＥＬサブユニットで構成されたリングの「入り口」に基質タンパク質が結合し、リングを構成するシャペロニンＧｒｏＥＬサブユニットに７つのＡＴＰがそれぞれ結合すると、シャペロニンＧｒｏＥＬの構造変化が起こって補因子であるＧｒｏＥＳがＧｒｏＥＬに結合可能となる。次いで、ＧｒｏＥＳがＧｒｏＥＬに結合すると、基質タンパク質がリングの空洞内に落とし込まれ、シャペロニン複合体を形成する。シャペロニン複合体ではリングの空洞内で落とし込まれた基質タンパク質のフォールディングが進行する。次いでリング内のＡＴＰが加水分解されるとＧｒｏＥＳが解離し、それと同時にリング内のフォールディングされた基質タンパク質も解離する。すなわち、ＡＴＰの加水分解の時間がシャペロニンＧｒｏＥＬの反応サイクルのタイマーになっている。
ＡＴＰの加水分解の時間は、野生型ＧｒｏＥＬでは約８秒である。一方、野生型ＧｒｏＥＬのアミノ酸配列のうち、３９８番のアスパラギン酸残基がアラニン残基に置換されたＧｒｏＥＬ変異体（以下、「ＧｒｏＥＬ（Ｄ３９８Ａ）」ともいう）等では、ＡＴＰの加水分解活性が野生型より低下して、複合体の半減期が３０分以上となることが知られている（例えば、非特許文献１、特許文献１参照）。

【0004】

また野生型のシャペロニンが半導体ナノ粒子を内包する複合体を形成し、ＡＴＰの存在下に半導体ナノ粒子を放出可能であることが知られている（非特許文献２参照）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特開２００８−２９４４８７号公報

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｃｅｌｌ、Ｖｏｌ．９７、ｐ３２５〜３３８、１９９９．

【非特許文献2】Ｎａｔｕｒｅ、Ｖｏｌ．４２３、ｐ６２８〜６３２、２００３．

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

非特許文献２に記載の半導体ナノ粒子を内包するシャペロニン複合体は、シャペロニンと半導体ナノ粒子の自発的な相互作用により形成されるため、半導体ナノ粒子を内包するシャペロニン複合体を高い効率で得ることが困難である場合があった。
本発明は、優れた効率で金属ナノ粒子を内包可能なシャペロニン複合体及びその製造方法、並びに該シャペロニン複合体を有する基板を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

前記課題を解決するための具体的手段は以下の通りである。
すなわち本発明の第一の態様は、配列番号１のアミノ酸配列からなる第一のＧｒｏＥＬサブユニット変異体、及び配列番号１のアミノ酸配列中、５２番および３９８番のアラニン残基以外の１もしくは２以上のアミノ酸残基が置換、欠失、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、分子シャペロン活性を有する第二のＧｒｏＥＬサブユニット変異体からなる群より選ばれる少なくとも１種のＧｒｏＥＬサブユニット変異体を含む複数のＧｒｏＥＬサブユニットからなるシャペロニン変異体と、前記複数のＧｒｏＥＬサブユニットに包囲された金属ナノ粒子と、ＡＤＰ、ＡＴＰ、及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種のヌクレオチドと、ＧｒｏＥＳサブユニットと、を有するシャペロニン複合体である。

【0009】

本発明の第二の態様は、配列番号１のアミノ酸配列からなる第一のＧｒｏＥＬサブユニット変異体、及び配列番号１のアミノ酸配列中、５２番および３９８番のアラニン残基以外の１もしくは２以上のアミノ酸残基が置換、欠失、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、分子シャペロン活性を有する第二のＧｒｏＥＬサブユニット変異体からなる群より選ばれる少なくとも１種のＧｒｏＥＬサブユニット変異体を含む複数のＧｒｏＥＬサブユニットからなるシャペロニン変異体と、金属ナノ粒子と、ＧｒｏＥＳサブユニットと、を接触させて、ＡＤＰ、ＡＴＰ、及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種のヌクレオチドを加えて、前記複数のＧｒｏＥＬサブユニットで前記金属ナノ粒子を包囲することを含むシャペロニン複合体の製造方法である。前記シャペロニン変異体と前記金属ナノ粒子との接触は、ＡＤＰ、ＡＴＰ、及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種のヌクレオチドと、ＧｒｏＥＳサブユニットとの存在下に行われることが好ましい。

【0010】

本発明の第三の態様は、支持体と、前記支持体上に配置された前記シャペロニン複合体とを備える基板である。前記シャペロニン複合体は、前記金属ナノ粒子を包囲するＧｒｏＥＬサブユニット群と、前記金属ナノ粒子を包囲しないＧｒｏＥＬサブユニット群とを有することが好ましい。

【発明の効果】

【0011】

本発明によれば、優れた効率で金属ナノ粒子を内包可能なシャペロニン複合体及びその製造方法、並びに該シャペロニン複合体を有する基板を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】本発明の実施例にかかるシャペロニン複合体の透過型電子顕微鏡像の一例を示す図である。

【図2】本発明の実施例にかかるシャペロニン複合体の透過型電子顕微鏡像の一例を示す図である。

【図3】本発明の実施例にかかる弾丸型のシャペロニン複合体の透過型電子顕微鏡像の一例を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0013】

＜シャペロニン複合体＞
本発明のシャペロニン複合体は、配列番号１のアミノ酸配列からなる第一のＧｒｏＥＬサブユニット変異体、及び配列番号１のアミノ酸配列中、５２番および３９８番のアラニン残基以外の１もしくは２以上のアミノ酸残基が置換、欠失、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、分子シャペロン活性を有する第二のＧｒｏＥＬサブユニット変異体からなる群より選ばれる少なくとも１種のＧｒｏＥＬサブユニット変異体を含む複数のＧｒｏＥＬサブユニットからなるシャペロニン変異体と、前記複数のＧｒｏＥＬサブユニットに包囲された金属ナノ粒子と、ＡＤＰ、ＡＴＰ、及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種のヌクレオチドと、ＧｒｏＥＳサブユニットと、を有する。すなわち前記シャペロニン複合体は、複数のＧｒｏＥＬサブユニットで包囲されてなる空洞に金属ナノ粒子が内包された金属ナノ粒子含有シャペロニン複合体である。
特定構造のＧｒｏＥＬサブユニット変異体を含んで構成されるシャペロニン変異体は、優れた効率で金属ナノ粒子が内包されたシャペロニン複合体を生成することができる。また内包される金属ナノ粒子の粒子径の均一性に優れる。さらに前記シャペロニン複合体は、所定の時間経過後には、内包された金属ナノ粒子を放出可能である。

【0014】

これは例えば以下のように考えることができる。Ｎａｔｕｒｅ、Ｖｏｌ．４２３、ｐ６２８〜６３２（２００３）に記載の複合体は、ＡＴＰ等の非存在下にシャペロニン分子とＣｄＳナノ粒子の自発的な相互作用により形成されるため、生成効率が充分とは言い難い。一方、本発明のシャペロニン複合体は、ＡＴＰの加水分解速度が抑制されたＧｒｏＥＬサブユニット変異体を含むシャペロニン変異体を有するため、ＡＴＰ等とＧｒｏＥＳサブユニットの存在下に形成されることが可能である。これにより、シャペロニン変異体に金属ナノ粒子が効率的に内包されると考えることができる。また前記シャペロニン複合体はＧｒｏＥＳサブユニットを更に含む場合に、シャペロニン変異体と金属ナノ粒子の相互作用が強化されると考えることができる。

【0015】

また前記シャペロニン変異体は、分散状態にある金属ナノ粒子を取り込んで、シャペロニン複合体を形成する。すなわち、前記シャペロニン変異体は凝集状態の金属ナノ粒子とシャペロニン複合体を形成しないことから、内包される金属ナノ粒子の粒子径が均一になると考えることができる。

【0016】

尚、本明細書においては、複数のＧｒｏＥＬサブユニットからなり、ＧｒｏＥＬサブユニットに包囲された空洞を有するＧｒｏＥＬサブユニット多量体を「シャペロニンＧｒｏＥＬ」、ＧｒｏＥＬサブユニットとして少なくとも１つのＧｒｏＥＬサブユニット変異体を含むシャペロニンＧｒｏＥＬを「シャペロニン変異体」、シャペロニン変異体と金属ナノ粒子との複合体を「シャペロニン複合体」と称する。また「〜」を用いて表される数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。また組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。さらに「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の作用が達成されれば、本用語に含まれる。

【0017】

（シャペロニン変異体）
前記シャペロニン変異体に含まれるＧｒｏＥＬサブユニット変異体は、配列番号１のアミノ酸配列を有する第一のＧｒｏＥＬサブユニット変異体、及び配列番号１のアミノ酸配列中、５２番および３９８番のアラニン残基以外の１もしくは２以上のアミノ酸残基が置換、欠失、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる第二のＧｒｏＥＬサブユニット変異体からなる群より選ばれる少なくとも１種である。
前記第二のＧｒｏＥＬサブユニット変異体としては、ＡＴＰの加水分解活性が野生型ＧｒｏＥＬサブユニットよりも低下しているものであれば特に制限はない。前記第二のＧｒｏＥＬサブユニット変異体は、配列番号１のアミノ酸配列のうち５２番および３９８番のアラニン残基以外の位置における、アミノ酸残基の置換、欠失、もしくは付加した変異部位の数が１５以下であることが好ましく、１０以下であることがより好ましく、５以下であることが更に好ましい。

【0018】

前記アミノ酸残基の置換としては、以下のような具体例が挙げられる。
一般にタンパク質の機能を維持するためには、置換するアミノ酸残基は、置換前のアミノ酸残基と類似の性質を有するアミノ酸残基であることが好ましい。このようなアミノ酸残基の置換は、保存的置換と呼ばれている。例えば、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐは、共に非極性アミノ酸残基に分類されるため、互いに似た性質を有する。また、非荷電性アミノ酸残基としては、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎが挙げられる。また、酸性アミノ酸残基としては、Ａｓｐ及びＧｌｕが挙げられる。また、塩基性アミノ酸残基としては、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓが挙げられる。これらの各グループ内のアミノ酸残基の置換は好ましく許容される。

【0019】

前記アミノ酸残基の置換は、前記第二のＧｒｏＥＬサブユニット変異体に機能を追加するものであってもよい。新たな機能を付加する置換の具体例としては、例えば、野生型ＧｒｏＥＬの４９０番のアスパラギン酸残基をシステイン残基に変異させた変異体（Nat. Biotechnol., 2001 Sep; 19(9): 861-5.）が挙げられる。かかる変異は、シャペロニン変異体をガラス基板等に固定化することを可能にする。また、２６５番のアスパラギン残基をアラニン残基に変異させた変異体（Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000 Jan 27; 267(3): 842-9.）を挙げることもできる。かかる変異は金属ナノ粒子をより効率的にシャペロニン変異体に内包することを可能にする。

【0020】

また前記第二のＧｒｏＥＬサブユニット変異体は、前記第一のＧｒｏＥＬサブユニット変異体と同様の機能を有するものであっても、さらに機能が追加されたものであってもよい。これらの具体例としては、例えば、ＧｒｏＥＬサブユニットにおけるＣ末端の繰返し配列を欠失、付加した変異体（Cell, 2006 Jun 2; 125(5): 903-14.）を挙げることができる。かかる変異は、シャペロニン変異体の空洞の体積を変化させることを可能とする。
更に前記第二のＧｒｏＥＬサブユニット変異体は、用途に応じて、１以上のアミノ酸残基がさらに付加したものであってもよい。このような付加可能なアミノ酸残基としては、シグナルペプチド、タグ配列等を構成しうるアミノ酸残基を挙げることができる。

【0021】

前記第二のＧｒｏＥＬ変異体サブユニットとしては、前記具体例として挙げた変異以外の変異を有するものであってもよい。そのような変異としては例えば、Cell. 2002 Dec 27; 111(7): 1027-39．等に記載された特定のタンパク質をより効率的にフォールディングすることを可能にする変異や、Cell. 1995 Nov 17; 83(4): 577-87.等に記載された単一のリングからなる７量体を形成することを可能にする変異等をあげることができる。

【0022】

前記ＧｒｏＥＬサブユニット変異体は、例えば、ＧｒｏＥＬサブユニット変異体をコードする塩基配列からなるＤＮＡを通常用いられる方法で発現させることで製造することができる。具体的には、ＧｒｏＥＬサブユニット変異体をコードする塩基配列からなるＤＮＡを含む組換えベクターを、組換えベクターに応じて選択される宿主細胞に感染させて、宿主細胞を培養することで製造することができる。
前記ＧｒｏＥＬサブユニット変異体の製造方法の詳細については、例えば、特開２００８−２９４４８７号公報に記載の製造方法を参照することができる。

【0023】

前記シャペロニン変異体は、配列番号１のアミノ酸配列からなる第一のＧｒｏＥＬサブユニット変異体、及び配列番号１のアミノ酸配列中、５２番および３９８番のアラニン残基以外の１もしくは２以上のアミノ酸残基が置換、欠失、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、分子シャペロン活性を有する第二のＧｒｏＥＬサブユニット変異体からなる群より選ばれる少なくとも１種のＧｒｏＥＬサブユニット変異体を含む。すなわち、前記シャペロニン変異体を構成する複数個（好ましくは７個、より好ましくは１４個）のＧｒｏＥＬサブユニットのうち、少なくとも１個は上記のＧｒｏＥＬサブユニット変異体である。

【0024】

前記シャペロニン変異体は、従来知られているシャペロニン変異体（例えば、ＧｒｏＥＬ（Ｄ３９８Ａ））と比べて顕著にＡＴＰの加水分解活性が低下している。そのため形成されたシャペロニン複合体は、所定の時間、安定的に金属ナノ粒子を内包することができる。
また前記シャペロニン複合体は、ＡＤＰ、ＡＴＰ、及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種のヌクレオチドとＧｒｏＥＳサブユニットの存在下に、金属ナノ粒子を内包可能であるため、金属ナノ粒子の内包効率が高く、シャペロニン複合体を優れた効率で生成することができる。
さらに前記シャペロニン変異体がＧｒｏＥＬサブユニットの１４量体である場合、シャペロニン変異体を構成する２つのリングの空洞に同時に金属ナノ粒子を内包することができるため、より効率的に金属ナノ粒子をシャペロニン複合体内に内包することができる。

【0025】

前記シャペロニン変異体を構成するＧｒｏＥＬサブユニットの数は、金属ナノ粒子を内包可能であれば特に制限はない。前記シャペロニン変異体はＧｒｏＥＬサブユニットの７量体であることが好ましく、より好ましくは１４量体である。また前記シャペロニン変異体を構成するＧｒｏＥＬサブユニット群のうち、前記ＧｒｏＥＬサブユニット変異体の総数は少なくとも１とすることができる。前記シャペロニン変異体がＧｒｏＥＬサブユニットの１４量体である場合、ＡＴＰの加水分解活性の観点から、ＧｒｏＥＬサブユニット変異体の総数は、７以上であることが好ましく、１４であることがより好ましい。
尚、前記シャペロニン変異体は、ＧｒｏＥＬサブユニット変異体を含むＧｒｏＥＬサブユニット群から、通常の条件下、例えば、ＡＴＰ依存的（Nature, 1990 Nov 22; 348(6299): 339-42）に形成される。

【0026】

（金属ナノ粒子）
前記シャペロニン複合体は、金属ナノ粒子の少なくとも１種を含む。前記金属ナノ粒子としては、金属元素を含むナノ粒子であって、前記シャペロニン変異体に内包可能なものであれば特に制限されず、目的に応じて適宜選択することができる。前記金属ナノ粒子は、実質的に単一の金属元素からなる金属ナノ粒子、２種以上の金属元素を含む合金又は金属化合物からなる金属ナノ粒子、金属元素と非金属元素を含む金属化合物からなる金属ナノ粒子等のいずれであってもよい。また前記金属ナノ粒子は、磁性粒子及び反磁性粒子のいずれでもあってもよく、また導体粒子及び半導体粒子のいずれであってもよい。
ここで「実質的に」とは不可避的に混入する他の元素が含まれることを排除しないことを意味する。具体的には他の元素の含有率が１質量％以下である。

【0027】

前記金属ナノ粒子を構成する金属元素としては、長周期律表（ＩＵＰＡＣ１９９１）の第３周期、第４周期、第５周期、及び第６周期からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属元素を挙げることができる。中でも第２〜１４族から選ばれる少なくとも１種の金属が好ましく、第２族、第４族、第５族、第６族、第７族、第８族、第９族、第１０族、第１１族、第１２族、第１３族、及び第１４族から選ばれる少なくとも１種の金属元素が更に好ましい。
前記金属元素としては、具体的には銅、銀、金、白金、パラジウム、ニッケル、錫、コバルト、ロジウム、イリジウム、鉄、ルテニウム、オスミウム、マンガン、モリブデン、タングステン、ニオブ、タンタル、チタン、ビスマス、アンチモン、鉛、ケイ素、ゲルマニウム、カドミウム、インジウム、クロムなどが挙げられる。

【0028】

前記合金及び金属化合物としては、ＦｅＰｔ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＳｉＯ_２等を挙げることができる。

【0029】

前記金属ナノ粒子の平均粒子径は、前記シャペロニン変異体に内包可能であれば特に制限されない。例えば１ｎｍ〜１０ｎｍであることが好ましく、２ｎｍ〜５ｎｍであることがより好ましい。金属ナノ粒子の平均粒子径は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によって３５０個の粒子について円相当粒子径として測定される金属ナノ粒子の粒子径の算術平均値として求められる。
なお、前記金属ナノ粒子は１個の金属ナノ粒子からなる１次粒子であっても、複数の金属ナノ粒子からなる２次粒子であってもよい。

【0030】

前記シャペロニン変異体がＧｒｏＥＬサブユニットの１４量体である場合、シャペロニン変異体は金属ナノ粒子を内包可能な２つの空洞を有する。前記シャペロニン複合体において、金属ナノ粒子は２つの空洞のうち少なくとも１つに内包されていればよい。金属ナノ粒子が２つの空洞の両方に内包されることで金属ナノ粒子の含有率が高いシャペロニン複合体とすることができる。また金属ナノ粒子が１つの空洞にのみ内包されることで、基板への接着性に優れるシャペロニン複合体とすることができる。
なお、前記シャペロニン変異体が２つの金属ナノ粒子を内包可能である場合、それぞれの金属ナノ粒子は、同一であっても異なっていてもよい。

【0031】

シャペロニン変異体の１つの空洞に内包される金属ナノ粒子の数は、金属ナノ粒子の粒子径に応じて適宜選択される。内包される金属ナノ粒子の粒子径を均一にする観点から、１つの空洞に内包される金属ナノ粒子の数は１個であることが好ましい。

【0032】

前記シャペロニン複合体は、ＡＤＰ、ＡＴＰ、及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種のヌクレオチドを更に含む。シャペロニン複合体がＡＤＰ、ＡＴＰ、及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種のヌクレオチドを更に含むことで、シャペロニン複合体に構造変化が生じて、より効率的にシャペロニン変異体に金属ナノ粒子を内包することができる。

【0033】

前記ＡＤＰ又はＡＴＰの誘導体としては、例えば、ＡＤＰＢｅＦｘ、ＡＭＰＢｅＦｘ、ＡＴＰγＳ、後述するＡＴＰ代替化合物等を挙げることができる。例えば、前記シャペロニン複合体がヌクレオチドとしてＡＤＰＢｅＦｘを含むことで、後述するフットボール型及び弾丸型のシャペロニン複合体をより安定化することができる。

【0034】

シャペロニン複合体におけるＡＤＰ、ＡＴＰ、及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種のヌクレオチドの含有数は、シャペロニン変異体がＧｒｏＥＬサブユニットの１４量体である場合、シャペロニン変異体１分子あたりに７分子又は１４分子であることが好ましく、前記ヌクレオチドがＡＤＰ又はその誘導体の場合にはシャペロニン変異体１分子あたりに７分子であり、前記ヌクレオチドがＡＴＰ又はその誘導体の場合にはシャペロニン変異体１分子あたりに１４分子であることがより好ましい。
また前記ヌクレオチドがＡＤＰ又はＡＴＰの誘導体である場合、シャペロニン複合体におけるヌクレオチド含有数は、誘導体の種類に応じて適宜選択することが好ましい。

【0035】

前記シャペロニン複合体は、ＡＤＰ、ＡＴＰ、及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種のヌクレオチドに加えてＧｒｏＥＳサブユニットを更に有する。ＧｒｏＥＳサブユニットを更に有することでシャペロニン変異体がより効率的に金属ナノ粒子を内包することができ、シャペロニン複合体の生成効率がより向上する。シャペロニン複合体におけるＧｒｏＥＳサブユニットの含有数は、シャペロニン変異体がＧｒｏＥＬサブユニットの１４量体である場合、シャペロニン変異体１分子あたりに７分子又は１４分子であることが好ましく、前記ヌクレオチドがＡＤＰ又はその誘導体の場合にはシャペロニン変異体１分子あたりにＧｒｏＥＳサブユニットが７分子であり、前記ヌクレオチドがＡＴＰ又はその誘導体の場合にはシャペロニン変異体１分子あたりにＧｒｏＥＳサブユニットが１４分子であることがより好ましい。

【0036】

前記ＧｒｏＥＳサブユニットは、シャペロニンＧｒｏＥＬの補因子として作用し、被内包物である金属ナノ粒子をシャペロニンＧｒｏＥＬの空洞内に閉じ込めることができる。本発明においてＧｒｏＥＳサブユニットは、野生型のＧｒｏＥＳサブユニットであっても、ＧｒｏＥＳサブユニット変異体であってもよい。またＧｒｏＥＳサブユニットに蛍光ラベル等を常法により付加したものであってもよい。前記蛍光ラベル等には通常用いられる蛍光ラベル等を特に制限なく用いることができる。

【0037】

前記ＧｒｏＥＳサブユニットは大腸菌に由来するものであっても、通常用いられる方法で製造されたものであってもよい。ＧｒｏＥＳサブユニットは例えば、ＧｒｏＥＳサブユニットをコードする塩基配列からなるＤＮＡを通常用いられる方法で発現させることで製造することができる。具体的には、ＧｒｏＥＳサブユニットをコードする塩基配列からなるＤＮＡを含む組換えベクターを、組換えベクターに応じて選択される宿主細胞に感染させて、宿主細胞を培養することで製造することができる。

【0038】

本発明のシャペロニン複合体は、金属ナノ粒子を内包することから、分散媒中での分散安定性に優れた金属ナノ粒子分散物として用いることができる。このようなシャペロニン複合体は、例えば、化粧品等の用途に用いることができる。

【0039】

＜シャペロニン複合体の製造方法＞
本発明のシャペロニン複合体の製造方法は、配列番号１のアミノ酸配列からなる第一のＧｒｏＥＬサブユニット変異体、及び配列番号１のアミノ酸配列中、５２番および３９８番のアラニン残基以外の１もしくは２以上のアミノ酸残基が置換、欠失、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、分子シャペロン活性を有する第二のＧｒｏＥＬサブユニット変異体からなる群より選ばれる少なくとも１種のＧｒｏＥＬサブユニット変異体を含む複数のＧｒｏＥＬサブユニットからなるシャペロニン変異体と、金属ナノ粒子とを接触させて、前記複数のＧｒｏＥＬサブユニットで前記金属ナノ粒子を包囲する内包工程を含む。前記シャペロニン複合体の製造方法は必要に応じてその他の工程を更に含んでいてもよい

【0040】

前記シャペロニン変異体と金属ナノ粒子とを接触させる方法は特に制限されない。例えば適当な緩衝液中で、シャペロニン変異体と金属ナノ粒子とを混合する方法等を挙げることができる。シャペロニン変異体と金属ナノ粒子とを混合する方法としては通常用いられる攪拌方法から適宜選択して用いることができる。例えば、マイクロチューブ中で、ピペティングにより混合する方法、ローテーターを用いて混合する方法、ボルテックスを用いて混合する方法等を挙げることができる。シャペロニン変異体と金属ナノ粒子とを接触させる温度としては、例えば４〜６０℃とすることができ、２５〜３７℃であることがより好ましい。接触時間は例えば１〜６０分間であることが好ましく、１〜２分間であることがより好ましい。

【0041】

前記緩衝液としては、通常用いられる緩衝液から適宜選択して用いることができる。例えば、ＨＥＰＥＳ、ＰＢＳ、Ｔｒｉｓ等を挙げることができる。
前記緩衝液のｐＨとしては５〜９であることが好ましく、７〜８であることがより好ましい。ｐＨの調整には例えば、ＫＯＨ、ＮａＯＨ等の無機塩基や、ＨＣｌ等の無機酸を用いることができる。
前記緩衝液は、無機塩を更に含むことが好ましい。無機塩としては、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、Ｎａ_２ＳＯ_４等を挙げることができる。中でもシャペロニン複合体の生成効率の観点から、ＫＣｌ及びＭｇＣｌ_２を含むことが好ましい。

【0042】

前記緩衝液の濃度としては、シャペロニン複合体の生成効率の観点から、１ｍＭ〜１００ｍＭであることが好ましく、２０ｍＭ〜４０ｍＭであることがより好ましい。
前記緩衝液が無機塩としてＫＣｌを含む場合、ＫＣｌの濃度は１ｍＭ〜２００ｍＭであることが好ましく、５０ｍＭ〜１００ｍＭであることがより好ましい。また前記緩衝液が無機塩としてＭｇＣｌ_２を含む場合、ＭｇＣｌ_２の濃度は１ｍＭ〜１０ｍＭであることが好ましく、４ｍＭ〜６ｍＭであることがより好ましい。

【0043】

前記内包工程におけるシャペロニン変異体と金属ナノ粒子の混合比率は特に制限されない。例えばシャペロニン複合体の生成効率の観点から、シャペロニン変異体を構成するＧｒｏＥＬサブユニット１μｍｏｌあたりに金属ナノ粒子を１ｇ〜１０ｇ混合することが好ましく、２ｇ〜８ｇ混合することがより好ましい

【0044】

前記内包工程は、ＡＤＰ、ＡＴＰ、及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種のヌクレオチドの存在下に行うことが好ましく、ＡＤＰ、ＡＴＰ、及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種のヌクレオチドと、ＧｒｏＥＳサブユニットとの存在下に行われることがより好ましく、ＡＤＰ、ＡＴＰ、及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種のヌクレオチドと、ＧｒｏＥＳサブユニットと、金属イオン（好ましくは、マグネシウムイオン）の存在下に行われることがさらに好ましい。これにより優れた生成効率で金属ナノ粒子が内包されたシャペロニン複合体を生成することができる。

【0045】

前記シャペロニン変異体が２つの空洞を有し、前記内包工程をＡＴＰの存在下に行う場合、シャペロニン変異体の２つの空洞の両方に金属ナノ粒子が内包されたフットボール型のシャペロニン複合体を優先的に得ることができる。
一方、前記シャペロニン変異体が２つの空洞を有し、前記内包工程をＡＤＰの存在下に行う場合、シャペロニン変異体の２つの空洞の一方にのみ金属ナノ粒子が内包された弾丸型のシャペロニン複合体を優先的に得ることができる。

【0046】

さらに前記内包工程を、シャペロニン変異体、第一の金属ナノ粒子、及びＡＤＰの存在下に行って、シャペロニン変異体の２つの空洞の一方に第一の金属ナノ粒子が内包された第一のシャペロニン複合体を得た後、第一のシャペロニン複合体と、第二の金属ナノ粒子とを、ＡＴＰの存在下に接触させることで、第一の金属ナノ粒子と第二の金属ナノ粒子とが１つのシャペロニン変異体に内包されたハイブリッド型のシャペロニン複合体を得ることもできる。

【0047】

前記内包工程においては、ＡＴＰの代わりにＡＴＰ代替化合物を用いてもよい。ＡＴＰ代替化合物としては、ＧｒｏＥＬサブユニット変異体のＡＴＰ結合部位に結合可能で、シャペロニンＧｒｏＥＬ変異体の構造変化を引き起こすことが可能な化合物であれば特に制限はない。例えば、ＡＤＰとフッ化ベリリウムの付加物（J. Biol. Chem., 279, 45737-45743 (2004).）、ＡＤＰとフッ化アルミニウムやフッ化ガリウムの付加物（J. Mol. Biol., 2003 May 23; 329(1): 121-34.）等を挙げることができる。

【0048】

前記内包工程をＡＤＰ、ＡＴＰ、及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種のヌクレオチドの存在下に行う場合、ＧｒｏＥＬサブユニットに対して、ＡＤＰ、ＡＴＰ、及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種のヌクレオチドを１０^３〜１０^６のモル比で用いることが好ましく、１０^３〜１０^４のモル比で用いることがより好ましい。

【0049】

前記内包工程をＧｒｏＥＳサブユニットの存在下に行う場合、ＧｒｏＥＬサブユニットに対して、ＧｒｏＥＳサブユニットを１〜１０のモル比で用いることが好ましく、１〜３のモル比で用いることがより好ましい。

【0050】

前記内包工程を、ＡＤＰ、ＡＴＰ、及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種のヌクレオチドと、ＧｒｏＥＳサブユニットとの存在下に行う場合、シャペロニン変異体と、金属ナノ粒子と、ＡＤＰ、ＡＴＰ、及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種のヌクレオチドと、ＧｒｏＥＳサブユニットとの混合順は特に制限されず、これらを同時に混合してもよく、またこれらを順次混合してもよい。中でもシャペロニン複合体の生成効率の観点から、シャペロニン変異体と、金属ナノ粒子と、ＧｒｏＥＳサブユニットとの混合物に、ＡＤＰ、ＡＴＰ、及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種のヌクレオチドを混合する方法であることが好ましい。

【0051】

前記シャペロニン複合体の製造方法は、前記内包工程に加えて、シャペロニン複合体の精製工程、修飾工程等をさらに含んでいてもよい。
前記精製工程としては、例えば、クロマトグラフィーにより分離する方法、限外ろ過する方法、等を挙げることができる。

【0052】

＜基板＞
本発明の基板は、支持体と、前記支持体上に配置された前記シャペロニン複合体とを備える。前記基板は必要に応じてその他の構成要素を更に備えていてもよい。
前記基板においては、金属ナノ粒子を内包するシャペロニン複合体の凝集が抑制された状態で支持体上に配置されることになる。すなわち支持体上に、金属ナノ粒子をその凝集が抑制された状態で配置することが可能となる。

【0053】

前記支持体としては特に制限されず、通常用いられる支持体から、目的に応じて適宜選択して用いることができる。支持体としては例えば、ガラス基材、フェノール樹脂等の樹脂基材、アルミナ等の金属基材、カーボンなどを挙げることができる。

【0054】

前記支持体上におけるシャペロニン複合体の配置態様は特に制限されない。例えばシャペロニン複合体が前記フットボール型である場合は、フットボール型の長軸方向が支持体の面に略平行になるように配置されることが好ましい。またシャペロニン複合体が弾丸型の場合、金属ナノ粒子を内包していない空洞が支持体に接するように配置されることが好ましい。
このようにシャペロニン複合体として弾丸型シャペロニン複合体を用いることで、支持体上に金属ナノ粒子を内包するシャペロニン複合体を、金属ナノ粒子を内包する空洞が上を向いた状態で面状に配置することができる。これは例えばシャペロニン複合体と支持体との疎水性相互作用によるものと考えることができる。

【0055】

前記基板は、例えば、前記シャペロニン複合体と分散媒とを含む分散物を支持体上に付与し、分散媒の少なくとも一部を除去して、前記シャペロニン複合体を支持体上に吸着させることで製造することができる。
前記分散媒としては、前記シャペロニン複合体を分散可能であれば特に制限されず、通常用いられる分散媒から適宜選択することができる。分散媒としては、水、緩衝液、エタノール等を挙げることができる。また分散媒の除去方法及び条件は特に制限されず、用いる分散媒や基板の用途等に応じて適宜選択することができる。

【0056】

本発明の基板は、金属ナノ粒子を内包するシャペロニン複合体が支持体上に配置されていることから、センサー等の用途に好適に用いることができる。

【実施例】

【0057】

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。尚、特に断りのない限り、「％」は質量基準である。また、本実施例で市販のキットを用いる場合は、そのキットの取扱説明書に従って操作を行った。

【0058】

［調製例１］
配列番号１のアミノ酸配列からなるＧｒｏＥＬサブユニット（以下、「ＧｒｏＥＬサブユニット変異体」ともいう）を、特開２００８−２９４４８７号公報に記載の方法に準じて調製した。

【0059】

［調製例２］
以下のようにして磁性体である金属ナノ粒子としてＦｅＰｔナノ粒子を調製した。
（１）非修飾ＦｅＰｔナノ粒子の合成
三口フラスコに、アセチルアセトン白金（II）０．３９ｇ（１．０ｍｍｏｌ／ｌ）、アセチルアセトン鉄（II）０．３５ｇ（１．０ｍｍｏｌ／ｌ）、テトラエチレングリコール１００ｍｌを混合し、Ａｒガス雰囲気中で１時間ガス置換した。Ａｒ雰囲気中、３００℃で１時間還流した。その後、Ａｒ雰囲気中で室温まで冷却して、非修飾ＦｅＰｔナノ粒子のテトラエチレングリコール分散液を調製した。
得られた非修飾ＦｅＰｔナノ粒子を含むテトラエチレングリコール分散液に等量のエタノールを混合し、４０００ｒｐｍ×２０分遠心した後、上清を除去して沈殿を得た。得られた沈殿にエタノール５０ｍｌを加えて４０００ｒｐｍ×２０分遠心処理して上清を除去するエタノール洗浄を、遠心上清が着色しなくなるまで繰り返した。
最終的に得られた沈殿を、超純水、ＨＫＭ緩衝液、又はエタノールに分散して、非修飾ＦｅＰｔナノ粒子分散液を得た。得られた非修飾ＦｅＰｔナノ粒子分散液は４℃で保管した。
なお、ＨＫＭ緩衝液は組成が、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ
ＭｇＣｌ_２であり、ＫＯＨでｐＨ７．５に調整した。

【0060】

（２）ピルビン酸修飾ＦｅＰｔナノ粒子の合成
三口フラスコに、アセチルアセトン白金（II）０．３９ｇ（１．０ｍｍｏｌ／ｌ）、アセチルアセトン鉄（II）０．３５ｇ（１．０ｍｍｏｌ／ｌ）、テトラエチレングリコール１００ｍｌを混合し、Ａｒガス雰囲気中で１時間ガス置換した。Ａｒ雰囲気中、３００℃で１時間還流した後、温度を１５０℃まで下げた。ピルビン酸とテトラエチレングリコールの混合液（１：１（ｖ／ｖ）、１２時間攪拌して調製した）２０ｍｌを加えた後、再び２時間還流した。その後、Ａｒ雰囲気中で室温まで冷却して、ピルビン酸修飾ＦｅＰｔナノ粒子を調製した。
得られたピルビン酸修飾ＦｅＰｔナノ粒子のテトラエチレングリコール分散液について、上記と同様にして洗浄処理を行い、ピルビン酸修飾ＦｅＰｔナノ粒子分散液を得た。

【0061】

（３）オレイン酸修飾ＦｅＰｔ粒子の合成
三口フラスコに、アセチルアセトン白金（II）０．３９ｇ（１．０ｍｍｏｌ／ｌ）、アセチルアセトン鉄（II）０．３５ｇ（１．０ｍｍｏｌ／ｌ）、テトラエチレングリコール１００ｍｌを混合し、Ａｒガス雰囲気中で１時間ガス置換した。Ａｒ雰囲気中、３００℃で１時間還流した後、温度を２００℃まで下げた。オレイン酸１０ｍｌを加えた後、再び３０分間還流した。その後、Ａｒ雰囲気中で室温まで冷却して、オレイン酸修飾ＦｅＰｔナノ粒子を調製した。
得られたオレイン酸修飾ＦｅＰｔナノ粒子のテトラエチレングリコール分散液について、上記と同様にして洗浄処理を行い、オレイン酸修飾ＦｅＰｔナノ粒子分散液を得た。

【0062】

上記で得られたそれぞれのＦｅＰｔナノ粒子分散液をコロジオン支持膜グリッドに載せ、２４時間乾燥して観察用サンプルを得た。得られた観察用サンプルについて、透過型電子顕微鏡ＪＥＭ ２０００ＥＸ（日本電子社製）を用いて、加速電圧１００ｋＶで観察し、粒子電顕像を得た。得られた粒子電顕像を６００ｄｐｉで取り込み、画像処理ソフトウェアImage J（Ver. 1.46）で粒子分析処理（Analyze Particles）を行って、それぞれのＦｅＰｔナノ粒子分散液について平均粒子径を求めた。
その結果、非修飾ＦｅＰｔナノ粒子は平均粒子径４．８８ｎｍ、ピルビン酸修飾ＦｅＰｔナノ粒子は平均粒子径３．９９ｎｍ、オレイン酸修飾ＦｅＰｔナノ粒子は平均粒子径５．０５ｎｍであった。

【0063】

［実施例１］
非修飾ＦｅＰｔナノ粒子のＨＫＭ緩衝液分散液（濃度１００ｍｇ／ｍｌ）を用いて、以下のようにしてシャペロニン複合体を作製した。
マイクロチューブに最終濃度がそれぞれ以下のようになるように各材料を添加して、室温で１分間、マイクロピペットで混合して試料液を調製した。
・ＧｒｏＥＬサブユニット変異体 ０．１μＭ
・ＧｒｏＥＳサブユニット ０．２μＭ
・ＡＴＰ １ｍＭ
・非修飾ＦｅＰｔナノ粒子 ２．５ｍｇ／ｍｌ

【0064】

上記で得られた試料液６．０μｌを親水化処理済みコロジオン支持膜に１分間接触させた。超純水６．０μｌで１回リンスした後、２％酢酸ウラン６．０μｌを加えて１分間染色した。一夜乾燥後、透過型電子顕微鏡ＨＴ−７５００（日立ハイテク社製）を用い、加速電圧８０ｋＶで観察した。得られた観察画像の一例を図１に示す。

【0065】

図１から、シャペロニン変異体に２つの非修飾ＦｅＰｔナノ粒子が内包されているフットボール型のシャペロニン複合体、及びシャペロニン変異体に１つの非修飾ＦｅＰｔナノ粒子が内包されている弾丸型のシャペロニン複合体がそれぞれ観察されることが分かる。すなわち、フットボール型のシャペロニン複合体は、例えば図１の右下の拡大図に示されている。また弾丸型のシャペロニン複合体は、例えば図１の左上の拡大図に示されている。

【0066】

［実施例２］
実施例１において、非修飾ＦｅＰｔナノ粒子の代わりにピルビン酸修飾ＦｅＰｔナノ粒子のＨＫＭ緩衝液分散液（濃度１００ｍｇ／ｍｌ）を用いて、ピルビン酸修飾ＦｅＰｔナノ粒子の最終濃度が３．５ｍｇ／ｍｌとなるようにしたこと以外は、実施例１と同様にして試料液を調製した。
実施例１と同様にして、透過型電子顕微鏡（加速電圧１２０ｋＶ）で観察を行ったところ、実施例１と同様に、シャペロニン変異体にピルビン酸修飾ＦｅＰｔナノ粒子が内包されているシャペロニン複合体が観察された。
また得られたシャペロニン複合体においては、ピルビン酸修飾ＦｅＰｔナノ粒子の磁性が維持された状態であった。

【0067】

［実施例３］
実施例１において、非修飾ＦｅＰｔナノ粒子の代わりにオレイン酸修飾ＦｅＰｔナノ粒子のＨＫＭ緩衝液分散液（濃度１００ｍｇ／ｍｌ）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして試料液を調製した。
実施例１と同様にして、透過型電子顕微鏡で観察を行ったところ、実施例１と同様に、シャペロニン変異体にオレイン酸修飾ＦｅＰｔナノ粒子が内包されているシャペロニン複合体が観察された。

【0068】

［実施例４］
ピルビン酸修飾ＦｅＰｔナノ粒子のＨＫＭ緩衝液分散液（濃度２０．０ｍｇ／ｍｌ）２０．０μｌ、５．０μＭのＧｒｏＥＬサブユニット変異体を含むＨＫＭ緩衝液０．８μｌ、１０．０μＭのＧｒｏＥＳサブユニットを含むＨＫＭ緩衝液０．８μｌをマイクロチューブ内で１分間ピペッティングして混合したのち、室温下にローテーター（ＲＴ−５（タイテック）、4ｒ／min）で４０分間撹拌した。その後、ＨＫＭ緩衝液１７．９９μｌと９６．６ｍＭのＡＴＰ溶液０．４１μｌを加え、さらに、室温下にローテーター（ＲＴ−５（タイテック）、4ｒ／min）で２０分間撹拌して試料液を調製した。この試料液４０．０μｌ中の最終濃度は以下の通りであった。
・ＧｒｏＥＬサブユニット変異体 ０．１μＭ
・ＧｒｏＥＳサブユニット ０．２μＭ
・ＡＴＰ １ｍＭ
・ピルビン酸修飾ＦｅＰｔナノ粒子 １０ｍｇ／ｍｌ

【0069】

上記で得られた試料液６．０μｌを親水化処理済みコロジオン支持膜に１分間接触させた。超純水６．０μｌで１回リンスした後、１．０％リンタングステン酸（ｐＨ４．０）６．０μｌを加えて１分間染色した。１６時間以上乾燥後、透過型電子顕微鏡ＪＥＭ２０００ＥＸ（日本電子社製）を用い、加速電圧１００ｋＶで観察した。得られた観察画像の一例を図２に示す。
得られた観察画像から、３５０個のシャペロニン複合体中の金属ナノ粒子を内包しているシャペロニン複合体の個数、及び金属ナノ粒子が未内包のシャペロニン複合体の個数をそれぞれ数え、金属ナノ粒子の内包率を算出したところ、９５．４％であった。

【0070】

［実施例５］
ピルビン酸修飾ＦｅＰｔナノ粒子のＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）分散液（濃度４０．０ｍｇ／ｍｌ）１２．５μｌ、５．０μＭのＧｒｏＥＬサブユニット変異体を含むＨＫＭ緩衝液２．０μｌ、１０．０μＭのＧｒｏＥＳサブユニットを含むＨＫＭ緩衝液２．０μｌ、ＨＫＭ緩衝液３３．５μｌをマイクロチューブ内で１分間ピペッティングして混合した。その後、ＨＫＭ緩衝液４８．９６μｌと９６．６ｍＭのＡＴＰ溶液１．０４μｌを加えて、さらに、室温下に２０秒間ピペッティングして試料液を調製した。この試料液１００．０μｌ中の最終濃度は以下の通りであった。
・ＧｒｏＥＬサブユニット変異体 ０．１μＭ
・ＧｒｏＥＳサブユニット ０．２μＭ
・ＡＴＰ １ｍＭ
・ピルビン酸修飾ＦｅＰｔナノ粒子 ５ｍｇ／ｍｌ
上記と同様にして６０９個のシャペロニン複合体中の金属ナノ粒子の内包率を算出したところ、８９．５％であった。

【0071】

［実施例６］
非修飾ＦｅＰｔナノ粒子分散液（濃度４０．０ｍｇ／ｍｌ、４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．５）６．２５μｌ、５．０μＭのＧｒｏＥＬサブユニット変異体を含むＨＫＭ緩衝液１０．０μｌ、１０．０μＭのＧｒｏＥＳサブユニットを含むＨＫＭ緩衝液１０．０μｌをマイクロチューブ内で１分間ピペッティングして混合した。次いでＨＫＭ緩衝液２９．４８μｌ、９６．６ｍＭのＡＴＰ溶液０．５２μｌを加えて、さらに、室温下に２０秒間ピペッティングして試料液を調製した。この試料液５０．０μｌ中の最終濃度は以下の通りであった。
・ＧｒｏＥＬサブユニット変異体 １．０μＭ
・ＧｒｏＥＳサブユニット ２．０μＭ
・ＡＴＰ １．０ｍＭ
・非修飾ＦｅＰｔナノ粒子 ５ｍｇ／ｍｌ

【0072】

上記で得られた試料液６．０μｌを親水化処理済みコロジオン支持膜に４０秒間接触させた。超純水６．０μｌで１回リンスした後、１．０％リンタングステン酸（ｐＨ４．０）６．０μｌを加えて１分間染色した。１６時間以上乾燥後、透過型電子顕微鏡ＨＴ−７５００（日立ハイテク社製）を用い、加速電圧８０ｋＶで観察した。
その結果、図１の右下の拡大図に示すようにＡＴＰの存在下に形成されたシャペロニン複合体は、フットボール型の形状であり、支持体上にフットボール型の長軸が支持体の面と略平行になるように配置されていた。

【0073】

［実施例７］
非修飾ＦｅＰｔナノ粒子分散液（濃度４０．０ｍｇ／ｍｌ、４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．５）６．２５μｌ、５．０μＭのＧｒｏＥＬサブユニット変異体を含むＨＫＭ緩衝液１０．０μｌ、１０．０μＭのＧｒｏＥＳサブユニットを含むＨＫＭ緩衝液１０．０μｌをマイクロチューブ内で１分間ピペッティングして混合した。次いでＨＫＭ緩衝液２９．４８μｌ、９９．１ｍＭのＡＤＰ溶液０．５１μｌを加えて、さらに、室温下に２０秒間ピペッティングして試料液を調製した。この試料液５０．０μｌ中の最終濃度は以下の通りであった。
・ＧｒｏＥＬサブユニット変異体 １．０μＭ
・ＧｒｏＥＳサブユニット ２．０μＭ
・ＡＤＰ １．０ｍＭ
・非修飾ＦｅＰｔナノ粒子 ５ｍｇ／ｍｌ

【0074】

上記で得られた試料液６．０μｌを親水化処理済みコロジオン支持膜に４０秒間接触させた。超純水６．０μｌで１回リンスした後、１．０％リンタングステン酸（ｐＨ４．０）６．０μｌを加えて１分間染色した。１６時間以上乾燥後、透過型電子顕微鏡ＨＴ−７７００（日立ハイテク社製）を用い、加速電圧８０ｋＶで観察した。得られた観察画像の一例を図３に示す。
図３から、ＡＤＰの存在下に形成されたシャペロニン複合体は、弾丸型の形状であり、支持体上に弾丸型の長軸が支持体の面に略垂直になるように配置されていることが分かる。

【0075】

［実施例８］
蛍光波長４６０ｎｍの量子ドットＣｄＳ ４６０（Ｌｕｍｉｄｏｔ^ＴＭLumidotTM、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）は、カルボン酸修飾されているため、トルエンに分散されて市販されている。これを以下のようにして分散媒を変更した。
マイクロチューブにＣｄＳ ４６０トルエン分散液（ＣｄＳ濃度５．０ｍｇ／ｍｌ）を１００．０μｌいれ、これにエタノール１．０ｍｌを加えて穏やかに混合した。１４５００ｒｐｍ×１０分間遠心後、上清を除去した。得られた黄色の沈殿物にメタノール５００．０μｌを加えて、超音波を約１分間照射して均一に分散して、濃度が１．０ｍｇ／ｍｌのＣｄＳナノ粒子分散液を得た。

【0076】

２．５μＭのＧｒｏＥＬサブユニット変異体を含むＨＫＭ緩衝液４０．０μｌ、５．０μＭのＧｒｏＥＳサブユニットを含むＨＫＭ緩衝液４０．０μｌ、ＨＫＭ緩衝液８．９６μｌをマイクロチューブ内で混合した。次いでＣｄＳナノ粒子分散液（濃度１．０ｍｇ／ｍｌ、メタノール）１０．０μｌを加えて１分間ピペッティングした後、９６．６ｍＭのＡＴＰ溶液１．０４μｌを加えて、さらに、室温下に２０秒間ピペッティングして試料液を調製した。この試料液１００．０μｌ中の最終濃度は以下の通りであった。
・ＧｒｏＥＬサブユニット変異体 １．０μＭ
・ＧｒｏＥＳサブユニット ２．０μＭ
・ＡＴＰ １．０ｍＭ
・ＣｄＳナノ粒子 ０．１ｍｇ／ｍｌ

【0077】

上記で得られた試料液６．０μｌを親水化処理済みコロジオン支持膜に４０秒間接触させた。超純水６．０μｌで１回リンスした後、１．０％リンタングステン酸（ｐＨ４．０）６．０μｌを加えて１分間染色した。１６時間以上乾燥後、透過型電子顕微鏡ＪＥＭ２０００ＥＸ（日本電子社製）を用い、加速電圧８０ｋＶで観察したところ、実施例１と同様に、ＣｄＳナノ粒子がシャペロニン変異体に内包されたシャペロニン複合体が観察された。

【0078】

以上の結果から、本発明のシャペロニン複合体は、複合体の形成効率に優れることが分かる。またＡＴＰの存在下にシャペロニン複合体を形成することで、シャペロニン変異体の２つの空洞の両方に金属ナノ粒子が内包されたフットボール型のシャペロニン複合体が得られることが分かる。一方、ＡＤＰの存在下にシャペロニン複合体を形成することで、シャペロニン変異体の２つの空洞の一方に金属ナノ粒子が内包された弾丸型のシャペロニン複合体が得られることが分かる。

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]