特許 6099210 アジュバント化合物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6099210

(24)【登録日】2017年3月3日

(45)【発行日】2017年3月22日

(54)【発明の名称】アジュバント化合物

(51)【国際特許分類】

   C07C 323/60 20060101AFI20170313BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20170313BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20170313BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20170313BHJP

   A61K 47/50 20170101ALI20170313BHJP

   A61K 47/42 20170101ALI20170313BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20170313BHJP

   C07K 7/06 20060101ALI20170313BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20170313BHJP

   C07H 21/00 20060101ALN20170313BHJP

【ＦＩ】

   C07C323/60

   A61K39/39

   A61K39/00 G

   A61P37/04

   A61K39/00 A

   A61K47/48

   A61K47/42

   C07K16/00ZNA

   C07K7/06

   C12N15/00 G

   !C07H21/00CSP

【請求項の数】15

【全頁数】35

(21)【出願番号】特願2014-534504(P2014-534504)

(86)(22)【出願日】2012年10月4日

(65)【公表番号】特表2014-530808(P2014-530808A)

(43)【公表日】2014年11月20日

(86)【国際出願番号】NL2012050694

(87)【国際公開番号】WO2013051936

(87)【国際公開日】20130411

【審査請求日】2015年8月17日

(31)【優先権主張番号】2007536

(32)【優先日】2011年10月5日

(33)【優先権主張国】NL

(31)【優先権主張番号】61/543,510

(32)【優先日】2011年10月5日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/615,566

(32)【優先日】2012年3月26日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】514084004

【氏名又は名称】アイエスエー ファーマシューティカルズ ビー．ヴイ．

【氏名又は名称原語表記】ＩＳＡ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｂ．Ｖ．

(74)【代理人】

【識別番号】100107456

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 成人

(74)【代理人】

【識別番号】100162352

【弁理士】

【氏名又は名称】酒巻 順一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100123995

【弁理士】

【氏名又は名称】野田 雅一

(74)【代理人】

【識別番号】100148596

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 和弘

(72)【発明者】

【氏名】オッセンドープ， フェルディナンド アントニウス

(72)【発明者】

【氏名】メリーフ， コーネリス ヨハネス マリア

(72)【発明者】

【氏名】カーン， セリーナ

(72)【発明者】

【氏名】フィリッポフ， ドミトリ ヴィクトロヴィッツ

(72)【発明者】

【氏名】フォン ダー マーエル， ギスバート アリー

【審査官】 斉藤 貴子

(56)【参考文献】

【文献】 特開平０４−０５４１３１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１１／１１９７５９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開昭５９−１３９３４８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１１−５０６３０９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 MOYLE, P. M. and TOTH, I.，CURRENT MEDICINAL CHEMISTRY，ベルギー，BENTHAM SCIENCE PUBLISHERS BV，２００８年 １月 １日，V15 N5，P506-516

【文献】 HIDA, T. et al.，THE JOURNAL OF ANTIBIOTICS，１９９５年 １月 １日，V48 N7，P589-603

【文献】 SPOHN, R. et al.，Synthetic lipopeptide adjuvants and Toll-like receptor 2−structure-activity relationships，Vaccine，２００４年，22(19)，2494-2499

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｃ ３２３／６０

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

【化1】

上記の式［１］（式中、Ｒ^１及びＲ^２は、それぞれ独立して、１０〜１７個の炭素原子を有する直鎖状のアルキル基であり、ｎは１１〜１８（１８を含む）であり、Ｙは硫黄であり、ＸはＯであり、Ｒは６０個以下のアミノ酸のペプチドを含む有機基である）によって表される化合物。

【請求項2】

Ｒ^１及びＲ^２が１５個の炭素原子を有する直鎖状のアルキル基である、請求項１に記載の化合物。

【請求項3】

ｎが１１〜１５（１５を含む）である、請求項１又は２に記載の化合物。

【請求項4】

ＲがＳＫ_ｍ（式中、ｍは１、２、３、４又は５である）であり、Ｒが抗原に任意にカップリングされている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項5】

Ｒ^１及びＲ^２が１５個の炭素原子を有する直鎖状のアルキル基であり、ｍが４であり、ｎが１２又は１４である、請求項４に記載の化合物。

【請求項6】

基Ｒが、

【化2】

（式中、Ｒ^４はＫ_ｍペプチド部分であり、ｍは１、２、３、４又は５であり、Ｒ^４は抗原に任意にカップリングされており、Ｒ^５は水素であるか、炭素、窒素及び酸素から選択される１〜６個の原子を含む基である）によって表される、請求項１に記載の化合物。

【請求項7】

Ｒ^５が−ＣＨ_２−ＯＨ基、−ＣＨ_２−ＣＨ_３基、−（ＣＨ_２）_３−ＣＨ_３基、−ＣＨ_２Ｃ≡ＣＨ基、−ＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ_２基、又は−（ＣＨ_２）_２ＮＨ_２基である、請求項６に記載の化合物。

【請求項8】

Ｒ^５が水素ではなく、Ｒ^５が結合されている不斉炭素がＬ体配置を有する、請求項６又は７に記載の化合物。

【請求項9】

Ｋ_ｍペプチド部分が抗原にカップリングされている、請求項４〜８のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項10】

（ａ）任意に固定化及び／又は側鎖保護されているＲ−Ｈを用意するステップと、
（ｂ）置換システイン構成単位Ｆｍｏｃ−（Ｙ−（２−（ＯＣ（Ｏ）Ｒ^２）−３−（ＯＣ（Ｏ）Ｒ^１））プロピル）−Ｃｙｓ−ＯＨをＲ−Ｈへカップリングさせるステップと、
（ｃ）得られたペプチドのＮ末端からＦｍｏｃ基を切断するステップと、
（ｄ）Ｆｍｏｃ遊離ペプチドをＨ−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｎ＝Ｃ＝Ｘで処理するステップと
を含む（式中、Ｒ、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｘ、Ｙ及びｎは請求項１〜８のいずれか一項で定義した通りである）、請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物を調製する固相ペプチド合成方法。

【請求項11】

Ｒが６０個以下のアミノ酸のペプチドを含む有機基であり、Ｒ−Ｈが固定化及び／又は側鎖保護されている、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物と、
別個の化合物として、又は請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物の一部としての抗原と、を含む組成物。

【請求項13】

薬剤を製造するための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物又は請求項１２に記載の組成物の使用。

【請求項14】

請求項１３に記載の組成物の使用であって、前記組成物は、抗原に対する予防用又は治療用ワクチンとして使用するためのものである、使用。

【請求項15】

抗原に対する対象の免疫反応を誘導、維持及び／若しくは増強するためのワクチン組成物、並びに／又は対象の抗原に関連する疾患若しくは状態を予防、遅延及び／若しくは治療するためのワクチン組成物を製造するための、
請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物と、
別個の化合物として、又は請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物の一部としての抗原と、の使用。

【発明の詳細な説明】

【発明の詳細な説明】

【0001】

［発明の分野］
本発明は、ワクチン組成物におけるアジュバントとして適する新規化合物、その化合物を調製する方法及びその化合物を含む組成物に関する。

【0002】

［発明の背景］
ワクチン接種の手法は、感染因子との接触後に疾患を発症することから患者を保護する防御免疫を促進することを主な目的として数十年間使用されてきている。この目的を達成するため、生きた弱毒化病原体、死滅病原体若しくは破砕病原体、病原体調製物、又は病原体の精製成分若しくは組換え成分を患者に投与し、それぞれの病原体の抗原成分に対する特異的免疫反応を誘起してきた。このような免疫反応を刺激する成分は、例えば、病原体特異的タンパク質、多糖類又は脂質であり得る。病原体に含まれる抗原に対する特異的免疫反応は、アジュバントの同時投与によってさらに刺激することができる。アジュバントが１種又は複数の抗原に対する特異的免疫反応の質を加速、延長又は増強することは当技術分野では公知であり、ワクチンの一部として現在使用されている。提唱するアジュバントの利点としては、１）ワクチンにとって最適である免疫反応を誘導し最適化する能力、２）ワクチンを粘膜へ送達することができる能力、３）細胞性免疫反応を促進する能力、４）高精製した抗原又は組換え抗原などの弱毒化免疫原の免疫原性を増強する能力、５）防御免疫を獲得するのに必要な抗原の量又は免疫化の頻度を低減する能力、６）免疫反応が低下しているか弱まっている個体、例えば、新生児、高齢者及び免疫不全患者などにおけるワクチンの有効性を改善する能力が挙げられる。

【0003】

アジュバントには様々な作用機序がある。一組のアジュバントはトール様受容体を介して作用する。トール様受容体（ＴＬＲ）は特定のパターンの微生物成分、特に病原体由来の成分を認識し、先天免疫及び適応免疫の両方の活性化を制御する。未熟な樹状細胞はこれらの微生物成分に反応して成熟する。今のところ、ＴＬＲファミリーの１３種類のメンバーが同定されている。ＴＬＲは、単球、マクロファージ及び樹状細胞などの食細胞によって発現される。リガンド結合を介してＴＬＲが活性化されると、ＭｙＤ８８依存性経路（ＮＦ−［カッパ］β）又はＭｙＤ８８非依存性経路（ＩＦＲ−３）のいずれかでシグナル変換現象が生じる。トール様受容体２（ＴＬＲ２）と相互に作用する公知のリポペプチドアジュバントは、いわゆるＰａｍ３Ｃｙｓ−リポペプチドである。Ｒｅｎａｔｅ Ｓｐｏｈｎら（Ｖａｃｃｉｎｅ ２２ （２００４） ２４９４−２４９９）によれば、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫ４異型体は、マウスでの細胞性免疫反応を決定する最も有効な添加剤であることが判明した。Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫ４の別の利点は、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫ４が化学的に安定しており、しかも高品質で多量に生産することができるということである。アジュバントとして使用するためのＰａｍ３Ｃｙｓ−リポペプチドである、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−（Ｌｙｓ）４（Ａｃａ−Ａｃａ−ビオチン）．２トリフルオロアセタートは、例えば、Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ，ＵＳＡから市販されている。

【0004】

国際公開第２００９／０７２７６７号には、ワクチン用アジュバントとしてのＰａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫ４とポリイノシン酸：ポリシチジル酸の混合物の使用が開示されている。

【0005】

本発明の目的は、Ｐａｍ３Ｃｙｓ様リポペプチドの免疫反応を改善することである。

【0006】

［発明の要約］
本発明は、より良好な免疫反応を誘導する、改良Ｐａｍ３Ｃｙｓ様リポペプチドに関する。新規化合物は、

【化1】

（式中、Ｒ^１及びＲ^２は、それぞれ独立して、炭素、窒素、酸素及び硫黄から選択される１７個以下の原子を有する分枝状又は直鎖状の基であり、ｎは０〜１８（１８を含む）であり、Ｙは硫黄又はセレンであり、ＸはＳ又はＯであり、Ｒは−ＯＨであるか、１つ若しくは複数のペプチド、１つ若しくは複数の核酸、１つ若しくは複数の抗体、又はそれらの組み合わせを含む有機基である）によって表される。Ｒ^１及びＲ^２は、それぞれ独立して、１７個以下の炭素原子、好ましくは１０〜１７個の炭素原子を有する分枝状又は直鎖状のアルキル基であるのが好ましい。Ｒ^１及びＲ^２は、それぞれ独立して、１７個以下の炭素原子、好ましくは１０〜１７個の炭素原子を有する分枝状又は直鎖状のアルキル基であり、Ｙは硫黄であるのが好ましい。

【0007】

出願人は、公知のＰａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫ４と比較した場合、本発明に記載の化合物がＴＬＲ２を機能的に刺激的することにより改良された免疫反応を誘導することができることを見出した。以下の理論に拘束されるものではないが、より高い刺激レベルは、公知の化合物のＮ末端パルミトイル成分中の架橋−ＣＨ_２−基を−ＮＨ−架橋基へ交換することにより達成されるものと出願人は考えている。化合物の脂肪鎖が二量体受容体の規定のくぼみに適合し、架橋−ＮＨ−基が組み入れられることによって、水素架橋が形成されると考えられる。これによってリガンドが受容体へより強固に結合され、その結果として所望のアジュバント活性を得るのに有益である。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】先行技術によるＰａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫ４化合物及び本発明に記載の化合物の実施例２つを示す図である。

【図2】本発明に記載の化合物の調製に関する合成スキームを示す図である。

【図3】ＴＲＬ２トランスフェクトＨＥＫ細胞及びＴＲＬ２トランスフェクト樹状細胞を先行技術による化合物及び本発明に記載の化合物とインキュベートした試験結果を示す図である。

【図4】先行技術による化合物、本発明に記載の化合物とインキュベートしたマウスＤＣ細胞株、又は未刺激のままとしたマウスＤＣ細胞株についての試験結果を示す図である。

【図5】ヒト単球由来の樹状細胞（ｍｏＤＣ）の活性化についての結果を示す図である。

【図6】ＯＶＡ抗原（ＳＩＩＮＦＥＫＬ ＣＴＬエピトープを含有）のＵ−Ｐａｍコンジュゲート合成長鎖ペプチドのインビボにおけるＴ細胞刺激能力を示す図である。

【0009】

［発明の詳細な説明］
本発明に記載の化合物（１）は、Ｓ又はＯである基Ｘを有することができる。合成が容易なため天然に存在するＯが好ましい。Ｓ原子は、当業者には公知の異型体である。Ｙは硫黄又はセレンであるが、実施例で示すように硫黄が好ましい。

【0010】

Ｒ^１及びＲ^２は、それぞれ独立して、炭素、窒素、酸素及び硫黄から選択される１７個以下の原子を有する分枝状又は直鎖状の基であり、直鎖状のアルキル基は１７個以下の炭素原子、好ましくは１０〜１７個の炭素原子を有するのが好ましい。一実施形態では、Ｒ^１及びＲ^２は、それぞれ独立して、炭素、窒素、酸素及び硫黄から選択される１個又は複数を含有する１７個以下の原子（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６又は１７個のそれぞれの原子）の長さを有する分枝状又は直鎖状の基であるのが好ましい。当業者には、「１７個以下の原子の長さ」という用語は、本発明の状況において、分枝状又は直鎖状の基の骨格が１７個以下の原子を含むことを意味し、したがって、脂肪族基の水素原子は１７個以下の原子の数の計算には含まれていないことは公知である。さらに好ましい基Ｒ^１及び基Ｒ^２は、１５個の炭素原子を含む直鎖状アルキル基である。含まれる炭素原子がより少なく、親油性が低いタイプの化合物を生じる基は、可溶性がより良好で、それによって、予測可能な溶液中での挙動を示すことができることから有利であり得る。

【0011】

式（１）において、ｎは０〜１８（１８を含む）であり、好ましくは少なくとも４であり、より好ましくは１１〜１５（１５を含む）である。出願人は、式中、ｎが１１である化合物、及びｎが１３である化合物に関して有利な結果を確認した。

【0012】

第１の実施形態では、Ｒは１つ又は複数のペプチドを含む有機基である。この点で、本発明に記載の化合物はペプチドコンジュゲートと呼ばれる。これらのペプチドは天然アミノ酸だけを含むことができるが、さらにこれらのペプチドに合成アミノ酸が含まれていてもよい。Ｒは６０個以下のアミノ酸のペプチドであるのが好ましい。適切なペプチドの例はＳＳＮＡＳＫ４、ＳＲ８、ＲＰＤＲＹ−ＮＨ_２及びＱＰＤＲＹ−ＮＨ_２である。好ましいペプチドはＳＫ_ｍ（式中、ｍは１、２、３、４又は５である）である。ｍは４であるのが好ましい。またＳＫ４はＳｅｒＬｙｓＬｙｓＬｙｓＬｙｓとしても知られている。ＳＫ_ｍペプチドのＳ部分、さらに好ましくはＳＫ４ペプチドのＳ部分は、下記のように適切に修飾されていてもよく、ＳＫ_ｍペプチドは、抗原に任意にさらにカップリングされていてもよい。好ましい修飾型ＳＫ_ｍペプチドは、

【化2】

（式中、Ｒ^４は、抗原に任意にさらにカップリングされているＫ_ｍペプチド部分を表し、Ｒ^５は、水素であるか、炭素、窒素及び／又は酸素から選択される１〜６個の原子を含む比較的小さな基である）によって示される。ｍは４であるのが好ましい。可能性のある基Ｒ^５の例は水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、好ましくはＣ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、好ましくはＣ２〜Ｃ３アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、好ましくはＣ２〜Ｃ３アルキニル、Ｃ１〜Ｃ５ヒドロキシアルキル、Ｃ１〜Ｃ５メルカプトアルキル、Ｃ１〜Ｃ５アミノアルキル、Ｃ１〜Ｃ４−シアノアルキル、Ｃ１〜Ｃ３−アジドアルキル、例えば−ＣＨ_２Ｎ_３基、Ｃ１〜Ｃ６−ハロアルキル、例えば−ＣＨ_２Ｘ基（Ｘ＝Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ）、炭素、窒素、酸素及び硫黄から選択される１個又は複数を含有する芳香族の５員環又は６員環、並びに炭素、窒素、酸素及び硫黄から選択される１個又は複数を含有する３員〜６員の（ヘテロ）環が好ましい。Ｒ^５は、水素、−ＣＨ_２−ＯＨ基、−ＣＨ_２−ＣＨ_３基、−（ＣＨ_２）_２−ＣＨ_３基、−（ＣＨ_２）_３−ＣＨ_３基、−ＣＨ_２Ｃ≡ＣＨ基、−ＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ_２、−（ＣＨ_２）_２ＮＨ_２基、−ＣＨ_２−ＳＨ基、−ＣＨ_２−２−チオフェン基、２−チオフェン基、又は−ＣＨ_２−ＣＮ基が好ましく、Ｒ^５は、−ＣＨ_２−ＯＨ基、−ＣＨ_２−ＣＨ_３基、−（ＣＨ_２）_２−ＣＨ_３基、−（ＣＨ_２）_３−ＣＨ_３基、−ＣＨ_２Ｃ≡ＣＨ基、−ＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ_２、又は−（ＣＨ_２）_２ＮＨ_２基であるのがさらに好ましい。Ｒ^５が結合されている不斉炭素の配置はＬ体又はＤ体であってもよく、その配置がＬ体であるのが好ましい。

【0013】

基Ｒは抗原を含むことができ、式（２）の基Ｒ^４が抗原を含むことがさらに好ましい。抗原は、直接的に又はスペーサー分子：リンカーを介してペプチド、特にＫ_ｍペプチド部分にカップリングさせることができる。本発明の状況における「リンカー」とは、成分に関して少なくとも２つの結合点を有する低分子量の成分を意味するものと理解されたい。この点で、二価のリンカーはこのような２つの結合点を有しており、多価リンカーはこのような少なくとも３つの結合点を有する。これらの結合点の１つを介して、リンカーはＲのペプチド成分に結合され、１つ又は複数の残りのそれぞれの結合点は上記で定義した抗原に結合される。これらの結合点はリンカーの前駆体の官能基に由来し、少なくとも１つの抗原を本発明に記載のアジュバント化合物に結合させることができる。リンカーは８００Ｄａ以下の分子量を有するのが好ましい。これはすべて従来の化学である。

【0014】

抗原がリンカーに連結される適切な化学結合及び／又はリンカーが本発明に記載のアジュバント化合物のＲ基に連結される適切な化学結合の例は、脂肪鎖を含有しており、単一又は繰返しのチオエーテル、アミド、アミン、オキシム、ジスルフィド、チアゾリジン、チオ尿素、エステル、チオエステル、エーテル、カルバメート、チオカルバメート、カーボネート、チオカーボネート、ヒドラゾン、サルフェート、スルファミデート、スルホネート、スルホンアミド、ホスフェート、ホスホロチオエート、グリオキシル−オキシムを任意に含む有機分子、又はディールスアルダー（Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ）付加環化、シュタウディンガー（Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ）ライゲーション、ネイティブライゲーション若しくはヒュスゲン（Ｈｕｉｓｇｅｎ）１，３−二極性付加環化を介して得られる結合である。カップリング方法は数ある中でもＣｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．２０１０、３９、２０５４に開示されており、その文献は参照により本明細書に組み込まれる。

【0015】

適切なリンカーの例は、ウニリンカー（Ｕｎｙｌｉｎｋｅｒ）型リンカー、α，ω−ジヒドロキシアルカン及びオリゴ又はポリエチレングリコール誘導体である。リンカーは天然又は非天然アミノ酸残基、脂環式化合物、例えばシクロヘキサン及びシクロペンタン誘導体、並びに（ヘテロ）芳香族環、例えば置換フェニル及び置換トリアゾールを挙げることができる。

【0016】

リンカーが使用されない場合、抗原は本発明に記載の化合物の残りの部分に、好ましくは基ＲのＫｍペプチド部分に直接カップリングされる。Ｋｍペプチド部分と抗原の間の適切な結合の例は、チオエーテル結合、ジスルフィド結合、アミド結合又はエステル結合である。

【0017】

任意にリンカーを介した、本発明に記載のアジュバント化合物の抗原の共有結合的導入の代わりに、カップリングはイオン結合を介して生じさせることもできる。適切なイオン結合の例は、Ｋｍペプチド部分のリジン側鎖の正荷電アミン基と抗原の負荷電アミノ酸残基の間のクーロン力相互作用である。さらなる実施形態では、本発明に記載のアジュバント化合物、好ましくは式（１）に記載の化合物は抗原にカップリングされていてもよいが、本明細書に記載の技術を使用して、別の化合物、例えば抗体、核酸、例えばポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドなどにカップリングされていてもよい。別の化合物は、基Ｒに、さらに好ましくは式（２）の基Ｒ^４にカップリングされるのが好ましい。別の化合物は式（２）のペプチドに、特にＫ_ｍペプチド部分にカップリングされていてもよい。

【0018】

第２の実施形態では、Ｒは、１種又は複数の核酸、例えば１種又は複数のオリゴヌクレオチド或いは１種又は複数のポリヌクレオチド、好ましくは１種又は複数のオリゴヌクレオチドを含む有機基である。オリゴヌクレオチドはセンスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチドであってもよい。この点で、本発明に記載の化合物は核酸コンジュゲートと呼ばれる。このような核酸は、式（１）の化合物に直接カップリングされてもよいし、リンカーを介して結合されてもよい。リンカーが使用されない場合、核酸は、Ｒが結合されているカルボニル炭素原子を介して、式（１）に記載の化合物に核酸の３’末端又は５’末端のリン酸ジエステル基の酸素原子又はリン原子を介してカップリングされるのが好ましい。上述のリンカーを使用するのが好ましい。このようなリンカーの一末端は、Ｒが結合されているカルボニル炭素原子を介して式（１）に記載の化合物に結合されており、リンカーの別の末端は、好ましくはオリゴヌクレオチドの３’末端又は５’末端のリン酸ジエステル基の酸素原子又はリン原子を介して核酸に結合される。

【0019】

本発明の状況では、「核酸」は、５〜６０個のヌクレオチド（すなわち、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９又は６０個のヌクレオチド）の長さを有するのが好ましい。核酸、例えばポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドは、当業者に公知の任意の核酸、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ又はそれらの組み合わせであってもよい。したがって、核酸は天然に存在するヌクレオチド、又は天然に存在するヌクレオチドに対して１つ若しくは複数の修飾を有するヌクレオチド類似体を含むことができる。この点で、天然に存在するヌクレオチドはＤＮＡ又はＲＮＡに含まれるものである。ヌクレオチド類似体は、修飾核酸塩基、修飾糖成分、修飾ヌクレオシド間連結、及びそれらの組み合わせから選択される少なくとも１種の修飾を含む。修飾の例は、修飾された糖成分及び／又は修飾ヌクレオシド間連結を含む、修飾骨格である。このため、核酸の骨格及び核酸塩基は、当業者に一般に公知の技術によって修飾し、特異性の増強若しくは低減及び／又は安定性の増強若しくは低下を達成することができる。したがって、核酸はＲＮＡ残基、ＤＮＡ残基、ヌクレオチド類似体又は本明細書の下記にさらに詳述する同等物を含むことができる。

【0020】

核酸は、ヌクレアーゼ耐性の増加及び／又は標的配列に対する（アンチセンス）ヌクレオチドの親和性の増大を図るように修飾される１個又は少なくとも１個の残基を含むのが好ましい。したがって、好ましい実施形態では、核酸は、１つ又は少なくとも１つのヌクレオチド類似体又は同等物を含み、ここで、ヌクレオチド類似体又は同等物は修飾塩基及び／又は修飾骨格及び／又は非天然ヌクレオシド間連結、或いはこれらの修飾の組み合わせを有する残基と定義する。

【0021】

好ましい実施形態では、ヌクレオチド類似体又は同等物は修飾骨格を含む。このような骨格の例は、モルホリノ骨格、カルバメート骨格、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシド及びスルホン骨格、ホルムアセチル（ｆｏｒｍａｃｅｔｙｌ）及びチオホルムアセチル（ｔｈｉｏｆｏｒｍａｃｅｔｙｌ）骨格、メチレンホルムアセチル骨格、リボアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファメート、スルホネート及びスルホンアミド骨格、メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格、並びにアミド骨格が挙げられる。ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーは、これまでアンチセンス剤として研究されてきた、修飾骨格オリゴヌクレオチドである。モルホリノオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡのデオキシリボース糖が六員環で置換され、リン酸ジエステル結合がホスホロジアミデート結合で置換されている、非荷電骨格を有する。モルホリノオリゴヌクレオチドは酵素分解に強く、また翻訳を阻害するか、又はリボヌクレアーゼＨの活性化によってではなくｍＲＮＡ前駆体スプライシングを妨げることによってアンチセンス剤として作用すると考えられる。モルホリノオリゴヌクレオチドは、細胞膜の物理的破壊方法によって組織培養細胞まで順調に送達され、これらのいくつかの方法を比較する一研究では、スクレープローディング（ｓｃｒａｐｅ ｌｏａｄｉｎｇ）が送達の最も効率的な方法であることが分かった。しかし、モルホリノ骨格は非荷電であるため、カチオン性脂質は細胞でのモルホリノオリゴヌクレオチド吸収に関する効果的なメディエーターではない。

【0022】

骨格中の残基間の連結はリン原子を含んでいないことがさらに好ましく、例えば、短鎖アルキル又はシクロアルキルヌクレオシド間連結によって形成される連結、混合ヘテロ原子とアルキル又はシクロアルキルヌクレオシド間連結によって形成される連結、或いは１つ又は複数の短鎖ヘテロ原子又はヘテロ環ヌクレオシド間連結によって形成される連結である。

【0023】

好ましいヌクレオチド類似体又は同等物は、修飾ポリアミド骨格を有するペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む（Ｎｉｅｌｓｅｎら、（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４、１４９７−１５００）。ＰＮＡ系分子は、塩基対認識の観点によればＤＮＡ分子の真の模倣体である。ＰＮＡの骨格は、ペプチド結合によって連結されている、Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシン単位から構成されており、ここで、核酸塩基はメチレンカルボニル結合によってこの骨格に連結される。代替骨格は、１個の炭素が伸長されたピロリジンＰＮＡモノマーを含む（Ｇｏｖｉｎｄａｒａｊｕ及びＫｕｍａｒ（２００５）Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ、４９５−４９７）。ＰＮＡ分子の骨格が非荷電のリン酸基を含んでいるため、ＰＮＡ−ＲＮＡハイブリッドはそれぞれＲＮＡ−ＲＮＡ又はＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドよりも通常さらに安定している（Ｅｇｈｏｌｍら、（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６５、５６６−５６８）。

【0024】

さらに好ましい骨格は、リボース又はデオキシリボース糖が６員モルホリノ環で置換されている、モルホリノヌクレオチド類似体又は同等物を含む。最も好ましいヌクレオチド類似体又は同等物は、リボース又はデオキシリボース糖が６員モルホリノ環で置換されており、隣接するモルホリノ環の間のアニオン性リン酸ジエステル結合が非イオン性ホスホロジアミデート結合で置換されている、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）を含む。

【0025】

さらなる実施形態では、本発明のヌクレオチド類似体又は同等物は、ホスホジエステル結合に少なくとも１つの非架橋酸素の置換を含む。この修飾によって塩基対はわずかに不安定になるが、ヌクレアーゼ分解に対する顕著な耐性が加わる。好ましいヌクレオチド類似体又は同等物は、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、Ｈ−ホスホネート、メチルホスホネート及び他のアルキルのホスホネート、例えば３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネート及びキラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホロアミデート、例えば３’−アミノホスホロアミデート及びアミノアルキルホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート又はボラノホスフェートを含む。

【0026】

さらに好ましい本発明のヌクレオチド類似体又は同等物は、２’、３’及び／又は５’位で、例えば−ＯＨ；−Ｆ；１個又は複数のヘテロ原子が割り込んでいてもよい、置換又は無置換の直鎖状又は分枝鎖状低級（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アリル、アリール又はアラルキル；Ｏ−、Ｓ−、又はＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、又はＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−又はＮ−アルキニル；Ｏ−、Ｓ−、又はＮ−アリル；Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル、−メトキシ、−アミノプロポキシ；アミノオキシ、メトキシエトキシ；−ジメチルアミノオキシエトキシ；及び−ジメチルアミノエトキシエトキシで一置換又は二置換されている、１つ又は複数の糖成分を含む。糖成分はピラノース又はその誘導体、或いはデオキシピラノース又はその誘導体であってもよく、リボース又はその誘導体、或いはデオキシリボース又はその誘導体であるのが好ましい。このような好ましい誘導体化糖成分は、２’−炭素原子が糖環の３’又は４’炭素原子に連結され、それにより二環式糖成分を形成する、架橋型核酸（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）（ＬＮＡ）を含む。好ましいＬＮＡは２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン−架橋核酸を含む（Ｍｏｒｉｔａら、２００１．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｎｏ．１：２４１−２４２）。これらの置換によってヌクレオチド類似体又は同等物にリボヌクレアーゼＨ及びヌクレアーゼの耐性が付与され、標的ＲＮＡに対する親和性が高まる。

【0027】

（アンチセンス）オリゴヌクレオチドの全位置を均一に修飾する必要はないことは当業者には理解されよう。さらに、複数の前述の類似体又は同等物は、単一の（アンチセンス）オリゴヌクレオチドに組み入れることができるか、或いは（アンチセンス）オリゴヌクレオチド内の単一の位置であっても組み入れることができる。特定の実施形態では、本発明の（アンチセンス）オリゴヌクレオチドは、少なくとも２つの異なる種類の類似体又は同等物を有する。好ましい実施形態では、修飾はオリゴヌクレオチドの全長にわたって行われる。

【0028】

好ましいオリゴヌクレオチドは、天然オリゴヌクレオチドであっても合成オリゴヌクレオチドであってもよい、免疫調節するオリゴヌクレオチドである。このようなオリゴヌクレオチドは、トール様受容体、好ましくはトール様受容体９（ＴＬＲ９）に作用することによって免疫調節するのが好ましい。このようなオリゴヌクレオチドは、１つ又は複数の、例えば１、２、３、４、５、６又は７つ以上のＣｐＧ（メチル化されていないシチジン−リン酸−グアノシン（ＣｐＧ）ジヌクレオチド）、さらに好ましくは１つ又は複数のクラスＢのＣｐＧを含むのが好ましい。オリゴヌクレオチドを含む好ましいクラスＢのＣｐＧは、Ｄｒｕｇｓ Ｒ Ｄ． ２００６；７（５）：３１２−６に開示されている、配列５’−ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ−３’（配列番号１０）を含むＣｐＧ７９０９であり、前記文献は参照により本明細書に組み込まれる。オリゴヌクレオチドを含むクラスＢのＣｐＧは、ヒトＢ細胞及び単球の成熟に関する強力な刺激剤である。好ましいクラスＢのＣｐＧオリゴヌクレオチドは、１つ又は複数の、好ましくは３つの６量体ＣｐＧモチーフ５’−Ｐｕ Ｐｙ Ｃ Ｇ Ｐｙ Ｐｕ−３’、部分的又は完全にホスホロチオエート化された骨格を含み、１８〜２８個のヌクレオチド、例えば１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７又は２８個のヌクレオチドの長さが好ましい。オリゴヌクレオチドを含む別の好ましいＣｐＧは、１つ又は複数の、例えば１、２、３、４、５、６、７つ以上のクラスＡのＣｐＧを含む。クラスＡのＣｐＧは大量のＩ型インターフェロン、特にＩＦＮαの産生を刺激し、ｐＤＣの成熟を誘導し、及び／又は間接的なサイトカインシグナル伝達を介したＮＫ細胞の強力な活性化因子である。

【0029】

好ましいクラスＡのＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’末端、３’末端又はその両方での１つ又は複数のｐｏｌｙ Ｇ配列と、内部パリンドローム配列と、１つ又は複数の内部パリンドローム内ＧＣジヌクレオチドと、部分的にホスホロチオエート化された骨格、好ましくは一末端又は両末端で７〜１０個がホスホロチオエート化されている塩基とを含む。

【0030】

好ましい実施形態では、Ｒはペプチドと核酸、好ましくは上述のペプチドとオリゴヌクレオチドを含む有機基である。本発明のこの第３の態様では、本発明に記載の化合物はペプチド／核酸コンジュゲートと呼ばれ、ペプチド／オリゴヌクレオチドコンジュゲートが好ましい。この点で、核酸は、ペプチドに直接的に又は本明細書に記載のリンカーを介してカップリングされ、それが次に式（１）に記載の化合物にカップリングされる。好ましい実施形態では、核酸は、Ｒ^４又はＲ^５に、好ましくは式（２）によって表される（修飾）ＳＫ_ｍペプチドのＲ^４に、直接的に又は本明細書に記載のリンカーを介してカップリングされる。或いは、核酸は、ＳＫ_ｍペプチド、好ましくはＳＫ_４ペプチドのＫ_ｍ部分に、直接的に又は本明細書に記載のリンカーを介してカップリングさせることができる。

【0031】

特に好ましい実施形態では、核酸は、ＳＫ_ｍペプチド、好ましくはＳＫ_４ペプチドの末端リジン残基に、直接的に又は本明細書に記載のリンカーを介してカップリングされる。この点で、リンカーは６個の炭素原子を含有するリンカーであるのが好ましい。

【0032】

ペプチド／核酸コンジュゲートの製造は、例えばＣａｒｔｅｒ及びＬｅＢｅａｎ、Ｊ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ、２０１１（ｄｏｉ：１０．４０６１／２０１１／９２６５９５）から当技術分野では公知であり、その文献は参照により本明細書にその全体が組み込まれる。

【0033】

第４の実施形態では、Ｒは１つ又は複数の抗体を含む有機基である。この点で、本発明に記載の化合物は抗体コンジュゲートと呼ばれる。抗体は当業者に公知の任意の抗体であってよい。好ましい抗体は、１）癌細胞表面上の特定の標的分子に対する抗体：分化抗原、例えばＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、過剰発現抗原、例えばＨＥＲ−２／Ｎｅｕ、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）；２）例えば非活性化制御性Ｔ細胞などの自己免疫性疾患を引き起こすか免疫制御に関与しているＴ細胞のサブセットを欠失させることを目的としたＴ細胞の表面分子に対する抗体、例えばＩＬ−２受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−１５受容体、からなるリストから選択される。

【0034】

抗体は、核酸について上述したように、式（１）に記載の化合物にカップリングさせることができる。このような場合、抗体は、直接的に又は本明細書に記載のリンカーを介してカップリングさせることができる。

【0035】

或いは、抗体は、上述のペプチドコンジュゲートに、好ましくは式（２）によって表される（修飾）ＳＫ_ｍペプチドのＲ^４に、直接的に又は本明細書に記載のリンカーを介してカップリングさせることができる。このような第５の実施形態では、Ｒはペプチドと抗体を含む有機基である。この点で、本発明に記載の化合物はペプチド／抗体コンジュゲートと呼ばれる。この点で、抗体は、ペプチドに直接的に又は本明細書に記載のリンカーを介してカップリングされ、それは次に式（１）に記載の化合物にカップリングされる。好ましい実施形態では、抗体は、Ｒ^４又はＲ^５に、好ましくは式（２）により表わされる（修飾）ＳＫ_ｍペプチドのＲ^４に、直接的に又は本明細書に記載のリンカーを介してカップリングされる。或いは、抗体は、ＳＫ_ｍペプチド、好ましくはＳＫ_４ペプチドのＫ_ｍ部分に、直接的に又は本明細書に記載のリンカーを介してカップリングさせることができる。

【0036】

特に好ましい実施形態では、抗体は、ＳＫ_ｍペプチド、好ましくはＳＫ_４ペプチドの末端リジン残基に、直接的に又は本明細書に記載のリンカーを介してカップリングされる。この点で、リンカーは６個の炭素原子を含有するリンカーであるのが好ましい。

【0037】

第６の実施形態では、Ｒはヒドロキシル又はＯＨである。この態様に記載の化合物は、下記の用途において、例えば同時投与において、ペプチド、核酸又は抗体と組み合わせて使用することができる。

【0038】

本発明に記載の好ましい化合物は式（１）（式中、Ｒ^１及びＲ^２は、それぞれ独立して、炭素、窒素、酸素及び硫黄から選択される１７個以下の原子を有する分枝状又は直鎖状の基であり、ｎは０〜１８（１８を含む）であり、ＸはＳ又はＯであり、Ｒは、１つ若しくは複数のペプチド、１つ若しくは複数の核酸、１つ若しくは複数の抗体、又はそれらの組み合わせを含む有機基である）によって表される。言いかえれば、本発明に記載の好ましい化合物は、上述のようなペプチドコンジュゲート、核酸コンジュゲート、ペプチド／核酸コンジュゲート、抗体コンジュゲート、又はペプチド／抗体コンジュゲートである。特に、上述のペプチドコンジュゲート、ペプチド／核酸コンジュゲート、又はペプチド／抗体コンジュゲートが好ましい。したがって、Ｒが１つ又は複数のペプチドを含み、１つ若しくは複数の核酸又は１つ若しくは複数の抗体を任意に含む有機基であるのが特に好ましい。

【0039】

本発明に記載の化合物はＲエピマー及びＳエピマーの混合物であってもよく、２−（ＯＣ（Ｏ）Ｒ２）−３−（ＯＣ（Ｏ）Ｒ１）プロピル基のＣ−２でのＲエピマーが適切である。

【0040】

また本発明は、
（ａ）任意に固定化及び／又は側鎖保護されているＲ−Ｈを用意するステップと、
（ｂ）置換システイン構成単位Ｆｍｏｃ−（Ｓ−（２−（ＯＣ（Ｏ）Ｒ^２）−３−（ＯＣ（Ｏ）Ｒ^１））プロピル）−Ｃｙｓ−ＯＨをＲ−Ｈへカップリングさせるステップと、
（ｃ）Ｎ末端からＦｍｏｃ基を切断するステップと、
（ｄ）得られたペプチドをアルキルイソシアネート又はアルキルイソチオシアネートＨ−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｎ＝Ｃ＝Ｘで処理するステップと
を含む、標準の固相ペプチド合成プロトコルによって本新規化合物を調製する方法を対象とする。

【0041】

この方法では、Ｒ、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｘ及びｎは上述で定義した通りである。置換システイン構成単位がＦｍｏｃ−Ｐａｍ_２−Ｃｙｓ−ＯＨであり、それによって、Ｒ^１及びＲ^２が１５個の炭素原子を有する直鎖アルキル基であるのが好ましい。好ましい実施形態では、本方法は、本発明に記載のペプチドコンジュゲートを調製するためのものであり、
（ａ）固相ペプチドを合成し、それによって、固定化及び側鎖保護したペプチドＲ−Ｈを得るステップと、
（ｂ）Ｆｍｏｃ−（Ｓ−（２−（ＯＣ（Ｏ）Ｒ^２）−３−（ＯＣ（Ｏ）Ｒ^１））プロピル）−Ｃｙｓ−ＯＨ、好ましくはＦｍｏｃ−Ｐａｍ_２−Ｃｙｓ−ＯＨを、ステップ（ａ）で得られた固定化及び側鎖保護したペプチドＲ−Ｈとカップリングさせるステップと、
（ｃ）Ｐａｍ_２Ｃｙｓ−成分からＮ末端のＦｍｏｃ基を切断するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）のＦｍｏｃ遊離生成物を、アルキルイソシアネート又はアルキルイソチオシアネートＨ−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｎ＝Ｃ＝Ｘと、好ましくはアルキルイソシアネートＨ−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｎ＝Ｃ＝Ｏと反応させるステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）の生成物の固相から酸による脱保護と切断を行うステップと、
（ｆ）ＲＰ ＨＰＬＣ精製を行うステップと
を含む。

【0042】

上記の方法をＵ−Ｐａｍ−１４及びＵ−Ｐａｍ−１２の合成に関する図２及び下記によって説明する。図２は、目的化合物Ｕ−Ｐａｍ−１４及びＵ−Ｐａｍ−１２の固相合成について記載しているが、ここで、以下の用語を次の通り定義する。

【0043】

ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＲＡＭは、リンクアミドリンカー（Ｒｉｎｋ−ａｍｉｄｅ Ｌｉｎｋｅｒ）を備えているポリスチレン及びポリエチレングリコールの官能基化コポリマー（ペプチド合成用の通常の固相）であり、
ＮＨＢｏｃはｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルで保護されたアミノ基であり、
ｔＢｕはｔｅｒｔ−ブチルであり、
Ｆｍｏｃ−Ｐａｍ_２Ｃｙｓ−ＯＨはフルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｓ−［２，３−ビス（パルミトイルオキシ）プロピル］−Ｌ−システインであり、
ＰｙＢＯＰはヘキサフルオロリン酸（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリピロリジノホスホニウムであって、ペプチド化学において通常使用されているホスホニウム活性化剤であり、
ＤＩＰＥＡはジイソプロピルエチルアミンであって、ペプチド化学において通常使用されている有機塩基であり、
ＴＦＡはトリフルオロ酢酸であり、
ＮＭＰは溶媒のＮ−メチルピロリドンであり、
ＤＣＭは溶媒のジクロロメタンである。

【0044】

ステップ（ａ）の固相ペプチド合成は公知であり、例えばＤｉｃｋ、Ｆ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｉｎ：Ｍ．Ｗ． Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｂ． Ｍ． Ｄｕｎｎ （ｅｄｓ．） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．３５、ｐｐ．６３−７２．Ｔｏｔｏｗａ：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、１９９４に開示されており、この文献は参照により本明細書に組み込まれる。ステップ（ａ）では、固定化及び側鎖保護したペプチド１は、リンクアミドリンカーが装填されているＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ樹脂から出発して調製される（スキーム１のＴｅｎｔａｇｅｌ Ｓ ＲＡＭ）。図示した合成は、完全自動方式でＡＢＩ ４３３Ａペプチド合成機にて、カップリング剤としてのＨＣＴＵと塩基としてのＤＩＰＥＡを用いてＦｍｏｃ／ＯｔＢｕ化学を適用することにより適切に行われる。当技術分野で公知の別のペプチド合成機を使用することもできることを理解されたい。例えば２０％ピペリジンを含むＮＭＰを使用する最終Ｆｍｏｃ切断時に、ペプチド樹脂（１）は装置から適切に取り除かれ、ＤＣＭで洗浄し乾燥させる。ステップ（ｂ）では、Ｆｍｏｃ−Ｐａｍ_２Ｃｙｓ−ＯＨをペプチド樹脂１に手動操作で適切にカップリングさせ、完全に保護されたペプチド樹脂２を得る。ホスホニウムカップリング剤のＰｙＢＯＰをこのカップリングステップで使用し、塩基（ＤＩＰＥＡ）を２回に分けて適切に添加し、塩基によって触媒される副反応を防止する。ステップ（ｃ）でピペリジンによるＦｍｏｃ基の切断を行った後、樹脂をＮＭＰで適切に洗浄し、得られたＮ末端アミノ基を含まない固定化Ｎ−リポヘキサペプチドは、ステップ（ｄ）でＤＣＭ／ＮＭＰ混合物中のテトラデシルイソシアネートを用いて一晩処理し、固定化及び完全保護したＵＰａｍ−１４（３）を得た。生成物は、ステップ（ｅ）で、Ｈ_２ＯとカチオンスカベンジャーとしてのＴＩＳの存在下において、９５％ＴＦＡを適切に使用する酸加水分解によって側鎖保護基を同時に除去しながら樹脂から切断した。続いて、ステップ（ｆ）で、Ｃ_４相のＲＰ ＨＰＬＣ精製と凍結乾燥を行って白色固形物として純粋なＵＰａｍ−１４（５）を得た。ＵＰａｍ−１２（６）の製造においては、固定化リポヘキサペプチドへ尿素結合Ｎ末端脂溶性鎖を導入する段階でテトラデシルイソシアネートの代わりにドデシルイソシアネートを使用するという点を除き、樹脂２から出発する同一プロトコルを使用することができる。

【0045】

ペプチドコンジュゲートに関する上記合成は、当技術分野で公知である、本発明に記載の別のコンジュゲートを得るのに適用することができる。この場合、ペプチドＲ−Ｈは、Ｒがペプチドと一緒に、１つ若しくは複数の核酸、１つ若しくは複数の抗体、又はそれらの組み合わせを含む有機基であるＲ−Ｈと置換することができる。別の実施形態では、ペプチドコンジュゲートは上記のように調製され、続いて、１つ又は複数の核酸或いは１つ又は複数の抗体とコンジュゲートさせ、こうしてペプチド／核酸コンジュゲート又はペプチド／抗体コンジュゲートを得る。このような複合方法は当技術分野で公知であって、例えば、Ｃａｒｔｅｒ ａｎｄ ＬｅＢｅａｎ、Ｊ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ、２０１１（ｄｏｉ：１０．４０６１／２０１１／９２６５９５）に開示されており、その文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0046】

上述の本発明に記載の化合物は、薬剤又はワクチンの一部として適切に使用される。したがって、本発明は、薬剤として、好ましくは本明細書に定義されている疾患又は状態を治療する薬剤として使用するための本発明に記載の前記化合物又は化合物を含む組成物を対象とする。本発明は、対象、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトにおけるＴＬＲ２介在性の先天性免疫反応を増強するための本発明に記載の化合物又は化合物を含む組成物を対象とするのがさらに好ましい。本化合物はいわゆる単独治療で使用することができ、この場合、単独治療では、例えば腫瘍のリンパ排液領域での局所投与において、既存の免疫系が刺激される。上述のような本発明に記載の化合物の別の単独適用は、好ましくは眼部へ注入することによる（視）神経の軸索再生などの中枢神経系障害又は疾患の治療、及び好ましくは全身注射による虚血、例えば、心臓又は脳又は他の器官の虚血などの治療である。さらなる単独適用は、ウイルス、細菌、真菌、原虫類などによる感染の治療、並びに寄生虫感染、例えば、内臓リーシュマニア症及び内臓性眼内炎の治療である。

【0047】

単独適用において、本発明に記載の化合物は、液体形態の液剤、懸濁剤又は乳剤、クリーム剤、スプレー剤、又は当業者に公知の他の形態で適用することができる。虚血及び軸索再生の治療に対しては、本発明に記載の化合物は薬学的に許容される注射用製剤であるのが好ましい。

【0048】

本発明の態様では、本発明に記載の化合物は、本明細書に定義されている疾患又は状態を治療するための方法で使用される。

【0049】

化合物は、本明細書で定義したように、抗原及び／又は別の化合物、例えば抗体、ポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドなどの核酸を既に含んでいる。或いは、又は前述の実施形態と組み合わせて、本明細書で示した化合物を含む組成物は、別個の分子として、本明細書で定義したような抗原及び／又は別の化合物、例えば、抗体、ポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドなどの核酸をさらに含むことができる。したがって、本発明はまた、薬剤として、好ましくは予防用又は治療用のワクチン組成物として使用するための、抗原及び／若しくは別の化合物、例えば、抗体、ポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドなどの核酸を含む化合物、並びに／又は、前記化合物を含む組成物、又は、化合物と、別個の分子として、抗原及び／又は別の化合物、例えば、抗体、ポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドなどの核酸とを含む組成物を対象とする。特に、本発明は、アジュバントとしての本発明に記載の化合物と、少なくとも１つの抗原及び／又は別の化合物、例えば、抗体、ポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドなどの核酸とを含み、抗原又は別の化合物が別個の化合物として存在することができるか、上述のような本発明に記載の化合物にカップリングされている、ワクチン組成物を対象とする。抗原又は別の化合物は本発明に記載の化合物の一部であり、抗原又は別の化合物が上述のアジュバント化合物にカップリングされているのが好ましい。このような連結は、使用の際、抗原を取り込み、代謝し、提示する抗原提示細胞、特に樹状細胞の同時刺激により免疫反応が増強されるという利点を有する。

【0050】

したがって、本発明の態様では、抗原に対する対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）の免疫反応を誘導、維持及び／又は増強（追加免疫）するための方法、並びに／又は、対象の前記抗原に関連する疾患又は状態を予防、遅延及び／又は治療するための方法であって、本明細書で定義した化合物又は組成物を前記対象に投与する方法を提供する。前記方法のそれぞれの特徴は、本明細書に示している。

【0051】

抗原は、対象の免疫系による免疫反応を誘導、維持又は増強することができる任意の物質であり得る。対象は動物であるのが好ましい。動物は哺乳動物であるのが好ましく、ヒトであるのが好ましい。前記の誘導又は増強された免疫反応は、前記抗原に対して特異的であると理解されたい。抗原特異性免疫反応はＴ細胞反応又は細胞性免疫反応であるのが好ましい。したがって、このような抗原はＴ細胞エピトープ：Ｔヘルパー及び／又はＣＴＬエピトープを含むのが好ましい。

【0052】

抗原は、完全長の生体高分子又はその断片であってもよい。抗原は、例えば、合成物質、タンパク質の精製サブユニット、タンパク質断片、タンパク質消化物、ペプチド、ＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、オリゴヌクレオチド、オリゴサッカライド、好ましくは生物起源の粗製組成物、例えばあらゆる微生物、細菌、酵母又は真菌の溶解物、超音波処理物若しくは凝固物又はそれらの混合物などであり得る。一実施形態では、抗原がペプチドである場合、前記ペプチドは６〜６０個のアミノ酸、即ち、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９又は６０個のアミノ酸又はそれ以上であってもよい。前記実施形態では、前記ペプチドは、したがって由来するタンパク質とは異なる。抗原は、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原又は寄生虫抗原であってもよい。抗原は感染因子に由来するものであってもよい。このような感染因子は、癌及び／又は前癌状態を引き起こすことがある。抗原は化学的に合成されるか、酵素的に生成されるペプチド、オリゴヌクレオチド又はオリゴサッカライドであるのが好ましく、精製後に得られたものがさらに好ましい。また抗原は、前記抗原又はその断片をコードしている核酸（ＤＮＡ、又はＲＮＡ）の形態であってもよい。ＲＮＡ分子又はＤＮＡ分子は、好ましくは小胞又はリポソームに含まれているか、或いはベクターに含まれていてもよい、「ネイキッド」ＤＮＡであってもよい。ベクターは、当技術分野で公知の任意の（組換え）ＤＮＡ又はＲＮＡベクターであってもよく、プラスミドであるのが好ましく、ここで、前記抗原をコードしている前記ＤＮＡは、コードされているメッセンジャーの発現及び翻訳に関与する調節配列に作動可能的に連結されている。またベクターは任意のＤＮＡ又はＲＮＡウイルスであってもよく、例えば、以下に限定されるものではないが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、改変ワクシニアアンカラウイルス（ＭＶＡ）又は鶏痘ウイルス、或いは選ばれた対象にポリペプチドの発現を付与することができる他のウイルス系ベクターであってもよい。ＤＮＡベクターは、エピゾーム自己複製ベクターなどの非組み込み型であってもよく、或いは、ランダムな組み込み又は相同組換えにより宿主ゲノムに組み込まれているベクターであってもよい。

【0053】

抗原は、病原体のタンパク質、組換えタンパク質、ペプチド、ハプテン、多糖類、糖タンパク質、リポ多糖類、ＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子（すべてのポリヌクレオチド）、癌細胞及び微生物からなる群から得られる単一成分又は複合成分として選択されるのが好ましい。好ましい組成物は、アジュバントとしての本発明に記載の化合物と、少なくとも１つのウイルス抗原又は細菌抗原、例えばＴＢＣ；破傷風及びヘリコバクターピロリ、又はウイルス感染若しくは寄生虫感染症若しくは細菌感染の治療又は予防に好適であるか、癌の治療又は予防に好適である寄生虫抗原又は腫瘍抗原を含むか、或いは、基Ｒがウイルス抗原又は細菌抗原、例えばＴＢＣ及び破傷風、又はウイルス感染若しくは寄生虫感染症若しくは細菌感染の治療又は予防に好適であるか、癌の治療又は予防に好適である寄生虫抗原又は腫瘍抗原を含む本発明に記載の化合物を含む。

【0054】

適切なウイルス抗原は、インフルエンザウイルス抗原、例えば、ＨＡ：ヘマグルチニン又はノイラミニダーゼ抗原；ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）抗原、例えばＥ２、Ｅ６、Ｅ７；ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原、例えばＧＰ１２０、ＧＰ１４０、ＧＰ１６０；水疱性口内炎ウイルス抗原、例えば水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質；サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）抗原；肝炎ウイルス抗原、例えばＡ型肝炎（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎（ＨＤＶ）及びＧ型肝炎（ＨＧＶ）：Ｌ−ＨＢｓＡｇ、Ｓ−ＨＢｓＡｇ、Ｍ−ＨＢｓＡｇ、ｐｒｅ Ｓ；呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）抗原；ＳＶ４０ウイルス抗原、例えばラージＴ、スモールＴ；ＥＢＶ抗原、例えばＥＢＮＡ、カポージ肉腫ウイルス（ＫＳＶ）抗原、ヒトＴ−リンパ親和性ウイルス−１（ＨＴＬＶ−１）抗原、メルケル細胞ウイルス（ＭＣＶ）抗原、又は単純性疱疹ウイルス抗原である。

【0055】

使用する抗原又はペプチドが由来するＨＰＶ株は、例えば血清型１６、１８、３１、３３又は４５のハイリスクＨＰＶ血清型であるのが好ましく、血清型１６、１８、３１又は３３由来であるのがさらに好ましく、血清型１６又は１８由来であるのが最も好ましく、そのうち１６が最も好ましい。ＨＰＶ血清型１６のＥ２、Ｅ６及びＥ７タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１〜３にそれぞれ記載する。ＨＰＶ血清型１８のＥ２、Ｅ６及びＥ７タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号４〜６にそれぞれ記載する。

【0056】

適切な寄生虫抗原は原虫類、線虫類、吸虫類又は条虫綱類、例えば、クリプトスポリジウム・ホミニス（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｈｏｍｉｎｉｓ）又はクリプトスポリジウム・パルブム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）；ビルハルツ住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｈａｅｍａｔｏｂｉｕｍ）、マンソン住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉ）又は日本住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）；熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）、三日熱マラリア原（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）又は卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ）；リーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ）、リーシュマニア・トロピカ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔｒｏｐｉｃａ）、リーシュマニア・エチオピカ６（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ａｅｔｈｉｏｐｉｃａ）、リーシュマニア・メキシカーナ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍｅｘｉｃａｎａ）、リーシュマニア・ドノバニ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ）、リーシュマニア・インファンタム（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｉｎｆａｎｔｕｍ）又はリーシュマニア・ブラジリエンシス（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓ）；トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ Ｇｏｎｄｉｉ）由来であってもよい。

【0057】

適切な細菌抗原は、結核菌、肺炎球菌、黄色ブドウ球菌、コレラ菌、髄膜炎菌由来の抗原であってもよい。

【0058】

腫瘍抗原は腫瘍細胞上で発現される抗原である。抗原のこの群は、下記に示す限定されない事例において癌に関係していると言われるものが好ましい：腫瘍では単独で発現されるが、正常な成熟細胞では全く発現されないか限られた量でのみ発現されるタンパク質由来の抗原、正常な成熟細胞と比べて腫瘍で過剰に発現されるタンパク質由来の抗原、腫瘍で変異したタンパク質由来の抗原、癌ではない対象の対応する組織と比べて癌対象の所定の組織で異常発現される抗原。異常発現される抗原は、通常は抗原が発現されない組織で新たに発現される可能性がある。変異抗原はスプライス変異であってもよい。変異抗原は、転座の結果、異常融合タンパク質としてさらに産生されることがある。癌に関係していることが知られている抗原の例は、ｐ５３、ＭＤＭ−２、ＨＤＭ２及びｐ５３経路で機能する他のタンパク質、スルビビン、テロメラーゼ、シトクロムＰ４５０アイソフォーム１Ｂ１、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ及びＣＤ１９などの分子、並びにすべてのいわゆるハウスホールドタンパク質である。

【0059】

適切な抗原は、癌及び／又は前癌状態などの疾患を引き起こす感染因子由来の抗原が挙げられる。このような感染因子の例は、性器疣贅、子宮頸癌、頭頸部癌、陰茎癌、外陰癌、肛門癌、鼻咽腔癌、ＣＩＮ、ＶＩＮ、ＰＩＮ、ＶＡＩＮ及びＡＩＮなどの疾患を引き起こすＨＰＶ、肝癌に関係しているＨＣＶ及びＨＢＶ、中皮腫に関係しているＳＶ４０、Ｔ細胞白血病／リンパ腫と関係しているＨＴＬＶ−１、メルケル細胞癌と関係しているメルケル細胞ウイルス、並びにカポージ肉腫と関係しているＫＳＶである。

【0060】

上記のワクチン組成物は、それらの感染因子によって誘発される急性又は慢性の感染又は疾患に対する予防用ワクチン組成物（即ち予防薬）又は治療用ワクチン組成物（即ち治療薬）として使用することができる。

【0061】

またワクチン組成物は、前記抗原が関係しているか連動している所定の疾患又は状態に対して特異的免疫反応を誘発するように設計された、予防用又は治療用ワクチン組成物として使用されるのが好ましい。疾患又は状態は癌であるのが好ましい。癌は非ウイルス性癌又はウイルス性癌、例えば、ＨＰＶによって誘発される癌などであってもよい。好ましいワクチン組成物は、アジュバントとしての本発明に記載の化合物と、少なくとも１つの非ウイルス性癌関連の腫瘍抗原とを含むか、或いは基Ｒが非ウイルス性癌関連の腫瘍抗原である、本発明に記載の化合物を含む。治療又は予防する癌は、脳腫瘍、腎細胞癌、黒色腫、白血病、肺癌、胃癌、食道癌、甲状腺癌、膵臓癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮癌、精巣癌、胆管腫、肝臓癌、結腸癌、消化器癌、膀胱癌、又は直腸癌であってもよい。さらに、本ワクチン組成物を使用することによって、前悪性病変を治療又は予防することができる。前悪性病変は、細胞が癌細胞になりやすくなる遺伝的変化を受けた損傷である。これらの前悪性病変は、時間の経過と共に癌に変化していく可能性がある。適切な腫瘍抗原の例は、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＧＥ−１、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＨＡＧＥ、チロシナーゼ、ＣＥＡ（癌胎児抗原）、ｐ５３、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）；ＰＲＡＭＥ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＵＣ−１、ＳＡＲＴ−１又はＳＡＲＴ−３、ＸＡＧＥ−１Ｂ、チロシナーゼ、ＴＥＲＴ（テロメラーゼ逆転写酵素）、ＷＴ１、スルビビン−２Ｂ、ｇｐ７５、ＭＤＭ２、テロメラーゼ、ａｌ［ｒｈｏ］ｈ−１フェトプロテイン、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、Ｇ２５０、ＨＥＲ２、ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｒａｓ、ＰＭＬＲＡＲα、ＰＲ１、ＳＳＸ−２、ＨＳＰ７０、或いは上記の任意のウイルス性、非ウイルス性の腫瘍、細菌性抗原又は寄生虫抗原由来のペプチド類似体である。

【0062】

好ましい抗原は、上記の任意のウイルス性、非ウイルス性の腫瘍、細菌性抗原又は寄生虫抗原由来のＴ細胞エピトープ、即ち、ＣＤ４及び／又はＣＤ８Ｔ細胞エピトープを含むペプチドを含むが、国際公開第０２／０７０００６号及び国際公開第２００８／１４７１８７号に開示されているハイリスクヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）−特異的Ｅ６及びＥ７オンコプロテイン由来のものを含むのが好ましい。なおこれらの文献は参照により本明細書に組み込まれる。

【0063】

配列番号２により上記で示したＨＰＶ血清型１６ Ｅ６由来の好ましいペプチドは、Ｅ６ １−３２、Ｅ６ １９−５０、Ｅ６ ４１−６５、Ｅ６ ５５−８０、Ｅ６ ７１−９５、Ｅ６ ８５−１０９、Ｅ６ ９１−１２２、Ｅ６ １０９−１４０及びＥ６ １２７−１５８を含むか、これらからなるか、又はこれらとオーバーラップするペプチドからなる群から選択される。

【0064】

配列番号３により上記で示したＨＰＶ血清型１６ Ｅ７由来の好ましいペプチドは、Ｅ７ １−３５、Ｅ７ ２２−５６、Ｅ７ ４３−７７及びＥ７ ６４−９８を含むか、これらからなるか、又はこれらとオーバーラップするペプチドからなる群から選択される。

【0065】

配列番号２又は配列番号３により上記で示したＨＰＶ血清型１６ Ｅ６又はＥ７由来の好ましいペプチドは、Ｅ６ １−３２、Ｅ６ １９−５０、Ｅ６ ４１−６５、Ｅ６ ５５−８０、Ｅ６ ７１−９５、Ｅ６ ８５−１０９、Ｅ６ ９１−１２２、Ｅ６ １０９−１４０、Ｅ６ １２７−１５８、Ｅ７ １−３５、Ｅ７ ２２−５６、Ｅ７ ４３−７７及びＥ７ ６４−９８を含むか、これらからなるか、又はこれらとオーバーラップするペプチドからなる群から選択される。本発明はまた、前述のパラグラフで示したＨＰＶに由来し、対応するＥ６又はＥ７ ＨＰＶタンパク質の対応する位置に由来する合計１、２、３、４、５、６、７、８、９個以上の付加アミノ酸を含むペプチドを包含する。これらの付加アミノ酸は前記ペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に存在していてもよい。しかし、このようなペプチドは完全長のＥ６タンパク質又はＥ７タンパク質とは異なるのが好ましい。

【0066】

別の実施形態では、ＨＰＶ由来のペプチドは、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０個のアミノ酸の長さを有し、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸１１−３２、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質アミノ酸のアミノ酸１３−２２、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸２９−３８、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質の３７−６８、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸５２−６１、ＨＰＶ６タンパク質のアミノ酸５１−７２、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸５５−８６、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸６１−８２、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸７１−９２、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸７３−１０５、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸９１−１１２、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸１０１−１２２、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸１２１−１４２、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸１２９−１３８、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸１３７−１４６、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸１４９−１５８、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質のアミノ酸１−３２、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質のアミノ酸１１−１９、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質のアミノ酸２１−４２、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質のアミノ酸５１−７２、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質のアミノ酸７６−８６；ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸１３−２２、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸２９−３８、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸５２−６１、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸１２９−１３８、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸１３７−１４６、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質のアミノ酸１４９−１５８、及びＨＰＶ Ｅ７タンパク質のアミノ酸１１−１９からなる群から選択されるエピトープを含む連続的なアミノ酸配列を含むのが好ましい。Ｅ６とＥ７のタンパク質は、配列番号２及び配列番号３により上記で示したＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８由来であるのが好ましい。

【0067】

本明細書で示したそれぞれのＨＰＶペプチド又はエピトープは、対応するＥ６タンパク質又はＥ７タンパク質で示した対応する最初のアミノ酸と対応する最後のアミノ酸を提供することにより識別される。

【0068】

好ましい抗原は、国際公開第２００８／１４７１８６号に開示されている非ウイルス性腫瘍抗原ｐ５３に由来するＣＤ４及び／又はＣＤ８Ｔ細胞エピトープを含むペプチドを含む。この文献は参照により本明細書に組み込まれる。

【0069】

ヒトｐ５３のアミノ酸配列は配列番号７に示す。タンパク質ｐ５３由来の連続するアミノ酸配列の長さは４５個以下のアミノ酸であって、ｐ５３のアミノ酸配列由来の少なくとも１９個の連続するアミノ酸を含むのが好ましい。ペプチド内に含まれるｐ５３由来の連続するアミノ酸配列の長さは、１９−４５、２２−４５、２２−４０、２２−３５、２４−４３、２６−４１、２８−３９、３０−４０、３０−３７、３０−３５、３２−３５、３３−３５、３１−３４のアミノ酸であるのが好ましい。別の好ましい実施形態では、ペプチドは、ｐ５３の、好ましくは配列番号７による上記で示したヒトｐ５３由来の２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４又は４５個又は４５個以上の連続するアミノ酸残基を含む。したがって、当業者には、本発明のペプチドはｐ５３タンパク質、好ましくは配列番号７による上記で示したヒトｐ５３とは異なることが理解されよう。好ましい実施形態では、タンパク質が配列番号７による上記で示したヒトｐ５３である場合、ペプチドは次のペプチドから選択され、各ペプチドは任意の次の配列：ｐ５３ ８６−１１５、ｐ５３ １０２−１３１、ｐ５３ １４２−１７１、ｐ５３ １５７−１８６、ｐ５３ １９０−２１９、ｐ５３ ２２４−２４８、ｐ５３ ２２５−２５４、ｐ５３ ２５７−２８６、ｐ５３ ２７３−３０２、ｐ５３ ３０５−３３４、ｐ５３ ３５３−３８２及びｐ５３ ３６９−３９３を含むか、これらからなるか、又はこれらとオーバーラップする。

【0070】

タンパク質が配列番号７による上記で示したヒトｐ５３である場合、ペプチドは次のペプチドから選択されるのがより一層好ましく、各ペプチドは任意の次の配列：ｐ５３ １４２−１７１、ｐ５３ １５７−１８６、ｐ５３ １９０−２１９、ｐ５３ ２２４−２４８、ｐ５３ ２２５−２５４、ｐ５３ ２４１−２７０、ｐ５３ ２５７−２８６及びｐ５３ ２７３−３０２を含むか、これらからなるか、又はこれらとオーバーラップする。

【0071】

本明細書で示した各ｐ５３ペプチドは、配列番号７により上記で示した、対応するヒトｐ５３タンパク質で示した対応する最初のアミノ酸と対応する最後のアミノ酸を提供することにより識別される。

【0072】

好ましい抗原は少なくとも２つの、又は少なくとも３つの、又は以下のｐ５３ペプチド：ｐ５３ １４２−１７１、ｐ５３ １５７−１８６、ｐ５３ １９０−２１９、ｐ５３ ２２４−２４８、ｐ５３ ２２５−２５４、ｐ５３ ２４１−２７０、ｐ５３ ２５７−２８６及びｐ５３ ２７３−３０２、ｐ５３ ３０５−３３４、ｐ５３ ３５３−３８２及びｐ５３ ３６９−３９３を包含する。さらに好ましい抗原は、ｐ５３ ８６−１１５及び／又はｐ５３ １０２−１３１をさらに含む。

【0073】

好ましい抗原は、国際公開第２００８／１１８０１７号に開示されている非ウイルス性腫瘍抗原ＰＲＡＭＥ由来のＣＤ４及び／又はＣＤ８Ｔ細胞エピトープを含むペプチドを含む。なおこの文献は参照により本明細書に組み込まれる。

【0074】

このようなペプチドは、配列番号８に示す、ヒトＰＲＡＭＥタンパク質の５０９個のアミノ酸配列から選択される連続するアミノ酸配列を含んでいてもよい。それにより、ペプチドは少なくとも１つのＨＬＡクラスＩＩのＴｈ細胞エピトープを含むのが好ましく、さらに少なくとも１つのＨＬＡクラスＩの細胞毒性Ｔ細胞エピトープを含むのが好ましい。配列番号８により好ましくは示される、ヒトＰＲＡＭＥタンパク質由来の連続するアミノ酸配列の長さは、ペプチド内に１９−４５のアミノ酸を含むのが好ましく、３０−４０のアミノ酸を含むのがより一層好ましく、３０−３５のアミノ酸を含むのがより一層好ましく、３３−３５のアミノ酸を含むのが最も好ましい。さらに好ましいペプチドは、配列番号８により好ましくは示されるヒトＰＲＡＭＥタンパク質由来の連続するアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列のａａ．１９−５３、ａａ．４７−７９、ａａ．６９−１０１、ａａ．８０−１１４、ａａ．９４−１２６、ａａ．１１２−１４４、ａａ．１３３−１６６、ａａ．１７３−２０７、ａａ．１９０−２２３、ａａ．２３４−２６８、ａａ．２４７−２７９、ａａ．２６２−２９４、ａａ．２８４−３１６、ａａ．２９５−３２７、ａａ．３５３−３８７、ａａ．３９９−４３１、ａａ．４１７−４５０、ａａ．４４７−４８０、ａａ．４７７−５０９からなる群から選択される。また本発明は、このパラグラフで示したＰＲＡＭＥに由来し、対応するＰＲＡＭＥタンパク質の対応する位置に由来する合計１、２、３、４、５、６、７、８、９個以上の付加アミノ酸を含むペプチドを包含する。これらの付加アミノ酸は、前記ペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に存在していてもよい。しかし、このようなペプチドは、配列番号８により示した完全長ＰＲＡＭＥタンパク質とは異なるのが好ましい。

【0075】

本明細書で示した各ＰＲＡＭＥペプチドは、対応するヒトＰＲＡＭＥタンパク質で示した対応する最初のアミノ酸と対応する最後のアミノ酸を提供することにより識別される。

【0076】

好ましい抗原は、国際公開第９８／１４４６４号に開示されている非ウイルス性腫瘍抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１に由来する、ＣＤ４及び／又はＣＤ８Ｔ細胞エピトープを含むペプチドを含む。なおこの文献は参照により本明細書に組み込まれる。

【0077】

好ましい抗原は、米国特許第６，６３０，５７４号、米国特許第６，５０４，０１０号、米国特許第７，４２５，６０７号、米国特許第６，６８６，４４７号に開示されている非ウイルス性腫瘍抗原ＸＡＧＥ−１Ｂに由来する、ＣＤ４及び／又はＣＤ８Ｔ細胞エピトープを含むペプチドを含む。なおこれらの文献は参照により本明細書に組み込まれる。

【0078】

好ましい抗原は、ＥＰ１１１７２９１４．１に開示されている非ウイルス性腫瘍抗原ＰＳＭＡに由来する、ＣＤ４及び／又はＣＤ８Ｔ細胞エピトープを含むペプチドを含む。なおこの文献は参照により本明細書に組み込まれる。

【0079】

このようなペプチドは、配列番号９に示す、ヒトＰＳＭＡタンパク質の７５０個のアミノ酸配列から選択される連続するアミノ酸配列を含んでいてもよい。それにより、ペプチドは少なくとも１つのＨＬＡクラスＩＩのＴｈ細胞エピトープを含むのが好ましく、また少なくとも１つのＨＬＡクラスＩの細胞毒性Ｔ細胞エピトープを含むのが好ましい。配列番号９により好ましくは示される、ヒトＰＳＭＡタンパク質由来の連続するアミノ酸配列の長さは、ペプチド内に１９−４５のアミノ酸を含むのが好ましく、３０−４０のアミノ酸を含むのがより一層好ましく、３０−３５のアミノ酸を含むのがより一層好ましく、３３−３５のアミノ酸を含むのが最も好ましい。さらに好ましいペプチドは、配列番号９により好ましくは示されるヒトＰＳＭＡタンパク質由来の連続するアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列のａａ．３−３５、ａａ．３１−６５、ａａ．５３−８８、ａａ．９４−１３０、ａａ．１５６−１８８、ａａ．２０７−２４２、ａａ．２５３−２８９、ａａ．３０２−３３３、ａａ．３４１−３７１、ａａ．３９３−４２６、ａａ．４３２−４６４、ａａ．４５１−４８５、ａａ．４６９−５００、ａａ．５０７−５３９、ａａ．５４７−５７９、ａａ．５６５−６００、ａａ．６０３−６３６、ａａ．６４８−６８１、ａａ．６７９−７１３、ａａ．７１６−７４９からなる群から選択される。また本発明は、このパラグラフで示したＰＳＭＡに由来し、対応するＰＳＭＡタンパク質の対応する位置に由来する合計１、２、３、４、５、６、７、８、９個以上の付加アミノ酸を含むペプチドを包含する。これらの付加アミノ酸は、前記ペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に存在していてもよい。しかし、このようなペプチドは、配列番号９により示される完全長ＰＳＭＡタンパク質とは異なるのが好ましい。

【0080】

本明細書で示した各ＰＳＭＡペプチドは、対応するヒトＰＳＭＡタンパク質で示した対応する最初のアミノ酸と対応する最後のアミノ酸を提供することにより識別される。

【0081】

好ましい抗原は、国際公開第０６／０４３８９号に開示されている結核菌由来の非ウイルス性抗原に由来するＣＤ４及び／又はＣＤ８Ｔ細胞エピトープを含むペプチドを含む。なおこの文献は参照により本明細書に組み込まれる。

【0082】

結核菌由来の抗原は、マイコバクテリウムに感染している脊椎動物において免疫反応をインビボで誘発することができるタンパク質がコードされているマイコバクテリウムＮＲＰ／ｄｏｒｍａｎｃｙ（ＤｏｓＲ）レギュロンを含むポリペプチドの群から選択されるのが好ましい。このような抗原は、Ｒｖ０７９、Ｒｖ０５６９、Ｒｖ０５７２ｃ、Ｒｖ１７３３ｃ、Ｒｖ１７３８、Ｒｖ１８１３ｃ、Ｒｖ１９９６、Ｒｖ２００７ｃ（ＦｄｘＡ）、Ｒｖ２０２９ｃ（ＰｆｋＢ）、Ｒｖ２０３０ｃ、Ｒｖ２０３１ｃ（ＨｓｐＸ、Ａｃｒ、１６−ｋＤａαクリスタリン相同体）、Ｒｖ２０３２、Ｒｖ２６２３、Ｒｖ２６２４ｃ、Ｒｖ２６２６ｃ、Ｒｖ２６２７ｃ、Ｒｖ２６２８、Ｒｖ３１２６ｃ、Ｒｖ３１２７、Ｒｖ３１２９、Ｒｖ３１３０ｃ、Ｒｖ３１３１、Ｒｖ３１３２ｃ、Ｒｖ３１３３ｃ（ＤｏｓＲ）、Ｒｖ３１３４ｃ、Ｒｖ００８０、Ｒｖ１７３７ｃ（ＮａｒＫ２）、Ｒｖ１７３５ｃ及びＲｖ１７３６ｃ（ＮａｒＸ）からなる、ヒトＴ細胞株においてＩＦＮ−γ反応を誘発することができるタンパク質がコードされているマイコバクテリウムＮＲＰ／ｄｏｒｍａｎｃｙ（ＤｏｓＲ）レギュロンを含むポリペプチドの群から選択されるのがさらに好ましい。マイコバクテリア抗原に関するＲｖの学名並びにＮＲＰ／ｄｏｒｍａｎｃｙ（ＤｏｓＲ）レギュロンのＤＮＡ配列及びタンパク質配列は当技術分野で公知であり、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｌｉｓｔ．ｐａｓｔｅｕｒ．ｆｒ／ＴｕｂｅｒｃｕＬｉｓｔ／、又はｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ（アクセッション番号ＡＬ１２３４５６）で確認することができる。本明細書で使用しているＲｖの学名は、抗原のアミノ酸配列か抗原をコードしているヌクレオチド配列のいずれかを意味し得る。

【0083】

マイコバクテリウムタンパク質由来の連続するアミノ酸配列の長さは、４５個以下のアミノ酸であり、前記マイコバクテリウムタンパク質のアミノ酸配列由来の少なくとも１９個の連続するアミノ酸を含むのが好ましい。ペプチド内に含まれる前記マイコバクテリウムタンパク質由来の連続するアミノ酸配列の長さは、１９−４５、２２−４５、２２−４０、２２−３５、２４−４３、２６−４１、２８−３９、３０−４０、３０−３７、３０−３５、３２−３５、３３−３５、３１−３４のアミノ酸であるのが好ましい。別の好ましい実施形態では、ペプチドは、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４又は４５又は４５を超える前記マイコバクテリウムタンパク質の連続するアミノ酸残基を含む。ペプチド内に含まれている前記マイコバクテリウムタンパク質由来の連続するアミノ酸配列の長さは、前記ペプチドの長さであってもよい。したがって、当業者には、本発明のペプチドが前記マイコバクテリウムタンパク質とは異なることがあることが理解されよう。

【0084】

また本発明は、このパラグラフで示したこのようなタンパク質由来であり、対応するタンパク質の対応する位置に由来する合計１、２、３、４、５、６、７、８、９以上の付加アミノ酸を含むペプチドを包含する。これらの付加アミノ酸は、前記ペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に存在していてもよい。しかし、このようなペプチドは完全長のマイコバクテリウムタンパク質とは異なっているのが好ましい。

【0085】

本発明の状況においては、ペプチドは抗原由来のアミノ酸以上の付加アミノ酸を含んでいてもよく、又はこのような抗原由来のアミノ酸配列から完全に調製されるか、このようなアミノ酸配列からなっていてもよい。ペプチド内に含まれている、上記で定義した抗原の１つに由来する連続するアミノ酸配列の長さは、少なくとも１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４若しくは４５個のアミノ酸、及び／又は１００、９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８９、８８、８７、８６、８５、８４、８３、８２、８１、８０、６０、５０、４５、４０、３５、３３若しくは３０個以下のアミノ酸であるのが好ましく、ペプチド内に含まれている上記で定義した抗原の１つに由来する連続するアミノ酸配列の長さは１９−４５であるのがさらに好ましく、２２−４０のアミノ酸であるのがより一層好ましく、３０−３５であるのがより一層好ましく、３３−３５のアミノ酸であるのが最も好ましい。別の好ましい実施形態では、本発明のペプチドは、本明細書で定義した抗原由来の連続するいずれかのアミノ酸配列からなり、それにより、天然抗原の配列中のこのアミノ酸配列に隣接していない抗原由来の連続するアミノ酸配列のいずれか一端にアミノ酸は付加されないことを理解されたい。これらのペプチドは容易に合成することができ、プロテアソーム及び他のプロテアーゼ並びに細胞内処理系のペプチダーゼによって処理されて、専門的な抗原提示細胞によって取り込まれるのに十分なほどの大きさであり、また少なくとも１つのＨＬＡクラスＩ及び／又は少なくとも１つのＨＬＡクラスＩＩエピトープを含むのに十分な物理学的容量と長さを有している。場合によっては、ペプチドは、例えば、生物学的利用性、細胞の取り込み、Ｔ細胞へのターゲッティング、処理及び／又は可溶性を促進することができる付加アミノ酸、修飾アミノ酸又は他の官能基であってもよい、Ｎ末端又はＣ末端の伸長を含むことができるか、或いはアジュバント又は（同時）刺激的機能を提供する免疫調整物質を含有若しくは放出することができる。

【0086】

本発明の化合物はアジュバントとして作用することが予想されることが好ましい。アジュバントは、抗原がアジュバントとの組み合わせで（本明細書で定義した単一化合物として、又は２つの別個の分子として）投与される場合に、免疫反応又はその増強が前記抗原に対して誘発されるような方法で免疫系を刺激することができる分子として本明細書では定義される。抗原特異的に誘発された免疫反応を分析又は測定するためには、前記免疫反応を、アジュバントは存在せず抗原が存在する状態で、又は公知のアジュバントと一緒に抗原が存在する状態で誘発される免疫反応と比較する。公知のアジュバントは、実施例の部分でＰａｍ３ＣｙｓＳＫ４として示したような別のＴＬＲ２アジュバントであってもよい。誘発は対象で、又は対象由来の細胞で測定される。

【0087】

いかなる理論にも拘束されるものではないが、本発明の化合物はＴＬＲ２を介して作用すると考えられる。

【0088】

誘発又は誘導される免疫反応はＢ細胞及び／又はＴ細胞応答であってもよい。免疫反応は、Ｂ細胞応答、即ち、前記抗原に対して特異的な抗体の産生であってもよい。抗体はＩｇＧ抗体であるのが好ましい。前記免疫反応はＴ細胞応答であってもよい。前記Ｂ細胞及び／又はＴ細胞応答は、実施例に記載したようにＥＬＩＳＡを使用し抗体及び／又はサイトカインの産生を測定することにより検出することができる。好ましいサイトカインは、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＴＮＦα又はＩＬ−１０である。

【0089】

好ましい実施形態では、抗原特異的に誘発された免疫反応の検出とは、前記アジュバント及び抗原を投与した少なくとも１、１０、１１、１２時間以上後、又は少なくとも１日後、又は少なくとも２日後、又は少なくとも３日後、又は少なくとも４日後、又は少なくとも５日後、又は少なくとも６日後、又は少なくとも７日後、又は少なくとも２週間後、又は少なくとも３週間後、又は少なくとも４週間以上経った後に前記検出を行うことを意味する。検出は対象で、又は対象由来の細胞で測定される。

【0090】

本発明の状況において、抗原特異的に誘発された免疫反応は、前記抗原に対する免疫反応の検出可能な増加を意味するのが好ましい。前記検出可能な増加は、抗原が単独適用される場合、又は前記抗原が公知アジュバントと共に使用される場合に誘発又は誘導される免疫反応と比較することにより測定することができる。公知のアジュバントは、実施例の部分で示した別のＴＬＲ２アジュバントであってもよい（Ｐａｍ３ＣｙｓＳＫ４）。検出可能な増加は、前記アジュバント及び抗原を投与した少なくとも１、１０、１１及び１２時間以上経った後か少なくとも１日後に、又は少なくとも２日後、又は少なくとも３日後、又は少なくとも４日以上経った後に、既に本明細書に示したサイトカインの量が少なくとも５％増加、又は１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１５０％、２００％以上増加しているのが好ましい。検出は、対象で、又は対象由来の細胞で測定される。

【0091】

また本発明の化合物の官能基は、ＴＬＲ２を発現する細胞を使用し、実施例の部分で示したように測定することもできる。

【0092】

驚いたことに、本発明の化合物は、従来用いられているアジュバントの投与量よりも少ない前記化合物の投与量を使用して、所定の抗原に対して少なくとも同等の、又はそれ以上の有効な免疫反応を誘導することができるように思われる。少ないとは、Ｐａｍ３ＣｙｓＳＫ４）などの従来のアジュバントの投与量よりも少なくとも１倍、少なくとも１０倍、少なくとも３０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１５０倍、又は少なくとも２００倍少ない投与量であることを意味し得る。

【0093】

本発明のワクチン組成物は、アジュバントと抗原に加えて、アジュバントと抗原と同等の効果又は類似の効果を有する１種又は複数の有効成分をさらに含むことができる。例えば、本発明に記載のワクチン組成物は、本発明に記載のアジュバントに加えて、１種又は複数のアジュバントを含むことができる。これらの別のアジュバントは、本発明に記載のワクチン組成物に混合してもよいし、治療する哺乳動物又はヒトに別々に投与することができる。本発明に記載のアジュバント化合物と組み合わせて使用される適切な別のアジュバントの例は、モンタニドアジュバント、例えば、モンタニドＩＳＡ−５１又はモンタニドＩＳＡ７２０（Ｓｅｐｐｉｃ Ｆｒａｎｃｅ）、フロイントアジュバント又はＩＦＡ、レシキモド；イミキモド；ポリＩＣ：ＬＣ（Ｈｉｌｔｏｎｏｌ）；ＩＳＣＯＭＳ；ＣｐＧ及びＧＬＡ；ＭＰＬである。別のアジュバントはＴ細胞付着阻害剤であり、ＢＱ−７８８などのエンドセリン受容体阻害物質がさらに好ましい（Ｂｕｃｋａｎｏｖｉｃｈ ＲＪら，、Ｉｓｈｉｋａｗａ Ｋ，ＰＮＡＳ（１９９４）９１：４８９２）。ＢＱ−７８８は、Ｎ−ｃｉｓ−２，６−ジメチルピペリジノカルボニル−Ｌ−γ−メチルロイシル−Ｄ−１−メトキシカルボニルトリプトファニル−Ｄ−ノルロイシンである。しかし、任意のＢＱ−７８８誘導体又は修飾ＢＱ−７８８化合物もまた本発明の範囲内に包含される。

【0094】

本ワクチン組成物は、例えば、解毒型リピドＡ、臨床等級のＣｐＧ或いは他の適切な免疫調節剤又は抗体、例えば、ＣＴＬＡ−４阻害抗体又はＣＤ４０アゴニスト抗体、或いはＴＮＦ受容体ファミリー、例えば、ＯＸ４０、ＣＤ２７、４−１−ＢＢ（ＣＤ１３７）或いは４−１−ＢＢリガンド及び／又はＣＤ４０リガンド、ＯＸ４０リガンド又は機能性断片及びその誘導体の他のメンバーに対するアゴニスト抗体のような化合物、並びに同様のアゴニスト活性を有する合成化合物も含むことができる。これらの化合物は、本発明に記載の化合物及び／又はワクチン中の特異的抗原のいずれかに混合するかコンジュゲートすることができる。

【0095】

本ワクチン組成物はまた、前述の有効成分に加えて、投与用の１種又は複数の薬学的に許容される担体も含むことができる。薬学的に許容される担体は、生理食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストロース溶液、グリセリン及びエタノールからなる群から選択される複数の成分を選択し、混合することにより調製することができる。他の一般的な添加剤、例えば、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤などを加えることができる。水溶液、懸濁液及びエマルションなどの注射用液剤を調製するためには、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び滑沢剤をさらに加えることができる。

【0096】

本発明のワクチン組成物の特定の製剤、投与方法及び薬学的に許容される添加剤の使用は当技術分野で公知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ；Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ ２００５、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａに開示されている。本発明のワクチン組成物及び薬剤は、静注投与又は皮下投与又は筋内投与に適切なように製剤化するのが好ましいが、別の投与経路、例えば、注射又はパッチなどによる粘膜投与又は皮内（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ）投与及び／又は皮膚内（ｉｎｔｒａｃｕｔａｎｅｏｕｓ）投与も考えられる。ここでは皮内投与が好ましい。

【0097】

好ましい実施形態では、ワクチン組成物は皮内投与又は適用に適するように製剤化される。皮内投与は当業者に公知である。本発明の状況においては、皮内投与は皮膚内投与と同義であり、皮下投与とは区別される。物質の最も表面的な適用は（皮膚上の）上皮投与であり、次いで、（皮膚中又は皮膚への）皮内投与であり、次いで、（皮膚直下組織での）皮下投与であり、次いで、（筋肉本体への）筋肉内投与である。

【0098】

ワクチン組成物の皮内投与は、疾患の部位に、又はその間近にワクチンが注射され、リンパ節に流入し疾患の局所活性化が得られ、免疫系の局所活性化をより増強するので非常に好ましい。好ましい実施形態では、皮内投与は、損傷部位又は疾患部位で直接的に実施される。損傷部位とは、本明細書では、損傷部位から５、２、１、０．５、０．２又は０．１ｃｍ未満であると理解されたい。

【0099】

さらに、好ましい実施形態は、徐放性ビヒクル、例えば、鉱油（例えばモンタニドＩＳＡ５１）、ＰＬＧＡ系粒子又はスキャフォールド、デキストラン系粒子又はスキャフォールド、ポリ活性剤系粒子又はスキャフォールド、リポソーム、ビロソーム中のワクチン組成物の一部としての抗原及びアジュバント化合物の送達を含む。皮内送達については、ワクチン組成物は、１種又は複数の免疫学的に不活性な薬学的に許容される担体、例えば、生理的イオン強度及び／又は浸透性の緩衝水溶液（例えばＰＢＳなど）をさらに含む組成物で投与されるのが好ましい。

【0100】

さらに、本発明の少なくとも１つのワクチン組成物の投与を単一投与として行うことができることが本発明に包含される。さらに、ワクチンの様々な活性化合物は、連続的投与及び／又は異なる投与経路若しくは異なる投与部位を使用することによる投与を行うことも可能である。或いは、必要に応じて、少なくとも１つのワクチン組成物の投与を繰り返すことができる。

【0101】

定義
本発明の状況において、抗原はペプチドにより定義することができる。このようなイニシャルペプチドとオーバーラップしているいかなるペプチドも、本発明によって包含される。オーバーラップしているとは、ペプチド配列が所定の配列と部分的に又は完全にオーバーラップすることを意味する。オーバーラップするとは、部分的にオーバーラップしていることを意味するのが好ましい。部分的にとは、オーバーラップがペプチド配列のＮ末端及び／又はＣ末端の１個又は複数のアミノ酸のオーバーラップであることを意味するのが好ましく、Ｎ末端及び／又はＣ末端の２つ以上のアミノ酸のオーバッラップ、或いはそれ以上のオーバーラップであるのがさらに好ましい。また、オーバーラップは、ペプチド配列のＮ末端の１個若しくは複数のアミノ酸及び／又はＣ末端の２個以上のアミノ酸のオーバーラップであるか、その逆であるのが好ましい。得られたペプチドが本明細書の前で定義した所望の活性を示す限り、すべての種類のオーバーラップが本発明によって包含されることは当業者に理解されよう。

【0102】

本発明の状況において、ペプチドはアミノ酸配列によって表される。

【0103】

本発明の状況において、核酸分子は、ペプチドをコードする核酸配列又はヌクレオチド配列によって表される。核酸分子は制御領域を含んでいてもよい。

【0104】

所定の配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）によって本明細書に示したそれぞれの核酸分子又はタンパク質又はペプチドは、開示した特定配列ではあるが、これに限定されないことを理解されたい。

【0105】

本願の全体にわたって、毎回、１つがペプチドの特定アミノ酸配列配列番号を表し、１つは所定の配列番号を持つアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列を含むペプチドによってそれを置き換えることができる。

【0106】

好ましい実施形態では、配列同一性又は類似性は、本明細書に示した配列の全長を比較することにより決定される。

【0107】

「配列同一性」は、本明細書では、配列を比較することにより決定される、２つ以上のアミノ酸（ポリペプチド又はタンパク質又はペプチド）配列間、或いは２つ以上の核酸（ポリヌクレオチド）配列間の関係として定義される。好ましい実施形態では、配列同一性は、２つの所定の配列番号の完全長又はその一部に基づいて算出される。その一部とは、両配列番号の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％を意味することが好ましい。当技術分野では、「同一性」はまた、アミノ酸配列間、又は核酸配列間の配列関連性の程度も意味し、場合によっては、このような配列の文字列間の一致によって決定される。

【0108】

２つのアミノ酸配列間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列及びその保存されたアミノ酸置換を、第２のポリペプチドの配列と比較することにより決定される。「相同性」及び「類似性」は既知の方法によって容易に算出することができ、それらの方法は限定されるものではないが、（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ Ｉ、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８７；及びＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ． ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．、Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１；及びＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．、４８：１０７３（１９８８）に記載されているものを挙げることができる。

【0109】

相同性を決定する好ましい方法は、試験しようとする配列間の最大の一致が得られるように設計される。相同性と類似性を決定する方法は、公開され利用可能なコンピュータープログラムにおいて体系化されている。２つの配列間の同一性と類似性を決定する好ましいコンピュータープログラム方法としては、例えば、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２（１）：３８７（１９８４））、ＢｅｓｔＦｉｔ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）が挙げられる。ＢＬＡＳＴ Ｘプログラムは、ＮＣＢＩ及び他の情報源から公開され利用可能である（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら、ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）。よく知られているスミスウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎ）アルゴリズムもまた、同一性の決定に使用することができる。

【0110】

ポリペプチド配列を比較するための好ましいパラメータとしては、：アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）；比較マトリックス：ＢＬＯＳＳＵＭ６２、Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９：１０９１５−１０９１９（１９９２）より；ギャップペナルティ：１２；及びギャップレングスペナルティ：４が挙げられる。これらのパラメータを使用する有用なプログラムは、「Ｏｇａｐ」プログラムとして、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ．に立地するＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐから公開され利用可能である。上記のパラメータは、アミノ酸比較用のデフォルトパラメータである（末端ギャップに対するペナルティはなし）。

【0111】

核酸を比較するための好ましいパラメータは、アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）；比較マトリックス：マッチ＝＋１０、ミスマッチ＝０；ギャップペナルティ：５０；ギャップレングスペナルティ：３が挙げられる。ギャッププログラムとして、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．に立地するＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐから公開され利用可能である。上で示したのは、核酸比較用のデフォルトパラメータである。

【0112】

場合によっては、アミノ酸の類似性の程度を決定する際、当業者はまた、当業者には明白であるような、いわゆる「保存的」アミノ酸置換を考慮に入れることができる。保存的アミノ酸置換とは、類似側鎖を有する残基の互換性を意味する。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンであり；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリン及びスレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギン及びグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、及びヒスチジンであり；硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システイン及びメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミンである。本明細書で開示したアミノ酸配列の置換変異体は、開示した配列の少なくとも１つの残基が除去され、かつその場所に別の残基が挿入されたものである。アミノ酸交換は保存的であるのが好ましい。それぞれの天然に存在するアミノ酸に対する好ましい保存的置換は、次の通りである：ＡｌａからＳｅｒ；ＡｒｇからＬｙｓ；ＡｓｎからＧｌｎ又はＨｉｓ；ＡｓｐからＧｌｕ；ＣｙｓからＳｅｒ又はＡｌａ；ＧｌｎからＡｓｎ；ＧｌｕからＡｓｐ；ＧｌｙからＰｒｏ；ＨｉｓからＡｓｎ又はＧｌｎ；ＩｌｅからＬｅｕ又はＶａｌ；ＬｅｕからＩｌｅ又はＶａｌ；ＬｙｓからＡｒｇ；Ｇｌｎ又はＧｌｕ；ＭｅｔからＬｅｕ又はＩｌｅ；ＰｈｅからＭｅｔ、Ｌｅｕ又はＴｙｒ；ＳｅｒからＴｈｒ；ＴｈｒからＳｅｒ；ＴｒｐからＴｙｒ；ＴｙｒからＴｒｐ又はＰｈｅ；及びＶａｌからＩｌｅ又はＬｅｕ。

【0113】

本文書及びそのクレームにおいて、動詞の「含む（ｔｏ ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」とその活用形は、その用語の後に続く項目は包含されるが、詳しく記載されなかった項目は除外されないことを意味するように非限定的な意味で用いられる。さらに、動詞の「からなる（ｔｏ ｃｏｎｓｉｓｔ）」とは、本明細書で定義した化合物又は組成物が詳しく示されなかったもの以外のさらなる１種又は複数の成分を含んでいてもよいことを意味する「本質的に〜からなる（ｔｏ ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」で置き換えることができ、前記のさらなる１種又は複数の成分は、本発明の特有の特徴を変更しない。

【0114】

さらに、不定冠詞の「ａ」又は「ａｎ」による要素への言及は、１つの要素及びただ１つの要素が存在することを状況が明確に要求しない限り、１つ以上の要素が存在する可能性を排除しない。そのため、不定冠詞の「ａ」又は「ａｎ」は、通常、「少なくとも１つ」を意味する。

【0115】

本明細書に引用されているすべての特許及び文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0116】

本発明を以下の限定することを意図するものではない実施例により説明する。

【0117】

実施例１
本発明に記載の化合物の利点を説明するために、ＣＨ_２からＮＨへの置換を含有する、既に確立されているＴＬＲ２／ＴＬＲ１リガンドＰａｍ_３ＣｙｓＳＫ_４の２つの異型体を調製した。Ｕ−Ｐａｍ−１４及びＵ−Ｐａｍ−１２という名称のこれらの２つの化合物は、Ｎ末端のシステイン残基に結合されている脂肪鎖の長さが異なっており、Ｕ−Ｐａｍ−１４は天然リガンドのパルミトイル成分の正確な等量式であるが、ＵＰａｍ−１２は短くなった鎖を含有する。図１は、先行技術のＰａｍ_３ＣｙｓＳＫ_４リガンドと本発明に記載のＵ−Ｐａｍ−１４及びＵ−Ｐａｍ−１２リガンドを示す。円は、−ＣＨ_２−架橋が−ＮＨ−架橋で置換されている場所を示す。

【0118】

固相ペプチド合成で使用する試薬と溶媒はすべて、ＢａｃｈｅｍとＢｉｏｓｏｌｖｅから購入し、受け取り使用した。Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（（ＲＳ）−２，３−ジ（パルミトイルオキシ）−プロピル）−ＯＨ（本明細書では、（ＲＳ）はジパルミトイルオキシプロピル基のＣ−２でのＲエピマーとＳエピマーの混合物を意味する）はＢａｃｈｅｍから購入し、Ｆｍｏｃ−アミノ酸、ＨＣＴＵ及びＰｙＢＯＰはＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍから購入した。Ｔｅｎｔａｇｅｌ系樹脂は、Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅに発注した。ＬＣ／ＭＳは、ＶｉｄａｃのＣ４分析カラム（４．６×５０ｍｍ、５μｍ粒径、流速１．０ｍＬ／分）又はＡｌｌｔｉｍａのＣＮ分析カラム（４．６×５０ｍｍ、３μｍ粒径、流速１．０ｍＬ／分）を使用して、ＪＡＳＣＯ系で実施した。吸光度は２１４ｎｍ及び２５６ｎｍで測定した。

【0119】

溶媒系：
Ａ：１００％の水、
Ｂ：１００％のアセトニトリル、
Ｃ：１％のＴＦＡ／Ｈ２Ｏ。

【0120】

特段の記載のない限り、１０％Ｃ中のＢの勾配を１５分間かけて加えた。精製は、セミ分取用Ｖｉｄａｃ Ｃ４カラム（１０×２５０ｍｍ、５μｍ粒径、流速５．０ｍＬ／分）を備えた、Ｇｉｌｓｏｎ分取ＨＰＬＣ系で行った。

【0121】

溶媒系：
Ａ：１００％の水、
Ｂ：１００％のアセトニトリル、
Ｃ：１％のＴＦＡ／Ｈ２Ｏ。

【0122】

特段の記載のない限り、１０％Ｃ中のＢの勾配は３ＣＶかけて添加した。ＵＶ吸光度は２１４ｎｍ及び２５６ｎｍで測定した。固相ペプチド合成は、確立されている方法にしたがってＴｅｎｔａｇｅｌ−ＲＡＭ樹脂から開始するＦｍｏｃ系プロトコルを適用し、ＡＢＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）４３３Ａ自動装置で実施した。Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨに用いた各サイクルで実施した連続ステップは、次の通りであった：
１）１５分間、２０％ピペリジンを含むＮＭＰでＦｍｏｃ基を脱保護した；
２）ＮＭＰ洗浄を行った；
３）５倍過剰量を使用し適切なアミノ酸のカップリングを行った。

【0123】

簡単に説明すると、Ｆｍｏｃアミノ酸（０．２５ｍｍｏｌ）を０．２５ＭのＨＣＴＵを含むＮＭＰ（１ｍＬ）に溶解し、得られた溶液を反応槽に移し、続いて１．０ＭのＤＩＰＥＡを含むＮＭＰの０．５ｍＬを入れ、カップリングを開始した。次いで、反応槽を４５分振盪した；
４）ＮＭＰ洗浄を行った；
５）０．５ｍｍｏｌのＤＩＰＥＡの存在下で０．５Ｍの無水酢酸を含むＮＭＰを用いてキャッピングを行った；
６）ＮＭＰ洗浄を行った；
７）１５分間、２０％ピペリジンを含むＮＭＰを用いて最終Ｆｍｏｃ除去を行った；
８）ＮＭＰ洗浄を行った；
９）ＤＣＭ洗浄を行った。

【0124】

Ｈ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｒｉｎｋ−Ｔｅｎｔａｇｅｌ （１）
ペプチド合成は、Ｆｍｏｃ系プロトコルを適用するＡＢＩ ４３３Ａ自動装置を使用し、Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ Ｓ Ｔｅｎｔａｇｅｌから開始し（０．２６ｍｍｏｌ／ｇを充填）、１ｍｍｏｌスケールで行った。樹脂は、最終Ｆｍｏｃ脱保護の後に、ＮＭＰ及びＤＣＭで洗浄し、乾燥させた。得られた樹脂１は、次のステップで使用した。

【0125】

Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（（ＲＳ）−２，３−ジ（パルミトイルオキシ）−プロピル）−ＯＨカップリングの一般的方法
Ｈ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｒｉｎｋ−Ｔｅｎｔａｇｅｌを充填したＴｅｎｔａｇｅｌ Ｓ Ｒａｍ樹脂１は、０．１８ＭのＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（（ＲＳ）−２，３−ジ（パルミトイルオキシ）−プロピル）−ＯＨを含む０．２２ＭのＰｙＢｏｐのＤＣＭ：ＮＭＰ（２：１）ストック溶液０．５ｍＬで処理した。得られた混合物を２×４４μｍｏｌのＤｉｐｅａで１５分かけて活性化し、１８時間振盪して反応させ、その後、ＮＭＰ及びＤＣＭで洗浄した。樹脂をＤＣＭ：ＮＭＰ中で再度膨潤させ、１０μｍｏｌの分量に分けた。

【0126】

イソシアネート添加の一般的手順
Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（（ＲＳ）−２，３−ジ（パルミトイルオキシ）−プロピル）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）２を充填した１０μｍｏｌ樹脂をＤＣＭ：ＮＭＰ（１：１）中で膨潤させ、Ｆｍｏｃ脱保護のため、２０％ピペリジンを含むＮＭＰを用いて３×３分で処理した。ＮＭＰを完全洗浄した後、樹脂を１ｍＬのＤＣＭ：ＮＭＰ（１：１）中に懸濁し、テトラデシルイソシアネート又はドデシルイソシアネート（２５μＬ）で処理した。混合物を１８ｈ振盪し、ＮＭＰ及びＤＣＭで洗浄し、風乾した。樹脂を切断用カクテルＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ_２Ｏ（９５／２．５／２．５）で１０４分間処理した。溶液を濾過し、Ｅｔ_２Ｏ（５０ｍＬ）で沈殿させ、−２００℃で１８時間保存した。Ｅｔ_２Ｏを遠心分離にかけ、除去し、沈殿物を１ｍｌのＭｅＣＮ：Ｈ_２Ｏ：ｔＢｕＯＨ（１：１：１）中で超音波処理して溶解させた。各５０μＬの生成物をＬＣＭＳ分析（Ｖｉｄａｃ Ｃ４カラム）用に５０μＬのＭｅＣＮ：Ｈ_２Ｏ：ｔＢｕＯＨ（１：１：１）で希釈した。得られた配列は、別の０．５ｍＬのＭｅＣＮ：Ｈ_２Ｏ：ｔＢｕＯＨ（１：１：１）で希釈し、セミ分取Ｖｉｄａｃ Ｃ４カラムで精製した（１０×２５０ｍｍ、５μｍ粒径、流速５．０ｍＬ／分、６０−１００％Ｂ。）。

【0127】

このようにして得られた本発明に記載の化合物は、次の特性を有していた。

【0128】

【表1】

【0129】

【表2】

【0130】

実施例２
実施例１で得られた２つの化合物Ｕ−Ｐａｍ−１２及びＵ−Ｐａｍ−１４について、ヒトＴＬＲ２を発現するリポーター細胞株ＨＥＫ−ＴＬＲ２（図３Ａ）とマウス樹状細胞株（図３Ｂ）を活性化するそれら化合物の機能的能力に関して、未修飾のＰａｍ３ＣｙｓＳＫ４と比較して試験した。

【0131】

この試験では、ＴＬＲ２がトランスフェクトされた生きたＨＥＫ細胞及び樹状細胞（５×１０^４細胞／ウェル）を培養培地中の各Ｐａｍ化合物の濃度を上げながらインキュベートし、３７℃でインキュベートした。２４時間後、上清を回収し、それぞれＩＬ−８又はＩＬ−１２サイトカインの存在下で、特定のサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイによって測定した。

【0132】

両細胞型とも、未修飾のＰａｍ３ＣｙｓＳＫ４に比べてＵ−Ｐａｍ化合物によってより一層顕著に刺激されていた。両化合物は、最大刺激レベルを少なくとも２倍に増加させ、同様の刺激レベルに到達するのに必要とされる化合物の濃度に対して少なくとも１００倍超の効果があると算出された。

【0133】

本発明に記載の化合物は、低濃度（ｐＭ〜ｎＭ）でヒト由来及びマウス由来の両ＴＬＲ２を機能的に刺激することができることが分かった。活性濃度は、未修飾のＴＬＲ２リガンド濃度よりも低い。さらに、生理学上重要な樹状細胞を活性化させ、免疫学的に関連のあるサイトカインＩＬ−１２を産生させることができる。このサイトカインは、ウイルス抗原及び／又は腫瘍抗原への特異的Ｔリンパ球の効率的な初回抗原刺激を促進するのに極めて重要である。したがって、アジュバントとして前記化合物を含む組成物を効果的に使用して、抗原の免疫原性を高め、それによってワクチンの有効性を改善することができる。

【0134】

本発明に記載の化合物を使用すると免疫反応が改善され、このことは、先天性免疫系の活性化がさらに強化され、しかも適応性免疫系の活性化がさらに増強されることを意味し、公知のＰａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫ４による免疫刺激と比べて、より高いＴ細胞応答及び／又はより高い抗体反応として現れると考えられる。

【0135】

実施例３
本実施例は、Ｒ^５基の（ＣＨ_２−ＯＨ）がＣＨ_２−ＣＨ_３で置換されている、ＵＰａｍ−１４誘導体の合成を説明する。この化合物は、本明細書ではＵｐａｍ−１４−Ａｂｕと称する。

【0136】

Ｈ−Ａｂｕ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｒｉｎｋ−Ｔｅｎｔａｇｅｌ （２）
ペプチド合成は、Ｆｍｏｃ−Ａｂｕ−ＯＨをＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＯｔＢｕ）−ＯＨの代わりに使用してＵｐａｍ−１４のセリン残基の代わりに２−アミノ酪酸残基を導入するという違いを除き、Ｈ−Ｓｅｒ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｒｉｎｋ−Ｔｅｎｔａｇｅｌ （１）に関して実施例１に記載したようにして実施した。その後の合成ステップと精製ステップは、実施例１に記載のステップと同じであった。

【0137】

このようにして得られた本発明に記載の化合物は、次の特性を有していた。

【0138】

【表3】

【0139】

実施例４
Ｕ−Ｐａｍ化合物について、樹状細胞（図４及び図５）とマウスのインビボ（図６）でさらに機能的に試験を行った。

【0140】

図４は、３０ｎＭのＵ−Ｐａｍ３ＣＳＫ４（Ｕ−Ｐａｍ１４）若しくはＰａｍ３ＣＳＫ４のいずれかと４８時間インキュベートしたマウスＤＣ細胞株、又は未刺激のままとしたマウスＤＣ細胞株を示す。続いて、ＤＣは、ＣＤ４０、ＣＤ８６及びＭＨＣクラスＩＩ分子に対する抗体で染色した。平均蛍光強度はＦＡＣＳ分析で測定した。Ｕ−Ｐａｍは、ＩＬ−１２サイトカイン産生（実施例２を参照）だけでなく、最適なＴ細胞初回抗原刺激能力と関連する最適なＤＣ成熟に関する特質の細胞表面分子の発現においてもｗｔ Ｐａｍより優れていることがデータから明らかである。

【0141】

図５に、ヒト単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣ）のＵ−Ｐａｍ活性化の分析を示す。ＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦを含む増殖培地でドナーＰＢＭＣのＣＤ１４＋分画を培養した５日目に、これらのｍｏＤＣをｗｔ Ｐａｍ３ＣＳＫ４、Ｕ−Ｐａｍ１４、Ｐａｍ３ＣＳＫ４複合若しくはＵ−Ｐａｍ１４複合の合成長鎖ペプチド（Ｐａｍ−ＳＬＰ若しくはｕＰａｍ１４−ＳＬＰ）とインキュベートするか、或いは未刺激のままとした。４８時間インキュベーションした後、ｍｏＤＣ培養物の上清を取り、これをＩＬ １２ｐ４０（図５Ａ）及びＩＬ １２ｐ７０（図５Ｂ）のＥＬＩＳＡ分析に供した。４８時間インキュベーションした後、ｍｏＤＣをＣＤ８６に対する抗体で染色した（図５Ｃ）。この分析から、Ｕ−Ｐａｍ化合物もまたヒト樹状細胞の活性化をさらに改善することが示唆される。重要なことには、未結合の化合物だけでなく、Ｕ−Ｐａｍコンジュゲート長鎖ペプチド抗原もＤＣ活性を改善した。

【0142】

インビボにおける、ＯＶＡ抗原（ＳＩＩＮＦＥＫＬ ＣＴＬエピトープを含有）のＵ−Ｐａｍコンジュゲート合成長鎖ペプチドのＴ細胞初回抗原刺激能力を図６に示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５ｎｍｏｌのＵ−Ｐａｍ１４−ＳＬＰコンジュゲート、５ｎｍｏｌのＰａｍ３ＣＳＫ４−ＳＬＰコンジュゲート、５ｎｍｏｌのＳＬＰと混合した５ｎｍｏｌの遊離Ｕ−Ｐａｍ１４、５ｎｍｏｌのＳＬＰと混合した５ｎｍｏｌの未結合Ｐａｍ３ＣＳＫ４、又はＰＢＳ単独のいずれかを用いてワクチンの皮下注射を行った。１４日後、マウスを殺処理し、脾臓を採取し、単一細胞懸濁液を調製した。脾細胞は、γ−インターフェロンに対しては蛍光標識した抗体で細胞内染色し、細胞表面マーカーＣＤ３及びＣＤ８βに対しては抗体で細胞内染色した。ＩＦＮγを産生するＯＶＡペプチド特異的ＣＤ８ Ｔ細胞のパーセンテージを示す（図６Ａ）。別の独立した実験では、Ｃ５７ＢＬ／６に上述のようにワクチン注射を行い、再度、１４日後に脾臓を採取した。脾細胞の画分を７日間、照射されたＯＶＡ発現ＥＧ７リンパ腫細胞で再刺激した。培養した脾細胞をＭＨＣクラスＩｋｂ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ−ＡＰＣ四量体で染色するとともに、細胞表面マーカーＣＤ３及びＣＤ８βに対する抗体で染色した。ＯＶＡ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞のパーセンテージを（図６Ｂ）に示す。両インビボ実験において、Ｔ細胞エピトープを持つＳＬＰへＵｐａｍ１４を複合することにより抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の初回抗原刺激が増強されたことが明らかである。

【0143】

実施例５

【化3】

【0144】

Ｘｎが変動するＵＰａｍ異型体について、３μＭ及び３０ｎＭでのＩＬ−１２産生と、細胞表面マーカーＣＤ４０、ＣＤ８６及びＭＨＣクラスＩＩの上方制御を測定することによって比較した。式中、Ｘ_ｎは、Ｒ^５に対し異なる基を含有する、式（２）に記載のＳＫ_４ペプチド部分のセリンを置き換えている。検討したこれらの異なる基Ｒ^５を含有する化合物Ｘ１〜Ｘ８を下記の表に示すが、Ｘ１は実施例１で調製したＵＰａｍ−１４であり、Ｘ２は実施例３で調製したＵＰａｍ−１４−Ａｂｕである。ＣＤ４０をアップレギュレートする化合物の効力にＤＣ成熟アッセイで確認されるような傾向があった。化合物Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７又はＸ８は、先行技術のＰａｍ_３Ｃｙｓ−ＳＫ_４で得られた結果と比べて、上方制御の増加が明らかであった。細胞表面マーカーＣＤ８６及びＭＨＣクラスＩＩの上方制御において、確かな傾向が認められた。

【0145】

【表4】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]