特許 6099574 外傷性脳損傷を処置する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6099574

(24)【登録日】2017年3月3日

(45)【発行日】2017年3月22日

(54)【発明の名称】外傷性脳損傷を処置する方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/185 20060101AFI20170313BHJP

   A61K 31/221 20060101ALI20170313BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20170313BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20170313BHJP

   A61K 31/198 20060101ALI20170313BHJP

   A61K 31/41 20060101ALI20170313BHJP

   A61K 31/325 20060101ALI20170313BHJP

   A61K 38/00 20060101ALI20170313BHJP

   A61P 27/16 20060101ALI20170313BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/185

   A61K31/221

   A61P25/00

   A61P43/00 121

   A61K31/198

   A61K31/41

   A61K31/325

   A61K37/02

   A61P27/16

【請求項の数】17

【全頁数】26

(21)【出願番号】特願2013-552693(P2013-552693)

(86)(22)【出願日】2012年2月3日

(65)【公表番号】特表2014-511374(P2014-511374A)

(43)【公表日】2014年5月15日

(86)【国際出願番号】US2012023855

(87)【国際公開番号】WO2012106654

(87)【国際公開日】20120809

【審査請求日】2015年2月2日

(31)【優先権主張番号】61/439,671

(32)【優先日】2011年2月4日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】509024112

【氏名又は名称】ハフ イヤ インスティテュート

(73)【特許権者】

【識別番号】594003676

【氏名又は名称】オクラホマ メディカル リサーチ ファウンデーション

【氏名又は名称原語表記】ＯＫＬＡＨＯＭＡ ＭＥＤＩＣＡＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ

(74)【代理人】

【識別番号】100083806

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 秀和

(74)【代理人】

【識別番号】100095500

【弁理士】

【氏名又は名称】伊藤 正和

(74)【代理人】

【識別番号】100111235

【弁理士】

【氏名又は名称】原 裕子

(72)【発明者】

【氏名】コプケ、 リチャード ディ．

(72)【発明者】

【氏名】フロイド、 ロバート エイ．

(72)【発明者】

【氏名】タウナー、 レアール

【審査官】 磯部 洋一郎

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００９−５４４７１２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Journal of Neurotrauma，(2008), 25，1449-1457

【文献】 Neurotherapeutics，Vol.7, No.1 (2010)，51-61

【文献】 In vitro blood-brain barrier permeability and cerebral endothelial cell uptake of the neuroprotective nitrone compound NXY-059 in normoxic, hypoxic and ischemic conditions，Brain Res.，２００２年，Vol.955，pp229-235

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３１／１８５

Ａ６１Ｋ ３１／１９８

Ａ６１Ｋ ３１／２２１

Ａ６１Ｋ ３１／３２５

Ａ６１Ｋ ３１／４１

Ａ６１Ｋ ３８／００

Ａ６１Ｐ ２５／００

Ａ６１Ｐ ２７／１６

Ａ６１Ｐ ４３／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

外傷性脳損傷の処置用の組成物であって、
前記組成物は、２，４−ジスルホニルα−フェニルｔｅｒｔ−ブチルニトロンおよびＮ−アセチルシステインを含み、
前記外傷性脳損傷は、騒音への暴露または爆風への暴露により誘発されたものである、組成物。

【請求項2】

前記外傷性脳損傷が、非開放性脳損傷である、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

経口投与される、請求項１または２に記載の組成物。

【請求項4】

前記組成物は、生物体が外傷性脳損傷を受けた１〜４時間後に投与される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項5】

前記組成物が、アセチル−Ｌ−カルニチン、グルタチオンモノエチルエステル、エブセレン、Ｄ−メチオニン、カルバマチオンおよびスゼト・シラー（Ｓｚｅｔｏ−Ｓｃｈｉｌｌｅｒ）ペプチドからなる群より選択される１種以上の化合物を更に含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項6】

外傷性脳損傷の処置用の組成物であって、
前記組成物は、２，４−ジスルホニルα−フェニルｔｅｒｔ−ブチルニトロンと、Ｎ−アセチルシステイン、アセチル−Ｌ−カルニチン、グルタチオンモノエチルエステル、エブセレン、Ｄ−メチオニン、カルバマチオン、およびスゼト・シラーペプチドからなる群より選択される１種以上の化合物と、を含み、
前記外傷性脳損傷が、騒音への暴露により誘発される非開放性脳損傷である、組成物。

【請求項7】

外傷性脳損傷の処置用の組成物であって、
前記組成物は、２，４−ジスルホニルα−フェニルｔｅｒｔ−ブチルニトロンと、Ｎ−アセチルシステイン、アセチル−Ｌ−カルニチン、グルタチオンモノエチルエステル、エブセレン、Ｄ−メチオニン、カルバマチオン、およびスゼト・シラーペプチドからなる群より選択される１種以上の化合物と、を含み、
前記外傷性脳損傷が、爆風への暴露により誘発される非開放性脳損傷である、組成物。

【請求項8】

経口投与される、請求項６または７に記載の組成物。

【請求項9】

前記組成物は、生物体が外傷性脳損傷を受けた１〜４時間後に投与される、請求項６〜８のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項10】

耳鳴の処置用の組成物であって、
前記組成物は、２，４−ジスルホニルα−フェニルｔｅｒｔ−ブチルニトロンおよびＮ−アセチルシステインを含み、
前記耳鳴は、騒音への暴露または爆風への暴露により誘発されたものである、組成物。

【請求項11】

経口投与される、請求項１０に記載の組成物。

【請求項12】

前記組成物が、アセチル−Ｌ−カルニチン、グルタチオンモノエチルエステル、エブセレン、Ｄ−メチオニン、カルバマチオンおよびスゼト・シラーペプチドからなる群より選択される１種以上の化合物を更に含む、請求項１０または１１に記載の組成物。

【請求項13】

生物体が外傷性脳損傷を受けた１〜４時間後に投与される、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項14】

外傷性脳損傷を有する生物体における耳鳴の処置用の組成物であって、
前記組成物は、２，４−ジスルホニルα−フェニルｔｅｒｔ−ブチルニトロンと、Ｎ−アセチルシステイン、アセチル−Ｌ−カルニチン、グルタチオンモノエチルエステル、エブセレン、Ｄ−メチオニン、カルバマチオン、およびスゼト・シラーペプチドからなる群より選択される１種以上の化合物と、を含み、
前記耳鳴は、騒音への暴露または爆風への暴露により誘発されたものである、組成物。

【請求項15】

経口投与される、請求項１４に記載の組成物。

【請求項16】

生物体の騒音への暴露または爆風への暴露の１〜４時間後に投与される、請求項１４または１５に記載の組成物。

【請求項17】

中枢神経系における化合物の生物学的利用率を増加させるための、２，４−ジスルホニルα−フェニルｔｅｒｔ−ブチルニトロンを含む組成物であって、
前記化合物は前記組成物の投与と同時またはその後に投与され、
前記化合物は、Ｎ−アセチルシステイン、アセチル−Ｌ−カルニチン、グルタチオンモノエチルエステル、エブセレン、Ｄ−メチオニン、カルバマチオンおよびスゼト・シラーペプチドからなる群より選択される１種以上の化合物である、組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

背景
爆風による過度の圧力が、頭蓋骨を通して脳に伝達されるとする証拠が増えている。これにより、脳の聴覚中枢、例えば脳幹、側頭葉、および視床への傷害など、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）を誘発する可能性を生じ、難聴、めまい、および耳鳴などの症状を示す可能性がある。特に顕著なことは、爆風関連のＴＢＩが、非爆風関連のＴＢＩに比較して、有意に高い割合（６０％）で難聴および耳鳴を生じるという観察である。同様に、蝸牛神経核、下丘、内側膝状体および一次聴覚皮質など、強度の音響または騒音により誘発される中枢聴覚構造の変化が報告されている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0002】

一部の物理的傷害は恒久的影響を有するが、爆風による外傷により引き起こされる二次的な分子的および細胞的プロセスから生じる長期的傷害結果の多くは、物理的傷害の影響を増幅させる。ＴＢＩは、挫傷、びまん性軸索損傷、血腫、クモ膜下出血を含め、ほぼ即座に損傷プロセスを開始し、その後間もなく様々な二次的損傷が続く。二次的損傷は、虚血、浮腫、酸化的傷害、ＡＴＰ減少、細胞骨格の変化、炎症、および細胞死経路の活性化などを含み得る。今日まで、これらの二次的な分子および細胞プロセスに取り組む効果的治療アプローチについては、徹底して研究されることがなかった。つまり、ＴＢＩの被害に関連するこれらの問題を処置するのに適した処置方法および化合物の実質的な必要性が存在する。

【課題を解決するための手段】

【0003】

騒音または爆風による外傷性脳損傷を処置する方法が、提供される。一実施形態において、２，４−ジスルホニルα−フェニルｔｅｒｔ−ブチルニトロンを含む組成物の薬学的有効量が、騒音または爆風により脳損傷を受けた生物体に投与される。この実施形態の一態様において、該組成物は、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）を更に含む。この実施形態の別の態様において、該組成物は、経口投与される。

【0004】

外傷性脳損傷を処置する方法が、提供される。一実施形態において、２，４−ジスルホニルα−フェニルｔｅｒｔ−ブチルニトロンを含む組成物の薬学的有効量が、外傷性脳損傷に見舞われた生物体に投与される。この実施形態の一態様において、該組成物は、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）を更に含む。この実施形態の別の態様において、該組成物は、経口投与される。

【0005】

別の実施形態において、脳損傷を処置する該方法は、４−ヒドロキシ−α−フェニルブチルニトロンを含む組成物を、脳損傷を有する生物体に投与することを含む。この実施形態の一態様において、該組成物は、ＮＡＣを更に含む。この実施形態の一態様において、該組成物は、ＮＡＣおよびアセチル−Ｌ−カルニチン（ＡＬＣＡＲ）を更に含む。この実施形態の更に別の態様において、該組成物は、経口投与される。

【0006】

耳鳴を処置する方法が、提供される。一実施形態において、２，４−ジスルホニルα−フェニルｔｅｒｔ−ブチルニトロンを含む組成物の治療有効量が、騒音誘発による耳鳴に罹患した生物体に投与される。この実施形態の一態様において、該組成物は、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）を更に含む。この実施形態の別の態様において、該組成物は、経口投与される。

【0007】

別の実施形態において、騒音による耳鳴を処置する方法は、４−ヒドロキシ−α−フェニルブチルニトロンを含む組成物を、騒音による耳鳴に罹患した生物体に投与することを含む。この実施形態の一態様において、該組成物は、ＮＡＣを更に含む。この実施形態の別の態様において、該組成物は、ＮＡＣおよびアセチル−Ｌ−カルニチン（ＡＬＣＡＲ）を更に含む。この実施形態の更に別の態様において、該組成物は、経口投与される。

【0008】

本発明は、中枢神経系において化合物の生物学的利用率を増加させる方法にも関する。該方法は、２，４−ジスルホニルα−フェニルｔｅｒｔ−ブチルニトロンを、血液脳関門の透過性を上昇させるのに十分な量で生物体に投与すること、および該化合物を、２，４−ジスルホニルα−フェニルｔｅｒｔ−ブチルニトロンの投与と同時に、またはその後に、生物体に投与することを含む。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1A-1F】対照の対象（１Ａ）、騒音に暴露された対象（１Ｂ−騒音後１時間目；１Ｃ−騒音後８時間目；１Ｅ−騒音後２４時間目）、ならびに、騒音暴露後４時間目に２，４−ジスルホニルα−フェニルｔｅｒｔ−ブチルニトロン（２，４−ジスルホニルＰＢＮ）およびＮＡＣで処置された対象（１Ｄ−騒音後８時間目；１Ｆ−騒音後２４時間目）における、ｃ−ｆｏｓについて免疫染色された背側蝸牛神経核（ＤＣＮ）の像を提供する。

【図1G】図１Ａ〜１Ｆの像からＤＣＮにおいて計数されたｃ−ｆｏｓ陽性細胞の数を表す棒グラフを提供する（ＮＣ＝正常対照、Ｈ−Ｎ＝騒音暴露後時間、Ｄ−Ｎ＝騒音暴露後日数、Ｔ＝２，４−ジスルホニルＰＢＮ＋ＮＡＣの処置を受けた）。

【図2】２，４−ジスルホニルＰＢＮおよびＮＡＣでの処置の非存在下、および存在下で、騒音暴露後の様々な時点での後腹側蝸牛神経核（ＰＶＣＮ）におけるｃ−ｆｏｓ陽性細胞の数を表す棒グラフを提供する（ＮＣ＝正常対照、Ｈ−Ｎ＝騒音暴露後時間、Ｄ−Ｎ＝騒音暴露後日数、Ｔ＝２，４−ジスルホニルＰＢＮ＋ＮＡＣの処置を受けた）。

【図3A-3F】対照の対象（３Ａ）、騒音に暴露された対象（３Ｂ−騒音暴露後１時間目；３Ｃ−騒音暴露後８時間目；３Ｅ−騒音暴露後２４時間目）、ならびに、騒音暴露後４時間目に２，４−ジスルホニルＰＢＮおよびＮＡＣで処置された対象（３Ｄ−騒音暴露後８時間目；３Ｆ−騒音暴露後２４時間目）における、ｃ−ｆｏｓについて免疫染色された前腹側蝸牛神経核（ＡＶＣＮ）の像を提供する。

【図3G】図３Ａ〜３Ｆの像からＡＶＣＮにおいて計数されたｃ−ｆｏｓ陽性細胞の数を表す棒グラフを提供する（ＮＣ＝正常対照、Ｈ−Ｎ＝騒音暴露後時間、Ｄ−Ｎ＝騒音暴露後日数、Ｔ＝２，４−ジスルホニルＰＢＮ＋ＮＡＣの受けた処置）。

【図4】図１Ｇ、図２および図３Ｇの結果の比較を表す棒グラフを提供する。

【図5A-5C】対照の対象（５Ａ）、騒音に暴露された対象（５Ｂ）、および、騒音に暴露され４−ヒドロキシ−α−フェニルブチルニトロン（４−ＯＨＰＢＮ）＋ＮＡＣ＋ＡＬＣＡＲで処置された対象（５Ｃ）における、プレセレベリンについて免疫染色されたＤＣＮの中央部の像を提供する。

【図5D】対照の対象、騒音に暴露された対象、および、騒音に暴露され４−ＯＨＰＢＮ＋ＮＡＣ＋ＡＬＣＡＲで処置された対象における、ＤＣＮの外側、中央、および内側部のプレセレベリン陽性細胞の密度を表す棒グラフを提供する。

【図6A-6C】対照の対象（６Ａ）、騒音に暴露された対象（６Ｂ）、および、騒音に暴露され処置（４−ＯＨＰＢＮ＋ＮＡＣ＋ＡＬＣＡＲ）された対象（６Ｃ）における、ＰＥＰ−１９について免疫染色されたＤＣＮの中央部の像を提供する。

【図6D】対照の対象、騒音に暴露された対象、および、騒音に暴露され処置（４−ＯＨＰＢＮ＋ＮＡＣ＋ＡＬＣＡＲ）された対象における、ＤＣＮの外側、中央、および内側部のＰＥＰ−１９陽性細胞の密度を表す棒グラフを提供する。

【図7A-7C】対照の対象（７Ａ）、騒音に暴露された対象（７Ｂ）、および、騒音に暴露され処置（４−ＯＨＰＢＮ＋ＮＡＣ＋ＡＬＣＡＲ）された対象（７Ｃ）における、ＮｅｕＮについて免疫染色されたＤＣＮの中央部の像を提供する。

【図7D】対照の対象、騒音に暴露された対象、および、騒音に暴露され処置（４−ＯＨＰＢＮ＋ＮＡＣ＋ＡＬＣＡＲ）された対象における、ＤＣＮの外側、中央、および内側部のＮｅｕ−Ｎ陽性細胞の密度を表す棒グラフを提供する。

【図8A-8C】対照の対象（８Ａ）、騒音暴露後の対象（８Ｂ）、および、騒音暴露後４時間目に４−ＯＨＰＢＮ＋ＮＡＣ＋ＡＬＣＡＲで処置された対象（８Ｃ）の、ＤＣＮの中央部のカートホイール細胞体を取り囲む神経末端の透過型電子顕微鏡像を提供する。

【図8D-8F】それぞれ図８Ａ〜８Ｃをより高い倍率で表す。

【図8G-8I】対照の対象（８Ｇ）、騒音暴露後の対象（８Ｈ）、および、騒音暴露後４時間目に４−ＯＨＰＢＮ＋ＮＡＣ＋ＡＬＣＡＲで処置された対象（８Ｉ）の、ＤＣＮの中央部のカートホイール細胞体の一次樹状突起を取り囲む神経末端の透過型電子顕微鏡像を提供する。

【図8J-8L】それぞれ図８Ｇ〜８Ｉをより高い倍率で表す。

【図9】爆風に暴露された対象の海馬におけるアミロイド前駆蛋白質（ＡＰＰ）に陽性の細胞の密度を表す棒グラフを提供する（ＮＣ＝正常対照（爆風なし）、Ｈ−Ｂ＝爆風暴露後時間、Ｄ−Ｂ＝爆風暴露後日数、Ｔ＝爆風暴露後４時間目の２，４−ジスルホニルＰＢＮ＋ＮＡＣでの処置）。

【図10A】正常対照の対象におけるグリア原線維酸性蛋白質（ＧＦＡＰ）について免疫染色されたＤＣＮの光学顕微鏡像（倍率４倍）を提供する。

【図10B-10D】正常対照の対象（１０Ｂ）、爆風に暴露された対象（１０Ｃ）、および、爆風に暴露された後２，４−ジスルホニルＰＢＮ＋ＮＡＣで処置された対象（１０Ｄ）の、ＧＦＡＰについて免疫染色されたＤＣＮの中央部の光学顕微鏡像（倍率２０倍）を提供する。

【図10E】対照の対象、爆風に暴露された対象、および、爆風に暴露された後２，４−ジスルホニルＰＢＮ＋ＮＡＣで処置された対象の、ＤＣＮの外側、中央、および内側部におけるＧＦＡＰ陽性細胞の密度を表す棒グラフを提供する。

【図11】爆風に暴露された対象の、爆風１時間後に投与される２，４−ジスルホニルＰＢＮ（ＨＰＮ−０７）＋ＮＡＣの非存在下（対照）および存在下の、血液脳関門透過性の％上昇率を表す棒グラフを提供する。

【図12A-12C】騒音外傷に暴露されなかった対照の対象（図１２Ａ）、処置なしの暴露後６ヶ月目の対象（図１２Ｂ）、および、ＨＰＮ−０７処置ありの暴露後６ヶ月目の対象（図１２Ｃ）における、海馬のダブルコルチン免疫染色区分を表す。

【図13A-13E】騒音外傷に暴露されなかった対照の対象（図１３Ａ）、処置なしの暴露後２１日目および６ヶ月目の対象（それぞれ図１３Ｂおよび図１３Ｄ）、ならびにＨＰＮ−０７処置された同じ時点の対象（それぞれ図１３Ｃおよび１３Ｅ）における、嗅内皮質のダブルコルチン免疫染色区分を表す。

【発明を実施するための形態】

【0010】

詳細な説明
本発明は、騒音による耳鳴および外傷性脳損傷、ならびに酸化ストレス、プログラム細胞死、または炎症プロセスに関連する脳損傷を処置する方法を提供する。外傷性脳損傷（ＴＢＩ）は、外部力により引き起こされた、脳機能の変化または脳病理の他の証拠である。ＴＢＩを引き起こす外部力として、非限定的に、透過的損傷（脳への物体の透過）、および非透過的もしくは非開放性損傷、例えば爆風もしくは圧力への暴露（爆風によるＴＢＩ）、物体による頭部打撲、または騒音への暴露（騒音によるＴＢＩ）が挙げられる。本発明は、耳鳴および外傷的脳損傷の処置における２，４−ジスルホニル−α−フェニルｔｅｒｔブチルニトロンの機能性、および、２，４−ジスルホニル−α−フェニルｔｅｒｔブチルニトロンとＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）とを組み合わせることによる相乗効果を実証する。本開示の残り部分の目的のために、２，４−ジスルホニル−α−フェニルｔｅｒｔブチルニトロンは、２，４−ジスルホニルＰＢＮまたはＨＰＮ−０７と称する。

【0011】

２，４−ジスルホニルＰＢＮは、以下の構造を有する。

【化1】

該化合物の酸形態は、以下の構造を有する。

【化2】

該酸形態は、固体でもあり得るし、低ｐＨ溶液中にも見出され得る。該化合物のイオン化塩形態が、より高いｐＨにおいて存在し、以下の構造のいずれかにより表すことができる。

【化3】

または

【化4】

該塩形態において、Ｘは、薬学的に許容し得る陽イオンである。最も一般的にはこの陽イオンは、ナトリウム、カリウム、またはアンモニウムなどの一価物質であるが、それは単独の多価であっても、または薬学的に許容し得る一価陰イオンと組み合わされた陽イオン、例えばカルシウムと塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオン、ヒドロキシルイオン、硝酸イオン、スルホン酸イオン、酢酸イオン、酒石酸イオン、シュウ酸イオン、コハク酸イオン、パルモ酸イオン（ｐａｌｍｏａｔｅ）などの陰イオン；マグネシウムとそのような陰イオン；亜鉛とそのような陰イオンの組合せなどであってもよい。これらの物質のうち、遊離酸と単純なナトリウム、カリウム、またはアンモニウムとの塩が最も好ましく、カルシウムおよびマグネシウム塩も好ましいが若干劣る。２，４−ジスルホニルＰＢＮ化合物は、米国特許第５，４８８，１４５号に詳細に記載されている。米国特許第５，４８８，１４５号の全体的な開示は、参照により本明細書に組み入れられる。２，４−ジスルホニルＰＢＮの塩も、以下に説明される２，４−ジスルホニルＰＢＮの使用と同様の手法で、脳損傷および耳鳴の処置に用いることができる。

【0012】

追加として、ミトコンドリアを標的とする抗酸化ペプチドが本発明において有用であり、耳鳴および外傷性脳損傷の処置用の組成物の一部として含まれてもよい。これらの化合物は、酸化ストレスおよびミトコンドリアの傷害を導く細胞内活性酸素種（ＲＯＳ）の発生を阻止する。ミトコンドリアの酸化的傷害は、アポトーシスおよび壊死を誘発し細胞死をもたらすことが知られている。好ましい抗酸化ペプチドは、スゼト・シラー（Ｓｚｅｔｏ−Ｓｃｈｉｌｌｅｒ）（ＳＳ）ペプチドおよびその機能的類似体である。これらの化合物は、交互に並んだ芳香族残基および塩基性アミノ酸を有する。特に、チロシン（Ｔｙｒ）またはジメチルチロシン（Ｄｍｔ）類似体を有するペプチドは、オキシラジカルを除去することができる。これらの化合物は、低比重リポ蛋白質の酸化を阻害する。ＳＳ−ペプチドとしては、ＳＳ−３１（Ｄ−Ａｒｇ−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ_２）およびＳＳ−０２（Ｄｍｔ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ_２）などの化合物が挙げられる。ＴｙｒおよびＤｍｔ含有ＳＳ−ペプチドに加えて、トリプトファン含有ＳＳ−ペプチドも、本発明において有用である。最後に、ＳＳ−ペプチド中に見出されるアミノ酸は、ＬまたはＤであってもよく、天然由来、非天然由来、および天然由来アミノ酸誘導体であってもよい。特に、ＰＣＴ国際公報ＷＯ２００５／０７２２９５号に開示されたＳＳ−ペプチドが、本発明における使用に適する。２００５年８月１１日に公開されたＷＯ２００５／０７２２９５号の全体的開示が、参照により本明細書に組み入れられる。本発明の組成物は、非限定的にアセチル−Ｌ−カルニチン（ＡＬＣＡＲ）、グルタチオンモノエチルエステル、エブセレン、Ｄ−メチオニンをはじめとする抗酸化化合物を場合により含んでいてもよい。

【0013】

別の実施形態において、本発明は、４−ヒドロキシ−α−フェニルブチルニトロン（４−ＯＨＰＢＮ）または４−ＯＨＰＢＮの誘導体を、単独で、または少なくとも１種の抗酸化剤と組み合わせて使用して、脳損傷および騒音による耳鳴を処置する。加えて４−ＯＨＰＢＮの誘導体を配合させて、経口吸収を増強してもよく、生物学的利用性反応速度（ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を変化させてもよく、および／または、上記化合物の１種以上と組み合わせて配合させてもよい。好ましくは、脳損傷および耳鳴を処置する組成物は、経口投与される。しかし、該組成物を全身に送達する他の方法も、等しく十分に作用するはずである。

【0014】

実施例で実証される通り、本発明者らは、騒音暴露または爆風暴露の１〜４時間後にＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）と組み合わせて投与される４−ヒドロキシ−α−フェニルブチルニトロン（４−ＯＨＰＢＮ）または２，４−ジスルホニルＰＢＮが、生じた外傷性脳損傷に関連する分子変化を予防し得ることを発見した。更に、背側蝸牛神経核など、騒音または爆風暴露により影響を受ける脳の領域を、耳鳴の病因に関連付け、耳鳴処置の新規な治療的アプローチを提供した。

【0015】

本発明の好ましい実施形態を、主に騒音による耳鳴ならびに騒音および爆風による外傷性脳損傷に関連して記載しているが、本明細書に記載される方法および組成物は、様々な異なる事象または要因により誘発される外傷性脳損傷および耳鳴を処置するのに用いられ得ることが、理解されなければならない。本明細書に記載される方法は、虚血、浮腫、酸化的傷害、ＡＴＰ減少、細胞骨格の変化、炎症、および細胞死経路の活性化など、ＴＢＩにより生じる二次的損傷を処置するのに特に有用となり得る。

【0016】

本発明の組成物は、好ましくは経口投与されるが、非限定的に静脈内、皮下、吸入、舌下、真皮下または髄腔内をはじめとする他の送達方法でも投与される。更に、該活性組成物は、ナノ粒子またはデンドリマー製剤として投与されてもよい。ナノ粒子は、多官能性であってもよく、外部磁力を適用させて背側蝸牛神経核などの所望の標的への薬物送達を補助するためにポリマーおよび常磁性酸化鉄粒子で構成されていてもよい。追加として、該組成物を当業者に公知の添加剤とともに製剤して、経口吸収を増強し、生物学的利用性反応速度を変化させてもよい。

【実施例】

【0017】

以下の実施例において、本発明者らは、高レベルの騒音および爆風への暴露（高圧暴露）が、背側蝸牛神経核、海馬、および嗅内皮質をはじめとする特定領域において外傷性脳損傷に関連する分子的および細胞的な変化を誘発し得ることを実証する。その上、本発明者らは、２，４−ジスルホニルＰＢＮ（ＨＰＮ−０７）を単独で、またはＮＡＣと組み合わせて含む組成物の投与が、外傷性脳損傷に関連する細胞変化を回復させ得ることを実証する。それを実行することにより、騒音による耳鳴をはじめとする外傷性脳損傷の症状を、低減することができる。あるいは本発明者らは、４−ヒドロキシ−α−フェニルブチルニトロン、ＮＡＣおよびＡＬＣＡＲを含む組成物が、類似の治療効果を有し得ることを実証する。

【0018】

実施例１
この実施例の目的は、２，４−ジスルホニルＰＢＮ（ＨＰＮ−０７）およびＮＡＣを含む組成物が、背側蝸牛神経核の騒音による外傷性脳損傷を示す分子変化を回復させるのに効果的であることを実証することである。

【0019】

慢性的な音響暴露による耳鳴に見舞われた動物のＭＲＩ試験で、背側蝸牛神経核における脳活性の上昇が実証されている。前初期遺伝子であるｃ−ｆｏｓの発現は、神経細胞活性マーカとして受け入れられ広く用いられている。ｃ−ｆｏｓ発現の増加が、騒音暴露後数時間から５．５週間目まで中枢神経系において観察されており、ｃ−ｆｏｓの発現が、耳鳴、または騒音誘発性の耳鳴に関連する可塑性の、神経相関を表し得ることが示唆される。ｃ−ｆｏｓの発現増加は、脳損傷にも関連付けられている。この実施例では、ｃ−ｆｏｓの発現を、ＨＰＮ−０７およびＮＡＣを含む組成物の投与を実施する場合および実施しない場合について、１１５ｄＢ ＳＰＬオクターブ帯域騒音暴露の１時間〜２１日目後において検査した。

【0020】

成体ラット（スプラグードゥーリー、各群４〜６匹）を、試験に用いた。騒音群（Ｎ）および騒音＋処置群（Ｎ／Ｔ）の動物を、１４ｋＨｚを中心とする１１５ｄＢ ＳＰＬオクターブ帯域騒音に１時間暴露した。２０ｍｇ／ｋｇのＨＰＮ０７および５０ｍｇ／ｋｇのＮＡＣを含む組成物を、騒音暴露の４時間後に腹腔投与し、続く２日間において１日２回ずつ腹腔内投与した。騒音暴露を受けなかったラットを、正常対照（ＮＣ）とした。聴性脳幹反応（ＡＢＲ）および歪成分耳音響放射（ＤＰＯＡＥ）を、騒音暴露および安楽死の前に記録した。脳幹を、騒音暴露１時間後（１Ｈ）、８Ｈ、２４Ｈ、７日後（７Ｄ）および２１Ｄに回収し、パラフィン包埋用に処理して６μｍの厚さで切片にした。ｃ−ｆｏｓ陽性細胞を、免疫組織化学的染色により、切片において同定した。免疫密度（ｉｍｍｕｎｏｄｅｎｓｉｔｙ）を、陽性細胞数／ｍｍ^２として光学顕微鏡により決定した。データを統計解析した（一元配置ＡＮＯＶＡおよびターキーＨＳＤ検定）。

【0021】

図１に、正常対照群（Ａ）、騒音暴露群（Ｂ、Ｃ、Ｅ）および騒音／処置群（Ｄ、Ｆ）の背側蝸牛神経核（ＤＣＮ）から得られた、光学顕微鏡によるｃ−ｆｏｓ免疫染色像の例を示す。騒音暴露１時間後に、多数の陽性ｃ−ｆｏｓ染色細胞が主に紡錘状の細胞体層に見出され、分子層および深部層における陽性細胞はほとんどなく（Ｂ）、ｃ−ｆｏｓ発現が騒音暴露の直後にＤＣＮにおいて上方制御されることが示唆された。陽性細胞数は、騒音暴露後８Ｈ（Ｃ）および２４Ｈ（Ｅ）に減少し、７Ｄおよび２１Ｄに正常レベルまで回復した（データは示さず）。ＤＣＮにおける陽性染色細胞を計数し、統計解析した（Ｇ）。ＮＣ群に比較したｃ−ｆｏｓ陽性細胞数の有意な増加が、１Ｈ−Ｎ、８Ｈ−Ｎおよび２４Ｈ−Ｎ群において見出された（ｐ＜０．０１）。有意差は、８Ｈ−Ｎ群と８Ｈ−Ｎ／Ｔ群の間にも見出され（ｐ＜０．０１）、ＨＰＮ−０７およびＮＡＣを含む組成物での処置が、騒音曝露後のこの時点でＤＣＮにおけるｃ−ｆｏｓ発現を下方制御することが示唆された。

【0022】

図２に、ＰＶＣＮにおけるｃ−ｆｏｓ免疫染色密度測定の結果を示す。ｃ−ｆｏｓ陽性細胞数の有意な増加が、ＮＣ群に比較した１Ｈ−Ｎ群において見出され（ｐ＜０．０１）、ｃ−ｆｏｓ発現が騒音暴露の直後にＰＶＣＮにおいて上方制御されることが示唆された。

【0023】

図３に、正常対照群（Ａ）、騒音暴露群（Ｂ、Ｃ、Ｅ）および騒音／処置群（Ｄ、Ｆ）の前腹側蝸牛神経核（ＡＶＣＮ）から得られた、光学顕微鏡によるｃ−ｆｏｓ免疫染色像の例を提供する。騒音暴露１時間後に、多数の陽性ｃ−ｆｏｓ染色細胞がＡＶＣＮに見出され（Ｂ）、ｃ−ｆｏｓ発現が騒音暴露の直後にＡＶＣＮにおいて上方制御されることが示唆された。陽性細胞数は、騒音暴露後８Ｈ（Ｃ）および７〜２１Ｄ（図示せず）に正常レベルまで回復した。しかし、騒音暴露後２４Ｈに、第二の上方制御ピークが存在した。ＤＣＮにおける陽性染色細胞数を計数し、統計解析した（Ｇ）。ｃ−ｆｏｓ陽性細胞数の有意な増加が、ＮＣ群に比較した１Ｈ−Ｎ群および２４Ｈ−Ｎ群において見出された（ｐ＜０．０５または０．０１）。有意差は、８Ｈ−Ｎ群と８Ｈ−Ｎ／Ｔ群の間にも見いだされ（ｐ＜０．０１）、ＨＰＮ−０７およびＮＡＣを含む組成物の投与が、騒音暴露後のこの時点でＤＣＮにおけるｃ−ｆｏｓ発現を下方制御することが示唆された。

【0024】

図４に、騒音暴露およびＨＰＮ−０７＋ＮＡＣ処置後の異なる時点でのＤＣＮ、ＡＶＣＮおよびＰＶＣＮのｃ−ｆｏｓ発現の比較を提供する。有意差が、１Ｈ−Ｎ、８Ｈ−Ｎおよび２４Ｈ−Ｎ／Ｔ群における３種の核の間に見出された（ｐ＜０．０５または０．０１）。ＤＣＮは、騒音暴露後の２つの時点（１Ｈおよび８Ｈ）でＶＣＮよりも有意に多くのｃ−ｆｏｓ陽性細胞を有し（ｐ＜０．０１）、ＤＣＮが深部層のみに直接の聴覚入力を有するものの、騒音暴露に対して感受性があることも示唆された。

【0025】

要約すると、実施例１は、以下のことを実証している：（１）ｃ−ｆｏｓ発現は、騒音暴露の直後に蝸牛神経核の神経細胞において上方制御された；（２）ｃ−ｆｏｓ発現は、ＤＣＮにおいて騒音暴露２４時間後に、そしてＶＣＮにおいて８Ｈに、正常レベルに回復した；（３）騒音暴露後２４Ｈに、ＡＶＣＮにおいて第二の上方制御ピークがある；（４）騒音暴露後に、ＶＣＮよりもＤＣＮにおいて多くのｃ−ｆｏｓ陽性神経細胞が見出された；ならびに（５）ＨＰＮ−０７およびＮＡＣを含む組成物の投与は、ＤＣＮ（８Ｈ）およびＡＶＣＮ（２４Ｈ）においてｃ−ｆｏｓ発現を下方制御し得る。このデータから、ＨＰＮ−０７およびＮＡＣでの処置が、ＤＣＮおよびＡＶＣＮにおいて騒音による外傷性脳損傷の影響を低減するのに効果的であることが示唆される。更に、騒音による耳鳴の心理物理的証拠を有する動物において、ＤＣＮにおける自発的な活性上昇が以前に示されており、そのような活性亢進が騒音による耳鳴に関連し得ることが示唆された。つまりこれらの結果から、ＨＰＮ−０７とＮＡＣとの組み合わせが、騒音による耳鳴、および騒音による蝸牛神経核への損傷に関連する他の状態を処置するのに効果的となり得ることも示唆される。

【0026】

実施例２
この実施例において、細胞型に特異的なシナプス活性マーカであるプレセレベリン、ならびに神経細胞マーカであるＰＥＰ−１９（カートホイール細胞マーカ）およびＮｅｕＮに加え、透過型電子顕微鏡試験（ＴＥＭ）を用いて、１０５ｄＢ ＳＰＬオクターブ帯域の騒音暴露後４時間目に開始した４−ヒドロキシ−α−フェニルブチルニトロン、ＮＡＣおよびＡＬＣＡＲ（４−ＯＨＰＢＮ＋ＮＡＣ＋ＡＬＣＡＲ）を含む組成物の非存在下および存在下、暴露後１０日目のチンチラのＤＣＮにおけるシナプス変性を検査した。

【0027】

３〜５歳のチンチラを、以下の３つの群（各群６匹）に分けた：１）正常対照；２）騒音暴露のみ（４ｋＨｚを中心とする１０５ｄＢ ＳＰＬオクターブ帯域騒音を６時間）；３）騒音暴露に加えて、騒音暴露４時間後に開始し、続く２日間に１日２回実施した４−ＯＨＰＢＮ＋ＮＡＣ＋ＡＬＣＡＲでの処置。処置群の動物は、ジメチルスルホキシド（４０％）、ポリエチレングリコール４００（４０％）、および生理食塩水（２０％）に溶解された４−ＯＨ−ＰＢＮ ２０ｍｇ／ｋｇと、水中の２０％ＮＡＣ（０．０５％無水エデト酸二ナトリウム、ｐＨ７．０、Ｈｏｓｐｉｒａ Ｉｎｃ．， ｌａｋｅ Ｆｏｒｅｓｔ， ＩＬ）５０ｍｇ／ｋｇと、生理食塩水中のＡＬＣＡＲ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｏｎｃ． Ａｔ． Ｌｏｕｓ， ＭＯ）２０ｍｇ／ｋｇと、を受けた。これらの薬剤を、別々に腹腔内投与した。脳幹を回収して、４％パラホルムアルデヒドによる心内灌流により固定した。脳幹を、クリオトームで厚さ１８〜２０μｍに連続的に薄切した。抗プレセレベリン、抗ＰＥＰ−１９または抗ＮｅｕＮ抗体を用いた免疫組織化学的標識を切片で実施して、騒音暴露後のシナプスおよび神経細胞への処置の有効性を評価した。免疫密度を、免疫陽性細胞数／ｍｍ^２として測定した。細胞数を統計解析した（一元配置ＡＮＯＶＡおよびターキーＨＳＤ解析）。４％の新鮮な脱重合パラホルムアルデヒドおよび０．１２５％グルタルアルデヒドで灌流された３匹のチンチラ（各群１匹）の脳組織をＴＥＭ試験に用いて、チンチラのＤＣＮの中央部におけるシナプス変性を検査した。

【0028】

図５に、正常対照群（５Ａ）、騒音暴露群（５Ｂ）および騒音／処置群（５Ｃ）のＤＣＮの中央部から、光学顕微鏡により得られたプレセレベリン免疫染色像の例を提供する。陽性プレセレベリン染色細胞が、ＤＣＮの紡錘状の細胞体層および深部層に見出された（Ａ〜Ｃの矢印および矢じり）。紡錘状の細胞体層の陽性染色細胞を計数して、統計解析した（Ｄ）。有意差が、ＤＣＮの中央部のみで群間に見出されたが、外側および内側部には見出されなかった。中央部では、有意差が、正常対照群と騒音暴露群の間（ｐ＜０．０１）、および騒音暴露群と騒音／処置群の間（ｐ＜０．０５）に見出された。

【0029】

図６に、正常対照群（６Ａ）、騒音暴露群（６Ｂ）および騒音／処置群（６Ｃ）のＤＣＮの中央部から、光学顕微鏡により得られたＰＥＰ−１９免疫染色像の例を提供する。陽性ＰＥＰ−１９染色細胞が、ＤＣＮの紡錘状の細胞体層および深部層に見出された（Ａ〜Ｃの矢印および矢じり）。紡錘状の細胞体層の陽性染色細胞を計数して、統計解析した（Ｄ）。全ての領域で、群間に有意差は全く見出されなかった（ｐ＞０．０５）。

【0030】

図７に、正常対照群（７Ａ）、騒音暴露群（７Ｂ）および騒音／処置群（７Ｃ）のＤＣＮの中央部から、光学顕微鏡により得られたＮｅｕＮ免疫染色像の例を示す。多数の陽性ＮｅｕＮ染色細胞が、紡錘状の細胞体層および深部層に見出され、ＤＣＮの分子層にはほとんど見出されなかった。陽性染色細胞を計数して、統計解析した（Ｄ）。有意差は、全ての領域で、群間に有意差は全く見出されなかった（ｐ＞０．０５）。

【0031】

図８に、正常対照（左の列）、騒音暴露（中央の列）および騒音／処置（右の列）のチンチラのＤＣＮの中央部においてカートホイール細胞体（Ａ〜Ｆ）およびその一次樹状突起（Ｄ１、Ｇ〜Ｌ）を取り囲む神経末端の例を提供する。パネルＤ〜ＦおよびＪ〜Ｌの像は、それぞれパネルＡ〜ＣおよびＧ〜Ｉのより高倍率の像である。２つの型の末端ＰＶＤ（多型性小胞、高密度（ｐｌｅｏｍｏｒｐｈｉｃ ｖｅｓｉｃｌｅｓ， ｄｅｎｓｅ））およびＰＶＬ（多型性小胞、低密度（ｌｕｓｅｎｔ））が、カートホイール細胞体、およびその一次樹状突起を取り囲んで見出された。３群のいずれのチンチラＰＶＤシナプス末端にも、明白な変化は見出されなかった。正常対照群のＰＶＬに比較して、騒音暴露群および騒音／処置群のＰＶＬにおいては、巨大な小胞が認められたが（Ｅ、Ｆ、Ｋの矢じり）、騒音／処置群のＤ１を取り囲む神経末端のＰＶＬには、認められなかった（Ｌ）。その上、正常対照群および騒音／処置群において凸形状を有するシナプス膜（Ｄ、Ｆ、ＪおよびＬの矢印）は、騒音暴露されたチンチラでは平坦に見え、より低密度の輪郭を有した（ＥおよびＫの白抜き矢印）。

【0032】

要約すると、実施例２により以下のことが実証される：（１）プレセレベリン発現の下方制御は、騒音暴露群のＤＣＮの中央部のみに見出され；（２）本試験において用いられた騒音暴露は、カートホイール細胞の喪失（ＰＥＰ−１９により標識）またはＤＣＮにおける他の神経細胞の喪失（ＮｅｕＮにより標識）を誘発しなかった；（３）ＴＥＭにより、ＤＣＮの中央部のカートホイール細胞体およびその一次樹状突起を取り囲む神経末端において、小胞の拡大およびシナプス膜の平坦化が示された；（４）ＤＣＮの中央部のシナプス変性は、騒音暴露の一結果である可能性がある；（５）４−ＯＨＰＢＮ＋ＮＡＣ＋ＡＬＣＡＲを含む組成物の投与は、プレセレベリンの発現を有意に回復させ、ＤＣＮ内のカートホイール細胞体およびその一次樹状突起を取り囲むシナプスの変性を低減した。つまり、騒音暴露後の早期４−ＯＨＰＢＮ＋ＮＡＣ＋ＡＬＣＡＲ処置は、正常な中枢聴覚構造を維持する働きがある。

【0033】

実施例３
この実施例の目的は、爆風暴露後の海馬および皮質における様々な脳損傷バイオマーカに対する、ＮＡＣと２，４−ジスルホニルＰＢＮ（ＨＰＮ−０７）との組み合わせの影響を実証することである。

【0034】

雄ロングエバンス有色ラットを、３回の爆風（１４ｐｓｉ、爆風の間隔は１．５分間）に暴露した。ラットに通常の生理食塩水中の３００ｍｇ／ｋｇ ＮＡＣ＋３００ｍｇ／ｋｇ ＨＰＮ−０７を、爆風暴露１時間後に腹腔内注射し、その後、ラットの処置群には続く２日間に１日２回継続して注射した。爆風を受けたラットまたは受けなかったラットに、担体溶液を注射し、対照として使用した。各群および各時点で、ラット６匹を用いた。動物は全て、爆風暴露後３時間、２４時間、７日および２１日目に１０％パラホルムアルデヒドで心内灌流した（各群の各時点に６匹。合計５４匹）。脳を採取して、３０μｍに低温薄切した。アミロイド前駆蛋白質（ＡＰＰ）およびグリア原線維酸性蛋白質（ＧＦＡＰ）レベルを、海馬および聴覚皮質のＣＡ１領域において測定して、外傷性または爆風による脳損傷のレベルを示した。ウサギ抗ＡＰＰ ＩｇＧ（１：１００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）またはＧＦＡＰ ＩｇＧ（１：５００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）およびアビジン・ビオチン複合体（ＡＢＣ）法を用いた免疫組織化学的染色により、レベルを測定した。光学または共焦顕微鏡測定により、像を採取した。ＡＰＰ陽性染色を計数して、図９に示された通り統計解析した（ＡＮＯＶＡおよび事後検定）。

【0035】

ＡＰＰ染色は、対照群（爆風暴露なし）では海馬および皮質のＣＡ１領域に存在しない。しかし爆風暴露２４時間後に、強度のＡＰＰ陽性染色が、海馬および皮質のＣＡ１領域において見出され、脳損傷を示している。この損傷は、ＨＰＮ−０７およびＮＡＣでの併用処置を受けた場合には両方の領域で低減した（共焦顕微鏡像は示さず）。ＡＰＰ蛋白質が、損傷への応答として軸索および細胞体に蓄積されることも、観察された（共焦顕微鏡像は示さず）。図９に、共焦顕微鏡像において見出されたＡＰＰ陽性体の定量を提供する。有意差が、爆風暴露２４時間後に、正常対照（ＮＣ）と爆風群（２４Ｈ−Ｂ）の間（ｐ＜０．００１および０．０５）、ならびに爆風群（２４Ｈ−Ｂ）と爆風＋処置群（２４Ｈ−Ｂ／Ｔ）の間（ｐ＜０．００１）に見出された。これらの結果から、爆風暴露１時間後のＨＰＮ−０７とＮＡＣとの組み合わせが、脳におけるＡＰＰ形成および発現を阻害することが示され、従って爆風による脳損傷から生じる傷害がＨＰＮ−０７およびＮＡＣ処置により低減することが示唆された。

【0036】

図１０は、爆風後２１日目に、正常対照群の背側蝸牛神経核（ＤＣＮ−４×、図１０Ａ）およびＤＣＮの中央部（２０×、図１０Ｂ）、爆風暴露群（図１０Ｃ）および爆風／処置群（図１０Ｄ）の、光学顕微鏡により得られたＧＦＡＰ免疫染色像を示す。陽性ＧＦＡＰ染色細胞が、ＤＣＮの全ての層に見出されたが、それらのほとんどは、表層に位置している。正常対照には、陽性細胞がほとんど見出されない。より多くのＧＦＡＰ陽性細胞が、爆風後２１日目のＤＣＮに見出され、処置後のＤＣＮでは陽性細胞がより少ない。ＤＣＮにおける陽性染色細胞を計数して統計解析し、その結果を図１０Ｅに提供している。有意差は、ＤＣＮの中央部の群間に見出されたが（ｐ＜０．０５）、ＤＣＮの外側および内側では見出されなかった（全てｐ＞０．０５）。これらの結果から、ＨＰＮ−０７およびＮＡＣでの処置が、爆風暴露後のグリア細胞活性を阻害し、ＤＣＮにおける領域的な効果を有し得ることが実証される。このデータは、ＮＡＣ／ＨＰＮ−０７処置が、ＤＣＮおよび聴覚皮質などの聴覚中枢を含め、爆風によるＴＢＩを低減することを裏付けている。

【0037】

実施例４
この実施例の目的は、血液脳関門透過性に対するＨＰＮ−０７およびＮＡＣの影響を検証することである。

【0038】

雄ロングエバンス有色ラット（Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， Ｉｎｄｉａｎａ、体重３６０〜４００ｇ）に対し、生理食塩水に５ｍｌ／ｋｇで溶解された３００ｍｇ／ｋｇ ＮＡＣ＋３００ｍｇ／ｋｇ ＨＰＮ−０７の組み合わせを、腹腔内注射した。対照群の動物には、同様の容量の生理食塩水を腹腔内注射した。薬物または生理食塩水は、初日に１回投与し、その後、続く２日間に１日２回投与した。

【0039】

初期薬物投与後７日目に、核磁気共鳴画像（ＭＲＩ）を利用して、血液脳関門（ＢＢＢ）の破綻を検出した。造影剤（Ｍａｇｎｅｖｉｓｔ＝ＧｄＤＴＰＡ）の注射後に、造影後Ｔ１強調ＭＲＩ画像に記録されたコントラストの増強は、血液脳関門の破綻を示している。Ｔ１強化像の極度に高い強度は、ベースラインで注射されたガドリニウム系造影剤の漏出によるものである。

【0040】

磁気共鳴画像を、０．４ｍｍｏｌＧｄ／ｋｇ Ｍａｇｎｅｖｉｓｔの注射の前および後に得て、血液脳関門の破綻領域を実証した。ＭＲＩパラメータおよび画像スケールの倍率は、Ｔ１強化像全てにおいて一定に維持した。画像を、視覚的および関心部分（ＲＯＩ）測定の両方で評価した。ＲＯＩ測定を、その時点（Ｔ１強化像における造影材料の注射前および後）の脳で得た。ＲＯＩシグナル強度の差を、造影材料を注射する前の値に関して標準化して、図１１に示された通り％変化として報告した。

【0041】

ＮＡＣは、血液脳関門透過性を増加させないことで知られるため、これらの結果は予期されないものであり、ＨＰＮ−０７が血液脳関門を効果的に増加させて、それにより任意の共投与化合物の生物学的利用率を増加させることを初めて示した。つまり本発明は、２，４−ジスルホニルＰＢＮを、血液脳関門の透過性を上昇させるのに十分な量で患者に投与すること、および脳の状態を処置または診断するのに用いられる第二の化合物または物質を投与すること、を含む、血液−脳透過性を上昇させる方法にも関する。

【0042】

実施例５
この実施例の目的は、騒音によるＴＢＩを生じる海馬および嗅内皮質への損傷を処置する際の、２，４−ジスルホニルＰＢＮの長期影響を決定することである。

【0043】

この実施例において、３〜５歳チンチラを、３群に自由に分けた（各群の各時点にチンチラ６匹）。騒音暴露群および騒音＋処置群のチンチラに、４ｋＨｚを中心とする１０５ｄＢ ＳＰＬオクターブ帯域騒音に６時間暴露した。騒音＋処置群のチンチラは、騒音暴露４時間後にＨＰＮ−０７処置（３００ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）を開始し、その後、続く２日間に１日２回処置を受けた。正常対照群および騒音暴露のみの群のチンチラは、担体溶液を受けた（腹腔内）。騒音暴露後２１日目および６ヶ月目にチンチラを安楽死させて、４％のＰＢＳ中パラホルムアルデヒドで灌流した。脳を摘出して、固定剤中に１週間、後固定した。脳を３０μｍで低温薄切した。ヤギ抗ダブルコルチン（１：１００）を用いて、神経前駆細胞を標識した。海馬および嗅内皮質のＣＡ１領域から、光学顕微鏡により像を撮影した。ダブルコルチン染色は、騒音暴露後の神経細胞傷害および神経細胞死の後の脳の神経形成を表す。

【0044】

図１２は、騒音に暴露されなかった対照の対象（図１２Ａ）、騒音暴露６ヶ月後の処置なし（図１２Ｂ）およびＨＰＮ−０７処置ありの対象（図１２Ｃ）の、海馬のダブルコルチン免疫染色区分を示す。そこに示される通り、ダブルコルチン染色の密度は、騒音に暴露された対象では、ＨＰＮ−０７処置対象に比較して顕著に増加しており、ＨＰＮ−０７処置対象では対照の対象と同等のダブルコルチン密度を示している。

【0045】

類似の結果が、図１３に示された通り嗅内皮質において得られた。図１３Ａに、対照条件下（外傷性騒音に暴露されていない）の対象において非常に低レベルのダブルコルチン染色を示す。図１３Ｂおよび１３Ｄに、外傷性騒音事象への暴露後、それぞれ２１日目および６ヶ月目のダブルコルチン染色増加を実証している。図１３Ｃおよび１３Ｅは、ＨＰＮ−０７処置が、両方の時点でダブルコルチン染色レベルを低減することを実証している。

【0046】

総括すると、これらの結果から、騒音暴露が、外傷性事象の後、長期間持続する海馬および嗅内皮質の幹細胞／修復活性上昇をもたらすことが示唆される。更に、ＨＰＮ−０７で処置された対象の修復活性低下は、この化合物が外傷性騒音事象により誘発される組織損傷を低減するのに効果的であることを示唆している。海馬は、短期記憶から長期記憶への情報の固定、および空間的ナビゲーションにおいて重要な役割を担い、嗅内皮質は、記憶およびナビゲーションのためのネットワーク拠点として機能し、海馬と新皮質の間の主要インターフェースとしても作用する。つまりこれらの結果から、ＨＰＮ−０７が、騒音による長期記憶（ＬＴＭ）の欠損を処置するのに効果的となり得ることも示唆される。

【0047】

実施例により、騒音および爆風による脳損傷を処置する際の、単独およびＮＡＣと組み合わせた２，４−ジスルホニルＰＢＮの有効性が実証される。詳細には２，４−ジスルホニルＰＢＮの使用が、外傷性脳損傷による二次的状態に関連する細胞および分子的影響を低減することが示された。最後に、２，４−ジスルホニルＰＢＮは、意外にも、血液脳関門の透過性を上昇させて、該化合物の生物学的利用率増加を導く。

【0048】

本明細書において用いられた「薬学的有効量」は、細胞の傷害もしくは機能、組織の傷害もしくは機能、または非限定的に騒音による耳鳴をはじめとする外傷性脳損傷による他の機能的もしくは身体的症状に対して治療関連の影響を有する医薬化合物または組成物の量である。治療関連の影響は、騒音および爆風による脳損傷をはじめとし、外傷性脳損傷の身体的もしくは機能的症状の若干の改善、または外傷性脳損傷に関連する細胞的、生理学的、解剖学的または生化学的マーカの変化に関係する。２，４−ジスルホニルＰＢＮとＮＡＣとの組み合せ、または４−ＯＨＰＢＮとＮＡＣとＡＬＣＡＲとの組み合せを含む組成物において、薬学的有効量は、組み合わせとしての投与量が薬学的に有効であることを条件とするが、各々の化合物にとって薬学的有効である投与量であっても、各々の化合物にとっては臨床量未満である（即ち、それぞれ個別で薬学的有効量に満たない）投与量であっても、またはそれらの組み合わせであってもよい。

【0049】

一実施形態において、外傷性脳損傷または耳鳴を処置する方法は、２，４−ジスルホニルＰＢＮおよびＮＡＣを含む組成物の薬学的有効量を生物体に投与することを含む。一態様において、該組成物は、２，４−ジスルホニルＰＢＮ １部あたりにＮＡＣを少なくとも２部、即ち、ＮＡＣを２，４−ジスルホニルＰＢＮに対して２：１〜２．５：１の比で含む。別の態様において、該組成物は、等しい部の２，４−ジスルホニルＰＢＮおよびＮＡＣを含む。更に、ＮＡＣと２，４−ジスルホニルＰＢＮとの組成物中で用いられるＮＡＣの濃度は、ＮＡＣ単独で患者を処置する場合よりも実質的に低くてもよい。該組成物は、２，４−ジスルホニルＰＢＮ約７０ｍｇ〜約１２００ｍｇ、およびＮＡＣ約７００ｍｇ〜約４０００ｍｇを含んでいてもよい。更に、２，４−ジスルホニルＰＢＮを含む組成物は、約１ｍｇ／ｋｇ体重〜約４００ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくはおよそ３００ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与されてもよい。ＮＡＣを含む組成物は、約５ｍｇ／ｋｇ体重〜約３００ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与されてもよい。これらの範囲は、本明細書に含まれる実施例に基づいており、他の生物体の薬学的有効量の範囲を限定するものではない。

【0050】

別の実施形態において、外傷性脳損傷または耳鳴を処置する方法は、４−ＯＨＰＢＮ＋ＮＡＣ＋ＡＬＣＡＲを含む組成物の薬学的有効量を、生物体に投与することを含む。そのような組成物は、ＡＬＣＡＲとＮＡＣと４−ＯＨＰＢＮを組み合わせて用いる場合において、ＮＡＣについては約５ｍｇ／ｋｇ〜約３００ｍｇ／ｋｇ、４−ＯＨＰＢＮについては約５ｍｇ／ｋｇ〜約１５０ｍｇ／ｋｇ、およびＡＬＣＡＲについては約５ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇの用量範囲を有し得る。

【0051】

当業者は、本開示を読むことにより、同様に満足な結果ももたらす関連化合物をおそらく認識するであろう。更に、前述の実施例は、騒音暴露および爆風暴露の１〜４時間後に検査対象を処置したが、より短期間内の投与による処置も同様に効果的であるはずであり、おそらく好ましいであろう。加えて、騒音暴露後、爆風暴露後、ストレス後、または他の外傷性脳損傷の原因から４８時間を超えて投与される処置も、効果的となる場合がある。従って、前述の開示は、単に本発明の例示とみなされ、本発明の真の範囲は、特許請求の範囲により定義される。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図1G】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図3F】

【図3G】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図8E】

【図8F】

【図8G】

【図8H】

【図8I】

【図8J】

【図8K】

【図8L】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図10E】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図13D】

【図13E】