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特許6104252フコシルトランスフェラーゼ活性が欠損したニコチアナ・ベンサミアナ植物

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6104252

(24)【登録日】2017年3月10日

(45)【発行日】2017年3月29日

(54)【発明の名称】フコシルトランスフェラーゼ活性が欠損したニコチアナ・ベンサミアナ植物

(51)【国際特許分類】

C12N 15/09 20060101AFI20170316BHJP

A01H 5/00 20060101ALI20170316BHJP

C12P 21/02 20060101ALI20170316BHJP

C12N 15/113 20100101ALI20170316BHJP

C12N 5/10 20060101ALI20170316BHJP

A01H 5/10 20060101ALI20170316BHJP

【ＦＩ】

C12N15/00 AZNA

A01H5/00 A

C12P21/02 Z

C12N15/00 G

C12N5/10

A01H5/10

【請求項の数】15

【全頁数】57

(21)【出願番号】特願2014-533791(P2014-533791)

(86)(22)【出願日】2012年10月4日

(65)【公表番号】特表2014-531903(P2014-531903A)

(43)【公表日】2014年12月4日

(86)【国際出願番号】EP2012004160

(87)【国際公開番号】WO2013050155

(87)【国際公開日】20130411

【審査請求日】2015年9月3日

(31)【優先権主張番号】61/542,965

(32)【優先日】2011年10月4日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】11075218.5

(32)【優先日】2011年10月6日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】514084761

【氏名又は名称】アイコン・ジェネティクス・ゲーエムベーハー

(74)【代理人】

【識別番号】100140109

【弁理士】

【氏名又は名称】小野新次郎

(74)【代理人】

【識別番号】100075270

【弁理士】

【氏名又は名称】小林泰

(74)【代理人】

【識別番号】100101373

【弁理士】

【氏名又は名称】竹内茂雄

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本修

(74)【代理人】

【識別番号】100107386

【弁理士】

【氏名又は名称】泉谷玲子

(72)【発明者】

【氏名】ウェテリングス，クーン

(72)【発明者】

【氏名】ファン・エルディク，ゲルベン

【審査官】中村勇介

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２００８／１４１８０６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１０／１４５８４６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２００９／０５６１５５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Jae Sook Kang, et al.，PNAS，２００８年４月１５日，vol.105, no. 15，pp. 5933-5938

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ１５／００−１５／９０

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

少なくとも５個のノックアウトアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子を含む、ニコチアナ・ベンサミアナ植物、またはその細胞、部位、種子もしくは子孫。

【請求項2】

ノックアウトアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子の１個以上が、以下：
ａ．ＳＥＱＩＤＮＯ：３に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むアミノ酸配列をコードする核酸分子；
ｂ．ＳＥＱＩＤＮＯ：６に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むアミノ酸配列をコードする核酸分子；
ｃ．ＳＥＱＩＤＮＯ：９に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むアミノ酸配列をコードする核酸分子；
ｄ．ＳＥＱＩＤＮＯ：１２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むアミノ酸配列をコードする核酸分子；
ｅ．ＳＥＱＩＤＮＯ：１４に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むアミノ酸配列をコードする核酸分子；
からなる群から選択される天然のアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子の変異版である、請求項１に記載の植物、またはその細胞、部位、種子もしくは子孫。

【請求項3】

ノックアウトアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子の１個以上が、以下：
ａ．ＳＥＱＩＤＮＯ：１に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む核酸分子；
ｂ．ＳＥＱＩＤＮＯ：４に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む核酸分子；
ｃ．ＳＥＱＩＤＮＯ：７に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む核酸分子；
ｄ．ＳＥＱＩＤＮＯ：１０に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む核酸分子；
ｅ．ＳＥＱＩＤＮＯ：１３に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む核酸分子；
からなる群から選択される天然のアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子の変異版である、請求項２に記載の植物、またはその細胞、部位、種子もしくは子孫。

【請求項4】

ノックアウトアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子が、以下：
ａ．ＳＥＱＩＤＮＯ：１の３５５位におけるＧのＡへの置換を含有するＦｕｃＴＡ遺伝子；
ｂ．ＳＥＱＩＤＮＯ：４の３０５４位におけるＧのＡへの置換を含有するＦｕｃＴＢ遺伝子；
ｃ．ＳＥＱＩＤＮＯ：７の２８０７位におけるＧのＡへの置換を含有するＦｕｃＴＣ遺伝子；
ｄ．ＳＥＱＩＤＮＯ：１０の２２４位におけるＧのＡへの置換を含有するＦｕｃＴＤ遺伝子；
ｅ．ＳＥＱＩＤＮＯ：１３の９１０位におけるＧのＡへの置換を含有するＦｕｃＴＥ遺伝子；
からなる群から選択される、請求項１または２に記載の植物、またはその細胞、部位、種子もしくは子孫。

【請求項5】

ノックアウトアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子に関してホモ接合型である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の植物または植物細胞。

【請求項6】

さらに少なくとも１個のノックアウトベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼ遺伝子を含み、前記のノックアウトベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼ遺伝子が該ベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼ遺伝子中に対応する野生型ＤＮＡ領域と比較して１個以上の挿入された、欠失した、または置換されたヌクレオチドからなる変異したＤＮＡ領域を含み、かつここで前記のノックアウトベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼ遺伝子が機能するベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼタンパク質をコードしていない、請求項１〜５のいずれか１項に記載の植物、またはその細胞、部位、種子もしくは子孫。

【請求項7】

さらに以下の作動可能に連結されたＤＮＡ断片：
ａ．植物で発現可能なプロモーター；
ｂ．転写された際に少なくとも１個のアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子に対して阻害性のＲＮＡ分子を生じるＤＮＡ領域；
ｃ．植物において機能する転写終結およびポリアデニル化シグナルを含むＤＮＡ領域；
を含む少なくとも１個のキメラ遺伝子を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の植物、またはその細胞、部位、種子もしくは子孫。

【請求項8】

さらに、前記のＤＮＡ領域が少なくとも以下：
ａ．ＳＥＱＩＤＮＯ：２、ＳＥＱＩＤＮＯ：５、ＳＥＱＩＤＮＯ：８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３、またはそれらの相補物から選択される２１ヌクレオチドの内の少なくとも１８ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む第１センスＤＮＡ領域から転写されるＲＮＡ領域；
ｂ．前記の第１センスＤＮＡ領域の相補物に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する少なくとも１８個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む第２アンチセンスＤＮＡ領域から転写されるＲＮＡ領域
の間で二本鎖ＲＮＡ領域を形成することができるＲＮＡ分子を生じることを特徴とする、請求項７に記載の植物、またはその細胞、部位、種子もしくは子孫。

【請求項9】

前記のＤＮＡ領域がＳＥＱＩＤＮＯ：１９の配列を含む、請求項８に記載の植物、またはその細胞、部位、種子もしくは子孫。

【請求項10】

さらに前記の植物または植物細胞に対して外来の異種糖タンパク質を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の植物、またはその細胞、部位、種子もしくは子孫。

【請求項11】

前記の糖タンパク質が、以下の作動可能に連結された核酸分子：
ａ．植物で発現可能なプロモーター；
ｂ．前記の異種糖タンパク質をコードするＤＮＡ領域；
ｃ．転写終結およびポリアデニル化に関わるＤＮＡ領域；
を含むキメラ遺伝子から発現される、請求項１０に記載の植物、またはその細胞、部位、種子もしくは子孫。

【請求項12】

以下：
ａ．ＳＥＱＩＤＮＯ：１の３５５位におけるＧのＡへの置換を含有するＦｕｃＴＡ遺伝子；
ｂ．ＳＥＱＩＤＮＯ：４の３０５４位におけるＧのＡへの置換を含有するＦｕｃＴＢ遺伝子；
ｃ．ＳＥＱＩＤＮＯ：７の２８０７位におけるＧのＡへの置換を含有するＦｕｃＴＣ遺伝子；
ｄ．ＳＥＱＩＤＮＯ：１０の２２４位におけるＧのＡへの置換を含有するＦｕｃＴＤ遺伝子；
ｅ．ＳＥＱＩＤＮＯ：１３の９１０位におけるＧのＡへの置換を含有するＦｕｃＴＥ遺伝子；
からなる群から選択される、アルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子のノックアウトアレル。

【請求項13】

ニコチアナ・ベンサミアナにおいて低減したレベルのコアのアルファ（１，３）−フコース残基を有する糖タンパク質を産生するための方法であって、以下の工程：
ａ．少なくとも５個のノックアウトアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子を含む植物または植物細胞を提供し；そして
ｂ．前記の細胞を培養し、前記の細胞から糖タンパク質を単離する；
を含む、前記方法。

【請求項14】

ニコチアナ・ベンサミアナにおいて低減したレベルのコアのアルファ（１，３）−フコース残基および低減したレベルのベータ（１，２）−キシロース残基を有する糖タンパク質を産生するための方法であって、以下の工程：
ａ．植物細胞を提供し、前記の植物細胞は
ｉ．少なくとも５個のノックアウトアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子を含み；そして
ｉｉ．低減したレベルのベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼ活性を有することを特徴とし；そして
ｂ．前記の細胞を培養し、前記の細胞から糖タンパク質を単離する；
を含む、前記方法。

【請求項15】

前記植物または植物細胞、並びに、そのノックアウトアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子が、請求項２−１１のいずれか１項に規定されたものである、請求項１３又は１４に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、分子農業、すなわち植物および植物細胞の、生物製剤（ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、特に薬学的に興味深いポリペプチドおよびタンパク質、例えば結果として免疫原性のタンパク質に結合したＮ−グリカンの対応する未改変の植物よりも低いレベル、特にタンパク質に結合したＮ−グリカン上のベータ（１，２）−キシロース残基およびコアのアルファ（１，３）−フコース残基のより低いレベルをもたらす変更されたＮ−グリコシル化パターンを有する療法用タンパク質が含まれる、ペプチドおよびタンパク質を産生するための生物反応器としての使用の分野に関する。本発明はアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼおよびベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼ活性が欠損しているニコチアナ属の植物に関し、その植物は異種糖タンパク質を産生するための宿主植物または宿主細胞として適用することができる。

【背景技術】

【0002】

グリコシル化は、結果として糖タンパク質をもたらすオリゴ糖鎖のタンパク質への共有結合である。多くの糖タンパク質において、そのオリゴ糖鎖はアスパラギン（Ａｓｎ）残基のアミド窒素に結合し、Ｎ−グリコシル化がもたらされる。グリコシル化は天然および生物製剤タンパク質において見出される最も広く行き渡った翻訳後修飾である。ヒトのタンパク質の半分より多くがグリコシル化されており、それらの機能はしばしば特定の糖型（グリカン）に依存し、それはそれらの血漿半減期、組織標的化またはそれらの生物学的活性にさえ影響を及ぼし得ると推定されている。同様に、認可された生物製剤の３分の１より多くが糖タンパク質であり、それらの機能および効率の両方がそれらのＮ−グリカンの存在および組成により影響を受ける。

【0003】

タバコ植物ニコチアナ・ベンサミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）のような葉状作物は、植物は一般に、動物性病原体、例えばプリオン類およびウイルスを有しないこと、安全かつ生物学的に活性な価値ある組み換えタンパク質の低費用かつ大規模な生産、スケールアップの場合、効率的な収穫および貯蔵の可能性が含まれるいくつかの利点を有すると考えられているため、療法用タンパク質の生産のための魅力的な系である。しかし、植物由来のＮ結合型グリカンは哺乳類細胞のＮ結合型グリカンとは異なる。植物において、ベータ（１，２）−キシロースおよびアルファ（１，３）−フコース残基がグリカンのコアであるＭａｎ３ＧｌｕｃＮＡｃ２−Ａｓｎに連結されていることが示されており、一方でそれらは哺乳類のグリカンでは検出されず、そこでは代わりにシアル酸残基および末端のベータ（１，４）−ガラクトシル構造が存在する。植物により付加される独特のＮ−グリカンはそのタンパク質の免疫原性および機能活性の両方に影響を与える可能性があり、結果としてそれはタンパク質生産プラットフォームとして用いられるべき植物に関する制限の代表的なものである可能性がある。実際、ベータ（１，２）−キシロース残基およびアルファ（１，３）−フコースの哺乳類における免疫原性が記述されている(Bardor et al., 2003, Glycobiology 13: 427)。

【0004】

キシロースのＵＤＰ−キシロースからタンパク質に結合したＮ−グリカンのコアのβ結合マンノースへの転移を触媒する酵素は、ベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼ（“ＸｙｌＴ”，ＥＣ２．４．２．３８）である。そのベータ−１，２−キシロシルトランスフェラーゼは植物および一部の無脊椎動物種に特有の酵素であり、ヒトまたは他の脊椎動物には存在しない。国際公開第２００７１０７２９６号は、ニコチアナ属、例えばニコチアナ・ベンサミアナからのベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼの同定およびクローニングを記述している。

【0005】

フコースのＧＤＰ−フコースからタンパク質に結合したＮ−グリカンのコアのβ結合Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）への転移を触媒する酵素はアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ（“ＦｕｃＴ”，ＥＣ２．４．１．２１４）である。国際公開第２００９０５６１５５号は、ニコチアナ・ベンサミアナからのアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼのｃＤＮＡ配列を記述している。

【0006】

植物により産生される糖タンパク質上のアルファ（１，３）−フコシルおよびベータ（１，２）−キシロシル構造を回避するために、様々な戦略が適用されてきた。国際公開第２００８１４１８０６号は、アラビドプシス・サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）における２個のアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子における、および１個のベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼ遺伝子におけるノックアウトを記述している。国際公開第２００９０５６１５５号は、異種糖タンパク質上のベータ−１，２−キシロシル構造の形成が欠損しており、アルファ−１，３−フコシル構造も欠いているニコチアナ・ベンサミアナ植物の産生のためのＲＮＡ干渉戦略を記述している。Yin et al. (2011, Protein Cell 2:41)は、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）における内因性キシロシルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼの発現のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）戦略を用いた下方制御を報告している。彼らは、その糖鎖工学的に操作された（ｇｌｙｃｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）系統においてキシロシル化された、およびコアがフコシル化されたＮ−グリカンが著しく（完全にではないが）低減していることを見出した。国際公開第２０１０１４５８４６号は、ニコチアナ・ベンサミアナにおけるその２個のベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼ遺伝子のノックアウトを記述している。４種類のベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼヌルアレルのホモ接合型の組み合わせは、ニコチアナ・ベンサミアナにおける完全なベータ−１，２−キシロシルトランスフェラーゼ活性の消失に十分であることが分かった。

【0007】

ニコチアナ・ベンサミアナのアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼのノックアウトアレルは今までに記述されていない。

【0008】

本発明は、ニコチアナ・ベンサミアナにおける糖タンパク質上のＮ−グリカン上のコアのアルファ（１，３）−フコース残基のレベルを低減するための方法および手段を提供し、それは本明細書において提供される以下の記述、実施例、図面および特許請求の範囲から明らかになるであろう。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】国際公開第２００７１０７２９６号

【特許文献2】国際公開第２００９０５６１５５号

【特許文献3】国際公開第２００８１４１８０６号

【特許文献4】国際公開第２０１０１４５８４６号

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】Bardor et al., 2003, Glycobiology 13: 427

【非特許文献2】Yin et al., 2011, Protein Cell 2:41

【発明の概要】

【0011】

第１の態様において、本発明はニコチアナ・ベンサミアナにおいて低減したレベルのコアのアルファ（１，３）−フコース残基を有する糖タンパク質を産生するための方法を提供し、前記の方法は、少なくとも３個のノックアウトアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子を含む植物または植物細胞を提供し、そして前記の細胞を培養し、前記の細胞から糖タンパク質を単離する工程を含む。別の態様において、前記の方法はさらに、ベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼ活性のレベルの低減を含む。さらに別の態様において、前記のベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼ活性のレベルの低減は、内在性のベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼ遺伝子のノックアウト変異の結果である。

【0012】

本発明の別の態様において、ニコチアナ・ベンサミアナにおいて低減したレベルのコアのアルファ（１，３）−フコース残基を有する糖タンパク質を産生するための方法が提供され、前記の方法は、少なくとも５個のノックアウトアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子を含む植物または植物細胞を提供し、そして前記の細胞を培養し、前記の細胞から糖タンパク質を単離する工程を含む。さらなる態様において、前記のノックアウトアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子はそのゲノム中にホモ接合型の状態で存在する。

【0013】

さらに別の態様において、本発明に従う方法は、さらに少なくとも５個の内在性のアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の発現が転写サイレンシングまたは転写後サイレンシングにより低減されることを特徴とする。さらなる態様において、本発明に従う植物または植物細胞は、さらに以下の作動可能に連結されたＤＮＡ断片を含む少なくとも１個のキメラ遺伝子を含む：植物で発現可能なプロモーター、転写された際に少なくとも１個のアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子に対して阻害性のＲＮＡ分子を生じるＤＮＡ領域、ならびに植物において機能する転写終結およびポリアデニル化シグナルを含むＤＮＡ領域。さらに別の態様において、前記のＤＮＡ領域はＳＥＱＩＤＮＯ．１９の配列を含む。

【0014】

本発明の方法のさらに別の態様において、前記の糖タンパク質は異種タンパク質である。さらに別の態様において、前記の異種糖タンパク質は以下の作動可能に連結された核酸分子を含むキメラ遺伝子から発現される：植物で発現可能なプロモーター、前記の異種糖タンパク質をコードするＤＮＡ領域、ならびに転写終結およびポリアデニル化に関わるＤＮＡ領域。さらに別の態様において、本発明に従う方法は、さらに前記の異種糖タンパク質の精製の工程を含む。

【0015】

本発明の別の態様において、本発明に従う方法により得られる糖タンパク質が提供される。本発明のさらに別の態様において、本発明に従う方法により得られる低減したレベルのコアのアルファ（１，３）−フコース残基を有する糖タンパク質が提供される。さらに別の態様において、本発明に従う方法により得られる低減したレベルのコアのアルファ（１，３）−フコースおよびベータ（１，２）−キシロース残基を有する糖タンパク質が提供される。

【0016】

本発明の別の態様は、少なくとも３個のノックアウトアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子を含むニコチアナ・ベンサミアナ植物、またはその細胞、部位、種子もしくは子孫を提供する。本発明のさらに別の態様は、少なくとも５個のノックアウトアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子を含むニコチアナ・ベンサミアナ植物、またはその細胞、部位、種子もしくは子孫を提供する。さらに別の態様において、前記の植物または植物細胞はそのノックアウトアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子に関してホモ接合型である。別の態様において、前記の植物または植物細胞はさらに少なくとも１個のノックアウトベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼ遺伝子を含み、ここで前記のノックアウトベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼ遺伝子はそのベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼ遺伝子中に対応する野生型ＤＮＡ領域と比較して１個以上の挿入された、欠失した、または置換されたヌクレオチドからなる変異したＤＮＡ領域を含み、かつここで前記のノックアウトベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼ遺伝子は機能するベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼタンパク質をコードしていない。

【0017】

【0018】

さらなる態様において、前記の植物または植物細胞は、さらに前記の植物または植物細胞に対して外来性の糖タンパク質を含む。さらに別の態様において、前記の糖タンパク質は以下の作動可能に連結された核酸分子を含むキメラ遺伝子から発現される：植物で発現可能なプロモーター、前記の異種糖タンパク質をコードするＤＮＡ領域、ならびに転写終結およびポリアデニル化に関わるＤＮＡ領域。

【0019】

本発明の別の態様において、アルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子のノックアウトアレルが提供される。

【0020】

さらに別の態様は、低減したレベルのコアのアルファ（１，３）−フコース残基を有する糖タンパク質を得るための本発明に従う方法の使用を提供する。さらなる態様は、低減したレベルのコアのアルファ（１，３）−フコース残基を有し、かつ低減したレベルのベータ（１，２）−キシロース残基を有する糖タンパク質を得るための本発明に従う方法の使用を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】図１：Ｎ．ベンサミアナからのＦｕｃＴＡのｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせたＮ．ベンサミアナのゲノムＤＮＡのサザンブロットハイブリダイゼーションの結果。レーン１＝ラムダマーカー、レーン２〜７：ＥｃｏＲＶ（レーン２）、ＨｉｎｄＩＩＩ（レーン３）、ＥｃｏＲＩ（レーン４）、ＮｓｉＩ（レーン５）、ＡｓｅＩ（レーン６）、ＰｓｔＩ（レーン７）で消化したＮ．ベンサミアナのゲノムＤＮＡ；レーン８＝ＥｃｏＲＶおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化したニコチアナ・タバカムｃｖ．ＳＲ１。

【図2】図２：ＢＡＣクローン（レーン１〜１５）のハイブリダイゼーションパターンをＮ．ベンサミアナのゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーションパターン（ｃ）と比較したサザンブロットの例。

【図3】図３：Ｎ．ベンサミアナにおけるＭ２種子の産生に関する最適なＥＭＳ用量の決定。種子を異なる濃度のＥＭＳで処理した。Ａ：播種の６日後（黒い棒）および１２日後（白い棒）の発芽率。Ｂ：種子の生存。Ｃ：植物の稔性。

【図4】図４：ホモ接合型の７重ノックアウト植物を得るために用いられた交配スキーム。ｘ１４：変異体アレルＸＹＬ００１（国際公開第２０１０１４５８４６号において記述されているようなＸｙｌＴｇ１４−１）、ｘ１９：ＸＹＬ００２（国際公開第２０１０１４５８４６号において記述されているようなＸｙｌＴｇ１９−１）、ａ：ＦｕｃＴ００４、ｂ：ＦｕｃＴ００６、ｃ：ＦｕｃＴ００７、ｄ：ＦｕｃＴ００９、ｅ：ＦｕｃＴ００３。“ｘ１４／ｘ１４ｘ１９／ｘ１９”は、以前に国際公開第２０１０１４５８４６号において記述された二重ノック（ｄｏｕｂｌｅｋｎｏｃｋ）ＸｙｌＴ変異体を指す。

【図5】図５：Ｎ．ベンサミアナＦｕｃＴ遺伝子および変異体遺伝子の機能性に関する相補性アッセイの設定および試験。ＷＴ：Ａ．サリアナ野生型；３ＫＯ：Ａ．サリアナ三重変異体（ＸｙｌＴおよびＦｕｃＴＡおよびＦｕｃＴＢに関するＴ−ＤＮＡ挿入ノックアウト変異体）；Ａｔ３ＫＯ＋ＮｂＦｕｃＴＡ：Ｎ．ベンサミアナＦｕｃＴＡｃＤＮＡを有するＴ−ＤＮＡで形質転換された三重変異体；Ａｔ３ＫＯ＋ｍｕｔＦｕｃＴＡ：エキソン１中にＳＥＱＩＤＮｏ．１の２１７位において停止コドンを作り出す点変異を有するＮ．ベンサミアナＦｕｃＴＡｃＤＮＡを有するＴ−ＤＮＡで形質転換された三重変異体。

【図6】図６：異なるＦｕｃＴ遺伝子がノックアウトされているＮ．ベンサミアナ植物からのタンパク質試料のフコシル化レベルの比較。異なるＦｕｃＴ遺伝子がノックアウトされている植物からの葉のタンパク質の試料のウェスタンブロット分析。抗α１，３フコース抗体（１／５００希釈）で調べ；化学発光に関して３分間の曝露。ＷＴ：野生型植物；Ｍ：タンパク質マーカー。その遺伝子のノックアウト版はその表において小文字で；野生型版は大文字で示されている。

【図7】図７：４個または５個のＦｕｃＴ遺伝子に関してヌル変異を有するＮ．ベンサミアナ植物からの葉のタンパク質上の相対グリカンレベルの比較。総タンパク質を異なるＦｕｃＴ遺伝子が変異している植物の葉から単離した。グリカンを単離し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより分析した。相対レベルをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルから決定された総ピーク面積の百分率として表す。白い棒：野生型；黒い棒：４ＫＯ：ＦｕｃＴＡ（ＦｕｃＴ００４）、−Ｂ（ＦｕｃＴ００６）、−Ｃ（ＦｕｃＴ００７）、および−Ｄ（ＦｕｃＴ００９）がノックアウトされている（３つの系統の平均）；灰色の棒：５ＫＯ：全てのＦｕｃＴ遺伝子がノックアウトされている（ＦｕｃＴ００４、−００６、−００７、−００９、および−００３）（３つの系統の平均）。

【図8】図８：全てのＸｙｌＴおよび／またはＦｕｃＴ遺伝子がノックアウトされているＮ．ベンサミアナ植物（国際公開第２０１０１４５８４６号において記述されているように、ＦｕｃＴ００４、−００６、−００７、−００９、および−００３、ならびにＸｙｌＴｇ１４−１およびＸｙｌＴｇ１９−１）からの葉のタンパク質における相対グリカンレベルの比較。全てのＸｙｌＴおよび／またはＦｕｃＴ遺伝子が変異している植物の葉から総タンパク質を単離した。グリカンを単離し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより分析した。相対レベルをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルから決定された総ピーク面積の百分率として表す。白い棒：野生型；濃い灰色の棒：５ＫＯ：全てのＦｕｃＴ遺伝子がノックアウトされている（３つの系統の平均）；黒い棒：７ＫＯ：全てのＦｕｃＴおよびＸｙｌＴ遺伝子がノックアウトされている（３つの系統の平均）；薄い灰色の棒：ＲＮＡｉ：ＸｙｌＴおよびＦｕｃＴＲＮＡｉ遺伝子を発現する植物(Strasser et al. 2008, Plant Biotech J 6:392)。

【図9】図９：ｍａｇｎＩＣＯＮ（登録商標）を用いて完全ノックアウトＮ．ベンサミアナ植物中で発現させたＩｇＧ１上のグリカンのＬＣ−ＭＳ分析。完全ノックアウトＮ．ベンサミアナ植物において、全てのＸｙｌＴおよび／またはＦｕｃＴ遺伝子がノックアウトされている（国際公開第２０１０１４５８４６号において記述されているように、ＦｕｃＴ００４、−００６、−００７、−００９、および−００３、ならびにＸｙｌＴｇ１４−１およびＸｙｌＴｇ１９−１）。ＩｇＧ１をこれらの完全ノックアウト植物中でｍａｇｎＩＣＯＮ（登録商標）を用いて発現させた。ＩｇＧ１を浸潤の９日後に葉の抽出物からプロテインＧを用いて単離した。精製された抗体の重鎖を還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥから対応するバンドを切り出すことにより単離した。このバンド中の重鎖のタンパク質を、Kolarich et al. (2006) Proteomics 6:3369により記述された通りのＬＣ−ＭＳによるグルカン分析のために用いた。上のパネルは、グリコシル化されていないペプチドの存在を図説するためのより広い質量スペクトルを示す。ペプチド１（ＥＥＱＹＮＳＴＹ）およびペプチド２（ＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲ）は同じトリプシン消化からの２つの変種である。それらは長さが異なり、それはＮ−グリカンの存在によるトリプシンの立体障害により引き起こされる。結果として、全てのペプチド−グリカンはこのＬＣ−ＭＳスペクトルにおいて２個のピークをもたらす；下のパネルにおけるグリコペプチド２に関する２個のピークを矢印で示す。

【図10】図１０：Ｎ−グリカンの構造（Ｎ−グリカンの最新の命名法に関してhttp://www.proglycan.comも参照）。^＊は示した糖鎖および結果として得られる糖タンパク質のペプチド部分のアスパラギンの間の結合を示す。

【図11】図１１：６または７個の遺伝子がノックアウトされているＮ．ベンサミアナ植物からのタンパク質試料のフコシル化レベルの比較。ＦｕｃＴＲＮＡｉ遺伝子を含有する植物を、この遺伝子を含有しない植物と比較した。葉のタンパク質の試料のウェスタンブロット分析。抗α１，３フコース抗体（１／５００希釈）で調べ；化学発光に関して１時間の曝露。ＷＴ：野生型植物；Ｍ：タンパク質マーカー。その遺伝子のノックアウト版はその表において小文字で；野生型版は大文字で示されている。

【図12】図１２：ＷＴ、４、５、７重ＫＯ、ＲＮＡｉおよび７ＫＯ／ＦｕｃＴＲＮＡｉ植物の内因性タンパク質上に存在するフコシル化されたＮ−グリカン、キシロシル化されたＮ−グリカン、それぞれの定量的概要。総タンパク質を植物の葉から単離し、グリカンを単離し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより分析した。グリカンのレベルを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルから決定された全ての異なるフコシル化、キシロシル化されたＮ−グリカンそれぞれのピークの合計として表した。ＷＴ：野生型（２つの系統の平均）。ＲＮＡｉＸｙｌＴおよびＦｕｃＴＲＮＡｉ遺伝子を発現する植物（Strasser et al. 2008, Plant Biotech J 6:392）（２つの系統の平均）。４ＫＯ：ＦｕｃＴＥを除く全てのＦｕｃＴ遺伝子がノックアウトされている（６つの系統の平均）。５ＫＯ：全てのＦｕｃＴ遺伝子がノックアウトされている（３つの系統の平均）。ＨＯＭ７ＫＯ：全てのＦｕｃＴおよびＸｙｌＴ遺伝子がノックアウトされている（３つの系統の平均）。ＨＥＴ７ＫＯ＋ＲＮＡｉ：ＸｙｌＴおよびＦｕｃＴＡ遺伝子がノックアウトされ、他のＦｕｃＴ遺伝子がヘテロ接合型でノックアウトされており、ＦｕｃＴＲＮＡｉ遺伝子と組み合わせられている（４つの系統の平均）。ＨＯＭ７ＫＯ＋ＦｕｃＴＲＮＡｉ：７個全部のノックアウト遺伝子に関してホモ接合型であり、ＦｕｃＴＲＮＡｉ遺伝子を含有する植物（４つの系統の平均）。

【発明を実施するための形態】

【0022】

本発明は、ニコチアナ・ベンサミアナにおけるアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼをコードする５個の遺伝子の同定およびこれらの遺伝子のより多くのノックアウトは前記の植物において産生されるタンパク質上のコアのアルファ（１，３）−フコース残基のレベルを進行的に低減することに基づく。

【0023】

【0024】

“低減したレベル（Ｒｅｄｕｃｅｄｌｅｖｅｌｓ）のコアのアルファ（１，３）−フコース残基”または“低減したレベル（ａｒｅｄｕｃｅｄｌｅｖｅｌ）のコアのアルファ（１，３）−フコース残基”は、本明細書で用いられる際、対照の植物において得られるようなレベルに関するコアのアルファ（１，３）−フコース残基のレベルの低減であることを意味する。その“対照の植物”は一般に選択された標的植物であり、それはあらゆる植物であってよく、好都合には、Ｎ．ベンサミアナ、Ｎ．タバカムが含まれるニコチアナおよびＳ．ツベローサム（Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）のようなタバコおよび関連する種、または他の植物、例えばＭ．サティバ（Ｍ．ｓａｔｉｖａ）の中から選択されてよい。一般に、その対照の植物において、アルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子は未改変であり、それは野生型レベルのアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する。

【0025】

“野生型レベルのアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ活性”（“野生型（ｗｉｌｄｔｙｐｅ）”または“野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）”とも書かれる）は、本明細書で用いられる際、それが天然において最も一般的に生じるような、植物中の典型的なアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ活性のレベルを指す。従って、前記の対照植物は、内在性のアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を標的とするサイレンシング核酸分子または低レベルのアルファ−１，３−フコシルトランスフェラーゼ活性と関係するアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子のアレル、例えばノックアウトアレルのどちらも与えられていない。

【0026】

前記のコアのアルファ（１，３）−フコース残基の低減したレベルは、少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９７％、または少なくとも９９％の低減からなることができる。産生された糖タンパク質と結合したアルファ（１，３）−フコシル化されたグリカン構造の量は、この発明において記述される方法に従って決定することができる。

【0027】

“コアのアルファ（１，３）−フコース構造”、また“アルファ（１，３）−フコース（ａｌｆａ（１，３）−ｆｕｃｏｓｅ）残基”、または“アルファ（１，３）−フコース（ａｌｐｈａ（１，３）−ｆｕｃｏｓｅ）残基”または“α（１，３）−フコース残基”は、本明細書で用いられる際、Ｎ−グリカンのコア領域にアルファ１，３結合しているフコースを指す。

【0028】

“アルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ（Ａｌｆａ（１，３）−ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）”または“アルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ（ａｌｐｈａ（１，３）−ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）”、または“α（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ”、または“ＦｕｃＴ”は、フコースのＧＤＰ−フコースからタンパク質に結合したＮ−グリカンのコアのβ結合Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）への転移を触媒する酵素である（ＥＣ２．４．１．２１４）。

【0029】

植物におけるアルファ（１，３）フコシルトランスフェラーゼ（ＦｕｃＴ）をコードする遺伝子には、実験により実証された、および推定上のＦｕｃＴのｃＤＮＡおよび遺伝子配列、その一部または相同配列を同定する以下のデータベース登録が含まれる：ＮＭ１１２８１５（アラビドプシス・サリアナ）、ＮＭ１０３８５８（アラビドプシス・サリアナ）、ＡＪ６１８９３２（フィスコミトレラ・パテンス（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａｐａｔｅｎｓ））、Ａｔ１ｇ４９７１０（アラビドプシス・サリアナ）、Ａｔ３ｇ１９２８０（アラビドプシス・サリアナ）、ＤＱ７８９１４５（レムナ・ミノル（Ｌｅｍｎａｍｉｎｏｒ））、ＡＹ５５７６０２（メディカゴ・トランカツラ（Ｍｅｄｉｃａｇｏｔｒｕｎｃａｔｕｌａ））、Ｙ１８５２９（ビグナ・ラジアタ（Ｖｉｇｎａｒａｄｉａｔａ））、ＡＰ００４４５７（オリザ・サティバ（Ｏｒｙｚａｓａｔｉｖａ））、タンパク質ＣＡＩ７０３７３をコードするＡＪ８９１０４０（ポプルス・アルバ（Ｐｏｐｕｌｕｓａｌｂａ）ｘポプルス・トレムラ（Ｐｏｐｕｌｕｓｔｒｅｍｕｌａ））、タンパク質ＡＡＬ９９３７１をコードするＡＹ０８２４４５（メディカゴ・サティバ（Ｍｅｄｉｃａｇｏｓａｔｉｖａ））、タンパク質ＣＡＥ４６６４９をコードするＡＪ５８２１８２（トリーティクム・アエスティウム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍ））、タンパク質ＣＡＥ４６６４８をコードするＡＪ５８２１８１（ホルデウム・ウルガレ（Ｈｏｒｄｅｕｍｖｕｌｇａｒｅ））、およびＥＦ５６２６３０．１（ニコチアナ・ベンサミアナ）（全ての配列は参照により本明細書に援用される）。

【0030】

“ノックアウトアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子”または“ノックアウトアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼアレル”または“アルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子のノックアウトアレル”または“ノックアウトＦｕｃＴ遺伝子”または“ノックアウトＦｕｃＴアレル”は、本明細書において用いられる際、本発明において記述されるような方法を用いて、Kang et al. (2008, Proc Natl Acad Sci USA 105: 5933)により記述されたようなアラビドプシス・サリアナの３重ノックアウトを補完しない、遺伝子または前記の遺伝子のアレルを指す。前記の“ノックアウトアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子”は、その核酸配列中に１個以上の変異を含む野生型のアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子またはアレルである。前記のノックアウト遺伝子は、例えば機能するｍＲＮＡに転写されない遺伝子、またはそれがコードするＲＮＡが正しくスプライシングされない遺伝子、または機能するタンパク質をコードしていない遺伝子であり得る。従って、ノックアウト遺伝子は、例えばプロモーター領域中に変異を有する、スプライス部位中に変異を有する、またはコード配列中に結果としてアミノ酸置換をもたらす、もしくは結果として中途での翻訳終結をもたらす変異を有する遺伝子を含み得る。

【0031】

変異は１個以上のヌクレオチドの欠失、挿入または置換であり得る。変異は天然において見付かる（例えばヒトによる変異原の適用なしで自然に生じる）変異である“自然突然変異”またはヒトの介入により、例えば突然変異誘発により誘発され、非天然変異体ヌルアレルと呼ばれる“誘発突然変異”のどちらかであり得る。

【0032】

“突然変異誘発”は、本明細書で用いられる際、植物細胞（例えば複数のニコチアナ・ベンサミアナの種子または他の部位、例えば花粉等）にその細胞のＤＮＡにおいて変異を誘発する技法、例えば突然変異誘発物質、例えば化学物質（例えばエチルメチルスルホネート（ｅｔｈｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（ＥＭＳ）、エチルニトロソ尿素（ＥＮＵ）等）との接触、または電離放射線（中性子（例えば高速中性子突然変異誘発等における中性子）、アルファ線、ガンマ線（例えばコバルト６０線源により供給されるガンマ線）、エックス線、紫外線等）、またはこれらの２つ以上の組合せを適用するプロセスを指す。従って、１個以上のアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子の所望の突然変異誘発を、化学的手段の使用により、例えば１個以上の植物組織のエチルメチルスルホネート（ＥＭＳ）、エチルニトロソ尿素等との接触により、物理的手段、例えばＸ線等の使用により、またはガンマ線、例えばコバルト６０線源により供給されるガンマ線により成し遂げることができる。照射により作り出される変異はしばしば大きな欠失または他の全体的な損傷、例えば転座もしくは複雑な再編成であるが、化学的変異原により作り出される変異はしばしばより離散的な損傷、例えば点変異である。例えば、ＥＭＳはグアニン塩基をアルキル化し、それは結果として塩基の誤対合をもたらし：アルキル化されたグアニンはチミン塩基と対合し、結果として主にＧ／ＣのＡ／Ｔへの転位をもたらすであろう。突然変異誘発後、ニコチアナ・ベンサミアナ植物を処理された細胞から既知の技法を用いて再生される。例えば、結果として得られたニコチアナ・ベンサミアナの種子を従来の栽培手順に従って植えることができ、続いてその植物において自家受粉種子が形成される。現世代または後の世代におけるそのような自家受粉の結果として形成される追加の種子を収穫し、変異アルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子の存在に関してスクリーニングすることができる。特定の変異体遺伝子に関してスクリーニングするためのいくつかの技法が既知であり、例えばＤｅｌｅｔｅａｇｅｎｅ（商標）(Delete-a-gene; Li et al., 2001, Plant J 27: 235-242)はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイを用いて高速中性子での突然変異誘発により産生された欠失変異体に関してスクリーニングし、ＴＩＬＬＩＮＧ（ゲノム中の標的化された誘発された局所損傷；McCallum et al., 2000, Nat Biotechnol 18:455-457）はＥＭＳで誘発された点変異を同定する；直接配列決定等。

【0033】

変異アルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子は、当該技術で一般的に用いられる様々な方法を用いて、例えばＰＣＲに基づく方法を用いてそのアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼのゲノムまたはｃＤＮＡの一部または全部を増幅し、直接配列決定して、産生（例えば突然変異誘発により誘発）および／または同定することができる。

【0034】

突然変異誘発後、植物を処理された種子から生長させ、または処理された細胞から既知の技法を用いて再生させる。例えば、突然変異誘発した種子を従来の栽培手順に従って植えてよく、続いてその植物において自家受粉種子が形成される。現世代または後の世代におけるそのような自家受粉の結果として形成される追加の種子を収穫し、変異アルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子の存在に関して当該技術において一般的に用いられる技法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく技法（アルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子の増幅）またはハイブリダイゼーションに基づく技法、例えばサザンブロット分析、ＢＡＣライブラリスクリーニング等、および／またはアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子の直接配列決定を用いてスクリーニングすることができる。変異アルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子中の点変異（いわゆる一塩基多型またはＳＮＰ）の存在に関してスクリーニングするために、当該技術において一般的に用いられるＳＮＰ検出法、例えばオリゴライゲーションに基づく技法、一塩基伸長に基づく技法、制限部位の差異に基づく技法、例えばＴＩＬＬＩＮＧ、または直接配列決定および例えばＮｏｖｏＳＮＰ(Weckx et al, 2005, Genome Res 15: 436)を用いたその配列の野生型配列に対する比較を用いることが出来る。

【0035】

上記で記述したように、特定の野生型のアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子の（自然ならびに誘発された）突然変異誘発は、結果として得られた変異アルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子中の１個以上の欠失した、挿入された、または置換されたヌクレオチド（以下“変異領域”と呼ぶ）の存在をもたらす。従って、その変異アルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子を、野生型アルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子中のその１個以上の欠失した、挿入された、または置換されたヌクレオチドの位置および構成により特性付けることができる。

【0036】

一度特定の変異アルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子が配列決定されたら、生物学的試料（例えば植物、植物性物質または植物性物質を含む製品の試料）中の変異アルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子を特異的に認識するプライマーおよびプローブを開発することができる。

【0037】

本明細書で用いられる際、用語“アレル（単数または複数）”は、特定の座位にある遺伝子の１つ以上の取り得る形態のいずれかを意味する。生物の二倍体（または複二倍体）細胞において、所与の遺伝子のアレルは、染色体上の特定の位置または座位（ｌｏｃｕｓ）（複数形は座位（ｌｏｃｉ））に位置する。１つのアレルは一対の相同染色体のそれぞれの染色体上に存在する。

【0038】

別の態様において、ニコチアナ・ベンサミアナにおいて低減したレベルのコアのアルファ（１，３）−フコース残基および低減したレベルのベータ（１，２）−キシロース残基を有する糖タンパク質を産生する方法が提供され、前記の方法は以下の工程を含む：少なくとも３個のノックアウトアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子を含み、かつ低減したレベルのベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼ活性を有する植物細胞を提供し；そして前記の細胞を培養し、前記の細胞から糖タンパク質を単離する。

【0039】

“低減したレベルのベータ（１，２）−キシロース残基”は、本明細書で用いられる際、対照植物において得られるようなレベルに関する、コアのベータ（１，２）−キシロース残基のレベルの低減を意味する。その“対照”植物は一般に選択された標的植物であり、それはあらゆる植物であってよく、好都合には、Ｎ．ベンサミアナ、Ｎ．タバカムが含まれるニコチアナおよびＳ．ツベローサムのようなタバコおよび関連する種、または他の植物、例えばＭ．サティバの中から選択されてよい。一般に、その対照の植物において、ベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼは未改変であり、それは野生型レベルのベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼ活性を有する。“野生型レベルのベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼ活性”（“野生型（ｗｉｌｄｔｙｐｅ）”または“野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）”とも書かれる）は、本明細書で用いられる際、それが天然において最も一般的に生じるような、植物中の典型的なベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼ活性のレベルを指す。従って、前記の対照植物は、内在性のベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を標的とするサイレンシング核酸分子または低レベルのベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼ活性と関係するベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼ遺伝子のアレル、例えばノックアウトアレルのどちらも与えられていない。

【0040】

前記のベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼ残基の低減したレベルは、少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９７％、または少なくとも９９％の低減からなることができる。産生された糖タンパク質と結合したベータ（１，２）−キシロシル化されたグリカン構造の量は、この発明において記述される方法に従って決定することができる。

【0041】

“コアのアルファ（１，３）−フコース残基の低減したレベルおよびベータ（１，２）−キシロース残基の低減したレベル”は、アルファ（１，３）−フコース残基、ベータ（１，２）−キシロース残基、またはアルファ（１，３）−フコースおよびベータ（１，２）−キシロース残基を含むグリカンのレベルの低減からなることができる。前記の低減は、少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９７％、または少なくとも９９％の低減からなることができる。産生された糖タンパク質と結合したアルファ（１，３）−フコシル化およびベータ（１，２）−キシロシル化されたグリカン構造の量は、この発明において記述される方法に従って決定することができる。

【0042】

ベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼ活性のレベルは、内在性のベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の発現を低減することにより低減することができる。

【0043】

述べられた整数（ａｓｔａｔｅｄｉｎｔｅｇｅｒ）の“発現を低減する”により、その整数の転写および／または翻訳および／または翻訳後修飾が、その明記された整数がそうでなければそれを発現したであろう細胞、組織、器官または生物への低減した生物学的作用を有するように、阻害される、または妨げられる、またはノックダウンされる、またはノックアウトされる、または妨害されることを意味する。

【0044】

当業者は、発現が阻害された、妨害された、または低減したかどうかを、過度の実験なしで知るであろう。例えば、特定の遺伝子の発現レベルは、ｍＲＮＡ鋳型分子の逆転写に続くポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により決定することができる。あるいは、遺伝子配列の発現レベルはノーザンハイブダイゼーション分析またはドットブロットハイブリダイゼーション分析またはインサイチュハイブリダイゼーション分析または類似の技法により決定することができ、そのような技法ではｍＲＮＡを膜支持体に転写し、目的の遺伝子によりコードされるｍＲＮＡ転写産物のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、適切なレポーター分子、例えばとりわけ放射活性により標識されたｄＮＴＰ（例えば［アルファ−３２Ｐ］ｄＣＴＰまたは［アルファ−３５Ｓ］ｄＣＴＰ）またはビオチン化されたｄＮＴＰで標識された“プローブ”分子にハイブリダイズさせる。次いで、目的遺伝子の発現を、そのハイブリダイズしたプローブ分子に結合したレポーター分子により生成されるシグナルの出現を検出することにより決定することができる。

【0045】

あるいは、特定の遺伝子の転写の速度を核ランオン（ｒｕｎ−ｏｎ）および／または核ランオフ（ｒｕｎ−ｏｆｆ）実験により決定することができ、ここで核を特定の細胞または組織から単離し、ｒＮＴＰの特定のｍＲＮＡ分子中への組み込みの速度を決定する。あるいは、目的の遺伝子の発現をＲＮアーゼプロテクションアッセイにより決定することができ、ここで前記の目的遺伝子によりコードされるｍＲＮＡのヌクレオチド配列に相補的である標識されたＲＮＡプローブまたは“リボプローブ”を前記のｍＲＮＡに二本鎖ｍＲＮＡ分子が形成されるのに十分な時間および条件下でアニーリングさせ、その時間の後、試料をＲＮアーゼに消化させて一本鎖ＲＮＡ分子を除去し、そして特にハイブリダイズしなかった過剰なリボプローブを除去する。そのようなアプローチは、Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: a laboratory manual. （第２版）ニューヨーク, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. 1659 p. ISBN 0-87969-309-6により詳細に記述されている。

【0046】

当業者は、タンパク質レベルで特定の遺伝子の発現のレベルを検出するための様々な免疫学的および酵素的方法、例えば、とりわけロケット免疫電気泳動、ＥＬＩＳＡ、放射免疫アッセイおよびウェスタンブロット免疫電気泳動の技法の使用も知っているであろう。

【0047】

ベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼ活性のレベルは、好都合には内在性のベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の発現の転写サイレンシングまたは転写後サイレンシングにより低減または排除することができる。この目的のため、その内在性のベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を標的とするサイレンシングＲＮＡ分子をその植物細胞中に導入する。

【0048】

本明細書で用いられる際、“サイレンシングＲＮＡ”または“サイレンシングＲＮＡ分子”は、植物細胞中に導入された際に標的遺伝子の発現を低減するあらゆるＲＮＡ分子を指す。そのようなサイレンシングＲＮＡは、例えばいわゆる“アンチセンスＲＮＡ”であってよく、それによりそのＲＮＡ分子は、標的核酸の配列、好ましくは標的遺伝子のコード配列の相補物（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）に対して９５％の配列同一性を有する少なくとも２０個の連続したヌクレオチドの配列を含む。しかし、アンチセンスＲＮＡは、プロモーター配列ならびに転写終結およびポリアデニル化シグナルが含まれる標的遺伝子の制御配列に向けられてもよい。サイレンシングＲＮＡにはさらに、いわゆる“センスＲＮＡ”も含まれ、それによりそのＲＮＡ分子は標的核酸の配列に対して９５％の配列同一性を有する少なくとも２０個の連続したヌクレオチドの配列を含む。他のサイレンシングＲＮＡは、国際公開０１／１２８２４号または米国特許第６４２３８８５号（両方の文献が参照により本明細書に援用される）において記述されているような、標的核酸の配列の相補物に対して９５％の配列同一性を有する少なくとも２０個の連続したヌクレオチドを含む“ポリアデニル化されていないＲＮＡ”であることができる。さらに別のタイプのサイレンシングＲＮＡは、国際公開第０３／０７６６１９号（参照により本明細書に援用される）において記述されているような、標的核酸の配列またはその相補物に対して９５％の配列同一性を有する少なくとも２０個の連続したヌクレオチドを含み、さらに国際公開第０３／０７６６１９号において記述されているような大部分が二本鎖である領域を含む（ジャガイモやせいもウイロイド型のウイロイドからの核局在化シグナルを含む、またはＣＵＧ三塩基反復を含む、大部分が二本鎖である領域が含まれる）ＲＮＡ分子である。サイレンシングＲＮＡは、本明細書で定義されるようなセンスおよびアンチセンス鎖を含む二本鎖ＲＮＡであってもよく、ここでそのセンスおよびアンチセンス鎖は互いに塩基対合して二本鎖ＲＮＡ領域を形成することができる（好ましくは、前記のセンスおよびアンチセンスＲＮＡの少なくとも２０個の連続したヌクレオチドは互いに相補的である）。そのセンスおよびアンチセンス領域は、そのセンスおよびアンチセンス領域が二本鎖ＲＮＡ領域を形成した際にヘアピンＲＮＡ（ｈｐＲＮＡ）が形成され得るように１個のＲＮＡ分子内に存在していてもよい。ｈｐＲＮＡは当業者に周知である（例えば参照により本明細書に援用される国際公開第９９／５３０５０号を参照）。そのｈｐＲＮＡは、大部分が相補的であり得るが完全に相補的である必要はない長いセンスおよびアンチセンス領域を有する長鎖ｈｐＲＮＡとして分類することができる（典型的には約２００ｂｐより大きく、２００ｂｐ〜１０００ｂｐの範囲に及ぶ）。ｈｐＲＮＡは、大きさが約３０から約４２ｂｐまでの範囲のかなり小さいものであることもできるが、９４ｂｐよりはるかに大きくはない（参照により本明細書に援用される国際公開第０４／０７３３９０号を参照）。サイレンシングＲＮＡは、例えば国際公開第２００５／０５２１７０号、国際公開第２００５／０４７５０５号、もしくは米国特許出願公開第２００５／０１４４６６７号において記述されているような人工のマイクロＲＮＡ分子、または国際公開第２００６／０７４４００号において記述されているようなｔａ−ｓｉＲＮＡであることもできる（全ての文献が参照により本明細書に援用される）。

【0049】

ベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼをサイレンシングするための適切な方法は、国際公開第２００９０５６１５５号において記述されているような方法である。

【0050】

本発明の特定の態様において、ベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼ活性の低減したレベルは、内在性のベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼ遺伝子におけるノックアウト変異の結果である。

【0051】

“内在性のベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼ遺伝子におけるノックアウト変異”は、本明細書において用いられる際、そのベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼ遺伝子を不活性にする変異であり、ここでその不活性な遺伝子は、その遺伝子が機能するアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼタンパク質をコードしていないことを特徴とする。“ノックアウト遺伝子”または“ノックアウトアレル”とも呼ばれる前記の遺伝子は、機能するｍＲＮＡに転写されない遺伝子、またはそれがコードするＲＮＡが正しくスプライシングされない遺伝子、または機能するタンパク質をコードしていない遺伝子のいずれかであり得る。従って、ベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼ遺伝子を不活性にする変異は、例えばプロモーター領域中の変異、スプライス部位中の変異、または結果としてアミノ酸置換もしくは中途での翻訳終結をもたらすコード配列中の変異を含む。

【0052】

ニコチアナ・ベンサミアナの内在性ベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼ遺伝子における適切なノックアウト変異は、国際公開第２０１０１４５８４６号において記述されているようなノックアウトである。

【0053】

そのアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼおよびベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼ活性は、それぞれ植物からのタンパク質に結合したＮ−グリカン上のアルファ（１，３）−フコース残基のレベルおよびベータ（１，２）−キシロース残基のレベルを決定することにより評価することができる。植物からのタンパク質に結合したＮ−グリカン上のアルファ（１，３）−フコース残基のレベルおよびベータ（１，２）−キシロース残基のレベルは、例えばFaye et al. (Analytical Biochemistry (1993) 209: 104-108)により記述されたようなフコースもしくはキシロース特異的抗体を用いるウェスタンブロット分析により、または例えばKolarich and Altmann (Anal. Biochem. (2000) 285: 64-75)により記述されたようなマトリクス援助レーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）を用いるその植物の糖タンパク質から単離されたグリカンに対する質量分析法により、またはPabst et al. (Analytical Chemistry (2007) 79: 5051-5057)により記述されたような液体クロマトグラフィー−エレクトロスプレーイオン化−質量分析法（ＬＣ／ＥＳＩ／ＭＳ）を用いて、または例えばHenriksson et al. (Biochem. J. (2003) 375: 61-73)により記述されたような液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）を用いて測定することができる。

【0054】

本発明の方法のさらに別の態様において、前記の植物または植物細胞は少なくとも５個のノックアウトアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子を含む。

【0055】

少なくとも５個のノックアウトアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子は、５個のノックアウトアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、または６個のノックアウトアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、または７個のノックアウトアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、または７個より多くのノックアウトアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子であることができる。

【0056】

適切なノックアウトアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子は、ＳＥＱＩＤＮＯ．３、ＳＥＱＩＤＮＯ．６、ＳＥＱＩＤＮＯ．９、ＳＥＱＩＤＮＯ．１２、ＳＥＱＩＤＮＯ．１４のアミノ酸配列をコードする核酸からなる、またはこれらのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、もしくは少なくとも８５％、もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％、もしくは少なくとも９７％、もしくは少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸からなる群から選択される天然のアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子の変異版であることができる。

【0057】

適切なノックアウトアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子はさらに、ＳＥＱＩＤＮＯ．１、ＳＥＱＩＤＮＯ．４、ＳＥＱＩＤＮＯ．７、ＳＥＱＩＤＮＯ．１０、ＳＥＱＩＤＮＯ．１３からなる、またはこれらの配列に対して少なくとも８０％、もしくは少なくとも８５％、もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％、もしくは少なくとも９７％、もしくは少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する核酸からなる群から選択される天然のアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子の変異版であることができる。

【0058】

本発明のさらに別の態様において、前記のノックアウトアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子は、以下：
−ＳＥＱＩＤＮＯ：３に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むアミノ酸配列をコードする核酸分子；
−ＳＥＱＩＤＮＯ：６に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むアミノ酸配列をコードする核酸分子；
−ＳＥＱＩＤＮＯ：９に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むアミノ酸配列をコードする核酸分子；
−ＳＥＱＩＤＮＯ：１２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むアミノ酸配列をコードする核酸分子；
−ＳＥＱＩＤＮＯ：１４に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むアミノ酸配列をコードする核酸分子；
からなる群から選択される天然のアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子の変異版である。

【0059】

さらなる態様において、前記のノックアウトアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子は、以下：
−ＳＥＱＩＤＮＯ：１に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む核酸分子；
−ＳＥＱＩＤＮＯ：４に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む核酸分子；
−ＳＥＱＩＤＮＯ：７に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む核酸分子；
−ＳＥＱＩＤＮＯ：１０に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む核酸分子；
−ＳＥＱＩＤＮＯ：１３に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む核酸分子；
からなる群から選択される天然のアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子の変異版である。

【0060】

本発明に関する適切なノックアウトアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子は、表２および表４において示されるような変異の群から選択される１個以上の変異を有する遺伝子である。

【0061】

さらに別の態様において、前記のノックアウトアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子は、以下：
−ＳＥＱＩＤＮＯ：１の３５５位におけるＧのＡへの置換を含有するＦｕｃＴＡ遺伝子；
−ＳＥＱＩＤＮＯ：４の３０５４位におけるＧのＡへの置換を含有するＦｕｃＴＢ遺伝子；
−ＳＥＱＩＤＮＯ：７の２８０７位におけるＧのＡへの置換を含有するＦｕｃＴＣ遺伝子；
−ＳＥＱＩＤＮＯ：１０の２２４位におけるＧのＡへの置換を含有するＦｕｃＴＤ遺伝子；
−ＳＥＱＩＤＮＯ：１３の９１０位におけるＧのＡへの置換を含有するＦｕｃＴＥ遺伝子；
からなる群から選択される。

【0062】

遺伝子の“変異版”は、本明細書で用いられる際、ある遺伝子の１個以上の変異を含有する版である。“天然のアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ”、また、“野生型アルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ”は、本明細書で用いられる際、それが天然において最も一般的に存在するような、アルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼの典型的な形態を指す。

【0063】

別の特定の態様において、前記のノックアウトアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子は、ゲノム中にホモ接合型の状態で存在する。

【0064】

本発明に従う別の態様において、本発明に従う方法はさらに、少なくとも５個の内在性のアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の発現が転写サイレンシングまたは転写後サイレンシングにより低減していることを特徴とする。転写サイレンシングまたは転写後サイレンシングは、適切には内在性のアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を標的とするサイレンシングＲＮＡ分子を植物細胞中に導入することにより達成することができる。

【0065】

少なくとも５個の内在性のアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子をサイレンシングするために、１個より多くのキメラ遺伝子を植物細胞中に導入することが適切であり、それはそのキメラ遺伝子のそれぞれがサイレンシングＲＮＡ分子をコードし、そのそれぞれがそのアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子の少なくとも１個をサイレンシングするのに適していることを特徴とする。あるいは、少なくとも５個のアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子をサイレンシングすることができるサイレンシングＲＮＡ分子をコードする１個のキメラ遺伝子を植物細胞中に導入することができる。前記の１個のキメラ遺伝子はいくつかの２１個の連続したヌクレオチドの領域を含むことができ、そのそれぞれがアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子の少なくとも１個に存在する２１ヌクレオチドの領域に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。あるいは、前記の１個のキメラ遺伝子は２１個の連続したヌクレオチドの領域を含むことができ、それは少なくとも５個のアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子が前記の２１個の連続したヌクレオチドの領域に対して８５％の配列同一性を有する２１ヌクレオチドの配列を含むことを特徴とする。

【0066】

ニコチアナ・ベンサミアナのアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子をサイレンシングするための適切な方法は、国際公開第２００９０５６１５５号において記述されているような方法である。

【0067】

さらに別の態様において、本発明に従う植物細胞は、以下の作動可能に連結されたＤＮＡ断片を含む少なくとも１個のキメラ遺伝子を含む：植物で発現可能なプロモーター、転写された際に少なくとも１個のアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子に対して阻害性のＲＮＡ分子を生じるＤＮＡ領域、植物において機能する転写終結およびポリアデニル化シグナルを含むＤＮＡ領域。さらなる態様において、前記のＤＮＡ領域は、少なくともＳＥＱＩＤＮＯ：２、ＳＥＱＩＤＮＯ：５、ＳＥＱＩＤＮＯ：８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３、またはそれらの相補物から選択される２１ヌクレオチドの内の少なくとも１８ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む第１センスＤＮＡ領域から転写されるＲＮＡ領域および前記の第１センスＤＮＡ領域の相補物に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する少なくとも１８個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む第２アンチセンスＤＮＡ領域から転写されるＲＮＡ領域の間で二本鎖ＲＮＡ領域を形成することができるＲＮＡ分子を生じる。

【0068】

“少なくとも１個のアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子に対して阻害性のＲＮＡ分子”は、本明細書で用いられる際、少なくとも１個のアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の発現を低減するサイレンシングＲＮＡ分子を指す。

【0069】

本明細書で用いられる際、用語“植物で発現可能なプロモーター”は、植物細胞において転写を制御（開始）することができるＤＮＡ配列を意味する。これには植物由来のあらゆるプロモーターが含まれるが、植物細胞において転写を方向付けることができる非植物由来のあらゆるプロモーター、すなわちウイルスまたは細菌由来の特定のプロモーター、例えばＣａＭＶ３５Ｓ(Harpster et al.(1988) Mol Gen Genet. 212(1):182-90)、サブタレニアンクローバーウイルスプロモーター４番および７番（国際公開第９６０６９３２号）、またはＴ−ＤＮＡ遺伝子プロモーターも含まれ、種子特異的プロモーター（例えば国際公開第８９／０３８８７号）、器官原基特異的プロモーター(An et al. (1996) Plant Cell 8(1):15-30)、茎特異的プロモーター(Keller et al., (1988) EMBO J. 7(12): 3625-3633)、葉特異的プロモーター(Hudspeth et al. (1989) Plant Mol Biol. 12: 579-589)、葉肉特異的プロモーター（例えば光誘導性Ｒｕｂｉｓｃｏプロモーター）、根特異的プロモーター(Keller et al. (1989) Genes Dev. 3: 1639-1646)、塊茎特異的プロモーター(Keil et al. (1989) EMBO J. 8(5): 1323-1330)、維管束組織特異的プロモーター(Peleman et al. (1989) Gene 84: 359-369)、雄ずい選択的プロモーター（国際公開第８９／１０３９６号、国際公開第９２／１３９５６号）、裂開領域（ｄｅｈｉｓｃｅｎｃｅｚｏｎｅ）特異的プロモーター（国際公開第９７／１３８６５号）等が含まれるがそれらに限定されない組織特異的または器官特異的プロモーターも含まれる。

【0070】

“転写終結およびポリアデニル化領域”は、本明細書で用いられる際、新生ＲＮＡの切断を駆動し、その後ポリ（Ａ）尾部が結果として生じるＲＮＡの３’末端において付加される、植物において機能する配列である。植物において機能する転写終結およびポリアデニル化シグナルには、３’ｎｏｓ、３’３５Ｓ、３’ｈｉｓおよび３’ｇ７が含まれるが、それらに限定されない。

【0071】

さらに別の態様において、本発明に従う植物細胞は、植物で発現可能なプロモーター、転写された際に少なくとも１個のアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子に対して阻害性のＲＮＡ分子を生じるＤＮＡ領域、ならびに植物において機能する転写終結およびポリアデニル化シグナルを含むＤＮＡ領域を含むキメラ遺伝子を含み、前記のＤＮＡ領域がＳＥＱＩＤＮＯ．１９の配列を含むことを特徴とする。

【0072】

本発明の別の態様において、本発明の方法に従って産生される糖タンパク質は異種糖タンパク質である。さらに別の態様において、前記の異種タンパク質は、以下の作動可能に連結された核酸分子を含むキメラ遺伝子から発現される：植物で発現可能なプロモーター、前記の異種糖タンパク質をコードするＤＮＡ領域、転写終結およびポリアデニル化に関わるＤＮＡ領域。さらに別の態様において、本発明に従う方法はさらに前記の異種タンパク質の精製の工程を含む。

【0073】

単語“発現”は、本明細書で用いられる際、その最も広範な文脈において、センスもしくはアンチセンスｍＲＮＡを産生するための特定の遺伝子配列の転写、またはペプチド、ポリペプチド、オリゴペプチド、タンパク質もしくは酵素分子を産生するためのセンスｍＲＮＡ分子の翻訳を指すように解釈されるものとする。センスｍＲＮＡ転写産物の産生を含む発現の場合には、単語“発現”は、その後のペプチド、ポリペプチド、オリゴペプチド、タンパク質または酵素分子の生物学的活性、細胞または細胞内局在、代謝回転または定常状態レベルを修正する翻訳後の事象有りまたは無しで、転写および翻訳プロセスの組み合わせを示すように解釈されてもよい。

【0074】

異種糖タンパク質、すなわち天然ではそのような植物細胞で通常発現されない糖タンパク質には、例えばモノクローナル抗体のような、療法薬として用いることができる哺乳類またはヒトのタンパク質が含まれてよい。好都合には、その外来の糖タンパク質は植物で発現可能なプロモーターおよび目的の糖タンパク質のコード領域を含むキメラ遺伝子から発現させることができ、それによりそのキメラ遺伝子は植物細胞のゲノム中に安定に組み込まれる。外来タンパク質を植物細胞中で発現させるための方法は、当該技術において周知である。あるいは、その外来糖タンパク質を、例えば国際公開第０２／０８８３６９号、国際公開第２００６／０７９５４６号および国際公開第２００６／０１２９０６号において記述されているウイルスベクターおよび方法を用いて、または国際公開第８９／０８１４５号、国際公開第９３／０３１６１号および国際公開第９６／４０８６７号もしくは国際公開第９６／１２０２８号において記述されているウイルスベクターを用いて、一過性の方法で発現させることもできる。

【0075】

“異種タンパク質”により、それは天然ではその植物または植物細胞により発現されないタンパク質（すなわちポリペプチド）であることは理解されている。これは、植物または植物細胞により天然に発現されるタンパク質である同種タンパク質とは対照的である。翻訳後Ｎ−グリコシル化を経る異種および同種ポリペプチドは、本明細書において異種または同種糖タンパク質と呼ばれる。

【0076】

本発明の方法により好都合に産生され得る対象の異種タンパク質の例には、サイトカイン、サイトカイン受容体、成長因子（例えばＥＧＦ、ＨＥＲ−２、ＦＧＦ−アルファ、ＦＧＦ−ベータ、ＴＧＦ−アルファ、ＴＧＦ−ベータ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−２、ＮＧＦ）、成長因子受容体が含まれるが、それらに限定されない。他の例には、成長ホルモン（例えばヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン）；インスリン（例えばインスリンＡ鎖およびインスリンＢ鎖）、プロインスリン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、コロニー刺激因子（例えばＧ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ）；インターロイキン；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）およびその受容体（ＶＥＧＦ−Ｒ）、インターフェロン、腫瘍壊死因子およびその受容体、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、トロンビン、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）；凝固因子（例えば第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、フォン・ヴィルブランド因子等）、抗凝固因子；組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、ウロキナーゼ、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、カルシトニン、ＣＤタンパク質（例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤｌＩａ、ＣＤｌＩｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ７１等）、ＣＴＬＡタンパク質（例えばＣＴＬＡ４）；Ｔ細胞およびＢ細胞受容体タンパク質、骨形成タンパク質（ＢＭＰ、例えばＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３等）、神経栄養因子、例えば骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン類、例えばレンニン、リウマチ因子、ランテス、アルブミン、リラキシン、マクロファージ抑制タンパク質（例えばＭＩＰ−１、ＭＩＰ−２）、ウイルスタンパク質または抗原、表面膜タンパク質、イオンチャンネルタンパク質、酵素、制御タンパク質、免疫調節タンパク質、（例えばＨＬＡ、ＭＨＣ、Ｂ７ファミリー）、ホーミング受容体、輸送タンパク質、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、Ｇタンパク質共役型受容体タンパク質（ＧＰＣＲ）、神経調節タンパク質、アルツハイマー病関連タンパク質およびペプチドが含まれる。融合タンパク質およびポリペプチド、キメラタンパク質およびポリペプチド、ならびに前記のタンパク質のいずれかの断片もしくは部分、または変異体、変種、もしくは類似体も、本発明の方法により産生することができる適切なタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドの中に含まれる。対象のタンパク質は糖タンパク質であることができる。糖タンパク質の１つのクラスは、例えばワクチンを産生するために用いることができるウイルスの糖タンパク質、特にサブユニットである。ウイルスタンパク質の一部の例は、ライノウイルス、ポリオウイルス、ヘルペスウィルス、ウシヘルペスウィルス、インフルエンザウイルス、ニューカッスル病ウイルス、呼吸系発疹ウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｃｉｔｉｏｖｉｒｕｓ）、麻疹ウイルス、レトロウイルス、例えばヒト免疫不全ウイルス、またはパルボウイルス、またはパポバウイルス、ロタウイルス、またはコロナウイルス、例えば伝染性胃腸炎ウイルス、またはフラビウイルス、例えばダニ媒介性脳炎ウイルスもしくは黄熱ウイルス、トガウイルス、例えば風疹ウイルスもしくは東部ウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、もしくはベネズエラウマ脳炎ウイルス、肝炎を引き起こすウイルス、例えばＡ型肝炎ウイルスもしくはＢ型肝炎ウイルス、ペスチウイルス、例えばブタコレラウイルス、またはラブドウイルス、例えば狂犬病ウイルスからのタンパク質を含む。

【0077】

その異種糖タンパク質は、抗体またはその断片であることができる。用語“抗体”は、組換え抗体（例えばＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥのクラス）ならびに組換え抗体、例えば単鎖抗体、キメラおよびヒト化抗体ならびに多重特異性抗体を指す。用語“抗体”は、前記の全ての断片および誘導体も指し、さらにエピトープに特異的に結合する能力を保持しているそのあらゆる改変または誘導体化された変種を含み得る。抗体誘導体は、抗体にコンジュゲートされたタンパク質または化学的部分を含み得る。モノクローナル抗体は標的抗原またはエピトープに選択的に結合することができる。抗体には、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ヒト化またはキメラ抗体、ラクダ化抗体、ラクダ科（ｃａｍｅｌｉｄ）抗体（ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標））、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦｖ）フラグメント、抗イディオタイプ（ａｎｔｉ−Ｉｄ）抗体、細胞内抗体、合成抗体、および上記のいずれかのエピトープ結合断片が含まれる。用語“抗体”は、免疫グロブリンのＦｃ領域と同等の領域を含む融合タンパク質も指す。いわゆる二重特異性抗体(Bostrom J et al (2009) Science 323, 1610-1614)の本発明の植物または植物細胞における産生も考えられる。

【0078】

本発明の範囲内の抗体には、以下の抗体のアミノ酸配列を含む抗体が含まれる：重鎖および軽鎖可変領域を含む抗体（米国特許第５，７２５，８５６号参照）またはトラスツズマブ、例えばＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（商標）が含まれる抗ＨＥＲ２抗体；抗ＣＤ２０抗体、例えば米国特許第５，７３６，１３７号におけるようなキメラ抗ＣＤ２０、米国特許第５，７２１，１０８号におけるような２Ｈ７抗体のキメラまたはヒト化変種；ヒト化および／または親和性成熟抗ＶＥＧＦ抗体、例えばヒト化抗ＶＥＧＦ抗体ｈｕＡ４．６．１ＡＶＡＳＴＩＮ（商標）（国際公開第９６／３００４６号および国際公開第９８／４５３３１号）が含まれる抗ＶＥＧＦ抗体；抗ＥＧＦＲ（国際公開第９６／４０２１０号におけるようなキメラ化またはヒト化抗体）；抗ＣＤ３抗体、例えばＯＫＴ３（米国特許第４，５１５，８９３号）；抗ＣＤ２５または抗ｔａｃ抗体、例えばＣＨＩ−６２１（ＳＩＭＵＬＥＣＴ）および（ＺＥＮＡＰＡＸ）（米国特許第５，６９３，７６２号）。本発明は、本発明の形質転換された植物細胞を培養することまたは本発明の形質転換された植物を生長させることを含む、抗体の産生のための方法を提供する。産生された抗体は、標準的な手順に従って精製および配合することができる。

【0079】

その異種糖タンパク質をコードするＤＮＡ領域は、植物内での発現のレベルを増大させるためにコドン最適化されていてよい。コドン最適化により、植物におけるコドン使用頻度に近づけるための、構造遺伝子またはその断片のオリゴヌクレオチド構築ブロックの合成およびそれらのその後の酵素集合のための適切なＤＮＡヌクレオチドの選択を意味する。

【0080】

“精製”は、本明細書において用いられる際、植物の総タンパク質の混合物からその異種タンパク質を単離することである。精製のレベルは、少なくとも５０％の純度まで、または少なくとも６０％の純度まで、または少なくとも７０％の純度まで、または少なくとも８０％の純度まで、または少なくとも８５％の純度まで、または少なくとも９０％の純度まで、または少なくとも９５％の純度まで、または少なくとも９８％の純度まで、または少なくとも９９％の純度までであることができる。タンパク質精製のための方法は当該技術で周知であり、それは示差沈殿、超遠心分離、クロマトグラフィー、または親和性精製からなることができるが、それらに限定されない。

【0081】

本発明の別の態様は、本発明に従う方法により得られる糖タンパク質を提供する。さらに別の態様において、前記の糖タンパク質は低減したレベルのアルファ（１，３）−フコース残基を有する。さらに別の態様において、前記の糖タンパク質は低減したレベルのアルファ（１，３）−フコース残基および低減したレベルのベータ（１，２）−キシロース残基を有する。

【0082】

本発明に従う別の態様は、少なくとも３個のノックアウトアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子を含む、ニコチアナ・ベンサミアナ植物、またはその細胞、部位、種子もしくは子孫を提供する。さらに別の態様において、前記の植物は少なくとも５個のノックアウトアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子を含む。

【0083】

少なくとも５個のノックアウトアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子は、５個のノックアウトアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、または６個のノックアウトアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、または７個のノックアウトアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、または少なくとも７個のノックアウトアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子であることができる。

【0084】

【0085】

【0086】

別の態様は本発明に従う植物を提供し、ここでそのノックアウトアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子の１個以上は、以下：
−ＳＥＱＩＤＮＯ：３に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むアミノ酸配列をコードする核酸分子；
−ＳＥＱＩＤＮＯ：６に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むアミノ酸配列をコードする核酸分子；
−ＳＥＱＩＤＮＯ：９に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むアミノ酸配列をコードする核酸分子；
−ＳＥＱＩＤＮＯ：１２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むアミノ酸配列をコードする核酸分子；
−ＳＥＱＩＤＮＯ：１４に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むアミノ酸配列をコードする核酸分子；
からなる群から選択される天然のアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子の変異版である。

【0087】

さらに別の態様は本発明に従う植物を提供し、ここでそのノックアウトアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子の１個以上は、以下：
−ＳＥＱＩＤＮＯ：１に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む核酸分子；
−ＳＥＱＩＤＮＯ：４に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む核酸分子；
−ＳＥＱＩＤＮＯ：７に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む核酸分子；
−ＳＥＱＩＤＮＯ：１０に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む核酸分子；
−ＳＥＱＩＤＮＯ：１３に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む核酸分子；
からなる群から選択される天然のアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子の変異版である。

【0088】

さらに別の態様は本発明に従う植物を提供し、ここでそのノックアウトアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子は、以下：
−ＳＥＱＩＤＮＯ：１の３５５位におけるＧのＡへの置換を含有するＦｕｃＴＡ遺伝子；
−ＳＥＱＩＤＮＯ：４の３０５４位におけるＧのＡへの置換を含有するＦｕｃＴＢ遺伝子；
−ＳＥＱＩＤＮＯ：７の２８０７位におけるＧのＡへの置換を含有するＦｕｃＴＣ遺伝子；
−ＳＥＱＩＤＮＯ：１０の２２４位におけるＧのＡへの置換を含有するＦｕｃＴＤ遺伝子；
−ＳＥＱＩＤＮＯ：１３の９１０位におけるＧのＡへの置換を含有するＦｕｃＴＥ遺伝子；
からなる群から選択される。

【0089】

さらなる態様において、本発明に従う植物または植物細胞は、そのノックアウトアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子に関してホモ接合型である。

【0090】

さらに別の態様において、本発明に従う植物または植物細胞はさらに少なくとも１個のノックアウトベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼ遺伝子を含み、ここで前記のノックアウトベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼ遺伝子はそのベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼ遺伝子中に対応する野生型ＤＮＡ領域と比較して１個以上の挿入された、欠失した、または置換されたヌクレオチドからなる変異したＤＮＡ領域を含み、かつここで前記のノックアウトベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼ遺伝子は機能するベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼタンパク質をコードしていない。

【0091】

さらに別の態様において、前記の植物または植物細胞は、さらに以下の作動可能に連結されたＤＮＡ断片を含む少なくとも１個のキメラ遺伝子を含む：植物で発現可能なプロモーター；転写された際に少なくとも１個のアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子に対して阻害性のＲＮＡ分子を生じるＤＮＡ領域；ならびに植物において機能する転写終結およびポリアデニル化シグナルを含むＤＮＡ領域。適切には、前記のＤＮＡ領域は、少なくともＳＥＱＩＤＮＯ：２、ＳＥＱＩＤＮＯ：５、ＳＥＱＩＤＮＯ：８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３、またはそれらの相補物から選択される２１ヌクレオチドの内の少なくとも１８ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む第１センスＤＮＡ領域から転写されるＲＮＡ領域および前記の第１センスＤＮＡ領域の相補物に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する少なくとも１８個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む第２アンチセンスＤＮＡ領域から転写されるＲＮＡ領域の間で二本鎖ＲＮＡ領域を形成することができるＲＮＡ分子を生じる。

【0092】

さらなる態様において、前記のＤＮＡ領域はＳＥＱＩＤＮＯ．１９の配列を含む。

【0093】

さらなる態様において、本発明に従う植物または植物細胞はさらに前記の植物または植物細胞に対して外来の糖タンパク質を含む。さらに別の態様において、前記の糖タンパク質は以下の作動可能に連結された核酸分子を含むキメラ遺伝子から発現される：植物で発現可能なプロモーター、前記の異種糖タンパク質をコードするＤＮＡ領域、転写終結およびポリアデニル化に関わるＤＮＡ領域。

【0094】

本発明に従う別の態様は、以下：
−ＳＥＱＩＤＮＯ：１の３５５位におけるＧのＡへの置換を含有するＦｕｃＴＡ遺伝子；
−ＳＥＱＩＤＮＯ：４の３０５４位におけるＧのＡへの置換を含有するＦｕｃＴＢ遺伝子；
−ＳＥＱＩＤＮＯ：７の２８０７位におけるＧのＡへの置換を含有するＦｕｃＴＣ遺伝子；
−ＳＥＱＩＤＮＯ：１０の２２４位におけるＧのＡへの置換を含有するＦｕｃＴＤ遺伝子；
−ＳＥＱＩＤＮＯ：１３の９１０位におけるＧのＡへの置換を含有するＦｕｃＴＥ遺伝子；
からなる群から選択されるアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子のノックアウトアレルを提供する。

【0095】

【0096】

本発明に従う植物はさらに、伝統的な育種技法により交配することができ、低減したレベルのアルファ（１，３）−フコシル化および／または低減したレベルのベータ（１，２）−キシロシル化を有する糖タンパク質を含む子孫植物を得るための種子を産生するために用いることができる。

【0097】

本明細書で用いられる際、“含む”は、述べられた特徴、整数、工程または構成要素の言及された通りの存在を明記するものとして解釈されるべきであるが、１個以上の特徴、整数、工程もしくは構成要素、またはそれらの群の存在または追加を除外しない。従って、例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸の配列を含む核酸またはタンパク質は、実際に言及されたものよりも多くのヌクレオチドまたはアミノ酸を含んでいてよく、すなわち、より大きな核酸またはタンパク質中に組み込まれていてよい。機能的または構造的に定義されたＤＮＡ領域を含むキメラ遺伝子は、追加のＤＮＡ領域等を含んでいてよい。

【0098】

別途記載しない限り、実施例において、全ての組み換え技法は、“Sambrook J and Russell DW (編者) (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第３版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ニューヨーク”において、および“Ausubel FA, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA and Struhl K (編者) (2006) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, ニューヨーク”において記述されているような標準的なプロトコルに従って実施される。標準的な材料および参考文献は、“Croy RDD (編者) (1993) Plant Molecular Biology LabFax, BIOS Scientific Publishers Ltd., Oxford and Blackwell Scientific Publications, オックスフォード”において、および“Brown TA, (1998) Molecular Biology LabFax, 第２版, Academic Press, サンディエゴ”において記述されている。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に関する標準的な材料および方法は、“McPherson MJ and Moller SG (2000) PCR (The Basics), BIOS Scientific Publishers Ltd., オックスフォード”において、および“PCR Applications Manual, 第３版 (2006), Roche Diagnostics GmbH, マンハイムまたはwww.roche-applied-science.com”において見付けることができる。

【0099】

本明細書において参照または引用される全ての特許、特許出願、および刊行物または公表（ｐｕｂｌｉｃｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ）（インターネット上の刊行物を含む）は、参照によりそのまま援用される。

【0100】

記述および実施例全体を通して、以下の配列への参照が行われる：
ＳＥＱＩＤＮｏ１：ＦｕｃＴＡゲノムＤＮＡ
ＳＥＱＩＤＮｏ２：ＦｕｃＴＡコード配列
ＳＥＱＩＤＮｏ３：ＦｕｃＴＡタンパク質
ＳＥＱＩＤＮｏ４：ＦｕｃＴＢゲノムＤＮＡ
ＳＥＱＩＤＮｏ５：ＦｕｃＴＢコード配列
ＳＥＱＩＤＮｏ６：ＦｕｃＴＢタンパク質
ＳＥＱＩＤＮｏ７：ＦｕｃＴＣゲノムＤＮＡ
ＳＥＱＩＤＮｏ８：ＦｕｃＴＣコード配列
ＳＥＱＩＤＮｏ９：ＦｕｃＴＣタンパク質
ＳＥＱＩＤＮｏ１０：ＦｕｃＴＤゲノムＤＮＡ
ＳＥＱＩＤＮｏ１１：ＦｕｃＴＤコード配列
ＳＥＱＩＤＮｏ１２：ＦｕｃＴＤタンパク質
ＳＥＱＩＤＮｏ１３：ＦｕｃＴＥゲノムＤＮＡ
ＳＥＱＩＤＮｏ１４：ＦｕｃＴＥタンパク質
ＳＥＱＩＤＮｏ１５：プライマーＶＨ０３１
ＳＥＱＩＤＮｏ１６：プライマーＶＨ０３２
ＳＥＱＩＤＮｏ１７：プライマーＶＨ０３３
ＳＥＱＩＤＮｏ１８：プライマーＶＨ０３４
ＳＥＱＩＤＮｏ１９：ＦｕｃＴサイレンシングＲＮＡをコードする配列
ＳＥＱＩＤＮｏ２０：ＦｕｃＴサイレンシングＲＮＡをコードする配列：ニコチアナ・ベンサミアナＦｕｃＴＢコード配列の一部（１１８３から１２６５まで）：ｇａａａｃｔｇｔｃｔａｔｃａｔｇｔａｔａｔｇｔａｃｇｔｇａａａｇａｇｇｇａｇｇｔｔｔｇａｇａｔｇｇａｔｔｃｃａｔｔｔｔｃｔｔａａｇｇｔｃｇａｇｔｇａｔｔｔｇｔｃｔｔｔ
ＳＥＱＩＤＮｏ２１：ＦｕｃＴサイレンシングＲＮＡをコードする配列：

【0101】

【化1】

【実施例】

【0102】

１．ニコチアナ・ベンサミアナからのＦｕｃＴ遺伝子の単離。

【0103】

ＦｕｃＴＫＯ植物を産生するため、ＦｃｕＴ遺伝子ファミリーの全てのメンバーを同定および単離する必要があった。従って、我々はまずサザンブロット分析によりその遺伝子ファミリーの大きさを決定した。Ｎ．ベンサミアナからのゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＰｓｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｓｉＩ、またはＡｓｅＩで消化し、１％アガロースゲル上で泳動し、ナイロン膜上にブロットした。そのブロットをＮ．ベンサミアナからのＦｃｕＴＡのｃＤＮＡクローン（Strasser et al. (2008) Plant Biotech J. 6:392）とハイブリダイズさせた。曝露後、そのオートラジオグラムはレーンあたり７本に至るまでのハイブリダイズしたバンドを示し、これは最大で７個の遺伝子のファミリーを示している（図１）。

【0104】

このＦｕｃＴ遺伝子ファミリーの全てのメンバーを単離するため、ＡｍｐｌｉｃｏｎＥｘｐｒｅｓｓにより２つのＢＡＣライブラリーを構築した。それぞれが、クローニング酵素としてそれぞれＭｂｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて、ゲノムの２．５倍をカバーしていた。そのライブラリーをＦｕｃＴＡｃＤＮＡプローブを用いてスクリーニングした。合計で３２個のＢＡＣクローンが見付かった。これらのクローンを、それぞれの個々のクローンのハイブリダイゼーションパターンをＮ．ベンサミアナのゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーションパターンと比較するサザンブロット分析に基づいて、異なるファミリーに分類した（図２）。その３２個のクローンの内で、８個はハイブリダイズしなかった。残りのクローンは８個のファミリーに分類することができた。これらのファミリーの５個は、Ｎ．ベンサミアナのゲノムのサザンブロットハイブリダイゼーションにおけるバンドと重なるハイブリダイゼーションパターンを示した。

【0105】

それぞれのＢＡＣクローンファミリーの１つの代表を、４５４配列決定技術を用いて配列決定し、ＦｕｃＴＡｃＤＮＡの配列を用いたＢＬＡＳＴ相同性検索により、ＦｕｃＴ遺伝子の存在に関して分析した。この方法で試験した８個のファミリーの内で、５個はＦｕｃＴ配列を含有し、それらは全てＦｕｃＴＡのコード配列に関する完全長であった。これらの５個の遺伝子をＦｕｃＴＡ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｄ、および−Ｅと名づけた。これらの５個のＦｕｃＴ遺伝子の配列を、それぞれＳＥＱＩＤＮＯ１、ＳＥＱＩＤＮＯ４、ＳＥＱＩＤＮＯ７、ＳＥＱＩＤＮＯ１０、およびＳＥＱＩＤＮＯ１３において示す。

【0106】

これらのコンティグおよび公開されたＦｕｃＴＡｃＤＮＡの配列を用いたＥＳＴ２Ｇｅｎｏｍｅ(Mott (1997) Comput. Applic. 13:477)分析は、ＦｕｃＴＥを除く全ての遺伝子がＡ．サリアナのＦｕｃＴ−Ａおよび−Ｂ遺伝子と比較した場合に同じ数のイントロンを有し、そのイントロン−エキソン境界もこれらの２つの種の間で保存されていることを示した。驚くべきことに、Ｎ．ベンサミアナのＦｕｃＴＥ遺伝子中にはイントロンは見付からなかった。ＦｕｃＴ−Ｄ遺伝子は７８３３ｂｐの異常に大きなイントロン１を含有することが分かった。

【0107】

ＴＳＳＰ(Shahmuradov et al. (2005) Nucl. Acids Res. 33:1069)を用いたプロモーター要素に関する上流の配列の分析は、ＦｕｃＴＥを除く全ての遺伝子が高い信頼度で予測されたＴＡＴＡ領域を有することを示した。加えて、ＦｕｃＴＥ遺伝子のアミノ酸配列の分析は、それが２８８位においてチロシンのアスパラギン酸への置換（Ｙ２８８Ｄ）を含有することを示した。この位置は高度に保存された供与体基質結合部位（“モチーフＩＩ”）の一部であり、このチロシン残基の変異はヒトのＦｕｃＴＶＩの酵素活性を完全に不活性化することが示されている(Jost et al. 2005 Glycobiology 15:165)。対照的に、全ての他のＮ．ベンサミアナのＦｕｃＴ遺伝子はこの位置に保存されたチロシン残基を含有する。まとめると、これはＦｕｃＴＥはおそらく不活性なＦｕｃＴ酵素をコードする不活性な遺伝子であることを示している。

【0108】

最後に、その遺伝子の間の相同性を決定するため、我々はその遺伝子の引き出されたコード配列をＣｌｏｎｅｍａｎａｇｅｒプログラムを用いてヌクレオチドレベルでアラインメントし、結果としてＦｕｃＴ遺伝子ファミリーは２つの群に分けられた：ＦｕｃＴＡおよびＦｕｃＴＢが１つの群を形成し、ＦｕｃＴＡは以前に公開されたＮ．ベンサミアナＦｕｃＴＡｃＤＮＡ(Strasser et al. (2008) Plant Biotech J. 6:392)に対して１００％の同一性を有する。ＦｕｃＴＡおよび−Ｂのコード領域は９６％の同一性を有する。その２個の遺伝子の間の主な目立つ違いは、ＦｕｃＴＢは中途での停止コドンのためより短いコード配列を有することである。ＦｕｃＴＣ、ＦｕｃＴＤおよびＦｕｃＴＥは第２の群を形成する。３個の遺伝子全てがそのコード領域において９６％の同一性を有する。その２個の群からの遺伝子は８０％の相対的同一性を共有している。

【0109】

２．ＥＭＳによる突然変異誘発
我々はそれぞれのＦｕｃＴ遺伝子に関するヌル変異の選択に至る（ｃｏｍｅｔｏ）ためにＥＭＳによる突然変異誘発を用いた。エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）は、グアニン（Ｇ）をアルキル化することにより、ＧのＡへの、およびＣのＴへの点変異を引き起こす。これらの点変異は、それらが停止コドンまたはスプライス部位の変異を誘発することによりヌル変異を生成した場合、遺伝子をノックアウトし得る。この方法を用いて、我々は全てのＦｕｃＴ遺伝子に関するノックアウトに関してスクリーニングすることができる。これらの変異体を交配した後、完全ノックアウトが達成されるであろう。

【0110】

Ｍ２種子産生に関する最適なＥＭＳ用量の決定。

【0111】

異なるＥＭＳ用量および結実（ｓｅｅｄｓｅｔ）、発芽および植物の表現型への作用を試験した。これは、Ｎ．ベンサミアナにおけるＥＭＳに誘発されるＦｕｃＴのノックアウトを見付けるための最適なＥＭＳ用量を見出すために必要であった。

【0112】

ＥＭＳによる突然変異誘発に関する最適用量を、種子を０、５０、７５、１００、１５０、および２００ｍＭのＥＭＳで処理することにより決定した。簡潔には、種子を室温で２時間浸し、室温で４時間ＥＭＳで処理し、室温で１５分間の洗浄を５回行った。種子を一夜乾燥させ、すぐに播種した。発芽、幼苗致死および植物の稔性への作用を記録した。Ｎ．ベンサミアナはＮ．デブネイ（Ｎ．ｄｅｂｎｅｙｉ）およびＮ．スアベオレンス（Ｎ．ｓｕａｖｅｏｌｅｎｓ）の組み合わせからの複二倍体種である可能性が最も高いため(Goodspeed, T. H. 1954 Pages 485-487 in: The Genus Nicotiana: Origins, Relationships and Evolution of its Species in the Light of Their Distribution, Morphology and Cytogenetics. Chronica Botanica、米国マサチューセッツ州ウォルサム)、それらも最初はその試験に含まれた。しかし、それらはＮ．ベンサミアナと比較してＥＭＳに対する感受性が低いことが示されたため（データは示していない）、それらは稔性試験には用いられなかった。ＥＭＳ処理は発芽の遅れを引き起こしたが（図３Ａ）、７５ｍＭＥＭＳまで致死性は検出されなかった。より高いＥＭＳ用量では致死率が急速に上昇し、１５０ｍＭではその処理を生き延びた種子はなかった（図３Ｂ）。稔性は５０ｍＭにおいて既に影響を受けた。その種子を７５ｍＭで処理することにより、Ｍ１植物のおおよそ６０％が不稔であった（図３Ｃ）。これらの結果に基づいて、最適なＥＭＳ用量を７５ｍＭに設定した。

【0113】

ＥＭＳにより突然変異誘発された植物およびＦｕｃＴ変異体に関してスクリーニングするためのＭ２集団のＤＮＡ試料の産生
我々の変異体を見付けるよい機会を有するため、我々は約１００００の植物をスクリーニングする必要があった。７５ｍＭのＥＭＳ用量を用いることにより１００００より多くのＭ２植物を得るため、我々は少なくとも２００００のＭ１植物を生長させる必要があった。決定された密度および世代時間において、７０００のＭ１植物を４ヶ月で生長させることができた。従って、少なくとも３つのＭ１集団を生長させる必要があった。

【0114】

Ｍ２種子を播種し、そのＭ２のＮ．ベンサミアナ植物の葉の試料に対してＤＮＡ抽出を行った。そのＤＮＡ抽出は組織内で行われ、組織内のＥｄｗａｒｄｓおよびＫｉｎｇｆｉｓｈｅｒ法に従って植物あたり４個の葉のディスク（ｄｉｓｃｓ）を抽出した。１つのＥＭＳ処理に由来するＤＮＡプレートをＥＭＳ処理単位と定めた。

【0115】

我々は合計で６つのＥＭＳ処理単位を作った。２つの処理単位は失敗した：処理単位２は不十分な変異頻度により、処理単位４はＥＭＳによる突然変異誘発とは無関係の植物の死のために失敗した。まとめると、４つの処理単位が残り、それはそれぞれがＭ２のＮ．ベンサミアナの葉の試料から抽出された９５のＤＮＡ試料の９９のプレートを含んでいた。それぞれのプレートの位置Ｈ１２において、我々はＵＳＤＡ国立生殖質システムからのＮ．ベンサミアナ系統種（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）ＮＢＮＰＧＳ２（系統種コードＰＩ５５５６８４）の内部対照ＤＮＡ試料を含ませた。この系統種はＥＭＳによる突然変異誘発のために用いられたベンサミアナ系統種（すなわち、ＩｃｏｎＧｅｎｅｔｉｃｓＧｍｂＨにより供給された栽培品種“ＢＥＮＴＨＡＭＩＡＮＡ”）と比較していくつかの既知のＳＮＰを含有していた。これらのＳＮＰの位置を表１において要約する。プレートを−７０℃で保管した。

【0116】

【表1】

【0117】

直接配列決定によるＥＭＳに誘発された点変異の検出および一塩基多型（ＳＮＰ）の検出
直接配列分析によるＥＭＳに誘発された点変異の高スループット検出のため、我々はSmits et al. (2006), Pharmacogenet. Genomics 16:159により記述された方法を用いた。その方法はＡｇｏｗａＧｍｂＨ（現在ＬＧＣ実験室サービス（ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｓｅｒｖｉｃｅ）の一部）により我々のために適合された。簡潔には、特定の遺伝子断片をＰＣＲにより個々の植物の葉の組織のＤＮＡから遺伝子特異的なプライマーを用いて増幅した。それぞれのプライマーはその５’末端において、結果として生じるＰＣＲ断片の両方の鎖の配列の分析を可能にするであろう追加の配列を有していた。

【0118】

配列のクロマトグラムを、それらをＮｏｖｏＳＮＰ(Weckx, S. et al. 2005 Genome Research 15:436)でＦｕｃＴＡ、ＦｕｃＴＢ、ＦｕｃＴＣ、ＦｕｃＴＤおよびＦｕｃＴＥの配列と比較することにより、一塩基多型（ＳＮＰ）に関して分析した。

【0119】

突然変異誘発の検出のための標的領域の定義。

【0120】

直接配列決定によるＳＮＰの検出は５００ｂｐの配列断片に限られていたため、ＥＭＳを用いて突然変異誘発した際にヌル変異を生成する最も高い見込みを有するＦｕｃＴＡ〜Ｅ遺伝子中の５００ｂｐの領域を同定する必要があった。従って、我々は（１）１回のＧのＡへの、またはＣのＴへの変異により停止コドンに変化し得るコドンおよび／またはスプライス供与部位および受容部位の最も高い密度を有し、かつ（２）触媒ドメインまたは保存されたドメインの中または上流に位置する領域を同定する必要があった。

【0121】

停止またはスプライス変異の候補の最も高い密度を見付けるため、我々は１回のＥＭＳ変異により停止コドンまたはスプライス変異体に変異し得るコード配列中の全てのコドンを同定するアルゴリズムを用いた。

【0122】

ＦｕｃＴ遺伝子内の突然変異誘発の検出のために２つの一般的な標的が定められた：
我々の第１の標的に関して、我々の選択はα１，３−ＦｕｃＴの“モチーフＩＩ”ならびにモチーフＩＩの上流の２個の他のモチーフである“Ｍｎ結合”および“ＳＳＤモチーフ”に関する共有された保存されたアミノ酸配列に基づいた(Jost et al. 2005 Glycobiology 15:165; Wilson et al. 2001 Biochim Biophys Acta. 1527:88)。従って、標的として我々は上記の“モチーフＩＩ”および“Ｍｎ結合、ＳＳＤモチーフ”の間のエキソンを選んだ。ＦｕｃＴＡ〜Ｄ遺伝子に関して、これはエキソン３であり（ＦｕｃＴＡに関してＳＥＱＩＤＮｏ１のヌクレオチド２８３３〜３０７４；ＦｕｃＴＢに関してＳＥＱＩＤＮｏ４のヌクレオチド２８１３〜３０５４、ＦｕｃＴＣに関してＳＥＱＩＤＮｏ７のヌクレオチド２５６５〜２８０６、およびＦｕｃＴＤに関してＳＥＱＩＤＮｏ１０のヌクレオチド９６８５〜９９２６）、全て２４１ｂｐの長さを有し；ＦｕｃＴＥ（１個のエキソンのみからなる）に関して我々は３２０ｂｐの断片を選んだ（ＳＥＱＩＤＮｏ１３のヌクレオチド５９２〜９１２）。

【0123】

我々は変異の発見においてより多くの機会を有するために第２の標的をスクリーニングした。我々は、停止コドンに変化し得るコドンの最も高い密度を有するエキソン１（ＦｕｃＴＡに関してＳＥＱＩＤＮｏ１のヌクレオチド１〜３５４、ＦｕｃＴＢに関してＳＥＱＩＤＮｏ４のヌクレオチド１〜３５４、ＦｕｃＴＣに関してＳＥＱＩＤＮｏ７のヌクレオチド１〜３９６、およびＦｕｃＴＤに関してＳＥＱＩＤＮｏ１０のヌクレオチド１〜３９６）およびＦｕｃＴＥに関して３９６ｂｐの断片（ＳＥＱＩＤＮｏ１３のヌクレオチド１〜３９６）を選んだ。

【0124】

変異体に関するスクリーニングはＦｕｃＴＥおよびＦｕｃＴＡを除く全ての遺伝子に関して停止コドン変異体をもたらし、その内で後者はスプライス部位変異体のみをもたらしたため、ＦｕｃＴＡ遺伝子に関して第３の標的を含めることが決定された。この標的はエキソン２中に位置していた（ＳＥＱＩＤＮｏ１のヌクレオチド１０９８〜１２５８）。

【0125】

それぞれの遺伝子に関して、停止コドンまたはスプライス部位変異を引き起こす可能性のあるＳＮＰを表２および３において標的ごとに列挙する。エキソン１を標的として用いることは、はるかにより多くの可能性のある停止コドンまたはスプライス部位変異体の位置を与えるはずであることは明らかである。しかし、これらの変異は、変異の下流のＡＴＧが新しい開始コドンとして機能し得る可能性があるため、有効なノックアウト変異体をもたらすより低い信頼度を有していた。次いでこれは膜貫通ドメインを欠くタンパク質を産生する可能性があり、それはなお活性なグリコシルトランスフェラーゼ活性を有し得る(Jost et al., 2005, Glycobiology 15:165)。

【0126】

【表2】

【0127】

【表3-1】

【0128】

【表3-2】

【0129】

異なるＦｕｃＴ遺伝子における可能性のあるノックアウト変異に関する異なるＥＭＳで突然変異誘発した集団のスクリーニングの結果
ＦｕｃＴ遺伝子に関して、以下の数のＥＭＳ系統をスクリーニングした：４２７５系統のＭ２個体をＦｕｃＴＡにおける変異に関してスクリーニングし、ＦｕｃＴＢに関して８０７５系統、ＦｕｃＴＣに関して６５５５系統、ＦｕｃＴＤに関して６２７０系統およびＦｕｃＴＥに関して４３７０系統のＭ２個体をスクリーニングした。以下の数の推定上のヌルアレルを同定した：ＦｕｃＴＡにおいて３系統、２系統はスプライス部位変異、１系統は停止コドン変異であり、それぞれＦｕｃＴ００１、ＦｕｃＴ００４、およびＦｕｃＴ０１３と名付けられた。２系統の推定上のヌルアレルがＦｕｃＴＢに関して同定され、それぞれ１系統はスプライス部位変異、１系統は停止コドン変異であり、ＦｕｃＴ００６およびＦｕｃＴ００８と名付けられた。ＦｕｃＴＣに関して、４系統の推定上のヌルアレルが同定され、それぞれ１系統はスプライス部位変異、３系統は停止コドン変異であり、ＦｕｃＴ００７、ＦｕｃＴ０１０、ＦｕｃＴ０１１およびＦｕｃＴ０１２と名付けられた。ＦｕｃＴＤに関して、１系統のスプライス部位変異および１系統の停止コドン変異が同定され、ＦｕｃＴ００５およびＦｕｃＴ００９と名付けられた。最後に、ＦｕｃＴＥに関して、停止コドン変異は同定されなかった。代わりに、置換変異を有する２系統のアレルが同定され、ＦｕｃＴ００２およびＦｕｃＴ００３と名付けられた。そのＦｕｃＴ００３置換は保存された“モチーフＩＩ”中に位置していた。

【0130】

表４は、ＦｕｃＴ遺伝子に関するスクリーニングの結果：変異の位置、変異の配列および変異のタイプを要約する。

【0131】

【表4】

【0132】

３．全てのＸｙｌＴおよびＦｕｃＴ遺伝子のノックアウト変異体に関してホモ接合型のＮ．ベンサミアナ植物：７重ノックアウト植物を産生するための交配スキーム。

【0133】

我々は、変異が同定されていた元のＭ２種子のロットから２４系統の植物を播種およびスクリーニングすることにより、表４において列挙した全ての系統に関してホモ接合型の変異体を回収した。これらの植物のそれぞれからのＤＮＡ試料を、上記で記述した直接配列決定技法を用いてスクリーニングした。我々は変異体ＦｕｃＴ０１３を回収することができなかった。

【0134】

この方法で選択されたホモ接合型変異体を自家受粉させて安定な変異体種子ロットを作り出した。加えて、選択された数の変異体を、変異薬物（ｄｒａｇ）の全部ではなくてもほとんどを排除するため、“ＢＥＮＴＨＡＭＩＡＮＡ”系統種を用いた５重戻し交配スキームに入れた。最後に、選択された数の変異体を交配スキームに入れて７重ノックアウト植物を産生した。その交配スキームを図４において示す。その７重ノックアウト植物を産生するために用いられた最後の変異体のセットは以下の通りであった：ＸＹＬ００１（国際公開第２０１０１４５８４６号において記述されているようなＸｙｌＴｇ１４−１）、ＸＹＬ００２（国際公開第２０１０１４５８４６号において記述されているようなＸｙｌＴｇ１９−１）、ＦｕｃＴ００３、ＦｕｃＴ００４、ＦｕｃＴ００６、ＦｕｃＴ００７、ＦｕｃＴ００９。最後のＦｕｃＴ変異体のセットの選択は、遺伝子転写アッセイおよび相補性アッセイに基づいた。両方を下記で記述する。

【0135】

上記で記述した戻し交配および交配スキームにおいて変異体アレルの接合状態を迅速かつより経済的に同定することを可能にするため、ＥｎｄＰｏｉｎｔＴａｑＭａｎアッセイがＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅにより設計された。これのためのＲＴ−ＰＣＲ分析が組織内で行われた。ＴａｑＭａｎプローブは、その５’末端に結合した蛍光レポーター色素および３’末端に連結された消光部分を有するオリゴヌクレオチドである。これらのプローブはＰＣＲ産物の内部領域にハイブリダイズするように設計される。ハイブリダイズしていない状態では、その蛍光および消光分子の近接がそのプローブからの蛍光シグナルの検出を妨げる。ＰＣＲの間、ポリメラーゼがその上にＴａｑＭａｎプローブが結合している鋳型を複製した際に、そのポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性がそのプローブを切断する。これはその蛍光および消光色素の連結を解く。そうして、蛍光がそれぞれのサイクルにおいてプローブ切断の量に比例して増大し、それは今度はその標的の接合状態のレベルに関連している。従って、内部標準と比較した際に、その蛍光のレベルを接合状態のレベル：“野生型”、“ヘテロ接合型”および“ホモ接合型”に変換することができる。

【0136】

４．ＦｕｃＴ遺伝子の連鎖分析。

【0137】

ＦｕｃＴ遺伝子のいずれかが遺伝的に連鎖しているかどうかを決定するため、我々は系統種“ＢＥＮＴＨＡＭＩＡＮＡ”およびＮＢＮＰＧＳ２（ＵＳＤＡ国立生殖質システム系統種ＰＩ５５５６８４；表１も参照）において全てのＦｕｃＴ遺伝子中のＳＮＰを利用して連鎖分析を実施した。この目的のため、ＢＥＮＴＨＡＭＩＡＮＡおよびＮＢＮＰＧＳ２を交配し、そのＦ１をＢＥＮＴＨＡＭＩＡＮＡと交配し、次のＢＣ１世代からの５７６系統の個体のＦｕｃＴ遺伝子型を分析した。

【0138】

ＦｕｃＴ遺伝子のいずれの間にも連鎖が存在しない場合、アレルは異なる個体の遺伝子型にわたって見掛け上ランダムに分布するであろう。２個以上のＦｕｃＴ遺伝子の間に連鎖が存在する（ｅｘｉｔｓ）場合、これはその個体のおおよそ５０％が２個以上の特定のＦｕｃＴ遺伝子に関してホモ接合型であることとして現れるであろう。分析した９６系統の集団において後者が観察されなかったため、我々はその５個のＦｕｃＴ遺伝子が連鎖していないと結論付けた。

【0139】

５．異なるＦｕｃＴ遺伝子が転写されているかどうかの決定。

【0140】

完全ノックアウト植物のための交配スキームは５世代を超えると考えられるため、我々はこのタイムラインを短縮する機会を探した。１つの可能性は、その５個のＦｕｃＴ遺伝子のいずれかが発現されていないかどうかを調べることであった。これを決定するため、我々はＦｕｃＴ転写産物を葉のｍＲＮＡから広い特異性を有するプライマーセットを用いて増幅した。次いで我々はこの増幅の結果得られた個々のｃＤＮＡをクローニングおよび配列決定した。従って、このクローンのセットの配列分析は、ＦｕｃＴ遺伝子が発現されていたかどうか、およびどのＦｕｃＴ遺伝子が発現されていたかを明らかにするはずである。加えて、我々はＦｕｃＴ遺伝子間で保存されている領域にハイブリダイズするプライマーを用いたため、我々は我々がＢＡＣスクリーニングにおいて見逃していた可能性のある追加の遺伝子を拾い上げることができるであろう。

【0141】

ｃＤＮＡを、Ｎ．ベンサミアナの葉から抽出したｍＲＮＡからｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）キットのプロトコルに従って調製した。

【0142】

我々は、これらのｃＤＮＡ試料に対して、ＦｕｃＴＡのＣＤＳに基づいて遺伝子間のＳＮＰを考慮して設計したプライマーを用いてＰＣＲを実施した。プライマーの組み合わせ１（ＰＣ１）として記述されるプライマーＶＨ０３１（ＳＥＱＩＤＮＯ．１５）およびＶＨ０３２（ＳＥＱＩＤＮＯ．１６）を用いて、５７０ｂｐの断片が増幅されるであろう。プライマーＶＨ０３３（ＳＥＱＩＤＮＯ．１７）およびＶＨ０３４（ＳＥＱＩＤＮＯ．１８）により形成されるプライマーの組み合わせ２（ＰＣ２）を用いて、３８４ｂｐの断片が増幅されるであろう。そのＰＣＲは、５６℃（ＰＣ２）および６２℃（ＰＣ１）のアニーリング温度で、標準的なＰＣＲ混合物［５０μｌの総体積中、１０μｌＧｏＴａｑ緩衝液５×；１μｌｄＮＴＭ１０ｍＭ；１μｌ順方向プライマー１０μＭ；１μｌ逆方向プライマー１０μＭ；０．４μｌＴａｑポリメラーゼ５Ｕ／μｌ；２μｌ精製されたＰＣＲ産物］および標準的なプロトコル［２分間９４℃；３０×［３０秒間９４℃、３０秒間５６℃／６２℃、３０秒間７２℃］、１０分間７２℃］を用いて運転された。

【0143】

結果として得られたＰＣＲ産物をＱｕｉａｇｅｎＰＣＲ精製キットを用いて精製し、ＰＧｅｍＴＥａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）中にクローニングし、商業的なｔｈｅｒｍｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に形質転換した。１００μｌを１００μｇ／ｍｌトリアセリン（ｔｒｉａｃｅｌｌｉｎｅ）を含有するＬＢプレート上にまいた。プライマーの組み合わせＰＣ１から得られた１９２個のクローンおよびＰＣ２から得られた９６個のクローンを、ＡＧＯＷＡにより配列決定した。５個のＦｕｃＴ配列中のＳＮＰに基づいて、異なるＦｕｃＴ遺伝子のどれが発現されたかを識別することが可能であった。

【0144】

ＰＣ１に関して、１４８個のクローンが使用可能な配列情報を与え、結果として６１個のクローンがＦｕｃＴＡに、５８個のクローンがＦｕｃＴＢに、２個のクローンがＦｕｃＴＣに、２７個のクローンがＦｕｃＴＤに相同性であり、ＦｕｃＴＥに相同性であるクローンはなく、４４個の試料は配列決定により失敗した。ＰＣ２の９６個のクローンを調べて、我々はＦｕｃＴＡに相同性の１５個のクローン、ＦｕｃＴＢに相同性の３９個のクローンを見付け、ＦｕｃＴＣに相同性のクローンは見付からず、ＦｕｃＴＤに相同性の１２個のクローンを見付け、そしてＦｕｃＴＥに相同性のクローンは見付からず、３０個の試料は配列決定により失敗した。加えて、その２つのプライマーの組み合わせは新規のＦｕｃＴ配列を全くもたらさなかった。

【0145】

まとめると、これはおそらくＦｕｃＴＥを除く全てのＦｕｃＴ遺伝子がＮ．ベンサミアナの葉において発現していることを示した。これらの発見は、実施例１で示されたＴＳＳＰ予測データを確証している。加えて、これらの結果は、おそらくＢＡＣスクリーニングにより同定された５個以外に他のＦｕｃＴ遺伝子は存在しないことを示した。

【0146】

ＦｕｃＴＥはＮ．ベンサミアナの葉において発現していないようであったため、我々はＦｕｃＴＥ遺伝子を７重ノックアウト植物のための交配スキームに組み入れる最後の１個として残しておくことに決定した（図４における“世代４”を参照）。

【0147】

６．相補性アッセイはどのＦｕｃＴ遺伝子がおそらく活性でありどの変異がおそらくヌル変異であるかを示す。

【0148】

個々のＦｕｃＴ遺伝子の機能性を決定するため、そして我々のＥＭＳスクリーニングから単離された推定上のヌル変異が真のヌルまたはノックアウト変異体であるかどうかも決定するため、我々は相補性アッセイを考案した。このアッセイにおいて、補完されるべき変異体は、ＦｕｃＴおよびＸｙｌＴ遺伝子がＴ−ＤＮＡの挿入によりノックアウトされたアラビドプシス・サリアナ系統（“３重ノックアウト変異体”）であった。この系統はKang et al. (2008) Proc Natl Acad Sci USAにより記述されており、我々の実験室でもＳＡＬＫから入手可能な３つの異なるＴ−ＤＮＡノックアウト系統を交配することにより作り出された（国際公開第２０１０１２１８１８号参照）。

【0149】

その系を設定するため、我々はまずそのアラビドプシス３重変異体をそのＮ．ベンサミアナＦｕｃＴ遺伝子のいずれか１つを用いて補完することができるかどうかを試験した。我々はそのアラビドプシス３重変異体をアグロバクテリウム浸漬法を用いてＣａＭＶ３５Ｓプロモーターにより駆動されるＦｕｃＴ遺伝子の１つのｃＤＮＡ配列を含有するＴ−ＤＮＡにより形質転換した。そのｃＤＮＡ配列は、予測されたその遺伝子のコード配列およびイントロン−エキソン境界に基づいて合成により産生された。ｂａｓｔａ（グルフォシネート）を用いたその形質転換体の選択の後、葉の組織からのタンパク質試料を、コアのα１，３フコースを含有するグリカンの存在に関してウェスタンブロットを用いて抗コアα１，３フコース抗体で調べて分析した。この抗体は、Faye et al. (1993) Anal Biochem 209:104により記述された通りに調製された。図５（左のパネル）において、その結果は、そのＡ．サリアナ３重変異体をＮ．ベンサミアナのＦｕｃＴＡｃＤＮＡにより補完することができることを示している。野生型の対照のレーンは、コアのα１，３フコースに対する抗体の結合により産生される明確な化学発光シグナルを示している。Ａ．サリアナ３重変異体からのタンパク質試料を含有するレーンでは化学発光シグナルは検出されなかった。これは、内在性のＦｕｃＴ遺伝子の不活性化の結果としてのコアのα１，３フコースの非存在により引き起こされた。対照的に、ＦｕｃＴＡｃＤＮＡを用いて形質転換したいくつかの異なる個々の３重変異体からのタンパク質を含有するレーンでは明確なシグナルを検出することができた。まとめると、これはその相補性アッセイを用いてＮ．ベンサミアナのＦｕｃＴ遺伝子が活性であるかどうかを決定することができることを示している。

【0150】

このアッセイを用いて、我々はＦｕｃＴＢおよびＦｕｃＴＥを除く全ての遺伝子が補完することができ、従って活性な遺伝子であることを示した（データは示していない）。ＦｕｃＴＢはＦｕｃＴＡに対してそのＦｕｃＴタンパク質のＣ末端から４１アミノ酸を取り除く中途での停止コドンを除いて１００％相同性であるため、ＦｕｃＴＢは補完することができず、従っておそらく不活性な遺伝子であるという事実は意外であった。相補性アッセイに基づく、ＦｕｃＴＥはおそらく不活性な遺伝子であるという事実は、この遺伝子もＮ．ベンサミアナの葉において転写されていないようであり、モチーフＩＩ中に不活性化するＹ２８８Ｄ置換を含有するという発見と一致する。

【0151】

次に、我々はこの相補性アッセイを用いて、ＥＭＳで突然変異誘発した集団から分離された推定上のヌル変異が実際にそれぞれのＦｕｃＴ遺伝子を不活性にするかどうかを決定した。図５の右のパネルは、ＥＭＳ変異が８番目の可能性のある停止コドン（２１７位；表３のＦｕｃＴＡ遺伝子を参照）において模擬的に再現された（ｓｉｍｕｌａｔｅｄ）ＦｕｃＴＡを用いた相補性アッセイの結果を示す。“Ａｔ３ＫＯ＋ｍｕｔＦｕｃＴＡ（エキソン１における停止）と表記した区画におけるレーン１〜５における化学発光シグナルの非存在から、このＦｕｃＴＡの変異版は３重ノックアウト変異体を補完することができないことは明白である。化学発光の非存在は、その植物が形質転換されていないという事実により引き起こされたものでも（そのレーンのそれぞれの下の“コピー数”を参照）、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより決定した場合にその変異した遺伝子が発現されていなかったという事実により引き起こされたものでもなかった（データは示していない）。従って、我々は、この変異はヌル変異であると考えることができると結論付けることができる。

【0152】

我々は続いて、この相補性分析を、我々がＥＭＳ集団中で見付けたＦｕｃＴＡ、−Ｃ、および−Ｄ遺伝子に関する全ての推定上のヌル変異に適用した。ＦｕｃＴＢおよび−Ｅ変異は、それらの野生型遺伝子が補完することができなかったため、分析しなかった。

【0153】

まず、ＦｕｃＴＡ（イントロン３および１；それぞれＦｕｃＴ００１、および−００４）およびＦｕｃＴＣ（イントロン２；ＦｕｃＴ００７）に関して同定されたスプライス部位変異体に関して補完を調べた（表４）。ＦｕｃＴＤに関するスプライス部位変異は、イントロンの大きさ（７８３３ｂｐ）のため、分析しなかった。ＦｕｃＴＡおよび−Ｃ変異を分析するため、我々はその３重ノックアウト変異体を、それら自身のイントロン３、１、または２を含有するＦｕｃＴＡまたはＦｕｃＴＣＣＤＳを用いて形質転換し、これらの遺伝子を用いて得られた補完をスプライス部位変異を含有する遺伝子と比較した。その結果は、ＦｕｃＴＡに関して変異体ＦｕｃＴ００１はヌル変異ではなく、一方でＦｕｃＴ００４はヌル変異である可能性が非常に高いことを示した（データは示していない）。ＦｕｃＴＣに関して、イントロンスプライス部位変異は、イントロン３を含有するＦｕｃＴＣＣＤＳを用いて形質転換された３重ノックアウト植物はその変異体の表現型を補完しなかったため、評価することができなかった。しかし、遺伝子予測プログラムＦＧＥＮＥＳＨはＦｕｃＴＣのスプライス部位変異に関する強力に破壊的な作用を予測しなかった。

【0154】

次の補完アッセイに基づいて、我々は変異体ＦｕｃＴ００４（ＦｕｃＴＡ）、ＦｕｃＴ０１０、−０１１、および−０１２（ＦｕｃＴＣ）、ならびにＦｕｃＴ００９（ＦｕｃＴＤ）はヌル変異体であることを確証した（データは示していない）。我々がその相補性アッセイからの全てのデータを手元に有する時点までに、我々は既にＦｕｃＴ００４、−００７、および−００９の交配を進めていたため、我々はそれらを用いて続行し、他の変異体をバックアップ変異体ＦｕｃＴとして用いた。我々の交配戦略は、まず完全ノックアウト植物を作り出すための最も可能性の高い戦略として５重ノックアウト変異体（ＸＹＬ００１、ＸＹＬ００２、ＦｕｃＴ００４、ＦｕｃＴ００７、およびＦｕｃＴ００９）の達成に向けられた。我々の第２の戦略は、さらにＦｕｃＴ００６およびＦｕｃＴ００３を導入することにより７重ノックアウトを作り出すことに向けられた（それぞれ図４中の世代４および５を参照）。

【0155】

７．７重ノックアウト植物：全てのＦｕｃＴおよびＸｙｌＴ遺伝子におけるヌル変異に関してホモ接合型のＮ．ベンサミアナ植物のグリカン分析。

【0156】

７重ノックアウト植物を産生する一方で、我々は３重、４重、および５重ノックアウト植物も交配スキームの副産物として産生した。我々はこれらの植物を、連続したＦｕｃＴ遺伝子のノックアウトが相加作用を有するかどうか、そして従ってＦｕｃＴ−Ｂおよび−Ｅ遺伝子が相補性アッセイから示唆されたように実際に不活性であるかどうかを評価するために用いた。

【0157】

図６は、結合した抗α１，３フコース抗体からの化学発光シグナルの減少により示されるように、より多くのＦｕｃＴ遺伝子のノックアウトがコアのα１，３フコシルトランスフェラーゼ活性をその変異体植物から進行的に取り除くことを明確に示している。この結果は、おそらくＦｕｃＴＢおよび−Ｅ遺伝子がなおいくらかのフコシルトランスフェラーゼ活性を、これは検出されなかったが、有していることを示している（すなわち、レーン“ａＢｃｄＥ”を“ａｂｃｄＥ”に対して比較、およびレーン“ａｂｃｄＥ”を“ａｂｃｄｅ”に対して比較）。

【0158】

ノックアウトアレルＦｕｃＴ００４、ＦｕｃＴ００６、ＦｕｃＴ００７、ＦｕｃＴ００９、およびＦｕｃＴ００３を含有する、５個のＦｕｃＴ遺伝子ＦｕｃＴＡ、ＦｕｃＴＢ、ＦｕｃＴＣ、ＦｕｃＴＤおよびＦｕｃＴＥがノックアウトされている植物の種子は、国立産業、海洋および食品細菌保存機関（ＮａｔｉｏｎａｌＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌ，ＭａｒｉｎｅａｎｄＦｏｏｄＢａｃｔｅｒｉａ）（ＮＣＩＭＢ），ＮＣＩＭＢＬｔｄ，ＦｅｒｇｕｓｏｎＢｕｉｌｄｉｎｇ，ＣｒａｉｂｓｔｏｎｅＥｓｔａｔｅ，Ｂｕｃｋｓｂｕｒｎ，ＡｂｅｒｄｅｅｎＡＢ２１９ＹＡ，Ｓｃｏｔｌａｎｄに、２０１１年９月１２日に、受入番号ＮＣＩＭＢ４１８６０の下で、ＢａｙｅｒＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅＮＶ，Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｐａｒｋ３８，ＢＥ−９０５２Ｇｅｎｔ，Ｂｅｌｇｉｕｍにより寄託されている。寄託者であるＢａｙｅｒＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅＮＶ（出願者へのこの発明の譲渡人）は、その登録事務所をＪ．Ｅ．Ｍｏｍｍａｅｒｔｓｌａａｎ１４，１８３１Ｄｉｅｇｅｍ，Ｂｅｌｇｉｕｍにおいて有するＢａｙｅｒＣｒｏｐＳｃｉｅｎｃｅＮＶと、およびその中に合併された。

【0159】

その４重（“ａｂｃｄＥ”）および５重植物（“ａｂｃｄｅ”）においてどの特定のグリカンレベルが低減しているかを決定するため、そしてどのタイプのグリカンが存在しているかも決定するため、我々は上記で言及した植物の葉からの総可溶性内因性タンパク質から単離されたグリカンに対してＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を実施した。結果を表５において要約し、図７において示す。

【0160】

野生型ならびに４重および５重ＫＯ植物中のグリカンを比較した際、フコース含有グリカンのレベルが、完全には消滅していないとはいえ、急激に低減していることは明らかである。対照的に、キシロースのみを有する（すなわちフコースを有しない）グリカンのレベルは急激に増大している。同様の結果がStrasser et al.によりＡ．サリアナにおけるＦｕｃＴノックアウトに関して報告されている(Strasser et al. 2004, FEBS Lett 561:132)。

【0161】

最後に、我々は全てのＦｕｃＴおよびＸｙｌＴ遺伝子が変異し、ノックアウトされている完全ノックアウト植物（７ＫＯ）におけるグリカンの量および質を分析した。結果を表５および図８において要約する。

【0162】

野生型植物を５ＫＯおよび７ＫＯ植物と比較すると、フコース、キシロースのどちらかまたは両方を含有する全てのグリカンにおける強い低減が観察される。５ＫＯおよび７ＫＯ植物を比較した場合、我々の以前の２重ＸｙｌＴノックアウト植物に関する結果（国際公開第２０１０１４５８４６号）から予想されたように、全てのキシロース含有グリカンが７ＫＯのスペクトルから消失していることは明らかである。また、５ＫＯ植物におけるキシロースおよびフコースの両方を含有するグリカンを表す棒が、フコースのみを有するグリカンに移動したように見える（例えば、ＭＭＸＦおよびＭＭＦ；ＧｎＭＸＦおよびＧｎＭＦ；ＧｎＧｎＸＦおよびＧｎＧｎＦを比較）。最後に、７ＫＯ植物から得られたグリカンをＸｙｌＴおよびＦｕｃＴＲＮＡｉ遺伝子を発現する植物(Strasser et al. 2008, Plant Biotech J 6:392)から得られたグリカンと比較した場合、そのスペクトルはほとんど同一である。注目すべき違いは７ＫＯ植物におけるＭＭグリカンの強い存在であり、それはそのＲＮＡｉ植物には存在せず、程度はより低いがＭａｎ４Ｇｎグリカンに関しても同様である。また、その７ＫＯ植物はＲＮＡｉと比較してより高いレベルのＧｎＧｎＦグリカンを有し、逆もまた同様であり、ＲＮＡｉ植物はより高いレベルのＧｎＭおよびＧｎＧｎグリカンを有する。

【0163】

【表5-1】

【0164】

【表5-2】

【0165】

８．Ｎ．ベンサミアナの完全ノックアウト植物においてｍａｇｎＩＣＯＮ（登録商標）を用いて発現させたＩｇＧ１のグリカン分析。

【0166】

７ＫＯ植物の内因性タンパク質上のグリカンの質および量はＸｙｌＴ−およびＦｕｃＴＲＮＡｉ遺伝子を発現している植物の内因性タンパク質上のグリカンの質および量と比較可能であったため、ならびに後者の植物において発現させたＩｇＧ１タンパク質はキシロースまたはフコースを有するグリカンを含有しないことが記述されている（すなわち、それらの内因性タンパク質はフコースを有するという事実にもかかわらず；Nagels et al. 2011, Plant Physiol 155:1103）ため、我々は完全ノックアウト植物において発現させたＩｇＧ１分子上のグリカンが同様にフコースおよびキシロースを有しないであろうかどうかを試験することに決定した。

【0167】

ＩｇＧ１を浸潤の９日後に葉の抽出物からプロテインＧを用いて単離した。精製された抗体の重鎖を還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥから対応するバンドを切り出すことにより単離した。このバンド中の重鎖のタンパク質を、Kolarich et al. (2006) Proteomics 6:3369により記述された通りのＬＣ−ＭＳによるグルカン分析のために用いた。

【0168】

図９は、この分析の結果得られたスペクトルを示す。上のパネルは、グリコシル化されていないペプチドの存在を図説するためのより広い質量スペクトルを示す。ペプチド１（ＥＥＱＹＮＳＴＹ）およびペプチド２（ＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲ）は同じトリプシン消化からの２つの変種である。それらは長さが異なり、それはＮ−グリカンの存在によるトリプシンの立体障害により引き起こされる。結果として、全てのペプチド−グリカンはこのＬＣ−ＭＳスペクトルにおいて２個のピークを生成する：下のパネルにおいて、グリコペプチド１に関して黒で、グリコペプチド２に関して橙色で示す。図９の下のパネルにおいて、１個の主要なグリカンのピークのみをＧｎＧｎに関して見付けることができる。加えて、高マンノースグリカンに関するいくつかの小さなピークも見ることができる（Ｍａｎ７、８、および−９）。しかし、表６において列挙されたＬＣ−ＭＳにより同定された全てのグリコペプチドの完全な要約において、グリコシル化された、およびグリコシル化されていないグリコペプチドの全画分の２．６％に相当するＧｎＧｎＦグリカンの小さい画分が同定された。

【0169】

【表6】

【0170】

７重ノックアウト植物のＦｕｃＴＲＮＡｉ遺伝子との組み合わせは、Ｎ−グリカン上のフコースレベルをさらに低減する
７重ノックアウト植物中のＮ−グリカン上の残留フコース残基の量をさらに減少させる試みにおいて、我々はこれらの植物をｐＧＡＸ３（国際公開第２００９／０５６１５５号）からのＦｕｃＴＲＮＡｉ遺伝子を含有する植物と交配することによりこれらの植物においてＦｕｃＴＲＮＡｉ遺伝子を導入した。その７重ノックアウト遺伝子ならびにＦｕｃＴＲＮＡｉ遺伝子のホモ接合性を、ＥｎｄＰｏｉｎｔＴａｑＭａｎアッセイにより確証した。これらの植物（すなわち７ＫＯ／ＦｕｃＴＲＮＡｉ）からの内因性タンパク質を、ウェスタンブロットにより、およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析により分析した。

【0171】

図１１におけるウェスタンブロット分析の結果は、ＦｕｃＴＲＮＡｉ遺伝子を７重ノックアウト植物に追加することは、６または７個の遺伝子がノックアウトされている植物からのタンパク質を含有するレーンと比較した場合の７ＫＯ／ＦｕｃＴＲＮＡｉ植物からのタンパク質を含有するレーンからの化学発光シグナルの完全な非存在により示されるように、Ｎ−グリカンからコアのα１，３フコース残基をさらに取り除くことを明確に示している。１時間の延長された曝露の後でさえも、７ＫＯ／ＦｕｃＴＲＮＡｉのレーンにおいてシグナルを検出することはできなかった。

【0172】

特定のグリカンレベルを決定するため、７ＫＯ／ＦｕｃＴＲＮＡｉ植物の葉からの総可溶性内因性タンパク質から単離されたグリカンに対してＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を実施した。

【0173】

７ＫＯ／ＦｕｃＴＲＮＡｉ植物のグリカンを野生型、４重、５重および７重ＫＯ植物と比較した場合、ＭＭＦ、ＧｎＧｎＦおよびＧｎＡＦ（ＬｅａＧｎ）グリカンのフコース含有グリカンのレベルがごく痕跡量までさらに低減していることは明らかである。７ＫＯ植物の場合と同様に、キシロシル化Ｎ−グリカンは７ＫＯ／ＦｕｃＴＲＮＡｉ植物において（表７において示されるように）完全に消失していた。

【0174】

【表7-1】

【0175】

【表7-2】

【0176】

【表7-3】

【0177】

図１２は、野生型、４重、５重および７重ＫＯ、ＲＮＡｉならびに７ＫＯ／ＦｕｃＴＲＮＡｉ植物の内因性タンパク質上に存在するフコシル化、キシロシル化されたＮ−グリカンそれぞれの定量的概要を示す。

【0178】

Ｎ−グリカン上のフコースレベルをさらに低減するための、ＦｕｃＴＲＮＡｉ遺伝子の７重ノックアウト植物中への導入。

【0179】

７重ノックアウト植物におけるＮ−グリカン上のフコースレベルをさらに低減するため、２個以上のＦｕｃＴ遺伝子に対して１００％相同性である２５個以上のヌクレオチドの多数の区間（ｓｔｒｅｔｃｈｅｓ）が含まれ、組み合わせられて全てのＦｕｃＴ遺伝子を標的とする、全てのＦｕｃＴ遺伝子のサイレンシングを目標とするＲＮＡｉ遺伝子を構築する。例えば、ＦｕｃＴＢコード配列（ＳｅｑＩＤＮｏ５）のヌクレオチド１１８３から１２６５まで（ＳｅｑＩＤＮｏ２０）の断片は、ＦｕｃＴ−Ｂ、−Ｃ、−Ｄ、および−Ｅに１００％相同性である１１８３から１２２６までの４４ヌクレオチドの区間ならびにＦｕｃＴ−Ａおよび−Ｂに１００％相同性である１２１９から１２６５までの４７ヌクレオチドの断片を含有する。この断片（ＳｅｑＩＤＮｏ２０）を、ＳｅｑＩＤＮｏ２１において示されるようなＲＮＡｉ遺伝子へと組み立てる。そのＲＮＡｉ遺伝子の発現は、それをｐＧＡＸ３（国際公開第２００９／０５６１５５号）と同様にＴ−ＤＮＡベクター中にクローニングすることにより、３５Ｓプロモーターにより駆動される。７重ノックアウトＮ．ベンサミアナ植物をこのコンストラクトを用いて形質転換し、内因性タンパク質上の、および例えばＩｇＧ１分子のような異種性にｍａｇｎＩＣＯＮ（登録商標）で発現させたタンパク質上のＮ−グリカンの組成に関して分析する。

【0180】

加えて、そのＦｕｃＴＲＮＡｉ遺伝子を、既存のＢＡＲ遺伝子がＦｕｃＴＲＮＡｉ遺伝子断片により置き換えられているｐＩＣＨ３７８１およびｐＩＣＨ３８３１（国際公開第０２／１０１０６０号）と同様に、プロモーターを有しないＴ−ＤＮＡベクター中にクローニングする。７重ノックアウトＮ．ベンサミアナ植物を、これらのコンストラクトを用いて形質転換する。プロモーターを有しないベクターの使用は、強い構成的プロモーターを有するベクターと比較して、より広い一次形質転換体の選択肢を提供するであろう。そのような場合、そのＲＮＡｉは居住遺伝子（ｒｅｓｉｄｅｎｔｉａｌｇｅｎｅ）との転写融合体の一部になる（そのプロモーターを有しないベクターはそのＲＮＡｉ遺伝子の前にスプライス受容部位を含有する）。これは、ＲＮＡｉは通常は多重遺伝子ファミリーを標的とし、これは植物の表現型−生長、発生、非生物的または生物的ストレス耐性等を損ない得るため、好都合である可能性がある。結果として得られた安定に形質転換された植物を、それらの内因性タンパク質の、および例えばＩｇＧ１分子のような異種性にｍａｇｎＩＣＯＮ（登録商標）で発現させたタンパク質のＮ−グリカン上のフコースの非存在に関してスクリーニングする。選択された植物を、さらにそれらのガラス温室中での性能、例えば野生型植物と比較した栄養生長効率に関してスクリーニングすることができる。

【0181】

その優先権が本特許出願により主張される２０１１年１０月４日に出願された米国特許出願第６１／５４２，９６５号および２０１１年１０月６日に出願された欧州特許出願第１１０７５２１８．５号の内容は、記述、全ての特許請求の範囲、全ての図および配列リストのＳＥＱＩＤＮＯ１〜１９を含め、参照により本明細書にそのまま援用される。
本発明は、非限定的に以下の態様を含む。
［態様１］ニコチアナ・ベンサミアナにおいて低減したレベルのコアのアルファ（１，３）−フコース残基を有する糖タンパク質を産生するための方法であって、以下の工程：
ａ．少なくとも３個のノックアウトアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子を含む植物または植物細胞を提供し；そして
ｂ．前記の細胞を培養し、前記の細胞から糖タンパク質を単離する；
を含む、前記方法。
［態様２］ニコチアナ・ベンサミアナにおいて低減したレベルのコアのアルファ（１，３）−フコース残基および低減したレベルのベータ（１，２）−キシロース残基を有する糖タンパク質を産生するための方法であって、以下の工程：
ａ．植物細胞を提供し、前記の植物細胞は
ｉ．少なくとも３個のノックアウトアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子を含み；そして
ｉｉ．低減したレベルのベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼ活性を有することを特徴とし；そして
ｂ．前記の細胞を培養し、前記の細胞から糖タンパク質を単離する；
を含む、前記方法。
［態様３］前記のベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼ活性の低減したレベルが内在性のベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼ遺伝子のノックアウト変異の結果である、態様２に記載の方法。
［態様４］前記の植物または植物細胞が少なくとも５個のノックアウトアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子を含む、態様１〜３のいずれか１項に記載の方法。
［態様５］前記のノックアウトアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子が、以下：
ａ．ＳＥＱＩＤＮＯ：３に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むアミノ酸配列をコードする核酸分子；
ｂ．ＳＥＱＩＤＮＯ：６に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むアミノ酸配列をコードする核酸分子；
ｃ．ＳＥＱＩＤＮＯ：９に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むアミノ酸配列をコードする核酸分子；
ｄ．ＳＥＱＩＤＮＯ：１２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むアミノ酸配列をコードする核酸分子；
ｅ．ＳＥＱＩＤＮＯ：１４に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むアミノ酸配列をコードする核酸分子；
からなる群から選択される天然のアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子の変異版である、態様１〜４のいずれか１項に記載の方法。
［態様６］前記のノックアウトアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子が、以下：
ａ．ＳＥＱＩＤＮＯ：１に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む核酸分子；
ｂ．ＳＥＱＩＤＮＯ：４に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む核酸分子；
ｃ．ＳＥＱＩＤＮＯ：７に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む核酸分子；
ｄ．ＳＥＱＩＤＮＯ：１０に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む核酸分子；
ｅ．ＳＥＱＩＤＮＯ：１３に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む核酸分子；
からなる群から選択される天然のアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子の変異版である、態様５に記載の方法。
［態様７］前記のノックアウトアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子が、以下：
ａ．ＳＥＱＩＤＮＯ：１の３５５位におけるＧのＡへの置換を含有するＦｕｃＴＡ遺伝子；
ｂ．ＳＥＱＩＤＮＯ：４の３０５４位におけるＧのＡへの置換を含有するＦｕｃＴＢ遺伝子；
ｃ．ＳＥＱＩＤＮＯ：７の２８０７位におけるＧのＡへの置換を含有するＦｕｃＴＣ遺伝子；
ｄ．ＳＥＱＩＤＮＯ：１０の２２４位におけるＧのＡへの置換を含有するＦｕｃＴＤ遺伝子；
ｅ．ＳＥＱＩＤＮＯ：１３の９１０位におけるＧのＡへの置換を含有するＦｕｃＴＥ遺伝子；
からなる群から選択される、態様６に記載の方法。
［態様８］前記のノックアウトアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子がゲノム中にホモ接合型の状態で存在する、態様１〜７のいずれか１項に記載の方法。
［態様９］さらに少なくとも５個の内在性のアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の発現が転写サイレンシングまたは転写後サイレンシングにより低減していることを特徴とする、態様１〜８のいずれか１項に記載の方法。
［態様１０］前記の植物または植物細胞がさらに、以下の作動可能に連結されたＤＮＡ断片：
ａ．植物で発現可能なプロモーター；
ｂ．転写された際に少なくとも１個のアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子に対して阻害性のＲＮＡ分子を生じるＤＮＡ領域；
ｃ．植物において機能する転写終結およびポリアデニル化シグナルを含むＤＮＡ領域；
を含む少なくとも１個のキメラ遺伝子を含む、態様９に記載の方法。
［態様１１］さらに、前記のＤＮＡ領域が少なくとも以下：
ａ．ＳＥＱＩＤＮＯ：２、ＳＥＱＩＤＮＯ：５、ＳＥＱＩＤＮＯ：８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３、またはそれらの相補物から選択される２１ヌクレオチドの内の少なくとも１８ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む第１センスＤＮＡ領域から転写されるＲＮＡ領域；
ｂ．前記の第１センスＤＮＡ領域の相補物に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する少なくとも１８個の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む第２アンチセンスＤＮＡ領域から転写されるＲＮＡ領域
の間で二本鎖ＲＮＡ領域を形成することができるＲＮＡ分子を生じることを特徴とする、態様１０に記載の方法。
［態様１２］前記のＤＮＡ領域がＳＥＱＩＤＮＯ：１９の配列を含む、態様１１に記載の方法。
［態様１３］前記の糖タンパク質が異種糖タンパク質である、態様１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
［態様１４］前記の異種糖タンパク質が、以下の作動可能に連結された核酸分子：
ａ．植物で発現可能なプロモーター；
ｂ．前記の異種糖タンパク質をコードするＤＮＡ領域；
ｃ．転写終結およびポリアデニル化に関わるＤＮＡ領域；
を含むキメラ遺伝子から発現されることを特徴とする、態様１３に記載の方法。
［態様１５］さらに前記の異種糖タンパク質の精製の工程を含む、態様１３または１４に記載の方法。
［態様１６］態様１〜１５のいずれか１項に記載の方法により得られる糖タンパク質。
［態様１７］態様１〜１５のいずれか１項に記載の方法により得られる、低減したレベルのコアのアルファ（１，３）−フコース残基を有する糖タンパク質。
［態様１８］態様２〜１５のいずれか１項に記載の方法により得られる、低減したレベルのコアのアルファ（１，３）−フコース残基を有し、かつ低減したレベルのベータ（１，２）−キシロース残基を有する糖タンパク質。
［態様１９］少なくとも３個のノックアウトアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子を含む、ニコチアナ・ベンサミアナ植物、またはその細胞、部位、種子もしくは子孫。
［態様２０］少なくとも５個のノックアウトアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子を含む、態様１９に記載の植物。
［態様２１］ノックアウトアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子の１個以上が、以下：
ａ．ＳＥＱＩＤＮＯ：３に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むアミノ酸配列をコードする核酸分子；
ｂ．ＳＥＱＩＤＮＯ：６に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むアミノ酸配列をコードする核酸分子；
ｃ．ＳＥＱＩＤＮＯ：９に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むアミノ酸配列をコードする核酸分子；
ｄ．ＳＥＱＩＤＮＯ：１２に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むアミノ酸配列をコードする核酸分子；
ｅ．ＳＥＱＩＤＮＯ：１４に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むアミノ酸配列をコードする核酸分子；
からなる群から選択される天然のアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子の変異版である、態様１９または２０に記載の植物。
［態様２２］ノックアウトアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子の１個以上が、以下：
ａ．ＳＥＱＩＤＮＯ：１に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む核酸分子；
ｂ．ＳＥＱＩＤＮＯ：４に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む核酸分子；
ｃ．ＳＥＱＩＤＮＯ：７に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む核酸分子；
ｄ．ＳＥＱＩＤＮＯ：１０に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む核酸分子；
ｅ．ＳＥＱＩＤＮＯ：１３に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む核酸分子；
からなる群から選択される天然のアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子の変異版である、態様２１に記載の植物。
［態様２３］ノックアウトアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子が、以下：
ａ．ＳＥＱＩＤＮＯ：１の３５５位におけるＧのＡへの置換を含有するＦｕｃＴＡ遺伝子；
ｂ．ＳＥＱＩＤＮＯ：４の３０５４位におけるＧのＡへの置換を含有するＦｕｃＴＢ遺伝子；
ｃ．ＳＥＱＩＤＮＯ：７の２８０７位におけるＧのＡへの置換を含有するＦｕｃＴＣ遺伝子；
ｄ．ＳＥＱＩＤＮＯ：１０の２２４位におけるＧのＡへの置換を含有するＦｕｃＴＤ遺伝子；
ｅ．ＳＥＱＩＤＮＯ：１３の９１０位におけるＧのＡへの置換を含有するＦｕｃＴＥ遺伝子；
からなる群から選択される、態様２１または２２に記載の植物。
［態様２４］ノックアウトアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子に関してホモ接合型である、態様１９〜２３のいずれか１項に記載の植物または植物細胞。
［態様２５］さらに少なくとも１個のノックアウトベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼ遺伝子を含み、前記のノックアウトベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼ遺伝子が該ベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼ遺伝子中に対応する野生型ＤＮＡ領域と比較して１個以上の挿入された、欠失した、または置換されたヌクレオチドからなる変異したＤＮＡ領域を含み、かつここで前記のノックアウトベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼ遺伝子が機能するベータ（１，２）−キシロシルトランスフェラーゼタンパク質をコードしていない、態様１９〜２４のいずれか１項に記載の植物または植物細胞。
［態様２６］さらに以下の作動可能に連結されたＤＮＡ断片：
ａ．植物で発現可能なプロモーター；
ｂ．転写された際に少なくとも１個のアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子に対して阻害性のＲＮＡ分子を生じるＤＮＡ領域；
ｃ．植物において機能する転写終結およびポリアデニル化シグナルを含むＤＮＡ領域；
を含む少なくとも１個のキメラ遺伝子を含む、態様１９〜２５のいずれか１項に記載の植物または植物細胞。
［態様２７］前記のＤＮＡ領域がＳＥＱＩＤＮＯ：１９の配列を含む、態様２６に記載の植物または植物細胞。
［態様２８］さらに前記の植物または植物細胞に対して外来の糖タンパク質を含む、態様１９〜２７のいずれか１項に記載の植物または植物細胞。
［態様２９］前記の糖タンパク質が、以下の作動可能に連結された核酸分子：
ａ．植物で発現可能なプロモーター；
ｂ．前記の異種糖タンパク質をコードするＤＮＡ領域；
ｃ．転写終結およびポリアデニル化に関わるＤＮＡ領域；
を含むキメラ遺伝子から発現される、態様２８に記載の植物または植物細胞。
［態様３０］以下：
ａ．ＳＥＱＩＤＮＯ：１の３５５位におけるＧのＡへの置換を含有するＦｕｃＴＡ遺伝子；
ｂ．ＳＥＱＩＤＮＯ：４の３０５４位におけるＧのＡへの置換を含有するＦｕｃＴＢ遺伝子；
ｃ．ＳＥＱＩＤＮＯ：７の２８０７位におけるＧのＡへの置換を含有するＦｕｃＴＣ遺伝子；
ｄ．ＳＥＱＩＤＮＯ：１０の２２４位におけるＧのＡへの置換を含有するＦｕｃＴＤ遺伝子；
ｅ．ＳＥＱＩＤＮＯ：１３の９１０位におけるＧのＡへの置換を含有するＦｕｃＴＥ遺伝子；
からなる群から選択される、アルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子のノックアウトアレル。
［態様３１］低減したレベルのコアのアルファ（１，３）−フコース残基を有する糖タンパク質を得るための、態様１〜１５のいずれか１項に記載の方法の使用。
［態様３２］低減したレベルのコアのアルファ（１，３）−フコース残基を有し、かつ低減したレベルのベータ（１，２）−キシロース残基を有する糖タンパク質を得るための、態様２〜１５のいずれか１項に記載の方法の使用。

【図1】