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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6105570
(24)【登録日】2017年3月10日
(45)【発行日】2017年3月29日
(54)【発明の名称】哺乳動物の胚の生存能力を予測する方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/06 20060101AFI20170316BHJP
G01N 33/48 20060101ALI20170316BHJP
G01N 33/483 20060101ALI20170316BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20170316BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/06
G01N33/48 M
G01N33/483 C
C12M1/34 A
【請求項の数】17
【全頁数】46
(21)【出願番号】特願2014-517943(P2014-517943)
(86)(22)【出願日】2012年6月29日
(65)【公表番号】特表2014-520522(P2014-520522A)
(43)【公表日】2014年8月25日
(86)【国際出願番号】GB2012051533
(87)【国際公開番号】WO2013005012
(87)【国際公開日】20130110
【審査請求日】2015年6月26日
(31)【優先権主張番号】61/503,827
(32)【優先日】2011年7月1日
(33)【優先権主張国】US
(31)【優先権主張番号】61/577,860
(32)【優先日】2011年12月20日
(33)【優先権主張国】US
(73)【特許権者】
【識別番号】508311226
【氏名又は名称】ケンブリッジ・エンタープライズ・リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100140109
【弁理士】
【氏名又は名称】小野 新次郎
(74)【代理人】
【識別番号】100075270
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 泰
(74)【代理人】
【識別番号】100101373
【弁理士】
【氏名又は名称】竹内 茂雄
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100135415
【弁理士】
【氏名又は名称】中濱 明子
(72)【発明者】
【氏名】ゼルニッカ−ゲッツ，マグダレナ
(72)【発明者】
【氏名】アジドゥク，アンナ
(72)【発明者】
【氏名】グラハム，クリス
【審査官】
西 賢二
(56)【参考文献】
【文献】
国際公開第２０１１／０２５７３６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
AJDUK, A.，FERTILIZATION TRIGGERS OSCILLATORY CHANGES IN VELOCITY OF CYTOPLASMIC MOVEMENTS IN A MOUSE EGG，Biol. Reprod.，２００９年，Vol. 81，ABSTRACT 131
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ１２Ｑ １／００−３／００
Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８
Ｃ１２Ｍ １／００−３／１０
Ｃ１２Ｎ １／００−７／０８
ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
哺乳動物の単一細胞胚の発生能を評価するインビトロの方法であって、該方法は、
（ａ）１細胞期における胚中の細胞質内運動および／または１細胞期における胚の受精丘の拍動（ＦＣの拍動）の間のインターバルを測定すること、および
（ｂ）その測定値を用いて、胚の発生能を予測すること
を含み、
細胞質内運動の測定が、１細胞期における胚中の平均細胞質内速度の測定、または１細胞期における胚中の２つの連続した速度ピーク間のインターバルの測定から選択される、上記方法。
（ａ）１細胞期における胚中の細胞質内運動および／または１細胞期における胚の受精丘の拍動（ＦＣの拍動）の間のインターバルを測定すること、および
（ｂ）その測定値を用いて、胚の発生能を予測すること
を含み、
細胞質内運動の測定が、１細胞期における胚中の平均細胞質内速度の測定、または１細胞期における胚中の２つの連続した速度ピーク間のインターバルの測定から選択される、上記方法。
【請求項2】
速度ピーク間もしくはＦＣの拍動間の、より長いインターバルまたはより長い平均インターバルが、より優れた発生能の予測と相関する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
速度ピーク間もしくはＦＣの拍動間のインターバルまたは平均インターバルと、１つまたはそれより多くの予め決定された参考値とを比較することによって、前記胚の発生能が予測される、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記平均細胞質内速度が、記録された最初の速度ピークの前、速度ピークの間で、および／または記録された最後の速度ピークの後に測定され、ここで平均速度は経時的に計算され、それにより計算された速度が、平均基底細胞質内速度である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
より速い平均基底細胞質内速度が、より優れた発生能の予測と相関し、および場合により、前記胚の発生能が、平均基底細胞質内速度と、１つまたはそれより多くの予め決定された参考値とを比較することによって予測される、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記単一細胞胚が、受精と前核の形成との間の発生ステージにある、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
測定を行うことが、タイムラプス画像の捕捉、それに続く定量的な画像解析を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記胚が培地の小液滴中に保持された状態で画像化される、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記画像の捕捉が、受精の４時間以内に完了する、請求項７または請求項８に記載の方法。
【請求項10】
（i）前記定量的な画像解析が、粒子画像速度測定法（ＰＩＶ）を使用する；および／または
（ii）前記測定が、非侵襲的になされる；および／または
（iii）前記測定が、胚中に細胞内色素の非存在下でなされる；および／または
（iv）前記測定が、細胞骨格の機能に干渉することなくなされる；および／または
（v）前記測定が、受精丘の形成に干渉することなくなされる；および／または
（vi）前記発生能を予測することが、胚が胚盤胞期まで発達すると予測される確率を決定することを含む；および／または
（vii）前記発生能が、その後の培養における胚の細胞分裂の速度を含む；および／または
（viii）前記発生能が、その後の４日の培養後に生じると予測される胚中の細胞数を含む；および／または
（ix）前記発生能を予測することが、胚が母となるレシピエントに移植された後に臨月まで発達すると予測される確率を決定することを含む；および／または
（x）前記方法が、受精の２４時間以内に完了する；および／または
（xi）前記方法が、受精の４時間以内に完了する；および／または
（xii）前記胚の発生能を評価するのに、胚中の細胞質内運動および／または受精丘の拍動の測定値だけが使用される
請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
（ii）前記測定が、非侵襲的になされる；および／または
（iii）前記測定が、胚中に細胞内色素の非存在下でなされる；および／または
（iv）前記測定が、細胞骨格の機能に干渉することなくなされる；および／または
（v）前記測定が、受精丘の形成に干渉することなくなされる；および／または
（vi）前記発生能を予測することが、胚が胚盤胞期まで発達すると予測される確率を決定することを含む；および／または
（vii）前記発生能が、その後の培養における胚の細胞分裂の速度を含む；および／または
（viii）前記発生能が、その後の４日の培養後に生じると予測される胚中の細胞数を含む；および／または
（ix）前記発生能を予測することが、胚が母となるレシピエントに移植された後に臨月まで発達すると予測される確率を決定することを含む；および／または
（x）前記方法が、受精の２４時間以内に完了する；および／または
（xi）前記方法が、受精の４時間以内に完了する；および／または
（xii）前記胚の発生能を評価するのに、胚中の細胞質内運動および／または受精丘の拍動の測定値だけが使用される
請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記胚が、さらに培養される、および場合により前記胚の発生能を評価するのに、培養中の前記胚の発生の程度および／または形態がさらに使用される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記哺乳動物の胚が、（ｉ）ヒト以外の哺乳動物の胚である、（ｉｉ）マウス胚である、（ｉｉｉ）家畜の胚である、または（ｉｖ）ヒト胚である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
ヒト以外の哺乳動物の卵を受精させること、および請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法に従って結果得られた胚の発生能を評価することを含む、体外受精方法。
【請求項14】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法に従ってヒト以外の哺乳動物の胚の発生能を評価すること、および胚を母となるレシピエントに移植することを含む、補助繁殖方法。
【請求項15】
複数の胚から１個またはそれより多くのヒト以外の哺乳動物の胚を選択する方法であって、該方法は、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法に従って各胚の発生能を評価すること、およびそれらの予測された発生能に基づいて１個またはそれより多くの胚を選択することを含む、上記方法。
【請求項16】
胚の集合体中の１個またはそれより多くのヒト以外の哺乳動物の胚を発生能に従って格付けする方法であって、該方法は、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法に従って集合体中の各胚の発生能を評価すること、およびその予測された発生能に基づいて各胚を格付けすること、および場合により、予測された発生能に基づいて複数の胚から１個またはそれより多くの胚を選択することをさらに含む、
上記方法。
上記方法。
【請求項17】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法を行うための装置であって、該装置は、胚のタイムラプス画像を捕捉するための１個またはそれより多くのセンサーと、少なくとも１つの該センサーと連携する少なくとも１個のプロセッサーとを含み、ここで該プロセッサーは、前記画像を捕捉し、該画像が胚の発生能の予測値に変換されるように、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法を実施するためのコンピューターで読取り可能なインストラクションでプログラム化されており、
さらに前記装置は、
（ｉ）前記胚の温度および／またはｐＨ曝露を制御するための人工気候室；および／または
（ｉｉ）胚の温度を制御するための加熱台
を含み、そして、１個またはそれより多くの前記センサーが、白色の透過光を使用してタイムラプス画像を捕捉するように配置されている、上記装置。
さらに前記装置は、
（ｉ）前記胚の温度および／またはｐＨ曝露を制御するための人工気候室；および／または
（ｉｉ）胚の温度を制御するための加熱台
を含み、そして、１個またはそれより多くの前記センサーが、白色の透過光を使用してタイムラプス画像を捕捉するように配置されている、上記装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、哺乳動物の胚の発生能を評価する方法、予測された発生能に従って複数の胚から胚を選択または格付けする方法、ならびに体外受精（ＩＶＦ）および補助繁殖の方法を提供する。さらに本発明の方法を行うためのシステムも提供される。
【背景技術】
【0002】
現在、ＩＶＦ診療所において母親になる予定の人に移植するための胚の生命力を評価するより優れた手段が求められている。一般的な標準的手段は、３日目に発生の程度を評価して、これを、その後の発生、すなわち妊娠の成功可能性の予測変数として使用することであった。この評価の信頼性が低いために、外見上健康な胚盤胞を直接使用できるように胚盤胞期（６日）まで胚を培養するためのＩＶＦ診療所数の増加を招いた。このアプローチは多大な費用を要するだけでなく、このような長期わたるインビトロでの培養により胚盤胞期に不可避の危険をもたらすことがある。
【0003】
卵の受精後の胚における初期の現象が特徴付けられている。哺乳動物の接合体において、精子の侵入は、細胞骨格、表層粒７、小胞体８、およびミトコンドリア９の再編成につながる。精子の侵入は、接合体の形状の変化：第二極体（ＰＢ）の形成；精子クロマチン上での受精丘（ＦＣ）の突き出し１７、１８；およびＦＣを二等分する軸に沿った接合体の平坦化１９を引き起こす。また哺乳動物の受精は、減数分裂の完了から第一の胚細胞周期の中間期に入るまでの間、遊離の細胞質内Ｃａ２＋の振動も誘発する１０。Ｃａ２＋振動は、受精直後の現象を調節するだけでなく１１〜１４、着床後の発生の形態に影響を与えることも報告されている１２、１５、１６。機能的なアクチン細胞骨格とＣａ２＋一過性上昇（Ca2+ transient）の正しいパターン（特にＣａ２＋上昇にかかる全体の時間）とはいずれも発生に重要であることが報告されている１２、１５、１６、３７〜３９。
【0004】
ある種の生物において、精子の侵入によって細胞質内運動（cytoplasmic movement）が起こることが説明されている。例えばウニ、ホヤ、およびカエルにおいて、細胞質内運動は、胚極性の確立などの発生現象進行の成功と関連していることが知られている１〜６。マウス受精卵では、ある種の細胞質内の動きが検出されている２０。
【0005】
このような受精直後に胚で起こる現象が特徴付けられているが、培養期間後の胚の発生の程度を評価することが、依然として好ましく標準的な胚の品質の評価方法である。
【発明の概要】
【0006】
本発明者等は、マウス卵への精子の侵入によって起こる細胞質内運動を特徴付けた。本発明者等はさらに、受精後に起こる胚の形状の周期的な変化も確認した。本発明者等は、このような運動の動力学は、それに続く胚の発生の成功を確実に予測するのに使用できることを見出した。
【0007】
第一の形態において、本発明は、哺乳動物の胚の発生能を評価するインビトロの方法を提供し、本方法は、（ａ）１細胞期で、胚の細胞質内運動および／または胚の形状の周期的な変化を測定すること、および
（ｂ）その測定値を用いて、胚の発生能を予測すること
を含む。
【0008】
この方法の重要な特徴は、受精後および最初の胚細胞分裂の前の胚発生の極めて初期の段階から得た測定値を使用する点である。従って本方法は、有利に、初期かつ迅速に、胚の品質およびその後の発生成功の可能性を評価する方法を提供する。
【0009】
発明者等は、１細胞期におけるマウス胚中の細胞質内運動の平均速度に関するパラメーターと、その後の発生成功の指標との間に有意な相関があることを確認した。発明者等は、受精後のマウス胚で、細胞質内運動の平均速度における別個の周期的なピーク（本明細書では「速度ピーク（speed peak）」と称する）を観察した。発明者等は、速度ピーク間インターバルの長さが、胚発生の成功の予測に役立つことを見出した。より長い速度ピーク間インターバルと、より優れた発生の成功とが相関する。
【0010】
本発明の方法に係るいくつかのケースにおいて、胚の発生能は、２つの連続した速度ピークを確認するのに十分な期間にわたり、１細胞期における胚中の平均細胞質内速度（cytoplasmic speed）を測定すること、および２つの速度ピーク間のインターバルを計算することにより予測される。より長い速度ピーク間インターバルまたはより長い速度ピーク間平均インターバルと、より優れた発生能の予測とが相関する可能性がある。いくつかのケースにおいて、より短い速度ピーク間インターバルまたはより短い速度ピーク間平均インターバルと、より優れた発生能の予測とが相関する場合もある。いくつかのケースにおいて、胚の発生能は、速度ピーク間インターバルまたは速度ピーク間平均インターバルと、１つまたはそれより多くの予め決定された参考値とを比較することにより予測される。
【0011】
胚の受精丘が形成されるとき、速度ピークは胚の形状の周期的な変化と一致する。最も驚くべきことに、速度ピークは、受精丘の拍動（ＦＣの拍動）と一致する。それゆえにＦＣの拍動などの胚の形状の周期的な変化も発生能の予測に役立つ可能性がある。
【0012】
発生の成功と有意に相関する第二のパラメーターは、平均基底細胞質内速度（average basal cytoplasmic speed）である。これは、速度ピーク間で記録された最初の速度ピークの前、および／または最後に記録された速度ピークの後の平均速度である。発明者等は、平均基底細胞質内速度は、胚の発生の成功の予測に役立つことを見出した。より速い平均基底細胞質内速度は、より優れた発生の成功と相関する。
【0013】
本発明の方法に係るいくつかのケースにおいて、胚の発生能は、速度ピーク間で記録された最初の速度ピークの前、および／または最後に記録された別個の速度ピークの後の、胚中の平均基底細胞質内速度を測定することによって予測される。より速い平均基底細胞質内速度と、より優れた発生能の予測とが相関する可能性がある。いくつかのケースにおいて、より遅い平均基底細胞質内速度と、より優れた発生能とが相関する可能性がある。いくつかのケースにおいて、胚の発生能は、平均基底細胞質内速度と、１つまたはそれより多くの予め決定された参考値とを比較することによって予測される。
【0014】
発生能の予測は、これらのパラメーター両方を一緒に用いることにより改善できる。本発明の方法に係るいくつかのケースにおいて、発生能の予測は、速度ピーク間またはＦＣの拍動間のインターバルの長さと、平均基底細胞質内速度との両方に基づく。これらのパラメーターは、同時期に採取された胚の測定値を用いて計算することができた。発明者等は、一般的に、ピーク間インターバルの長さに基づいて発生能が高いまたは低いと予測された胚は、それと一致して、それらの平均基底細胞質内速度に基づいて発生能が高いまたは低いと予測されることも見出した。すなわち、これらの２つのパラメーターに基づく予測は、一致する傾向がある。
【0015】
本発明の方法は、体外受精した卵の生命力を、受精後の初期段階で、すなわち最初の胚細胞分裂の前に予測する迅速な方法を提供し、それにより体外受精（ＩＶＦ）治療の見込みを改善することが可能である。
【0016】
さらなる形態において、本発明は、哺乳動物の卵を受精させることと、１細胞期における胚中の細胞質内運動および／または胚の形状の周期的な変化を測定することにより結果得られた胚の発生能を予測することとを含む、体外受精方法を提供する。優れた発生能を有すると予測された体外受精卵は、例えば母となる受容者に移植するために選択することができ、それによって妊娠の成功率が改善される。
【0017】
さらに、補助繁殖方法も提供され、本方法は、１細胞期における胚中の細胞質内運動および／または胚の形状の周期的な変化を測定することにより、哺乳動物の胚の発生能を予測することと、続いて胚を母となる受容者に移植することとを含む。
【0018】
いくつかのケースにおいて、所定の胚の絶対的な品質は、胚群中の相対的な品質、例えば同じ母親から得られた卵から発生した胚群中の相対的な胚の品質よりも重要性は低い。本発明のさらなる形態は、複数の胚から１個またはそれより多くの胚を選択する方法を提供し、本方法は、１細胞期における胚中の細胞質内運動および／または胚の形状の周期的な変化を測定することにより各胚の発生能を予測することと、それらの予測された発生能に基づいて１個またはそれより多くの胚を選択することとを含む。また胚（複数可）を選択する際に、その他の要素を考慮に入れてもよい。１個またはそれより多くの胚は、補助繁殖方法で使用するために選択することができる。
【0019】
本発明のその他の形態は、胚群中の１個またはそれより多くの胚を、それらの発生能に従って格付けする方法を提供し、本方法は、１細胞期における胚中の細胞質内運動および／または胚の形状の周期的な変化を測定することにより各胚の発生能を予測することと、その予測された発生能に基づいて各胚を格付けすることとを含む。１個またはそれより多くの胚はさらに、予測された発生能に基づいて選択されてもよい。１個またはそれより多くの胚は、補助繁殖方法で使用するために選択することができる。
【0020】
さらなる形態において、本発明は、本発明の方法を行うためのシステムを提供し、本システムは、胚の低速度撮影画像を捕捉するための１個またはそれより多くのセンサーと、少なくとも１つのセンサーと連携する少なくとも１個のプロセッサーとを含み、このプロセッサーは、前記画像が胚の発生能の予測値に変換されるようにコンピューターで読取り可能なインストラクションでプログラム化されている。
【0021】
以下、本発明を添付の図面を参照しながら例を挙げてより詳細に説明するが、これらに限定されない。この開示を考慮することにより多くの等価な改変およびバリエーションが当業者には明らかであると予測される。従って、明示された本発明の典型的な実施態様は、限定ではなく説明のためとみなされる。本発明の範囲から逸脱することなく説明した実施態様に様々な変化を施すことができる。本明細書において引用された全ての文書は、明確に参照により本明細書に組み入れられる。
【0022】
本発明は、説明された形態および好ましい特徴の組み合わせを含むが、このような組み合わせが明かに許容できないか、あるいは明確に回避されることが述べられている場合を除く。
【0023】
章の見出しは、本明細書では単に便宜上用いられているだけであり、限定として解釈されないものとする。図面における色の言及は、単に情報として示されたに過ぎない。カラーの図面はない。
【図面の簡単な説明】
【0024】
【図1b】図１ｂは、解析されたＭＩＩ期、すなわち第二減数分裂の分裂中期における未受精卵の概略図である。ステージ１：第二極体が形成され、ＦＣが最初に出現する。ステージ２：ＦＣの形成が完了する。ステージ３：ＦＣが退縮して前核が形成される。
【図1e】図１ｅは、未受精卵（ＭＩＩ）およびステージ１〜３における接合体に代表的な、ベクトルパターンと共に示したＤＩＣ画像である。単に明確にする目的で１秒ごとにベクトルを示す。ベクトルの長さおよびバックグラウンドの色は、局所的な細胞質内運動の速度を示す。スケールバーは１０μｍである。
【図2a】図２は、平均細胞質内速度のピークはＦＣ領域におけるアクトミオシン細胞骨格の変化に依存することを示す。図２ａは、拍動するＦＣを有する接合体のＤＩＣ画像であり、反復的にＦＣ（星印でマークした）が突き出て平坦になる。スケールバーは２０μｍである。
【図2b】図２ｂは、マウス受精卵における平均細胞質内速度のピーク（青色／下のライン）はＦＣ直径の減少の始まり（緑色／上のライン）と相関することを示す。ＦＣ直径は、（ａ）で示されるように、ＦＣの一方の端部において最大対称を示すポイントから細胞の他方の端部までとして測定された。
【図2c】図２ｃは、ＦＣ直径の変化（速度ピーク直前と、速度ピークがその最大値に到達したときのタイムポイントとのＦＣ直径の差として測定した）は、それに伴う速度ピークの振幅と相関することを示す。これらの測定値から計算されたピアソンの相関係数は０．５９５であり、これは統計学的に有意である（ｐ＜０．０００１）。
【図2d】図２ｄは、ＦＣ皮質におけるＵｔｒＣＨ−ＥＧＦＰの蛍光強度（青色／下のライン）は、ＦＣが形状を変化させるにつれて（ＦＣ直径における変化で示した通り（赤色／上のライン））変動していることを示す。強度値は、焦点のシフトによって引き起こされる強度の変化を除外するために、ＵｔｒＣＨ−ＥＧＦＰとＧａｐ４３−ＲＦＰ（膜タンパク質）蛍光との比率として示される（詳細に関しては「方法」を参照）。星印は、ＵｔｒＣＨ−ＥＧＦＰおよびＧａｐ４３−ＲＦＰの強度が測定された皮質領域の端部を示す。スケールバーは１０μｍである。
【図2e】図２ｅは、ＦＣの下上の肩におけるＭｙｏＲＬＣ−ＧＦＰ蛍光の強度（それぞれ青色のライン、および十字記号で示された青色のライン）は、（ＦＣ直径における変化（赤色）で示されるように）ＦＣがその形状を変化させるにつれて揺れ動くことを示す。強度の値は、ＵｔｒＣＨ−ＥＧＦＰ蛍光とＧａｐ４３−ＲＦＰ蛍光との比率で示される。星印は、ＭｙｏＲＬＣ−ＧＦＰおよびＧａｐ４３−ＲＦＰの強度が測定された領域を表示する。スケールバーは１０μｍである。
【図2g】図２ｇは、タキソール（青色の（上の）ライン）、およびジャスプラキノリド（赤色の（下の）ライン）で処理された代表的な接合体における平均細胞質内速度を示す。およそ９０分の時点で認識できるピークは、焦点のシフトに起因する。
【図3a】図３は、細胞質内速度ピークは、遊離Ｃａ２＋の振動に依存することを示す。図３ａは、代表的な受精卵における、平均細胞質内速度（青色／下のライン）および遊離Ｃａ２＋レベル（緑色／上のライン）のピークを示す。
【図3c】図３ｃは、ＳｒＣｌ２で活性化された卵における、平均細胞質内速度（青色／下のライン）および遊離Ｃａ２＋レベル（緑色／上のライン）のピークを示す。卵をＳｒＣｌ２で活性化したところ、Ｃａ２＋一過性上昇に付随する速度ピークは、小さいものでさえも生じなかった（（ｃ）の挿入図）。全てのグラフにおいて、Ｃａ２＋レベルの増加は、ＦｕｒａＲｅｄ蛍光強度の減少で示された。（ｂ）におけるピークは、焦点のシフトに起因するものであった。
【図4a】図４は、高振幅の細胞質内速度ピークはＦＣの存在に依存することを示す。卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）で処理された代表的な卵における平均細胞質内速度（青色／下のライン）および遊離Ｃａ２＋レベル（緑色／上のライン）を示す。新鮮な精子頭部を、皮質下（ａ）または細胞質の中心部分（ｂ）に注入した。熱不活化した精子頭部を皮質下に注入し、卵をＳｒＣｌ２で活性化するか（ｃ）または活性化しなかった（ｄ）。加熱した精子頭部を注入しＳｒＣｌ２で活性化した卵において、小さい速度ピークが頻繁に現れた（（ｃ）における挿入図）。全てのグラフにおいて、Ｃａ２＋レベルの増加は、ＦｕｒａＲｅｄ蛍光の強度の減少で示された。
【図4b】同上。
【図4c】同上。
【図4d】同上。
【図5a】図５は、胚の生存能力の指標としての細胞質内運動を示す。４日培養した後、接合体で記録された平均の基底速度（ａ）または平均の速度ピーク間インターバル（ｂ）と、胚中の細胞数との相関を示す。（ｃ）（ａ）におけるデータにフィッティングした数学モデルであり、それによれば、平均ピーク間インターバルの様々な値を調整したところ、４日齢の胚における平均基底速度と細胞数との間に線形および二次相関があることが示される。平均ピーク間インターバルは、＋１ＳＤ（上のライン）、平均ピーク間インターバルは、＋０．５ＳＤ（上から二番目のライン）、平均ピーク間インターバル（上から三番目のライン）、平均ピーク間インターバルは、−０．５ＳＤ（上から四番目のライン）であり、平均ピーク間インターバルは、−１ＳＤである（下のライン）。（ｄ）（ｂ）におけるデータにフィッティングした数学モデルであり、それによれば、平均基底速度の様々な値について調整したところ、４日齢の胚において平均ピーク間インターバルと細胞数との間に線形相関があることが示されることが示される。平均ピーク間インターバルは、＋１ＳＤ（上のライン）、平均ピーク間インターバルは、＋０．５ＳＤ（上から二番目のライン）、平均ピーク間インターバル（上から三番目のライン）、平均ピーク間インターバルは、−０．５ＳＤ（上から四番目のライン）、平均ピーク間インターバルは、−１ＳＤ（下のライン）である。（ｃ）および（ｄ）におけるモデルのグラフ表示は、（ａ）および（ｂ）それぞれにおいて赤色の括弧で指定された範囲の値に関して作製された。（ｅ）我々のモデルに基づいて「優れた」とスコア付けされた胚から得られた卵筒（左）、および２週齢の子（右）を示す。アクチンはファロイジンで緑色に標識されており、Ｇａｔａ４は、内臓内胚葉を赤色にマーキングする。スケールバーは５０μｍである。（ｆ）胚移植の効率を示す。胚を、２細胞期に雌のレシピエントに移植して、６．５（青色の（塗りつぶされた）柱）または１９．５ｄｐｃ（赤色の（斜線の）柱）で解剖した我々のモデルに従って、「高品質」または「低品質」とスコア付けした。
【図5b】同上。
【図5c】同上。
【図5d】同上。
【図5e】同上。
【図5f】同上。
【図6a】図６は、卵母細胞質中で、ヒト卵母細胞におけるＰＬＣζおよびＩＣＳＩによって誘導されたＣａ２＋振動は同時に起こる一過性の運動を伴うことを示す。図６ａは、オレゴングリーンＢＡＰＴＡデキストラン（ＯＧＢＤ）（任意単位）の蛍光によって測定された細胞内Ｃａ２＋の増加、およびそれに対応するＰＩＶで測定された細胞質内運動の記録を示す。
【図6b】図６ｂにおけるトレースは、大きい初期のＣａ２＋増加とそれに伴う運動の減少を示す他の卵母細胞からの、Ｃａ２＋とＰＩＶそれぞれの初期の様相を示す。＊でマークしたスパイクは、図７の拡大目盛りで示される。
【図7】図７は、Ｃａ２＋変化と細胞質内運動との同時発生の解析を示す。これらの時間の目盛りが拡大されたパネルは、図６Ｂの卵母細胞から得られる。第一のＣａ２＋スパイクは長期間続き、細胞質内運動は抑制される。その後のＣａ２＋スパイクはそれより短く、スパイクが最大になった直後に、速度ピークにおける運動の平均振幅は最大に増加する。この図示されたケースにおいて、速度ピークの最大値は、Ｃａ２＋が最大になってから２０秒後に起こる。ここで留意すべきは、運動の平均振幅は、Ｃａ２＋最大値と同じ１０秒のインターバル内で加速し始めることである。
【図8】図８は、細胞質内運動のパターンを重ね合わせたヒト卵母細胞の画像である。各ベクトルマップは、あるフレームとその次のフレームとの間の１０秒のインターバルにおける運動を記録する。この一対のベクトルマップは２０秒間隔をあけて回収されたものであり、これらは、運動の位置を変えずに運動の方向が逆転していることを図示している。
【図9a】図９は、接合体における細胞質内運動を示す。ＦＣの上の面（ａ）、ＦＣを二等分する面（ｃ）、およびＦＣの下の面（ｅ）で画像化された、接合体中の平均細胞質内速度を示す。（ｂ）、（ｄ）、および（ｆ）はそれぞれ（ａ）、（ｃ）、および（ｅ）において矢印でマークされたタイムポイントの細胞質内速度である。背景の色は、局所的な速度の値を示す。ＦＣは、５時の方向に観察することができる。スケールバーは１０μｍである。（ｇ）精子が注入された卵における第一および第二のＣａ２＋一過性上昇の際に記録された速度ピークである。
【図9b】同上。
【図9c】同上。
【図9d】同上。
【図9e】同上。
【図9f】同上。
【図9g】同上。
【図10】図１０は、受精丘の皮質におけるアクチンの再構成を示す。（ａ）は、タイムラプス動画からのさらなる画像であり、ＦＣにおける（ＵｔｒＣＨ−ＥＧＦＰで標識された）アクチンの再構成を示す。ＦＣ形状における変化に伴う、ＦＣ皮質におけるＵｔｒＣＨ−ＥＧＦＰ強度における変化である。ＦＣが平坦化すると（平坦化の開始は赤色のラインでマークされる）、Ｆ−アクチンを標識するＵｔｒＣＨ−ＥＧＦＰの強度が弱くなる。ＦＣが次第に突き出てくると、ＵｔｒＣＨ−ＥＧＦＰの強度は再び増加する。Ｇａｐ４３−ＲＦＰは、膜マーカーとして役立った。画像を２０秒毎に取り、常に４番目の画像を示す。（ｂ）は、（ａ）で示されたＦＣの皮質領域をズームした画像である。スケールバーは１０μｍである。
【図11】図１１は、受精丘の皮質におけるミオシンの再構成を示す。（ａ）は、タイムラプス動画からのさらなる画像であり、ＦＣにおける（ＭｙｏＲＬＣ−ＧＦＰで標識された）ミオシンの再構成を示す。ＦＣ皮質の肩におけるＭｙｏＲＬＣ−ＧＦＰの強度は、ＦＣ形状における変化に従って変化する。ＦＣが平坦化すると（平坦化の開始は赤色のラインでマークされる）、ＭｙｏＲＬＣ−ＧＦＰの強度は弱くなる。ＦＣが次第に突き出てくると、ＭｙｏＲＬＣ−ＧＦＰの強度は再び増加する。Ｇａｐ４３−ＲＦＰは、膜マーカーとして役立った。画像を２０秒毎に取り、常に２番目の画像を示す。（ｂ）および（ｃ）は、（ａ）でそれぞれ数字１および２で示されたＦＣの皮質領域をズームした画像である。スケールバーは１０μｍである。
【図12】図１２は、マウス接合体におけるＣａ２＋キレート化および細胞骨格阻害剤の微小管およびアクトミオシンに対する作用を示す。分裂後期の隆起が起こったら、体外受精した卵を阻害剤に移した。画像は、前もって薬物と２０分インキュベートした直後（２０＋０分）、あるいは１．５または３時間インキュベートした後（それぞれ０＋９０分、および０＋１８０分）に固定された代表的な接合体の共焦点Ｚ−スタックス（Z-stacks）から調製された突起を示す。実験用およびコントロール接合体を同じ設定でスキャンした。ジャスプラキノリド処理した接合体のファロイジン染色ではＦ−アクチンを示すことはできなかったが（下から３番目のパネル）、これは、ジャスプラキノリドはファロイジンと同じ結合部位を競合して適切な染色を妨げるためである。抗アクチン抗体での染色から、ジャスプラキノリドにより、より厚いアクチンの皮質層（２つの下のパネル）の形成が起こったことが明らかになった。雌性クロマチンはｆで示し、雄性クロマチンはｍで示した。スケールバーは１０μｍである。
【図13a】図１３は、ＤＩＣイメージングはマウス胚の発生に影響を与えないことを示す。図１３ａは、平均の基底速度で胚細胞期に達する確率と、平均ピーク間インターバルの調整との相互関係を証明する数学モデルである。平均ピーク間インターバルは、＋１ＳＤであり（上のライン）、平均ピーク間インターバルは、＋０．５ＳＤであり（上から二番目のライン）、平均ピーク間インターバル（上から三番目のライン）、平均ピーク間インターバルは、−０．５ＳＤであり（上から四番目のライン）、平均ピーク間インターバルは、−１ＳＤである（下のライン）。
【図13b】図１３ｂは、胚細胞期（すなわち細胞が３２個以上）に達する確率と平均ピーク間インターバルとの相互関係を、平均基底速度の適用により証明する数学モデルである。平均ピーク間インターバルは、＋１ＳＤであり（上のライン）、平均ピーク間インターバルは、＋０．５ＳＤであり（上から二番目のライン）、平均ピーク間インターバル（上から三番目のライン）、平均ピーク間インターバルは、−０．５ＳＤであり（上から四番目のライン）、平均ピーク間インターバルは、−１ＳＤである（下のライン）。
【発明を実施するための形態】
【0025】
用語「胚」は、本明細書では、単一細胞である受精卵からの最も初期の哺乳動物の有機体を意味するものとして用いられる。卵は、精子と融合することにより受精する。卵を体外受精させて胚を得ることもできる。単一細胞胚は、生きた細胞である。
【0026】
本発明の方法は、あらゆる適切な哺乳動物種由来の胚に適用することができ、このような哺乳動物種としては、例えば：霊長類、例えばヒト、大型類人猿（例えばゴリラ、チンパンジー、オランウータン）、旧世界ザル、新世界ザル；げっ歯類（例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター）；ネコ；イヌ；ウサギ目（例えば、アナウサギ）；ウシ；ヒツジ；ヤギ；ウマ；ブタ；およびその他のあらゆる家畜、農業用、実験用または家庭用の哺乳動物が挙げられる。実施例で説明した研究はマウスで行ったが、予備的な結果から、ヒト単一細胞胚でも類似した細胞質内運動パターンが生じることが示された。
【0027】
哺乳動物の胚の「発生能」は、胚の品質の尺度である。これは、引き続き発生が成功する胚の能力の尺度である。発生の成功は、所定期間にわたり、あるいは特定の条件下で（例えば培養液中で増殖させた後か、あるいは母となるレシピエントへの胚の移植の後に）達成することができる。母となるレシピエントへの移植は、最終的に妊娠するために、母親になる予定のものに胚を移植することを意味する。母親は、胚を生じる卵（雌性配偶子）のドナーまたは源であってもよいし、あるいは代理母であってもよい。
【0028】
胚の発生能の予測は、引き続き発生が成功する胚の能力の予測である。発生能の予測は、胚が特定のステージまで発達する能力を有するかどうかの予測を含んでもよい。その例としては、胚を培養液中で増殖させた場合、胚が胚盤胞期に達することの予測、あるいは胚を母となるレシピエントに移植した後、胚が、卵筒期まで、または最後のステージまで発達することの予測が挙げられる。このような予測は、胚が特定の発生ステージに達すると予測される確率の決定、または所定期間中に特定の発生ステージに達すると予測される確率を含んでもよい。例えば、このような予測は、培養液中で４日増殖させた後、胚が胚盤胞期に達すると予測される確率を決めることもできる。その後、必ずしも胚が予測に従って培養されなくてもよい。その代わりに、胚が母となるレシピエントに移植されてもよい。このような予測は、胚が所定期間の後に到達すると予測される発生ステージの予測を含んでもよい。その例としては、培養液中での期間の後に、例えば培養液中で１、２、３、４、５、６日またはそれより長く増殖させた後に、胚が有すると予測される細胞の数の予測が挙げられる。
【0029】
いくつかのケースにおいて、発生能の予測は、胚中の細胞質内運動および／または単一胚の形状の周期的な変化の測定に基づく。その他の実施態様において、発生の予測は、これらの測定に基づくことに加えて、発生の成功を予測することが知られているその他のパラメーターも併用する。例えば、単一細胞胚で細胞質内運動および／または胚の形状の周期的な変化を測定した後、続いて胚を培養してもよく、さらに、培養液中における胚の発生の程度および／または形態学を、胚の発生能を評価することに利用してもよい。
【0030】
用語「細胞質内運動」は、細胞質の流体動力学的な挙動を意味する。細胞質とは、単一細胞胚中の流体相である。未受精卵または受精卵において、雌性減数分裂における第二分裂の一倍体の染色体組が脱凝縮して核膜を獲得するまで、さらに受精卵の場合は、精子クロマチンが正確にヒストンと接触して核膜に封入されるようになるまで、通常の細胞核は存在しない。このような雌性および雄性前核の形成は、最初の胚細胞分裂の前に起こる。前核が形成されるまで、本明細書で説明されているような細胞質内運動が起こる。
【0031】
用語「平均（average）」は、本明細書で用いられる場合、中心傾向の尺度を意味する。「平均」は、平均値（mean）および中央値（median）を包含する。「平均細胞質内速度（average cytoplasmic speed）」は、単一細胞胚を通る単一面で測定された、あるいは細胞質全体で測定された、例えば細胞全体を通過する一続きの面で測定された、いずれかの特定の時間における平均速度を意味する。
【0032】
発明者等は、受精前、マウス卵における細胞質内運動は遅く、比較的均等であることを示した。受精は、卵中での細胞質内運動速度の劇的な周期的増加および減少を誘発する。これらの突然の周期的かつ一時的な細胞質内の流れは、その間に起こるより低い速度の運動とは異なっており、本明細書では「速度ピーク」と称する。
【0033】
用語「事後運動（after-movement）」は、速度ピークの劇的な速度減少の直後に起こる可能性がある細胞質内運動を意味するが、これは、より高振幅であり、速度ピーク間に起こるそれより遅い運動と区別することができる。速度ピークは、事後運動を含む場合がある。
【0034】
速度ピークは、卵の細胞質中全体で発生しており、受精後から前核形成までおよそ４時間続く可能性がある。速度ピークは、この期間中、経時的に胚中の平均細胞質内速度を測定することによって確認することができる。速度ピークは、単一細胞胚中のあらゆる面で確認することができる。しかしながら、速度ピークの振幅は、細胞の赤道面で最大である。
【0035】
速度ピークの振幅は、経時的に変化する可能性がある。最初の速度ピークは、比較的高い振幅を示す可能性があり、その後に速度ピークが比較的低い振幅を有する期間（減数第二分裂の分裂後期の開始時と初期のＦＣ伸長との間であり、本明細書において「ステージ１」と称される）が続く。ＦＣ形成が完了するか、あるいは伸長したら（本明細書において「ステージ２」と称される）、速度ピークの振幅はより大きくなる可能性がある。速度ピークの振幅は、ＦＣ退縮の間とその後に減少する可能性がある（本明細書において「ステージ３」と称される）。
【0036】
速度ピークの急速な細胞質内運動の方向またはベクトルは、同じ受精卵で記録された速度ピーク間で異なっていてもよい。ステージ１の間、ベクトルは、典型的には第二極体（ＰＢ）の発生に向かう。ステージ２の間、ベクトルは、典型的には直接ＦＣに向かうか、あるいはわずかに入れ替わって第二極体に向かう。
【0037】
単一細胞胚中の細胞質内運動の２つの連続した速度ピークが確認されたら、それらのピーク間の時間のインターバルを測定することができる。２つより多くの連続した速度ピークが確認されたら、胚における速度ピーク間平均インターバルを決定することができる。
【0038】
受精丘（ＦＣ）は、受精能のある精子と接触したときに受精卵表面から突き出る一過性の円錐型の突起である。また速度ピークまたはＦＣの拍動は、胚におけるＣａ２＋一過性上昇と同時に起こる可能性がある。「平均基底細胞質内速度」は、記録された最初の速度ピークの前の期間、速度ピーク間の期間、および／または記録された最後の速度ピークの後の経時的な平均細胞質内速度である。平均基底細胞質内速度は、これらの期間の１つまたはそれより多くの間のあらゆる時点で測定することができる。本発明の方法に係るいくつかのケースにおいて、平均細胞質内速度は、記録された最初の速度ピークまで測定されるか、ある別個の速度ピークの直後から次の別個の速度ピークの開始時まで測定されるか、および／または、記録された最後の別個の速度ピークの直後に測定される。平均基底細胞質内速度は、これらの期間全体で決定してもよい。
【0039】
いくつかのケースにおいて、胚の発生能は、速度ピーク間もしくはＦＣの拍動間インターバル、速度ピーク間もしくはＦＣの拍動間平均インターバル、または平均基底細胞質内速度と、１つまたはそれより多くの予め決定された参考値とを比較することによって予測される。参考値は、これらのパラメーターと高いまたは低い発生能の指標との相互関係を示す以前のデータに基づいて経験的に決定することもできる。
【0040】
いくつかのケースにおいて、測定は、胚が受精と前核形成との間の発生ステージにあるときになされる。「前核形成」とは、精子と卵クロマチンとの脱凝縮、およびより小さい核小体を含む間期核の形成である。このような形成は、明視野またはＤＩＣ（微分干渉コントラスト）画像で当業者により確認することができる。
【0041】
いくつかのケースにおいて、単一細胞胚は、受精と受精丘の退縮との間の発生ステージにある。いくつかのケースにおいて、単一細胞胚は、極体の突き出しの後、および前核の形成の前、または受精丘の退縮の前の発生ステージにある。極体の突き出しは、卵との接触ゾーンにおける極体の端部が丸くなるときに観察され、これは、分裂溝が引き締まることを示唆している。
【0042】
いくつかのケースにおいて、胚は、受精丘形成が完了した発生ステージにある。これは、受精丘の形成と退縮との間の期間である。いくつかのケースにおいて、発生能の予測は、受精丘が存在する期間中になされた細胞質内運動の測定に基づく。マウスにおいて、受精丘は、受精からおよそ１〜１．５時間後からおよそ２時間存在する。典型的には、受精丘は、卵を体外受精させる場合、精子とインキュベートしてから約２時間後に形成が始まると予想される。本発明の方法に係るいくつかのケースにおいて、測定は、精子と卵とを共に２時間インキュベートしてした後になされる。
【0043】
いくつかのケースにおいて、測定することは、タイムラプス画像の捕捉、それに続く定量的な画像解析を含む。タイムラプス画像は、単一細胞胚を通る単一面から捕捉することができる。ＦＣ形成が完了するステージ２の間、速度ピークは最も速いために最も容易に区別され、速度ピークの細胞質内運動は、典型的にはＦＣに向かう。また細胞の赤道面でも、速度ピークは最も速い。さらに赤道面は最大なので、最良の品質の画像が得られる。好ましくは、タイムラプス画像は、細胞中心を通る単一面から捕捉される。好ましくは、タイムラプス画像は、ＦＣを赤道で二等分する単一面から捕捉される。
【0044】
本発明の方法に従って評価される胚は、実験的使用などのその後の下流の手法で使用することを意図していてもよいし、または母となるレシピエントに移植して、最終的に妊娠させるために使用することを意図していてもよい。従って、胚へのあらゆるダメージを最小化しつつ評価方法を実行することが重要である。本発明の方法は、非侵襲的であってもよい。例えば、本発明の方法の利点の一つは、細胞に添加される色素（例えば蛍光性色素）がまったく存在しない状態で行うことができる点である。さらに発明者等は、受精丘の拍動と一致する速度ピークは、アクトミオシン細胞骨格の動力学に依存することを見出した。それゆえに、細胞質内運動の本来のパターンおよび胚の形状の変化に起こり得る作用を最小化するために、測定は、好ましくは、細胞骨格の機能または動力学および／または受精丘の形成に干渉しないか、あるいは干渉を最小化するような方法でなされる。
【0045】
特に好ましい実施態様において、画像化された単一細胞胚は、培地の小液滴中に単一細胞胚群が緊密に詰まった状態で保持される。好ましくは、培地の小液滴の体積は、３０μｌ未満、または２０μｌ未満である。この体積は、５〜１０μｌの体積であってもよい。発明者等は、これは、細胞の構造的な動力学に影響を及ぼすことなく、胚の位置を安定化すること、すなわち胚を静止した状態に保つ有効な方法であることを見出した。
【0046】
あるいは、胚は、培地の液滴中で１個の胚であってもよい。培地は、一定のｐＨを維持するために、例えばＨＥＰＥＳで緩衝化されていてもよい。あるいは人工気候室を用いて安定したｐＨを維持してもよい。培地のｐＨを正しいレベルに維持するために、人工気候室には、ＣＯ２、例えば５％ＣＯ２が供給されてもよい。
【0047】
また人工気候室を用いて、イメージング中の胚の温度を調節することもできる。例えば、温度は、３５〜４０℃、または３７〜３８℃、または約３７．５℃に維持してもよい。また温度は、加熱台を用いて制御してもよい。
【0048】
好ましくは、画像は、胚にダメージを与えない光を用いて捕捉される。例えば、長い曝露、強い光または短波長は、活性酸素種の生産によりＤＮＡおよび呼吸鎖にダメージを与える可能性がある。放射照度および曝露時間は、例えば速いランプのシャッター速度または発光ダイオード（ＬＥＤ）光源を選択すること、加えて画像回収に超高感度センサーを使用することにより最小化することができる。光学フィルターまたは単一波長のＬＥＤ光源の使用により、適切な波長が選択される可能性がある。白色の透過光を用いてもよい。
【0049】
細胞質内運動および細胞の形状における変化を測定するのに適したイメージングシステムで、明視野顕微鏡を使用してもよい。あるいはこのようなシステムは、例えば微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）、ホフマン変調コントラストまたは位相差顕微鏡などの高コントラスト技術を使用してもよい。
【0050】
本発明のその他の利点は、最初の胚細胞分裂の前に、極めて初期の発生ステージの胚から短い期間で記録された測定値から、極めて初期に胚の発生能を評価する方法を提供する点である。いくつかのケースにおいて、関連する測定は全て、受精の６時間以内に、より好ましくは５、４、３、２または１時間内になされる。いくつかのケースにおいて、測定値は全て、胚で前核が形成される前になされる。より好ましくは、測定値は全て、ＦＣ退縮の前になされる。例えば、胚のタイムラプス画像は全て、これらの期間内に捕捉されてもよい。いくつかのケースにおいて、本方法は、発生能の予測を含む場合、受精から６日以内、より好ましくは４、３、２または１日以内、または受精から１２、６、４、３、２もしくは１時間以内に完了する。
【0051】
いくつかのケースにおいて、定量的画像解析は、粒子画像速度測定法（ＰＩＶ）を使用する。ＰＩＶは、連続的な画像対間の、相互関係を示す画像のサブ領域に関連する、流体動力学で広く用いられている標準的な解析技術である２１〜２４。ＰＩＶ解析を用いて、各画像を四角の検査領域に分割することができ、さらに順に並んだ次の画像の比較的大きい領域内で相互相関係数分布を計算することができる。相互相関係数分布のピークから、第一の画像の検査領域における材料の、第二の画像における最も可能性が高い配置が得られる。次にこれを用いて、所定時間にわたる画像間の変位ベクトルを計算することができる（図１Ａ）。ピクセル領域のコントラストパターンの変位が多くのピクセルで測定されるため、この技術２２、２４、４８によってサブピクセルの運動を正確に測定することが可能である。
【0052】
いくつかのケースにおいて、本発明によれば、胚群中の１個またはそれより多くの胚は、それらの発生能に従って格付けすることができる。各胚の発生能は、その胚群中の他の胚の発生能と比較して格付することができる。それにより、胚群のうちどの胚が、具体的なその後の目的とする使用に最も適しているのか、例えば妊娠するために母となるレシピエントに移植することに最も適しているのかを決定する有用な方法を提供することができる。それによって、胚の発生能に従って胚を選択することができる。
【0053】
本方法は、母平均（population mean）インターバルまたは平均インターバル(average interval)を速度ピーク間もしくはＦＣの拍動間で、および／または母平均の平均基底細胞質内速度を計算することを含んでいてもよい。本方法は、これらのパラメーターに関する母標準偏差を計算することを含んでいてもよい。母集団における明白な異常値は、計算から排除してもよい。例えば、平均からの標準偏差が１より大きい、または標準偏差が１．５より大きい、または標準偏差が２より大きい、または標準偏差が３より大きいか、あるいは計算された値の上からおよび／または下から１０％の、計算された速度ピーク間もしくはＦＣの拍動間のインターバルまたは平均インターバル、または計算された平均基底細胞質内速度を有する胚は、排除してもよい。母平均および／または標準偏差を用いて、母集団中の１個またはそれより多くの胚の相対的な発生能を定量することができる。高い発生能を有する胚の指標は、例えば、計算された速度ピーク間のインターバルまたは平均インターバルが、母平均の速度ピーク間インターバルまたは平均インターバルよりも長いこと、および／または、平均基底細胞質内速度が母平均の平均基底細胞質内速度よりも速いことであってもよい。
【0054】
逆に言えば、高い発生能を有する胚の指標は、計算された速度ピーク間のインターバルまたは平均インターバルが、母平均の速度ピーク間インターバルまたは平均インターバルよりも短いこと、および／または、平均基底細胞質内速度が、母平均の平均基底細胞質内速度よりも遅いことであってもよい。
【0055】
同様に、高いまたは低い発生能を有する胚の指標は、それぞれ、計算されたインターバルまたは速度ピーク間の平均インターバルが、少なくとも半分、または少なくとも３分の１、または少なくとも４分の１、あるいは少なくとも１、２または３の標準偏差で母平均インターバルまたは速度ピーク間の平均インターバルよりも長いかあるいは短いこと、および／または、平均基底細胞質内速度が、少なくとも半分、または少なくとも３分の１、または少なくとも４分の１であるか、あるいは少なくとも１、２または３の標準偏差で母集団の母平均の平均基底細胞質内速度よりも速いかあるいは遅いことであってもよい。
【実施例】
【0056】
新鮮なマウス受精卵の速いイメージングと、粒子画像速度測定法に基づく高度画像分析とを組み合わせるこにより、受精は、精子頭部の上に形成される突起の拍動と一致する周期的な細胞質内運動を誘導することが明らかになる。我々は、これらの運動は、受精により誘導されたＣａ２＋振動によって誘発されたアクトミオシン細胞骨格の収縮によって引き起こされることを見出した。最も重要なことに、このように運動と卵活性化現象とが関係していることにより、接合体がうまく発生するかどうかを予測するのにこのような運動を単独で使用することが可能になる。この方法は、体外受精した卵の生命力を予測するための、最も初期の最も速い非侵襲的な方法を提供するものであり、従って、ＩＶＦ治療の可能性を大いに改善することもできる。
【0057】
方法卵および精子の回収
Ｆ１（Ｃ５７Ｂｌ６×ＣＢＡ）マウスの雌を過排卵させ、卵母細胞および接合体を上述したようにして４４回収した。単為生殖的活性化は、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋を含まず１０ｍＭＳｒＣｌ２が補充されたＭ２培地中で卵を４時間インキュベートすることにより行われた。卵核胞（ＧＶ）期卵母細胞を卵巣から単離して１５０μｇ／ｍｌジブチリル環状ＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）が補充されたＭ２培地に入れた。精巣上体精子をＦ１の雄から単離し、４ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含む受精用培地０．５ｍｌ中で受精できるようにした４５。すでに述べられたようにして４４、ＫＳＯＭ培地中で胚を画像化した。イメージング前のいくつかの実験で、胚を、３０μＭのＢＡＰＴＡ−ＡＭ（Ｃａ２＋をキレート化するため）、５μｇ／ｍｌノコダゾール（微小管を脱重合するため）、２μｇ／ｍｌサイトカラシンＤ（Ｆ−アクチンを脱重合するため）、１０μＭタキソール（微小管を安定化させるため）または１００ｎＭジャスプラキノリド（Ｆ−アクチンを安定化させるため）と共に２０分プレインキュベートし、続いて純粋なＫＳＯＭ（ＢＡＰＴＡ処理した胚）または各薬物を含むＫＳＯＭ（上記処理した胚の残り）に移した。（ミオシン軽鎖キナーゼ（ＭＬＣＫ）を阻害して、ミオシンＩＩを活性化するために４６）ＭＬ−７で処理された胚を、２５μＭＭＬ−７と共に２０分プレインキュベートし、続いて、２５μＭのＭＬ−７含有ＫＳＯＭを含む培養皿中で、ＭＬ−７を吸収すると予想されるミネラルオイルで覆わないで画像化した。
【0058】
細胞質内運動のイメージングおよび相互相関の解析ほとんどの実験で、倒立共焦点顕微鏡（ツァイス（Zeiss）のＬＳＭ５１０メタ（Meta））下で、３７．５℃および５％ＣＯ２で、接合体を単一面で画像化した。６３３ｎｍのＨｅＮｅレーザーを用いてＤＩＣ画像を１０秒毎に捕捉した。遊離Ｃａ２＋イオン濃度を測定するために、胚を、５μＭのＦｕｒａＲｅｄ−ＡＭ（インビトロジェン（Invitrogen））およびＦｕｒａＲｅｄ中で２０分プレインキュベートし、ＤＩＣ画像を４８８ｎｍのアルゴンレーザーで同時に得た。細胞質内運動と胚の発生能との相関を試験した実験において、接合体を単一面で、透過光中で、標準的な非共焦点顕微鏡（ツァイスのアキシオバート（Axiovert）またはデルタビジョン（Deltavision））で、１０秒毎に２．５時間、画像化した。接合体の皮質および中央部分における細胞質内運動を比較した実験において、胚を、デルタビジョン顕微鏡で、１１面で、６μｍ毎に、１０秒毎に３時間、画像化した。表７に、用いられた全てのイメージングシステムの光学的な詳細を要約した。ＦｕｒａＲｅｄ蛍光の強度を、イメージＪ（ImageJ）ソフトウェアを用いて測定した。ＭａｔＰＩＶ ｖ１．６．１から適用したアルゴリズムを用いたＭＡＴＬＡＢ（マスワークス社（The Mathworks Inc.）、米国マサチューセッツ州ナティック）で特注のソフトウェアを用いて画像を解析した４７。アルゴリズムは、連続的な画像対間の相互関係を示す画像のサブ領域に関連する、流体動力学で広く用いられている標準的な解析技術のＰＩＶで用いられるアルゴリズムをベースとする２１〜２４。ＰＩＶ解析において、各画像を四角の検査領域に分け、相互相関係数分布を、順に並んだ次の画像のそれより大きい領域内で計算した。相互相関係数分布のピークから、第一の画像における検査領域の材料の第二の画像における最も可能性が高い配置が得られた。次にこれを用いて、画像間の時間にわたる変位ベクトルを計算した（図１Ａ）。多くのピクセルにわたりピクセル領域のコントラストパターンの変位が測定されるため、この技術を用いてサブピクセルの運動を正確に測定することが可能である２２、２４、４８。
【0059】
粒子画像速度測定法（ＰＩＶ）解析ＭａｔＰＩＶ ｖ１．６．１５０から適合させたアルゴリズムを用いたＭＡＴＬＡＢ（マスワークス社、米国マサチューセッツ州ナティック）で特注のソフトウェアを用いて、受精卵のＤＩＣ画像を解析した。このアルゴリズムは、相互関係を示す連続的な画像対間のサブ領域に基づくパターン整合技術の使用に関連する標準的な解析技術であるＰＩＶで用いられるアルゴリズムをベースとする（本文における方法および図１ａを参照）。解析されたそれぞれの検査領域に関する変位を計算するために、続いて繰り返し２回のＰＩＶを用いた。第一のより大きい検査領域の変位を計算し、続いてそれを、より小さい検査領域での次の反復のための探索領域の中心をどこにするかの推測値として用いた。アルゴリズムが最良のフィッティングを探す領域は、検査領域それ自身より２倍大きかった。図１ａにおいて、この図は、ＰＩＶアルゴリズムの１回の反復を示す。ツァイスのＬＳＭ５１０メタ共焦点顕微鏡で行われた実験では、第一の反復に６４×６４ピクセルの最初の検査領域サイズを用い、続いて第二の反復に３２×３２ピクセルの検査領域を用いた。このイメージングシステムのピクセルサイズは、０．３５μｍであった。ツァイスのアキシオバートおよびデルタビジョン顕微鏡で行われたより大きいピクセルサイズ（それぞれ０．６４および０．８３μｍ）での実験について、第一の反復に、３２×３２ピクセルの最初の検査領域サイズを用い、続いて第二の反復に、１６×１６ピクセルの検査領域を用いた。各細胞の中心における１１×１１ベクトルの正方形の平均振幅をとることにより、細胞質内運動の平均速度を計算した。
【0060】
ＰＩＶを使用して、速度ピーク間の期間で観察されるような極めて小さい（サブピクセルレベルの）変位を測定することの精度の試験は、より高い倍率（２５２倍、すなわち対物の倍率が６３倍であり、デジタル倍率が４倍である）でとられた卵の画像を用いて、画像を人工的にシフトさせ、続いて実験で用いられるのと同じレベルに（１４倍、すなわち対物の倍率が２０倍であり、デジタル倍率が０．７倍である）倍率および画像解像度を低くすることによってなされた。続いてＰＩＶを用いてシフトを測定した。エラーは、およそ０．３ピクセル未満の変位に関しては、変位にほぼ直線的に比例しており（図１４）、これは、実験的に測定された基底運動の範囲のほとんどを含むことが見出された。これは、小さい変位を測定する場合のＰＩＶ精度を調べた他の研究と一致する２４、２６，５１。基底運動の順の変位（ツァイスのＬＳＭ５１０メタで０．１〜０．３ピクセル／フレームまたは３．５〜１０．６ｎｍ／秒、ツァイスのアキシオバートで６．４〜１９．２ｎｍ／秒、およびデルタビジョンで８．３〜２４．９ｎｍ／秒）は、−１８．１％〜−１５．５％のエラーを示した（図１４）。比較目的でＰＩＶ測定が用いられるため、これらのシステム上の過小評価は、結果またはそれらの解釈にほとんど影響しなかった。
【0061】
細胞質内速度および運動方向の解析細胞質内速度における振動の変化を示した接合体において、平均基底速度は、事後運動の最後とそれに続く速度ピークの開始時との間のインターバルで、または最後の事後運動の後の期間に測定された（図１Ｄ）。速度の振動を提示しなかった接合体について、平均基底速度は全ての記録期間で計算された。ほとんどの場合、細胞質内運動の方向は、接合体でＰＩＶによって生じた全てのベクトルの平均ベクトルに基づいて評価された。いくつかの接合体において、ベクトルは一対の渦流を形成し、続いてその方向に沿って共通の軸が形成された。極めて不規則なベクトルパターンの方向は、高い規則性を有するベクトルの大半の方向から、視覚的に評価した。
【0062】
卵細胞質内精子注入法ライカ（Leica）の微調整装置およびライカの倒立顕微鏡を用いて、これまでに述べられたようにしてＩＣＳＩを行った４９。いくつかの実験で、新たに単離した精子の代わりに熱不活化した精子（６０℃で３０分）を用いた。精子懸濁液を１０％ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ、Ｍｒ＝３６０ｋＤａ）を含むＭ２培地と混合した。圧電マイクロピペット駆動ユニット（IntraCel PMAS-CT150、プライムテック（PrimeTech）、日本）を用いて精子を卵母細胞のサイトゾルに送達した。
【0063】
体外受精および胚移植細胞質内運動と胚の発生能との相関を試験するために、１０μｌの受精能のある精子の懸濁液を卵丘細胞で取り囲まれた卵に添加し、続いて配偶子と共に２時間インキュベートした。阻害剤の特異性を試験する実験、またはアクチンおよびミオシンの生きた状態のイメージングを含む実験では、受精前に、卵を酸性タイロード溶液（ｐＨ＝２．５）で短時間で処理して透明帯を除去し、続いておよそ１μｌの受精能のある精子の懸濁液と混合して、一緒に３０分インキュベートした。いずれのケースにおいても、受精は、４ｍｇ／ｍｌのＢＳＡが補充された受精用培地中で行われた４５。２細胞期の胚を、精管切除した雄と交配したレシピエントのＦ１の雌の卵管に０．５ｄｐｃで移した。これらを６．５ｄｐｃまたは１９．５ｄｐｃに解剖した。
【0064】
アクチンフィラメントおよびミオシンＩＩの生きた状態のイメージングＥＧＦＰに融合したユートロフィンのアクチン結合ドメイン（ＵｔｒＣＨ−ＥＧＦＰ２６）、ＧＦＰに融合したミオシンＩＩ調節軽鎖（ＭｙｏＲＬＣ−ＧＦＰ２７）、およびＲＦＰでタグ付けされたタンパク質マーカーＧａｐ４３をコードするコンストラクト５０を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＲＮ３Ｐベクターにクローニングし、ｍメッセージｍマシーン（mMessage mMachine）Ｔ３キット（アンビオン（Ambion））を用いてＴ３プロモーターからｍＲＮＡを合成した。ｍＲＮＡ（ピペット濃度は、ＵｔｒＣＨ−ＥＧＦＰおよびＭｙｏＲＬＣ−ＧＦＰの場合、０．５μｇ／μｌであり、Ｇａｐ４３−ＲＦＰの場合は、０．３６μｇ／μｌである）を、ＧＶ卵母細胞に注入し、続いてこれを１５０μｇ／ｍｌのｄｂｃＡＭＰを含むＭ２中でおよそ５時間培養し、続いて洗浄し、Ｍ１６培地に移して成熟させた。１６時間後にＭＩＩ期に達した卵母細胞を体外受精用に選択し、続いて倒立型回転円盤共焦点顕微鏡（ツァイス）で１０〜１５秒毎に画像化した。ＵｔｒＣＨ−ＥＧＦＰ、ＭｙｏＲＬＣ−ＧＦＰ、およびＧａｐ４３−ＲＦＰの蛍光強度を、イメージＪソフトウェアを用いてＦＣ皮質および細胞質中で測定した。皮質のＵｔｒＣＨ−ＥＧＦＰ、ＭｙｏＲＬＣ−ＧＦＰ、およびＧａｐ４３−ＲＦＰについて得られた値を細胞質について得られたそれぞれの強度で標準化して、例えばレーザーパワーの変動などのイメージングにおけるアーティファクトによって引き起こされるあらゆる強度変化を除去した。続いて最終結果を、強度を標準化したＵｔｒＣＨ−ＥＧＦＰとＧａｐ４３−ＲＦＰとの比率またはＭｙｏＲＬＣ−ＧＦＰとＧａｐ４３−ＲＦＰとの比率として示して、焦点のシフトによって引き起こされるあらゆる強度変化を除去した。
【0065】
免疫染色以前に説明された通りにして、胚を４％ＰＦＡ中で固定し、透過化した４４。倒立共焦点顕微鏡（ツァイスのＬＳＭ５１０メタ）を用いて胚をスキャンした。
【0066】
より詳細には、胚を４％ＰＦＡ中で固定し（３０分、室温または４℃で一晩）、０．２〜０．５％トリトン（Triton）−Ｘ１００で透過化し（３０分、室温）、３％ＢＳＡまたは１０％ＦＣＳでブロックした。その後、これらを以下の抗体および色素で染色した：１）ＦＩＴＣで標識したマウス抗チューブリンβ抗体（シグマ−アルドリッチ（Sigma-Aldrich）；３％ＢＳＡで１：５０に希釈、室温で１．５時間）；
２）マウス抗アクチンベータ抗体（シグマ−アルドリッチ；３％ＢＳＡで１：１００に希釈、室温で１．５時間）
３）ヤギ抗Ｇａｔａ４一次抗体（サンタクルーズ（Santa Cruz）；１０％ＦＣＳで１：２００、４℃で一晩）、続いてアレクサフルオロ（Alexafluor）５６８で標識した二次抗体（モレキュラープローブス；１０％ＦＣＳで１：１０００、室温で１．５時間）；
４）テキサスレッド（TexasRed）またはオレゴングリーン（OregonGreen）で標識したファロイジン（インビトロジェン（Invitrogen）；１：１００、室温で３０分、または４℃で一晩）；
５）ヘキスト（Hoechst）３３３４２（モレキュラープローブス（Molecular Probes）；ＰＢＳ中で１００ｎｇ／μｌ、室温で３０分、または４℃で一晩）。
【0067】
倒立共焦点顕微鏡（ツァイスのＬＳＭ５１０メタ）を用いて胚をスキャンした。統計的分析
スチューデントのｔ検定、カイ二乗検定または適切な回帰モデルのいずれかを用いて統計的分析を行った。行われた実験の連続的な性質および我々が取り組もうとしている質問のアプリオリな性質のために、我々は、統計的有意性を５％レベルで評価した。平均基底速度または速度ピーク間平均インターバルと、発生４日後に生産された細胞の総数（すなわち４日齢の細胞数）との関係を決定するために、我々は、平均細胞数と説明変数の線形結合とを関連付ける対数リンク関数：平均基底速度、平均基底速度の二乗、速度ピーク間平均インターバル、速度ピーク間平均インターバルの二乗、および基底速度と速度ピーク変数との様々な相互作用を用いて負の二項モデルを胚の細胞数にフィッティングした。我々の最初の解析において、我々は、胚発生で使用されたイメージングシステム（ツァイスまたはデルタビジョン）の起こり得る交絡作用を考慮した。しかしながら、我々は、解析されたパラメーター、すなわち速度ピーク間の平均インターバルの二次効果と、画像システムとの相互作用は統計学的に有意ではなく、さらに説明能力にまったく寄与しないことを見出したために、我々はそれらを我々の最終的な解析から排除した。最終モデルと比較して記載された上記全ての変数を用いたフルモデルの尤度比検定により、対数尤度において統計学的に有意ではない変化が生じた（ｐ＝０．５３）。細胞数データ５１で観察されたバリエーションを説明するために、より標準的な細胞数のポアソン回帰モデリングに対して細胞数の負の二項モデリングを選択した。
【0068】
上述したのと同じ説明変数と、接合体が発生して胚盤胞になる（すなわち少なくとも３２細胞期に達する）確率との関係を調査するために、我々はさらに、発生４日後に生産された細胞の総数を二分割して二項変数にした後にロジスティック回帰モデルをフィッティングすることによっても我々のデータを解析したところ、細胞総数が３１細胞を超えたかどうかが示された。最終的なロジスティックモデルは、最終的な負の二項モデルにおける説明変数と同じ説明変数を含んでいた。最終モデルに対するフルモデルの尤度比検定は、対数尤度（ｐ＝０．３０）において統計学的に有意ではない変化を生じる。
【0069】
実施例１マウス卵の受精により周期的な細胞質内の動きのバーストが起こる
マウス卵の受精の際の細胞質内運動を特徴付けて、それらが受精に関連する他の現象に関連するのか、加えて関連する場合はどのようにして関連するのかを評価するために、我々はまず、受精直後から前核形成までの時間、卵を撮影した。続いて我々はＰＩＶ法２１〜２４に基づく高度画像分析用いて、これらの運動を解析し、定量した（図１Ａ）。それにより、マウス卵が受精した後、細胞質内運動の速度が劇的に周期的増加および減少を起こす（我々は、速度ピークと名付けた；図１Ｂ〜Ｄ、ｎ＝５５の未受精の卵母細胞、およびｎ＝１２５の体外受精卵）ことが明らかになった。この一連の卵の細胞質中の迅速な繰り返し運動は、前核形成までおよそ４時間続いた。速度ピークは、最初のうちは比較的低い振幅を示したが（減数第二分裂の分裂後期から、初期のＦＣ伸長までの間；ステージ１）、その後、ＦＣが完全に伸張したらそれよりも有意に大きい振幅になった（ステージ２）。最後に、ＦＣ退縮中およびその後に、それらの振幅は減少した（ステージ３）（図１Ｂ、Ｄ、表１）。ステージ２において、急速な細胞質内運動はＦＣを二等分する赤道面で最大であり、そこから外側の面では、外に向かうほど遅くなった（図９）。ＰＩＶ解析から、各速度ピークの後に、通常は４分より長く持続し、より低い振幅を示す事後運動になったことが明らかになった。ステージ３の間の運動は、速度ピークが事後運動とあまり異なっていないことが多いという点で、この規則の例外であった（図１Ｄ、表１）。さらに我々は、受精は、未受精の卵母細胞の休止レベルと比較して、平均の基底細胞質内速度（ピーク間インターバルの間、または最後に記録されたピークの後の速度）の２倍以上の増加をもたらしたことに留意した（図１Ｃ〜Ｄ、表２）。
【0070】
我々の解析から、ステージ１の間、これらの急な細胞質内運動のベクトルは、発生中の第二極体に向かう傾向がある（１７／２５の速度ピーク、１１の接合体）ことが明らかになった。この方向性は、ステージ２の間、ベクトルが直接ＦＣに向かうように、または場合によってはわずかに入れ替わって第二極体に向かった（６４／６５の速度ピーク、１９の接合体）。これらのステージのいずれかにおける低振幅の事後運動またはピーク間インターバルの間に、一定したパターンはなかった。ステージ３において、速度ピークの方向性または何らかのパターンはもはや認められなかった（図１Ｅ、表４）。大半の接合体で前核が観察されたとき（４９／６３、７７．８％）（図１Ｄ）、これらの速度ピークは、ＦＣ退縮後に止まった。従って、我々の結果から、マウス卵の受精は、細胞質内運動の速度ピークを誘発し、それらが最強になった時点で、精子の侵入部位の上に形成されるＦＣに向けられることが示される。
【0071】
実施例２高振幅の細胞質内速度ピークは、ＦＣの拍動と相関し、アクトミオシン細胞骨格に依存する
ステージ２における急な運動の方向は、ＦＣがこのような運動の発生に関与する可能性があることを示唆することから、次に我々はこの期間にわたるＦＣの形態を試験した（６９の速度ピーク、１４の接合体）。それにより、各速度ピークにおいて、ＦＣの頂点は中心に向かって埋まり、ＦＣが沈み込んで凸型になった接合体の領域が広くなることが示された。結果として、ＦＣの軸に沿った接合体の直径（以下、「ＦＣ直径」と証する）は、１．２８±０．６６μｍに減少した（その長さの１．５５±０．７９％）（図２Ａ、Ｃ）。ＦＣの形状はピーク間インターバル中に回復した（図２Ｃ）。興味深いことに、ＦＣ直径の減少の程度は、速度ピークの振幅と直線的な関連を示した（２０の接合体、７１の解析された速度ピーク）（図２Ｂ）。
【0072】
アクトミオシン細胞骨格はＦＣ領域で高濃度化されているため１７、２５、我々は、アクトミオシン細胞骨格は、ＦＣの拍動に関与する可能性があると考察した。この可能性を評価するために、我々は、ＦＣの拍動の全体にわたり、ＥＧＦＰでタグ付けされたユートロフィンのアクチン結合ドメイン（ＵｔｒＣＨ−ＥＧＦＰ２６）またはＧＦＰでタグ付けされたミオシンＩＩの調節軽鎖（ＭｙｏＲＬＣ−ＧＦＰ２７）のいずれかをコードするｍＲＮＡを有する卵母細胞を注入することによりアクトミオシンを可視化した。このような卵母細胞における受精後のＵｔｒＣＨ−ＥＧＦＰの平均蛍光強度の測定から、ＦＣの下に存在する連続するアクチン層における振動の変化が解明された；アクチンマーカーの蛍光強度は、ＦＣが弛緩するに従って減少し、ＦＣが徐々に突き出るに従って増加した（図２Ｄ、図１０）。ＦＣの肩の下に存在するＭｙｏＲＬＣ−ＧＦＰの平均蛍光強度についても同様の結果を得た（図２Ｅ、図１１）。このようなＵｔｒＣＨ−ＥＧＦＰおよびＭｙｏＲＬＣ−ＧＦＰ蛍光における変動は、その領域のアクトミオシン量における変化を反映している可能性がある。しかしながら、これらの変化は比較的小さく、一時的で反復的であるため、このような変化は、ＦＣの拍動をもたらすＦＣを取り囲むアクトミオシンの収縮性を示す可能性が高い。
【0073】
ＦＣの運動はＦＣに対応する細胞質内速度ピークの範囲内で起こるため、次に我々はアクトミオシン細胞骨格が双方に関与するかどうかを試験した。この目的を達成するために、我々は、アクトミオシンと微小管の細胞骨格との両方に干渉する選択的な阻害剤を使用した。それらの特異性を免疫染色によって確認し（図１２）、表５にそれらの細胞周期の進行に対する作用を示す。我々は、ノコダゾールによって誘導された解重合もタキソールによって誘導された微小管の安定化も、速度ピークの動力学はわずかに変化したが、速度ピークを阻害しなかったことを見出した。ノコダゾール処理により、一部の事後運動において、さらに全ての速度ピーク間インターバルにおいて細胞質内速度が増加し（ｎ＝３８、図２Ｆ、表１、２）、それに対して、タキソール処理により、全てのピーク間インターバルにおいて、速度ピークの振幅、一部の事後運動、および細胞質内速度が減少した（ｎ＝２７、図２Ｇ、表１、２）。それに対して、サイトカラシンＤを用いたアクチンの解重合またはジャスプラキノリドを用いたアクチンフィラメントの安定化により、基底速度がほぼ３倍減少した（図２Ｆ、Ｇ、表２）。さらにサイトカラシンＤの処理により、速度ピークが劇的になくなった（図２Ｆ）。２１の解析された接合体のうち２つ（９．５％）だけが焦点が合っておらず、低振幅の速度ピークが記録された。速度ピークはそれでもなおジャスプラキノリドで処理した接合体（ｎ＝６０）に存在していたが、それらの振幅はコントロールにおける振幅よりも有意に低く、事後運動は実質的に検出不可能であった（図２Ｇ、表１）。ほとんど全ての接合体において、またミオシン軽鎖キナーゼ（ＭＬＣＫ）阻害剤であるＭＬ−７での処理も、細胞質内速度の振動をブロックし（１６／１７の接合体、９４．１％）（図２Ｆ）、１つの例外的な接合体のみがはっきりしない低振幅の速度ピークを表示した。
【0074】
またこれらの実験から、ノコダゾールまたはタキソール処理による微小管の解重合または安定化はそれぞれ、ＦＣの形成および／または維持のどちらにも影響を与えなかったことも明らかになった。それに対して、サイトカラシンＤで処理された大多数の接合体（２０／２１、９５％）においてＦＣは形成されず、これは、以前の研究と一致していた１３。ジャスプラキノリドで処理された接合体におけるアクチンフィラメントの安定化は、それでもなおＦＣの形成および／または維持を許容したが、コントロールの場合ほどに顕著ではなかった。ＭＬＣＫ活性が阻害された場合、ＦＣは胚のわずか半分（１０／１７、５８．８％）にしか存在せず、ＦＣが存在した場合でもＦＣの発達はあまり十分ではなかった。これは、ＭＬＣＫ活性はＦＣの形成および維持に関与するという以前の結論と一致する２５、２８。これらの結果と合わせて、細胞質内の振動およびＦＣの拍動はいずれも、主としてアクトミオシン細胞骨格に依存することが示される。
【0075】
実施例３細胞質内運動はＣａ２＋一過性上昇と相関があり、それに依存する
受精は、遊離Ｃａ２＋の振動を開始させることが知られているため１０、２９、我々は次に、アクトミオシンが介在する速度ピークは、これらのＣａ２＋パルスに依存するのかどうかについて取り組もうと考えた。この目的を達成するために、我々は、Ｃａ２＋感受性の蛍光色素のＦｕｒａＲｅｄを含む受精卵をローディングし、ＦｕｒａＲｅｄの蛍光およびＤＩＣ画像を同時に回収した。３２の接合体において、Ｃａ２＋の増加に伴い全ての１２１の速度ピークが発生した。Ｃａ２＋レベルがピークになると細胞質内速度は（我々の記録のインターバルの解像度の範囲内で）正確に増加した（図３Ａ）。異常に頻繁なＣａ２＋振動を示す一つの接合体においてのみ、一部のＣａ２＋スパイク（４／１７）が速度ピークに反映されていなかった。ＩＣＳＩで受精させたいくつかの卵で、我々は、最初のＣａ２＋一過性上昇に伴う速度ピークの記録を達成した。これらの速度ピークは、最初のＣａ２＋一過性上昇に相当するステージ１の速度ピークの残りよりも高振幅を示し、その後の速度ピークよりも大きかった（図９）。
【0076】
Ｃａ２＋振動は細胞質内運動に必須であるかどうかを決定するために、我々は、細胞内Ｃａ２＋の基底レベルを変化させることなくカルシウム振動を阻害することが知られているＣａ２＋キレート化剤ＢＡＰＴＡをローディングした２１の受精卵における動きを記録した３０。この処理により高振幅の速度ピークが阻害されたが、平均の基底細胞質内速度はコントロールに比べて１．７倍に上昇した（図３Ｂ）。ＢＡＰＴＡは微小管を破壊したが（図１２）、他の系で観察されたように３１、３２、これは、速度ピークの損失に関与する可能性は低く、なぜなら特異的に微小管を破壊しても類似の現象を引き起こさないためである（上記参照）。
【0077】
興味深いことに、我々がＳｒＣｌ２を用いてマウス卵（ｎ＝４７）を活性化させて、受精後に観察されるＣａ２＋振動と類似したＣａ２＋振動を引き起こしたところ、Ｃａ２＋一過性上昇のうち３０％のみ（１３３／４４４）が速度ピークを伴った。さらにこれらは、極めて低い振幅を示す接合体の速度ピークと類似しておらず（図３Ｃ、表１、３）、Ｃａ２＋一過性上昇の始まりが１０〜３０秒遅延することも多かった。事後運動は、これらのＳｒによって誘導されたＣａ２＋一過性上昇のうち７６．８％（３４１／４４４）で示されたが、それらの振幅も接合体の振幅よりも低かった（表１、３）。これは、Ｃａ２＋振動は急速な細胞質内運動に必要であるが、Ｃａ２＋振動は、別個の高振幅の速度ピークを誘発させるには不十分であることを示す。従って、受精により、このような動きを十分に可能にする追加の現象が起こる。
【0078】
実施例４細胞質内運動を開始させるのに機能的な精子タンパク質が必要である
細胞質内速度ピークおよびＣａ２＋振動の両方において精子それ自体またはＦＣのいずれかによってなされる相対的な寄与をさらに特徴付けるために、我々は、卵の皮質の直下または細胞の中心のいずれかに精子を直接注入した。ＦＣ形成は精子クロマチンと皮質アクチンとの相互作用に依存し、さらに距離に依存するために３３、ＦＣは、注入された卵の前者のグループにのみ形成された。いずれのケースにおいても、注入された精子は、Ｃａ２＋振動および卵の活性化をもたらした。しかしながら、ＦＣを形成した卵ではＣａ２＋一過性上昇の９７％（１０１／１０４）が速度ピークを伴うのに対して（ｎ＝１７、図４Ａ）、ＦＣがない卵では、Ｃａ２＋一過性上昇の７１％（２０７／２９０）が速度ピークを示した（ｎ＝３５；図４Ｂ）。重要なことには、速度ピークの平均振幅は、ＦＣがない卵の平均振幅よりも有意に低かったが、それに対してＦＣを有する卵では、振幅は、自然に受精した卵の振幅と類似していた（図４ＡＢ、表１、３）。しかしながら、前核形成中の速度ピークおよび全てのステージからの事後運動の平均振幅は、両方のグループにおいて類似していたことから（表３）、これらの特定の運動のメカニズムはＦＣとは無関係である可能性があることが示唆される。
【0079】
ＦＣの細胞質内運動誘発への寄与をさらに詳細に分析するために、我々は、全ての機能性タンパク質が欠失しておりＤＮＡ源として役立つ熱不活化した精子頭部の注入に応答して、速度ピークが起こるかどうかを試験した。クロマチンと皮質との結合は、ＦＣ様の形成３３を誘発するのに十分であることが知られている。その結果として、Ｓｒ２＋によって活性化された皮質および卵に熱不活化した精子頭部を注入したところ、Ｃａ２＋振動およびＦＣ形成の両方が観察された。このような接合体において（ｎ＝２５）、Ｃａ２＋一過性上昇の６０．８％（４８／７９）においてＦＣが存在するときに速度ピークが発生した（ステージ２）。しかしながら、速度ピークの振幅は、比較的低いままであった（図４Ｃ、表３）。興味深いことに、ＦＣの拍動も、正常な接合体で観察されたＦＣの拍動に比べてかなり小さく、さらに速度ピークもＦＣの拍動もＣａ２＋一過性上昇のピークとまったく同調していなかったが、１０〜３０秒後に起こった。Ｃａ２＋振動は不活化精子が注入された卵では記録されず、単為生殖的活性化がなされないままであった（図４Ｄ）。これらの結果を総合すると、高振幅の速度ピークはＦＣの拍動と関連しており、精子の機能性タンパク質によって促進されることが示唆される。
【0080】
実施例５細胞質内運動は、胚の生命力の指標を提供する
我々が、細胞質内運動がＣａ２＋振動のパターンと細胞骨格の品質とに関連することを見出してから、我々は、このような運動の解析により発生の成功を予測することができるのかどうかについて興味を持った。これに取り組むために、我々は、７１個の卵を体外受精させ、ＦＣが存在する期間中ずっとそれらの細胞質内運動を記録し、続いて胚を４日間培養した。まず第一に、我々は、各胚中の細胞質内運動のパターンと、そのステージでの細胞総数とを関連付けた。このから、速度ピーク間の平均インターバルの様々な値について、平均基底速度と、胚中の細胞数との間に統計学的に有意な線形および二次効果があったこと（それぞれｐ＝０．０００５および０．０００１）が明らかになった（対数スケールで；図５Ｃ）。発生４日目における平均細胞数は、横ばい状態かまたは減少した後に、平均基底速度（平均基底速度値１２．２ｎｍ／秒の平均から最大１．７の標準偏差（ＳＤ＝６．７ｎｍ／秒））で増加した（図５Ａ、Ｃ）。さらに、平均基底速度の様々な値またはその二乗について、発生４日後の平均細胞数は、速度ピーク間の平均インターバルに比例して増加した（１ＳＤ毎に、すなわちおよそ７分毎に１．３倍高い（９５％ＣＩ：１．０７〜１．４７）；ｐ＝０．００４５、図５Ｂ、Ｄ）。我々は、胚盤胞期まで発達する確率を評価することによって発生の成功を調べたところ、同様の発見が観察された（図１３Ａ）。この解析から、平均基底速度（ｐ＝０．００９）と、発生４日後に胚が胚盤胞期に達する確率の対数とは線形的な関係を有することが示唆される：胚盤胞まで発達する確率は、平均基底速度が増加するにつれて増加する。さらに我々は、１ＳＤ毎に速度ピーク間の平均インターバルが増加するにつれて、胚が胚盤胞まで発達する確率は、２．３倍増加する（９５％ＣＩ：１．１０〜４．８９；ｐ＝０．０２７）（図１３Ｂ）ことを見出した。
【0081】
我々の細胞質内運動の記録方法が何らかの光によるダメージを引き起こす可能性を除去するために、さらに発生し得る何らかの光感受性が受精後のイメージング段階の影響を受けるのかどうかを試験するために、我々は、記録開始後の様々な時点で前核が形成された接合体の発生を比較した。我々は、平均細胞数にも、または達成される発生ステージの分布にも何らかの差があるという証拠を見出すことはできなかった（いずれか２種の比較グループについてｐ＞０．４６、およびｐ＝０．９７、それぞれ図１３Ｃ、Ｄ）。我々はさらに、画像化した（ｎ＝７１）および画像化していない（ｎ＝４６）胚の発生も比較して、両方のグループが同じ方法で処理されたことを確認した。両方のグループにおいて、平均細胞数（図１３Ｅ）、加えて異なる細胞数を有する胚の分布（図１３Ｆ）は類似していた（それぞれｐ＝０．７５および０．１９）。
【0082】
最終的に、上記の結果から細胞質内運動のパターンは着床前の発生の品質の予測に役立つことが示されたため、我々は、これらの運動パターンが、どの卵が出産まで発生が成功するのかを予測できるかどうかを決定しようと試みた。この目的を達成するために、我々は、体外受精卵を画像化して解析して、体外受精卵の細胞質内の動きのパターンが優れた発生能を示すのか、あるいは不良な発生能を示すのかに従って体外受精卵をグループ分けした。優れた可能性を示す胚は、４日培養した後に胚１つあたり２５〜５２（平均３２）個の細胞を有し、２５〜９０％（平均４６．５％）のケースで胚盤胞期に達すると予測された。低品質と分類された胚は、４日後に９〜２４（平均１７）個の細胞を有し、それらの０〜２５％、平均１０．７％が胚盤胞期に達すると予測されると思われる。２つの胚群を、２細胞期で雌のレシピエントに移植した。「低品質」とスコア付けした胚と比べて５倍の頻度で（８３．３％、５／６対１６．７％、１／６）卵筒期まで（６．５ｄｐｃ）発達した胚、および「低品質」とスコア付けした胚と比べてほぼ３倍の頻度で（２．７７、８７．５％、２１／２４対３１．６％、６／１９）臨月まで（１９．５ｄｐｃ）発達した胚を、「高品質」とスコア付けした（図５Ｅ、Ｆ、表６）。総合すると、これらの発見は、受精後の細胞質内運動は、発生の成功予測に役立ち、我々のイメージング方法は胚発生を妨げないことを示す。
【0083】
実施例６ヒト卵母細胞においてＰＬＣζによって誘導されたＣａ２＋振動は、同調する細胞質内運動を引き起こす。
【0084】
近年の証拠によれば、受精時のＣａ２＋振動は、精子が卵母細胞と融合した後に誘発され、それにより、卵母細胞への精子特異的なホスホリパーゼＣ（ＰＬＣζ）の導入が起こることが示されている５２，５３。次にＰＬＣζは、卵質内でＩｎｓＰ３生産の繰り返しサイクルを発生させ、Ｃａ２＋振動による繰り返しのＣａ２＋放出現象を起こす５２，５３。最も都合のよい形態としては、精子ＰＬＣζは、卵母細胞にその相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）をマイクロインジェクションすることによって導入され、この相補的ＲＮＡは卵母細胞内で数時間にわたりＰＬＣζタンパク質に翻訳される５４。従って、ＰＬＣζのｃＲＮＡを卵母細胞に注入することによって、持続的なＣａ２＋振動を引き起こすＰＬＣζタンパク質が生産され、さらに平行して行われた実験で、ＰＬＣζは、マウス、ブタ、ウシ、およびヒト卵母細胞の桑実期および胞胚期までの胚発生を活性化することが示された５４〜５７。
【0085】
ここで我々は、精子ＰＬＣζのｃＲＮＡが注入されたヒト卵母細胞におけるＰＩＶイメージングの使用を報告する。我々は、ＩＣＳＩ後に受精できなかったヒト卵母細胞において、それぞれのＰＬＣζによって誘導されたＣａ２＋一過性上昇とほぼ同調する、突然の、ただし小さい細胞質内運動を検出できることを実証する。我々が説明する方法は、ヒト卵母細胞におけるＣａ２＋振動振動パターンをモニターする非侵襲的方法として発展性を有する可能性がある。
【0086】
材料および方法（実施例６）ヒト卵母細胞
ウェールズ大学病院（University Hospital of Wales）、カーディフのＩＶＦウェールズクリニックで、患者からヒト卵母細胞の提供を受けた。現行のプロジェクトおよび関連する全ての手法は、南東ウェールズ研究倫理委員会（South East Wales Research Ethics Committee）およびヒトの受精および胚研究認可局（Human Fertilisation and Embryology Authority）で承認されている（Ｒ０１６１、K.SwannおよびN.Amsoの管理下）。老化した「ＩＣＳＩ不能の」卵母細胞および卵胞の減数分裂過程から誘導された新鮮な卵母細胞を用いた。標準条件下でＩＣＳＩを行い、卵母細胞をさらに１６〜１８時間培養した後、それらが受精したかまたは受精していないかを判断した。「新鮮な卵母細胞」は卵胞の減数分裂から誘導され、回収してから５時間以内に用いた。活性化されていないと確認された卵母細胞だけを実験に用いた。その後の１〜４時間の間に、これらの卵母細胞をクリニックから研究所に移し、そこで上述したようにして卵母細胞に約１０〜２０ｐｌのヒトＰＬＣζのｃＲＮＡをマイクロインジェクションした５４，５５。簡単に言えば、ｃＲＮＡを、Ｃａ２＋感受性色素の０．５ｍＭオレゴングリーンＢＡＰＴＡデキストラン（ＯＧＢＤ、インビトロジェン）と混合した。次にこの混合物を、マイクロピペットを用いてマイクロインジェクションした（約１μＭのチップ直径）。マイクロピペットの針と同じラインに連結された増幅器からの短い電気振動のパルスを利用して、マイクロピペットを卵母細胞に挿入した。次に、マイクロピペット後部に圧力パルス（２０ｐｓｉで約１秒間）をかけて、注入混合物の１回適用量を卵母細胞に押し出した。ｃＲＮＡを、Ｃａ２＋感受性色素の０．５ｍＭオレゴングリーンＢＡＰＴＡデキストラン（ＯＧＢＤ、インビトロジェン）と混合した。ＰＬＣζのｃＲＮＡを上述したようにして調製した５４。データ回収中に、ＣＬ−１００温度制御装置（ワーナー・インスツルメンツ（Warner Instruments））を備えたシリーズ４０クイック・チェンジ（Quick Change）イメージングチャンバーを用いて、卵母細胞を油で覆った培地の液滴中で３７℃に維持した。Ｍ２培地（シグマ）中で卵母細胞をマイクロインジェクションし、続いて以前に説明されているようにしてＨＥＰＥＳで緩衝化したＫＳＯＭ培地中で記録をとった５９。
【0087】
イメージングシステムマイクロインジェクション後に、卵母細胞または接合体を、ニコン（Nikon）のＴｉＵ落射型顕微鏡（対物２０×０．７５ＮＡ）を用いて数時間にわたり画像化した。４９０ｎｍのバンドパスフィルターにハロゲンランプからの蛍光励起を通過させ、５０５ｎｍのダイクロイックで反射させ、５３０ｎｍのバンドパスフィルターで回収した。その他のハロゲンランプからの白色光を用いて、卵母細胞を微分干渉位相コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡で可視化した。これらの光源の軌道にシャッターを置き、フィルターのホイールを蛍光励起および放出光の両方の軌道上に置いて、画像獲得中に卵母細胞が光に晒される時間がごく短くなるようにした。シャッターおよびフィルターホイールをラムダ−１０（Lambda-10）制御器（サッター・インスツルメンツ（Sutter Instruments))によって制御した。クールスナップＨＱ２（Coolsnap HQ2）ＣＣＤカメラ（フォトメトリクス（Photometrics））を用いて、１０秒毎に高速で連続的に１００〜２００ミリ秒の曝露で画像を取った。インビボ（InVivo）ソフトウェア（メディア・サイバーネティックス（Media Cybernetics））用いて、ラムダ−１０、画像回収、および最初の解析を制御し、画像をｔｉｆｆの積層画像として保存した。
【0088】
イメージＪ（http://rsbweb.nih.gov/ij/）を用いて蛍光画像を解析し、卵母細胞全体からの色素の蛍光強度を時間に対してプロットした。細胞質中の運動を、マウス接合体における類似の運動を研究するために開発された相互相関法で解析した５８。アルゴリズムは、流体動力学的な調査におけるＰＩＶ解析で用いられているアルゴリズムに基づいており、連続した画像対間の相互関係を示す画像のサブ領域を含む。この解析により、細胞質の局所領域における運動を示すベクトル分野が得られた。以前に説明されたようにして５８、卵母細胞の中心における四角の領域のベクトルの振幅の平均をとることにより運動の平均速度を計算した。ソフトウェアをＭＡＴＬＡＢで開発され書き込まれており、このソフトウェアは、http://users.ox.ac.uk/~zool0847/code.htmlで教育機関の非営利使用のライセンスで利用できる。
【0089】
結果（実施例６）ＩＣＳＩ後に活性化できなかったヒト卵母細胞へのＰＬＣζのｃＲＮＡのマイクロインジェクションにより、図６Ａで説明された持続的な一連のＣａ２＋振動が起こった。遊離Ｃａ２＋上昇を示すスパイクの特定のパターンは卵母細胞間で多少の違いが示されたが、全般的な応答は、最初の大きいＣａ２＋増加、それに続いて、時間が経つに連れて次第に頻度が増加する一連のそれより小さいＣａ２＋一過性上昇からなっていた。この全般的なＣａ２＋振動パターンは、ＰＬＣζのｃＲＮＡ５５が注入されたヒト卵母細胞で以前に報告されたパターンに類似している。ｃＲＮＡ注入（記録開始の１５〜２０分前）からＣａ２＋スパイクの最初の出現への比較的長い潜伏時間、およびその後のＣａ２＋スパイク頻度の上昇は恐らく、時間経過によるＰＬＣζタンパク質発現の段階的な増加を反映しており、これは、これまでにもＰＬＣζのルシフェラーゼタグを有する融合コンストラクトで経験的に実証されている５４、６０〜６２。
【0090】
我々がＰＩＶを用いてＰＬＣζのｃＲＮＡを注入した卵母細胞を細胞質内運動に関して解析したところ、我々は、同じ１０秒のインターバル内で、各Ｃａ２＋一過性上昇の直後に別個の運動が起こることを見出した（図６Ｂ）。これらのヒト卵母細胞において、最大の平均ＰＩＶ速度は、Ｃａ２＋スパイクの最大値と一致するか、あるいはＣａ２＋一過性上昇が最大になってから５０秒以内に起こるかのいずれかであった。合計して、この範囲内で１０個の異なる接合体から９５／１０２の細胞質内運動が検出された。速度ピークの平均遅れ時間は、Ｃａ２＋ピーク後１８秒であった（１０〜５０秒の範囲）。注目すべきことに、卵母細胞質で検出された運動は、比較的規模が小さい：速度ピークにおける全てのベクトルの平均振幅は４０ｎｍ／秒を超えることはなく、さらにこれらの速度ピーク内で、局所領域は１２０ｎｍ／秒よりも速く動くことはなかった。ほとんどの場合でＣａ２＋一過性上昇に伴う運動の突然の増加がみられたが、いくつかの記録において最初のスパイクで達成されたより高いレベルのＣａ２＋は、しばしば細胞質の運動の減少を伴うことも興味深い（４／６ケース）（図６Ｂ）。一例において、第二のピークでＣａ２＋レベルが高いままである場合、細胞質内運動も抑制された（１／６）（図６Ｂおよび７）。
【0091】
個々の卵母細胞について、運動ベクトルは、それぞれの速度ピーク間で一定の位置にいたが、痙攣のような運動の最中に運動の方向を反転させることが多かった（図８）。しかしながら、平均の運動方向は、第一または第二極体の位置とは一致した関係を示さなかった。加えて、速度ピークにおいて小さい渦巻きが頻繁に観察された。単一面で画像化された卵母細胞が少数であったという限定を考慮すると、これらの渦巻きは、特定の卵母細胞構造とはまったく関連がなかった。
【0092】
これらのヒト卵母細胞において、ある程度のＣａ２＋上昇と運動との同調が共通して見出された。これは、ヒト卵母細胞における細胞質内運動は、遊離Ｃａ２＋イオンの上昇により直接的に誘導されることを示す。マウス接合体での以前の研究から、このような細胞質内運動はアクチン細胞骨格に依存し、精子および受精丘の存在大きな影響を受けることが示されている５８。速度ピーク中に形状が変化した活性化ヒト卵母細胞の領域を確認することは難しいが、記録中に細胞プロファイルの遅い進行性の変化が検出された。いくつかの記録において、細胞質の周りを動き、細胞膜の下に厚い粒状の三日月形を形成する粒状の領域を観察することができた。この外縁の三日月形も第一極体の位置に沿って移動したが、正確な三日月形の境界はあいまいであった。これらの「ＩＣＳＩ不能の」卵母細胞内に可能性のある精子が存在する可能性があるのかどうか、あるいは、マウス接合体で示唆されたように、細胞質内運動において精子周辺の何らかの構造が特異的な役割を果たす可能性があるのかは不明なままである。しかしながら、我々は、卵胞の減数分裂後に得られた７つの未受精の卵母細胞におけるＰＬＣζのｃＲＮＡによって誘導されたＣａ２＋振動および細胞質内運動の類似の解析は行わなかった。注目すべきことに、我々は、これらの卵胞の減数分裂由来の卵母細胞で観察された４１のＣａ２＋スパイクに関連する運動をまったく検出できなかった。
【0093】
考察ここで説明された受精後における細胞質内現象の、非侵襲的な急速なタイムラプスイメージングとＰＩＶ解析との併用により、マウス卵への精子の侵入が、細胞質内運動と関連する一連の予測外の周期的なアクトミオシン収縮を誘発させることが明らかになる。その最大速度において、これらの細胞質内運動により、同調して拍動を受ける精子の侵入部位の上に形成された突起に向かってベクトルが方向付けられる。細胞質内運動の速度ピークは、受精によって誘導されたＣａ２＋一過性上昇とタイミングが一致しており、さらにカルシウム振動に依存する。我々は、ピーク間インターバルの解析は、非侵襲的で極めて迅速な、胚の生命力およびその発生を進行させる能力を評価する新規の方法を提供することを示す。
【0094】
ＭＬＣＫ阻害またはＦ−アクチンを安定化もしくは解重合する処理により、速度ピークおよび基底細胞質内速度の両方が減少したという我々の発見から、細胞質内運動の媒介にアクトミオシン細胞骨格が関与することは明白である。またこのような運動は、Ｃａ２＋をＢＡＰＴＡでキレート化すると抑制されるために、Ｃａ２＋一過性上昇にも依存している。可能性の一つとして、例えばＣａ２＋／カルモジュリン依存性キナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）または従来のプロテインキナーゼＣ（ｃＰＫＣ）などのＣａ２＋依存性キナーゼは、細胞骨格を調節すること１０、およびＣａ２＋振動に応答すること３４〜３６の両方が知られていることから、これらの酵素は、運動の誘発に関与することが挙げられる。しかしながら、Ｃａ２＋振動の振幅は受精後の期間全体にわたり類似しているが（ただし一般的にその後のスパイクよりも大きい最初のＣａ２＋スパイクを除く２９）、速度ピークの振幅はＦＣ形成の開始時に増加し、ＦＣ退縮時に減少する。さらに単為生殖的活性化によって惹起されたＣａ２＋一過性上昇は、迅速な振動の細胞質内運動を促進するには不十分であり、これは、運動を起こすことができる追加の受精関連因子が存在するはずであるということを示唆している。
【0095】
活発な運動の速度ピークとアクトミオシンが介在する周期的なＦＣの運動とが一致するということは、これらは同じプロセスの兆候であることを示す。これはさらに、精子注入法後のＦＣ形成の研究によっても示されている。ＦＣ形成はクロマチンと皮質タンパク質との相互作用を必要とするため３３、精子が卵に深く注入される場合は、ＦＣ形成は起こらない。従って、この方法で受精した卵は、ＦＣを有する接合体でみられる速度ピークよりもかなり弱い速度ピークを示した。速度ピークが弱くてもなお存在するという事実は、皮質のアクトミオシンをある程度再構成させるのに十分な程度に精子クロマチンが細胞表面の近傍に存在することに起因する可能性がある。明確なＦＣを生産するには不十分であるが、それでもなお弱い細胞質内運動を強化することができると予想される。あるいは、速度ピークは、母由来のクロマチン上に蓄積した皮質のアクトミオシンの収縮によって誘発される可能性がある。実際に、我々は、一組の母系染色体上に形成された隆起がＦＣと類似した方法で振動することを頻繁に観察することができた。また、低振幅の速度ピークは、皮質に関連するのではなく、アクトミオシン細胞骨格の一般的な収縮性の作用である可能性もある。最後の２つの可能性はさらに、なぜＳｒ２＋で活性化された単為発生胚で所定の低振幅の速度ピークが観察できるのかを説明することもできる。
【0096】
熱不活化した精子頭部が注入されたＳｒ２＋で活性化された卵では、高速運動も誘発されず、ＦＣの動きもかなり減少した。従って、精子は、熱処理によって不活性化されたＦＣの動きおよび細胞質内運動を促進するタンパク質に高く寄与する可能性がある。また、正常な接合体と不活化精子が注入され、続いてＳｒ２＋活性化された胚とで観察された差は、Ｃａ２＋一過性上昇そのものの特徴が変更されたことに起因する可能性がある。典型的なＳｒ２＋によって誘導されたＣａ２＋ピークの動力学的挙動は、受精によって誘発されたＣａ２＋ピークの動力学的挙動とは異なる。さらに、Ｓｒ２＋によって誘導されたＣａ２＋振動の頻度は、我々の条件下では極めて高く、これは、高振幅の速度ピークの生成に負の影響を与えるようである。
【0097】
我々は、細胞質内運動のタイミングおよびパターンは、胚の品質の強力な指標を提供することを見出した。我々のデータから、低い平均基底速度（１０ｎｍ／秒未満；これは、アクトミオシン細胞骨格の品質が悪いことを示す）を示す胚、加えて極めて頻繁な速度ピーク（ピーク間インターバルが１０分未満；これは、頻繁なＣａ２＋一過性上昇を反映する）を示す胚は、インビトロでは胚盤胞期まで、またはインビボでは臨月まで発達することはまれであるということが示される。この結果は、機能的なアクチン細胞骨格とＣａ２＋一過性上昇の正しいパターン（特にＣａ２＋上昇にかかる全体の時間）とはいずれも発生に重要であるという発見と一致する１２、１５、１６、３７〜３９。しかしながら、これらの要素は、蛍光色素および有害な放射線照射を用いる侵襲的な手法を含むため、研究施設や医療施設では優れた品質の胚を選択するために使用できない。従って、体外受精診療所で行なわれている現行の方法は、３日目に形態学的に胚の生存能力および増殖を評価するか、あるいは３日目の評価が信頼性が低いために５日目に評価することである４０〜４２。発生の最初の２日で一連のパラメーターをイメージングおよびモニターすることによって、相当な進歩をもたらすことができる４３。胚の生命力およびその発生を達成する能力は、それよりもかなり短い期間で、すなわち受精前後のちょうど２時間で、非侵襲的なイメージングを用いることによって評価することができる。
【0098】
すなわち我々は、受精時のアクトミオシン細胞骨格の動的な振動の挙動を誘発することにおける精子の重要性を確認した。それに続く運動は、完全な発生能を達成する卵の能力を評価する強力な方法を提供するパターンおよびタイミングを有する。そのようなものとして、我々の方法は、補助繁殖診療所で実用的に使用できる高い可能性を有する。
【0099】
均等物上述した詳細な説明は、当業者により本発明が実施可能になるのに十分であるとみなされる。実施例は本発明の一形態の単なる説明を目的としているため、本発明は示された実施例に限定されることはなく、その他の機能的に同等な実施態様は本発明の範囲内である。本明細書において示され説明されたものに加えて、本発明の様々な改変が、前述の説明から当業者には明らかであり、添付の特許請求の範囲内に含まれるものとする。
本発明の各実施態様に、本発明の利点および目的が包含されていなくてもよい。
【0100】
本明細書において開示された特許文献などの全ての参考文献は、あらゆる目的のために、特に本明細書で述べられた開示のために、それらの全体が開示に組み入れられる。
【0101】
【表1】
【0102】
【表2】
【0103】
【表3】
【0104】
【表4】
【0105】
【表5】
【0106】
【表6-1】
【0107】
【表6-2】
【0108】
【表6-3】
【0109】
【表7】
【0110】
参考文献1. Roegiers, F., McDougall, A. & Sardet, C. The sperm entry point defines the orientation of the calcium-induced contraction wave that directs the first phase of cytoplasmic reorganization in the ascidian egg. Development 121, 3457-3466 (1995).
2. Sardet, C., Paix, A., Prodon, F., Dru, P. & Chenevert, J. From oocyte to 16-cell stage: cytoplasmic and cortical reorganizations that pattern the ascidian embryo. Dev Dyn 236, 1716-1731 (2007).
3. Speksnijder, J.E., Sardet, C. & Jaffe, L.F. The activation wave of calcium in the ascidian egg and its role in ooplasmic segregation. J Cell Biol 110, 1589-1598 (1990).
4. Stack, C., Lucero, A.J. & Shuster, C.B. Calcium-responsive contractility during fertilization in sea urchin eggs. Dev Dyn 235, 1042-1052 (2006).
5. Weaver, C. & Kimelman, D. Move it or lose it: axis specification in Xenopus. Development 131, 3491-3499 (2004).
6. Gerhart, J. et al. Cortical rotation of the Xenopus egg: consequences for the anteroposterior pattern of embryonic dorsal development. Development 107 Suppl, 37-51 (1989).
7. Abbott, A.L. & Ducibella, T. Calcium and the control of mammalian cortical granule exocytosis. Front Biosci 6, D792-806 (2001).
8. FitzHarris, G., Marangos, P. & Carroll, J. Cell cycle-dependent regulation of structure of endoplasmic reticulum and inositol 1,4,5-trisphosphate-induced Ca2+ release in mouse oocytes and embryos. Mol Biol Cell 14, 288-301 (2003).
9. Sun, Q.Y. et al. Translocation of active mitochondria during pig oocyte maturation, fertilization and early embryo development in vitro. Reproduction 122, 155-163 (2001).
10. Ducibella, T. & Fissore, R. The roles of Ca2+, downstream protein kinases, and oscillatory signaling in regulating fertilization and the activation of development. Dev Biol 315, 257-279 (2008).
11. Tombes, R.M., Simerly, C., Borisy, G.G. & Schatten, G. Meiosis, egg activation, and nuclear envelope breakdown are differentially reliant on Ca2+, whereas germinal vesicle breakdown is Ca2+ independent in the mouse oocyte. J Cell Biol 117, 799-811 (1992).
12. Toth, S., Huneau, D., Banrezes, B. & Ozil, J.P. Egg activation is the result of calcium signal summation in the mouse. Reproduction 131, 27-34 (2006).
13. Ozil, J.P. et al. Egg activation events are regulated by the duration of a sustained [Ca2+]cyt signal in the mouse. Dev Biol 282, 39-54 (2005).
14. Ducibella, T. et al. Egg-to-embryo transition is driven by differential responses to Ca(2+) oscillation number. Dev Biol 250, 280-291 (2002).
15. Ozil, J.P., Banrezes, B., Toth, S., Pan, H. & Schultz, R.M. Ca2+ oscillatory pattern in fertilized mouse eggs affects gene expression and development to term. Dev Biol 300, 534-544 (2006).
16. Ozil, J.P. & Huneau, D. Activation of rabbit oocytes: the impact of the Ca2+ signal regime on development. Development 128, 917-928 (2001).
17. Maro, B., Johnson, M.H., Pickering, S.J. & Flach, G. Changes in actin distribution during fertilization of the mouse egg. J Embryol Exp Morphol 81, 211-237 (1984).
18. Maro, B., Johnson, M.H., Webb, M. & Flach, G. Mechanism of polar body formation in the mouse oocyte: an interaction between the chromosomes, the cytoskeleton and the plasma membrane. J Embryol Exp Morphol 92, 11-32 (1986).
19. Gray, D. et al. First cleavage of the mouse embryo responds to change in egg shape at fertilization. Curr Biol 14, 397-405 (2004).
20. Deguchi, R., Shirakawa, H., Oda, S., Mohri, T. & Miyazaki, S. Spatiotemporal analysis of Ca(2+) waves in relation to the sperm entry site and animal-vegetal axis during Ca(2+) oscillations in fertilized mouse eggs. Dev Biol 218, 299-313 (2000).
21. Raffel, M., Willert, C.E. & Kompenhans, J. (Springer, 1998).
22. Willert, C.E. & Gharib, M. Digital particle image velocimetry. Exp Fluids 10, 181-193 (1991).
23. Keane, R.D. & Adrian, R.J. Theory of cross-correlation analysis of PIV images. Appl Sci Res 49, 191-215 (1992).
24. Westerweel, J. Fundamentals of digital particle image velocimetry. Measurement Science and Technology 8, 1379-1392 (1997).
25. Simerly, C., Nowak, G., de Lanerolle, P. & Schatten, G. Differential expression and functions of cortical myosin IIA and IIB isotypes during meiotic maturation, fertilization, and mitosis in mouse oocytes and embryos. Mol Biol Cell 9, 2509-2525 (1998).
26. Schuh, M. & Ellenberg, J. A new model for asymmetric spindle positioning in mouse oocytes. Curr Biol 18, 1986-1992 (2008).
27. Tinevez, J.Y. et al. Role of cortical tension in bleb growth. Proc Natl Acad Sci U S A 106, 18581-18586 (2009).
28. Deng, M., Williams, C.J. & Schultz, R.M. Role of MAP kinase and myosin light chain kinase in chromosome-induced development of mouse egg polarity. Dev Biol 278, 358-366 (2005).
29. Swann, K. & Ozil, J.P. Dynamics of the calcium signal that triggers mammalian egg activation. Int Rev Cytol 152, 183-222 (1994).
30. Kline, D. & Kline, J.T. Repetitive calcium transients and the role of calcium in exocytosis and cell cycle activation in the mouse egg. Dev Biol 149, 80-89 (1992).
31. Furuta, A. et al. Microtubule disruption with BAPTA and dimethyl BAPTA by a calcium chelation-independent mechanism in 3T3-L1 adipocytes. Endocr J 56, 235-243 (2009).
32. Xu, N., Luo, K.Q. & Chang, D.C. Ca2+ signal blockers can inhibit M/A transition in mammalian cells by interfering with the spindle checkpoint. Biochem Biophys Res Commun 306, 737-745 (2003).
33. Deng, M., Suraneni, P., Schultz, R.M. & Li, R. The Ran GTPase mediates chromatin signaling to control cortical polarity during polar body extrusion in mouse oocytes. Dev Cell 12, 301-308 (2007).
34. Halet, G., Tunwell, R., Parkinson, S.J. & Carroll, J. Conventional PKCs regulate the temporal pattern of Ca2+ oscillations at fertilization in mouse eggs. J Cell Biol 164, 1033-1044 (2004).
35. Markoulaki, S., Matson, S. & Ducibella, T. Fertilization stimulates long-lasting oscillations of CaMKII activity in mouse eggs. Dev Biol 272, 15-25 (2004).
36. Markoulaki, S., Matson, S., Abbott, A.L. & Ducibella, T. Oscillatory CaMKII activity in mouse egg activation. Dev Biol 258, 464-474 (2003).
37. Shawlot, W., Deng, J.M., Fohn, L.E. & Behringer, R.R. Restricted beta-galactosidase expression of a hygromycin-lacZ gene targeted to the beta-actin locus and embryonic lethality of beta-actin mutant mice. Transgenic Res 7, 95-103 (1998).
38. Shmerling, D. et al. Strong and ubiquitous expression of transgenes targeted into the beta-actin locus by Cre/lox cassette replacement. Genesis 42, 229-235 (2005).
39. Bunnell, T.M. & Ervasti, J.M. Delayed embryonic development and impaired cell growth and survival in Actg1 null mice. Cytoskeleton (Hoboken) 67, 564-572.
40. Scott, L. Embryological strategies for overcoming recurrent assisted reproductive technology treatment failure. Hum Fertil (Camb) 5, 206-214 (2002).
41. Bromer, J.G. & Seli, E. Assessment of embryo viability in assisted reproductive technology: shortcomings of current approaches and the emerging role of metabolomics. Curr Opin Obstet Gynecol 20, 234-241 (2008).
42. Scott, L. The biological basis of non-invasive strategies for selection of human oocytes and embryos. Hum Reprod Update 9, 237-249 (2003).
43. Wong, C.C. et al. Non-invasive imaging of human embryos before embryonic genome activation predicts development to the blastocyst stage. Nat Biotechnol 28, 1115-1121.
44. Plusa, B. et al. Downregulation of Par3 and aPKC function directs cells towards the ICM in the preimplantation mouse embryo. J Cell Sci 118, 505-515 (2005).
45. Fraser, L. Ca2+ is required for mouse sperm capacitation and fertilization in vitro. J Androl 3, 412-419 (1982).
46. Kamm, K.E. & Stull, J.T. Dedicated myosin light chain kinases with diverse cellular functions. J Biol Chem 276, 4527-4530 (2001).
47. Sveen, J. An introduction to MatPIV v.1.6.1. Mechanics and Applied Mathematics 27 (2004).
48. Westerweel, J. Theoretical analysis of the measurement precision in particle image velocimetry. Exp Fluids 29, S3-S12 (2000).
49. Kimura, Y. & Yanagimachi, R. Intracytoplasmic sperm injection in the mouse. Biol Reprod 52, 709-720 (1995).
50. Meilhac, S.M. et al. Active cell movements coupled to positional induction are involved in lineage segregation in the mouse blastocyst. Dev Biol 331, 210-221 (2009).
51. Lawless, J. Negative binomial and mixed Poisson regression. Canadian Journal of Statistics 15, 209-225 (1987).
52. Saunders CM, Larman MG, Parrington J, Cox LJ, Royse J,
Blayney LM, Swann K, Lai FA. PLCζ: a sperm-specific trigger of Ca2+ oscillations in eggs and embryo development. Development 2002;129:3533-3544.
53. Swann K, Saunders CM, Rogers N, Lai FA. PLCζ (zeta): A sperm protein that triggers Ca2+ oscillations and egg activation in mammals. Sem Cell & Dev. Biol. 2006;17:264-73.
54. Yu Y, Saunders CM, Lai FA, Swann K. Preimplantation development of mouse oocytes activated by different levels of human phospholipase Czeta. Hum Reprod 2008;23:365-373.
55. Rogers NT, Hobson E, Pickering S., Lai FA, Braude P, Swann K. PLCζ causes Ca2+ oscillations and parthenogenetic activation of human oocytes. Reproduction 2004;128:697-702.
56. Yoneda A, Kashima M, Yoshida S, Terada K, Nakagwa S, Sakamoto A, Hayakawa K, Suzuki K, Ueda J, Watanabe,T. Molecular cloning, testicular expression and oocyte activation potential of porcine phospholipase C zeta. Reproduction 2006;132:393-401.
57. Ross PJ, Beyhan Z, Iager AE, Yoon SY, Schellander K, Fissore RA, Cibelli JB. Parthenogenetic activation of bovine oocytes using bovine and murine phospholipase C zeta. BMC Dev Biol 2008;8:16.
58. Ajduk A, Ilozue T, Windsor S, Yu Y, Seres KB, Bomphrey RJ, Tom BD, Swann K, Thomas A, Graham C, Zernicka-Goetz M. Rhythmic actomyosin-driven contractions induced by sperm entry predict mammalian embryo viability. Nature Commun 2011;2:417.
59. Summers MC, Bhatnagar PR, Lawitts JA, Biggers JD. Fertilization in vitro of mouse ova from inbred and outbred strains: complete preimplantation embryo development in glucose-supplemented KSOM. Biol Reprod 1995;53:431-7.
60. Nomikos M, Blayney LM, Larman MG, Campbell K, Rossbach A, Saunders CM, Swann K, Lai FA. Role of Phospholipase C-ζ Domains in Ca2+-dependent Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate Hydrolysis and Cytoplasmic Ca2+ Oscillations. J Biol Chem. 2011:280:31011-31018.
61. Nomikos M, Elgmati K, Theodoridou M, Calver BL, Cumbes B, Nounesis G, Swann K, Lai FA. Male infertility-linked point mutation disrupts the Ca2+ oscillation-inducing and PIP(2) hydrolysis activity of sperm PLCzeta. Biochem J 2011;434:211-217.
62. Nomikos M, Elgmati K, Theodoridou M, Calver BL, Nounesis G, Swann K, Lai FA. Phospholipase Cζ binding to PtdIns(4,5)P2 requires the XY-linker region. J Cell Sci 2011;124:2582-90.