特許 6105854 細胞培養基材、およびそれを用いた細胞培養方法並びに多能性幹細胞の分化誘導方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6105854

(24)【登録日】2017年3月10日

(45)【発行日】2017年3月29日

(54)【発明の名称】細胞培養基材、およびそれを用いた細胞培養方法並びに多能性幹細胞の分化誘導方法

(51)【国際特許分類】

   C12M 3/00 20060101AFI20170316BHJP

   C12N 5/0735 20100101ALI20170316BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20170316BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20170316BHJP

【ＦＩ】

   C12M3/00 AZNA

   C12N5/0735

   C12N5/10

   !C12N15/00 A

【請求項の数】7

【全頁数】21

(21)【出願番号】特願2012-97103(P2012-97103)

(22)【出願日】2012年4月20日

(65)【公開番号】特開2013-223446(P2013-223446A)

(43)【公開日】2013年10月31日

【審査請求日】2015年3月25日

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 平成２３年１０月２０日にオンラインで閲覧可能となった「Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２０１２，３３（２），第５１５−５２３頁」で発表

(73)【特許権者】

【識別番号】000108454

【氏名又は名称】ソマール株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】591116380

【氏名又は名称】赤池 敏宏

(74)【代理人】

【識別番号】100096714

【弁理士】

【氏名又は名称】本多 一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100124121

【弁理士】

【氏名又は名称】杉本 由美子

(74)【代理人】

【識別番号】100161458

【弁理士】

【氏名又は名称】篠田 淳郎

(74)【代理人】

【識別番号】100176566

【弁理士】

【氏名又は名称】渡耒 巧

(72)【発明者】

【氏名】湊 彩や香

(72)【発明者】

【氏名】伊勢 裕彦

(72)【発明者】

【氏名】赤池 敏宏

【審査官】 名和 大輔

(56)【参考文献】

【文献】 湊 彩や香 他，ＢＭＢ２０１０ プログラム，２０１０年１２月１０日，4P-0861

【文献】 湊 彩香 他，再生医療，２０１１年 ２月 １日，Vol. 10, Suppl，p. 147, O-06-4

【文献】 Yue et al，Biomaterials，２０１０年 ４月１５日，VOl. 31，p. 5287-5296

【文献】 Nagaoka et al，The Journal of Biological Chemistry，２００８年 ９月２６日，Vol. 283, No. 39，p. 26468-26476

【文献】 フナコシ総合カタログ ２００５−２００６ 試薬編 ベストセレクション，２００５年 ８月，p. 655

【文献】 Minato et al，BIomaterials，２０１１年１０月２０日，Vol. 33，p. 515-523

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／

Ｃ１２Ｍ ３／

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＩＧＦＢＰ４のＴｈｙドメイン又はＩＧＦＢＰ４のＴｈｙドメインと９０％以上相同なアミノ酸配列を含み、かつ、（ＧＶＧＶＰ）ｎ（ｎは６５以上の数である。）で表される繰り返し配列を含む融合タンパク質であって、Ｗｎｔ受容体と結合する融合タンパク質を、３７℃で表面に固定またはコーティングすることを特徴とする細胞培養基材の製造方法。

【請求項2】

前記融合タンパク質が、Ｎ末側に、（ＧＶＧＶＰ）ｎ（ｎは６５以上の数である。）を含むタンパク質である請求項１記載の細胞培養基材の製造方法。

【請求項3】

前記融合タンパク質が、Ｎ末側に、（ＧＶＧＶＰ）ｎ（ｎは６５以上の数である。）を含み、Ｃ末側にＩＧＦＢＰ４のＴｈｙドメインまたはＩＧＦＢＰ４のＴｈｙドメインと９０％以上相同なアミノ酸配列を含むタンパク質である請求項１または２記載の細胞培養基材の製造方法。

【請求項4】

多能性幹細胞を心筋細胞へ分化する際に用いられる細胞培養基材の製造方法である請求項１〜３のいずれか一項記載の細胞培養基材の製造方法。

【請求項5】

請求項１〜４のいずれか一項記載の細胞培養基材の製造方法で製造した細胞培養基材と、液体培地とを用いて、多能性幹細胞を増殖させることを特徴とする細胞培養方法。

【請求項6】

請求項１〜４のいずれか一項記載の細胞培養基材の製造方法で製造した細胞培養基材と、液体培地とを用いて、多能性幹細胞を心筋細胞へ分化させることを特徴とする心筋細胞の製造方法。

【請求項7】

Ｗｎｔ／βカテニンシグナリング経路を阻害することにより多能性幹細胞を心筋細胞へ分化させる請求項６記載の心筋細胞の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細胞培養基材、およびそれを用いた細胞培養方法並びに多能性幹細胞の分化誘導方法に関し、詳しくは、多能性幹細胞を培養することができ、多能性幹細胞を、特定の細胞に分化させることの可能な細胞培養基材、およびそれを用いた細胞培養方法並びに多能性幹細胞の分化誘導方法に関する。

【背景技術】

【0002】

成人において心筋細胞は増殖しない為、損傷した心臓組織はそのままでは再生しない。心臓の病に対する治療法の確立のために、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞を用いた再生治療法は有望である。ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞は分化全能性を有する為、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞が分化してなる心筋細胞は、移植用の細胞供給源となりうる。これまで、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞からの心筋細胞への分化誘導において、骨形成タンパク質（ＢＭＰｓ， ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、ＢＭＰインヒビター、Ｗｎｔｓ、Ｗｎｔｓインヒビターを使用する方法が提案されている（非特許文献１〜３）。

【0003】

これらの因子は、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナリング経路を制御することにより、心臓発生をもたらす。Ｗｎｔ／β−カテニンシグナリングは、ＥＳ細胞の心筋細胞への分化誘導促進に重要であると考えられている。最近、ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ４ （ＩＧＦＢＰ４）が、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナリングを阻害することによって、胚様体（ＥＢ， ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ）形成後の後期において、ＥＳ細胞の心筋細胞への分化誘導を強く促進することが報告された（非特許文献４）。

【0004】

ＩＧＦＢＰ４は、Ｗｎｔ受容体であるＦｒｉｚｚｌｅｄ ８（Ｆｒｚ８）およびＷｎｔ共受容体であるｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ６ （ＬＲＰ６）に対するＷｎｔ３ａの結合を、これら受容体に結合することを通じて阻害することが明らかになった。さらに、ニワトリおよびカエル胚において、ＩＧＦＢＰ４は、Ｗｎｔβ−Ｃａｔｅｎｉｎシグナリングの阻害を通じての心臓発生に必要であることが分かった（非特許文献４）。そこで、ＩＧＦＢＰ４を用いたＥＳ細胞の心筋細胞分化の促進は、有望である。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Yuasa S. et al., Nat. Biotechnol. 2005;23:607-11.

【非特許文献2】Kami D. et al., Plos One 2008;3:e2407.

【非特許文献3】Monzen K. et al., Mol.Cell Biol. 1999;19:7096-105.

【非特許文献4】Zhu W. et al., Nature 2008;454:345-9.

【非特許文献5】Nadanaka et al., J. Biol.Chem. 2008;283:27333-43.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

しかしながら、ＩＧＦＢＰ４は培地中で不安定であるため、心筋細胞分化には高濃度のＩＧＦＢＰ４が必要である。加えて、Ｗｎｔｓは、自己自律的に制御されており、細胞表面のヘパラン硫酸プロテオグリカンに結合する（非特許文献５）。Ｗｎｔ分子は細胞表面に結合するため、Ｗｎｔの受容体への結合を阻害するには、高濃度のＩＧＦＢＰ４が必要となる。

【0007】

そこで本発明の目的は、高濃度のＩＧＦＢＰを必要とせずに、多能性幹細胞を、心筋細胞へ分化させることのできる細胞培養基材、およびそれを用いた細胞培養方法並びに多能性幹細胞の分化誘導方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者等は鋭意検討した結果、ＩＧＦＢＰファミリーに属するタンパク質、または該タンパク質の一部を含む融合タンパク質を固定化した基層を用いることで上記課題を解決し、心筋細胞分化を誘導しうることを見出した。

【0009】

即ち、本発明の細胞培養基材は、インシュリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）ファミリーに属するタンパク質の全部または一部の領域からなるポリペプチド、または、該インシュリン様成長因子結合タンパク質ファミリーに属するタンパク質の全部または一部を含む融合タンパク質を、表面に固定またはコーティングしたことを特徴とするものである。

【0010】

本発明の細胞培養基材において、前記インシュリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）ファミリーに属するタンパク質がＩＧＦＢＰ４、または、ＩＧＦＢＰ４と相同性を有するタンパク質であることが好ましい。

【0011】

また、本発明の細胞培養基材において、前記インシュリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）ファミリーに属するタンパク質の全部または一部の領域からなるポリペプチド、または、該インシュリン様成長因子結合タンパク質ファミリーに属するタンパク質の全部または一部を含む融合タンパク質が、ＩＧＦＢＰ４のＴｈｙドメイン、または、ＩＧＦＢＰ４のＴｈｙドメインと相同なアミノ酸配列を含むものであることが好ましい。

【0012】

また、本発明の細胞培養基材において、前記インシュリン様成長因子結合タンパク質ファミリーに属するタンパク質の全部または一部を含む融合タンパク質が、エラスチン様ポリペプチドの全部または一部を含むことが好ましい。

【0013】

また、本発明の細胞培養基材において、前記インシュリン様成長因子結合タンパク質ファミリーに属するタンパク質の全部または一部を含む融合タンパク質が、（ＧＶＧＶＰ）ｎ（ｎは２以上の数である。）で表される繰り返し配列を含むことが好ましい。

【0014】

また、本発明の細胞培養基材において、前記繰り返し配列が、（ＧＶＧＶＰ）ｎ（ｎは６５以上の数である。）で表されることが好ましい。

【0015】

また、本発明の細胞培養基材において、前記融合タンパク質が、Ｎ末側に、（ＧＶＧＶＰ）ｎ（ｎは６５以上の数である。）を含み、Ｃ末側にＩＧＦＢＰ４の全部または一部を含むタンパク質であることが好ましい。。

【0016】

また、本発明の細胞培養基材において、前記融合タンパク質が、Ｎ末側に、（ＧＶＧＶＰ）ｎ（ｎは６５以上の数である。）を含み、Ｃ末側にＩＧＦＢＰ４のＴｈｙドメインまたはＩＧＦＢＰ４のＴｈｙドメインと相同なアミノ酸配列を含むタンパク質であることが好ましい。

【0017】

本発明の細胞培養方法は、上記いずれかの細胞培養基材と、液体培地とを用いて、未分化性および分化多能性を維持しながら多能性幹細胞を増殖させることを特徴とするものである。

【0018】

本発明の心筋細胞の製造方法は、上記いずれかの細胞培養基材と、液体培地とを用いて、多能性幹細胞を心筋細胞へ分化させることを特徴とするものである。

【0019】

本発明の心筋細胞の製造方法は、Ｗｎｔ／βカテニンシグナリング経路を阻害することにより多能性幹細胞を心筋細胞へ分化させることが好ましい。

【発明の効果】

【0020】

本発明により、高濃度のＩＧＦＢＰを必要とせずに、多能性幹細胞を、心筋細胞へ分化させることのできる細胞培養基材、およびそれを用いた細胞培養方法並びに多能性幹細胞の分化誘導方法を提供することが可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】図１Ａは、ＩＧＦＢＰ４（Ｔｈｙ）、（ＧＶＧＶＰ）_１２−ＩＧＦＢＰ４、（ＧＶＧＶＰ）_２３−ＩＧＦＢＰ４、（ＧＶＧＶＰ）_４５−ＩＧＦＢＰ４、（ＧＶＧＶＰ）_６７−ＩＧＦＢＰ４タンパク質のウェスタンブロットである。図１Ａの上部はＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルをＣＢＢ染色したものの写真図であり、下部は、抗ＩＧＦＢＰ４抗体を用いたウェスタンブロットの結果を示す写真図である。図１Ｂは、（ＧＶＧＶＰ）_４５−ＩＧＦＢＰ４、（ＧＶＧＶＰ）_６７−ＩＧＦＢＰ４タンパク質の温度依存的凝集プロファイルを示すグラフ図である。結果は、平均±標準偏差として示す。縦軸が濁度（％）、横軸が温度である。

【図2】図２Ａは、３７℃１日（左）、４℃１日（右）における、ＩＧＦＢＰ４（Ｔｈｙ）、（ＧＶＧＶＰ）_１２−ＩＧＦＢＰ４、（ＧＶＧＶＰ）_２３−ＩＧＦＢＰ４、（ＧＶＧＶＰ）_４５−ＩＧＦＢＰ４、（ＧＶＧＶＰ）_６７−ＩＧＦＢＰ４の、ポリスチレンディッシュに対する吸着安定性試験（ＥＬＩＳＡアッセイ）の結果を示すグラフ図である。縦軸はＯＤ４５０ｎｍ、横軸は各タンパク質の濃度である。図２Ｂは、３７℃１週間における、ＩＧＦＢＰ４（Ｔｈｙ）、（ＧＶＧＶＰ）_１２−ＩＧＦＢＰ４、（ＧＶＧＶＰ）_２３−ＩＧＦＢＰ４、（ＧＶＧＶＰ）_４５−ＩＧＦＢＰ４、（ＧＶＧＶＰ）_６７−ＩＧＦＢＰ４の、ポリスチレンディッシュに対する吸着安定性試験（ＥＬＩＳＡアッセイ）の結果を示すグラフ図である。縦軸はＯＤ４５０ｎｍ、横軸は各タンパク質の濃度である。図２Ｃは、１０μｇ／ｍＬ ＩＧＦＢＰ４（Ｔｈｙ）、（ＧＶＧＶＰ）_１２−ＩＧＦＢＰ４、（ＧＶＧＶＰ）_２３−ＩＧＦＢＰ４、（ＧＶＧＶＰ）_４５−ＩＧＦＢＰ４、（ＧＶＧＶＰ）_６７−ＩＧＦＢＰ４のポリスチレンディッシュに対する、３７℃１日または１週間の吸着安定性試験（ＥＬＩＳＡアッセイ）の結果を示すグラフ図である。

【図3】図３は、ＬＲＰ５／６と、ＩＧＦＢＰ４（Ｔｈｙ）、（ＧＶＧＶＰ）_１２−ＩＧＦＢＰ４、（ＧＶＧＶＰ）_２３−ＩＧＦＢＰ４、（ＧＶＧＶＰ）_４５−ＩＧＦＢＰ４、（ＧＶＧＶＰ）_６７−ＩＧＦＢＰ４との相互作用の有無を確認する免疫沈降試験の結果を示すウェスタンブロット写真図である。Ｐ１９ＣＬ６細胞を各組換えタンパク質を固定したディッシュ上で３時間培養し、破砕して、免疫沈降を行った。上部が抗ＩＧＦＢＰ４抗体、下部が抗ＬＲＰ５／６抗体を用いてのウェスタンブロットの結果を示す写真図である。

【図4】図４Ａは、ゼラチンコートディッシュ（コントロール）、１μｇ／ｍＬ ＩＧＦＢＰ４（Ｔｈｙ）を添加したゼラチンコートディッシュ、１μｇ／ｍＬ（ＧＶＧＶＰ）_６７−ＩＧＦＢＰ４を添加したゼラチンコートディッシュ、（ＧＶＧＶＰ）_６７−ＩＧＦＢＰ４を固定化したディッシュ上で培養したＥＳ細胞の顕微鏡写真図（ｐｈａｓｅ ｃｏｎｔｒａｓｔ）である。上部が０日後、下部が２４日培養後の写真図である。図４Ｂは、２４日培養後のＥＳ細胞を用いたＲＴ−ＰＣＲの結果を示す写真図である。図４Ｃは、抗αＭＨＣ抗体（ＭＦ２０）を用いた免疫染色の結果を示す共焦点顕微鏡写真図である（左）。右は、２４日培養後のＥＳ細胞における、ＤＡＰＩ陽性領域に対するＭＦ２０陽性領域の割合を示すグラフ図である。

【図5】図５Ａは、懸滴培養開始１日、３日、５日目の胚様体の顕微鏡写真図である。図５Ｂは、各培養日数における胚様体（ＥＢ）のＲＴ−ＰＣＲの結果を示す写真図である。

【図6】図６Ａは、ゼラチンコートディッシュ（コントロール）、（ＧＶＧＶＰ）_６７−ＩＧＦＢＰ４を固定化したディッシュ上で培養した胚様体（ＥＢ）の１日目、７日目、２０日目の顕微鏡写真図（ｐｈａｓｅ ｃｏｎｔｒａｓｔ）である。図６Ｂは、ゼラチンコートディッシュ（コントロール）、（ＧＶＧＶＰ）_６７−ＩＧＦＢＰ４を固定化したディッシュ上で２０日間培養し、心筋細胞分化したＥＳ細胞の微分干渉顕微鏡写真図である。線で囲った領域は、自律拍動した領域を表す。図６Ｃは、２０日培養後の胚様体を用いたＲＴ−ＰＣＲの結果を示す写真図である。図６Ｄは、抗αＭＨＣ抗体（ＭＦ２０）を使用した免疫染色の結果を示す共焦点顕微鏡写真図である（左）。右は、２０日培養後の胚様体における、ＤＡＰＩ陽性領域に対するＭＦ２０陽性領域の割合を示すグラフ図である。

【図7】１０μｇ／ｍＬ （ＧＶＧＶＰ）ｎ−ＩＧＦＢＰ４固定化ディッシュ上で２０日間培養した胚様体（ＥＢ）のＭＦ２０陽性領域の共焦点顕微鏡写真図である。

【図8】可溶性因子として、ＩＧＦＢＰ４を加えた場合（左）と、ＩＧＦＢＰ４を基層に固定したものを用いた場合（右）の、Ｗｎｔ／βｃａｔｅｎｉｎシグナリング経路の阻害の予想メカニズムを表す模式図である。

【発明を実施するための形態】

【0022】

［ＩＧＦＢＰファミリータンパク質］
ＩＧＦＢＰ（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ）ファミリータンパク質は、高等生物において、インスリン様成長因子（ＩＧＦ、Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ）ＩおよびＩＩと特異的に結合するタンパク質として、ＩＧＦＢＰ１〜６の６種類が報告されている。インスリン様成長因子の活性制御や分解阻害といった機能を有することが示唆されている。中でも、ＩＧＦＢＰ４が好ましい。

【0023】

ＩＧＦＢＰ４は、インスリン様成長因子結合ドメインと、タイプ１チログロブリン（Ｔｈｙ）ドメインからなる。ＩＧＦＢＰ４のＣ末にあるＴｈｙドメインがＷｎｔ受容体結合ドメインである（非特許文献４）。ＩＧＦＢＰ４のアミノ酸配列は、例えば、ヒトについては、ＧｅｎＢａｎｋにおいて、アクセッション番号：ＡＡＨ１６０４１．１で登録されている。また、マウスについては、ＧｅｎＢａｎｋにおいて、アクセッション番号：：ＡＡＨ１９８３６．１で登録されている。本発明に用いるＩＧＦＢＰ４のペプチド配列としては、これらに限定されず、１〜９個のアミノ酸の欠失、挿入、置換がなされたものであってもよく、他の生物におけるＩＧＦＢＰ４であってもよい。また、上記のタンパク質分子と、アミノ酸レベルで８０％以上、好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を示し、かつ、インシュリン様成長因子結合活性を有するタンパク質も使用することができる。

【0024】

ＩＧＦＢＰファミリーに属するタンパク質を作製する方法としては、特にこれを限定しないが、分子生物学的手法を用いてリコンビナント・タンパク質を作製・精製し、これを使用することが望ましい。その他にも、同様の効果を示す方法であれば、いずれをも用いることができ、例えば、多能性幹細胞のＩＧＦＢＰファミリーに属するタンパク質を、生体組織・細胞から抽出、精製して使用すること、又は当該ペプチドを化学的に合成して使用することも可能である。

【0025】

エラスチンは大動脈をはじめ、項靭帯、黄色靭帯、肺、皮膚、子宮、弾性軟骨などの弾性線維の主要蛋白質である。エラスチンは生体内ではコラーゲンに次いで多量に存在し、そのもっとも重要な機能は弾性である。エラスチンは組織では不溶性である。エラスチン中の主要な繰り返しペプチド配列としてペンタペプチドＧｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ（以下ＧＶＧＶＰ）及びヘキサペプチドＶａｌ− Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（以下ＶＧＶＡＰＧ）の繰り返し配列がある。この２種類のペプチド繰り返し配列はヒト、ウシ、ブタ等の哺乳動物に共通して存在するが、性質は全く異なり、ＧＶＧＶＰ繰り返し配列は弾性機能を有し、コアセルベーションを示すが、細胞には全く認識されない。一方、ＶＧＶＡＰＧ繰り返し配列は弾性及びコアセルベーションを示さないが、種々の細胞の遊走、増殖などを惹起する。不溶性エラスチンを可溶化して得られる水溶性エラスチン、前駆蛋白質であるトロポエラスチン（可溶性）及びエラスチン由来ポリペンタペプチドは、コアセルベーションと呼ばれるユニークな現象を示す。水溶性エラスチン及びトロポエラスチンの水溶液は、低温では透明な均一溶液であるが、体温（３７℃）付近まで加熱すると、相分離を起こして白濁しコアセルベート液滴を形成し、そのまま放置するとコアセルベート層からなる下層と平衡溶液からなる上層の２層に分離する。このプロセスは可逆的で、温度を室温以下に冷却するとまた元の均一溶液に戻る。
本発明においては、基層に固定する融合タンパク質が、エラスチン様ポリペプチド中の主要な繰り返しペプチド配列を含むことが好ましく、Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ（以下ＧＶＧＶＰ）の繰り返し配列を含むことが好ましい。ＧＶＧＶＰの繰り返し数は、６５以上が好ましく、７０以上がより好ましい。

【0026】

本発明において、培養基材表面に固定化されるタンパク質の好適な態様としてはＩＧＦＢＰ４のＷｎｔ受容体結合ドメインと、エラスチン様ポリペプチドから構成される、キメラタンパク質（融合タンパク質）が挙げられる。ＩＧＦＢＰ４は、インスリン様成長因子結合ドメインと、タイプ１チログロブリン（Ｔｈｙ）ドメインからなる。ＩＧＦＢＰ４のＣ末にあるＴｈｙドメインがＷｎｔ受容体結合ドメインである（非特許文献４）。エラスチン様ポリペプチドは、グリシン−バリン−グリシン−バリン−プロリン（ＧＶＧＶＰ）の繰り返し配列を有し、熱を感受して疎水性が変化するという性質を持っている（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ ＤＴ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇ． １９９２；８：３４７−５２． ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ ＤＴ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ． Ｐｕｒｉｆ． １９９６；７：５１−７． Ｍｉｅ Ｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｍａｔｅｒ． Ｒｅｓ． Ｂ Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｍａｔｅｒ． ２００８；８６：２８３−９０．）。相転移温度（Ｔｇ（ｔ））以上では、これらのポリペプチドは、疎水相互作用を通してポリスチレンディッシュといった基層に安定して吸着させることができる。
低温下では、親水性が強まることにより、これらのポリペプチドは基層から遊離する。エラスチン様ポリペプチドのＴｇ（ｔ）は、ＧＶＧＶＰリピートの数に依存する（非特許文献１３）。従って、エラスチン様ポリペプチド、（ＧＶＧＶＰ）ｎは、様々な因子の固定化に有用である。本発明においては、ＴｈｙのＮ末と（ＧＶＧＶＰ）ｎが結合するようにして、（ＧＶＧＶＰ）ｎ−ＩＧＦＢＰ４とした融合タンパク質が特に好ましい。

【0027】

細胞培養用の培養基材としては、例えば、ディッシュ（培養皿とも称する）、シャーレやプレート（６穴、２４穴、４８穴、９６穴、３８４穴、９６００穴などのマイクロタイタープレート、マイクロプレート、ディープウェルプレート等）、フラスコ、チャンバースライド、チューブ、セルファクトリー、ローラーボトル、スピンナーフラスコ、フォロファイバー、マイクロキャリア、ビーズ等が挙げられる。これらの培養基材は、ガラス等の無機材料又はポリスチレン等の有機材料のいずれからなっていてもよいが、蛋白質やペプチド等に対する吸着性が高いポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン等の材料や、又は吸着性を高める処理、例えば親水処理や疎水処理等を施した材料の使用が好適である。また、滅菌可能な耐熱性及び耐水性を有している材料からなるのが好ましい。そのための好適な器材の一例としては、主に大腸菌等の培養に頻用される、細胞培養用の処理を特にしていないポリスチレン製ディッシュ及び／又はプレート（以下、無処理ポリスチレン製プレートと称する）を挙げることができ、当該培養基材は一般に市販されている。

【0028】

本発明で開示される方法の実施において、ＩＧＦＢＰファミリーに属するタンパク質や融合タンパク質を、上記の培養基材固相表面に固定又はコーティングする方法としては、吸着等の物理学的方法や共有結合等の化学的方法を適用することができるが、操作の容易さから吸着による方法が好ましい。例えば、プレート等の培養基材固相表面に当該分子の溶液を接触させ、一定時間後に溶媒を除去することにより、簡便に当該分子を吸着させることができる。さらに具体的には、例えば、蒸留水やＰＢＳ等を溶媒とするタンパク質分子の溶液を、ろ過、滅菌した後、プレート等の培養基材に接触させ、例えば数時間から１週間、好ましくは一昼夜放置するだけで、当該接着性分子が固定又はコーティングされた細胞培養用基材が得られる。好ましくは、蒸留水やＰＢＳ等で数回洗浄し、ＰＢＳ等の平衡塩溶液等で置換してから使用する。

【0029】

また、固定したいタンパク質に前もって人為的に抗原性分子が付加・融合させている場合は、当該タンパク質に対する特異抗体との結合を利用することもでき、タンパク質を効率的に基材表面に修飾することができる。この場合、特異抗体を前もって培養基材表面に、吸着等の物理学的方法や共有結合等の化学的方法によって固定又はコーティングしておく必要がある。例えば、培養基材に前もって修飾しておく抗体としては、ＩＧＦＢＰまたは（ＧＶＧＶＰ）ｎを特異的に認識するものを使用することができる。目的のタンパク質分子に各種タンパク質やタグ配列ペプチドを融合させたリコンビナント・タンパク質の場合、融合させた分子に特異的な抗体を、培養基材に前もって修飾することにより、使用することができる。

【0030】

本発明の実施において、細胞培養基材の固相表面に固定又はコーティングされるＩＧＦＢＰファミリーに属するタンパク質や融合タンパク質は少なくとも１種であるが、２種以上のＩＧＦＢＰファミリーに属するタンパク質や融合タンパク質を組み合わせて用いてもよい。その場合、各々のタンパク質の溶液を混合し、その混合溶液を上述の方法に基づき、修飾すればよい。

【0031】

上記のＩＧＦＢＰファミリーに属するタンパク質や融合タンパク質溶液の濃度は、当該タンパク質の吸着量及び／又は親和性、さらには当該タンパク質の物理学的性質によって適宜、検討する必要があるが、例えば、０．０１〜１０００μｇ／ｍＬ程度までの濃度範囲とし、好ましくは、０．１〜２００μｇ／ｍＬ程度、さらに好ましくは１〜５０μｇ／ｍＬ、そして最も好ましくは５〜２０μｇ／ｍＬである。

【0032】

本発明の細胞培養基材は、後述するように、種々の多能性幹細胞の未分化性を維持したままの培養や、多能性幹細胞を分化させる培養や、多能性幹細胞を分化させた細胞群から、所望の細胞を選抜、濃縮する培養方法に好適に用いることができる。

【0033】

［細胞培養方法］
本発明の細胞培養方法は、上記細胞培養基材と、液体培地とを用いて、未分化性および分化多能性を維持しながら多能性幹細胞を増殖させることを特徴とするものである。

【0034】

本発明の実施において、分子生物学や組換えＤＮＡ技術等の遺伝子工学の方法及び一般的な細胞生物学の方法及び従来技術について、実施者は、特に示されなければ、当該分野の標準的な参考書籍を参照し得る。これらには、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ第３版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、２００１）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９８７）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｂａｒｔｌｅｔｔ ＆ Ｓｔｒｉｌｉｎｇ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、２００３）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ第３版（Ｍａｓｔｅｒｓ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２０００）；Ａｎｔｉｂｏｉｄｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．＆ Ｌａｎｅ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８７）等を参照のこと。また、本明細書において参照される細胞培養、細胞生物学実験のための試薬及びキット類はＳｉｇｍａ社やＡｌｄｒｉｃｈ社、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＧＩＢＣＯ社、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社等の市販業者から入手可能である。

【0035】

また、多能性幹細胞を用いた細胞培養、及び発生・細胞生物学実験の一般的方法について、実施者は、当該分野の標準的な参考書籍を参照し得る。これらには、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｕｓｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（Ｗａｓｓｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９３）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ（Ｍ．Ｖ．Ｗｉｌｅｓ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２２５：９００，１９９３）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９４）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ（Ｔｕｒｋｓｅｎ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００２）が含まれる。本明細書において参照される細胞培養、発生・細胞生物学実験のための試薬及びキット類はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＧＩＢＣＯ社やＳｉｇｍａ社等の市販業者から入手可能である。

【0036】

マウス及びヒトの多能性幹細胞の作製、継代、保存法については、すでに標準的なプロトコールが確立されており、実施者は、前項で挙げた参考書籍に加えて、複数の参考文献（Ｍａｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ７０：８４１，１９９２；Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，８４３，７８０号；Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４，１９９８；Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１３７２６，１９９８；Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，米国特許第６，０９０，６２２号；Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：３９９，２０００；国際公開番号第００／２７９９５号）等を参照することにより、これらの多能性幹細胞を使用し得る。また、その他の動物種に関しても、例えばサル（Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，８４３，７８０号；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，７８４４，１９９６）やラット（Ｉａｎｎａｃｃｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６３：２８８，１９９４；Ｌｏｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，国際公開番号第９９／２７０７６号）、ニワトリ（Ｐａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２２：２３３９，１９９６；米国特許第５，３４０，７４０号；米国特許第５，６５６，４７９号）、ブタ（Ｗｈｅｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．６：５６３，１９９４；Ｓｈｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５７：１０８９，１９９７）等に関してＥＳ細胞又はＥＳ細胞様細胞の樹立方法が知られており、各記載の方法に従って、本発明に用いられるＥＳ細胞を作製することができる。

【0037】

ＥＳ細胞とは、胚盤胞期胚の内部にある内部細胞塊（ｉｎｎｅｒ ｃｅｌｌ ｍａｓｓ）と呼ばれる細胞集塊をｉｎ ｖｉｔｒｏ培養に移し、細胞塊の解離と継代を繰り返すことにより、未分化幹細胞集団として単離した多能性幹細胞である。マウス由来ＥＳ細胞としては、Ｅ１４、Ｄ３、ＣＣＥ、Ｒ１、Ｊ１、ＥＢ３等、様々なものが知られており、一部はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ社やＣｅｌｌ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｔｈｒｏｍｂ−Ｘ社等から購入することも可能である。ヒト由来ＥＳ細胞は、現在、全世界で５０種以上が樹立されており、米国・国立衛生研究所（ＮＩＨ）のリスト（ｈｔｔｐ：／／ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｇｉｓｔｒｙ／ｉｎｄｅｘ．ａｓｐ）には２０種以上の株が登録されている。その一部はＥＳ Ｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社やＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ａｌｕｍｎｉ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎから購入することが可能である。

【0038】

ＥＳ細胞は、一般に初期胚を培養することにより樹立されるが、体細胞の核を核移植した初期胚からもＥＳ細胞を作製することが可能である（Ｍｕｎｓｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１０：９８９，２０００；Ｗａｋａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：７４０，２００１；Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０３：１６６９，２００４）。また、異種動物の卵細胞、又は脱核した卵細胞を複数に分割した細胞小胞（ｃｙｔｏｐｌａｓｔｓやｏｏｐｌａｓｔｏｉｄｓと称される）に、所望する動物の細胞核を移植して胚盤胞期胚様の細胞構造体を作製し、それを基にＥＳ細胞を作製する方法も考案されている（国際公開番号第９９／４５１００号；第０１／４６４０１号；０１／９６５３２号；米国特許公開第０２／９０７２２号；０２／１９４６３７号）。また、単為発生胚を胚盤胞期と同等の段階まで発生させ、そこからＥＳ細胞を作製する試み（米国特許公開第０２／１６８７６３号；Ｖｒａｎａ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：１１９１１−６）や、ＥＳ細胞と体細胞を融合させることにより、体細胞核の遺伝情報を有したＥＳ細胞を作る方法も報告されている（国際公開番号第００／４９１３７号；Ｔａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１１：１５５３，２００１）。本発明で使用されるＥＳ細胞は、この様な方法により作製されたＥＳ細胞又はＥＳ細胞の染色体上の遺伝子を遺伝子工学的手法により改変したものも含まれる。

【0039】

ＥＧ細胞は、始原生殖細胞と呼ばれる胎児期の生殖細胞を、ＥＳ細胞の場合と同様、ＭＥＦ細胞やＳＴＯ細胞、Ｓｌ／Ｓｌ^４−ｍ２２０細胞等のフィーダー上で、ＬＩＦ及びｂＦＧＦ／ＦＧＦ−２、又はフォルスコリン等の薬剤で刺激することにより作製されたものであり（Ｍａｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ７０：８４１，１９９２；Ｋｏｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２２：１２３５，１９９６）、ＥＳ細胞ときわめて類似した性質を有している（Ｔｈｏｍｓｏｎ ＆ Ｏｄｏｒｉｃｏ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：５３，２０００）。ＥＳ細胞の場合と同様、ＥＧ細胞と体細胞を融合させて作製したＥＧ細胞（Ｔａｄａ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１６：６５１０，１９９７；Ａｎｄｒｅｗら）やＥＧ細胞の染色体上の遺伝子を遺伝子工学的手法により改変したものも、本発明の方法に使用することができる。

【0040】

ｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞：ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）とは、体細胞を初期化することによって得られる多能性を有する細胞である。上記特許文献３，４，５に記載された方法により作製することができる。また、ｉＰＳ細胞は、上記特許文献記載の方法以外にも多数の変法による作製方法が知られている。国際公開ＷＯ２００７／０６９６６６号公報には、Ｏｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、及びＭｙｃファミリー遺伝子の遺伝子産物を含む体細胞の核初期化因子、並びにＯｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、Ｓｏｘファミリー遺伝子及びＭｙｃファミリー遺伝子の遺伝子産物を含む体細胞の核初期化因子が記載されており、さらに体細胞に上記核初期化因子を接触させる工程を含む、体細胞の核初期化により誘導多能性幹細胞を製造する方法が記載されている。この他に、上記初期化因子の一つないし複数を使用せずに、他の因子を用いたり、初期化因子に変えて、または、加えて、別の物質や遺伝子を使用する方法が知られているが、ｉＰＳ細胞の定義に入るものであればいずれの方法により作製されたものであっても使用することができる。

【0041】

本発明で用いるｉＰＳ細胞は、体細胞を初期化することにより製造することができる。ここで用いる体細胞の種類は特に限定されず、任意の体細胞を用いることができる。体細胞は、生体を構成する細胞の内生殖細胞以外の全ての細胞を包含し、分化した体細胞でもよいし、未分化の幹細胞でもよい。体細胞の由来は、哺乳動物、鳥類、魚類、爬虫類、両生類の何れでもよく特に限定されないが、好ましくは哺乳動物（例えば、マウスなどのげっ歯類、またはヒトなどの霊長類）であり、特に好ましくはマウス又はヒトである。また、ヒトの体細胞を用いる場合、胎児、新生児又は成人の何れの体細胞を用いてもよい。

【0042】

また、多能性幹細胞は、ＥＳ細胞やＥＧ細胞、ｉＰＳ細胞のみに限らず、哺乳動物の胚や胎児、臍帯血、又は成体臓器や骨髄等の成体組織、血液等に由来する、ＥＳ／ＥＧ細胞に類似した形質を有するすべての多能性幹細胞が含まれる。例えば生殖細胞を特殊な培養条件下で培養することにより得られるＥＳ様細胞は、ＥＳ／ＥＧ細胞ときわめて良く似た形質を呈しており（Ｋａｎａｔｓｕ−Ｓｈｉｎｏｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １１９：１００１，２００４）、多能性幹細胞として使用することができる。その他の例としては、骨髄細胞から単離され、三胚葉すべての系譜の細胞に分化能を有する多能性成体幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ａｄｕｌｔ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ／ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：ＭＡＰＣ）を挙げることができる。また、毛根鞘細胞やケラチノサイト（国際公開番号第０２／５１９８０号）、腸管上皮細胞（国際公開番号第０２／５７４３０号）、内耳細胞（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．９：１２９３，２００３）等を特別な培養条件下で培養することにより得られた多能性幹細胞や、血液中の単核球細胞（又はその細胞核分に含まれる幹細胞）をＭ−ＣＳＦ（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ；マクロファージコロニー刺激因子）＋ＰＭＡ（ｐｈｏｒｂｏｌ １２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ １３−ａｃｅｔａｔｅ）処理（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：２４２６，２００３）、又はＣＲ３／４３抗体処理（Ａｂｕｌｊａｄａｙｅｌ、Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｏｐｉｎｉｏｎ １９：３５５，２００３）することにより作製される多能性幹細胞等に関しても、ＥＳ／ＥＧ細胞と類似の形質を有する幹細胞であればすべて含まれる。この場合、ＥＳ／ＥＧ細胞と類似の形質とは、当該細胞に特異的な表面（抗原）マーカーの存在や当該細胞特異的な遺伝子の発現、さらにはテラトーマ形成能やキメラマウス形成能といった、ＥＳ／ＥＧ細胞に特異的な細胞生物学的性質をもって定義することができる。

【0043】

本発明の実施において、多能性幹細胞は、上記本発明の細胞培養基材に播種される。多能性幹細胞の培養方法や培養条件は、当該培養基材を使用することを除き、多能性幹細胞の通常の培養方法や培養条件をそのまま使用することができる。多能性幹細胞の通常の培養方法や培養条件は、上記の参考書籍、すなわち、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｕｓｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（Ｗａｓｓｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９３）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ（Ｍ．Ｖ．Ｗｉｌｅｓ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２２５：９００，１９９３）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９４）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ（Ｔｕｒｋｓｅｎ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００２）や、参考文献（Ｍａｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ７０：８４１，１９９２；Ｔｈｏｍｓｏｎら、米国特許第５，８４３，７８０号；Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４，１９９８；Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１３７２６，１９９８；Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ ｅｔ ａｌ．米国特許第６，０９０，６２２号；Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：３９９，２０００；国際公開番号第００／２７９９５号）等を参照することができるが、特にこれらに限定されない。

【0044】

多能性幹細胞を培養するための液体培地としては、多能性幹細胞を継代培養する従来の方法に適用することができるものであれば、すべて使用可能である。その具体例としては、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）、Ｇｌａｓｇｏｗ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地等が挙げられ、通常、２ｍＭ程度のグルタミン及び／又は１００μＭ程度の２−メルカプトエタノールを添加して使用する。また、ＥＳ細胞培養用培地として市販されているＫｎｏｃｋＯｕｔ ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）や、ＥＳ ｃｅｌｌ−ｑｕａｌｉｆｉｅｄ ＤＭＥＭ（Ｃｅｌｌ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＴＸ−ＷＥＳ（Ｔｈｒｏｍｂ−Ｘ社）等も用いることができる。これらの培地にはＦＢＳを５〜２５％程度添加することが好ましいが、無血清培養することも可能で、例えば、１５〜２０％のＫｎｏｃｋＯｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を代用することができる。また、ＭＥＦ細胞の培養上清やｂＦＧＦ／ＦＧＦ−２、ＳＣＦ等を添加した培地を使用してもよく、その詳細な方法は公知である（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：９７１，２００１；国際公開番号第０１／５１６１６号；国際公開番号第０３／０２０９２０号；Ａｍｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，７０：８３７，２００４）。

【0045】

上記の多能性幹細胞を培養するための液体培地には、多能性幹細胞の未分化状態を維持する作用を有する物質・因子を添加することができる。具体的な物質・因子としては、特にこれを限定しないが、マウスＥＳ／ＥＧ細胞の場合、ＬＩＦが好適である。ＬＩＦは既報告論文（Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｈｏｏｐｅｒ、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１２１：１，１９８７；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３６：６８８，１９８８；Ｒａｔｈｊｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．４：２３０８，１９９０）や、ＮＣＢＩの公的なＤＮＡデータベースにアクセス番号Ｘ１３９６７（ヒトＬＩＦ）、Ｘ０６３８１（マウスＬＩＦ）、ＮＭ＿０２２１９６（ラットＬＩＦ）等で公知のタンパク質性因子であり、そのリコンビナント・タンパク質は、例えばＥＳＧＲＯ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社）の商品名で購入することができる。また、ＧＳＫ−３阻害剤を培養液に添加することにより、特に他の成長因子・生理活性因子等の添加をしなくても、マウス及びヒトＥＳ細胞の未分化性を効率的に維持することができる（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１０：５５，２００４）。この場合、ＧＳＫ−３の活性を阻害できる作用を有した物質であれば、すべて使用可能であり、例えばＷｎｔファミリー分子（Ｍａｎｏｕｋｉａｎ ＆ Ｗｏｏｄｇｅｔｔ、Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８４：２０３，２００２；Ｄｏｂｌｅ ＆ Ｗｏｏｄｇｅｔｔ、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１１６：１１７５，２００３）等を挙げることができる。

【0046】

本発明の実施において、従来の方法に基づき継代維持した多能性幹細胞を、上記の方法により作製された培養基材に播種し、かつ、上記の培養条件・方法に基いて培養することにより、当該細胞を分散した状態で、しかも当該細胞が本来有する未分化な状態を保持したまま継代培養することが可能である。この様な状態で培養した多能性幹細胞は、細胞分裂の際に物理的な抑制がかからないため、及び／又は細胞間接触に起因する細胞増殖抑制機構が作用しないため、及び／又は細胞の生存性が高まり、死細胞数が減少するため、細胞の著しい増加や増殖が認められる。一つの事例として、本発明の方法によりマウスＥＳ細胞を培養した場合、従来の方法で培養した場合と比較して、少なくとも１．２５倍以上、好ましくは１．５倍以上、より好ましくは２倍以上の増殖能を呈することが可能である。また、当該条件で４代ほど継代すると、従来法と比べて少なくとも３倍、好ましくは１０倍以上の細胞を回収することが可能である。増殖能は、単位時間における細胞数の増加率や倍化速度等の指標で表すことができ、その計測・算出方法としては、一般の細胞を用いた実験で使用され、公知となっている方法であれば、いずれも用いることができる。

【0047】

上述のように、多能性幹細胞における未分化な状態とは、多能性幹細胞が、ほぼ永続的または長期間の細胞増殖が可能であり、正常な核（染色体）型を呈し、適当な条件下において三胚葉すべての系譜の細胞に分化する能力をもった状態を意味する。また、好ましくは、多能性幹細胞のその他の特性、例えば、テロメアーゼ活性の維持やテラトーマ形成能、又はキメラ形成能等の性質のうち、少なくとも１つを有していることが望ましい。これらの性質・特性を調べる方法は、既に標準的なプロトコールが確立されており、例えば、上記の参考書籍、即ち、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｕｓｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（Ｗａｓｓｅｒｍａｎら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９３）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ（Ｍ．Ｖ．Ｗｉｌｅｓ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２２５：９００，１９９３）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９４）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ（Ｔｕｒｋｓｅｎ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００２）等を参照することにより、容易に実施することができるが、特にこれらに記載の方法には限定されない。

【0048】

また、未分化状態の多能性幹細胞は、以下に記載する少なくとも１つ、好ましくは複数の方法により、少なくとも１つ、好ましくは複数のマーカー分子の存在が確認できる細胞と定義することもできる。未分化状態の多能性幹細胞に特異的な種々のマーカーの発現は、従来の生化学的又は免疫化学的手法により検出される。その方法は特に限定されないが、好ましくは、免疫組織化学的染色法や免疫電気泳動法の様な、免疫化学的手法が使用される。これらの方法では、未分化状態の多能性幹細胞に結合する、マーカー特異的ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を使用することができる。個々の特異的マーカーを標的とする抗体は市販されており、容易に使用することができる。未分化状態の多能性幹細胞に特異的なマーカーとしては、例えばＡＬＰ活性や、Ｏｃｔ−３／４またはＲｅｘ−１／Ｚｆｐ４２等の遺伝子産物の発現が利用できる。また、各種抗原分子も用いることができ、マウスＥＳ細胞ではＳＳＥＡ−１、ヒトＥＳ細胞ではＳＳＥＡ−３やＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＧＣＴＭ−２等が未分化マーカーとして挙げられる。これらの未分化マーカーの発現は、ＥＳ細胞が分化することにより低減、消失する。

【0049】

あるいは、未分化状態の多能性幹細胞マーカーの発現は、特にその手法は問わないが、逆転写酵素介在性ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）やハイブリダイゼーション分析といった、任意のマーカー・タンパク質をコードするｍＲＮＡを増幅、検出、解析するための従来から頻用される分子生物学的方法により確認できる。未分化状態の多能性幹細胞に特異的なマーカー・タンパク質（例えば、Ｏｃｔ−３／４やＲｅｘ−１／Ｚｆｐ４２、Ｎａｎｏｇ等）をコードする遺伝子の核酸配列は既知であり、ＮＣＢＩの公共データベース等において利用可能であり、プライマー又はプローブとして使用するために必要とされるマーカー特異的配列を容易に決定することができる。

【0050】

［分化誘導による心筋細胞の製造方法］
本発明の心筋細胞の製造方法は、上記本発明の細胞培養基材と、液体培地とを用いて、多能性幹細胞を分化させることを特徴とする。

【0051】

多能性幹細胞の分化誘導のための培養方法や培養条件は、上記本発明の細胞培養基材を使用することを除き、多能性幹細胞の通常の分化誘導培養方法や培養条件をそのまま使用することができる。また、液体培地については上記したものと同様のものを使用することができる。

【0052】

分化誘導因子（Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒとも称される）は、多能性幹細胞の分化を誘導する為に、培地に添加されるペプチド、ホルモン、サイトカイン、タンパク質、糖タンパク質などの化合物であり、分化させたい細胞のタイプや、分化のステージに応じて様々な種類の分化誘導因子が用いられる。本発明においては、既知の方法やプロトコルに従い、目的の細胞に応じて公知の分化誘導因子を液体培地に添加することができる。本発明の分化誘導方法においては、ＩＧＦＢＰファミリータンパク質が、多能性幹細胞の心筋細胞への分化を促進するため、特に分化誘導因子を外から加えなくとも、心筋細胞への分化を起こすことが期待できる。

【0053】

本発明により調製された多能性幹細胞、及び／又は当該細胞から作製した分化細胞は、各種生理活性物質（例えば、薬物）や機能未知の新規遺伝子産物などの薬理評価や活性評価に有用である。例えば、多能性幹細胞や種々の分化細胞の機能調節に関する物質や薬剤、及び／又は多能性幹細胞や種々の分化細胞に対して毒性や障害性を有する物質や薬剤のスクリーニングに利用することができる。特に現状では、ヒト細胞を用いたスクリーニング法はほとんど確立しておらず、本発明により調製された多能性幹細胞に由来する各種分化細胞は、当該スクリーニング法を実施するための有用な細胞ソースとなる。また、本発明の方法により分化させた心筋細胞を心筋細胞シートとして分離できれば、心臓移植によらない心臓の再生医療法として有用である。

【実施例】

【0054】

［実験方法］
＜（ＧＶＧＶＰ）ｎプラスミドの作製＞
プラスミドは、非特許文献（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ ＤＴ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇ． １９９２；８：３４７−５２． ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ ＤＴ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ． Ｐｕｒｉｆ． １９９６；７：５１−７．）の記載に準拠して作製した。Ｘｈｏ Ｉ、ＰｆｌＭＩ、Ｎｏｔ Ｉ、Ｂａｍ ＨＩサイトをコードするオリゴヌクレオチドと、ＰｆｌＭＩ−（ＧＶＧＶＰ）_１１−ＰｆｌＭＩ配列をＯｐｅｒｏｎ バイオテクノロジー社から購入した。これらのオリゴヌクレオチドを、Ｍｉｇｈｔｙ ＴＡ−ｃｌｏｎｉｎｇ キットｆｏｒ ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（タカラバイオ社製）を用いて、ｐＭＤ２０−Ｔ（タカラバイオ社製）にサブクローンした。このベクターをＰｆｌＭＩで消化し、（ＧＶＧＶＰ）_１１のＰｆｌＭＩ断片と、Ｘｈｏ Ｉ、ＰｆｌＭＩ、Ｎｏｔ Ｉ、Ｂａｍ ＨＩサイトを有するｐＭＤ２０−ＴのＰＦｌＭＩ断片を得た。セルフライゲーションの防止のためｐＭＤ２０−ＴのＰＦｌＭＩ断片を脱リン酸化した。上記酵素処理断片とベクターをＴ４リガーゼを用いてライゲーションした。同様にして、（ＧＶＧＶＰ）_１２、（ＧＶＧＶＰ）_２３、（ＧＶＧＶＰ）_４５、（ＧＶＧＶＰ）_６７、をそれぞれ含むｐＭＤ２０ベクターを得た。上記断片とベクターが共に、両側にＰｆｌＭＩサイトを有しており、ベクターを脱リン酸化したため、上記断片のコンカテマーを得ることができた。得られたプラスミドをＸｈｏ ＩおよびＢａｍ ＨＩで処理した。（ＧＶＧＶＰ）ｎのＸｈｏ Ｉ／Ｂａｍ ＨＩ処理断片と、ｐＥＴ１４ｂのＸｈｏ Ｉ／Ｂａｍ ＨＩ処理断片をライゲーションして、Ｈｉｓタグ−（ＧＶＧＶＰ）_１２、（ＧＶＧＶＰ）_２３、（ＧＶＧＶＰ）_４５、（ＧＶＧＶＰ）_６７を発現する組換えプラスミドを作製した。

【0055】

＜（ＧＶＧＶＰ）ｎ−ＩＧＦＢＰ４の作製＞
ＩＧＦＢＰ４のＴｈｙドメインをコードするｃＤＮＡ断片をＰ１９ＣＬ６細胞のｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲにより増幅した。Ｔｈｙドメイン（アミノ酸の位置：１６７−２４５）をコードするＤＮＡ断片のＰＣＲは、Ｎｏｔ Ｉ、Ｘｈｏ Ｉ、Ｂａｍ ＨＩサイトを有するプライマーを用いて行われた。用いたプライマーは、ＩＧＦＢＰのセンスプライマーとして、５’−ＡＴＡＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＡＡＣＴＡＴＣＡＧＧＧＴＴＣＣＴＧＣＣＡＧＡＧＣＧＡＧＣＴＧ−３’、および、５’−ＣＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣＡＧＧＧＴＴＣＣＴＧＣＣＡＧＡＧＣＧＡ−３’を用いた。アンチセンスプライマーとして、５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＧＴＣＡＣＴＣＴＴＧＧＡＡＧＣＴＧＴＣＡＧＣＣＡＧ−３’を用いた。
ｃＤＮＡ断片をＭｉｇｈｔｙ ＴＡ−ｃｌｏｎｉｎｇ キットｆｏｒ ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（タカラバイオ社製）を用いて、ｐＭＤ２０−Ｔベクターにサブクローンした。得られたプラスミドをＮｏｔ ＩまたはＸｈｏ Ｉと、Ｂａｍ ＨＩで処理した。Ｔｈｙドメイン配列を含むＮｏｔ Ｉ／Ｂａｍ ＨＩ処理断片を、（ＧＶＧＶＰ）ｎを含むｐＭＤ２０のＮｏｔ Ｉ／Ｂａｍ ＨＩ断片に挿入した。（ＧＶＧＶＰ）ｎ−ＩＧＦＢＰ４を含むプラスミドをＸｈｏ ＩとＢａｍ ＨＩで処理し、（ＧＶＧＶＰ）ｎ−ＩＧＦＢＰ４断片を得た。（ＧＶＧＶＰ）ｎ−ＩＧＦＢＰ４のＸｈｏ Ｉ／Ｂａｍ ＨＩ処理断片、または、ＩＧＦＢＰ４（Ｔｈｙ） のＸｈｏ Ｉ／Ｂａｍ ＨＩ処理断片と、ｐＥＴ１４ｂベクターのＸｈｏ Ｉ／Ｂａｍ ＨＩ処理断片とをライゲーションすることにより、６−Ｈｉｓタグのついた、（ＧＶＧＶＰ）_１２−ＩＧＦＢＰ４、（ＧＶＧＶＰ）_２３−ＩＧＦＢＰ４、（ＧＶＧＶＰ）_４５−ＩＧＦＢＰ４、（ＧＶＧＶＰ）_６７−ＩＧＦＢＰ４、または、ＩＧＦＢＰ４（Ｔｈｙ）を発現する組換えプラスミドを構築した。

【0056】

＜組換えタンパク質の発現および精製＞
組換えタンパク質は、Ｅ． ｃｏｌｉ ＫＲＸ細胞（プロメガ社製）を用いて発現させた。Ｅ ｃｏｌｉ内での凝集、不溶化を防止する為に、タンパク質の発現は、相転移温度以下である２０℃で行った。発現させたタンパク質は、ＣＯＳＭＯＧＥＬ Ｈｉｓ Ａｃｃｅｐｔ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（ナカライテスク社製）を用いて精製した。タンパク質は、リン酸バッファー（ＰＢＳ）に溶解した。

【0057】

＜精製した（ＧＶＧＶＰ）ｎタンパク質のＴｇ（ｔ）と、温度依存性凝集プロファイルの決定＞
（ＧＶＧＶＰ）ｎタンパク質が、疎水性が温度依存的に変化するという挙動を示すタンパク質であるため、Ｔｇ（ｔ）を超えた温度における凝集挙動を調べた。Ｔｇ（ｔ）はＧＶＧＶＰリピートの繰り返し数に依存する。（ＧＶＧＶＰ）_１２、（ＧＶＧＶＰ）_２３、（ＧＶＧＶＰ）_４５、（ＧＶＧＶＰ）_６７のＴｇを濁度アッセイ（ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ ａｓｓａｙ）により決定した。Ｔｇ（ｔ）値の決定に用いられる、凝集の温度プロファイルは、島津社製の分光光度計を用いて測定した。波長は、３５０ｎｍに固定した。それぞれのタンパク質（１ｍｇ／ｍＬ）の濁度は、１５℃〜６０℃の間で、１℃／ｍｉｎで温度を上昇または下降させながら測定した。Ｔｇ（ｔ）値は、５０％の濁度が測定された温度として定義した。

【0058】

＜（ＧＶＧＶＰ）ｎ−ＩＧＦＢＰ４、ＩＧＦＢＰ４（Ｔｈｙ）のポリスチレンディッシュ上への固定化と、ＥＬＩＳＡを用いた組換えタンパク質の吸着安定性の評価＞
（ＧＶＧＶＰ）ｎ−ＩＧＦＢＰ４およびＩＧＦＢＰ４（Ｔｈｙ）溶液（０〜５０μｇ／ｍＬ）をポリスチレンディッシュ上でＴｇ（ｔ）より高い温度、３７℃、４℃のそれぞれの温度のもとで３時間インキュベートした。各タンパク質の最適濃度および吸着安定性を評価するために、抗ＩＧＦＢＰ４抗体（ミリポア社製）を用いたＥＬＩＳＡアッセイを行った。インキュベーション後、ディッシュを１％牛血清アルブミン含有ＰＢＳで１時間ブロックし、ラビットポリクローナル抗ＩＧＦＢＰ４抗体（１：２００００希釈）で２時間、室温でインキュベーションした。ＵＬＴＲＡ−ＳＥＮＳＩＴＩＶＥ ＴＭＢ ＬＩＱＵＩＤ ＨＯＲＳＥＲＡＤＩＳＨ ＳＵＢＳＴＲＡＴＥ ＳＹＳＴＥＭ（ミリポア社製）を用いて検出を行った。マイクロプレートリーダー（ＧＥヘルスケア社製）により４５０ｎｍの吸収を測定した。

【0059】

＜細胞培養＞
Ｐ１９ＣＬ６細胞を１０％の牛血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含有するＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ （ＤＭＥＭ）上で、３７℃、９５％空気／５％ ＣＯ_２下、培養した。ＥＳ細胞を未分化で維持するため、ＥＳ細胞（１ｘ１０^６細胞／３５ｍｍディッシュ）をフィーダー層上で培養した。フィーダー層は、ＣＯＭＰＬＥＴＥ ＥＳ ＣＥＬＬ ＭＥＤＩＡ Ｗ／１５％ ウシ血清、ＬＩＦを培地としたマウス胎仔繊維芽細胞により形成した。

【0060】

＜ＥＳ細胞の心筋細胞への分化＞
（ＧＶＧＶＰ）ｎ−ＩＧＦＢＰ４固定化ディッシュ上での、初期および後期におけるＥＳ細胞の心筋細胞分化を調べた。初期は、ＥＳ細胞（１ｘ１０^５細胞／３５ｍｍディッシュ）を、（ＧＶＧＶＰ）ｎ−ＩＧＦＢＰ４固定化ディッシュ、または、０．１％ゼラチンコートディッシュ上で培養した。後期は、胚様体（ＥＢ、ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ）形成後（懸滴標本検査法、５日間）、胚様体を、（ＧＶＧＶＰ）ｎ−ＩＧＦＢＰ４固定化ディッシュ、または、０．１％ゼラチンコートディッシュ上で、培養した。２０％ＦＢＳ、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ ＭＥＭ非必須アミノ酸（ギブコ社製）および０．０５ｍＭ ２−メルカプトエタノール（シグマ社製）を含有するＩｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ （ＩＭＤＭ、ギブコ社製）を、ＥＳ細胞の心筋細胞分化用培地として使用した。

【0061】

＜免疫沈降およびウェスタンブロット＞
Ｐ１９ＣＬ６細胞を、（ＧＶＧＶＰ）ｎ−ＩＧＦＢＰ４上で３時間培養した後、細胞をｌｙｓｉｓバッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１％ デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００およびプロテアーゼインヒビターカクテル（ナカライテスク社製））を用いて破砕した。破砕液を４℃、２００００×ｇで３０分間遠心した。上清を取り出し、ＰｕｒｅＰｒｏｔｅｏｍｅ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ 磁気ビーズ（ミリポア社製）とインキュベートし、抗ＬＲＰ５／６抗体（Ａｃｒｉｓ ａｎｔｉｂｏｄｙ ＧｍｂＨ製）に結合させた。インキュベーション後、ビーズに結合したタンパク質を５〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥグラジエントゲル（ＤＲＣ ＣＯ．Ｌｔｄ製）により分離した。分離したタンパク質をＰＶＤＦメンブレンにトランスファーした。メンブレンをラビットポリクローナル抗ＩＧＦＢＰ４抗体（１：１００００希釈）でインキュベーションし、その後、ＨＲＰ結合抗ラビットＩｇＧ抗体（ジャクソンイムノリサーチラボラトリー社製）でインキュベーションした。メンブレンに、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔｓ（ミリポア社製）を使用して、検出を行った。

【0062】

＜ＲＴ−ＰＣＲ＞
全ＲＮＡ抽出を、Ｔｒｉｐｕｒｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ロシュダイアグノスティクス社製）を用いて行った。Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ （ロシュ社製）を用いて、ｃＤＮＡ合成を行った。ＲＴ―ＰＣＲは、以下のタンパク質検出用プライマーを用いて行った。マウスβアクチン、マウスＧＡＴＡ ４、マウス αミオシン重鎖（αＭＨＣ）、マウスＥ−カドヘリン、マウス Ｎ−カドヘリン、マウスＯｃｔ−３、マウス Ｓｏｘ１、マウス Ｓｏｘ１７、マウス ＢｒａｃｈｙｕｒｙＴ、マウス Ｗｎｔ３ａ、マウスＩＧＦＢＰ４、マウスＦｒｉｚｚｌｅｄ８。ＰＣＲは、Ｅｘ−Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を使用して行った。

【0063】

＜免役染色および共焦点顕微鏡＞
細胞を２４×２４ｍｍ カバーグラス上で培養した。細胞を４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳで１５分間固定し、５０ｍＭ グリシン−ＰＢＳで洗浄し、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００／ＰＢＳで５分間透過処理を行って、１％ ＢＳＡ／ＰＢＳで１時間ブロッキングをした。固定化および透過処理後、細胞を室温で１時間、抗ヒトαＭＨＣモノクローナル抗体（ＭＦ２０、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製。１：１００希釈。）、または、抗ＩＧＦＢＰ４抗体（１：１００希釈）を用いて、インキュベーションした。細胞をＰＢＳで洗浄し、ＦＩＴＣ結合第２抗体またはＣｙ３結合第２抗体（ジャクソンイムノリサーチラボラトリー社製）を用いて室温で１時間インキュベーションした。細胞核を０．１μｇ／ｍＬ ＤＡＰＩで染色した。細胞は全て、共焦点顕微鏡（Ａ１／Ａ１Ｒシステム。ニコン社製）を使用して観察した。蛍光イメージは、ＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ニコン社製）を用いて処理した。ＭＦ２０陽性領域の割合は、それぞれのサンプルのランダムな２０箇所におけるＭＦ２０染色領域／ＤＡＰＩ染色領域の割合の平均から求めた。

【0064】

＜統計分析＞
細胞実験は３回行い、結果は、平均±標準偏差で示した。

【0065】

［実験結果］
＜（ＧＶＧＶＰ）ｎ−ＩＧＦＢＰ４のＴｇ（ｔ）および温度依存的凝集プロファイルの決定＞
ＩＧＦＢＰ４（Ｔｈｙ）、（ＧＶＧＶＰ）_１２−ＩＧＦＢＰ４、（ＧＶＧＶＰ）_２３−ＩＧＦＢＰ４、（ＧＶＧＶＰ）_４５−ＩＧＦＢＰ４、（ＧＶＧＶＰ）_６７−ＩＧＦＢＰ４、（ＧＶＧＶＰ）_４５、（ＧＶＧＶＰ）_６７の産生を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットにて確認した（図１ Ａ）。
（ＧＶＧＶＰ）ｎ−ＩＧＦＢＰ４のＴｇ（ｔ）を決定するために、濁度アッセイを行って、（ＧＶＧＶＰ）_１２、（ＧＶＧＶＰ）_２３、（ＧＶＧＶＰ）_４５、（ＧＶＧＶＰ）_６７、の凝集の温度依存的態様を調べた。（ＧＶＧＶＰ）_４５、（ＧＶＧＶＰ）_６７の温度依存的凝集は、５０℃以上で観察されたが、（ＧＶＧＶＰ）_１２、（ＧＶＧＶＰ）_２３はそうではなかった（図１ Ｂ）。ＧＶＧＶＰの２３回繰り返しでは凝集を引き起こすのに短すぎるものと考えられる。（ＧＶＧＶＰ）_４５、（ＧＶＧＶＰ）_６７の温度プロファイルから、（ＧＶＧＶＰ）_４５、（ＧＶＧＶＰ）_６７のＴｇはそれぞれ３２℃、４２℃であると算出した。

【0066】

＜ＩＧＦＢＰ４（Ｔｈｙ）、（ＧＶＧＶＰ）_１２−ＩＧＦＢＰ４、（ＧＶＧＶＰ）_２３−ＩＧＦＢＰ４、（ＧＶＧＶＰ）_４５−ＩＧＦＢＰ４、（ＧＶＧＶＰ）_６７−ＩＧＦＢＰ４のポリスチレンディッシュに対する吸着安定性＞
ＩＧＦＢＰ４（Ｔｈｙ）、（ＧＶＧＶＰ）_１２−ＩＧＦＢＰ４、（ＧＶＧＶＰ）_２３−ＩＧＦＢＰ４、（ＧＶＧＶＰ）_４５−ＩＧＦＢＰ４、（ＧＶＧＶＰ）_６７−ＩＧＦＢＰ４のポリスチレンディッシュに対する吸着安定性を調べるために、それぞれのタンパク質でコートされたディッシュを１日または１週間、４℃または３７℃でインキュベートした。吸着タンパク質量はＥＬＩＳＡにより測定した。（ＧＶＧＶＰ）_６７−ＩＧＦＢＰ４の吸着量が最も多かった。１日インキュベート後において、（ＧＶＧＶＰ）_１２−、（ＧＶＧＶＰ）_２３−、（ＧＶＧＶＰ）_４５−ＩＧＦＢＰ４は、ＩＧＦＢＰ４（Ｔｈｙ）と同等であった（図２ Ａ）。これら全てのタンパク質は、４℃および３７℃の双方で、１０μｇ／ｍＬを超えると吸着が飽和した（図１ ＡおよびＢ）。（ＧＶＧＶＰ）_６７−ＩＧＦＢＰ４、（ＧＶＧＶＰ）_４５−ＩＧＦＢＰ４の、Ｔｇより低い温度、４℃での吸着量が小さいこと、および、３７℃において、（ＧＶＧＶＰ）_６７−ＩＧＦＢＰ４の吸着量が（ＧＶＧＶＰ）_４５−ＩＧＦＢＰ４よりも少ないことが明らかになった（図２ Ａ）。ＩＧＦＢＰ４（Ｔｈｙ）単独では１週間にわたる安定的な吸着は起きないことがわかった。一方、（ＧＶＧＶＰ）_６７−ＩＧＦＢＰ４は、３７℃において１週間ディッシュに安定的に吸着した（図２ ＢおよびＣ）。上記結果より、ＩＧＦＢＰ４（Ｔｈｙ）は、（ＧＶＧＶＰ）_６７を介して安定してポリスチレンディッシュ上に固定化できることがわかった。

【0067】

＜ＩＧＦＢＰ４（Ｔｈｙ）、（ＧＶＧＶＰ）_１２−ＩＧＦＢＰ４、（ＧＶＧＶＰ）_２３−ＩＧＦＢＰ４、（ＧＶＧＶＰ）_４５−ＩＧＦＢＰ４、または、（ＧＶＧＶＰ）_６７−ＩＧＦＢＰ４と、ＬＲＰ５／６との相互作用＞
ＩＧＦＢＰ４（Ｔｈｙ）、（ＧＶＧＶＰ）_１２−ＩＧＦＢＰ４、（ＧＶＧＶＰ）_２３−ＩＧＦＢＰ４、（ＧＶＧＶＰ）_４５−ＩＧＦＢＰ４、 （ＧＶＧＶＰ）_６７−ＩＧＦＢＰ４がＷｎｔ受容体であるＬＲＰ５／６と結合するかどうかを調べる為、抗ＬＲＰ５／６抗体を用いた免疫沈降を行った。免疫沈降は、１０μｇ／ｍＬのＩＧＦＢＰ４（Ｔｈｙ）、（ＧＶＧＶＰ）_１２−ＩＧＦＢＰ４、（ＧＶＧＶＰ）_２３−ＩＧＦＢＰ４、（ＧＶＧＶＰ）_４５−ＩＧＦＢＰ４、または、（ＧＶＧＶＰ）_６７−ＩＧＦＢＰ４でコートされたディッシュ上で培養されたＰ１９ＣＬ６細胞を用いて行った。Ｐ１９ＣＬ６細胞は、Ｗｎｔ受容体であるＬＲＰ５／６およびＦｒｉｚｚｌｅｄ ８を発現しており、これらの受容体はＩＧＦＢＰ４に結合しうることが報告されている（文献４）。Ｐ１９ＣＬ６細胞が、（ＧＶＧＶＰ）ｎ−ＩＧＦＢＰ４コートされたディッシュに、ＩＧＦＢＰ４とＷｎｔ受容体との相互作用を通じて吸着するかどうかを調べた。Ｐ１９ＣＬ６細胞は、これらのタンパク質でコートされたディッシュに吸着したが、ＩＧＦＢＰ４（Ｔｈｙ）ドメインが無い（ＧＶＧＶＰ）_６７単独でコートされたディッシュには吸着しなかった（データ無し）。これらディッシュ上で培養されたＰ１９Ｃｌ６細胞において、抗ＬＲＰ５／６抗体結合ビーズと共に沈降した（ＧＶＧＶＰ）_{１２，２３，４５，６７}−ＩＧＦＢＰ４、ＩＧＦＢＰ４（Ｔｈｙ）は、抗ＩＧＦＢＰ４抗体を用いたウェスタンブロットで検出した（図３）。これらの結果により、Ｐ１９ＣＬ６細胞は、ＩＧＦＢＰ４（Ｔｈｙ）とＷｎｔ受容体との相互作用を通じて、（ＧＶＧＶＰ）ｎ−ＩＧＦＢＰ４コートされたディッシュに吸着すると考えられることが明らかになった。

【0068】

＜マウスＥＳ細胞を（ＧＶＧＶＰ）_６７−ＩＧＦＢＰ４コートされたディッシュ上で培養することによる、心筋細胞への分化＞
（ＧＶＧＶＰ）_６７−ＩＧＦＢＰ４コートされたディッシュを使用したマウスＥＳ細胞の心筋細胞への分化を調べるため、マウスＥＳ細胞を、０．１％ゼラチンコートディッシュ（コントロール）、１０μｇ／ｍＬ （ＧＶＧＶＰ）_６７−ＩＧＦＢＰ４コートされたディッシュ、１μｇ／ｍＬ ＩＧＦＢＰ４（Ｔｈｙ）コートされたディッシュ、または、１μｇ／ｍＬ （ＧＶＧＶＰ）_６７−ＩＧＦＢＰ４が可溶性因子として添加されたゼラチンコートディッシュを用いて、２４日間培養した。培地は、１日おきに交換した。マウスＥＳ細胞は、全ての条件において同様に吸着、増殖した（図４ Ａ）。心臓系の遺伝子発現を、ＧＡＴＡ４およびαＭＨＣのＲＴ−ＰＣＲにより調べた。（ＧＶＧＶＰ）_６７−ＩＧＦＢＰ４コートされたディッシュ上で培養したマウスＥＳ細胞では、２４日培養後のＧＡＴＡ４およびαＭＨＣの発現量が多かった（図４ Ｂ）。また、抗αＭＨＣ抗体（ＭＦ２０）による免疫染色で陽性となった（図４ Ｃ）。ＭＦ２０陽性領域の、ＤＡＰＩ陽性領域に対する割合は、コントロール、ＩＧＦＢＰ４（Ｔｈｙ）添加、（ＧＶＧＶＰ）_６７−ＩＧＦＢＰ４添加、（ＧＶＧＶＰ）_６７−ＩＧＦＢＰ４固定化、の順で、それぞれ５％、７％、７％、１８％であった（図４ Ｃ）。これらの結果から、（ＧＶＧＶＰ）_６７−ＩＧＦＢＰ４の固定化は、マウスＥＳ細胞の心筋細胞への分化を促進することが明らかになった。

【0069】

＜胚様体形成後の後期段階における、（ＧＶＧＶＰ）_６７−ＩＧＦＢＰ４コートされたディッシュ上で培養したマウスＥＳ細胞の心筋細胞への分化＞
ＩＧＦＢＰ４は、胚様体形成後の後期段階におけるマウスＥＳ細胞の心筋細胞への分化を促進することが報告されている（文献４）。胚様体を形成したマウスＥＳ細胞の心筋細胞への分化が、（ＧＶＧＶＰ）_６７−ＩＧＦＢＰ４固定化ディッシュにより促進されるかを調べた。懸滴標本検査法における胚様体形成過程のＥＳ細胞の遺伝子発現プロファイルをＲＴ−ＰＣＲにより調べた。３日目の懸滴培地において、胚様体が形成された。胚様体は、Ｎ−カドヘリン、Ｓｏｘ１７、ＢｒａｃｈｙｕｒｙＴ、ＧＡＴＡ４、Ｗｎｔ３ａ、およびＩＧＦＢＰ４を発現した（図５）。この結果より、ＥＳ細胞は、懸滴培地において、胚様体の形成を通して、内胚葉系中胚葉の細胞に分化することが明らかになった。また、５日目の培地において、ＩＧＦＢＰ４が強く発現していた一方、Ｗｎｔ３ａの発現は弱まっていた（図５ Ｂ）。これは、５日目において、心臓発生が開始したことを示唆している。そこで、懸滴培養法５日後において、胚様体を、１０μｇ／ｍＬ （ＧＶＧＶＰ） _６７−ＩＧＦＢＰ４固定化ディッシュまたは、０．１％ゼラチンコートディッシュ（コントロール）上で培養した。１μｇ／ｍＬ ＩＧＦＢＰ４（Ｔｈｙ）、１０μｇ／ｍＬ （ＧＶＧＶＰ）_６７−ＩＧＦＢＰ４を、溶解性因子として、ゼラチンコートディッシュに２０日間添加した（図６ Ａ）。培地は一日おきに交換した。ＧＡＴＡ４、αＭＨＣの遺伝子発現をＲＴ−ＰＣＲを用いて確認した。（ＧＶＧＶＰ） _６７−ＩＧＦＢＰ４上で２０日間培養した胚様体で、ＧＡＴＡ４およびαＭＨＣの双方の高い発現が見られた（図６ Ｃ）。２０日後において、心筋分化したＥＳ細胞の自律拍動が見られた。（ＧＶＧＶＰ） _６７−ＩＧＦＢＰ４上で培養した胚様体の拍動領域を図６Ｂに示す。ＭＦ２０を用いた免疫染色において、ＤＡＰＩ陽性領域に対するＭＦ２０陽性領域の割合は、コントロール、ＩＧＦＢＰ４（Ｔｈｙ）添加、（ＧＶＧＶＰ） _６７−ＩＧＦＢＰ４添加、（ＧＶＧＶＰ） _６７−ＩＧＦＢＰ４固定化ディッシュの順で、それぞれ約３０％、４０％、４０％、６５％であった。図７は、（ＧＶＧＶＰ） _６７−ＩＧＦＢＰ４固定化ディッシュ上で培養したＥＳ細胞のＭＦ２０陽性領域の共焦点顕微鏡による観察結果を示す。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]