特許 6110846 Ｃ型肝炎ウイルス阻害剤としての重水素が導入されたトリペプチド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6110846

(24)【登録日】2017年3月17日

(45)【発行日】2017年4月5日

(54)【発明の名称】Ｃ型肝炎ウイルス阻害剤としての重水素が導入されたトリペプチド

(51)【国際特許分類】

   C07D 401/12 20060101AFI20170327BHJP

   A61K 31/4725 20060101ALI20170327BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20170327BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20170327BHJP

   A61K 38/21 20060101ALI20170327BHJP

   A61K 31/7056 20060101ALI20170327BHJP

   A61K 38/00 20060101ALI20170327BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20170327BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20170327BHJP

   A61K 31/4745 20060101ALI20170327BHJP

   A61K 31/13 20060101ALI20170327BHJP

【ＦＩ】

   C07D401/12CSP

   A61K31/4725

   A61P31/14

   A61K45/00

   A61K37/66 G

   A61K31/7056

   A61K37/02

   A61K31/713

   A61K31/7105

   A61K31/4745

   A61K31/13

【請求項の数】16

【全頁数】31

(21)【出願番号】特願2014-512961(P2014-512961)

(86)(22)【出願日】2012年5月23日

(65)【公表番号】特表2014-515377(P2014-515377A)

(43)【公表日】2014年6月30日

(86)【国際出願番号】US2012039090

(87)【国際公開番号】WO2012166459

(87)【国際公開日】20121206

【審査請求日】2015年4月30日

(31)【優先権主張番号】61/490,665

(32)【優先日】2011年5月27日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】391015708

【氏名又は名称】ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニー

【氏名又は名称原語表記】ＢＲＩＳＴＯＬ−ＭＹＥＲＳ ＳＱＵＩＢＢ ＣＯＭＰＡＮＹ

(74)【代理人】

【識別番号】100100158

【弁理士】

【氏名又は名称】鮫島 睦

(74)【代理人】

【識別番号】100126778

【弁理士】

【氏名又は名称】品川 永敏

(74)【代理人】

【識別番号】100162684

【弁理士】

【氏名又は名称】呉 英燦

(72)【発明者】

【氏名】リ−チアン・スン

(72)【発明者】

【氏名】ポール・マイケル・スコラ

【審査官】 早川 裕之

(56)【参考文献】

【文献】 特表平０８−５０１２７５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００５−５３３０２８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１１−５０７８６９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１１−５０９２４２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１１−５１３３０９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１１−５１３３０７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１１／０３８２８３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００９／１２９１０９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Analytical Chemistry，２０１１年，８３，６２３７−６２４４

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｄ ４０１／１２

Ａ６１Ｋ ３１／１３〜７１３

Ａ６１Ｋ ４５／００

Ａ６１Ｐ ３１／１４

Ａ６１Ｋ ３７／０２〜６６

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

式(I):

【化1】

（式中、
R¹は重水素であり、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹、およびR¹⁰は、独立して、水素または重水素から選択される）
の化合物またはその医薬的に許容される塩。

【請求項2】

各R²が重水素である、請求項１に記載の化合物。

【請求項3】

各R³が重水素である、請求項２に記載の化合物。

【請求項4】

式:

【化2】

から選択される化合物またはその医薬的に許容される塩。

【請求項5】

請求項１に記載の化合物もしくはその医薬的に許容される塩、および医薬的に許容される担体を含有する組成物。

【請求項6】

抗HCV活性を有する少なくとも1つのさらなる化合物をさらに含有する、請求項５に記載の組成物。

【請求項7】

該さらなる化合物のうちの少なくとも1つがインターフェロンまたはリバビリンである、請求項６に記載の組成物。

【請求項8】

該インターフェロンが、インターフェロンα2B、ペグインターフェロンα、コンセンサスインターフェロン、インターフェロンα2A、またはリンパ芽球様インターフェロンタウから選択される請求項７に記載の組成物。

【請求項9】

該さらなる化合物のうちの少なくとも1つが、インターロイキン2、インターロイキン6、インターロイキン12、1型ヘルパーT細胞応答の発生を増強する化合物、干渉RNA、アンチセンスRNA、イミキモド、リバビリン、イノシン5'-一リン酸脱水素酵素阻害剤、アマンタジン、またはリマンタジンから選択される、請求項６に記載の組成物。

【請求項10】

該さらなる化合物のうちの少なくとも1つが、HCV感染症の処置のために、HCVメタロプロテアーゼ、HCVセリンプロテアーゼ、HCVポリメラーゼ、HCVヘリカーゼ、HCV NS4Bタンパク質、HCVエントリー、HCVアセンブリ、HCVイグレス、HCV NS5Aタンパク質、またはIMPDHから選択される標的の機能を阻害するのに有効である、請求項６に記載の組成物。

【請求項11】

治療上有効な量の請求項１に記載の化合物またはその医薬的に許容される塩を含有する、HCV感染症の治療剤。

【請求項12】

請求項１に記載の化合物またはその医薬的に許容される塩より前、後、または同時に、抗HCV活性を有する少なくとも1つのさらなる化合物を投与することを特徴とする、請求項１１に記載の治療剤。

【請求項13】

該さらなる化合物のうちの少なくとも1つがインターフェロンまたはリバビリンである、請求項１２に記載の治療剤。

【請求項14】

該インターフェロンがインターフェロンα2B、ペグインターフェロンα、コンセンサスインターフェロン、インターフェロンα2A、またはリンパ芽球様インターフェロンタウから選択される、請求項１３に記載の治療剤。

【請求項15】

該さらなる化合物のうちの少なくとも1つがインターロイキン2、インターロイキン6、インターロイキン12、1型ヘルパーT細胞応答の発生を増強する化合物、干渉RNA、アンチセンスRNA、イミキモド、リバビリン、イノシン5'-一リン酸脱水素酵素阻害剤、アマンタジン、またはリマンタジンから選択される、請求項１２に記載の治療剤。

【請求項16】

該さらなる化合物のうちの少なくとも1つが、HCV感染症の処置のために、HCVメタロプロテアーゼ、HCVセリンプロテアーゼ、HCVポリメラーゼ、HCVヘリカーゼ、HCV NS4Bタンパク質、HCVエントリー、HCVアセンブリ、HCVイグレス、HCV NS5Aタンパク質、またはIMPDHから選択される標的の機能を阻害するのに有効である、請求項１２に記載の治療剤。

【発明の詳細な説明】

【関連出願】

【0001】

（関連出願の相互参照）
本出願は、2011年5月27日に出願された米国仮特許出願第61/490,665号の利益を主張する。

【技術分野】

【0002】

本発明は、重水素化されたN-(tert-ブトキシカルボニル)-3-メチル-L-バリル-(4R)-N-((1R,2S)-1{[(シクロプロピルスルホニル)アミノ]カルボニル}-2-ビニルシクロプロピル)-4-[(4-メトキシ-7-クロロイソキノリン-1-イル)オキシ]-L-プロリンアミド化合物、その医薬組成物、その製造方法、および使用方法に関する。該化合物は、NS3プロテアーゼ(本明細書において「セリンプロテアーゼ」とも称される)を阻害する能力を有しており、C型肝炎ウイルスの処置において有用である。

【背景技術】

【0003】

HCVは主要なヒト病原体であり、世界中で推定1億7千万人が感染しており-これはヒト免疫不全ウイルス1型による感染数のおよそ５倍である。これらHCV感染者のかなりの割合が、肝硬変および肝細胞癌を含む重篤な進行性肝疾患を発症する。

【0004】

現在、最も有効なHCVの治療法は、α-インターフェロンとリバビリンの組み合わせを用いており、40％の患者において持続的効果をもたらしている。最近の臨床結果は、ペグα-インターフェロンが単独療法としては未修飾のα-インターフェロンよりも優れていることを示す。しかしながら、ペグα-インターフェロンとリバビリンの組み合わせを含む実験的な治療レジメンでも、かなりの割合の患者において、ウイルス量の持続的な減少が認められない。従って、HCV感染症の有効な治療法の開発が明確にかつ非常に必要とされている。

【0005】

HCVはプラス鎖RNAウイルスである。5'非翻訳領域における推定アミノ酸配列および広範な類似性の比較に基づいて、HCVはフラビウイルス科の独立した属として分類されている。フラビウイルス科の全てのメンバーは、単一の連続したオープンリーディングフレームの翻訳を介して全ての公知のウイルス-特異的タンパク質をコードするプラス鎖RNAゲノムを含有するエンベロープに包まれたビリオンを有する。

【0006】

HCVゲノム全体にわたって、ヌクレオチドおよびコードされたアミノ酸配列内に、かなりの多様性が見いだされる。６つの主要な遺伝子型がキャラクタライズされており、50を超えるサブタイプが記載されている。HCVの主要な遺伝子型は世界的な分布において異なっており、病原性および治療法における遺伝子型の影響の可能性についての多くの研究にもかかわらず、HCVの遺伝的多様性の臨床的意義は依然として捉えにくい。

【0007】

一本鎖HCV RNAゲノムは約9500ヌクレオチド長であり、約3000のアミノ酸である単一の大きなポリタンパク質をコードする単一のオープンリーディングフレーム(ORF)を有する。感染細胞において、このポリタンパク質は、細胞プロテアーゼおよびウイルスプロテアーゼにより複数の部位で切断され、構造タンパク質および非構造(NS)タンパク質を生じる。HCVの場合、成熟非構造タンパク質(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、およびNS5B)の生成は、2つのウイルスプロテアーゼによりもたらされる。1つめのものはNS2-NS3接合部を切断し;2つめは、NS3のN-末端領域内に含まれるセリンプロテアーゼであり、NS3の下流、すなわちNS3-NS4A切断部位においてシスで、残りのNS4A-NS4B、NS4B-NS5A、NS5A-NS5B部位についてトランスでの両方における以降の切断の全てを仲介する。該NS4Aタンパク質は複数の機能を果たすと思われ、NS3プロテアーゼの補助因子として作用し、NS3および他のウイルスのレプリカーゼ成分の膜局在をおそらく補助している。NS3タンパク質とNS4Aとの複合体形成は、効率的なポリタンパク質プロセシング、全ての部位におけるタンパク分解性切断の増強に必要であると思われる。該NS3タンパク質はまた、ヌクレオシドトリホスファターゼおよびRNAヘリカーゼ活性を示す。NS5Bは、HCVの複製に関与するRNA-依存性RNAポリメラーゼである。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明は、NS3プロテアーゼが、例えばNS4Aプロテアーゼと合わさって、機能するのを阻害することができるペプチド化合物を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0009】

第1の態様において、本発明は、式(I):

【化1】

（式中、
R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹、およびR¹⁰は、独立して、水素または重水素から選択されるが;ただし、少なくとも1つは水素以外である）
の化合物またはその医薬的に許容される塩を提供する。

【0010】

第1の態様の第1の実施態様において、本発明は、各R¹が重水素である、式(I)の化合物またはその医薬的に許容される塩を提供する。第1の態様の第2の実施態様において、各R²は重水素である。第1の態様の第3の実施態様において、各R³は重水素である。

【0011】

第1の態様の第4の実施態様において、本発明は、各R⁴が重水素である、式(I)の化合物またはその医薬的に許容される塩を提供する。

【0012】

第1の態様の第5の実施態様において、本発明は、R⁵が重水素である、式(I)の化合物またはその医薬的に許容される塩を提供する。

【0013】

第1の態様の第6の実施態様において、本発明は、各R⁶が重水素である、式(I)の化合物またはその医薬的に許容される塩を提供する。第7の実施態様において、各R⁷は重水素である。

【0014】

第1の態様の第8の実施態様において、本発明は、各R⁸が重水素である、式(I)の化合物またはその医薬的に許容される塩を提供する。第9の実施態様において、各R⁹は重水素である。第10の実施態様において、各R¹⁰は重水素である。

【0015】

第2の態様において、本発明は、式(I)の化合物もしくはその医薬的に許容される塩、および医薬的に許容される担体を含有する組成物を提供する。第2の態様の第1の実施態様において、該組成物は、抗HCV活性を有する少なくとも1つのさらなる化合物をさらに含有する。第2の態様の第2の実施態様において、該さらなる化合物のうちの少なくとも1つは、インターフェロンまたはリバビリンである。第2の態様の第3の実施態様において、該インターフェロンは、インターフェロンα2B、ペグインターフェロンα、コンセンサスインターフェロン、インターフェロンα2A、またはリンパ芽球様インターフェロンタウから選択される。

【0016】

第2の態様の第4の実施態様において、本発明は、式(I)の化合物もしくはその医薬的に許容される塩、医薬的に許容される担体、および抗HCV活性を有する少なくとも1つのさらなる化合物を含有する組成物を提供し、ここで、該さらなる化合物のうちの少なくとも1つは、インターロイキン2、インターロイキン6、インターロイキン12、1型ヘルパーT細胞応答の発生を増強する化合物、干渉RNA、アンチセンスRNA、イミキモド（Imiqimod）、リバビリン、イノシン5'-一リン酸脱水素酵素阻害剤、アマンタジン、またはリマンタジンから選択される。

【0017】

第2の態様の第5の実施態様において、本発明は、式(I)の化合物もしくはその医薬的に許容される塩、医薬的に許容される担体、および抗HCV活性を有する少なくとも1つのさらなる化合物を含有する組成物を提供し、ここで、該さらなる化合物のうちの少なくとも1つは、HCV感染症の処置のために、HCVメタロプロテアーゼ、HCVセリンプロテアーゼ、HCVポリメラーゼ、HCVヘリカーゼ、HCV NS4Bタンパク質、HCVエントリー、HCVアセンブリ、HCVイグレス、HCV NS5Aタンパク質、またはIMPDHから選択される標的の機能を阻害するのに有効である。

【0018】

第3の態様において、本発明は、式(I)の化合物もしくはその医薬的に許容される塩、抗HCV活性を有する1、2、3、4、もしくは5つのさらなる化合物、および医薬的に許容される担体を含有する組成物を提供する。第3の態様の第1の実施態様において、該組成物は、抗HCV活性を有する3または4つのさらなる化合物を含有する。第3の態様の第2の実施態様において、該組成物は、抗HCV活性を有する1または2つのさらなる化合物を含有する。

【0019】

第4の態様において、本発明は、治療上有効な量の式(I)の化合物またはその医薬的に許容される塩を患者に投与することを含む、患者においてHCV感染症を処置する方法を提供する。第4の態様の第1の実施態様において、該方法は、抗HCV活性を有する少なくとも1つのさらなる化合物を、式(I)の化合物またはその医薬的に許容される塩より前、後、または同時に投与することをさらに含む。第4の態様の第2の実施態様において、該さらなる化合物のうちの少なくとも1つはインターフェロンまたはリバビリンである。第4の態様の第3の実施態様において、該インターフェロンは、インターフェロンα2B、ペグインターフェロンα、コンセンサスインターフェロン、インターフェロンα2A、またはリンパ芽球様インターフェロンタウから選択される。

【0020】

第4の態様の第4の実施態様において、本発明は、式(I)の化合物またはその医薬的に許容される塩より前、後、または同時に、治療上有効な量の式(I)の化合物またはその医薬的に許容される塩と、抗HCV活性を有する少なくとも１つのさらなる化合物を患者に投与することを含む、患者においてHCV感染症を処置する方法を提供し、ここで、該さらなる化合物のうちの少なくとも1つは、インターロイキン2、インターロイキン6、インターロイキン12、1型ヘルパーT細胞応答の発生を増強する化合物、干渉RNA、アンチセンスRNA、イミキモド、リバビリン、イノシン5'-一リン酸脱水素酵素阻害剤、アマンタジン、またはリマンタジンから選択される。

【0021】

第4の態様の第5の実施態様において、本発明は、式(I)の化合物またはその医薬的に許容される塩より前、後、または同時に、治療上有効な量の式(I)の化合物またはその医薬的に許容される塩と、抗HCV活性を有する少なくとも１つのさらなる化合物を患者に投与することを含む、患者においてHCV感染症を処置する方法を提供し、ここで、該さらなる化合物のうちの少なくとも1つは、HCV感染症の処置のために、HCVメタロプロテアーゼ、HCVセリンプロテアーゼ、HCVポリメラーゼ、HCVヘリカーゼ、HCV NS4Bタンパク質、HCVエントリー、HCVアセンブリ、HCVイグレス、HCV NS5Aタンパク質、またはIMPDHから選択される標的の機能を阻害するのに有効である。

【0022】

第5の態様において、本発明は、式(I)の化合物またはその医薬的に許容される塩より前、後、または同時に、治療上有効な量の式(I)の化合物またはその医薬的に許容される塩と、抗HCV活性を有する1、2、3、4、もしくは5つのさらなる化合物を患者に投与することを含む、患者においてHCV感染症を処置する方法を提供する。第5の態様の第1の実施態様において、該方法は、抗HCV活性を有する3または4つのさらなる化合物を投与することを含む。第5の態様の第2の実施態様において、該方法は、抗HCV活性を有する1または2つのさらなる化合物を投与することを含む。

【0023】

本発明の他の態様は、本明細書において開示されている実施態様の適切な組合せを含んでよい。

【0024】

さらに他の態様および実施態様が、本明細書の記載中に見いだされうる。

【0025】

本発明により包含される化合物は、医薬品としての使用に適切に安定なものであることが理解されるべきである。

【0026】

分子中の特定の位置でのいずれの置換基または変数の定義は、該分子中の他の部分におけるその定義から独立していることを意図する。例えば、該3つのR⁴基の各々は、同一でも異なっていてもよい。

【0027】

本明細書に記載の全ての特許、特許出願、および参考文献は、引用によりその全体が本明細書に援用される。一貫性に欠ける場合、本出願の開示（定義を含む）を優先する。

【0028】

本明細書において用いる単数形「a」、「an」および「the」は、他に明確に指示されない限り、複数の言及も含む。

【0029】

式またはスキームにおける重水素の導入は、記号“D”、“d”または“²H”を用いて示されてもよいことが理解される。

【0030】

本発明の化合物は、医薬的に許容される塩として存在し得る。本明細書で用いる用語「医薬的に許容される塩」は、本発明の化合物の塩または双性イオン形態を意味し、それは水もしくは油-溶性もしくは分散性であり、適切な医学的判断の範囲内で、妥当な利益/リスク比に見合って、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わずに患者の組織に接触して用いるのに適していて、それらの使用目的に有効である。該塩は化合物の最終的な単離および精製の間に製造することができるか、あるいは別途、適切な塩基性官能基を適切な酸と反応させることにより製造することができる。代表的な酸付加塩としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、クエン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、硫酸水素塩、酪酸塩、ショウノウ酸塩（camphorate）、カンファースルホン酸塩;ジグルコン酸塩（digluconate）、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、2-ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メシチレンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、ナフチレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、2-ナフタレンスルホン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩（palmoate）、ペクチン酸塩（pectinate）、過硫酸塩、3-フェニルプロプリオン酸塩（phenylproprionate）、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、トリクロロ酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、リン酸塩、グルタミン酸塩、炭酸水素塩、パラ-トルエンスルホン酸塩、およびウンデカン酸塩が挙げられる。医薬的に許容される付加塩の形成に用いることができる酸の例としては、無機酸（例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、およびリン酸）および有機酸（例えばシュウ酸、マレイン酸、コハク酸、およびクエン酸）が挙げられる。

【0031】

塩基付加塩は、酸性基を適切な塩基（例えば、金属カチオンのヒドロキシド、カーボネート、もしくはビカーボネート）と反応させるか、あるいはアンモニア、または有機第一級、第二級、もしくは第三級アミンと反応させることによる、化合物の最終的な単離および精製の間に製造することができる。医薬的に許容される塩のカチオンとしては、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムおよびアルミニウム、ならびに無毒性の第四級アミンカチオン（例えば、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジエチルアミン、エチルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、N,N-ジメチルアニリン、N-メチルピペリジン、N-メチルモルホリン、ジシクロヘキシルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、N,N-ジベンジルフェネチルアミン、およびN,N'-ジベンジルエチレンジアミン）が挙げられる。塩基付加塩の形成に用いることができる他の代表的な有機アミンとしては、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペリジン、およびピペラジンが挙げられる。

【0032】

本明細書で用いる用語「抗HCV活性」は、該化合物がHCVウイルスの処置に有効であることを意味する。

【0033】

該用語「本発明の化合物」および同等の表現は、式(I)の化合物、ならびにその医薬的に許容されるエナンチオマー、ジアステレオマー、および塩を包含することを意味する。同様に、中間体についての言及は、内容的に許される限りそれらの塩を包含することを意味する。

【0034】

該用語「患者」には、ヒトおよび他の哺乳動物の両方が含まれる。

【0035】

該用語「医薬組成物」は、投与様式および剤形の種類によって、少なくとも１つのさらなる医薬担体、すなわち、希釈剤、保存剤、充填剤、流動性調整剤、崩壊剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁化剤、甘味剤、香味剤、着香剤、抗菌剤、抗真菌剤、滑沢剤および予製剤などの、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルと組み合わせて本発明の化合物を含む組成物を意味する。例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 18^th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1999)に記載された成分を用いてもよい。

【0036】

該フレーズ「医薬的に許容される」は本明細書において、適切な医学的判断の範囲内で、妥当なリスク/利益比に見合って、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わずに患者の組織と接触して用いるのに適した、化合物、物質、組成物、および/または剤形を意味するように用いられる。

【0037】

該用語「治療上有効な量」は、有意義な患者利益（例えば、ウイルス量の持続的減少）を示すのに十分である各活性成分の総量を意味する。単独で投与される個々の活性成分に適用する場合、該用語はその成分単独の量を言う。組み合わせに適用する場合、該用語は、組み合わせて、連続して、あるいは同時に投与されるかどうかにかかわらず、治療効果をもたらす活性成分を合わせた量を言う。

【0038】

該用語「処置」および「処置すること」は:(i)疾患、障害、および/または症状に罹りやすいが、まだ罹患していると診断されていない患者において、疾患、障害、または症状の発症を予防すること;(ii)疾患、障害、または症状の抑制、すなわち、その進行を抑止すること;ならびに/あるいは(iii)疾患、障害、または症状を軽減すること、すなわち、疾患、障害、および/または症状の退行をもたらすことを言う。

【0039】

本発明の化合物の命名において用いる場合、本明細書において用いる記号、P1'、P1、P2、P2^*、P3、およびP4は、天然ペプチド切断基質の結合に対する、プロテアーゼ阻害剤結合のアミノ酸残基の相対的位置を表示する。天然基質において切断はP1およびP1'間で生じ、ここで、ノンプライム位置は、ペプチド天然切断部位のC-末端終部から開始してN-末端に伸びているアミノ酸を表し;一方、プライム位置は指定切断部位のN-末端から始まってC-末端に向かって伸びる。例えば、P1'は切断部位のC-末端の右側終部からの第１の位置(すなわち、N-末端第1位置)を示し;一方、P1はC-末端切断部位の左側から番号付けを開始（P2:C-末端からの第2の位置、など)する。[Berger A. & Schechter I., Transactions of the Royal Society London series (1970), B257, 249 264参照].

【0040】

本発明の化合物には不斉中心が存在する。例えば、該化合物は、式:

【化2】

（式中、C₁およびC₂は各々、該シクロプロピル環の位置1および2における不斉炭素原子を示す）で表されるP1シクロプロピル部分を含んでもよい。

【化3】

本発明は、HCVプロテアーゼを阻害する能力を有する、全ての立体化学形態またはその混合物を包含すると理解されるべきである。

【0041】

本発明の特定の化合物はまた、異なる安定した立体構造形態で存在していてよく、それは分離可能でありうる。非対称単結合について制限された回転に起因するねじれ非対称（Torsional asymmetry）、例えば、立体障害または環の歪みにより、異なる配座異性体の分離が可能になりうる。本発明は、これら化合物の各配座異性体およびその混合物を含む。

【0042】

本発明の特定の化合物は双性イオン形態で存在していてよく、本発明はこれら化合物の各双性イオン形態およびその混合物を含む。

【0043】

治療で用いるために、治療上有効な量の式(I)の化合物ならびにその医薬的に許容される塩を未加工の化学薬品（raw chemical）として投与することができる場合、活性成分を医薬組成物として存在させることができる。従って、本発明は、治療上有効な量の式(I)の化合物もしくはその医薬的に許容される塩、および１つ以上の医薬的に許容される担体、希釈剤、もしくは賦形剤を含む医薬組成物をさらに提供する。該式(I)の化合物およびその医薬的に許容される塩は上記の通りである。該担体、希釈剤、または賦形剤は、製剤の他の成分に適合し、そのレシピエントに有害でないという意味で許容可能でなくてはならない。本発明の別の態様によると、式(I)の化合物またはその医薬的に許容される塩を、１つ以上の医薬的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と混合することを含む、医薬製剤の製造方法もまた提供する。

【0044】

医薬製剤は、単位用量あたり所定の量の活性成分を含む単位剤形であってもよい。本発明の化合物が1日あたり約0.01から約150ミリグラム/キログラム(「mg/kg」)体重、好ましくは1日あたり約0.05から約100mg/kg体重である投与量濃度が、HCV介在疾患の予防および処置に対する単独療法においては典型的である。通常、本発明の医薬組成物は、1日あたり約1から約5回の投与か、あるいは持続投与され得る。そのような投与は、長期治療もしくは救急治療として用いることができる。担体材料と組み合わせて単一剤形を製造する活性成分の量は、処置する症状、症状の重篤性、投与回数、投与経路、用いた化合物の排出速度、処置期間、ならびに患者の年齢、性別、体重、および状態によって変わり得る。好ましい単位用量製剤は、活性成分の、本明細書において上記した１日量もしくはそれ以下、またはその適当な画分を含むものである。通常、化合物の至適用量よりかなり少ない少用量で治療を開始する。その後、該状況下で最適な効果に達するまで投与量を少しずつ増加させる。概して、いずれの有害または有毒な副作用も伴わずに抗ウイルス効果が通常得られる濃度レベルで、該化合物を投与することが最も望ましい。

【0045】

本発明の組成物が、本発明の化合物と1つ以上のさらなる治療薬および／または予防薬との組み合わせを含む場合、該化合物およびさらなる薬物は両者とも、単独療法レジメンにおいて通常投与される用量より少ないかもしくは同等の用量であり得る。本発明の組成物は、１つ以上のさらなる治療薬または予防薬と、例えば、単層（monolithic）および/または二層/多層錠の形態で共に製剤化されうるか、あるいは該治療薬または予防薬とは別個に投与されうる。

【0046】

医薬製剤は、いずれの適当な経路、例えば、経口(頬側または舌下を含む)、直腸、経鼻、局所的(頬側、舌下、または経皮を含む)、膣、または非経口(皮下、皮内、筋肉内、関節内、滑液嚢内（intrasynovial）、胸骨内、髄腔内、病巣内、静脈内、または皮内注射もしくは注入を含む)経路による投与に適応しうる。そのような製剤は、薬学の分野において公知のいずれの方法よっても（例えば、活性成分と担体もしくは賦形剤を会合させることにより）、製造されうる。

【0047】

経口投与に適応した医薬製剤は、カプセル剤もしくは錠剤;粉末剤もしくは顆粒剤;水性もしくは非水性液体中の液剤もしくは懸濁剤;食用フォーム剤もしくはホイップ剤;または水中油液体エマルジョン剤もしくは油中水エマルジョン剤といった、別々のユニットであってよい。

【0048】

例えば、経口投与用に、錠剤またはカプセル剤の形態において、活性薬物成分を、経口で無毒の医薬的に許容される不活性担体（例えばエタノール、グリセロール、水など）と合わせることができる。粉末剤は、化合物を適切な微粒子サイズに細かく粉末化し、同様に粉末化された食用炭水化物（例えばデンプンまたはマンニトール）などの医薬担体と混合することにより製造される。着香剤、保存剤、分散剤、および着色剤もまた存在し得る。

【0049】

カプセル剤は、上記のように粉末混合物を製造し、成型ゼラチンシース（gelatin sheath）に詰めることにより製造される。充填工程の前に、流動化剤および滑沢剤（例えばコロイド状シリカ、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、または固体のポリエチレングリコール）を粉末混合物に加えることができる。カプセル剤が摂取される際の薬剤のアベイラビリティを高めるために、崩壊剤または可溶化剤（例えば寒天、炭酸カルシウムまたは炭酸ナトリウム）を加えることもできる。

【0050】

さらに、所望される場合もしくは必要な場合、適切な結合剤、滑沢剤、崩壊剤、および着色剤を混合物に加えることもできる。適切な結合剤としては、デンプン、ゼラチン、天然糖（例えばグルコースまたはβ-ラクトース）、コーンシロップ、天然および合成ガム（例えばアカシア、トラガカントまたはアルギン酸ナトリウム）、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。これらの剤形に用いられる滑沢剤としては、オレイン酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどが挙げられる。崩壊剤としては、限定はしないが、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガムなどが挙げられる。錠剤は、例えば、粉末混合物を製造し、顆粒化もしくは充填し、滑沢剤および崩壊剤を加え、そして錠剤に圧縮することにより製剤化される。粉末混合物は、適切に粉末化された化合物と、上記の希釈剤または塩基、ならびに適宜、結合剤（例えばカルボキシメチルセルロース、アルギネート（aliginate）、ゼラチン（gelating）、またはポリビニルピロリドン）、溶解遅延剤（例えばパラフィン）、吸収促進剤（例えば第四級塩）および/または吸収剤（例えばベントナイト、カオリン、またはリン酸水素カルシウム）とを混合することにより製造される。結合剤（例えばシロップ、デンプン糊、アカシア粘液（acadia mucilage）、またはセルロース系物質もしくはポリマー系物質の溶液）で湿らせて、ふるいに押し通すことにより、粉末混合物を顆粒化することができる。顆粒化の別法として、該粉末混合物を錠剤機に通して、不完全に成型されたスラグを得た後、顆粒に粉砕することができる。該顆粒を、ステアリン酸、ステアリン酸塩、タルク、または鉱物油の添加により滑らかにして、錠剤成形型への接着を防ぐことができる。次いで、滑らかにした混合物を錠剤へと圧縮する。また、本発明の化合物を、自由流動性不活性担体と合わせて、顆粒化工程または成形工程（slugging step）を経ずに直接、錠剤へと圧縮することができる。シェラックのシールコート（sealing coat）、糖もしくはポリマー材のコーティング、およびワックスの艶出しコーティングから成る、澄明もしくは不透明な保護コーティングを施すことができる。これらのコーティングに染料を加えて、異なる単位用量を区別することができる。

【0051】

経口液剤（例えば液剤、シロップ剤、およびエリキシル剤）は、所定の分量が所定の量の化合物を含むように単位用量形態で製造され得る。シロップ剤は、適切に風味付けされた水溶液中に化合物を溶解させることにより製造でき、一方、エリキシル剤は無毒のビヒクルを用いることにより製造される。可溶化剤および乳化剤（例えばエトキシ化イソステアリルアルコールおよびポリオキシエチレンソルビトールエーテル）、保存剤、香味添加剤（例えばペパーミント油あるいは天然甘味剤、またはサッカリンもしくは他の人工甘味剤）などを加えることもできる。

【0052】

必要に応じて、経口投与のための単位用量製剤をマイクロカプセル化することができる。該製剤はまた、例えば、ポリマー、ワックスなどの中に粒子状物質をコーティングまたは組み込むことによって、放出を遅延もしくは持続するように製造され得る。

【0053】

式(I)の化合物、およびその医薬的に許容される塩はまた、リポソームデリバリーシステム（例えば、小型の単層ベシクル、大型の単層ベシクル、および多重層ベシクル）の形態で投与することもできる。リポソームは、様々なリン脂質、例えばコレステロール、ステアリルアミン、またはホスファチジルコリンから形成することができる。

【0054】

式(I)の化合物およびその医薬的に許容される塩はまた、化合物分子が結合した個々の担体としてモノクローナル抗体を用いることによって送達されうる。また、該化合物を、標的化可能な薬物担体としての可溶性ポリマーと結合させてもよい。そのようなポリマーとしては、ポリビニルピロリドン、ピラン共重合体、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミドフェノール、ポリヒドロキシエチルアスパルトアミドフェノール、またはパリトイル（palitoyl）残基で置換されたポリエチレンオキシドポリリシンを挙げることができる。さらに、該化合物は、薬物の制御放出を達成するのに有用な生分解性ポリマーの類、例えば、ポリ乳酸、ポリイプシロンカプロラクトン（polepsilon caprolactone）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレート、およびヒドロゲルの架橋もしくは両親媒性ブロック共重合体に結合していてよい。

【0055】

経皮投与に適した医薬製剤は、長期間、レシピエントの表皮と密接な接触を維持することを目的とした、個別のパッチであってもよい。例えば、Pharmaceutical Research, 3(6), 318 (1986)に一般的に記載されるように、該活性成分はイオントフォレーシスによってパッチから送達されうる。

【0056】

局所投与に適した医薬製剤は、軟膏剤、クリーム剤、懸濁剤、ローション剤、粉末剤、液剤、ペースト剤、ゲル剤、スプレー剤、エアロゾル剤、または油剤として製剤化されうる。

【0057】

眼または他の外部組織、例えば口および皮膚の処置において、該製剤は好ましくは、局所用軟膏剤もしくはクリーム剤として塗布される。軟膏剤に製剤化する場合、該活性成分はパラフィン系（paraffinic）かまたは水-混和性のいずれかの軟膏基剤とともに用いられうる。別法として、該活性成分は水中油型クリーム基剤または油中水型基剤を用いてクリーム剤に製剤化されうる。

【0058】

眼への局所投与に適した医薬製剤としては、該活性成分が適切な担体（とりわけ水性溶媒）に溶解または懸濁されている点眼剤が挙げられる。

【0059】

口への局所投与に適した医薬製剤としては、ドロップ剤（lozenge）、トローチ剤（pastille）、および口腔洗浄剤（mouth wash）が挙げられる。

【0060】

直腸投与に適した医薬製剤は、坐薬または浣腸剤であってよい。

【0061】

担体が固体である、経鼻投与に適した医薬製剤としては、粗粉末（course powder）が挙げられ、それは、嗅ぎ薬を摂取する方法、すなわち、鼻に近づけられた粉末剤の容器から鼻腔を介して急速吸入することにより、投与される。鼻腔用スプレーもしくは点鼻薬として投与するための、担体が液体である適切な製剤としては、活性成分の水性または油性液剤が挙げられる。

【0062】

吸入による投与に適した医薬製剤としては、微粒子粉末または微粒子ミストが挙げられ、それは様々なタイプの定量加圧（metered, dose pressurized）エアロゾル、ネブライザー、または吸入器を用いて発生されうる。

【0063】

膣内投与に適した医薬製剤は、ペッサリー、タンポン、クリーム剤、ゲル剤、ペースト剤、フォーム剤、またはスプレー製剤であってよい。

【0064】

非経口投与に適した医薬製剤としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤（bacteriostat）、および製剤を対象のレシピエントの血液と等張にする塩（soute）を含みうる水性および非水性の無菌注射液剤;ならびに懸濁化剤および増粘剤を含みうる水性および非水性の無菌懸濁剤が挙げられる。該製剤は、単位用量もしくは複数用量（multi-dose）容器、例えば、密封アンプルおよびバイアルに入っていてよく、使用の直前に無菌の液体担体（例えば注射用の水）の添加のみを必要とする凍結乾燥状態で保存してもよい。即時調製（Extemporaneous）注射液剤および懸濁剤は、無菌粉末剤、顆粒剤、および錠剤から調製されうる。

【0065】

具体的に上述した成分に加えて、該製剤は、当該製剤のタイプを考慮して当分野で通常の他の剤を含んでもよい（例えば経口投与に適した製剤は香味剤を含んでもよい）ことが理解されるべきである。

【0066】

以下の表1に、本発明の化合物とともに投与することができる化合物のいくつかの実例を記載する。本発明の化合物は、併用療法において、一緒にまたは別個に、あるいは該化合物を組成物中に混合することによって、他の抗HCV活性化合物とともに投与することができる。

表1

【表1】

【表2】

【表3】

【表4】

【表5】

【0067】

本発明の化合物は、実験用試薬として用いてもよい。化合物は、HCV疾患メカニズムの知識をさらに高めるための、ウイルス複製アッセイの設計、動物アッセイ系（animal assay system）の検証および構造生物学研究に対する研究ツールの提供において有益でありうる。さらに、本発明の化合物は、例えば競合阻害により、他の抗ウイルス性化合物の結合部位の確立または決定に有用である。

【0068】

本発明の化合物はまた、物質のウイルス汚染を処理もしくは防止するのに用いてもよく、それにより、そのような物質（例えば血液、組織、手術器具および手術着、実験器具および実験着、ならびに採血または輸血の器具および材料）と接触する、実験もしくは医療の関係者または患者のウイルス感染の危険性を低下させうる。

【0069】

本発明は、合成プロセスまたは代謝プロセス（ヒトもしくは動物の体内(in vivo)で生じるもの、またはin vitroで生じるプロセスを含む）により作られる、式(I)を有する化合物を包含することを意図する。

【0070】

本開示は特定の実施態様に関連して記載されるが、それはその発明の範囲を制限することを意図するものではない。一方、本開示は、全ての代替形態、改変形態、および同等形態を、特許請求の範囲内に含み得るものとして包含する。従って、特定の実施態様を含む以下の実施例は、本発明の1つの実例を説明し、該実施例は特定の実施態様の例示目的であり、そしてその方法および概念的態様の最も有用で且つ容易に理解される記載であると考えられるものを提供するために提示するものであると解される。

【0071】

特に後述の例示的スキームおよび実施例におけるものを含めた本出願において使用される略語は、当業者には周知である。使用される略語のいくつかは以下の通りである:Et₃Nはトリエチルアミン;DPPAはジフェニルホスホリルアジド;hまたはhrまたはhrsは時間;EtOAcは酢酸エチル;Phはフェニル;minまたはminsは分;RTまたはRtまたはrtは室温または保持時間(文脈によって決定される);DMSOはジメチルスルホキシド;THFはテトラヒドロフラン;n-BuLiはn-ブチルリチウム;i-Prはイソプロピル;i-PrOはイソプロポキシ;MeOHはメタノール;TMSはトリメチルシリル;t-Buはtert-ブチル;t-BuOはtert-ブトキシ;Tsまたはp-Tsはパラ-トリルスルホニル;iPr₂EtNまたはDIPEAはジイソプロピルエチルアミン;HATUはO-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート;Etはエチル;および、Et₂Oはジエチルエーテル。

【0072】

本発明の化合物の合成に有用な出発物質は当業者に公知であり、容易に製造できるか、または市販されている。

【0073】

以下に記載の方法は、例示目的であり、特許請求の範囲を制限することを意図するものではない。それは、一般的な保護基を用いて官能基が保護されている化合物を製造し、次いで該保護基を除去して、本発明の化合物を得るのに必要でありうると認識されよう。本発明による保護基の使用に関する詳細は、当業者には公知である。

【実施例】

【0074】

実施例1001:化合物1001の製造

【化4】

【化5】

工程1
ベンゼン(100 mL)中の(E)-3-(4-クロロフェニル)アクリル酸(18.3 g, 0.1 mol)およびEt₃N(20.2 g, 0.2 mol)の溶液に、DPPA(27.5 g, 0.1 mol)を滴下した。2時間撹拌した後、該溶液を濃縮し、クロマトグラフィー(Biotage, 移動相 20/80 EtOAc/ヘキサン)により精製して、16 gの中間体アジドを固形物として得た。この中間体を100 mLのPh₂CH₂中に溶解させ、得られた混合液を、30分かけて90℃までゆっくりと加熱した。該反応混合液を還流加熱し、この温度で3時間維持した。室温まで冷却した後、沈殿した固形物を濾過により集め、トルエンで洗浄して、9.5 gの7-クロロイソキノリン-1(2H)-オン(53％)を得た。 ¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ ppm 6.66 (d, J=7.05 Hz, 1 H), 7.18 (d, J=7.05 Hz, 1 H), 7.66 (s, 1 H) 7.67 (d, J=2.01 Hz, 1 H), 8.24 (d, J=2.27 Hz, 1 H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-D₆) δ ppm 104.05, 125.62, 127.21, 128.54, 129.52, 130.77, 132.43, 136.55, 160.72; LC/MS, MS m/z (M+H)⁺ 180.

【0075】

工程2
無水CH₃CN(500 mL)中の工程1（実施例1001）の生成物, 7-クロロイソキノリン-1(2H)-オン(36.33 g, 203 mmol)およびN-ブロモスクシンイミド(39.74 g, 223.3 mmol)のスラリーを、約2時間かけてゆっくりと穏やかに還流加熱し、穏やかな還流で1.5時間維持した。該反応液をLC/MSによりモニターし、完了後、該スラリーを3時間かけて室温までゆっくりと冷却した。沈殿した固形物を濾過により集め、CH₃CN(100 mL x 3)で洗浄して、47 g(90％)の4-ブロモ-7-クロロイソキノリン-1(2H)-オンを得た。この物質をさらなる精製は行わずに次の工程に用いた。 ¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ ppm 7.46(s, 1H), 7.81 (dd, J=8.40, 2.00 Hz, 1 H), 7.88 (d, J=8.8 Hz, 1 H), 8.27(d, J=2.00 Hz, 1 H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-D₆) δ ppm 96.68, 126.34, 127.58, 127.71, 130.73, 132.20, 133.47, 134.46, 159.88; LC/MS, MS m/z (M+H)⁺ 258.

【0076】

工程3
POCl₃(200 mL, 2.15 mol)中の工程2（実施例1001）生成物, 4-ブロモ-7-クロロイソキノリン-1(2H)-オン(47 g, 182 mmol)の不均一な溶液を、1時間かけてゆっくりと還流加熱した。この加熱プロセスの間に、該反応混合液は均一になったことに留意すべきである。該反応混合液を、還流で4時間維持した後、室温まで冷却し、減圧濃縮して過剰量のPOCl₃を除去した。残留したPOCl₃の完全な除去を確実なものとするために、該残渣をCH₂Cl₂または別法としてトルエン中に溶解させ、減圧濃縮した。このプロセスを必要に応じて繰り返した。(注記:POCl₃は、ガラス容器中において適切に処分した（その旨をラベルで表示した）。)該残渣を600 mLのCH₂Cl₂に溶解させ、-35℃まで冷却し、中和した後、該混合液がわずかに塩基性(pH = 8)になるまで、1N NaOH(400 mL)を用いて慎重に塩基性化させた。有機層を分離し、H₂Oで洗浄し、MgSO₄で乾燥させ、減圧濃縮した。残った固形物を、EtOAc(約50 mL)から結晶化させて、32 gの4-ブロモ-1,7-ジクロロイソキノリンを得た。結晶化プロセスからの母液を濃縮し、Biotage(16％ EtOAc／ヘキサン)により精製して、さらなる4 gの4-ブロモ-1,7-ジクロロイソキノリンを固形物として得た。合計で、36 g(73％)の4-ブロモ-1,7-ジクロロイソキノリンを得た。 ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ ppm 7.80 (dd, J=8.81, 2.01 Hz, 1 H), 8.14 (d, J=9.06 Hz, 1 H), 8.34 (d, J=1.76 Hz, 1 H), 8.48 (s, 1 H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-D₆) δ ppm 118.39, 125.06, 127.59, 128.71, 133.89, 134.14, 134.93, 143.18, 148.98; LC/MS, MS m/z (M+H)⁺ 275.

【0077】

工程4
THF(500 ml)中の工程3（実施例1001）の生成物, 4-ブロモ-1,7-ジクロロイソキノリン(22.16 g, 80 mmol)のスラリーの溶液（-78℃で維持）に、1.6 M n-BuLi／ヘキサン(100 mL, 160 mmol)をカニューレによって15分かけて滴下した(内部温度を＜-65℃に維持した)。該溶液を0.5時間撹拌し、(i-PrO)₃B(37 ml, 160 mmol)をシリンジによって10分かけて滴下した(内部温度を＜-65℃に維持した)。該反応混合液を0.5時間撹拌し、30％ H₂O₂(80 ml, 776 mmol)を滴下漏斗によって10分かけて滴下した(この添加の間に内部温度は-60℃まで上昇した)後、1N NaOH溶液(80 ml, 80 mmol)を加えた。冷却浴を取り外し、該反応混合液を室温まで昇温させ、さらに1時間撹拌した。LC/MSによって該反応の完了を確認した後、該反応混合液を-40℃まで冷却し、400 mLのH₂O中の100 gのNa₂SO₃(0.793 mol)の溶液を30分かけて滴下した(内部温度を5〜10℃に維持した)。得られたスラリーを、6 N HCl(約50 ml)で0℃にて中和して、pH 〜6にした。該混合液を500 mlのEtOAcで希釈し、2 Lの分液漏斗にデカントした。該反応容器中に残った固形物に、500 mLのH₂Oおよび300 mlのEtOAcを加え、該混合液を6 N HCl(約20 ml)で中和した。分液漏斗中で有機層を合わせて、食塩水(300 ml x 3)およびH₂O(200 ml x 3)で洗浄した。有機相を、MgSO₄で乾燥させ、濾過して乾燥剤を除去し、濃縮し、粗生成物を得て、それを50 mlのEtOAcを用いてトリチュレートした。得られた固形物を濾過により集め、EtOAc(3 x 25 ml)ですすぎ、乾燥させて、1,7-ジクロロイソキノリン-4-オールを得た(2回操作: 12.0 g, 70％および13.8 g, 81％)。濾液を合わせて、濃縮し、Biotage(35％ EtOAc／ヘキサン)により精製して、さらなる2.1 gのBMS-796007を得た。合計で、27.9 g(82％)の1,7-ジクロロイソキノリン-4-オールを得た。 ¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ ppm 4.05 (s, 3 H), 7.4 (s, 1 H), 7.76 (dd, J=8.8, 2, Hz, 1 H), 8.16 (d, J=2 Hz, 1 H), 8.23 (d, J=8.8 Hz, 1 H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-D₆) δ ppm 123.78, 124.66, 125.62, 127.03, 127.71, 130.72, 133.80, 137.63; 148.88; LC/MS, MS (m/z) (M+H)⁺ 213.

【0078】

工程5
1,7-ジクロロ-4-メトキシイソキノリンの製造:
MeOH/CH₃CN(30 mL/300 mL)中の工程4（実施例1001）の生成物, 1,7-ジクロロイソキノリン-4-オール(16 g, 75.5 mmol)のスラリー（0℃で維持）に、ヘキサン中のTMSCHN₂の2 M溶液(60 ml , 120 mmol)を滴下した。該反応混合液を室温まで昇温させ、14時間撹拌した。該溶液を濃縮し、残留固形物をEtOAc(約50 mL)から再結晶化させて8.1 gの1,7-ジクロロ-4-メトキシイソキノリンを得て、それを25％ EtOAc／ヘキサンで洗浄した。該母液を濃縮し、Biotage(16％ EtOAc／ヘキサン)により精製して、さらなる3.2 gの1,7-ジクロロ-4-メトキシイソキノリンを固形物として得た。合計で、11.3 g(66％)の1,7-ジクロロ-4-メトキシイソキノリンを得た。 ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ ppm 4.05 (s, 3 H), 7.67 (dd, J=9.06, 2.01 Hz, 1 H), 7.80 (s, 1 H), 8.16 (d, J=8.81 Hz, 1 H), 8.23 (d, J=2.01 Hz, 1 H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-D₆) δ ppm 56.68, 122.70, 123.99, 124.14, 126.67, 127.83, 131.43, 134.10, 139.75, 149.94; LC/MS, MS m/z (M+H)⁺ 228.

【0079】

1,7-ジクロロ-4-(D₃-メトキシ)イソキノリンの製造:
アセトン(10 mL)中の工程4（実施例1001）, 1,7-ジクロロイソキノリン-4-オール(321 mg, 1.5 mmol)、ICD₃(217 mg, 1.500 mmol)、およびK₂CO₃(622 mg, 4.50 mmol)の混合液を20時間還流した。濾過後、該濾液を濃縮し、Biotage（10％ 酢酸エチル／ヘキサンで溶出）により精製して、250 mgの目的の生成物を固形物として得た。 LC/MS, MS (m/z) (M+H)⁺ 231.09.

【0080】

工程6
工程5（実施例1001）の生成物, 1,7-ジクロロ-4-メトキシイソキノリン(4.52 g, 20 mmol)、(2S,4R)-1-(tert-ブトキシカルボニル)-4-ヒドロキシピロリジン-2-カルボン酸(5.08 g, 22 mmol)およびt-BuOK(6.72 g, 60 mmol)の混合物に、10℃で撹拌しながら、DMSO(200 mL)を加えた。得られたスラリーを30分間超音波処理して、均一な溶液を得て、それを室温で3時間撹拌した。該反応混合液を0℃まで冷却し、H₂O(50 ml)を加えることによってクエンチした。該混合液を、1 N HCl水溶液を慎重に加えることによって、中和した後、最終的にpH 5まで酸性化した。該混合液をEtOAc(400 mL)で抽出し、有機層を食塩水(200 mL)、H₂O(200 mLx2)で洗浄した後、MgSO₄で乾燥させ、減圧濃縮して、8.36 gのクルードな固形物 (2S,4R)-1-(tert-ブトキシカルボニル)-4-(7-クロロ-4-メトキシイソキノリン-1-イルオキシ)ピロリジン-2-カルボン酸を得た。この物質をさらなる精製は行わずに次の工程に用いた。 ¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ ppm 2.34 - 2.47 (m, 1 H), 2.62 - 2.77 (m, 1 H), 3.70 - 3.92 (m, 2 H), 4.42 - 4.59 (m, 1 H), 5.65 (brs, 1 H), 7.54 (s, 1 H), 7.68 (dd, J=8.81, 2.01 Hz, 1 H), 8.02 - 8.13 (m, 2 H); ¹³C NMR (126 MHz, DMSO-D₆) δ ppm 13.90, 14.04, 20.71, 22.02, 27.84, 27.98, 30.91, 35.00, 35.87, 51.84, 52.08, 56.21, 57.49, 57.80, 59.70, 73.32, 73.87, 79.14, 79.19, 119.11, 119.77, 122.38, 123.35, 128.50, 130.95, 132.25, 145.70, 151.94, 153.25, 153.71, 173.51, 173.98; MS (M+H)⁺ 423.

【0081】

工程7
CH₂Cl₂(200 mL)中の工程6（実施例1001）の生成物, (2S,4R)-1-(tert-ブトキシカルボニル)-4-(7-クロロ-4-メトキシイソキノリン-1-イルオキシ)ピロリジン-2-カルボン酸(8.36 g, 19.8 mmol)、(1R,2S)-1-アミノ-N-(シクロプロピルスルホニル)-2-ビニルシクロプロパンカルボキサミド TsOH塩(9.64g, 24 mmol)、およびiPr₂EtN(17.4 mL, 100 mmol)の溶液に、HATU(11.4 g, 31 mmol)を加えた。該反応混合液を16時間撹拌し、減圧濃縮し、残渣をEtOAc(300 mL)中に溶解させ、1 N HCl(50 mL x 3)、水(30 mL x 2)、および食塩水(50 ml x 2)で連続的に洗浄した。有機性物質をMgSO₄で乾燥させ、濃縮し、Biotage(25％ アセトン／ヘキサン)を用いて精製して、11.5 gの粗生成物 (2S,4R)-tert-ブチル 4-(7-クロロ-4-メトキシイソキノリン-1-イルオキシ)-2-((1R,2S)-1-(シクロプロピルスルホニルカルバモイル)-2-ビニルシクロプロピルカルバモイル)ピロリジン-1-カルボキシレートを得た。この化合物を、MeOH(40 mL)から結晶化させることによって精製し、11 g(88％)の結晶性の固形物を得た。 ¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ ppm 1.03 - 1.31 (m, 8 H), 1.43 (s, 9H), 1.88 (dd, J=8.06, 5.54 Hz, 1 H), 2.17 - 2.36 (m, 2 H), 2.53 (dd, J=13.72, 6.42 Hz, 1 H), 2.90 - 3.03 (m, 1 H), 3.72 - 3.93 (m, 2 H), 4.40 (dd, J=9.69, 6.92 Hz, 1 H), 5.13 (d, J=10.32 Hz, 1 H), 5.31 (d, J=17.12 Hz, 1 H), 5.65 - 5.93 (m, 2 H), 7.55 (s, 1 H), 7.70 (dd, J=8.94, 2.14 Hz, 1 H), 8.06 (d, J=2.01 Hz, 1 H), 8.09 (d, J=8.81 Hz, 1 H); ¹³C NMR (126 MHz, DMSO-D₆) δ ppm 5.47, 5.57, 5.75, 19.85, 22.38, 27.90, 27.99, 30.65, 30.72, 32.11, 33.81, 35.11, 36.30, 40.86, 41.59, 48.56, 52.39, 52.76, 56.24, 58.76, 59.21, 73.57, 74.06, 79.28, 80.06, 117.80, 119.16, 119.81, 119.88, 122.14, 123.48, 128.52, 131.00, 132.28, 133.38, 145.72, 151.77, 151.86, 154.06, 168.38, 169.13, 172.46, 173.27; MS: (M+H)⁺ 635.

【0082】

工程8
50 mLのMeOH（3 mlの濃HClを含む）中の工程7（実施例1001）の生成物, (2S,4R)-tert-ブチル 4-(7-クロロ-4-メトキシイソキノリン-1-イルオキシ)-2-((1R,2S)-1-(シクロプロピルスルホニルカルバモイル)-2-ビニルシクロプロピルカルバモイル)ピロリジン-1-カルボキシレート(6.34 g, 10 mmol)のスラリーを、2時間還流した。該溶液を室温まで冷却し、減圧濃縮した。固体の残渣を乾燥Et₂O(50 ml)に溶解させ、該溶液を減圧濃縮した。このプロセスを5回繰り返すことにより、水および溶解したHClの完全な除去を確実なものとし、6.07 gの(2S,4R)-4-(7-クロロ-4-メトキシイソキノリン-1-イルオキシ)-N-((1R,2S)-1-(シクロプロピルスルホニルカルバモイル)-2-ビニルシクロプロピル)ピロリジン-2-カルボキサミドをHCl塩として得た(100％)。 ¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ ppm 0.96 - 1.21 (m, 3 H), 1.22 - 1.30 (m, 1 H), 1.38 (dd, J=9.57, 5.54 Hz, 1 H), 1.95 (dd, J=8.06, 5.79 Hz, 1 H), 2.25 - 2.46 (m, 2 H), 2.83 - 3.08 (m, 2 H), 3.75 - 3.90 (m, 2 H), 4.01 (s, 3 H), 4.70 (dd, J=10.32, 7.81 Hz, 1 H), 5.10 - 5.20 (m, 1 H), 5.33 (d, J=17.12 Hz, 1 H), 5.58 - 5.76 (m, 1 H), 5.88 (s, 1 H), 7.57 (s, 1 H), 7.74 (dd, J=8.81, 2.01 Hz, 1 H), 8.12 (d, J=9.06 Hz, 1 H), 8.28 (d, J=2.01 Hz, 1 H); ¹³C NMR (101 MHz, CD₃OD) δ ppm 6.52, 6.65, 22.60, 31.99, 34.63, 37.04, 43.18, 52.95, 56.85, 60.56, 76.08, 119.06, 119.10, 121.65, 123.93, 124.63, 130.72, 132.37, 133.78, 134.76, 148.49, 153.02, 170.08, 170.67; LC/MS MS m/z (M+H)⁺ 535.

【0083】

工程9
100 mLのCH₂Cl₂中の工程8（実施例1001）の生成物, HCl塩としての(2S,4R)-4-(7-クロロ-4-メトキシイソキノリン-1-イルオキシ)-N-((1R,2S)-1-(シクロプロピルスルホニルカルバモイル)-2-ビニルシクロプロピル)ピロリジン-2-カルボキサミド(6.07 g, 10 mmol)の溶液（0℃に維持）に、8.7 mLのiPr₂EtN(50 mmol)、続いてBoc-L-tert-ロイシン(2.772 g, 12 mmol)およびHATU(5.7 g, 15 mmol)を加えた。該反応混合液を室温まで昇温させ、16時間撹拌した後、減圧濃縮し、残渣をEtOAc(300 mL)に溶解させた。該EtOAc溶液を1N HCl(50 mL x 3)、H₂O(30 mL x 2)、および食塩水(50 ml x 2)で連続的に洗浄した。有機相を、MgSO₄で乾燥させ、減圧濃縮し、Biotage(33％ アセトン／ヘキサン)を用いて精製して粗生成物を得て、7 g(94％)の目的の生成物を得た。 ¹H NMR (400 MHz, CD₃OD) δ ppm 1.00-1.06 (m, 11 H), 1.16 (s, 9 H), 1.14-1.24 (m, 2 H), 1.44 (dd, J=9.32, 5.29 Hz, 1 H), 1.88 (dd, J=8.06, 5.54 Hz, 1 H), 2.17 - 2.39 (m, 2 H), 2.59 (dd, J=13.85, 6.80 Hz, 1 H), 2.87 - 3.02 (m, 1 H), 4.00 (s, 3 H), 4.01 - 4.14 (m, 1 H), 4.17 - 4.24 (m, 1 H), 4.43 (d, J=12.09 Hz, 1 H), 4.52 - 4.65 (m, 1 H), 5.12 (d, J=10.07 Hz, 1 H), 5.30 (d, J=16.87 Hz, 1 H), 5.65 - 5.91 (m, 2 H), 7.56 (s, 1H), 7.68 (d, J=9.06 Hz, 1 H), 8.05 (s, 1 H), 8.09 (d, J=9.06 Hz, 1 H);MS: (M+H)⁺ 748.

【0084】

工程10
工程9（実施例1001）の生成物, tert-ブチル (S)-1-((2S,4R)-4-(7-クロロ-4-メトキシイソキノリン-1-イルオキシ)-2-((1R,2S)-1-(シクロプロピルスルホニルカルバモイル)-2-ビニルシクロプロピルカルバモイル)ピロリジン-1-イル)-3,3-ジメチル-1-オキソブタン-2-イルカルバメート(2.469 g, 3.3 mmol)に、4M HCl(8.25 mL, 33.0 mmol)／1,4-ジオキサンを加えた。得られた溶液を25℃で3時間撹拌した。減圧下で濃縮した後、残渣に、エーテル(20mL)を加え、次いで再び濃縮し、該手順を3回繰り返した。一般的な減圧装置で乾燥させて、2.36 g(100％)の粗生成物を固形物として得て、それをさらなる精製は行わずに次の工程に用いた。 MS: (M+H)⁺ 648.50.

【0085】

工程11
CH₂Cl₂(体積:3 mL)中の工程10（実施例1001）の生成物, (2S,4R)-1-((S)-2-アミノ-3,3-ジメチルブタノイル)-4-(7-クロロ-4-メトキシイソキノリン-1-イルオキシ)-N-((1R,2S)-1-(シクロプロピルスルホニルカルバモイル)-2-ビニルシクロプロピル)ピロリジン-2-カルボキサミド, HCl(30 mg, 0.044 mmol)、反応物2(9.56 mg, 0.048 mmol)、およびN-エチル-N-イソプロピルプロパン-2-アミン(0.038 mL, 0.219 mmol)の溶液を、16時間撹拌した。濃縮後、残渣をプレパラティブHPLCにより精製して、21 mg(64％)の目的の生成物である化合物1001を固形物として得た。 ¹H NMR (400 MHz, MeOD) δ ppm 0.99 - 1.13 (m, 11 H), 1.17 (s, 6 H), 1.21 - 1.32 (m, 2 H), 1.45 (dd, J=9.4, 5.4 Hz, 1 H), 1.89 (dd, J=8.2, 5.4 Hz, 1 H), 2.20 - 2.35 (m, 2 H), 2.61 (dd, J=13.7, 6.9 Hz, 1 H), 2.91 - 3.01 (m, 1 H), 4.01 (s, 3 H), 4.03 - 4.12 (m, 1 H), 4.18 - 4.23 (m, 1 H), 4.43 (s, 1 H), 4.57 (dd, J=10.2, 7.2 Hz, 1 H), 5.14 (dd, J=10.3, 1.5 Hz, 1 H), 5.32 (d, J=17.1 Hz, 1 H), 5.71 - 5.85 (m, 2 H), 7.58 (s, 1 H), 7.69 (dd, J=8.5, 1.8 Hz, 1 H), 8.06 (d, J=1.8 Hz, 1 H), 8.10 (d, J=8.8 Hz, 1 H); MS: (M+H)⁺ 751.31.

【0086】

実施例1002:化合物1002の製造

【化6】

化合物1002を、化合物1001の製造について記載されたものと同様の方法によって製造した, MS: (M+H)⁺ 754.35。

【0087】

実施例1003:化合物1003の製造

【化7】

化合物1003を、化合物1001の製造について記載されたものと同様の方法によって製造した, MS: (M+H)⁺ 757.35。

【0088】

（生物学的研究）
HCV NS3/4Aプロテアーゼ複合体酵素アッセイおよび細胞ベースのHCVレプリコンアッセイを、下記の通り当業者に公知の情報を用いて調製し、実施し、検証した。

【0089】

組換えHCV NS3/4Aプロテアーゼ複合体の産生
BMS株、H77株またはJ4L6S株由来のHCV NS3プロテアーゼ複合体を、下記のとおり産生した。これらの精製した組換えタンパク質を、均一アッセイ(下記参照)において使用するために産生し、HCV NS3タンパク質分解活性の阻害において本発明の化合物がいかに有効であるかを示した。

【0090】

HCV感染患者からの血清を、サンフランシスコ病院のT.Wright医師から得た。HCVゲノム(BMS株)の設計された完全長cDNA(相補デオキシリボ核酸)鋳型を、血清RNA(リボ核酸)の逆転写-PCR(RT-PCR)によって得たDNAフラグメントから、他の遺伝子型1a株の間の相同性に基づいて選択したプライマーを使用して作製した。全ゲノム配列の決定から、Simmondsらの分類に従って、HCV分離株に対して遺伝子型1aを割り当てた(P Simmonds, KA Rose, S Graham, SW Chan, F McOmish, BC Dow, EA Follett, PL Yap and H Marsden, J. Clin. Microbiol., 31(6), 1493-1503 (1993)を参照)。非構造領域NS2-5Bのアミノ酸配列は、HCV遺伝子型1a(H77)に＞97％同一であり、遺伝子型1b(J4L6S)に87％同一であることが示された。感染性クローンH77(1a遺伝子型)およびJ4L6S(1b遺伝子型)は、R. Purcell(NIH)から得ており、該配列はGenbankにおいて公開されている(AAB67036は、Yanagi,M., Purcell,R.H., Emerson,S.U. and Bukh, J. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94(16), 8738-8743 (1997)参照;AF054247は、Yanagi,M., St Claire,M., Shapiro,M., Emerson,S.U., Purcell,R.H. and Bukh, J., Virology 244 (1), 161-172. (1998)参照)。

【0091】

組換えNS3/4Aプロテアーゼ複合体の産生のために、該H77およびJ4L6S株を用いた。これらの株について組換えHCV NS3/4Aプロテアーゼ複合体(アミノ酸1027〜1711)をコードするDNAを、P. Gallinariらによる記載の通りに操作した(Gallinari P, Paolini C, Brennan D, Nardi C, Steinkuhler C, De Francesco R. Biochemistry. 38(17):5620-32, (1999)参照)。手短に言うと、３つのリシンの可溶化尾部を、NS4Aコード領域の3'-末端に付加した。NS4A-NS4B切断部位のP1位置におけるシステイン(アミノ酸1711)をグリシンに変えて、リシンタグ（lysine tag）のタンパク分解性切断を回避した。さらに、システインからセリンへの変異を、アミノ酸ポジション1454にPCRによって導入し、NS3ヘリカーゼドメインにおける自己分解性切断を防いだ。改変を加えたP. Gallinariらにより記載されたプロトコール(Gallinari P, Brennan D, Nardi C, Brunetti M, Tomei L, Steinkuhler C, De Francesco R., J Virol. 72(8):6758-69 (1998)参照)に従って、該変異DNAフラグメントをpET21b細菌発現ベクター(Novagen)においてクローニングし、NS3/4A複合体を大腸菌株BL21(DE3)(Invitrogen)において発現させた。手短に言うと、該NS3/4Aプロテアーゼ複合体発現を、0.5ミリモル(mM)のイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)を用いて、20℃で22時間(h)誘導した。典型的な発酵(1リットル(L))によって、約10グラム(g)の湿細胞ペーストを得た。該細胞を、25 mM N-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-N'-(2-エタンスルホン酸)(HEPES), pH 7.5、20％グリセロール、500 mM 塩化ナトリウム(NaCl)、0.5％ Triton X-100、1マイクログラム/ミリリットル(「mg/mL」)リゾチーム、5 mM 塩化マグネシウム(MgCl₂)、1 mg/ml DnaseI、5 mM β-メルカプトエタノール(βME)、プロテアーゼ阻害剤-エチレンジアミン四酢酸(EDTA)非含有(Roche)から成る溶解バッファー(10 mL/g)に再懸濁させ、ホモジナイズし、4℃で20分(min)間インキュベートした。該ホモジネートを超音波処理し、4℃にて、235000 gで1時間(h)超遠心処理することによって清澄にした。イミダゾールを上清に加えて15 mMの最終濃度にし、pHを8.0に調整した。粗タンパク質抽出物を、バッファーB(25 mM HEPES、pH 8.0、20％グリセロール、500 mM NaCl、0.5％ Triton X-100、15 mM イミダゾール、5 mM βME)で予め平衡化したニッケル−ニトリロ三酢酸(Ni-NTA)カラムにロードした。試料を、流速1 mL/分でロードした。該カラムを15カラム容量のバッファーC(0.2％ Triton X-100以外はバッファーBと同一)で洗浄した。タンパク質を5カラム容量のバッファーD(200 mM イミダゾール以外はバッファーCと同一)で溶出した。

【0092】

NS3/4Aプロテアーゼ複合体-含有画分をプールし、バッファーD(25mM HEPES、pH 7.5、20％グリセロール、300 mM NaCl、0.2％ Triton X-100、10 mM βME)で予め平衡化した脱塩カラムSuperdex-S200にロードした。試料を流速1 mL/分でロードした。NS3/4Aプロテアーゼ複合体-含有画分をプールし、約0.5 mg/mlまで濃縮した。BMS、H77およびJ4L6S株由来のNS3/4Aプロテアーゼ複合体の純度は、SDS-PAGEおよび質量分析によって、90％超であると判断した。酵素は-80℃で保存し、アッセイバッファーに使用する前に、氷上で解凍して希釈した。

【0093】

HCV NS3/4Aタンパク質分解活性をモニターするためのFRETペプチドアッセイ
このin vitroアッセイは、本発明の化合物による、上記のBMS株、H77株もしくはJ4L6S株由来のHCV NS3プロテアーゼ複合体の阻害を測定することを目的とした。このアッセイにより、HCV NS3タンパク質分解活性の阻害において本発明の化合物がいかに有効であるかが示された。

【0094】

HCV NS3/4Aプロテアーゼ活性をモニターするために、NS3/4Aペプチド基質を用いた。該基質は、Anal. Biochem. 240(2):60-67 (1996)においてTalianiらにより記載されたRET S1(共鳴エネルギー移動デプシペプチド基質; AnaSpec, Inc. cat # 22991)(FRETペプチド)であった。このペプチドの配列は、切断部位においてアミド結合ではなくエステル結合が存在すること以外は、HCV NS3プロテアーゼのNS4A/NS4B天然切断部位に大まかに基づいている。該ペプチドはまた、ペプチドの一端近くに蛍光ドナーEDANSを、および他端の近くにアクセプターDABCYLを含有する。ペプチドの蛍光は、ドナーとアクセプター間の分子間の共鳴エネルギー移動(RET)によってクエンチされるが、NS3プロテアーゼがペプチドを切断するにつれ、生成物がRET消光から放出され、ドナーの蛍光が明らかになる。

【0095】

該ペプチド基質を、本発明の化合物の非存在下もしくは存在下において、3つの組換えNS3/4Aプロテアーゼ複合体のうちの1つと共にインキュベートした。Cytofluor Series 4000を用いて、蛍光性の反応生成物の形成をリアルタイムでモニターすることによって、化合物の阻害作用を決定した。

【0096】

試薬は以下の通りであった。HEPESおよびグリセロール(Ultrapure)はGIBCO-BRLから入手した。ジメチルスルホキシド(DMSO)はSigmaから入手した。β-メルカプトエタノールはBio Radから入手した。

【0097】

アッセイバッファー:50 mM HEPES, pH 7.5;0.15 M NaCl;0.1％ Triton;15％グリセロール;10 mM βME。基質:2 μMの最終濃度(-20℃で保存したDMSO中の2 mMストック溶液から)。HCV NS3/4A プロテアーゼ1a(1b)型、2-3 nMの最終濃度(25 mM HEPES, pH 7.5、20％グリセロール、300 mM NaCl、0.2％ Triton-X100、10 mM βME中の5 μM ストック溶液から)。アッセイ限界に近づいた効力を有する化合物については、50 μg/ml ウシ血清アルブミン(Sigma)をアッセイバッファーに加え、最終プロテアーゼ濃度を300 pMに下げることによって、該アッセイの感受性を高めた。

【0098】

該アッセイは、Falconの96-ウェルのポリスチレンブラックプレート中で実施した。各ウェルは、アッセイバッファー中の25 μlのNS3/4Aプロテアーゼ複合体、10％ DMSO/アッセイバッファー中の50 μlの本発明の化合物、およびアッセイバッファー中の25 μlの基質を含有した。同一のアッセイプレート上に対照(化合物を含まない)も調製した。酵素複合体を化合物もしくは対照溶液と1分間混合した後、基質を添加して酵素反応を開始させた。該アッセイプレートを、Cytofluor Series 4000(Perspective Biosystems)を使用して直ちに読み取った。25℃にて340 nmの発光および490 nmの励起を読み取るように装置を設定した。通常、約15分間反応させた。

【0099】

以下の式:
100-[(δF_inh/δF_con)x100]
（式中、δFは曲線の線形範囲にわたる蛍光の変化である）を用いて阻害率を算出した。非線形曲線の当てはめを阻害-濃度データに適用し、Excel XLfit ソフトウェアの使用により、式、y=A+((B-A)/(1+((C/x)^D)))を用いて、50％有効濃度(IC₅₀)を算出した。

【0100】

2以上のタイプのNS3/4A複合体に対して試験した本発明の化合物は、同様の阻害特性を有することが見出されたが、該化合物は1a株に比べて1b株に対してより大きな効力を一様に示した。

【0101】

特異性アッセイ
HCV NS3/4Aプロテアーゼ複合体の阻害における本発明の化合物のin vitro選択性を示すために、他のセリンもしくはシステインプロテアーゼと比較した、特異性アッセイを実施した。

【0102】

様々なセリンプロテアーゼ:ヒト好中球エラスターゼ(HNE)、ブタ膵臓エラスターゼ(PPE)およびヒト膵臓キモトリプシン、ならびに1種のシステインプロテアーゼ:ヒト肝臓カテプシンBに対する、本発明の化合物の特異性を決定した。全ての場合において、セリンプロテアーゼアッセイについていくらか改変を加えて以前の記載(PCT特許出願第WO 00/09543号)のとおり、各酵素に特異的な蛍光分析のアミノ-メチル-クマリン(AMC)基質を用いた96-ウェルプレートフォーマットプロトコールを用いた。全ての酵素はSigma、EMDbiosciencesから購入し、一方、基質はBachem、SigmaおよびEMDbiosciencesから購入した。

【0103】

化合物濃度は、その効力によって100から0.4 μMで変動させた。該酵素アッセイは、各々、室温で10分間プレインキュベートした酵素-阻害剤に基質を加えることによって開始し、cytofluorによる測定として15％変換まで加水分解させた。

【0104】

各アッセイについての最終条件は下記の通りであった。
50 mM トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸塩(トリス-HCl) pH 8、0.5 M 硫酸ナトリウム(Na₂SO₄)、50 mM NaCl、0.1 mM EDTA、3％ DMSO、0.01％ Tween-20、ならびに5 μM LLVY-AMCおよび1 nM キモトリプシン。
50 M トリス-HCl, pH 8.0、50 mM NaCl、0.1mM EDTA、3％ DMSO、0.02％ Tween-20、5 μM succ-AAPV-AMC、および20 nM HNEもしくは8 nM PPE;
100 mM NaOAC(酢酸ナトリウム) pH 5.5、3％ DMSO、1 mM TCEP(トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩)、5 nM カテプシンB(酵素ストックは使用の前に20 mM TCEPを含有するバッファー中で活性化させた)、およびH₂O中に希釈した2 μM Z-FR-AMC。

【0105】

阻害率は、式:
[1-((UV_inh-UV_blank)/(UV_ctl-UV_blank))] x 100
を用いて算出した。

【0106】

非線形曲線の当てはめを阻害-濃度データに適用し、Excel XLfit ソフトウェアを用いて50％有効濃度(IC₅₀)を算出した。

【0107】

HCVレプリコンの産生
HCVレプリコン全細胞系（whole cell system）を、Lohmann V, Korner F, Koch J, Herian U, Theilmann L, Bartenschlager R., Science 285(5424):110-3 (1999)による記載のとおり確立した。この系により、本発明者は、HCV RNA複製における本発明のHCVプロテアーゼ化合物の効果を評価することができた。簡単に述べると、Lohmannの論文に記載されたHCV 株1b配列(受託番号:AJ238799)を用いて、HCV cDNAをOperon Technologies, Inc. (Alameda, CA)が合成し、次いで、完全長レプリコンを標準的な分子生物学的技法を用いてプラスミドpGem9zf(+)(Promega, Madison, WI)中に構築した。該レプリコンは、(i)カプシドタンパク質の最初の12個のアミノ酸に融合したHCV 5' UTR、(ii)ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子(neo)、(iii)脳心筋炎ウイルス(EMCV)からのIRES、ならびに(iv)HCV NS3からNS5B遺伝子およびHCV 3' UTRから成る。プラスミドDNAをScaIで直線化し、RNA転写物を、メーカーの説明書に従ってT7 MegaScript転写キット(Ambion, Austin, TX)を用いて、in vitroで合成した。cDNAのin vitro転写物を、ヒト肝癌細胞株であるHUH-7にトランスフェクトした。HCVレプリコンを恒常的に発現している細胞の選択を、選択マーカーであるネオマイシン(G418)の存在下において行った。得られた細胞株を、経時的な、プラス鎖およびマイナス鎖RNA生成ならびにタンパク質生成についてキャラクタライズした。

【0108】

HCVレプリコンFRETアッセイ
HCVレプリコンFRETアッセイを、HCVウイルス複製における本発明に記載の化合物の阻害効果をモニターするために開発した。HCVレプリコンを恒常的に発現するHUH-7細胞を、10％ウシ胎仔血清(FCS)(Sigma)および1 mg/ml G418(Gibco-BRL)を含有するダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)(Gibco-BRL)中で増殖させた。細胞を、前夜に、96-ウェル組織培養無菌プレート中に播種した(1.5 x 10⁴細胞/ウェル)。化合物、および化合物を含有しない対照を、希釈プレートにおいて、4％ FCS、1:100 ペニシリン/ストレプトマイシン(Gibco-BRL)、1:100 L-グルタミンおよび5％ DMSOを含有するDMEM中で調製した(アッセイにおいて0.5％ DMSO 最終濃度)。化合物/DMSO混合物を細胞に加え、37℃で4日間インキュベートした。4日後、CC₅₀読み取りのためにアラマーブルー(Trek Diagnotstic Systems)を用いて、初めに細胞毒性について細胞を評価した。細胞をインキュベートしている培地に1/10の容積のアラマーブルーを加えることにより、化合物の毒性(CC₅₀)を決定した。4時間後、Cytofluor Series 4000(Perspective Biosystems)を用いて、530 nmの励起波長および580 nmの発光波長で、各ウェルからの蛍光シグナルを読み取った。次いで、プレートをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(3回、150 μl)で完全にすすいだ。該細胞を、HCVプロテアーゼ基質、蒸留水で1倍に希釈した5X細胞ルシフェラーゼ細胞培養溶解試薬(Promega #E153A)、150 mMの最終濃度まで加えたNaCl、100％ DMSO中の2 mMストックから10 μMの最終濃度まで希釈したFRETペプチド基質(上記の酵素アッセイにおいて説明した通り)を含む、25 μlの溶解アッセイ試薬で溶解した。その後、該プレートを、340 nm励起/490 nm発光、21サイクルの自動モードに設定されたCytofluor 4000装置に設置し、プレートを運動モードで読み取った。IC₅₀決定について記載の通り、EC₅₀決定を行った。

【0109】

HCVレプリコンルシフェラーゼレポーターアッセイ
二次アッセイとして、レプリコンFRETアッセイからのEC₅₀決定を、レプリコンルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて確認した。レプリコンルシフェラーゼレポーターアッセイの利用は、Kriegerらによって最初に記載された(Krieger N, Lohmann V, and Bartenschlager R, J. Virol. 75(10):4614-4624 (2001))。本発明者らのFRETアッセイに記載のレプリコンコンストラクトを、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子のヒト化形態およびルシフェラーゼ遺伝子の3'-末端に直接融合しているリンカー配列をコードするcDNAを挿入することによって改変した。この挿入物は、ネオマイシンマーカー遺伝子の直接上流のコア中に位置するAsc1制限部位を用いて、レプリコンコンストラクトに導入された。1179位での適応的変異（セリンからイソロイシン）も導入した(Blight KJ, Kolykhalov, AA, Rice, CM, Science 290(5498):1972-1974)。このHCVレプリコンコンストラクトを恒常的に発現している安定な細胞株を、上記の通り産生した。ルシフェラーゼレポーターアッセイを、以下のとおり改変してHCVレプリコンFRETアッセイについての記載の通り設定した。37℃/5％ CO₂インキュベーター中で4日間の後、Promega Dual-Gloルシフェラーゼアッセイシステムを使用して、ウミシイタケルシフェラーゼ活性について細胞を分析した。細胞を含有する各ウェルから培地(100 μl)を除去した。残った50 μlの培地に、50 μlのDual-Gloルシフェラーゼ試薬を加え、プレートを室温で10分〜2時間揺動させた。次いで、Dual-Glo Stop ＆ Glo試薬(50 μl)を各ウェルに加え、プレートを室温でさらに10分〜2時間再び揺動させた。発光プログラムを用いて、Packard TopCount NXTにおいて、プレートを読み取った。

【0110】

阻害率を以下の式:
％対照＝ 実験ウェル（＋化合物）における平均ルシフェラーゼシグナル
ＤＭＳＯ対照ウェル（−化合物）における平均ルシフェラーゼシグナル
を用いて算出した。
XLfitを用いて値をグラフ化し、分析して、EC₅₀値を得た。

【0111】

本発明は前述の例示的な実施例に限定されず、そしてその本質的特性から逸脱することなく他の特定の形態において具体化することができることが当業者には明白であろう。従って該実施例は、あらゆる点で、制限するものではなく例示的なものとしてみなされ、そして、前述の実施例に対してよりはむしろ特許請求の範囲を参照すべきであり、従って、特許請求の範囲と同等の意味および範囲内となる全ての変更を包含すると意図することが望ましい。