特許 6113160 軟骨損傷を修復するために遺伝子改変を伴わずに細胞を再プログラミングするための組成物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6113160

(24)【登録日】2017年3月24日

(45)【発行日】2017年4月12日

(54)【発明の名称】軟骨損傷を修復するために遺伝子改変を伴わずに細胞を再プログラミングするための組成物および方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20170403BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20170403BHJP

   C12N 5/0735 20100101ALI20170403BHJP

   C12N 5/077 20100101ALI20170403BHJP

   C12N 5/0775 20100101ALI20170403BHJP

   C12N 5/0789 20100101ALI20170403BHJP

   C12N 1/14 20060101ALI20170403BHJP

   C12N 1/18 20060101ALI20170403BHJP

   C12N 1/20 20060101ALI20170403BHJP

   C07K 14/005 20060101ALI20170403BHJP

   C07K 14/195 20060101ALI20170403BHJP

   C07K 14/37 20060101ALI20170403BHJP

   C07K 14/435 20060101ALI20170403BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20170403BHJP

   A61K 38/00 20060101ALI20170403BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 A

   C12N5/10

   C12N5/0735

   C12N5/077

   C12N5/0775

   C12N5/0789

   C12N1/14ZNA

   C12N1/18

   C12N1/20 A

   C07K14/005

   C07K14/195

   C07K14/37

   C07K14/435

   A61K48/00

   A61K37/02

【請求項の数】27

【全頁数】43

(21)【出願番号】特願2014-521809(P2014-521809)

(86)(22)【出願日】2012年7月19日

(65)【公表番号】特表2014-525743(P2014-525743A)

(43)【公表日】2014年10月2日

(86)【国際出願番号】US2012047495

(87)【国際公開番号】WO2013013105

(87)【国際公開日】20130124

【審査請求日】2015年4月2日

(31)【優先権主張番号】61/509,114

(32)【優先日】2011年7月19日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】511153068

【氏名又は名称】ヴィヴォスクリプト，インコーポレイテッド

(73)【特許権者】

【識別番号】510139634

【氏名又は名称】オレゴン ヘルス アンド サイエンス ユニバーシティー

(74)【代理人】

【識別番号】230104019

【弁護士】

【氏名又は名称】大野 聖二

(74)【代理人】

【識別番号】230111590

【弁護士】

【氏名又は名称】金本 恵子

(74)【代理人】

【識別番号】100105991

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 玲子

(74)【代理人】

【識別番号】100119183

【弁理士】

【氏名又は名称】松任谷 優子

(74)【代理人】

【識別番号】100114465

【弁理士】

【氏名又は名称】北野 健

(74)【代理人】

【識別番号】100156915

【弁理士】

【氏名又は名称】伊藤 奈月

(74)【代理人】

【識別番号】100149076

【弁理士】

【氏名又は名称】梅田 慎介

(72)【発明者】

【氏名】ズー，ヨン

(72)【発明者】

【氏名】ウー，シリ

(72)【発明者】

【氏名】バオ，ジュン

(72)【発明者】

【氏名】チュー，コン−キ

【審査官】 大久保 智之

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１０／０７２４０６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１０／０７１２１０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Journal of Bone and Mineral Research，２００９年，24, 5，826-836

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００

Ｃ１２Ｎ １／００

Ｃ１２Ｎ ５／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

エフェクタードメインであるＳｏｘ９ならびにＳｏｘ９と少なくとも９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するその相同配列、ならびに形質導入ドメインを含有する、出発細胞を軟骨形成細胞へ再プログラミングするための形質導入可能物質。

【請求項2】

形質導入ドメインは、エフェクタードメインに、共有結合、非共有結合、またはリンカーを介して結合している、請求項１に記載の形質導入可能物質。

【請求項3】

形質導入ドメインは、タンパク質形質導入ドメイン、細胞侵入性ペプチド、細胞浸透性ペプチド、活性化可能細胞侵入性ペプチド、細胞標的化ペプチド、ポリマー、およびスーパーチャージタンパク質から成る群から選択される、請求項１に記載の形質導入可能物質。

【請求項4】

タンパク質形質導入ドメインは、ＴＡＴ、ポリアルギニン、ペネトラチン、アンテナペディア、ＶＰ２２、トランスポータン、ＭＡＰ、ＭＴＳ、ＰＥＰ−１、Ａｒｇ／Ｔｒｐ類似体、ＲＲＷＲＲＷＷＲＲＷＷＲＲＷ、ポリグアニジン・ペプトイド、ポリグアニジン・ペプトイド、本質的タンパク質形質導入ドメイン、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７、ＨＩＶ−１ Ｒｅｖ、フロックハウスウィルス外殻ペプチド、ＤＮＡ結合ペプチド、ｃ−Ｆｏｓ、ｃ−Ｊｕｎ、酵母ＧＣＮ４、融合性ＨＡ２ペプチドおよびスーパーチャージＧＦＰから成る群から選択される、請求項３に記載の形質導入可能物質。

【請求項5】

細胞標的化ペプチドは、ＮＧＲ、ＲＧＤ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドである、請求項３に記載の形質導入可能物質。

【請求項6】

ポリマーは、カチオン性脂質ポリマーおよびナノ粒子から成る群から選択される、請求項３に記載の形質導入可能物質。

【請求項7】

リンカーはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５のアミノ酸配列を有する、請求項２に記載の形質導入可能物質。

【請求項8】

タンパク質形質導入ドメインはポリアルギニンである、請求項３に記載の形質導入可能物質。

【請求項9】

更にエフェクタードメインまたは形質導入ドメインの機能を妨害しない１つまたはそれ以上のモチーフを含有する、請求項１に記載の形質導入可能物質。

【請求項10】

モチーフは、エフェクタードメインまたは形質導入ドメインに共有結合で連結されている、請求項９に記載の形質導入可能物質。

【請求項11】

モチーフはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９のアミノ酸配列を有する、請求項１０に記載の形質導入可能物質。

【請求項12】

生物体からの出発細胞を軟骨形成細胞へ再プログラミングする方法であって、
出発細胞を少なくとも１つの請求項１に記載の形質導入可能物質に暴露することを含む、上記方法。

【請求項13】

生物体は、微生物、植物、または動物である、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

出発細胞は、増殖、分化、分化転換、逆分化、決定転換、脱分化、アポトーシス、または形態形成を引き起こすよう再プログラミングされる、請求項１２に記載の方法。

【請求項15】

出発細胞が、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、ＭＳＣ、線維芽細胞、造血幹細胞、内皮幹細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞および内皮細胞から成る群から選択される、請求項１２に記載の方法。

【請求項16】

出発細胞が、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）またはＭＳＣである、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

形質導入可能物質は、Ｈｉｓ６−Ｓｏｘ９−１１Ｒ、ＨＡ２−スーパーチャージＧＦＰ−Ｓｏｘ９およびｓｃＧＦＲ−Ｓｏｘ９−１１Ｒから成る群から選択されるポリペプチドを含有する、請求項１５に記載の方法。

【請求項18】

請求項１に記載の形質導入可能物質を含有する医薬組成物。

【請求項19】

更にエピジェネティック剤を含有する、請求項１８に記載の医薬組成物。

【請求項20】

エピジェネティック剤は、トリコスタチンＡ、バルプロ酸、アザ−２’−デオキシシチジン、またはスベロイルアニリドヒドロキサム酸を含有する、請求項１９に記載の医薬組成物。

【請求項21】

生体サンプルおよび請求項１に記載の形質導入可能物質を含有する組成物であって、形質導入可能物質は生体サンプルに形質導入されている、上記組成物。

【請求項22】

生物体において軟骨損傷が関与する症状を治療するための医薬品の製造における、請求項１に記載の形質導入可能物質の使用。

【請求項23】

軟骨損傷が関与する症状が、関節障害、変形性関節症、軟骨傷害、外傷性断裂もしくは剥離、軟骨無形成症、肋軟骨炎、脊椎円板ヘルニア形成、再発性多発性軟骨炎、腫瘍、軟骨腫、軟骨肉腫または多形性腺腫である、請求項２２に記載の使用。

【請求項24】

ヒトを除く生物体の軟骨損傷が関与する疾病または症状の治療法であって、
生物体から生体サンプルを取り出し、
生体サンプルを請求項１に記載の形質導入可能物質に暴露し；そして
形質導入可能物質で形質導入された生体サンプルを生物体に再移植する、
ことを含む、上記方法。

【請求項25】

軟骨損傷が関与する疾病または症状のための細胞療法を開発する方法であって、
ｉＰＳＣ、胚性幹細胞、前駆細胞または分化した細胞を、請求項１に記載の少なくとも１種の形質導入可能物質に暴露することにより、ｉＰＳＣ、胚性幹細胞、前駆細胞または分化した細胞を移植可能な軟骨形成細胞に再プログラミングし、
移植可能な軟骨形成細胞を生体サンプルまたはヒトを除く生物体に移植し、そして
移植可能な軟骨形成細胞の治療効果を評価する、
ことを含む、上記方法。

【請求項26】

疾病モデルを開発する方法であって、
ｉＰＳＣ、胚性幹細胞、前駆細胞または分化した細胞を、請求項１に記載の少なくとも１種の形質導入可能物質に暴露して、移植可能な軟骨形成細胞へと再プログラミングし、
移植可能な軟骨形成細胞を生体サンプルまたはヒトを除く生物体に移植し、そして
移植可能な軟骨形成細胞を有する疾病モデルを開発する、
ことを含む、上記方法。

【請求項27】

薬物スクリーニングまたは毒性モデルを開発するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、
請求項１に記載の少なくとも１種の形質導入可能物質への暴露により、ｉＰＳＣ、胚性幹細胞、前駆細胞または分化した細胞を軟骨形成細胞に再プログラミングし、そして
軟骨形成細胞を用いて、異なる化合物の効果および／または毒性をスクリーニングする、
ことを含む、上記方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

優先権
本出願は、米国特許仮出願６１／５０９，１１４（２０１１年７月１９日出願）に基づく優先権を主張し、この出願はその全体が参照として本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

胚性幹細胞はヒト体内の多くのタイプの細胞に分化する能力を有する。体細胞の大部分は最終分化しており、他のタイプの体細胞に変化する能力を失っていると信じられていた。近年の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）および分化転換分野の進歩により、このパラダイムは変化した。ウィルスによる形質導入を介する４つの転写因子：Ｏｃｔ４（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、Ｓｏｘ２（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、Ｋｌｆ４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、およびｃＭｙｃ（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）の異所性発現によって、体細胞を人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に再プログラミングすることができる（Ｏｋｉｔａら，ｎａｔｕｒｅ ４４８，３１３−３１７（２００７）；ＴａｋａｈａｓｈｉおよびＹａｍａｎａｋａ，Ｃｅｌｌ １２６，６６３−６７６（２００６））。潜在的にリスクが低いｉＰＳＣを作製するための、多くの改変された遺伝学的手法が更に開発されたが、それらには、再プログラミング遺伝子を運搬するための非組み込み型アデノウィルス（Ｓｔａｄｔｆｅｌｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２２，９４５−９４９（２００８））、再プログラミング・プラスミドの一過性トランスフェクション（Ｏｋｉｔａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２２，９４９−９５３（２００８））、ｐｉｇｇｙＢａｃ転移システムおよびＣｒｅ切除可能ウィルス（Ｃｒｅ−ｅｘｃｉｓａｂｌｅ ｖｉｒｕｓｅｓ）（Ｓｏｌｄｎｅｒら，Ｃｅｌｌ １３６，９６４−９７７（２００９）；Ｗｏｌｔｊｅｎら，Ｎａｔｕｒｅ ４５８，７６６−７７０（２００９））がある。また、特定のタイプの細胞における内因性遺伝子発現を利用する戦略により、より簡易かつ／または少ない外因性遺伝子を必要とする再プログラミングも可能となった（Ａａｓｅｎら，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２６，１２７６−１２８４（２００８）；Ｋｉｍら，Ｎａｔｕｒｅ ４５４，６４６−６５０（２００８）；Ｓｈｉら，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２，５２５−５２８（２００８））。更に、再プログラミング効率を向上し，ある特定の再プログラミング因子の代替となる小分子が同定されている（Ｈｕａｎｇｆｕら，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２６，７９５−７９７（２００８）；Ｈｕａｎｇｆｕら，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２６，１２６９−１２７５（２００８）；Ｌｉら，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ４，１６−１９（２００９）；Ｓｈｉら，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ３，５６８−５７４（２００８）；Ｓｈｉら，Ｓｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２，５２５−５２８（２００８））。しかしながら、これまでの方法は全て、なおも遺伝物質の使用を伴い、これは、標的細胞における外因性配列に未知の、所望しない、あるいは有害なゲノム改変を導入し得る。さらに、これらの方法は、導入遺伝子の発現レベルにおける適切な制御を欠く。当該分野において、外因性遺伝物質に依存せずまたはこれを導入せずに細胞を再プログラミングすることが必要とされている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0003】

関節軟骨は、細胞密度が低く栄養補給が制限された、高度に組織化された組織である。外傷または変性関節症により損傷を受けると、関節軟骨は、限定的な再生能力しか持たない。最も一般的な関節障害である変形性関節症（ＯＡ）により、数百万人が、関節の激しい痛み、腫脹および音鳴り（ｃｌｉｃｋｉｎｇ）を包含する症状に苦しんでいる。軟骨を修復するための外科的方法が設計されて線維軟骨を生じ、これにより痛みを一時的に軽減することができたが、線維軟骨はずり応力に対する抵抗が低いため、これは長期的な解決ではない。その一方、硝子軟骨は、関節軟骨として可動関節に衝撃吸収および潤滑をもたらす。硝子軟骨の細胞外マトリックスは、ＩＩ、ＩＸおよびＸＩ型コラーゲン分子で構成されたコラーゲン細線維、プロテオグリカンおよび他のマトリックスタンパク質を含み、線維軟骨と比較して相当に耐久性がある。よって、軟骨傷害修復のゴールは、組織化された硝子軟骨を再生することである。線維軟骨ではなく硝子軟骨による軟骨損傷の治癒は、依然として困難な臨床課題である。

【0004】

マイクロフラクチャー（ｍｉｃｒｏｆｒａｃｔｕｒｅ）と称される外科手技の一つは、損傷軟骨の領域下部にある肋軟骨下骨髄空間に小さい孔を開ける。この操作は、欠損部位における出血を誘導し、血餅の形成を誘導する。血餅は、骨髄由来の多能性間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含有し、この細胞は軟骨芽細胞（ｃｏｎｄｒｏｂｌａｓｔｓ）および軟骨細胞（ｃｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ）への分化能を有する。しかしながら、他の外科手技と同様に、形成される軟骨は、線維軟骨性である。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本開示の一観点は、生体サンプルを軟骨形成サンプルに再プログラミングするための形質導入可能物質に関する。再プログラミングされた軟骨形成サンプルは、軟骨、好ましくは硝子軟骨を再生または産生することにより、軟骨傷害または損傷を修復することができる。形質導入可能物質は、生体サンプルに形質導入されると生体サンプルの再プログラミング変化を生じさせることができるエフェクタードメインを含む。ある特定の態様では、エフェクタードメインは、Ｓｏｘ９、Ｓｏｘ６、Ｓｏｘ５、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、Ｍｅｆ２Ｃ、Ｔｒｐｓ１、Ｇｌｉ３、Ｒｕｎｘ２、Ｄｌｘ５、Ｄｌｘ６、ＧＡＴＡ−６およびＢａｆ６０ｃならびにこれらの相同配列、ならびにこれらの任意の組み合わせから成る群から選択されるポリペプチドである。ある特定の態様では、エフェクタードメインは本質的に（ｉｎｈｅｒｅｎｔｌｙ）生体サンプルに形質導入される能力を有する。

【0006】

ある特定の態様では、形質導入可能物質は、エフェクタードメインと共有的または非共有的に会合または結合した形質導入ドメインを更に含む。ある特定の態様では、形質導入ドメインはリンカーを介してエフェクタードメインに共有結合で連結されている。

【0007】

ある特定の態様では、形質導入可能物質は、１つもしくはそれ以上の特定の生体サンプルに選択的に形質導入される能力を有するか、または特定の生体サンプル周辺環境において形質導入可能となる能力を有する。

【0008】

本開示の別の観点は生体サンプルおよび形質導入可能物質を含有する組成物に関し、ここで、形質導入可能物質は生体物質に形質導入されている。

【0009】

本開示の別の観点は、形質導入可能物質を含む組成物に生体サンプルを暴露することによって生体サンプルを軟骨形成サンプルへと再プログラミングする方法に関する。

【0010】

本開示の別の観点は、生物体において軟骨損傷が関与する疾病または症状の治療法に関し、該方法は、形質導入可能物質を含む医薬組成物を生物体に投与することを含む。

【0011】

本開示の別の観点は、軟骨損傷が関与する疾病または症状のための細胞療法を開発する方法に関し、該方法は、形質導入可能物質を用いてｉＰＳＣ、胚性幹細胞、前駆細胞または分化した細胞を移植可能な軟骨形成細胞へと再プログラミングする段階を含む。

【0012】

本開示の別の観点は、疾病モデルを開発する方法に関し、該方法は、形質導入可能物質を用いてｉＰＳＣ、胚性幹細胞、前駆細胞または分化した細胞を移植可能な軟骨形成細胞へと再プログラミングする段階を含む。

【0013】

本開示の別の観点は、エフェクタードメインを同定する方法に関し、該方法は、被験エフェクタードメインを形質導入ドメインに共有結合または非共有結合させて、被験形質導入可能分子を形成すること、被験分子を生体サンプルに暴露すること、および生体サンプルから軟骨形成サンプルへの再プログラミング・レベルを測定すること、を含む。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】形質導入可能物質のキャラクタリゼーション（Ｉ）。（Ａ）形質導入可能物質：Ｏｃｔ４−１１Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）、Ｓｏｘ２−１１Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）、Ｋｌｆ４−１１Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）、およびｃＭｙｃ−１１Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）のタンパク質発現ベクターの概略図。リンカー：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５；エフェクタードメイン：Ｏｃｔ４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、Ｓｏｘ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、Ｋｌｆ４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、またはｃＭｙｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）。（Ｂ）ウェスタンブロット分析で測定した、細胞培養条件下での４つの形質導入可能物質（Ｏｃｔ４−１１Ｒ、Ｓｏｘ２−１１Ｒ、Ｋｌｆ４−１１Ｒ、およびｃＭｙｃ−１１Ｒ）の安定性。（Ｃ）転写因子（ＴＦ）と融合したスーパーチャージ（ｓｕｐｅｒ−ｃｈａｒｇｅｄ）緑色蛍光タンパク質（ｓｃＧＦＰ）を含有する形質導入可能物質の概略図。

【図2】形質導入可能物質のキャラクタリゼーション（ＩＩ）。免疫細胞化学によって測定した、１１Ｒ標識した形質導入可能物質のＯＧ２−ＭＥＦ細胞へのタンパク質形質導入。Ｏｃｔ４：Ｏｃｔ４−１１Ｒを形質導入したＭＥＦ細胞（緑色）、Ｓｏｘ２：Ｓｏｘ２−１１Ｒを形質導入したＭＥＦ細胞（赤色）、Ｋｌｆ４：Ｋｌｆ４−１１Ｒを形質導入したＭＥＦ細胞（赤色）、およびｃＭｙｃ：ｃＭｙｃ−１１Ｒを形質導入したＭＥＦ細胞（緑色）。ＤＡＰＩ：ＤＡＰＩ染色で核を可視化した細胞（青色）。画像をマージさせた。

【図3】形質導入可能物質のキャラクタリゼーション（ＩＩＩ）。タンパク質誘導性幹細胞（ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ｐｉＰＳ細胞）はコロニーを形成して増殖し、既知組成培地中、支持細胞未含有条件下で自己複製した。

【図4】形質導入可能物質、Ｏｃｔ４−１１Ｒ、Ｓｏｘ２−１１Ｒ、Ｋｌｆ４−１１Ｒ、およびｃＭｙｃ−１１ＲによるｐｉＰＳ細胞の作製。（Ａ）ｐｉＰＳ細胞作製のタイムライン。（Ｂ）Ｏｃｔ４−ＧＦＰ⁺ ｐｉＰＳ細胞のコロニーは３０−３５日目に初めて観察された。位相：代表的な位相コントラスト画像、ＧＦＰ：蛍光画像。（Ｃ）Ｏｃｔ４−ＧＦＰ⁺ ｐｉＰＳ細胞は慣例的なｍＥＳＣ培養条件下で長期にわたって自己複製を保持した。（Ｄ）長期間増殖させたｐｉＰＳ細胞は、緻密なドーム型のコロニーを形成し、典型的な多能性マーカーであるＡＬＰを強く発現した。（Ｅ）免疫蛍光による測定で、ｐｉＰＳ細胞は他の典型的な多能性マーカーを発現した：ＳＥＡ−１（赤色）、Ｓｏｘ２（赤色）、Ｏｃｔ４（赤色）、およびＮａｎｏｇ（赤色）。ＤＡＰＩ：ＤＡＰＩ染色によって可視化した核（青色）画像をマージさせた。（Ｆ）ｐｉＰＳ細胞における内因性多能性遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。（Ｇ）亜硫酸水素ゲノムシークエンシングによるＯｃｔ４プロモーターのメチル化分析。○（白丸）および●（黒丸）はそれぞれ、非メチル化およびメチル化ＣｐＧを表す。

【図5】インビトロおよびインビボにおけるｐｉＰＳ細胞の多能性（Ｉ）。ｐｉＰＳ細胞はインビトロにおいて、３つの胚葉で効率的に細胞に分化した。Ｔｕｊ１：特徴的なＴＵＪ１⁺神経細胞−外胚葉（赤色）；Ｂｒｙｔ：ブラキュリ⁺中胚葉細胞（赤色）；およびＳｏｘ１７：最終的なＳｏｘ１７⁺内胚葉細胞（Ｓｏｘ１７⁺ ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ ｅｎｄｏｄｅｒｍ ｃｅｌｌｓ）。画像をＤＡＰＩ染色（青色）とマージさせた。

【図6】インビトロおよびインビボにおけるｐｉＰＳ細胞の多能性（ＩＩ）。（Ａ）インビトロにおけるｐｉＰＳ細胞分化のＲＴ−ＰＣＲ分析。（Ｂ）ｐｉＰＳ細胞と凝集させた胚を偽妊娠マウスに移植した後、キメラ胚（１３．５ ｄｐｃ、７検体中２検体、左（ｌｅｆｔ））を得た（上段）。それらのｐｉＰＳ細胞は、キメラ胚から単離した生殖隆起組織において生殖細胞に寄与した（Ｏｃｔ４−ＧＦＰ陽性）（下段）。

【図7】形質導入可能物質のタンパク質発現ベクターの概略図。Ｈｉｓ６：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９；エフェクタードメイン：Ｎｇｎ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）、ＰＤＸ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）、ＭａｆＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）、またはＦｏｘｐ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）；リンカー：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５。

【図8】マウスにおける形質導入可能物質、Ｈｉｓ６−Ｎｇｎ３−１１Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）、Ｈｉｓ６−ＰＤＸ１−１１Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）、およびＨｉｓ６−ＭａｆＡ−１１Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）による肝および膵外分泌細胞のインスリン産生β細胞への再プログラミング（Ｉ）。マウス−１、マウス−２、およびマウス−３はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）タンパク質で処理した（コントロール群）。マウス−４、マウス−５、およびマウス−６はＨｉｓ６−Ｎｇｎ３−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−ＰＤＸ１−１１Ｒ、およびＨｉｓ６−ＭａｆＡ−１１Ｒで処理した（処理群）。Ａ）マウス−１の肝臓の免疫蛍光分析（ＩＦＡ）；Ｂ）マウス−２の肝臓のＩＦＡ；およびＣ）マウス−３の肝臓のＩＦＡ。

【図9】マウスにおける形質導入可能物質、Ｈｉｓ６−Ｎｇｎ３−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−ＰＤＸ１−１１Ｒ、およびＨｉｓ６−ＭａｆＡ−１１Ｒによる肝および膵外分泌細胞のインスリン産生β細胞への再プログラミング（ＩＩ）。マウス−１、マウス−２、およびマウス−３はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）タンパク質で処理した（コントロール群）。マウス−４、マウス−５、およびマウス−６はＨｉｓ６−Ｎｇｎ３−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−ＰＤＸ１−１１Ｒ、およびＨｉｓ６−ＭａｆＡ−１１Ｒで処理した（処理群）。Ａ）マウス−４の肝臓のＩＦＡ（１）；Ｂ）マウス−４の肝臓のＩＦＡ（２）；Ｃ）マウス−５の肝臓のＩＦＡ（１）；Ｄ）マウス−５の肝臓のＩＦＡ（２）；Ｅ）マウス−６の肝臓のＩＦＡ（１）；Ｆ）マウス−６の肝臓のＩＦＡ（２）。

【図10】マウスにおける形質導入可能物質、Ｈｉｓ６−Ｎｇｎ３−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−ＰＤＸ１−１１Ｒ、およびＨｉｓ６−ＭａｆＡ−１１Ｒによる肝および膵外分泌細胞のインスリン産生β細胞への再プログラミング（ＩＩＩ）。マウス−１、マウス−２、およびマウス−３はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）タンパク質で処理した（コントロール群）。マウス−４、マウス−５、およびマウス−６はＨｉｓ６−Ｎｇｎ３−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−ＰＤＸ１−１１Ｒ、およびＨｉｓ６−ＭａｆＡ−１１Ｒで処理した（処理群）。Ａ）マウス−１の膵臓のＩＦＡ；Ｂ）マウス−２の膵臓のＩＦＡ（１）；Ｃ）マウス−２の膵臓のＩＦＡ（２）；Ｄ）マウス−３の膵臓のＩＦＡ。

【図11】マウスにおける形質導入可能物質、Ｈｉｓ６−Ｎｇｎ３−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−ＰＤＸ１−１１Ｒ、およびＨｉｓ６−ＭａｆＡ−１１Ｒによる肝および膵外分泌細胞のインスリン産生β細胞への再プログラミング（ＩＶ）。マウス−１、マウス−２、およびマウス−３はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）タンパク質で処理した（コントロール群）。マウス−４、マウス−５、およびマウス−６はＨｉｓ６−Ｎｇｎ３−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−ＰＤＸ１−１１Ｒ、およびＨｉｓ６−ＭａｆＡ−１１Ｒで処理した（処理群）。Ａ）マウス−４の膵臓のＩＦＡ（１）；Ｂ）マウス−４の膵臓のＩＦＡ（２）；Ｃ）マウス−５の膵臓のＩＦＡ（１）；Ｄ）マウス−５の膵臓のＩＦＡ（２）；Ｅ）マウス−６の膵臓のＩＦＡ。

【図12】形質導入可能物質、Ｈｉｓ６−Ｆｏｘｐ３−１１Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）によるＴ細胞のＴｒｅｇ細胞への再プログラミング（ＩＡ）。ＣＤ１４単球未含有でのＰＢＭＣにおけるＣＤ４およびＣＤ２５タンパク質発現のフローサイトメトリー分析：アイソタイプ・コントロール、ＰＢＳコントロール、サンプルバッファー・コントロール、およびタンパク質（ＢＳＡ １００μｇ／ｍｌ）コントロール。

【図13】形質導入可能物質、Ｈｉｓ６−Ｆｏｘｐ３−１１ＲによるＴ細胞のＴｒｅｇ細胞への再プログラミング（ＩＢ）。Ｈｉｓ１６−Ｆｏｘｐ３−１１Ｒ（１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、または５０μｇ／ｍｌ）で処理したＣＤ１４単球未含有でのＰＢＭＣにおけるＣＤ４およびＣＤ２５タンパク質発現のフローサイトメトリー分析。

【図14】形質導入可能物質、Ｈｉｓ６−Ｆｏｘｐ３−１１ＲによるＴ細胞のＴｒｅｇ細胞への再プログラミング（ＩＩＡ）。ＰＢＭＣにおけるＣＤ４およびＣＤ２５タンパク質発現のフローサイトメトリー分析：アイソタイプ・コントロールおよびＰＢＳコントロール。

【図15】形質導入可能物質、Ｈｉｓ６−Ｆｏｘｐ３−１１ＲによるＴ細胞のＴｒｅｇ細胞への再プログラミング（ＩＩＢ）。ＰＢＭＣにおけるＣＤ４およびＣＤ２５タンパク質発現のフローサイトメトリー分析：サンプルバッファー・コントロールおよびタンパク質（ＢＳＡ １００μｇ／ｍｌ）コントロール。

【図16】形質導入可能物質、Ｈｉｓ６−Ｆｏｘｐ３−１１ＲによるＴ細胞のＴｒｅｇ細胞への再プログラミング（ＩＩＣ）。Ｈｉｓ１６−Ｆｏｘｐ３−１１Ｒ（１０μｇ／ｍｌまたは５０μｇ／ｍｌ）で処理したＰＢＭＣにおけるＣＤ４およびＣＤ２５タンパク質発現のフローサイトメトリー分析。

【図17】形質導入可能物質、Ｈｉｓ６−Ｆｏｘｐ３−１１ＲによるＴ細胞のＴｒｅｇ細胞への再プログラミング（ＩＩＤ）。Ｈｉｓ１６−Ｆｏｘｐ３−１１Ｒ（１００μｇ／ｍｌ）で処理したＰＢＭＣにおけるＣＤ４およびＣＤ２５タンパク質発現のフローサイトメトリー分析。

【図18-1】Ｆｏｘｏ１およびＦｏｘｏ３の例示的なエフェクタードメインの配列。

【図18-2】Ｆｏｘｏ１およびＦｏｘｏ３の例示的なエフェクタードメインの配列。

【図19-1】例示的なエフェクタードメインの配列。

【図19-2】例示的なエフェクタードメインの配列。

【図19-3】例示的なエフェクタードメインの配列。

【図19-4】例示的なエフェクタードメインの配列。

【図20-1】例示的な形質導入可能物質の配列：エフェクタードメイン−１１Ｒ。

【図20-2】例示的な形質導入可能物質の配列：エフェクタードメイン−１１Ｒ。

【図20-3】例示的な形質導入可能物質の配列：エフェクタードメイン−１１Ｒ。

【図20-4】例示的な形質導入可能物質の配列：エフェクタードメイン−１１Ｒ。

【図21-1】例示的な形質導入可能物質の配列：Ｈｉｓ６−エフェクタードメイン−１１Ｒ。

【図21-2】例示的な形質導入可能物質の配列：Ｈｉｓ６−エフェクタードメイン−１１Ｒ。

【図21-3】例示的な形質導入可能物質の配列：Ｈｉｓ６−エフェクタードメイン−１１Ｒ。

【図21-4】例示的な形質導入可能物質の配列：Ｈｉｓ６−エフェクタードメイン−１１Ｒ。

【図22-1】例示的な形質導入可能物質の配列：ＨＡ２−スーパーチャージＧＦＰ−エフェクタードメイン（ａ〜ｍ）およびｓｃＧＦＰ−Ｓｏｘ９−１１Ｒ（ｎ）。

【図22-2】例示的な形質導入可能物質の配列：ＨＡ２−スーパーチャージＧＦＰ−エフェクタードメイン（ａ〜ｍ）およびｓｃＧＦＰ−Ｓｏｘ９−１１Ｒ（ｎ）。

【図22-3】例示的な形質導入可能物質の配列：ＨＡ２−スーパーチャージＧＦＰ−エフェクタードメイン（ａ〜ｍ）およびｓｃＧＦＰ−Ｓｏｘ９−１１Ｒ（ｎ）。

【図22-4】例示的な形質導入可能物質の配列：ＨＡ２−スーパーチャージＧＦＰ−エフェクタードメイン（ａ〜ｍ）およびｓｃＧＦＰ−Ｓｏｘ９−１１Ｒ（ｎ）。

【図22-5】例示的な形質導入可能物質の配列：ＨＡ２−スーパーチャージＧＦＰ−エフェクタードメイン（ａ〜ｍ）およびｓｃＧＦＰ−Ｓｏｘ９−１１Ｒ（ｎ）。

【図22-6】例示的な形質導入可能物質の配列：ＨＡ２−スーパーチャージＧＦＰ−エフェクタードメイン（ａ〜ｍ）およびｓｃＧＦＰ−Ｓｏｘ９−１１Ｒ（ｎ）。

【図23】ヒト皮膚線維芽細胞の細胞株（ＨＨＦ、ＡおよびＢ）およびヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ、ＣおよびＤ）へのｓｃＳｏｘ９タンパク質の浸透。１０μｇ／ｍｌのスーパーチャージ緑色蛍光タンパク質（ｓｃＧＦＰ、ＡおよびＣ）または組換えＳｏｘ９−ｓｃＧＦＰ融合タンパク質（ｓｃＳｏｘ９、ＢおよびＤ）と共に細胞をインキュベートした。

【図24】ｓｃＳｏｘ９は、ＭＳＣの増殖増加を誘導した。ｓｃＳｏｘ９またはバッファーのみを添加した、１０％ＦＢＳおよび低グルコース（１．５ｇ／ｌ）を含有するＤＭＥＭにおいてＭＳＣを４８時間培養した。

【図25】バッファーで処理したＭＳＣ（Ａ）の陰性トルイジンブルー染色とは対照的な、ｓｃＳｏｘ９で処理した３日目のＭＳＣ（Ｂ）およびｓｃＳｏｘ９で処理した１４日目のＭＳＣ（Ｃ）の陽性トルイジンブルー染色により示される通り、ｓｃＳｏｘ９は、アグリカン発現および軟骨形成を誘導した。

【図26】ｓｃＧＦＰで処理したＭＳＣ（ＡおよびＣ）の陰性染色とは対照的な、ｓｃＳｏｘ９で処理したＭＳＣ（ＢおよびＤ）の陽性コラーゲンＩＩ型モノクローナル抗体（免疫ペルオキシダーゼ）染色により示される通り、ｓｃＳｏｘ９は、コラーゲンＩＩ型発現を誘導した。

【図27】ｓｃＳｏｘ９は、コラーゲンＩＩ型増加を誘導したが、コラーゲンＩ型およびＸ型発現減少を誘導した。表示の時点において、バッファーのみまたは１０μｇ／ｍｌのｓｃＳｏｘ９で処理したＭＳＣからＲＮＡを抽出し、コラーゲン（Ｃｏｌ）Ｉ、ＩＩおよびＸ型のｍＲＮＡ発現のためのＲＴ−ＰＣＲを行った。ＧＡＰＤＨと相対的な発現で表す。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本開示の一観点は、生体サンプルを軟骨形成サンプルに再プログラミングするための形質導入可能物質に関する。再プログラミングされた軟骨形成サンプルは、軟骨、好ましくは硝子軟骨を再生または産生することにより、軟骨傷害または損傷を修復することができる。形質導入可能物質は、エフェクタードメインを含む。

【0016】

ある特定の態様では、本明細書で使用する形質導入可能物質は、ＤＮＡまたはＤＮＡから誘導されたものではないが、生体サンプルの膜（例えば細胞膜）を通過するか、膜を通じて形質導入するか、または膜を通過させられることが可能な物質または分子であり、これによって形質導入可能物質が生体サンプルの外部から生体サンプルの内部に侵入または移動し、再プログラミングを生じさせる。例えば、形質導入可能物質は、受容体介在型エンドサイトーシスによって細胞への物質の侵入を促進する細胞表面受容体と相互作用してもよい。

【0017】

ある特定の態様では、形質導入可能物質は、他の生体サンプルに比較して特定のタイプの生体サンプル（例えば癌または腫瘍細胞）に形質導入される可能性が高い、または生体サンプル中もしくはその周辺の特定の微小環境（例えば癌または腫瘍周辺の微小環境）において形質導入可能となる。例えば、選択的形質導入可能物質は、好ましくは選択的形質導入可能物質を特定のタイプの生体サンプル中に運搬する、または生体サンプル周辺の微小環境において形質導入可能となる形質導入ドメイン（例えば細胞標的化ペプチドまたは活性化可能な細胞侵入性（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ）ペプチド）を含有する。

【0018】

いかなる理論にも拘束されることはないが、形質導入可能物質は細胞膜を通過し、細胞質に入り込み、細胞質活性（例えば翻訳、翻訳後修飾、シグナル伝達経路、またはアポトーシス経路）を再プログラミングしうると考えられる。更に、形質導入可能物質は核膜を通過し、ＤＮＡまたは染色体複製、遺伝子転写、およびＲＮＡスプライシングを再プログラミングまたは調節しうると考えられる。

【0019】

エフェクタードメインは、生体サンプル内部に入ると生体サンプルの再プログラミングを変更する能力を有するモチーフまたは分子である。エフェクタードメインは生体サンプル中（例えば細胞質または核中）で分子（例えばタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、および脂質）と相互作用し、増殖、分化、脱分化、分化転換、逆分化、決定転換、アポトーシス、および形態形成のような変化を起こしうる。エフェクタードメインは以下であってもよい：１）ポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは模倣物；２）生体サンプルのゲノム中に形質導入もしくは導入されると遺伝子を発現できない、または遺伝子修飾を起こせないが、生体サンプル中の分子と相互作用するポリヌクレオチド（例えばリボザイム、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ、オリゴヌクレオチドなど）；および３）小分子または他の化学物質（例えば化学療法薬）。

【0020】

ある特定の態様では、エフェクタードメインは本質的に形質導入可能である（例えばＰＤＸ１（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）およびＮｅｕｒｏＤ（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７））。

【0021】

エフェクタードメインの一例は、転写因子、染色体再構築タンパク質、抗体またはこれらのフラグメントもしくは模倣物など、ポリペプチドの一部または全体である。エフェクタードメインの別の例は、ポリマーではなく、生体ポリマー（例えばタンパク質、核酸、または多糖）と結合し、その生体ポリマーの活性または機能を改変する小分子である。小分子の例には、限定される訳ではないがアセチル化阻害剤、転写活性化剤、シグナル経路活性化剤、シグナル経路阻害剤およびメチル化阻害剤がある。

【0022】

別の態様では、エフェクタードメインは、体細胞または幹細胞を軟骨形成細胞に再プログラミングさせる、体細胞を幹細胞に再プログラミングさせる、あるいは細胞をある状態から別の状態へと変化させる少なくとも１種のポリペプチドとなり得る。例えばエフェクタードメインは以下であってもよい：１）Ｋｌｆ４（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、Ｓｏｘ２（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、Ｌｉｎ２８（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、Ｏｃｔ４（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、ｃＭｙｃ（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、Ｎａｎｏｇ（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）、およびそれらを任意に組み合わせたものから成る群から選択されるポリペプチド；２）Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、ｃＭｙｃ、およびそれらを任意に組み合わせたものから成る群から選択されるポリペプチド；３）Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、Ｌｉｎ２８、Ｎａｎｏｇ、およびそれらを任意に組み合わせたものから成る群から選択されるポリペプチド；４）Ｎｇｎ３（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）、ＰＤＸ１（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）、ＭａｆＡ（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）、ＮｅｕｒｏＤ（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、およびそれらを任意に組み合わせたものから成る群から選択されるポリペプチド；５）Ｆｏｘｐ３（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）、Ｆｏｘｏ１（例えば図１８ａ）およびＦｏｘｏ３（例えば図１８ｂ）を含有するポリペプチド；６）Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｌｉｎ２８、Ｎａｎｏｇ、ｃＭｙｃ、Ｎｇｎ３、ＰＤＸ１、ＭａｆＡ、ＮｅｕｒｏＤ、Ｆｏｘｐ３、Ｆｏｘｏ１およびＦｏｘｏ３、ならびにそれらを任意に組み合わせたものから成る群から選択されるポリペプチド；７）ポリペプチドＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃＭｙｃを組み合わせたもの；および８）ポリペプチドＮｇｎ３、ＰＤＸ１、およびＭａｆＡを組み合わせたもの；９）Ｓｏｘ９、Ｓｏｘ６、Ｓｏｘ５、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、Ｍｅｆ２Ｃ、Ｔｒｐｓ１、Ｇｌｉ３、Ｒｕｎｘ２、Ｄｌｘ５、Ｄｌｘ６、ＧＡＴＡ−６およびＢａｆ６０ｃから成る群から選択されるポリペプチド；１０）Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｌｉｎ２８、Ｎａｎｏｇ、ｃＭｙｃ、Ｎｇｎ３、ＰＤＸ１、ＭａｆＡ、ＮｅｕｒｏＤ、Ｆｏｘｐ３、Ｆｏｘｏ１、Ｆｏｘｏ２、Ｓｏｘ９、Ｓｏｘ６、Ｓｏｘ５、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、Ｍｅｆ２Ｃ、Ｔｒｐｓ１、Ｇｌｉ３、Ｒｕｎｘ２、Ｄｌｘ５、Ｄｌｘ６、ＧＡＴＡ−６およびＢａｆ６０ｃ、ならびにそれらを任意に組み合わせたものから成る群から選択されるポリペプチド；および１１）Ｓｏｘ９、Ｓｏｘ６、Ｓｏｘ５、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、Ｍｅｆ２Ｃ、Ｔｒｐｓ１、Ｇｌｉ３、Ｒｕｎｘ２、Ｄｌｘ５、Ｄｌｘ６、ＧＡＴＡ−６およびＢａｆ６０ｃ、ならびにそれらを任意に組み合わせたものから成る群から選択される第１のポリペプチド；ならびにＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｌｉｎ２８、Ｎａｎｏｇ、ｃＭｙｃ、Ｎｇｎ３、ＰＤＸ１、ＭａｆＡ、ＮｅｕｒｏＤ、Ｆｏｘｐ３、Ｆｏｘｏ１およびＦｏｘｏ３から成る群から選択される第２のポリペプチド。

【0023】

【表1】

【0024】

本発明により提供されるポリペプチドは、その相同配列も包含する。本明細書において用いる場合、“相同配列”とは、相同な参照ポリペプチドと十分な割合のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを表す。ある特定の態様では、相同配列は、本発明により提供されるエフェクタードメインとして有用なポリペプチドの１つと、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する。相同配列を有するポリペプチドは、本明細書に開示されるエフェクタードメインと実質的に同じ活性を有する。

【0025】

アミノ酸配列の同一性は、配列をアライメントした後に、そして必要な場合にはギャップを導入して同一のアミノ酸の数を最大とした後に、候補アミノ酸配列中の、参照アミノ酸配列中のアミノ酸残基と同一のアミノ酸残基のパーセンテージとして決定することができる。アミノ酸残基の保存的置換は、同一の残基と見なしてもよく、見なさなくてもよい。本明細書において用いる場合、“保存的置換”とは、アミノ酸残基を類似の生理化学的特性（例えば、疎水性および側鎖分子のかさ）を有する他のアミノ酸残基で置き換えることを表す。

【0026】

アミノ酸配列同一性のパーセンテージを決定する目的のためのアライメントは、当該技術分野において知られる種々の方法により行うことができる。例えば、アミノ酸配列のアライメントは、公共利用可能なツール、例えば、ＢＬＡＳＴｐ（Ｕ．Ｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のウエブサイトから利用可能：ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０）；Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ．ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２（１９９７）も参照）、ＣｌｕｓｔａｌＷ２（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのウエブサイトから利用可能：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｗ２／，Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｄ．Ｇ．ｅｔ ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６：３８３−４０２（１９９６）；Ｌａｒｋｉｎ Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ），２３（２１）：２９４７−８（２００７）も参照）、および ＴＣｏｆｆｅｅ（ Ｓｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓのウエブサイトから利用可能、Ｐｏｉｒｏｔ Ｏ．ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３１（１３）：３５０３−６（２００３）；Ｎｏｔｒｅｄａｍｅ Ｃ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｏｉｌ．，３０２（１）：２０５−１７（２０００）も参照）を用いて行うことができる。当業者は、そのツールで提供されるデフォルトのパラメータを用いてもよく、例えば適当なアルゴリズムを選択することによりアライメントに適したようにパラメータをカスタマイズしてもよい。

【0027】

本発明により提供されるポリペプチドは、更にその機能的同等物も包含する。本明細書において用いる場合、“機能的同等物”とは、親ポリペプチドの全部または一部と実質的に類似する機能的または構造的特徴を有するポリペプチドを表す。本発明において提供されるポリペプチドは、実質的に類似する機能を発揮できる、すなわち体細胞を再プログラミングさせて幹細胞とするかまたは１つの細胞状態を別の細胞状態に変化させることができるその機能的同等物を包含する。本発明により提供されるポリペプチド（すなわち、親ポリペプチド）の機能的同等物は、親ポリペプチドのフラグメント、変異体、誘導体、バリアント、または類似体であることができ、化学的または生物学的改変を含んでいてもよい。機能的同等物は、親ポリペプチドの１つまたはそれ以上のアミノ酸置換、付加、欠失、挿入、転移、修飾（例えばリン酸化、グリコシル化、標識化等）またはそれらを任意に組み合わせたものを有していてもよい。機能的同等物には、親ポリペプチドの天然に生ずるバリアントおよび組換え法または化学合成により得られるもの等の人工的ポリペプチド配列も含まれる。機能的同等物は、天然に生じないアミノ酸残基を含んでいてもよい。

【0028】

ある特定の態様では、形質導入可能物質は形質導入ドメインを更に含有する。形質導入ドメインは、形質導入可能物質の生体サンプル（例えば細胞）への侵入を促進する能力があるモチーフである。形質導入可能ドメインはエフェクタードメインと共有結合、非共有結合、またはリンカーを介して結合している。ある特定の態様では、形質導入ドメインはリンカーを介してエフェクタードメインに共有結合している。ある特定の態様では、リンカーは、１つまたはそれ以上のグリシン残基を含有するグリシン・リッチ・リンカーである（例えばｅｓｇｇｇｇｓｐｇ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５））。

【0029】

形質導入ドメインの例には、限定されるわけではないが以下がある：ポリマー（例えばカチオン性脂質ポリマーおよびナノ粒子）、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）、細胞侵入性（ｃｅｌｌ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ）ペプチド（ＣＰＰ１）、細胞浸透性（ｃｅｌｌ ｐｅｒｍｅａｔｉｎｇ）ペプチド（ＣＰＰ２）、活性化可能細胞侵入性ペプチドまたはコンジュゲート（ＡＣＰＰ）、細胞標的化ペプチド（ＣＴＰ）、およびスーパーチャージタンパク質。

【0030】

ＣＰＰ１、ＣＰＰ２、ＰＴＤおよびスーパーチャージタンパク質は、それと結合するカーゴ分子の細胞への運搬を促進することが知られているペプチドである。ＣＰＰ１、ＣＰＰ２、ＰＴＤまたはスーパーチャージタンパク質とカーゴ分子との結合は共有結合または非共有結合的相互作用であってもよい。カーゴ分子は小化学分子、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡフラグメント、ＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ）またはナノ粒子であってもよい。例えば、ＣＰＰ１およびＰＴＤは、表面輸送体および細胞周期に依存せずに細胞に侵入する能力を有する５から２０個のアミノ酸ペプチド・モチーフを含有する。また、ＣＰＰ１およびＰＴＤは血液脳関門を通過する能力も有する。ＣＰＰ１およびＰＴＤはインビトロおよびインビボで、非経口投与後、タンパク質およびペプチドを生体全体に均一に運搬する。カチオン性ＰＴＤは核局在化シグナルとして作用し、結合する分子カーゴを細胞核に運搬する。タンパク質形質導入ドメインの例には、それに制限されるわけではないが以下がある：ＴＡＴ（例えばＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）、ポリアルギニン（例えば７−１１個のアルギニン残基を有するポリアルギニン（ＲＲＲＲＲＲＲ、ＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）およびＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）など））、ペネトラチン（アンテナペディア、例えばＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８））、ＶＰ２２（例えばＤＡＡＴＡＴＲＧＲＳＡＡＳＲＰＴＱＲＰＲＡＰＡＲＳＡＳＲＰＲＲＰＶＱ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９））、トランスポータン（例えばＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０））、ＭＡＰ（例えばＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１））、ＭＴＳ（例えばＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２））、ＰＥＰ−１（例えばＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３））、Ａｒｇ／Ｔｒｐ類似体（例えばＲＲＷＲＲＷＷＲＲＷＷＲＲＷ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４））、ポリグアニジン・ペプトイド（例えば、バックボーンとグアニジン基の間に６−メチレン・スペーサーを有するポリグアニジン・ペプトイド（Ｎ−ａｒｇ ５、７、または９ペプトイド））、本質的（ｉｎｈｅｒｅｎｔ）タンパク質形質導入ドメイン、（例えばＲＨＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６）、ＫＰＫＲＲＧＰＫＫＫＫＭＴＫＡＲＬＥＲＦＫＬＲＲＭＫＡＮＡＲＥＲＮＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７）、ＨＩＶ−１ Ｒｅｖ（例えばＴＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲＥＲＱＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０））、フロックハウスウィルス外殻ペプチド（例えばＲＲＲＲＮＲＴＲＲＮＲＲＲＶＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１））、ＤＮＡ結合ペプチド、例えばｃ−Ｆｏｓ（例えばＫＲＲＩＲＲＥＲＮＫＭＡＡＡＫＳＲＮＲＲＲＥＬＴＤＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２））、ｃ−Ｊｕｎ（例えばＲＩＫＡＥＲＫＲＭＲＮＲＩＡＡＳＫＳＲＫＲＫＬＥＲＩＡＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３））、酵母ＧＣＮ４（例えばＫＲＡＲＮＴＥＡＡＲＲＳＲＡＲＫＬＱＲＭＫＱ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４））、融合性ＨＡ２ペプチド（例えばＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５）、ＧＤＩＭＧＥＷＧＮＥＩＦＧＡＩＡＧＦＬＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６））。

【0031】

スーパーチャージタンパク質は、改変していない形のタンパク質と比較して増加したまたは減少した総正味電荷（正味正電荷でも正味負電荷でもよい）を有するよう改変されたペプチドまたはタンパク質であることができる。ある特定の態様では、総正味正電荷を有する超正電荷タンパク質を形質導入ドメインとして用いることができる。スーパーチャージタンパク質の例としては、限定されないが、スーパーチャージＧＦＰ（例えばＡＳＫＧＥＲＬＦＲＧＫＶＰＩＬＶＥＬＫＧＤＶＮＧＨＫＦＳＶＲＧＫＧＫＧＤＡＴＲＧＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴＧＫＬＰＶＰＷＰＴＬＶＴＴＬＴＹＧＶＱＣＦＳＲＹＰＫＨＭＫＲＨＤＦＦＫＳＡＭＰＫＧＹＶＱＥＲＴＩＳＦＫＫＤＧＫＹＫＴＲＡＥＶＫＦＥＧＲＴＬＶＮＲＩＫＬＫＧＲＤＦＫＥＫＧＮＩＬＧＨＫＬＲＹＮＦＮＳＨＫＶＹＩＴＡＤＫＲＫＮＧＩＫＡＫＦＫＩＲＨＮＶＫＤＧＳＶＱＬＡＤＨＹＱＱＮＴＰＩＧＲＧＰＶＬＬＰＲＮＨＹＬＳＴＲＳＫＬＳＫＤＰＫＥＫＲＤＨＭＶＬＬＥＦＶＴＡＡＧＩＫＨＧＲＤＥＲＹＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７））、および米国特許出願ＵＳ２０１１０１１２０４０（その全体が本明細書に参照として組み込まれる）に開示される他のスーパーチャージタンパク質が挙げられる。また、天然に生ずるスーパーチャージタンパク質、例えばＨＢＥＧＦ（受託番号Ｑ９９０７５）、Ｎ−ＤＥＫ（受託番号Ｐ３５６５９）、Ｃ−ｊｕｎ（受託番号Ｐ０５４１２）、およびＨＧＦ（受託番号Ｐ１４２１０）、ならびに米国特許出願ＵＳ２０１１０１１２０４０（その全体が本明細書に参照として組み込まれる）に開示される他の天然のスーパーチャージタンパク質も用いることができる。

【0032】

細胞標的化ペプチドは細胞表面受容体に結合するタンパク質またはペプチドであり、エンドサイトーシスによって細胞に侵入する。ある特定の態様では、細胞標的化ペプチドは特定の組織または細胞タイプを標的とし、例えばＧｎＲＨペプチド（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８）はＧｎＲＨ受容体を発現する生体サンプル（例えば固形腫瘍およびホルモン応答性癌細胞系）を標的とする。細胞標的化ペプチドおよび標的とされる特定の生体サンプルの更なる例を表２に示す。

【0033】

【表2】

【0034】

活性化可能細胞侵入性ペプチドまたはコンジュゲート（ＡＣＰＰ）はカチオン性ＣＰＰ１、ＣＰＰ２、ＰＴＤまたはスーパーチャージタンパク質、およびそれを中和するアニオン性カウンターパートを含有する。ある特定の態様では、カチオン性ＣＰＰ１、ＣＰＰ２、ＰＴＤまたはスーパーチャージタンパク質、およびアニオン性カウンターパートは非共有結合性相互作用（例えば電荷−電荷相互作用）および／または共有結合性開裂可能リンカー（例えばマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）開裂可能配列）を介して結合している。細胞へのＡＣＰＰの形質導入は、非共有結合性相互作用が崩壊されるまで、そして／または開裂可能リンカーが開裂されるまで阻害される。例えば、いかなる理論にも拘束されることはないが、アニオン性カウンターパートは、ｐＨ７．４（血流中のｐＨ）でプロトン化され弱酸性（例えばｐＨ６．８）で中和される１つまたはそれ以上のｐＨ感応性基（例えばスルホンアミド基）を含有する。従って、カチオン性ＣＰＰ１、ＣＰＰ２、ＰＴＤまたはスーパーチャージタンパク質、およびアニオン性カウンターパート間の電荷−電荷相互作用は弱酸性微小環境（例えば腫瘍または癌の内部または周辺）で崩壊する。ＭＭＰの血中濃度は、腫瘍または癌周辺の微小環境中の濃度より低い。従って、ＭＭＰ開裂可能配列は血流中では開裂されないが、腫瘍または癌周辺の環境中では開裂される。カチオン性ＣＰＰ１、ＣＰＰ２、ＰＴＤまたはスーパーチャージタンパク質はもはやアニオン性カウンターパートでは中和されず、従って、暴露されて細胞（例えば腫瘍または癌細胞）への転移を促進される。ある特定の態様では、ＣＰＰ１、ＣＰＰ２、またはＰＴＤはＴＡＴである。ある特定の態様では、アニオン性カウンターパートはｐＨ感応性基（例えばスルホンアミド基）を含有するｐＨ感応性ポリマー（例えばジブロック・コポリマー）を含有する。

【0035】

別の例では、活性化可能細胞侵入性コンジュゲートは、慣例的なポリマー製の疎水性コア（これにエフェクタードメインを導入する）、ポリエチレングリコールおよび１つまたはそれ以上のカチオン性ＣＰＰ１、ＣＰＰ２、ＰＴＤまたはスーパーチャージタンパク質から成る親水性の周辺層、そして、電荷−電荷相互作用によってカチオン性ＣＰＰ１、ＣＰＰ２、ＰＴＤまたはスーパーチャージタンパク質を中和する１つまたはそれ以上のアニオン性カウンターパートを含有する。それらの電荷−電荷相互作用により、運搬の間、形質導入物質が弱酸性の微小環境（例えば腫瘍または癌）に到達してアニオン性カウンターパートのプロトン化が引き起こされ、電荷−電荷結合が崩壊されるまで、カチオン性電荷が遮蔽されると考えられる。その結果、アニオン性カウンターパートによってクエンチングされていたカチオン性ＣＰＰ１、ＣＰＰ２、ＰＴＤまたはスーパーチャージタンパク質は、周辺細胞（例えば腫瘍または癌細胞）内へのエフェクタードメインの運搬を促進する能力を有するようになる。

【0036】

ある特定の態様では、選択的形質導入可能物質は細胞標的化ペプチド、活性化可能細胞侵入性ペプチド、および活性化可能細胞侵入性コンジュゲートから成る群から選択される形質導入ドメインを含有する。

【0037】

形質導入ドメインは共有結合、非共有結合性相互作用、またはリンカーを介してエフェクターに結合していてもよい。従って、形質導入可能物質の作製は、形質導入ドメインおよびエフェクタードメインを別々に得、それらを共有結合または非共有結合性相互作用（例えば反発相互作用、双極子相互作用、水素結合相互作用、分散型相互作用、電荷−電荷相互作用、溶媒効果、カウンターイオン効果、エントロピー効果、親水性効果、および疎水性効果）によって結合させて行ってもよい。ある特定の態様では、形質導入物質はエフェクタードメインおよび形質導入可能ドメインを混合することによって作製してもよい。あるいはまた、形質導入可能物質は、天然の供与源からの物質の単離または組換えによって調製してもよい。両方のドメインがペプチドまたはポリペプチドである場合、エフェクタードメインが形質導入ドメインのＮ−末端またはＣ−末端に結合していてもよく、形質導入可能ポリペプチドは化学合成または組み換え技術によって作製してもよい。

【0038】

ある特定の態様では、形質導入可能物質は本質的に形質導入可能であるエフェクタードメイン、およびエフェクタードメインと共有結合または非共有結合性相互作用によって結合した形質導入ドメインを含む。

【0039】

ある特定の態様では、形質導入可能物質は、エフェクタードメインまたは形質導入ドメインの機能を妨害しない１つまたはそれ以上のモチーフを更に含有する。ある特定の態様では、これらのモチーフは共有結合、非共有結合、またはリンカーを介してエフェクタードメインおよび／または形質導入ドメインと結合している。ある特定の態様では、これらのモチーフは、形質導入可能物質の調製および／または精製を容易にする。それらのモチーフの一例は、形質導入可能物質の調製においてタンパク質精製を容易にするためのポリヒスチジン・タグである。ある特定の態様では、ポリヒスチジン・タグは少なくとも６個のヒスチジン残基を含有する（例えばＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＨ（“Ｈｉｓ６”、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９））。

【0040】

ある特定の態様では、形質導入可能物質には、例えば以下がある：Ｏｃｔ４−１１Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）、Ｓｏｘ２−１１Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）、Ｋｌｆ４−１１Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）、Ｌｉｎ２８−１１Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）、Ｎａｎｏｇ−１１Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）、ｃＭｙｃ−１１Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）、Ｎｇｎ３−１１Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）、ＰＤＸ１−１１Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）、ＭａｆＡ−１１Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）、ＮｅｕｒｏＤ−１１Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）、およびＦｏｘｐ３−１１Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）、Ｆｏｘｏ１−１１Ｒ（例えば図１８ｃ）、Ｆｏｘｏ３−１１Ｒ（例えば図１８ｄ）、Ｓｏｘ９−１１Ｒ、Ｓｏｘ６−１１Ｒ、Ｓｏｘ５−１１Ｒ、ｃ−Ｍｙｃ−１１Ｒ、Ｋｌｆ４−１１Ｒ、Ｍｅｆ２Ｃ−１１Ｒ、Ｔｒｐｓ１−１１Ｒ、Ｇｌｉ３−１１Ｒ、Ｒｕｎｘ２−１１Ｒ、Ｄｌｘ５−１１Ｒ、Ｄｌｘ６−１１Ｒ、ＧＡＴＡ−６−１１ＲおよびＢａｆ６０ｃ−１１Ｒ（ここで、１１Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）はリンカーに結合する、１１個のアルギニン残基から成るポリアルギニン配列を表し、このリンカーを介してポリアルギニン配列がエフェクタードメインに共有結合している）。ある特定の態様では、“１１Ｒ”はエフェクタードメインのＣ末端に共有結合している。ある特定の態様では、形質導入可能物質には、例えば以下がある：Ｈｉｓ６−Ｏｃｔ４−１１Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）、Ｈｉｓ６−Ｓｏｘ２−１１Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）、Ｈｉｓ６−Ｋｌｆ４−１１Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）、Ｈｉｓ６−Ｌｉｎ２８−１１Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）、Ｈｉｓ６−Ｎａｎｏｇ−１１Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）、Ｈｉｓ６−ｃＭｙｃ−１１Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）、Ｈｉｓ６−Ｎｇｎ３−１１Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）、Ｈｉｓ６−ＰＤＸ１−１１Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）、Ｈｉｓ６−ＭａｆＡ−１１Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）、Ｈｉｓ６−ＮｅｕｒｏＤ−１１Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）、Ｈｉｓ６−Ｆｏｘｐ３−１１Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）、Ｈｉｓ６−Ｆｏｘｏ１−１１Ｒ（例えば図１８ｅ）、Ｈｉｓ６−Ｆｏｘｏ３−１１Ｒ（例えば図１８ｆ）、 Ｈｉｓ６−Ｓｏｘ９−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−Ｓｏｘ６−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−Ｓｏｘ５−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−ｃ−Ｍｙｃ−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−Ｋｌｆ４−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−Ｍｅｆ２Ｃ−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−Ｔｒｐｓ１−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−Ｇｌｉ３−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−Ｒｕｎｘ２−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−Ｄｌｘ５−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−Ｄｌｘ６−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−ＧＡＴＡ−６−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−Ｂａｆ６０ｃ−１１Ｒ、ＨＡ２−スパーチャージＧＦＲ−Ｓｏｘ９、ＨＡ２−スパーチャージＧＦＲ−Ｓｏｘ６、ＨＡ２−スパーチャージＧＦＲ−Ｓｏｘ５、ＨＡ２−スパーチャージＧＦＲ−ｃ−Ｍｙｃ、ＨＡ２−スパーチャージＧＦＲ−Ｋｌｆ４、ＨＡ２−スパーチャージＧＦＲ−Ｍｅｆ２Ｃ、ＨＡ２−スパーチャージＧＦＲ−Ｔｒｐｓ１、ＨＡ２−スパーチャージＧＦＲ−Ｇｌｉ３、ＨＡ２−スパーチャージＧＦＲ−Ｒｕｎｘ２、ＨＡ２−スパーチャージＧＦＲ−Ｄｌｘ５、ＨＡ２−スパーチャージＧＦＲ−Ｄｌｘ６、ＨＡ２−スパーチャージＧＦＲ−ＧＡＴＡ−６、ＨＡ２−スパーチャージＧＦＲ−Ｂａｆ６０ｃ、ｓｃＧＦＲ−Ｓｏｘ９−１１Ｒ、ｓｃＧＦＲ−Ｓｏｘ６−１１Ｒ、ｓｃＧＦＲ−Ｓｏｘ５−１１Ｒ、ｓｃＧＦＲ−ｃ−Ｍｙｃ−１１Ｒ、ｓｃＧＦＲ−Ｋｌｆ４−１１Ｒ、ｓｃＧＦＲ−Ｍｅｆ２Ｃ−１１Ｒ、ｓｃＧＦＲ−Ｔｒｐｓ１−１１Ｒ、ｓｃＧＦＲ−Ｇｌｉ３−１１Ｒ、ｓｃＧＦＲ−Ｒｕｎｘ２−１１Ｒ、ｓｃＧＦＲ−Ｄｌｘ５−１１Ｒ、ｓｃＧＦＲ−Ｄｌｘ６−１１Ｒ、ｓｃＧＦＲ−ＧＡＴＡ−６−１１ＲおよびｓｃＧＦＲ−Ｂａｆ６０ｃ−１１Ｒ。ある特定の態様では、“Ｈｉｓ６”はエフェクタードメインのＮ末端に共有結合している。ある特定の態様では、転写因子のＮ末端は、第１のリンカー（例えば、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＨ）を介してｓｃＧＦＰに連結され、転写因子のＣ末端は、第２のリンカーを用いてまたは用いずに１１Ｒに共有結合により連結される。ｓｃＧＦＰ融合転写物質の概略図を図１（ｃ）に示し、例示的なｓｃＧＦＰ融合転写物質（即ち、ｓｃＧＦＰ−Ｓｏｘ９−１１Ｒ）のアミノ酸配列を図２２（ｎ）に提示し、図中、転写因子Ｓｏｘ９の配列を下線で示す。下線のＳｏｘ９配列を別の転写因子配列に置き換えることにより、転写因子、例えば、表１に収載する転写因子のｓｃＧＦＰ融合転写物質の配列を得ることができる。形質導入可能物質の例示的配列を表３に示す。

【0041】

【表3】

【0042】

ある特定の態様では、形質導入可能物質は、１つまたはそれ以上のアジュバント、例えば、小分子エピジェネティック剤と組み合わせることができる。好適なエピジェネティック剤としては、限定されないが、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤およびＤＮＡメチル化阻害剤が挙げられる。好適なアジュバントの例としては、限定されないが、トリコスタチンＡ（ヒストンデアセチラーゼ阻害剤でありかつＤＮＡメチル化阻害剤である）、バルプロ酸（ヒストンデアセチラーゼ阻害剤でありかつＤＮＡメチル化阻害剤である）、アザ−２’−デオキシシチジン（ＤＮＡメチル化阻害剤である）、およびスベロイルアニリドヒドロキサム酸（ヒストンデアセチラーゼ阻害剤である）が挙げられる。

【0043】

本発明の別の観点は、生体サンプルおよび少なくとも１つの形質導入可能物質を含む組成物に関し、ここで、形質導入可能物質は生体サンプルに形質導入されている。例えば、組成物は、Ｆｏｘｐ３、Ｆｏｘｏ１もしくはＦｏｘｏ３、またはそれらを任意に組み合わせたもの（例えば、形質導入可能物質はＦｏｘｐ３、Ｆｏｘｐ３−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−Ｆｏｘｐ３−１１Ｒ、Ｆｏｘｏ１、Ｆｏｘｏ１−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−Ｆｏｘｏ１−１１Ｒ、Ｆｏｘｏ３、Ｆｏｘｏ３−１１ＲまたはＨｉｓ６−Ｆｏｘｏ３−１１Ｒである）およびＴ細胞を含む形質導入可能物質を含み、ここで、形質導入可能物質はＴ細胞に形質導入されている；組成物はｐｉＰＳ細胞、およびＯｃｔ４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２およびｃＭｙｃ、およびそれらを任意に組み合わせたもの（例えば、形質導入可能物質は、Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ｃＭｙｃ、Ｏｃｔ４−１１Ｒ、Ｋｌｆ４−１１Ｒ、Ｓｏｘ２−１１Ｒ、ｃＭｙｃ−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−Ｏｃｔ４−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−Ｋｌｆ４−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−Ｓｏｘ２−１１ＲまたはＨｉｓ６−ｃＭｙｃ−１１Ｒである）から成る群から選択されるポリペプチドを含む１つまたはそれ以上の形質導入可能物質を含む；組成物は、肝臓または膵臓の外分泌細胞、およびＮｇｎ３、ＰＤＸ１、ＭａｆＡ、ＮｅｕｒｏＤ、およびそれらを任意に組み合わせたもの（例えば形質導入可能物質は、Ｎｇｎ３、ＰＤＸ１、ＭａｆＡ、ＮｅｕｒｏＤ、Ｎｇｎ３−１１Ｒ、ＰＤＸ１−１１Ｒ、ＭａｆＡ−１１Ｒ、ＮｅｕｒｏＤ−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−Ｎｇｎ３−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−ＰＤＸ１−１１ＲまたはＨｉｓ６−ＭａｆＡ−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−ＮｅｕｒｏＤ−１１Ｒである）から成る群から選択されるポリペプチドを含む１つまたはそれ以上の形質導入可能物質を含み、ここで、形質導入可能物質は肝臓または膵臓の外分泌細胞に形質導入されている；ならびに、組成物は、出発または基質細胞（例えば、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、線維芽細胞、造血幹細胞、内皮幹細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞および内皮細胞）と、Ｓｏｘ９、Ｓｏｘ６、Ｓｏｘ５、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、Ｍｅｆ２Ｃ、Ｔｒｐｓ１、Ｇｌｉ３、Ｒｕｎｘ２、Ｄｌｘ５、Ｄｌｘ６、ＧＡＴＡ−６およびＢａｆ６０ｃならびにこれらの任意の組み合わせから成る群から選択されるポリペプチドを含む１つまたはそれ以上の形質導入可能物質（例えば、形質導入可能物質は、Ｓｏｘ９−１１Ｒ、Ｓｏｘ６−１１Ｒ、Ｓｏｘ５−１１Ｒ、ｃ−Ｍｙｃ−１１Ｒ、Ｋｌｆ４−１１Ｒ、Ｍｅｆ２Ｃ−１１Ｒ、Ｔｒｐｓ１−１１Ｒ、Ｇｌｉ３−１１Ｒ、Ｒｕｎｘ２−１１Ｒ、Ｄｌｘ５−１１Ｒ、Ｄｌｘ６−１１Ｒ、ＧＡＴＡ−６−１１Ｒ、Ｂａｆ６０ｃ−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−Ｓｏｘ９−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−Ｓｏｘ６−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−Ｓｏｘ５−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−ｃ−Ｍｙｃ−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−Ｋｌｆ４−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−Ｍｅｆ２Ｃ−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−Ｔｒｐｓ１−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−Ｇｌｉ３−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−Ｒｕｎｘ２−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−Ｄｌｘ５−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−Ｄｌｘ６−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−ＧＡＴＡ−６−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−Ｂａｆ６０ｃ−１１Ｒ、ＨＡ２−スーパーチャージＧＦＰ−Ｓｏｘ９、ＨＡ２−スーパーチャージＧＦＰ−Ｓｏｘ６、ＨＡ２−スーパーチャージＧＦＰ−Ｓｏｘ５、ＨＡ２−スーパーチャージＧＦＰ−ｃ−Ｍｙｃ、ＨＡ２−スーパーチャージＧＦＰ−Ｋｌｆ４、ＨＡ２−スーパーチャージＧＦＰ−Ｍｅｆ２Ｃ、ＨＡ２−スーパーチャージＧＦＰ−Ｔｒｐｓ１、ＨＡ２−スーパーチャージＧＦＰ−Ｇｌｉ３、ＨＡ２−スーパーチャージＧＦＰ−Ｒｕｎｘ２、ＨＡ２−スーパーチャージＧＦＰ−Ｄｌｘ５、ＨＡ２−スーパーチャージＧＦＰ−Ｄｌｘ６、ＨＡ２−スーパーチャージＧＦＰ−ＧＡＴＡ−６、ＨＡ２−スーパーチャージＧＦＰ−Ｂａｆ６０ｃ、ｓｃＧＦＰ−Ｓｏｘ９−１１Ｒ、ｓｃＧＦＰ−Ｓｏｘ６−１１Ｒ、ｓｃＧＦＰ−Ｓｏｘ５−１１Ｒ、ｓｃＧＦＰ−ｃ−Ｍｙｃ−１１Ｒ、ｓｃＧＦＰ−Ｋｌｆ４−１１Ｒ、ｓｃＧＦＰ−Ｍｅｆ２Ｃ−１１Ｒ、ｓｃＧＦＰ−Ｔｒｐｓ１−１１Ｒ、ｓｃＧＦＰ−Ｇｌｉ３−１１Ｒ、ｓｃＧＦＰ−Ｒｕｎｘ２−１１Ｒ、ｓｃＧＦＰ−Ｄｌｘ５−１１Ｒ、ｓｃＧＦＰ−Ｄｌｘ６−１１Ｒ、ｓｃＧＦＰ−ＧＡＴＡ−６−１１Ｒ、ｓｃＧＦＰ−Ｂａｆ６０ｃ−１１Ｒまたはこれらの任意の組み合わせ）とを包含し、ここで、形質導入可能物質は、出発細胞に形質導入されている。

【0044】

本開示の別の観点は、本開示の形質導入可能物質を含む組成物に生体サンプルを暴露することにより、生体サンプルを再プログラミングする方法に関する。ある特定の態様では、好ましくは該方法は、選択的形質導入可能物質を含有する組成物に生体サンプルを暴露することによって、他の生体サンプルではなく、生物体内の特定の微小環境（例えば癌または腫瘍周辺の微小環境）内、またはその周辺の特定のタイプの生体サンプル（例えば癌または腫瘍細胞）（単数または複数）を再プログラミングする。

【0045】

ある態様では、生体サンプルには生物体由来の細胞、細胞塊、組織、器官、生体が含まれる。生体サンプルは正常な健常サンプル、または異常を有する疾病サンプル（例えば癌または腫瘍）であってもよい。

【0046】

生物体には、例えば微生物（例えば細菌）、真菌、植物、および動物（例えばヒト）が含まれる。

【0047】

動物（例えばヒト）由来の器官には例えば以下がある：循環器（例えば心臓、血液、および血管）、消化器（例えば唾液腺、食道、胃、肝臓、胆嚢、膵臓、腸管、直腸、および肛門）、内分泌器官（例えば内分泌腺、例えば視床下部、下垂体、松果体、甲状腺、副甲状腺、および副腎）、外皮系（例えば皮膚、毛髪、および爪）、リンパ器官（例えばリンパ節、リンパ管、扁桃腺、咽頭扁桃腺、胸腺、および脾臓）、筋肉器官（例えば筋肉）、神経器官（例えば脳、脊髄、末梢神経、および神経）、生殖器官（例えば卵巣、卵管、子宮、膣、乳腺、精巣、精管、精嚢、前立腺、および陰茎）、呼吸器官（例えば咽頭、喉頭、気管、気管支、肺、および横隔膜）、骨格器官（例えば骨、軟骨、靱帯、および腱）、泌尿器系（例えば腎臓、尿管、膀胱、および尿道）。器官は正常または健常であるか、あるいは異常または非健常（例えば癌性）であってもよい。

【0048】

植物体由来の器官には、例えば根、茎、葉、花、種子、および果実がある。

【0049】

生体サンプル（例えば動物）由来の組織には結合組織、筋肉組織、神経組織、および上皮組織がある。組織は正常または健常であるか、あるいは異常または非健常（例えば癌性）であってもよい。生体サンプル（例えば植物）由来の組織には表皮、維管束組織、および基本組織がある。

【0050】

細胞は原核細胞または真核細胞であってもよい。原核細胞には、例えば細菌がある。真核細胞には、例えば真菌、植物細胞、および動物細胞がある。動物細胞（例えば哺乳動物細胞またはヒト細胞）のタイプには、例えば以下がある：循環／免疫系または器官の細胞（例えばＢ細胞、Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞）、ナチュラルキラー細胞、顆粒球（例えば好塩基性顆粒球、好酸性顆粒球、好中性顆粒球、および過分葉好中球）、単球またはマクロファージ、赤血球（例えば網赤血球）、マスト細胞、血小板または巨核球、および樹状細胞）；内分泌系または器官の細胞（例えば甲状腺細胞（例えば甲状腺上皮細胞、傍濾胞細胞）、上皮小体細胞（例えば上皮小体主細胞、好酸性細胞）、副腎細胞（例えばクロム親和性細胞）、および松果腺細胞（例えば松果体細胞））；神経系または器官の細胞（例えばグリア芽細胞、（例えば星状膠細胞および乏突起膠細胞）、小膠細胞、巨大神経分泌細胞、星状細胞、ベッチェル細胞（ｂｏｅｔｔｃｈｅｒ ｃｅｌｌ）、および下垂体細胞（例えばゴナドトロピン産生細胞、副腎皮質刺激因子、甲状腺刺激ホルモン産生細胞、成長ホルモン産生細胞、および乳腺刺激ホルモン分泌細胞））；呼吸器系または器官の細胞（例えば肺細胞（Ｉ型肺細胞およびＩＩ型肺細胞）、クララ細胞、杯細胞、肺胞マクロファージ）；循環系または器官の細胞（例えば心筋細胞および周皮細胞）；消化系または器官の細胞（例えば胃主細胞、壁細胞、杯細胞、パネート細胞、Ｇ細胞、Ｄ細胞、ＥＣＬ細胞、Ｉ細胞、Ｋ細胞、Ｓ細胞、腸管内分泌細胞、 腸クロム親和性細胞、ＡＰＵＤ細胞、肝細胞（例えば肝実質細胞およびクッパー細胞））；外皮系または器官の細胞（例えば骨細胞（例えば骨芽細胞、骨細胞、および破骨細胞）、歯細胞（例えばセメント芽細胞およびエナメル芽細胞）、軟骨細胞（例えば軟骨芽細胞および軟骨細胞）、皮膚／毛細胞（例えば基質細胞、ケラチノサイト、およびメラニン形成細胞（母斑細胞））、筋肉細胞（例えば筋細胞）、含脂肪細胞、線維芽細胞、および腱細胞）、泌尿系または器官の細胞（例えば有足細胞、傍糸球体細胞、糸球体内メサンギウム細胞、糸球体外メサンギウム細胞、近位尿細管刷子縁細胞、および緻密斑細胞）、および生殖系または器官の細胞（例えば精子、セルトリ細胞、ライディッヒ細胞、卵子、卵母細胞）。

【0051】

更に、細胞には哺乳動物幹細胞（胚性幹細胞、胎児幹細胞、人工多能性幹細胞、および成人幹細胞）が含まれる。幹細胞は、細胞周期の間も未分化の状態を保持し、特定のタイプの細胞に分化する能力を有する細胞である。幹細胞は全能性（ｏｍｎｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞、複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞、少能性（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｔ）幹細胞、および単能性（ｕｎｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞であってもよく（Ｈａｎｓ Ｒ．Ｓｃｈｏｌｅｒ（２００７）“Ｔｈｅ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ａｎ Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ”ｉｎ Ｎｉｋｏｌａｕｓ Ｋｎｏｅｐｆｆｌｅｒ，Ｄａｇｍａｒ Ｓｃｈｉｐａｎｓｋｉ、ａｎｄ Ｓｔｅｆａｎ Ｌｏｒｅｎｚ Ｓｏｒｇｎｅｒ．Ｈｕｍａｎｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｓ Ｓｏｃｉａｌ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ．Ａｓｈｇａｔｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社、２８頁参照）、これらはいずれも体細胞から誘導してもよい。幹細胞には癌幹細胞が含まれる。

【0052】

ある特定の態様では、細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、ＭＳＣ、線維芽細胞、造血幹細胞、内皮幹細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞または内皮細胞である。

【0053】

別の態様では、本明細書で使用する「生体サンプルの再プログラミング」は、生体サンプル（例えば細胞）の生体活性の調節、改変、もしくは変更、または生体サンプルの状態もしくは状況の調節、改変、もしくは変更と同義である、またはそれを指す。例えば、生体サンプル（例えば細胞）を形質導入可能物質に暴露することにより、細胞の生体活性（例えば細胞増殖、細胞分化、細胞代謝、細胞周期、細胞シグナル伝達、ＤＮＡ複製、転写、ＲＮＡスプライシング、タンパク質合成、翻訳後修飾）が調節または改変されて、以下が生ずる：細胞増殖、（例えば前駆細胞から最終分化した細胞への）分化、（例えば最終分化した細胞から多能性幹細胞への）脱分化、（例えばあるタイプの最終分化した細胞から別のタイプの最終分化した細胞への）分化転換、（例えば最終分化した細胞から前駆細胞への）逆分化、（例えばあるタイプの前駆細胞から別のタイプの最終分化した細胞（天然の条件下では通常別のタイプの前駆細胞から誘導されるもの）への）決定転換、アポトーシス（例えば細胞または癌細胞の細胞死）、形態形成、および細胞運命の変更。別の例では、生体サンプルの状態は以下のように改変または変更されうる：異常または疾病状態から正常または健常状態へ（例えば癌細胞から非癌細胞へ）、あるタイプの細胞から別のタイプの細胞へ（例えば未分化幹細胞から分化した幹細胞または特殊化した細胞へ）、分化または特殊化した細胞から未分化細胞または幹細胞（例えば全能性幹細胞、多能性幹細胞、複能性幹細胞、少能性幹細胞、および単能性幹細胞）へ（例えば線維芽細胞から人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）へ）、体細胞から幹細胞または人工幹細胞へ、ある状態の幹細胞から別の状態の幹細胞へ（例えば全能性幹細胞から多能性幹細胞へ）、あるタイプの分化した細胞から別のタイプの分化した細胞へ（例えばＴ細胞から制御性Ｔ細胞へ、膵外分泌細胞からインスリン産生β細胞へ）、あるいは出発細胞（例えば、ＥＳＣ、ｉＰＳＣ、ＭＳＣ、線維芽細胞、造血幹細胞、内皮幹細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞または内皮細胞）から軟骨形成細胞へ。

【0054】

別の態様では、生体サンプルを形質導入可能物質に暴露し、再プログラミングさせる。生体サンプルはインビトロ、インビボ、またはエキソビボで暴露してもよい。例えば、生体サンプルのインビトロ暴露は、生存する生物体の外部環境中で（例えば細胞培養系または試験管内で）サンプルを形質導入可能物質と接触させることによって行う。生体サンプルのインビボ暴露は、サンプルを含有する生物体と物質を接触させるか、または（例えば投与によって）物質を生物内に導入することによって行う。形質導入可能物質は任意の既知の投与経路、例えば非経口（例えば皮下、腹腔内、静脈内（静脈内輸液、筋肉内注射、または皮内注射など））または非経口以外の（例えば経口、経鼻、眼内、舌下、直腸、または局所）経路で投与してもよい。生体サンプルのエキソビボ暴露は、生体サンプル（例えば細胞、組織、または器官）を生物体の体外に取り出し、形質導入可能物質と接触させ、同じ、または別の生物体に再び配することによって行う。エキソビボ暴露の例には、生体サンプルを生物体から取り出すこと、生体サンプルを形質導入可能物質に暴露すること、形質導入可能物質が形質導入された生体サンプルを生物体に再移植することが含まれる。

【0055】

ある特定の態様では、ＯＧ２−ＭＥＦ細胞をタンパク質Ｏｃｔ４−１１Ｒ、Ｓｏｘ２−１１Ｒ、Ｋｌｆ４−１１Ｒ、およびｃＭｙｃ−１１Ｒを含有する組成物に暴露し、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に再プログラミングさせる。

【0056】

ある特定の態様では、Ｔ細胞をＦｏｘｐ３−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−Ｆｏｘｐ３−１１Ｒ、Ｆｏｘｏ１−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−Ｆｏｘｏ１−１１Ｒ、Ｆｏｘｏ３−１１Ｒ、Ｆｏｘｏ３−１１Ｒを含有する組成物に暴露し、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）に再プログラミングさせる。

【0057】

ある特定の態様では、肝および／または膵外分泌細胞を、Ｎｇｎ３−１１Ｒ、ＰＤＸ１−１１Ｒ、ＭａｆＡ−１１Ｒ、ＮｅｕｒｏＤ−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−Ｎｇｎ３−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−ＰＤＸ１−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−ＭａｆＡ−１１Ｒ、およびＨｉｓ６−ＮｅｕｒｏＤ−１１Ｒから成る群から選択される１つまたはそれ以上のタンパク質を含有する組成物に暴露し、インスリン産生細胞（例えばβ細胞）に再プログラミングさせる。ある特定の態様では、組成物は１つまたはそれ以上のアジュバント（例えば膵島増殖因子（例えばβセルリン））を更に含む。ある特定の態様では、組成物はＨｉｓ６−Ｎｇｎ３−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−ＰＤＸ１−１１Ｒ、およびＨｉｓ６−ＭａｆＡ−１１Ｒを含有する。ある特定の態様では、組成物はＨｉｓ６−Ｎｇｎ３−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−ＰＤＸ１−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−ＭａｆＡ−１１Ｒ、およびβセルリンを含有する。特定の機構に拘束されることを意図するものではないが、それらの再プログラミングが決定転換および／または分化転換によって生ずることも企図される。

【0058】

ある特定の態様では、ＭＳＣ、ＥＳＣ、ｉＰＳＣ、線維芽細胞、造血幹細胞、内皮幹細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞または内皮細胞は、Ｓｏｘ９−１１Ｒ、Ｓｏｘ６−１１Ｒ、Ｓｏｘ５−１１Ｒ、ｃ−Ｍｙｃ−１１Ｒ、Ｋｌｆ４−１１Ｒ、Ｍｅｆ２Ｃ−１１Ｒ、Ｔｒｐｓ１−１１Ｒ、Ｇｌｉ３−１１Ｒ、Ｒｕｎｘ２−１１Ｒ、Ｄｌｘ５−１１Ｒ、Ｄｌｘ６−１１Ｒ、ＧＡＴＡ−６−１１Ｒ、Ｂａｆ６０ｃ−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−Ｓｏｘ９−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−Ｓｏｘ６−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−Ｓｏｘ５−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−ｃ−Ｍｙｃ−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−Ｋｌｆ４−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−Ｍｅｆ２Ｃ−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−Ｔｒｐｓ１−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−Ｇｌｉ３−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−Ｒｕｎｘ２−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−Ｄｌｘ５−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−Ｄｌｘ６−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−ＧＡＴＡ−６−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−Ｂａｆ６０ｃ−１１Ｒ、ＨＡ２−スーパーチャージＧＦＰ−Ｓｏｘ９、ＨＡ２−スーパーチャージＧＦＰ−Ｓｏｘ６、ＨＡ２−スーパーチャージＧＦＰ−Ｓｏｘ５、ＨＡ２−スーパーチャージＧＦＰ−ｃ−Ｍｙｃ、ＨＡ２−スーパーチャージＧＦＰ−Ｋｌｆ４、ＨＡ２−スーパーチャージＧＦＰ−Ｍｅｆ２Ｃ、ＨＡ２−スーパーチャージＧＦＰ−Ｔｒｐｓ１、ＨＡ２−スーパーチャージＧＦＰ−Ｇｌｉ３、ＨＡ２−スーパーチャージＧＦＰ−Ｒｕｎｘ２、ＨＡ２−スーパーチャージＧＦＰ−Ｄｌｘ５、ＨＡ２−スーパーチャージＧＦＰ−Ｄｌｘ６、ＨＡ２−スーパーチャージＧＦＰ−ＧＡＴＡ−６およびＨＡ２−スーパーチャージＧＦＰ−Ｂａｆ６０ｃ、ｓｃＧＦＰ−Ｓｏｘ９−１１Ｒ、ｓｃＧＦＰ−Ｓｏｘ６−１１Ｒ、ｓｃＧＦＰ−Ｓｏｘ５−１１Ｒ、ｓｃＧＦＰ−ｃ−Ｍｙｃ−１１Ｒ、ｓｃＧＦＰ−Ｋｌｆ４−１１Ｒ、ｓｃＧＦＰ−Ｍｅｆ２Ｃ−１１Ｒ、ｓｃＧＦＰ−Ｔｒｐｓ１−１１Ｒ、ｓｃＧＦＰ−Ｇｌｉ３−１１Ｒ、ｓｃＧＦＰ−Ｒｕｎｘ２−１１Ｒ、ｓｃＧＦＰ−Ｄｌｘ５−１１Ｒ、ｓｃＧＦＰ−Ｄｌｘ６−１１Ｒ、ｓｃＧＦＰ−ＧＡＴＡ−６−１１ＲおよびｓｃＧＦＰ−Ｂａｆ６０ｃ−１１Ｒから成る群から選択される１つまたはそれ以上のタンパク質を含む組成物に暴露されて、軟骨形成細胞に再プログラミングされる。ある特定の態様では、組成物は、エピジェネティック剤（例えば、トリコスタチンＡ、バルプロ酸、アザ−２’−デオキシシチジン、スベロイルアニリドヒドロキサム酸）など、１つまたはそれ以上のアジュバントをさらに含む。

【0059】

本開示の別の観点は、本開示の形質導入可能物質を含む組成物を生物に投与することにより、生物体において軟骨損傷が関与する疾病または症状を治療、予防または低下させる方法に関する。ある特定の態様では、組成物は形質導入可能物質を含有する医薬組成物である。ある特定の態様では、組成物は選択的形質導入可能物質を含有する。疾病または症状の治療、予防、または低減は生物体中の生体サンプル（例えば細胞、組織、または器官）の変化または再プログラミングを伴う。

【0060】

本発明はまた、生物体において軟骨損傷が関与する疾病または症状を治療、予防または軽減するための医薬品の製造における形質導入可能物質の使用を提供する。ある特定の態様では、形質導入可能物質は、選択的形質導入可能物質である。疾病または症状の治療、予防または軽減は、生物中の生体サンプル（例えば、細胞、組織または臓器）の変化または再プログラミングに伴うものである。軟骨損傷が関与する疾病または症状として、関節障害、変形性関節症、軟骨傷害、外傷性断裂または剥離、軟骨無形成症、肋軟骨炎、脊椎円板ヘルニア形成、再発性多発性軟骨炎（ｒｅｌａｐｓｉｎｇ ｐｏｌｙｃｈｏｎｒｉｔｉｓ）、腫瘍、軟骨腫、軟骨肉腫および多形性腺腫（ｐｅｏｍｏｒｐｈｉｃ ａｄｅｎｏｍａ）が挙げられるがこれらに限定されない。

【0061】

ある特定の態様では、この方法によって治療できるかまたは医薬品によって治療できる疾病または症状には、限定されるわけではないが以下がある：腫瘍、ガン、代謝障害または症状（例えば１型糖尿病、２型糖尿病、および肥満）、炎症性症状、心臓病、神経変性疾患（例えば貧血、筋萎縮性側索硬化症、脊髄損傷、熱傷、または関節炎）、自己免疫疾患または症状（例えば急性播種性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、アジソン病、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、貧血症（例えば自己免疫性溶血性貧血および悪性貧血）、関節炎、乾癬性関節炎、リウマチ性関節炎、１型糖尿病、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、水疱性類天疱瘡、セリアック病、シャーガス病、慢性閉塞性肺疾患、クローン病、皮膚筋炎、子宮内膜症、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、橋本病、化膿性汗腺炎、川崎病、ＩｇＡ腎症、特発性血小板減少性紫斑病、間質性膀胱炎、エリテマトーデス、混合性結合組織病、モルフェア、多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症、ナルコレプシー、神経性筋強直症、尋常性天疱瘡、乾癬、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、統合失調症、強皮症、シェーグレン症候群、全身硬直症候群、側頭動脈炎（“巨細胞性動脈炎”）、潰瘍性大腸炎、血管炎、白斑、およびウェゲナー肉芽腫症）。

【0062】

例えば、腫瘍を有する生物体に形質導入可能物質または形質導入可能物質から製造される医薬品を投与し、腫瘍細胞のアポトーシスを活性化する、または腫瘍細胞の化学療法、放射線療法、またはガン治療薬に対する感受性を高めてもよいことが企図される。

【0063】

ある特定の態様では、形質導入可能物質または形質導入可能物質から製造される医薬品を生物体に投与して免疫系を亢進または減弱させ、それによって免疫関連疾患または炎症性疾患を治療または予防してもよい。例えば、タンパク質Ｆｏｘｐ３−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−Ｆｏｘｐ３−１１Ｒ、Ｆｏｘｏ１−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−Ｆｏｘｏ１−１１Ｒ、Ｆｏｘｏ３−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−Ｆｏｘｏ３−１１ＲがＴ細胞に形質導入され、プログラミングされてＴｒｅｇ細胞となり、それによって免疫系の過剰反応が抑制され、自己免疫疾患の治療となる。

【0064】

ある特定の態様では、形質導入可能物質または形質導入可能物質から製造された薬物を生物体に投与して、関節障害、変形性関節症、軟骨傷害、軟骨傷害、外傷性断裂もしくは剥離、軟骨無形成症、肋軟骨炎、脊椎円板ヘルニア形成、再発性多発性軟骨炎、腫瘍、軟骨腫、軟骨肉腫または多形性腺腫など、軟骨損傷が関与する症状を治療することができる。

【0065】

例えば、軟骨損傷が関与する症状を治療するため、ポリペプチドまたは係るポリペプチドを含む組成物が、適切な細胞（例えば、ＥＳＣ、ｉＰＳＣ、ＭＳＣ、線維芽細胞、造血幹細胞、内皮幹細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞または内皮細胞）に形質導入され、これらを軟骨形成細胞へと再プログラミングするが、このポリペプチドは、Ｓｏｘ９−１１Ｒ、Ｓｏｘ６−１１Ｒ、Ｓｏｘ５−１１Ｒ、ｃ−Ｍｙｃ−１１Ｒ、Ｋｌｆ４−１１Ｒ、Ｍｅｆ２Ｃ−１１Ｒ、Ｔｒｐｓ１−１１Ｒ、Ｇｌｉ３−１１Ｒ、Ｒｕｎｘ２−１１Ｒ、Ｄｌｘ５−１１Ｒ、Ｄｌｘ６−１１Ｒ、ＧＡＴＡ−６−１１Ｒ、Ｂａｆ６０ｃ−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−Ｓｏｘ９−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−Ｓｏｘ６−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−Ｓｏｘ５−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−ｃ−Ｍｙｃ−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−Ｋｌｆ４−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−Ｍｅｆ２Ｃ−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−Ｔｒｐｓ１−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−Ｇｌｉ３−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−Ｒｕｎｘ２−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−Ｄｌｘ５−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−Ｄｌｘ６−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−ＧＡＴＡ−６−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−Ｂａｆ６０ｃ−１１Ｒ、ＨＡ２−スーパーチャージＧＦＰ−Ｓｏｘ９、ＨＡ２−スーパーチャージＧＦＰ−Ｓｏｘ６、ＨＡ２−スーパーチャージＧＦＰ−Ｓｏｘ５、ＨＡ２−スーパーチャージＧＦＰ−ｃ−Ｍｙｃ、ＨＡ２−スーパーチャージＧＦＰ−Ｋｌｆ４、ＨＡ２−スーパーチャージＧＦＰ−Ｍｅｆ２Ｃ、ＨＡ２−スーパーチャージＧＦＰ−Ｔｒｐｓ１、ＨＡ２−スーパーチャージＧＦＰ−Ｇｌｉ３、ＨＡ２−スーパーチャージＧＦＰ−Ｒｕｎｘ２、ＨＡ２−スーパーチャージＧＦＰ−Ｄｌｘ５、ＨＡ２−スーパーチャージＧＦＰ−Ｄｌｘ６、ＨＡ２−スーパーチャージＧＦＰ−ＧＡＴＡ−６、ＨＡ２−スーパーチャージＧＦＰ−Ｂａｆ６０ｃ、ｓｃＧＦＰ−Ｓｏｘ９−１１Ｒ、ｓｃＧＦＰ−Ｓｏｘ６−１１Ｒ、ｓｃＧＦＰ−Ｓｏｘ５−１１Ｒ、ｓｃＧＦＰ−ｃ−Ｍｙｃ−１１Ｒ、ｓｃＧＦＰ−Ｋｌｆ４−１１Ｒ、ｓｃＧＦＰ−Ｍｅｆ２Ｃ−１１Ｒ、ｓｃＧＦＰ−Ｔｒｐｓ１−１１Ｒ、ｓｃＧＦＰ−Ｇｌｉ３−１１Ｒ、ｓｃＧＦＰ−Ｒｕｎｘ２−１１Ｒ、ｓｃＧＦＰ−Ｄｌｘ５−１１Ｒ、ｓｃＧＦＰ−Ｄｌｘ６−１１Ｒ、ｓｃＧＦＰ−ＧＡＴＡ−６−１１Ｒ、ｓｃＧＦＰ−Ｂａｆ６０ｃ−１１Ｒおよびこれらの任意の組み合わせから成る群から選択される。特定の機構に拘束されることを意図するものではないが、そのような再プログラミングは、決定転換および／または分化転換を介するものであることが更に企図される。

【0066】

別の一例のため、出発細胞または基質細胞（例えば、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、ＭＳＣ、線維芽細胞、造血幹細胞、内皮幹細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞および内皮細胞）は、分化、分化転換、決定転換または逆分化により軟骨形成細胞へと再プログラミングされる。

【0067】

ある特定の態様では、１つまたはそれ以上のアジュバント、例えばエピジェネティック剤（例えば、トリコスタチンＡ、バルプロ酸、アザ−２’−デオキシシチジン、および／またはスベトイルアニリドヒドロキサム酸）も生物体に投与する。

【0068】

本開示の別の観点は、ｉＰＳＣ、胚性幹細胞もしくは他の種類の幹細胞または前駆細胞または分化した細胞を軟骨形成細胞に再プログラミングする方法に関し、該方法は、関節障害、変形性関節症、軟骨傷害、外傷性断裂もしくは剥離、軟骨無形成症、肋軟骨炎、脊椎円板ヘルニア形成、再発性多発性軟骨炎、腫瘍、軟骨腫、軟骨肉腫または多形性腺腫など、軟骨損傷が関与する疾病または症状のための細胞療法として開発することができる。幹細胞、前駆細胞または分化した細胞は、患者特異的であっても患者非特異的であってもよく、制御された分化または再プログラミングのために形質導入可能物質に暴露される前に修復されて分子欠損が取り除かれても取り除かれなくてもよい。再プログラミングされた細胞は、患者に戻し移植される前に濃縮、精製または操作することができる。ある特定の態様では、再プログラミングされた細胞は、軟骨形成細胞またはそれに由来する細胞である。

【0069】

本開示の別の観点は、ｉＰＳＣ、胚性幹細胞もしくは他の種類の幹細胞または前駆細胞または分化した細胞を軟骨形成細胞に再プログラミングする方法に関し、該方法は、薬物スクリーニング、機序研究、毒性アッセイまたは他の研究の疾病モデルならびに創薬および開発ツールとして用いることができる。例えば、該方法は、ｉＰＳＣ、胚性幹細胞、前駆細胞または分化した細胞を、形質導入可能物質を含む組成物に暴露して、ｉＰＳＣ、胚性幹細胞、前駆細胞または分化した細胞を移植可能な軟骨形成細胞に再プログラミングすること；移植可能な軟骨形成細胞を生体サンプルまたは生物体に移植すること；生体サンプルまたは生物体を疾病モデルとなるよう開発することを含む。別の一例のため、該方法は、形質導入可能物質を用いて患者特異的細胞を軟骨形成細胞に再プログラミングする段階と、患者特異的軟骨形成細胞または軟骨形成細胞由来細胞を用いて疾病モデルを開発する段階とを含む。別の一例のため、薬物スクリーニングまたは毒性モデルを開発する方法は、形質導入可能物質を用いて体細胞、前駆細胞または複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）細胞を軟骨形成細胞に再プログラミングすること、および軟骨形成細胞および／または軟骨形成細胞由来細胞を用いて、異なる化合物の効果および／または毒性をスクリーニングすることを含む。

【0070】

本開示の別の観点は、軟骨損傷が関与する様々な疾病または症状のための細胞療法を開発する方法に関し、該方法は、形質導入可能物質を用いてｉＰＳＣ、胚性幹細胞、前駆細胞または分化した細胞を移植可能な軟骨形成細胞に再プログラミングする段階；移植可能な軟骨形成細胞を生体サンプルまたは生物体に移植する段階；移植可能な軟骨形成細胞の治療効果を評価する段階を含む。

【0071】

移植可能な細胞は、それを必要とする対象に移植することができ、傷害部位、血餅または肋軟骨下骨髄空間など、適所に収まると、移植された軟骨形成細胞またはそれに由来する細胞は、軟骨組織、好ましくは硝子軟骨組織を再生し、軟骨損傷を修復することができる。

【0072】

例えば、軟骨損傷が関与する症状の患者は、患者の関節軟骨、関節または肋軟骨下骨髄空間の傷害部位への注射により、タンパク質薬、小分子薬または組み合わせにより治療されて、傷害部位、血餅または肋軟骨下骨髄空間において新たな軟骨形成細胞を生じる。新たに生じた軟骨形成細胞は、硝子軟骨組織を再生し、軟骨損傷を修復する。

【0073】

本開示の別の観点は、エフェクタードメインを同定する方法に関し、該方法は、被験エフェクタードメインを公知の形質導入ドメインに共有結合により連結して、被験形質導入可能分子を形成する段階；被験分子を生体サンプルに暴露する段階；および生体サンプルから軟骨形成サンプルへの再プログラミングを測定して、被験エフェクタードメインが生体サンプルに変化を生じさせることができるかを示す段階を含む。また、本開示の別の観点は、形質導入可能ドメインを同定する方法に関し、該方法は以下の段階を含む：既知のエフェクタードメインを被験形質導入ドメインに共有結合させて被験形質導入可能分子を作製すること；被験分子を生体サンプルに暴露させること；被験分子の位置または生体サンプルから軟骨形成サンプルへの再プログラミング効率を測定して、被験形質導入ドメインが生体サンプル内にエフェクタードメインを形質導入できるか否かを明らかにすること。

【実施例】

【0074】

以下の実施例は請求する本明細書をより良く説明するために提供するものであり、いかなる様にも本発明の範囲を制限するものと解釈すべきではない。以下に記載する具体的な組成物、物質、および方法は全て、全部または一部として、本発明の範囲内に含まれる。それらの具体的な組成物、物質、および方法は本発明を制限することを意図するものではなく、単に本発明の範囲内に含まれる具体的な態様の例証である。当業者は発明に関する能力を駆使することなく、また、本発明の範囲から逸脱することなく、同等の組成物、物質、および方法を開発しうる。理解されるように、本明細書に記載する方法に多くの改変を、本発明の範囲内に留まりつつ、施与することができる。出願人は、それらの改変が本発明の範囲内に包含されることを意図する。

【0075】

実施例１：体細胞から人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）への再プログラミング
１．ａ 形質導入可能物質、Ｏｃｔ４−１１Ｒ、Ｓｏｘ２−１１Ｒ、Ｋｌｆ４−１１Ｒ、およびｃＭｙｃ−１１Ｒの作製
ポリアルギニン・タンパク質形質導入ドメインを再プログラミング・タンパク質、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃＭｙｃのそれぞれのＣ末端にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５を介して融合させ、融合タンパク質、Ｏｃｔ４−１１Ｒ、Ｓｏｘ２−１１Ｒ、Ｋｌｆ４−１１Ｒ、およびｃＭｙｃ−１１Ｒを作製した（図１Ａ）。これらのポリアルギニン融合タンパク質をＥ．ｃｏｌｉ中で封入体として発現させ、その後可溶化、リフォールディング、および更なる精製を行って、形質導入可能物質、Ｏｃｔ４−１１Ｒ、Ｓｏｘ２−１１Ｒ、Ｋｌｆ４−１１Ｒ、およびｃＭｙｃ−１１Ｒを得た。質量分析およびウェスタンブロッティングによってタンパク質の同一性を確認した（図１Ｂ）。

【0076】

１．ｂ．形質導入可能物質、Ｏｃｔ４−１１Ｒ、Ｓｏｘ２−１１Ｒ、Ｋｌｆ４−１１Ｒ、およびｃＭｙｃ−１１Ｒの細胞侵入性および安定性
形質導入可能物質（Ｏｃｔ４−１１Ｒ、Ｓｏｘ２−１１Ｒ、Ｋｌｆ４−１１Ｒ、またはｃＭｙｃ−１１Ｒ）を種々の濃度で６−７２時間、マウス胎児線維芽（ＭＥＦ）細胞に添加した。免疫細胞化学により、細胞の形態およびタンパク質の存在を測定した。形質導入可能物質は０．５−８μｇ／ｍｌの濃度で６時間以内に細胞に入り込み、核に移行することが観察された（図２）。更に、形質導入されたタンパク質は４８時間までの間、細胞内でかなり安定であった（図３）。

【0077】

１．ｃ．ＯＧ２／Ｏｃｔ４−ＧＦＰレポーターＭＥＦ細胞の再プログラミング
上述のタンパク質形質導入条件を用いてＯＧ２／Ｏｃｔ４−ＧＦＰレポーターＭＥＦ細胞を再プログラミングした。細胞には４サイクルの処理を行った。各サイクルで、まず線維芽細胞（最初に６ウェルプレートに５ｘ１０⁴細胞／ウェルの密度で播種した）を形質導入可能物質、Ｏｃｔ４−１１Ｒ、Ｓｏｘ２−１１Ｒ、Ｋｌｆ４−１１Ｒ、およびｃＭｙｃ−１１Ｒ（ｍＥＳＣ培養液（１ｍＭバルプロ酸（ＶＰＡ。ヒストン脱アセチル化酵素１（ＨＤＡＣ１）の阻害剤）含有または未含有）中、８μｇ／ｍｌ）で一晩処理した後、形質導入可能物質およびＶＰＡを含有しない同培養液に交換し、更に３６時間培養してから次の処理サイクルに移行した。形質導入可能物質のタンパク質形質導入の反復が完了した後、処理した細胞を放射線照射したＭＥＦ支持細胞上に移し、コロニーが現れるまで（およそ３０−３５日目）ｍＥＳＣ培養液中に保持した（図４Ａ）。細胞にＯｃｔ４−１１Ｒ、Ｓｏｘ２−１１Ｒ、Ｋｌｆ４−１１Ｒ、およびｃＭｙｃ−１１Ｒを形質導入し、ＶＰＡで処理した場合は、５ｘ１０⁴細胞当たり３個のＧＦＰ＋コロニーが得られ、細胞にそれぞれＯｃｔ４−１１Ｒ、Ｓｏｘ２−１１Ｒ、またはＫｌｆ４−１１Ｒを形質導入し、ＶＰＡで処理した場合は、５ｘ１０⁴細胞当たり１個のＧＦＰ＋コロニーが得られた。次いで、これらのＧＦＰ＋コロニーを慣例的なｍＥＳＣ培養条件下で継代してｐｉＰＳ細胞を得、更にキャラクタライズを行った。

【0078】

精製したマウスｐｉＰＳ細胞は２０継代以上の間、安定に増殖し、標準的なｍＥＳ細胞と形態学的に識別不能であり、緻密なドーム型の小型コロニーを形成した（図４Ｂおよび４Ｃ）。それらは、免疫細胞化学および染色によって試験される典型的な多能性マーカー（ＡＬＰ（図４Ｄ）、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、およびＳＳＥＡ１（図４Ｅ））を発現した。ＲＴ−ＰＥＲ分析によって、これらの多能性マーカーおよび更なる多能性遺伝子の内因性遺伝子発現を確認した（図４Ｆ）。単一細胞生存アッセイでも、支持細胞未含有およびＮ２／Ｂ２７既知組成条件でｐｉＰＳ細胞がＯｃｔ４陽性コロニーとして効率的にコロニーを形成することが確認された。更に、Ｏｃｔ４プロモーターの亜硫酸水素ゲノムシークエンシングにより、ｐｉＰＳ細胞ではｍＥＳ細胞と同様にジメチル化が起こるが、ＭＥＦのＯｃｔ４プロモーターは高メチル化されることが明らかになった（図４Ｇ）。この結果は、これらのｐｉＰＳ細胞における多能性転写プログラムの再活性化を更に支持している。

【0079】

ｐｉＰＳ細胞の発生能を試験するため、胚葉体（ＥＢ）を用いる標準的なインビトロ分化または既知組成培地での単層培養による段階的分化、並びにインビボのキメラ形成能アッセイを行った。ｐｉＰＳ細胞は懸濁液中で効率的にＥＢを形成し、３つの一次胚葉で細胞に分化したが、それらには以下がある：原始内胚葉（ＡＦＰ、Ｓｏｘ１７）、前腸内胚葉（ＦｏｘＡ２）、膵臓細胞−内胚葉（ＰＤＸ１、Ｐａｘ６）、中胚葉（ブラキュリ）、および、神経細胞（Ｓｏｘ１）およびニューロン（βＩＩＩ−チューブリン）−外胚葉（図５および６Ａ）。これらのｐｉＰＳ細胞は８細胞期胚との凝集後、胚盤胞の内部細胞塊に効率的に導入され、凝集した胚をマウスに移植した後、インビボで生殖系の寄与を受けてキメラを形成することが、７つの胚のうち２つの生殖腺組織でＯｃｔ４−ＧＦＰ＋細胞が観察されたことから示唆された（図６Ｂ下段）。これらのインビトロおよびインビボでの特性を考え合わせ、精製された形質導入物質、Ｏｃｔ４−１１Ｒ、Ｓｏｘ２−１１Ｒ、Ｋｌｆ４−１１Ｒ、およびｃＭｙｃ−１１ＲによってＭＥＦを慣例的なｍＥＳ細胞と形態学的および機能的に類似したｐｉＰＳ細胞へ再プログラミングすることが可能であることが裏付けられる。

【0080】

実施例２：マウスにおける形質導入可能物質、Ｈｉｓ６−Ｎｇｎ３−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−ＰＤＸ１−１１Ｒ、およびＨｉｓ６−ＭａｆＡ−１１Ｒによる肝および膵外分泌細胞からインスリン産生β細胞への再プログラミング
ポリアルギニン・タンパク質形質導入ドメインを各再プログラミング・タンパク質（Ｎｇｎ３、ＰＤＸ１、およびＭａｆＡ）のＣ末端にリンカー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５）を介して融合させ、Ｈｉｓ６−Ｎｇｎ３−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−ＰＤＸ１−１１Ｒ、およびＨｉｓ６−ＭａｆＡ−１１Ｒを作製した（図７）。Ｈｉｓ６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９）はタンパク質精製を容易にするために含有させた。これらのポリアルギニン融合タンパク質を封入体としてＥ．ｃｏｌｉで発現させ、その後可溶化、リフォールディング、および更なる精製を行って、形質導入可能物質、Ｈｉｓ６−Ｎｇｎ３−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−ＰＤＸ１−１１Ｒ、およびＨｉｓ６−ＭａｆＡ−１１Ｒを作製した。質量分析およびウェスタンブロッティングによってタンパク質の同一性を確認した。

【0081】

６検体のＣＤ−１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を２群（処理群およびコントロール群）に分けた。形質導入可能物質、Ｈｉｓ６−Ｎｇｎ３−１１Ｒ（１ｍｇ／ｋｇ）、Ｈｉｓ６−ＰＤＸ１−１１Ｒ（１ｍｇ／ｋｇ）、Ｈｉｓ６−ＭａｆＡ−１１Ｒ（１ｍｇ／ｋｇ）を処理群（マウス−４、マウス−５、およびマウス−６）の各マウスに腹腔内（ＩＰ）注射し、コントロール群（マウス−１、マウス−２、およびマウス−３）の各マウスにはＢＳＡ（１ｍｇ／ｋｇ）を注射した。針を各マウスの腹膜内に穿通させた際、緑褐色または黄色の吸引液は観察されなかった。注射は毎日、７日間反復した。処理群およびコントロール群のいずれのマウスも、全ての注射の完了後３日目に屠殺した。マウス肝臓および膵臓を１Ｘ ＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで一晩固定した。その後、肝臓および膵臓組織を標準的なパラフィン包埋プロトコルによって処理した。組織用ミクロトームを用いて通常の方法で厚さ５マイクロの組織切片を調製し、標準的な組織ガラススライド上にマウントした。組織切片の処理の際、組織中のワックスをキシレンで溶解した。組織の切片化、組織染色、および免疫組織化学的染色を慣例的な方法を用いて行った。間接蛍光抗体（ＩＦＡ）アッセイでは、スライドを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳＴ）および３％ＢＳＡを用いて室温で１時間ブロッキングし、マウス抗インスリン抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に４℃で一晩インキュベートした。スライドをＰＢＳ（室温、１５分間）で３回洗浄し、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲート・ブタ抗マウス抗体（ＫＰＬ）と共に室温で２時間インキュベートした。同じ濃度のマウスＩｇＧをアイソタイプ・コントロールとして用いた。抗ＤＡＰＩ抗体を核マーカーとしてスライドに添加した。上記と同様にスライドを洗浄し、水性マウント液（Ｂｉｏｍｅｄａ、カリフォルニア州フォスターシティ）でマウントした。内皮マーカーを顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５１、カリフォルニア州サンディエゴ）下で同定し、マージした細胞をＭｉｃｒｏｓｕｉｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｕｉｔｅプログラム（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５１、カリフォルニア州サンディエゴ）で分析した（図８−１１）。結果は、コントロール群（図８）に比較して処理群では肝臓においてより多くのインスリン産生細胞が見られることを示している（図９）。コントロール群の膵臓ではインスリン産生細胞塊が観察されたが（図１０）、処理群の膵臓ではより広い範囲でインスリン産生細胞が観察された（図１１）。従って、結果は、形質導入可能物質、Ｈｉｓ６−Ｎｇｎ３−１１Ｒ、Ｈｉｓ６−ＰＤＸ１−１１Ｒ、およびＨｉｓ６−ＭａｆＡ−１１Ｒでの処理によって肝臓および／または膵臓細胞がインスリン産生細胞に転換されたことを示している。

【0082】

実施例３：Ｔ細胞の再プログラミングおよび形質導入可能物質Ｆｏｘｐ３を用いるそれらのＴｒｅｇ細胞へのプログラム
ポリアルギニン・タンパク質形質導入ドメインを各再プログラミング・タンパク質Ｆｏｘ３のＣ末端にリンカー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５）を介して融合させ、Ｈｉｓ６−Ｆｏｘｐ３−１１Ｒを作製した（図７）。Ｈｉｓ６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９）はタンパク質精製を容易にするために含有させた。ポリアルギニン融合タンパク質を封入体としてＥ．ｃｏｌｉで発現させ、その後可溶化、リフォールディング、および更なる精製を行って、形質導入可能物質、Ｈｉｓ６−Ｆｏｘｐ３−１１Ｒを得た。ウェスタンブロッティングによってタンパク質の同一性を確認した。

【0083】

１００ｍｌの健常ヒト血液をドナーから採取し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）を用い、密度勾配遠心分離によって末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。磁気ビーズ分離（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カリフォルニア州オーバーン）によってＣＤ１４＋単球を分離した。簡潔に記載すると、１０⁸個のＰＢＭＣを２００μＬの抗ＣＤ１４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）と共に氷中で３０分間インキュベートした。細胞を冷１Ｘ ＰＢＳ（２％ＦＣＳ含有）で洗浄し、３００ｇで１０分間遠心分離した後、１Ｘ ＰＢＳ（２％ＦＣＳ含有）に再懸濁した。細胞懸濁液を磁気カラムに適用し、１Ｘ ＰＢＳ（２％ＦＣＳ含有）で３回洗浄して未結合の細胞を溶出除去した。３００ｇで１０分間遠心分離し、ＰＢＭＣ／ｍｏｎｏ−を回収した。

【0084】

ＰＢＭＣ／ｍｏｎｏ−を６ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、メリーランド州ゲイサーズバーグ）で、１０％ＦＢＳ、非必須アミノ酸、２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２００ユニット／ｍｌペニシリン、およびストレプトマイシンを含有する培養液中、３７℃、５％ＣＯ₂でインキュベートした。１時間培養後、Ｈｉｓ６−Ｆｏｘｐ３−１１Ｒ（１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、または５０μｇ／ｍｌ）を細胞に添加した。別のウェルにＢＳＡ（１００μｇ／ｍｌ）を添加してコントロールとした。２日間培養後、同じ濃度のＨｉｓ６−Ｆｏｘｐ３−１１ＲまたはＢＳＡを添加した。５日間培養後、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。細胞を１００μＬに再懸濁し、ウサギ抗ヒトＣＤ２５を添加した（９０分間）。細胞を冷１Ｘ ＰＢＳ（２％ＦＢＳ含有）で３回洗浄した後、ＰＥコンジュゲート・マウス抗ヒトＣＤ４およびＦＩＴＣコンジュゲート・ヤギ抗ウサギＩｇＧを、氷中６０分間、細胞に添加した。ＰＥコンジュゲート・マウスＩｇＧおよびウサギＩｇＧを別の群の細胞と共にインキュベートし、アイソタイプ・コントロールとした。細胞をＰＢＳで洗浄し、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＦＣ５００血球計数器とＣｙｔｏｍｉｃｓ ＣＸＰソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒカリフォルニア州フラートン）を用いてフローサイトメトリー分析を行った（図１２および１３）。結果から、形質導入可能物質、Ｈｉｓ６−Ｆｏｘｐ３−１１Ｒでの処理によってＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）が劇的に増加し、増加はタンパク質用量依存的であることが明らかになった。

【0085】

１００ｍｌの健常ヒト血液をドナーから採取し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）を用い、密度勾配遠心分離によって末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。ＰＢＭＣ／ｍｏｎｏ−を６ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、メリーランド州ゲイサーズバーグ）で、１０％ＦＢＳ、非必須アミノ酸、２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２００ユニット／ｍｌペニシリン、およびストレプトマイシンを含有する培養液中、３７℃、５％ＣＯ₂でインキュベートした。１時間培養後、Ｆｏｘｐ３（１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、または１００μｇ／ｍｌ）を細胞に添加した。別のウェルにＢＳＡ（１００μｇ／ｍｌ）を添加してコントロールとした。２日間培養後、同じ濃度のＦｏｘｐ３またはＢＳＡを添加した。５日間培養後、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。細胞を１００μＬに再懸濁し、ウサギ抗ヒトＣＤ２５を添加した（９０分間）。細胞を冷１Ｘ ＰＢＳ（２％ＦＢＳ含有）で３回洗浄した後、ＰＥコンジュゲート・マウス抗ヒトＣＤ４およびＦＩＴＣコンジュゲート・ヤギ抗ウサギＩｇＧを、氷中６０分間、細胞に添加した。ＰＥコンジュゲート・マウスＩｇＧおよびウサギＩｇＧを別の群の細胞と共にインキュベートし、アイソタイプ・コントロールとした。細胞をＰＢＳで洗浄し、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＦＣ５００血球計数器とＣｙｔｏｍｉｃｓ ＣＸＰソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒカリフォルニア州フラートン）を用いてフローサイトメトリー分析を行った（図１４−１７）。結果から、形質導入可能物質、Ｈｉｓ６−Ｆｏｘｐ３−１１Ｒでの処理によってＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）が劇的に増加し、増加はタンパク質用量依存的であることが明らかになった。

【0086】

実施例４：スーパーチャージしたＳｏｘ９による骨髄由来ＭＳＣの再プログラミングと、その軟骨形成細胞への再プログラミング
分子工学技術を用いてＳｏｘ９を極めて大きい正電荷を有する（ｓｕｐｅｒ ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ ｃｈａｒｇｅｄ）緑色蛍光タンパク質（ｓｃＧＦＰ）と融合することにより、生理活性を有するスーパーチャージしたＳｏｘ９（ｓｃＳｏｘ９、ｓｃＧＦＰ−Ｓｏｘ９−１１Ｒとも称され、その配列を図２２（ｎ）に示す）を作製した。要約すると、先ず、ｓｃＳｏｘ９をコードするｃＤＮＡ配列をＥ．ｃｏｌｉにおける高レベルタンパク質発現に最適化し、続いて合成した。次に、この遺伝子をベクターｐＥＴ−１５ｂにサブクローニングし、続いてこのタンパク質発現プラスミドをＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞に形質転換した。最後に、融合タンパク質を産生およびリフォールディングさせ、Ｅ．ｃｏｌｉ培養物から精製した。

【0087】

５継代目のヒト皮膚線維芽細胞の細胞株（ＨＨＦ）およびヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を、３７℃のＤＭＥＭ培地において単層または細胞凝集塊で、１０μｇ／ｍｌ ｓｃＳｏｘ９または１０μｇ／ｍｌ ｓｃＧＦＰ（陰性対照）により培養した。ｓｃＳｏｘ９による１時間のインキュベート後に細胞を洗浄し、蛍光顕微鏡で観察した。ＨＨＦ細胞およびＭＳＣは両者共に、緑色蛍光の細胞内発現を示し、これらの細胞へのｓｃＳｏｘ９の進入を示唆した（図２３）。

【0088】

ｓｃＳｏｘ９またはバッファーを添加した、１０％ＦＢＳおよび低グルコース（１．５ｇ／ｌ）を含有するＤＭＥＭにおいてＭＳＣを培養した。ｓｃＳｏｘ９処理ＭＳＣの数は、培養７２時間後に、バッファー処理ＭＳＣと比較して２倍に増加した（図２４）。この結果は、ｓｃＳｏｘ９が、追加的な増殖因子を要求せずに、ＭＳＣ増殖および分化を誘導できたことを示した。

【0089】

次に、ＭＳＣから軟骨細胞への分化を調査した。１％ＦＢＳおよび高グルコース（４．５ｇ／ｌ）を含有するＤＭＥＭにおいてＭＳＣを培養し、１０μｇ／ｍｌのｓｃＳｏｘ９を添加した。２４時間後に、追加的なｓｃＳｏｘ９を添加しない、０％ＦＢＳおよび高グルコースを含有するＤＭＥＭに培養培地を交換した。培養を１４日間維持した。早くも４８時間目に、ｓｃＳｏｘ９処理ＭＳＣは、形態を軟骨細胞様細胞に変化させ始め、培養においてこの形態を２１日間維持した。このように形態的に変化した細胞は、陽性トルイジンブルー染色され、この結果は、関節軟骨マトリックスにおけるプロテオグリカンの主要成分であるアグリカンの産生と軟骨細胞の機能を実証した（図２５）。この結果は、ｓｃＳｏｘ９が、ＭＳＣの軟骨細胞分化を誘導したことを示した。

【0090】

さらに、ｓｃＳｏｘ９は、コラーゲンＩＩ型発現を誘導し、コラーゲンＩ型およびＸ型産生を下方調節した（図２６〜２７）。軟骨形成のため、ヒト骨髄由来ＭＳＣを、１０μｇ／ｍｌのｓｃＧＦＰ（図２６ＡおよびＣ）またはｓｃＳｏｘ９（図２６ＢおよびＤ）により、単層（図２６ＡおよびＢ）または凝集塊（図２６ＣおよびＤ）で培養した。１４日目に凝集塊を収集し、素早く凍結（ｓｎａｐ−ｆｒｏｚｅｎ）した。クリオスタット切片を、マウス抗ヒトコラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅ）ＩＩ型モノクローナル抗体で染色した（免疫ペルオキシダーゼ染色）。図２６に示す通り、ｓｃＧＦＰのみで培養したＭＳＣは、凝集塊形成不良を示したが、ｓｃＳｏｘ９で培養したＭＳＣは、コラーゲンＩＩ陽性であり、優れた凝集塊形成を示した。

【0091】

バッファーのみまたは１０μｇ／ｍｌのｓｃＳｏｘ９を添加した、１％ＦＢＳおよび高グルコース（４．５ｇ／ｌ）を含有するＤＭＥＭによりＭＳＣを培養した。処理後１２時間目および４８時間目にＲＮＡを抽出し、コラーゲン（Ｃｏｌ）Ｉ、ＩＩおよびＸ型ｍＲＮＡ発現のためのＴａｑＭａｎプローブに基づく解析アッセイによりＲＴ−ＰＣＲを行った。ＧＡＰＤＨと相対的な発現で表す。図２７に示す通り、ｓｃＳｏｘ９は、コラーゲンＩＩ型増加を誘導したが、コラーゲンＩ型およびＸ型発現を減少させた。

【0092】

Ｘ型コラーゲンは通常、肥大軟骨細胞において発現され、ＩＩ型コラーゲンは線維軟骨において発現され、一方、優位な（ｓｕｐｅｒｉｏｒ）硝子軟骨は、Ｉ型コラーゲンを発現する。このデータは、ｓｃＳｏｘ９が、軟骨形成を促進しつつ、同時に軟骨細胞肥大化を抑圧し、骨形成を阻止できることを示す。最も重要なことには、１回のｓｃＳｏｘ９添加が、軟骨細胞へのＭＳＣ分化の誘導に十分であり、軟骨細胞表現型を維持した。

【0093】

これらのインビトロデータは、ｓｃＳｏｘ９が、骨髄由来ＭＳＣに進入し、軟骨形成を誘導し、軟骨細胞表現型を維持することができることを実証した。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18-1】

【図18-2】

【図19-1】

【図19-2】

【図19-3】

【図19-4】

【図20-1】

【図20-2】

【図20-3】

【図20-4】

【図21-1】

【図21-2】

【図21-3】

【図21-4】

【図22-1】

【図22-2】

【図22-3】

【図22-4】

【図22-5】

【図22-6】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]