特許 6117251 慢性閉塞性肺疾患の患者の転帰予測

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6117251

(24)【登録日】2017年3月31日

(45)【発行日】2017年4月19日

(54)【発明の名称】慢性閉塞性肺疾患の患者の転帰予測

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/68 20060101AFI20170410BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/68

【請求項の数】15

【全頁数】29

(21)【出願番号】特願2014-560266(P2014-560266)

(86)(22)【出願日】2013年2月26日

(65)【公表番号】特表2015-509596(P2015-509596A)

(43)【公表日】2015年3月30日

(86)【国際出願番号】EP2013000558

(87)【国際公開番号】WO2013131621

(87)【国際公開日】20130912

【審査請求日】2015年3月6日

(31)【優先権主張番号】12001590.4

(32)【優先日】2012年3月8日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】508093584

【氏名又は名称】ベー．エル．アー．ハー．エム．エス ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング

(74)【代理人】

【識別番号】100129425

【弁理士】

【氏名又は名称】小川 護晃

(74)【代理人】

【識別番号】100099623

【弁理士】

【氏名又は名称】奥山 尚一

(74)【代理人】

【識別番号】100087505

【弁理士】

【氏名又は名称】西山 春之

(74)【代理人】

【識別番号】100167025

【弁理士】

【氏名又は名称】池本 理絵

(74)【代理人】

【識別番号】100168642

【弁理士】

【氏名又は名称】関谷 充司

(74)【代理人】

【識別番号】100096769

【弁理士】

【氏名又は名称】有原 幸一

(74)【代理人】

【識別番号】100107319

【弁理士】

【氏名又は名称】松島 鉄男

(74)【代理人】

【識別番号】100114591

【弁理士】

【氏名又は名称】河村 英文

(72)【発明者】

【氏名】ギースルドルフ，セブン

(72)【発明者】

【氏名】タム，マイケル

(72)【発明者】

【氏名】シュトルツ，ダイアナ

【審査官】 草川 貴史

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１０／０５４８１０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１２−５０８３８６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１０−５２６３０５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１０−５１３８７９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２０１０／００５５６８３（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＣＯＰＤの患者のリスク評価および／または治療のモニタリングを行う方法であって、
（ｉ）前記患者の体液の試料中のプロアドレノメデュリン（プロＡＤＭ）、プロナトリウム利尿ペプチド、プロバソプレシン（プロＡＶＰ）およびプロカルシトニン（ＰＣＴ）からなる群から選択される少なくとも１つのバイオマーカーまたは少なくとも１２のアミノ酸の長さを有するそれらの断片のレベルを決定するステップと、
（ｉｉ）ＢＯＤＥ指数パラメータを決定するステップであって、
（ｉｉ−ａ）前記ＢＯＤＥ指数パラメータである肥満度指数（ＢＭＩ、パラメータＢ）、気流閉塞の程度（ＦＥＶ_１、パラメータＯ）、呼吸困難（パラメータＤ）および運動能力（パラメータＥ）のうち、運動能力（パラメータＥ）を除いて決定するか、
（ｉｉ−ｂ）前記ＢＯＤＥ指数パラメータである肥満度指数（ＢＭＩ、パラメータＢ）、気流閉塞の程度（ＦＥＶ_１、パラメータＯ）、呼吸困難（パラメータＤ）および運動能力（パラメータＥ）のうち、運動能力（パラメータＥ）および気流閉塞の程度（ＦＥＶ_１、パラメータＯ）を除いて決定するステップと、
（ｉｉｉ）前記ステップ（ｉ）で決定された少なくとも１つのバイオマーカーの前記レベルを、前記ステップ（ｉｉ）で決定されたＢＯＤＥ指数パラメータと組み合わせて、ＣＯＰＤの患者のリスク評価および／または治療のモニタリングと相関させるステップと
を含む方法。

【請求項2】

前記少なくとも１つのバイオマーカーまたは少なくとも１２のアミノ酸の長さを有するその断片の前記レベルが、連続変数またはカテゴリー変数として、前記ＢＯＤＥ指数パラメータと組み合わされる請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記少なくとも１つのバイオマーカーまたは少なくとも１２のアミノ酸の長さを有するその断片の前記レベルと前記ＢＯＤＥ指数パラメータとがスコアとして組み合わされる請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記少なくとも１つのバイオマーカーまたは少なくとも１２のアミノ酸の長さを有するその断片の前記レベルと前記ＢＯＤＥ指数パラメータとが別々に重み付けされる請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

ＣＯＰＤと診断された患者が疾患の安定状態にあっても不安定（急性増悪）状態にあってもよい請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記リスク評価が、死亡のリスク評価と関係して患者が潜在的な生存者と潜在的な非生存者に分類され、この潜在的な生存者と潜在的な非生存者の分類が、前記ステップ（ｉ）で決定された少なくとも１つのバイオマーカーの前記レベルを、前記ステップ（ｉｉ−ａ）又は（ｉｉ−ｂ）で決定された前記ＢＯＤＥ指数パラメータと組み合わせて、数学的な計算によって行われる請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記リスク評価が、５年以内、４年以内、３年以内、２年以内、１年以内、又は６ヶ月以内の死亡のリスク評価に関する請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記リスク評価が、急性増悪を起こすリスクと関係して患者が急性増悪を起こす可能性が高い患者群または急性増悪を起こさない可能性が高い患者群のどちらかに分類され、この急性増悪を起こす可能性が高い患者群または急性増悪を起こさない可能性が高い患者群のどちらかへの分類が、前記ステップ（ｉ）で決定された少なくとも１つのバイオマーカーの前記レベルを、前記ステップ（ｉｉ−ａ）又は（ｉｉ−ｂ）で決定された前記ＢＯＤＥ指数パラメータと組み合わせて、数学的な計算によって行われる請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記リスク評価が、２年以内、１年以内、６ヶ月以内、３ヶ月以内、９０日以内、１ヶ月以内、３０日以内、１４日以内、又は７日以内に急性増悪を起こすリスク評価に関する請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記試料が、血液試料、血清試料、血漿試料、脳脊髄液試料、唾液試料および尿試料または前述の試料のいずれかの抽出物を含む群から選択される請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

ＭＲ−プロＡＤＭ、ＮＴ−プロＢＮＰ、ＢＮＰ、ＭＲ−プロＡＮＰ、コペプチン、ＰＣＴ１〜１１６、ＰＣＴ２〜１１６またはＰＣＴ３〜１１６からなる群から選択される前駆体断片のレベルが決定される請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

ＭＲ−プロＡＤＭの閾値が０．５から２ｎｍｏｌ／Ｌの間、０．５から１ｎｍｏｌ／Ｌの間、又は０．５から０．８ｎｍｏｌ／Ｌの間である請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

ＭＲ−プロＡＮＰの閾値が５０から２５０ｐｍｏｌ／Ｌの間、５０から２００ｐｍｏｌ／Ｌの間、又は５０から１４０ｐｍｏｌ／Ｌの間である請求項１１に記載の方法。

【請求項14】

コペプチンの閾値が２から３０ｐｍｏｌ／Ｌの間、２から２０ｐｍｏｌ／Ｌの間、又は２から１４ｐｍｏｌ／Ｌの間である請求項１１に記載の方法。

【請求項15】

ＰＣＴの閾値が０．０７から０．５ｎｇ／ｍＬの間、０．０７から０．２５ｎｇ／ｍＬの間、０．０７から０．２ｎｇ／ｍＬの間、又は０．０７から０．１ｎｇ／ｍＬの間である請求項１１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、臨床診断学の分野に関する。特に、本発明は、ＣＯＰＤの患者の体液に由来する試料におけるバイオマーカーのレベルの決定に関する。

【背景技術】

【0002】

一般的な予防可能で治療可能な疾患である慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）は、通常は進行性であり、有害な粒子または気体に対する気道および肺における増強された慢性炎症性応答に関連する持続的気流制限を特徴とする。ＣＯＰＤの症状には、呼吸困難、慢性咳嗽および慢性痰生成が含まれる。肺活量測定はＣＯＰＤの臨床診断を下すのに必要である。気管支拡張薬後ＦＥＶ_１／ＦＶＣ（１秒間強制吸気容量／強制肺活量）＜０．７０が存在すれば、持続的気流制限の存在およびしたがってＣＯＰＤが確認される。

【0003】

臨床的に関連するＣＯＰＤの有病率は、欧州の成人人口中約４〜６％であり、ＣＯＰＤ患者の推定数は英国で３００万人、ドイツで２７０万人、フランスで２６０万人である。合衆国ではおよそ１６００万の成人がＣＯＰＤに冒されている。さらに、ＣＯＰＤは、罹患および死亡のもっとも急速に増えている原因の１つになっている（ＰａｕｗｅｌｓおよびＲａｂｅ ２００４年．Ｌａｎｃｅｔ ３６４：６１３〜６２０ページ；Ｓｕｌｌｉｖａｎら、２０００年．Ｃｈｅｓｔ １１７：５Ｓ〜９Ｓ；Ｌｏｐｅｚら、２００６年．Ｌａｎｃｅｔ ３６７：１７４７〜１７５７ページ）。ＣＯＰＤは世界的には５番目の主要な死因であり、今後数十年でその罹患率および死亡率のさらなる増加が予想される（ＰａｕｗｅｌｓおよびＲａｂｅ ２００４年．Ｌａｎｃｅｔ ３６４：６１３〜６２０ページ）。

【0004】

慢性閉塞性肺疾患の増悪（症状の急性悪化のエピソード）はすべての急性入院の２．４％を超える原因であり、ＣＯＰＤに関連するもっとも重要な直接的医療費を構成する（Ｄｏｎａｌｄｓｏｎら、２００６年．Ｔｈｏｒａｘ ６１：１６４〜１６８ページ；Ｈａｌｂｅｒｔら、２００６年．Ｅｕｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ ２８：５２３〜５３２ページ；Ｌｉｎｄｅｎａｕｅｒら、２００６年．Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ １４４：８９４〜９０３ページ）。米国では、重篤なＣＯＰＤの患者のコホート中におけるＣＯＰＤによる平均入院費は、７１００米ドルと推定された（Ｈａｌｂｅｒｔら、２００６年．Ｅｕｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ ２８：５２３〜５３２ページ；Ｃｏｎｎｏｒｓら、１９９８年．Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ １５４：９５９〜９６７ページ）。増悪は現在では、疾患進行の自然経過における重要なイベントと認識されている（Ｃｅｌｌｉら、２００７年．Ｅｕｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ ２９：１２２４〜１２３８ページ）。いくつかの臨床的特性が、ＡＥＣＯＰＤにおける罹患率および死亡率の予後因子として広く確証されている（Ｃｏｎｎｏｒｓら、１９９８年．Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ １５４：９５９〜９６７ページ；Ａｎｔｏｎｅｌｌｉ Ｉｎｃａｌｚｉら、１９９７年．Ｅｕｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ １０：２７９４〜２８００ページ；Ｆｕｓｏら、１９９５年．Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ ９８：２７２〜２７７ページ；Ｇｕｎｅｎら、２００５年．Ｅｕｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ ２６：２３４〜２４ページ；Ａｌｍａｇｒｏら、２００６年．Ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ ７３：３１１〜３１７ページ）。

【0005】

疫学的には興味深いが、臨床パラメータの適中率は研究が異なれば変化し、その大多数は正確な個人のリスク評価を許さない（Ａｎｔｏｎｅｌｌｉ Ｉｎｃａｌｚｉら、１９９７年．Ｅｕｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ １０：２７９４〜２８００ページ；Ｙｏｈａｎｎｅｓら、２００５年．Ａｇｅ Ａｇｅｉｎｇ ３４：４９１〜４９６ページ；Ａｌｍａｇｒｏら、２００６年．Ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ ７３：３１１〜３１７ページ）。

【0006】

ＣＯＰＤ評価の目標は、治療を導くために、疾患の重症度、患者の健康状態に対するその影響、および将来のイベントのリスク（増悪、入院、死亡）を決定することである。

【0007】

気流制限の程度は肺活量測定（肺機能検査）を使用して評価され、１秒間強制呼気の容量は１秒間強制吸気容量（ＦＥＶ_１）と呼ばれ、リットル単位で測定される。全呼気は強制肺活量（ＦＶＣ）と呼ばれ、これもリットル単位で測定される。正常な肺機能を有する人では、ＦＥＶ_１はＦＶＣの少なくとも７０％である。次に、ＧＯＬＤ（慢性閉塞性肺疾患のグローバルイニシアティブ）ＣＯＰＤ分類法を使用して閉塞または気流制限の重症度を記載する。人の気流制限が悪くなるに従って、そのＦＥＶ_１は低くなる。ＣＯＰＤが進行するに従って、ＦＥＶ_１は低下する傾向がある。ＧＯＬＤ ＣＯＰＤ病期分類は、表１に要約されているＦＥＶ_１の値に基づいてＣＯＰＤについての重症度の４つのカテゴリーを使用する。

【0008】

ＢＯＤＥ指数（肥満度指数（Ｂ）、肺機能検査により測定される気流閉塞の程度（Ｏ）、および呼吸困難（Ｄ）、ならびに６分間歩行検査により測定される運動能力（Ｅ））は最近確立されており、ＣＯＰＤの患者における死亡率（Ｃｅｌｌｉら、２００４年．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ；３５０：１００５〜１０１２ページ）およびＣＯＰＤによる入院（Ｏｎｇら、２００５年．Ｃｈｅｓｔ １２８：３８１０〜３８１６ページ）の予後のためのツールであることが明らかにされた。しかし、この指数の決定は、疾患の安定状態での６分間歩行検査（６ＭＷＴ）が必要であり、急性増悪にも適していないために、厄介である。したがって、ＣＯＰＤの患者における疾患重症度をモニターする肺バイオマーカーを含む、他のパラメータを使用することに益々関心が高まってきた（Ｂａｒｎｅｓら、２００６年．Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ １７４：６〜１４ページ）。ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、Ｃ−反応性タンパク質、エンドセリン−１およびプロカルシトニンを含むいくつかの循環バイオマーカーは増悪中に増加し、循環中への局所的気道炎症の溢流を潜在的に反映している（Ｈｕｒｓｔら、２００６年．Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ １７４：８６７〜８７４ページ；Ｐｉｎｔｏ−Ｐｌａｔａら、２００７年．Ｃｈｅｓｔ １３１：３７〜４３ページ；Ｒｏｌａｎｄら、２００１年．Ｔｈｏｒａｘ ５６：３０〜３５ページ；Ｓｔｏｌｚら、２００７年．Ｃｈｅｓｔ １３１：９〜１９ページ）。

【0009】

全身マーカーも安定的なＣＯＰＤにおける疾患重症度および予後を決定する手段として最近一般的な関心を集めている（Ｄａｈｌら、２００７年．Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ １７５：２５０〜２５５ページ；ｄｅ Ｔｏｒｒｅｓら、２００６年．Ｅｕｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ ２７：９０２〜９０７ページ；Ｍａｎら、２００６年．Ｔｈｏｒａｘ ６１：８４９〜８５３ページ）。しかし、それでも、現行のバイオマーカーが著しい臨床転帰、特にＡＥＣＯＰＤ中および外部の生存とどのように関係するのか、ならびに安定的なＣＯＰＤの予後に関してどの全身バイオマーカーがＢＯＤＥ指数に取って代わることができるのかどうかについての情報は乏しい（Ｂａｒｎｅｓら、２００６年．Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ １７４：６〜１４ページ；Ｆｒａｎｃｉｏｓｉら、２００６年．Ｒｅｓｐｉｒ Ｒｅｓ ７：７４ページ；Ｂｈｏｗｍｉｋら、２０００年．Ｔｈｏｒａｘ ５５：１１４〜１２０ページ；Ｗｅｄｚｉｃｈａら、２０００年．Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ８４：２１０〜２１５ページ；Ｄｅｖら、１９９８年．Ｒｅｓｐｉｒ Ｍｅｄ ９２：６６４〜６６７ページ）。

【0010】

バイオマーカーであるコペプチン、中間領域プロアドレノメデュリン（ＭＲ−プロＡＤＭ）および中間領域プロ心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＭＲ−プロＡＮＰ）は、入院を必要とするＣＯＰＤの重度の増悪を抱えた患者の予後において助けとなる可能性があることが最近明らかにされた（Ｓｔｏｌｚら、２００７年．Ｃｈｅｓｔ １３１：１０５８〜１０６７ページ；Ｓｔｏｌｚら、２００８年．Ｃｈｅｓｔ １３４：２６３〜２７２ページ；Ｂｅｒｎａｓｃｏｎｉら、２０１１年．Ｃｈｅｓｔ １４０：９１〜９９ページ）。しかし、安定状態でのそのようなバイオマーカーの予後的価値はまだ知られておらず、外来患者のためのリスク層別化戦略は見つかっていない。

【発明の概要】

【0011】

本発明の主な目的は、ＣＯＰＤの患者の簡単で信頼性のある予後および／またはリスク評価および／または治療のモニタリングおよび／またはマネージメントを可能にする方法を提供することである。

【0012】

更なる目的は、ＣＯＰＤの患者の予後および／またはリスク評価および／または治療のモニタリングおよび／またはマネージメントを、前記患者への不利益を最小限に抑えて、可能にする方法を提供することである。

【0013】

また更なる目的は、ＢＯＤＥ指数パラメータの従来の決定の少なくとも一部に取って代わることができ、好ましくは、したがって患者の負担を軽減する方法を提供することである。

【0014】

本発明は、ＣＯＰＤの患者の予後および／またはリスク評価および／または治療のモニタリングおよび／またはマネージメントを行う方法であって、この方法は、
（ｉ）前記患者から体液の試料を得るステップと、
（ｉｉ）前記試料中のプロアドレノメデュリン（プロＡＤＭ）、プロナトリウム利尿ペプチド、プロバソプレシン（プロＡＶＰ）およびプロカルシトニン（ＰＣＴ）からなる群から選択される少なくとも１つのバイオマーカーまたは少なくとも１２のアミノ酸の長さを有するそれらの断片のレベルを決定するステップと、
（ｉｉｉ）ＢＯＤＥ指数パラメータである肥満度指数（ＢＭＩ、パラメータＢ）、気流閉塞の程度（ＦＥＶ_１、パラメータＯ）、呼吸困難（パラメータＤ）および運動能力（パラメータＥ）のうちの１つ、２つ、または３つを決定するステップと、
（ｉｖ）前記ステップ（ｉｉ）で決定された少なくとも１つのバイオマーカーの前記レベルを、前記ステップ（ｉｉｉ）で決定された１つ、２つまたは３つのＢＯＤＥ指数パラメータと組み合わせて、ＣＯＰＤの患者の予後および／またはリスク評価および／または治療のモニタリングおよび／またはマネージメントと相関させるステップと
を含む。

【0015】

この方法の好ましいバリエーションは、特許請求の範囲において引用形式の請求項として記載されている。

【0016】

したがって、本発明の方法では、患者の体液中の少なくとも１つの特に選択されたバイオマーカー（ステップｉｉ）を決定することと、４つのＢＯＤＥ指数パラメータ（ステップｉｉｉ）の中から最大で３つを決定することとを組み合わせて、ＣＯＰＤの患者の予後および／またはリスク評価および／または治療のモニタリングおよび／またはマネージメントのために、前記バイオマーカーレベルを前記最大で３つの決定されたＢＯＤＥ指数値と相関させる。以下に示すように、バイオマーカーを含むモデルは、ＢＯＤＥ指数パラメータのみを使用するモデルよりも有意に良好であり、２年以内の死亡予測は、バイオマーカーをＢＯＤＥ指数パラメータのうちの最大で３つ、特に指数パラメータＢＯＤまたはＢＤと組み合わせた場合、すなわち指数パラメータＥおよび／またはＯを除く場合に、同様に又は遥かに良好であった。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】ＣＯＰＤの患者の２年以内の死亡予測についてのＭＲ−プロＡＤＭ値の箱髭図である。

【図2】ＣＯＰＤの患者の２年以内の死亡予測についてのＭＲ−プロＡＮＰ値の箱髭図である。

【図3】ＣＯＰＤの患者の２年以内の死亡予測についてのコペプチン値の箱髭図である。

【図4】ＣＯＰＤの患者の２年以内の死亡予測についてのＰＣＴ値の箱髭図である。

【図5】ＣＯＰＤの患者の２年以内の死亡予測についてのＭＲ−プロＡＤＭのＲＯＣプロット（ＡＵＣ＝０．６３２）である。

【図6】ＣＯＰＤの患者の２年以内の死亡予測についてのＭＲ−プロＡＮＰのＲＯＣプロット（ＡＵＣ＝０．６１１）である。

【図7】ＣＯＰＤの患者の２年以内の死亡予測についてのコペプチンのＲＯＣプロット（ＡＵＣ＝０．６０５）である。

【図8】ＣＯＰＤの患者の２年以内の死亡予測についてのＰＣＴのＲＯＣプロット（ＡＵＣ＝０．６０４）である。

【図9】ＣＯＰＤの患者のＭＲ−プロＡＤＭの四分位点によるカプランマイヤー生存曲線（２年以内の死亡）である。

【図10】ＣＯＰＤの患者のＭＲ−プロＡＮＰの四分位点によるカプランマイヤー生存曲線（２年以内の死亡）である。

【図11】ＣＯＰＤの患者のコペプチンの四分位点によるカプランマイヤー生存曲線（２年以内の死亡）である。

【図12】ＣＯＰＤの患者のＰＣＴの四分位点によるカプランマイヤー生存曲線（２年以内の死亡）である。

【図13】ＣＯＰＤの患者の２年以内の死亡予測についてのＢＯＤＥと組み合わせたＭＲ−プロＡＤＭのＲＯＣプロット（ＡＵＣ＝０．７５０）である。

【図14】ＣＯＰＤの患者の２年以内の死亡予測についてのＢＯＤと組み合わせたＭＲ−プロＡＤＭのＲＯＣプロット（ＡＵＣ＝０．７４３）である。

【図15】ＣＯＰＤの患者の２年以内の死亡予測についてのＢＤと組み合わせたＭＲ−プロＡＤＭのＲＯＣプロット（ＡＵＣ＝０．７５６）である。

【図16】ＣＯＰＤの患者の２年以内の死亡予測についてのＢＯＤＥと組み合わせたＭＲ−プロＡＮＰのＲＯＣプロット（ＡＵＣ＝０．７３６）である。

【図17】ＣＯＰＤの患者の２年以内の死亡予測についてのＢＯＤと組み合わせたＭＲ−プロＡＮＰのＲＯＣプロット（ＡＵＣ＝０．７２７）である。

【図18】ＣＯＰＤの患者の２年以内の死亡予測についてのＢＤと組み合わせたＭＲ−プロＡＮＰのＲＯＣプロット（ＡＵＣ＝０．７４１）である。

【図19】ＣＯＰＤの患者の２年以内の死亡予測についてのＢＯＤＥと組み合わせたコペプチンのＲＯＣプロット（ＡＵＣ＝０．７１０）である。

【図20】ＣＯＰＤの患者の２年以内の死亡予測についてのＢＯＤと組み合わせたコペプチンのＲＯＣプロット（ＡＵＣ＝０．７０３）である。

【図21】ＣＯＰＤの患者の２年以内の死亡予測についてのＢＤと組み合わせたコペプチンのＲＯＣプロット（ＡＵＣ＝０．７２４）である。

【図22】ＣＯＰＤの患者の２年以内の死亡予測についてのＢＯＤＥと組み合わせたＰＣＴのＲＯＣプロット（ＡＵＣ＝０．６９８）である。

【図23】ＣＯＰＤの患者の２年以内の死亡予測についてのＢＯＤと組み合わせたＰＣＴのＲＯＣプロット（ＡＵＣ＝０．６７８）である。

【図24】ＣＯＰＤの患者の２年以内の死亡予測についてのＢＤと組み合わせたＰＣＴのＲＯＣプロット（ＡＵＣ＝０．７０６）である。

【図25】ＣＯＰＤの患者を組み合わせスコアに応じてリスク群に分けることによるＢＯＤＥとＭＲ−プロＡＤＭ（表５に示される通りにカットオフを使用し続いてスコア化しカテゴリー変数として適用される）の組み合わせについてのカプランマイヤー生存曲線（２年以内の死亡）である。

【図26】ＣＯＰＤの患者を組み合わせスコアに応じてリスク群に分けることによるＢＯＤとＭＲ−プロＡＤＭ（表５に示される通りにカットオフを使用し続いてスコア化しカテゴリー変数として適用される）の組み合わせについてのカプランマイヤー生存曲線（２年以内の死亡）である。

【図27】ＣＯＰＤの患者を組み合わせスコアに応じてリスク群に分けることによるＢＤとＭＲ−プロＡＤＭ（表５に示される通りにカットオフを使用し続いてスコア化しカテゴリー変数として適用される）の組み合わせについてのカプランマイヤー生存曲線（２年以内の死亡）である。

【図28】ＣＯＰＤの患者を組み合わせスコアに応じてリスク群に分けることによるＢＯＤＥとＭＲ−プロＡＮＰ（表５に示される通りにカットオフを使用し続いてスコア化しカテゴリー変数として適用される）の組み合わせについてのカプランマイヤー生存曲線（２年以内の死亡）である。

【図29】ＣＯＰＤの患者を組み合わせスコアに応じてリスク群に分けることによるＢＯＤとＭＲ−プロＡＮＰ（表５に示される通りにカットオフを使用し続いてスコア化しカテゴリー変数として適用される）の組み合わせについてのカプランマイヤー生存曲線（２年以内の死亡）である。

【図30】ＣＯＰＤの患者を組み合わせスコアに応じてリスク群に分けることによるＢＤとＭＲ−プロＡＮＰ（表５に示される通りにカットオフを使用し続いてスコア化しカテゴリー変数として適用される）の組み合わせについてのカプランマイヤー生存曲線（２年以内の死亡）である。

【図31】ＣＯＰＤの患者を組み合わせスコアに応じてリスク群に分けることによるＢＯＤＥとコペプチン（表５に示される通りにカットオフを使用し続いてスコア化しカテゴリー変数として適用される）の組み合わせについてのカプランマイヤー生存曲線（２年以内の死亡）である。

【図32】ＣＯＰＤの患者を組み合わせスコアに応じてリスク群に分けることによるＢＯＤとコペプチン（表５に示される通りにカットオフを使用し続いてスコア化しカテゴリー変数として適用される）の組み合わせについてのカプランマイヤー生存曲線（２年以内の死亡）である。

【図33】ＣＯＰＤの患者を組み合わせスコアに応じてリスク群に分けることによるＢＤとコペプチン（表５に示される通りにカットオフを使用し続いてスコア化しカテゴリー変数として適用される）の組み合わせについてのカプランマイヤー生存曲線（２年以内の死亡）である。

【図34】ＣＯＰＤの患者を組み合わせスコアに応じてリスク群に分けることによるＢＯＤＥとＰＣＴ（表５に示される通りにカットオフを使用し続いてスコア化しカテゴリー変数として適用される）の組み合わせについてのカプランマイヤー生存曲線（２年以内の死亡）である。

【図35】ＣＯＰＤの患者を組み合わせスコアに応じてリスク群に分けることによるＢＯＤとＰＣＴ（表５に示される通りにカットオフを使用し続いてスコア化しカテゴリー変数として適用される）の組み合わせについてのカプランマイヤー生存曲線（２年以内の死亡）である。

【図36】ＣＯＰＤの患者を組み合わせスコアに応じてリスク群に分けることによるＢＤとＰＣＴ（表５に示される通りにカットオフを使用し続いてスコア化しカテゴリー変数として適用される）の組み合わせについてのカプランマイヤー生存曲線（２年以内の死亡）である。

【発明を実施するための形態】

【0018】

本発明の主題は、ＣＯＰＤの患者の予後および／またはリスク評価および／または治療のモニタリングおよび／またはマネージメントを行う方法であって、この方法は、
（ｉ）患者から体液の試料を得るステップと、
（ｉｉ）プロアドレノメデュリン（プロＡＤＭ）、プロナトリウム利尿ペプチド、プロバソプレシン（プロＡＶＰ）およびプロカルシトニン（ＰＣＴ）からなる群から選択される少なくとも１つのバイオマーカーまたは少なくとも１２のアミノ酸の長さを有するそれらの断片のレベルを前記試料において決定するステップと、
（ｉｉｉ）ＢＯＤＥ指数パラメータである肥満度指数（ＢＭＩ、パラメータＢ）、気流閉塞の程度（ＦＥＶ_１、パラメータＯ）、呼吸困難（パラメータＤ）および運動能力（パラメータＥ）のうちの１つ、２つ、または３つを決定するステップと、
（ｉｖ）前記ステップ（ｉｉ）で決定された少なくとも１つのバイオマーカーの前記レベルを、前記ステップ（ｉｉｉ）で決定された１つ、２つまたは３つのＢＯＤＥ指数パラメータと組み合わせて、ＣＯＰＤの患者の予後および／またはリスク評価および／または治療のモニタリングおよび／またはマネージメントと相関させるステップと
を含む。

【0019】

用語「組み合わせ」とは、各種複数のパラメータを可能な限り選択し、数学的アルゴリズムを使用してこれらパラメータを特定の群にアレンジすることと定義される。

【0020】

用語「パラメータ」は、特定の系を定義する際に助けとなり得る特性、特長または測定可能な因子として、本発明では用いており、例えば、バイオマーカー（コペプチンやＰＣＴなど）、説明変数（年齢、性別、ＢＭＩなど）または臨床変数（ＦＥＶ_１など）がある。

【0021】

好ましい実施形態では、前記少なくとも１つのバイオマーカーまたは少なくとも１２のアミノ酸の長さを有するそれらの断片の前記レベルは、ＢＯＤＥ指数パラメータである肥満度指数（ＢＭＩ、パラメータＢ）と気流閉塞の程度（ＦＥＶ_１、パラメータＯ）と呼吸困難（パラメータＤ）の組み合わせ、又はＢＯＤＥ指数パラメータである肥満度指数（ＢＭＩ、パラメータＢ）と呼吸困難（パラメータＤ）の組み合わせで使用される。

【0022】

別の好ましい実施形態では、プロＡＤＭ、プロナトリウム利尿ペプチド、プロＡＶＰおよびＰＣＴからなる群から選択される少なくとも１つのバイオマーカーまたは少なくとも１２のアミノ酸の長さを有するそれらの断片の前記レベルと、前記１つ、２つまたは３つのＢＯＤＥ指数パラメータとを、連続変数またはカテゴリー変数として組み合わせることが可能である。

【0023】

好ましい実施形態では、プロＡＤＭ、プロナトリウム利尿ペプチド、プロＡＶＰおよびＰＣＴからなる群から選択される少なくとも１つのバイオマーカーまたは少なくとも１２のアミノ酸の長さを有するそれらの断片の前記レベルと、前記１つ、２つまたは３つのＢＯＤＥ指数パラメータとを、スコアにして、組み合わせることが可能である。例えば、前記バイオマーカーレベルは、１つまたは複数の閾値（cut-off value）を使用して二択化（dichotomized）されるか又はカテゴリー化されるような、２値変数またはカテゴリー変数としてもよい。次に、このような変数、すなわちスコアは、例えば、指数パラメータであるＢＯＤまたはＢＤから導き出される（retrieved）スコアと加算して、組み合わせスコアとすることができる。

【0024】

本発明の方法の具体的な実施形態では、プロＡＤＭ、プロナトリウム利尿ペプチド、プロＡＶＰおよびＰＣＴからなる群から選択される少なくとも１つのバイオマーカーまたは少なくとも１２のアミノ酸の長さを有するそれらの断片の前記レベルと、前記１つ、２つまたは３つのＢＯＤＥ指数パラメータとは、別々に重み付けされる。

【0025】

別の好ましい実施形態では、予後および／またはリスク評価は、死亡率のリスクと関係し、患者は潜在的生存者と潜在的非生存者に層別化される。

【0026】

特に好ましい実施形態では、予後および／またはリスク評価は、５年以内、より好ましくは４年以内、さらに好ましくは３年以内、さらに好ましくは２年以内、さらに好ましくは１年以内、もっとも好ましくは６ヶ月以内の死亡率のリスク評価に関する。

【0027】

別の好ましい実施形態では、予後および／またはリスク評価は、急性増悪の発生のリスクに関し、患者は、急性増悪を起こす可能性が高い患者群か、急性増悪を起こさない可能性が高い患者群かのどちらかに分類される。

【0028】

特に好ましい実施形態では、予後および／またはリスク評価は、２年以内、より好ましくは１年以内、さらに好ましくは６ヶ月以内、さらに好ましくは３ヶ月以内、さらに好ましくは９０日以内、さらに好ましくは１ヶ月以内、さらに好ましくは３０日以内、さらに好ましくは１４日以内、もっとも好ましくは７日以内に急性増悪を起こすリスク評価に関する。

【0029】

慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）は、ＧＯＬＤガイドライン（予測値の７０％より下のＦＥＶ_１／ＦＶＣ比および８０％より下のＦＥＶ_１の絶対的減少）に従って診断される。

【0030】

本発明によれば、ＣＯＰＤと診断された患者は、疾患の安定状態にあっても不安定（急性増悪）状態にあってもよい。

【0031】

ＣＯＰＤの急性増悪は、「正常な日々の変動を超えており、発症が急性であり、根底にあるＣＯＰＤを抱えている患者における常用薬剤の変化を正当化し得る患者のベースラインの呼吸困難、咳、および／または痰の変化に特徴がある前記疾患の自然経過におけるイベント」として定義されている（Ｒａｂｅら、２００７年．Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ １７６：５３２〜５５５ページ）。

【0032】

ＣＯＰＤの重症度は、予測される気管支拡張薬後ＦＥＶ_１％を使用して、ＧＯＬＤ基準に従って類別される。予測値の５０％から８０％のＦＥＶ_１は中程度ＣＯＰＤ（ＧＯＬＤ ＩＩ）と定義し、３０％から５０％のＦＥＶ_１は重症ＣＯＰＤ（ＧＯＬＤ ＩＩＩ）と定義し、３０％未満のＦＥＶ_１は極めて重症ＣＯＰＤ（ＧＯＬＤ ＩＶ）と定義する（表１参照）。１秒間強制呼気の容量は、１秒間強制呼気容量（ＦＥＶ_１）と呼ばれ、リットルで測定される。

【0033】

ＢＯＤＥは、ＣＯＰＤにかかった人の臨床リスクを評価するために考案された多次元指数である（Ｃｅｌｌｉら、２００４年．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５０：１００５〜１０１２ページ）。ＢＯＤＥは４つの変数、すなわち、（Ｂ）肥満度指数と、（Ｏ）１秒間強制呼気容量（ＦＥＶ_１）により測定される気流閉塞と、（Ｄ）修正医学研究審議会（ＭＲＣ）スケールにより測定される呼吸困難と、（Ｅ）６分間歩行距離（６ＭＷＤ）により測定される運動能力とを、１つのスコアに組み合わせるものである。それぞれの要素はグレード化されており、１０段階のスコアが得られ（表２）、スコアが高いほど大きなリスクを示している。ＢＯＤＥ指数は、ＣＯＰＤにおける予後および生存に対する肺要因と肺外要因の両方の影響を反映する。

【0034】

本発明において、用語「予後」（prognosis）とは、対象（例えば、患者）の医学的な症状がどのように進行するか予測することをいう。これには、対象の回復の可能性や転帰不良の可能性を推定することも含まれ得る。

【0035】

本発明において、用語「リスク評価」（risk assessment）とは、一個人に各種有害な事象を経験する確率を割り当てることをいう。これによって、一個人は好ましくは各種のリスクカテゴリーに評価され、これらカテゴリーには、例えば、高リスク対低リスクのリスクカテゴリーや、リスクカテゴリー１、２、３等などの数値に基づくリスクカテゴリーが含まれる。

【0036】

本発明の文脈における用語「治療のモニタリング」とは、患者の治療処置のコントロールおよび／または適合をいう。

【0037】

本発明の文脈における用語「患者のマネージメント」とは、
・病院または集中治療室への入所の判断、
・専門病院または専門病院組織への患者の移転の判断、
・集中治療室または病院から早期退院についての評価、
・リソース（例えば、内科医および／または看護士、診断器具、薬物）の配分、
・治療処置の判断
をいう。

【0038】

診断および予後マーカーの使用に関して本明細書で使用される用語「相関させる」とは、患者の前記マーカーの存在またはレベルを、所定の状態に罹っていると判明している又はそのリスクがあると判明している人におけるその存在または量と比較することである。患者の試料中のマーカーレベルは、特定の診断と関連があると判明しているレベルと比較することができる。前記試料のマーカーレベルは、診断と相関していると言われており、すなわち、当業者であれば前記マーカーレベルを使用して、患者が特定の種類の疾患に罹っているかどうかを決定することができ、それ相応に応答することができる。あるいは、前記試料のマーカーレベルは、良好な転帰（例えば、疾患の非存在など）と関連していることが判明しているマーカーレベルと比較することができる。好ましい実施形態では、マーカーレベルのパネルは、包括的確率または特定の転帰と相関する。

【0039】

閾レベル（threshold level）は、例えば、疾患の発生または重態および／もしくは死亡の確率が、集団中のそれぞれのマーカーの四分位点などと相関するカプラン−マイヤー分析から得ることができる。この分析によれば、７５パーセンタイルを超えるマーカーレベルを有する対象は、本発明に従って疾患に罹るリスクが著しく増加する。この結果は、古典的リスク因子を調整したコックス回帰分析によって更に支持される。他のすべての対象に対する最も高い四分位点は、本発明に従って疾患に罹る増大したリスクまたは重態および／もしくは死亡の確率と著しく高度に関連する。他の好ましい閾値は、例えば、準拠集団の９０、９５または９９パーセンタイルである。７５パーセンタイルよりも高いパーセンタイルを使用することにより、同定される偽陽性対象の数は減少するが、それでもリスクが増大しているにもかかわらず中程度である対象を同定しそこなう可能性がある。したがって、「偽陽性」も同定する犠牲を払ってリスクのある対象の大半を同定するほうが適切であると見なされるのか、または中程度リスクの対象をいくつか見逃す犠牲を払っても主に高リスクの対象を同定するほうが適切であると見なされるのかに応じて閾値を適合させてもよい。

【0040】

個人のマーカーレベル値ならびに他の予後検査および臨床パラメータを使用することにより個人のリスクを計算する他の数学的可能性は、例えば、ＮＲＩ（純再分類指数）またはＩＤＩ（統合判別指数）である。前記指数はＰｅｎｃｉｎａ（Ｐｅｎｃｉｎａ ＭＪ．ら、：Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｔｈｅ ａｄｄｅｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｍａｒｋｅｒ：ｆｒｏｍ ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ＲＯＣ ｃｕｒｖｅ ｔｏ ｒｅｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｅｙｏｎｄ． Ｓｔａｔ Ｍｅｄ．２００８年；２７：１５７〜１７２ページ）に従って計算することができる。

【0041】

マーカーペプチドおよびその前駆体という文脈において本明細書で述べたように、用語「断片」（fragment）とは、より大きなタンパク質またはペプチドから誘導され得るより小さなタンパク質またはペプチドのことであり、したがって、より大きなタンパク質またはペプチドの部分的な配列を含む。これら断片は、より大きなタンパク質またはペプチドから、そのペプチド結合のうちの１つ又は複数の鹸化によって、誘導され得るものである。マーカーペプチドであるプロＡＤＭ、プロナトリウム利尿ペプチド、プロＡＶＰ、およびＰＣＴの「断片」は、好ましくは少なくとも１２のアミノ酸の長さを有する断片に関する。そのような断片は、好ましくは、本明細書に記載される免疫アッセイを用いて検出することが可能である。

【0042】

プロナトリウム利尿ペプチドは、プロ心房性ナトリウム利尿ペプチド（プロＡＮＰ）およびプロ脳性ナトリウム利尿ペプチド（プロＢＮＰ）、または少なくとも１２のアミノ酸の長さを有するそれらの断片からなる群から選択される。

【0043】

１５３アミノ酸の配列であるプレ−プロＡＮＰは配列番号１に示されている。Ｎ末端シグナルペプチド（２５アミノ酸）と２つのＣ末端アミノ酸を切断すると、プロＡＮＰ（配列番号２）が放出される。このプロホルモンは切断されて、ＡＮＰ（１〜２８）またはα−ＡＮＰとしても知られる、成熟２８アミノ酸ペプチドＡＮＰおよびアミノ末端プロＡＮＰ断片（１〜９８）（ＮＴ−プロＡＮＰ、配列番号３）になる。中間領域プロＡＮＰ（ＭＲ−プロＡＮＰ）は、ＮＴ−プロＡＮＰまたはプロＡＮＰの少なくともアミノ酸残基５３〜９０（配列番号４）を含むその任意の断片として定義される。

【0044】

本発明に係る方法の好ましい実施形態では、プロＡＮＰ前駆体断片、ＭＲ−プロＡＮＰのレベルが決定される。

【0045】

アドレノメデュリンの前駆体ペプチド（プレ−プロアドレノメデュリン）のアミノ酸配列は、配列番号５としている。プロアドレノメデュリンは、プレ−プロアドレノメデュリンの配列のアミノ酸残基２２から１８５に関係する。プロアドレノメデュリン（プロＡＤＭ）のアミノ酸配列は、配列番号６としている。ＭＲ−プロアドレノメデュリン（ＭＲ−プロＡＤＭ）は、プレ−プロＡＤＭのアミノ酸残基４５〜９２に関係する。ＭＲ−プロＡＤＭのアミノ酸配列は、配列番号７としている。

【0046】

本発明に係る方法の別の好ましい実施形態では、プロＡＤＭ前駆体断片、ＭＲ−プロＡＤＭのレベルが決定される。

【0047】

バソプレシンの１６４アミノ酸前駆体ペプチド（プレ−プロバソプレシン）の配列は、配列番号８としている。プロバソプレシンはプレ−プロバソプレシンの配列のアミノ酸残基１９から１６４に関係する。プロバソプレシンのアミノ酸配列は、配列番号９としている。プロバソプレシンは切断されて、成熟バソプレシン、ニューロフィジンＩＩおよびＣ末端プロバソプレシン（ＣＴ−プロＡＶＰまたはコペプチン）になる。コペプチンはプレ−プロバソプレシンのアミノ酸残基１２６から１６４に関係する。コペプチンのアミノ酸配列は、配列番号１０としている。ニューロフィジンＩＩはプレ−プロバソプレシンのアミノ酸残基３２から１２４を含み、その配列は配列番号１１に示されている。

【0048】

本発明に係る方法の別の好ましい実施形態では、プロＡＶＰ前駆体断片、コペプチンのレベルが決定される。

【0049】

プロカルシトニンは、カルシトニンおよびカタカルシンの前駆体である。ＰＣＴ１〜１１６のアミノ酸配列は、配列番号１２としている。

【0050】

脳性ナトリウム利尿ペプチドの１３４アミノ酸前駆体ペプチド（プレ−プロＢＮＰ）の配列は、配列番号１３としている。プロＢＮＰは、プレ−プロＢＮＰのアミノ酸残基２７から１３４に関係する。プロＢＮＰの配列は、配列番号１４に示されている。プロＢＮＰは切断されて、Ｎ末端プロＢＮＰ（ＮＴ−プロＢＮＰ）および成熟ＢＮＰとなる。ＮＴ−プロＢＮＰはアミノ酸残基２７から１０２を含み、その配列は配列番号１５に示されている。配列番号１６は、プレ−プロＢＮＰペプチドのアミノ酸残基１０３から１３４を含むＢＮＰの配列を示している。

【0051】

本発明に係る方法の好ましい実施形態では、プロＢＮＰ前駆体断片、ＮＴ−プロＢＮＰまたはＢＮＰのレベルが決定される。

【0052】

本発明に係る方法の別の好ましい実施形態では、アミノ酸１から１１６または２から１１６または３から１１６からなるＰＣＴのレベルが決定される。

【0053】

本発明の別の好ましい実施形態では、カテゴリー変数として使用される場合のバイオマーカーについて閾値を定義することができる。例えば、スコア０、２または４を生じる２つの異なる閾値をそれぞれのバイオマーカーについて定義することができる。

【0054】

好ましくはＭＲ−プロＡＤＭの閾値は０．５から２ｎｍｏｌ／Ｌの間、より好ましくは０．５から１ｎｍｏｌ／Ｌの間、もっとも好ましくは０．５から０．８ｎｍｏｌ／Ｌの間である。本発明の特に好ましい実施形態では、前記閾値は０．５および０．８ｎｍｏｌ／Ｌである。

【0055】

好ましくはＭＲ−プロＡＮＰの閾値は５０から２５０ｐｍｏｌ／Ｌの間、より好ましくは５０から２００ｐｍｏｌ／Ｌの間、もっとも好ましくは５０から１４０ｐｍｏｌ／Ｌの間である。本発明の特に好ましい実施形態では、前記閾値は５０および１４０ｐｍｏｌ／Ｌである。

【0056】

好ましくはコペプチンの閾値は２から３０ｐｍｏｌ／Ｌの間、さらに好ましくは２から２０ｐｍｏｌ／Ｌの間、もっとも好ましくは２から１４ｐｍｏｌ／Ｌの間である。本発明の特に好ましい実施形態では、前記閾値は２および１４ｐｍｏｌ／Ｌである。

【0057】

好ましくはＰＣＴの閾値は０．０７から０．５ｎｇ／ｍＬの間、さらに好ましくは０．０７から０．２５ｎｇ／ｍＬの間、さらに好ましくは０．０７から０．２ｎｇ／ｍＬの間、もっとも好ましくは０．０７から０．１ｎｇ／ｍＬの間である。本発明の特に好ましい実施形態では、前記閾値は０．０７および０．１ｎｇ／ｍＬである。

【0058】

上記閾値は、これらの値が本発明において使用されるアッセイ系とは異なる較正が行われる場合は、他のアッセイでは異なることもある。したがって、上記閾値は、そのような異なる較正が行われるアッセイには、較正の違いを考慮に入れて、それに合うように適用する。較正の違いを定量化する１つの可能性は、両方の方法を使用して試料中のそれぞれのバイオマーカー（例えば、ＰＣＴ）を測定することによる、問題のアッセイ（例えば、ＰＣＴアッセイ）と本発明で使用されるそれぞれのバイオマーカーアッセイ（例えば、ＢＲＡＨＭＳ ＫＲＹＰＴＯＲ ＰＣＴ高感度）の方法比較分析（相関）である。別の可能性は、この検査が十分な分析感度を有すると仮定して、代表的正常集団の中央値バイオマーカーレベルを問題のアッセイを用いて決定し、結果を文献（例えば、ＰＣＴではＥＰ０９０１１０７３．５、「無症候集団における有害事象の予後のためのプロカルシトニン」（「Ｐｒｏｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ａｄｖｅｒｓｅ ｅｖｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ」））に記載されている中央値バイオマーカーレベルと比較し、この比較により得られる違いに基づいて較正を再計算することである。較正を本発明において使用して、正常（健康）対象由来の試料は測定されており、中央値（四分位範囲）血漿プロカルシトニンは、男性で０．０１８（０．０１５〜０．０２２）ｎｇ／ｍＬ、女性で０．０１４（０．０１２〜０．０１７）ｎｇ／ｍＬ（Ａｂｂａｓｉら、２０１０年．ＪＣＥＭ ９５：Ｅ２６〜Ｅ３１）、中央値（範囲）血漿ＭＲ−プロＡＤＭは０．４１（０．２３〜０．６４）ｎｍｏｌ／Ｌ（Ｓｍｉｔｈら、２００９年．Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ５５：１５９３〜１５９５ページ）、中央値（四分位範囲）コペプチン濃度は４．７（２．９〜７．５）ｐｍｏｌ／Ｌで、男性（６．２（４．１〜９．５）ｐｍｏｌ／Ｌ）のほうが女性（３．６（２．４〜５．５）ｐｍｏｌ／Ｌ）よりも有意に高い濃度であり（Ｍｅｉｊｅｒら、２０１０年．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ ７７：２９〜３６ページ）、および中央値（四分位範囲）ＭＲ−プロＡＮＰ濃度は６６（５１〜８６）ｐｍｏｌ／Ｌであった（Ｍｅｌａｎｄｅｒら、２００９年．ＪＡＭＡ ３０２：４９〜５７ページ）。

【0059】

本発明の文脈における用語「スコア」とは、特定の成果、または前記患者に存在する各種の質もしくは状態（例えば、前記バイオマーカーのレベルや前記ＢＯＤＥ指数パラメータ）の程度に基づいて、数値により表される評点のことである。

【0060】

本発明の文脈における用語「レベル」は、患者の試料から採取されるマーカーペプチドの濃度（好ましくは、重量／容積；ｗ／ｖとして表される）に関する。

【0061】

本明細書で述べるように、「アッセイ」または「診断アッセイ」は、診断学の分野で適用されるいかなる種類のものでも可能である。そのようなアッセイは、検出される分析物が１つまたは複数の捕捉プローブに一定の親和性で結合することに基づいていてもよい。捕捉分子と標的分子または対象の分子の間の相互作用に関して、親和定数は好ましくは１０^８Ｍ^−１よりも大きい。

【0062】

本発明の文脈では、「捕捉分子」は、試料由来の標的分子または対象の分子、すなわち、分析物（例えば、本発明の文脈では、心血管ペプチド（複数可））に結合するのに使用し得る分子である。したがって、捕捉分子は、空間的にも、表面電荷、疎水性、親水性、ルイス供与体および／または受容体の存在または非存在などの表面特長の点でも、標的分子または対象の分子に特異的に結合するのに適した形状でなければならない。これにより、結合は、捕捉分子と標的分子もしくは対象の分子の間の、例えば、イオン性、ファンデルワールス、ｐｉ−ｐｉ、シグマ−ｐｉ、疎水性もしくは水素結合相互作用、または前述の相互作用のうちの２つ以上の相互作用の組み合わせにより媒介されることがある。本発明の文脈では、捕捉分子は、例えば、核酸分子、炭水化物分子、ＰＮＡ分子、タンパク質、抗体、ペプチドまたは糖タンパク質を含む群から選択してもよい。好ましくは、捕捉分子は、標的または対象の分子に対して十分な親和性を有するその断片を含む抗体、および組換え抗体または組換え抗体断片を含む抗体、ならびに前記抗体の化学的に、および／もしくは生化学的に修飾された誘導体またはその少なくとも１２のアミノ酸の長さを有するバリアント鎖に由来する断片である。

【0063】

好ましい検出方法は、例えば、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、化学発光および蛍光免疫アッセイ、酵素結合免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ルミネックスベースのビーズアッセイ、タンパク質マイクロアレイアッセイなどの様々なフォーマット、ならびに、例えば、免疫クロマトグラフィーストリップ試験などの迅速試験フォーマットでの免疫アッセイを含む。

【0064】

アッセイは均一または不均一アッセイ、競合および非競合アッセイであっても可能である。特に好ましい実施形態では、アッセイは非競合免疫アッセイであるサンドイッチアッセイの形態であり、検出されるおよび／または定量される分子は第１の抗体におよび第二の抗体に結合している。第一の抗体は固相、例えば、ビーズ、ウェルもしくは他の容器の表面、チップまたはストリップに結合していてもよく、第二の抗体は、例えば、色素で、放射性同位元素で、または反応性もしくは触媒活性のある部分で標識されている抗体である。次に、分析物に結合している標識抗体の量が適切な方法により測定される。「サンドイッチアッセイ」に関係する一般的構成および手順は確立しており、当業者には公知である（Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ｄａｖｉｄ Ｗｉｌｄ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ ＬＴＤ、Ｏｘｆｏｒｄ；第３版（２００５年５月）、ＩＳＢＮ−１３：９７８−００８０４４５２６７；Ｈｕｌｔｓｃｈｉｇ Ｃら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２００６年２月；１０（１）：４〜１０ページ．ＰＭＩＤ：１６３７６１３４、参照により本明細書に組み込まれる）。

【0065】

特定の好ましい実施形態では、アッセイは、両方とも液体反応混合物中に分散系として存在している２つの捕捉分子、好ましくは抗体を含み、第一の標識化成分は第一の捕捉分子に付着しており、前記第一の標識化成分は、蛍光もしくは化学発光−消光または増幅に基づく標識化システムの一部であり、前記マーキングシステムの第二の標識化成分は第二の捕捉分子に付着しているために、両方の捕捉分子が分析物に結合すると、試料を含む溶液中において形成されたサンドイッチ複合体の検出を可能にする測定可能なシグナルが発生する。

【0066】

さらに好ましくは、前記標識化システムは、希土類クリプテートまたは希土類キレートを、蛍光色素または化学発光色素、特にシアニン型の色素と組み合わせて含む。本発明の文脈では、蛍光ベースのアッセイは、例えば、ＦＡＭ（５−または６−カルボキシフルオセイン）、ＶＩＣ、ＮＥＤ、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ＩＲＤ−７００／８００、ＣＹ３、ＣＹ５、ＣＹ３．５、ＣＹ５．５、Ｃｙ７などのシアニン色素、キサンテン、６−カルボキシ−２’，４’，７’，４，７−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、ＴＥＴ、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、５−カルボキシローダミン−６Ｇ（Ｒ６Ｇ５）、６−カルボキシローダミン−６Ｇ（ＲＧ６）、ローダミン、ローダミングリーン、ローダミンレッド、ローダミン１１０、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲなどのＢＯＤＩＰＹ色素、オレゴングリーン、ウンベリフェロンなどのクマリン、ヘキスト３３２５８などのベンズイミド；テキサスレッドなどのフェナントリジン、ヤキマイエロー、アレクサフルオル（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ）、ＰＥＴ、臭化エチジウム、アクリジニウム色素、カルバゾール色素、フェノキサジン色素、ポルフィリン色素、ポリメチン色素、および同類のものを含む群から選択しうる色素の使用を含む。

【0067】

本発明の文脈では、化学発光ベースのアッセイは、Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第４版、編集主幹、Ｊ．Ｉ．Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ；編集、Ｍ．Ｈｏｗｅ−Ｇｒａｎｔ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９３年、ｖｏｌ．１５、５１８〜５６２ページにおいて化学発光物質について記載された物理的原理に基づく色素の使用を含み、前記文献は５５１〜５６２ページの引用を含めて参照により本明細書に組み込まれる。好ましい化学発光色素はアクリジニウムエステルである。

【0068】

本明細書で使用される用語「試料」とは、患者などの対象の診断、予後、または評価を目的に得られる体液の試料のことである。好ましい検査試料には、血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿、唾液、痰および胸水が含まれる。さらに、当業者であれば、いくつかの検査試料は、分画または精製手順、例えば、全血から血清または血漿成分への分離に従ってより容易に分析されることを認識していると考えられる。

【0069】

したがって、本発明の好ましい実施形態では、試料は、血液試料、血清試料、血漿試料、脳脊髄液試料、唾液試料および尿試料または前述の試料のいずれかの抽出物を含む群から選択される。好ましくは、試料は血液試料、もっとも好ましくは血清試料または血漿試料である。

【実施例】

【0070】

（マーカー測定）
ＭＲ−プロＡＮＰは、Ｂ．Ｒ．Ａ．Ｈ．Ｍ．Ｓ ＫＲＹＰＴＯＲ（Ｂ．Ｒ．Ａ．Ｈ．Ｍ．Ｓ ＧｍｂＨ、Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ／Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）上で新規の完全自動化サンドイッチ免疫アッセイシステムを使用して検出された。この無作為アクセス分析器は、２つのフルオロフォア、ユーロピウムクリプテートとＸＬ６６５の間の非放射性移行に基づく高感度時間分解増幅クリプテート放出（Ｔｉｍｅ Ｒｅｓｏｌｖｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｃｒｙｐｔａｔｅ Ｅｍｉｓｓｉｏｎ；ＴＲＡＣＥ）技術を用いる。自動化アッセイは、他で（Ｍｏｒｇｅｎｔｈａｌｅｒら、２００４年．Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ５０：２３４〜６ページ）詳細に記載されており、他の研究（Ｋｈａｎら、２００８年．Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ ５１：１８５７〜６４ページ；Ｇｅｇｅｎｈｕｂｅｒら、２００６年．Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ５２：８２７〜３１ページ）で使用されたサンドイッチ化学発光アッセイに基本的に基づいている。ＭＲ−プロＡＮＰ検出では、１４μｌの患者血清は１４分間インキュベートされた。測定範囲は０〜１００００ｐｍｏｌ／Ｌ、検出限界は２．１ｐｍｏｌ／Ｌ、定量下限は４．５ｐｍｏｌ／Ｌであった。アッセイ内ＣＶは１．２％であり、検査室間ＣＶは５．４％であった。このアッセイは基準アッセイとして同じ抗体対を使用し（Ｍｏｒｇｅｎｔｈａｌｅｒら、２００４年．Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ５０：２３４〜６ページ）、２つのアッセイシステム間の相関性はｒ＝０．９９であった。

【0071】

ＭＲ−プロＡＤＭは、Ｂ．Ｒ．Ａ．Ｈ．Ｍ．Ｓ ＫＲＹＰＴＯＲ（Ｂ．Ｒ．Ａ．Ｈ．Ｍ．Ｓ ＧｍｂＨ、Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ／Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）上で新規の完全自動化サンドイッチ免疫アッセイシステムを使用して検出される（Ｃａｒｕｈｅｌら、２００９年．Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ ４２：７２５〜８ページ）。この無作為アクセス分析器は、２つのフルオロフォア、ユーロピウムクリプテートとＸＬ６６５の間の非放射性移行に基づく高感度時間分解増幅クリプテート放出（ＴＲＡＣＥ）技術を用いる。自動化アッセイは、他で（Ｍｏｒｇｅｎｔｈａｌｅｒら、２００５年 Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ５１：１８２３〜９ページ）詳細に記載されており、他の研究（Ｋｈａｎら、２００７年．Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ ４９：１５２５〜３２ページ；Ｇｅｇｅｎｈｕｂｅｒら、２００７年．Ｊ Ｃａｒｄ Ｆａｉｌ １３：４２〜９ページ）で使用されたサンドイッチ化学発光アッセイに基本的に基づいている。ＭＲ−プロＡＤＭ検出では、２６μｌの血清は２９分間インキュベートされる。測定範囲は０〜１００ｎｍｏｌ／Ｌ、検出限界および定量下限はそれぞれ０．０５および０．２３ｎｍｏｌ／Ｌであった。アッセイ内ＣＶは１．９％であり、検査室間ＣＶは９．８％である。このアッセイは他で（Ｍｏｒｇｅｎｔｈａｌｅｒら、２００５年．Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ５１：１８２３〜９ページ）詳細に記載されている同じ抗体対を使用し、２つのアッセイ系間の相関性はｒ＝０．９９である。

【0072】

コペプチンレベルは、検出限界がさらに低い１．７ｐｍｏｌ／Ｌの化学発光サンドイッチ免疫アッセイで測定された（Ｍｏｒｇｅｎｔｈａｌｅｒら、２００６年．Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ５２：１１２〜９ページ）。３５９人の健康な個人（男性１５３人および女性２０６人）において、中央値コペプチンレベルは４．２ｐｍｏｌ／Ｌであり、１．０〜１３．８ｐｍｏｌ／Ｌの範囲であった。コペプチンの中央値濃度は男性と女性の間で有意に異なっていた。コペプチンレベルと年齢の間には相関はなかった。＞２．２５ｐｍｏｌ／Ｌの試料では、検査室間ＣＶは＜２０％であり、アッセイ内ＣＶは＜１０％であった。

【0073】

ＰＣＴは、Ｍｏｒｇｅｎｔｈａｌｅｒら（Ｍｏｒｇｅｎｔｈａｌｅｒら、２００２年．Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ４８：７８８〜７９０ページ）に記載されている通りに、０．００７ｎｇ／ｍＬの機能的アッセイ感度を有する超高感度の市販の検査システムを使用して測定された。

【0074】

（データ分析）
研究集団のベースライン特性を要約する記述分析が実施された。連続変数について与えられる記述統計は中央値（範囲）であり、カテゴリー変数では我々はｎ（パーセント）を報告している。単一マーカー値の箱髭図を使用して、生存者と非生存者の間のマーカー値の分布を要約した。２年以内死亡の予測では、コックス回帰モデルが使用された。死亡率予測のための様々なマーカーの能力を説明するため、我々はカプランマイヤー生存曲線を計算し、マーカー四分位点または組み合わせスコア三分位値により患者を層別化した。さらに、時間依存性受信者動作特性（ＲＯＣ）プロットが実施された。受信者動作特性は、そのカットオフが変動するので、転帰（死亡）については感度対（１−特異度）のグラフィカルプロットである。感度（バイオマーカーによりそれとして正しく同定される実陽性の割合）および特異度（正しく同定される陰性の割合）は選択されたカットオフについて計算された。バイオマーカーは、バイオマーカーのカテゴリー化および異なるカテゴリーへの重み付けの配分によりＢＯＤＥ指数パラメータと組み合わされた。

【0075】

（結果）
総数で５４８患者が本研究に含まれた。中央値年齢は６７歳（範囲４０〜８８）であった。１６６患者（３０．３％）は女性であった。これらの患者のうちの４３人（７．８％）は２年以内に亡くなった。研究集団のベースライン特性は表３に提示されている。

【0076】

２年以内の死亡の予測のための単一マーカー値の箱髭図は図１から４に示されている。ＭＲ−プロＡＤＭ、ＭＲ−プロＡＮＰ、コペプチンおよびＰＣＴ濃度はそれぞれが生存者よりも非生存者のほうが有意に高かった（クラスカルウォリス検定、４つのマーカーペプチドすべてでｐ＜０．００１）。単一マーカーについての受信者動作特性（ＲＯＣ）は図５から８に示されている。マーカーペプチドの予後値を説明するため、単一マーカーごとにカプランマイヤー生存曲線が計算され、患者をそれぞれのマーカー濃度に応じて四分位に分けた（図９から１２）。図９から１２に示されるように、ＭＲ−プロＡＤＭ、ＭＲ−プロＡＮＰ、コペプチンおよびＰＣＴ濃度それぞれが、第１から第３四分位にある場合と比べて第４四分位にある場合のほうが２年以内の高い死亡率が観察された。

【0077】

マーカーペプチドの全体的予後の正確さは、単変量および多変量コックス回帰分析を使用して評価された（表４および５）。多変量モデルでは、バイオマーカーは、連続変数（表４）およびカテゴリー化された変数（表５）としてＢＯＤＥ指数パラメータと組み合わされた。バイオマーカーをカテゴリー化された変数として使用する場合、スコア０、２または４を生じる２つの異なるカットオフがバイオマーカーごとに定義され、ＭＲ−プロＡＤＭでは０．５と０．８ｎｍｏｌ／Ｌ、ＭＲ−プロＡＮＰでは５０と１４０ｐｍｏｌ／Ｌ、コペプチンでは２と１４ｐｍｏｌ／ＬおよびＰＣＴでは０．０７と０．１ｎｇ／ｍＬであった。次に、それぞれのバイオマーカースコアは、指数パラメータであるＢＯＤＥ、ＢＯＤまたはＢＤから組み合わせスコアに引き出されたスコアに加算された。

【0078】

それぞれＢＯＤＥ指数、ＢＯＤ指数およびＢＤ指数と組み合わされたカテゴリー化された変数としてのバイオマーカーＭＲ−プロＡＤＭのＲＯＣ曲線は図１３から１５に示されている。それぞれＢＯＤＥ指数、ＢＯＤ指数およびＢＤ指数と組み合わされたカテゴリー化された変数としてのバイオマーカーＭＲ−プロＡＮＰのＲＯＣ曲線は図１６から１８に示されている。それぞれＢＯＤＥ指数、ＢＯＤ指数およびＢＤ指数と組み合わされたカテゴリー化された変数としてのバイオマーカーコペプチンのＲＯＣ曲線は図１９から２１に示されており、それぞれＢＯＤＥ指数、ＢＯＤ指数およびＢＤ指数と組み合わされたカテゴリー化された変数としてのバイオマーカーＰＣＴのＲＯＣ曲線は図２２から２４に示されている。

【0079】

これらの結果から、バイオマーカー（連続またはカテゴリー変数として）を含むモデルは、ＢＯＤＥ指数パラメータのみを使用するモデルよりも有意に良好であったことが明らかにされている。驚くべきことに、２年以内の死亡の予測は、指数パラメータＥおよび／またはＯを含まずに、バイオマーカーを指数パラメータであるＢＯＤまたはＢＤと組み合わせた場合と類似するまたはその場合よりもはるかに良好であった。言い換えると、決定するのが難しく複雑であるパラメータＥ（６分間歩行検査）およびＯ（気流閉塞の程度）を含まずに、バイオマーカーを、容易に評価可能なパラメータＢＭＩ（Ｂ）および呼吸困難（Ｄ）と組み合わせて使用するスコアは、バイオマーカーを全部そろったＢＯＤＥ指数と組み合わせて使用するスコアと比べると類似する結果またははるかに良好な結果を与える。

【0080】

マーカーペプチドと指数パラメータであるＢＯＤＥ、ＢＯＤまたはＢＤとの組み合わせについてカプランマイヤー生存曲線が計算され（図２５から３６）、患者をそれぞれのスコアに応じてリスク群に分けた。例えば、図２５は、ＭＲ−プロＡＤＭと指数パラメータＢＯＤＥの組み合わせについてのカプランマイヤー生存曲線を示している。可能なスコアは０から１３の間である（表２のＢＯＤＥのスコアリングプラス表５に示されている閾値０．５と０．８ｎｍｏｌ／Ｌを使用するＭＲ−プロＡＤＭについてのスコア０、２または４に従って）。患者がスコア０から３の間を有する場合低い死亡率が観察され（２．５％）、スコアが４から６の間の場合は中程度の死亡率（６．８％）が観察され、スコアが７から１３では高い死亡率（１５．８％）が観察された。図２７は、ＭＲ−プロＡＤＭと指数パラメータＢＤの組み合わせについてのカプランマイヤー生存曲線を示している。可能なスコア（表２のＢＤのスコアリングプラス表５に示されている閾値０．５と０．８ｎｍｏｌ／Ｌを使用するＭＲ−プロＡＤＭについてのスコア０、２または４に従って）は０から８の間であった。患者がスコア０から２の間を有する場合低い死亡率が観察され（３．０％）、スコアが３から４の間の場合は中程度の死亡率（８．３％）が観察され、スコアが５から８では高い死亡率（１８．０％）が観察された。

【0081】

さらに、この所見は以下の分析および所見により強調される。
６分間歩行検査（指数パラメータＥ）が欠けている追加の４５患者が研究中に含まれた。これらの患者のうち１１人が２年間の追跡調査期間内で亡くなった。これらの患者の死亡率は２４．４％であり、すべての指数パラメータ（Ｅを含む）が入手可能であった最初に分析された５４８患者の死亡率の３倍よりも高かった。したがって、これらの４５患者の６分間歩行検査は無作為に欠けていたのではなく、むしろ患者の虚弱体質のせいで実施することができないと仮定された。欠けていた変数Ｅは最大数３ポイントで置き換えられ（表２参照）４５患者はモデルに含まれた（表６）。さらに、バイオマーカーを含むモデルは、ＢＯＤＥ指数パラメータのみを使用するモデルよりも有意に良好であり、２年以内の死亡の予測は、バイオマーカーを、指数パラメータであるＥおよび／またはＯを含まずに、指数パラメータであるＢＯＤまたはＢＤと組み合わせた場合と類似しているまたはその場合よりはるかに良好であった。

【表1】

【表2】

【表3】

【表4】

【表5】

【表6】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]