特許 6118601 細胞処理用基板

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6118601

(24)【登録日】2017年3月31日

(45)【発行日】2017年4月19日

(54)【発明の名称】細胞処理用基板

(51)【国際特許分類】

   C12M 3/00 20060101AFI20170410BHJP

【ＦＩ】

   C12M3/00 A

【請求項の数】11

【全頁数】17

(21)【出願番号】特願2013-57589(P2013-57589)

(22)【出願日】2013年3月21日

(65)【公開番号】特開2014-180255(P2014-180255A)

(43)【公開日】2014年9月29日

【審査請求日】2016年3月14日

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）国等の委託研究の成果に係る特許出願（平成２４年度経済産業省「戦略的基盤技術高度化支援事業（レーザー光と高速可動ステージの精密制御による高効率細胞融合・回収自動化装置の開発）」委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願）

(73)【特許権者】

【識別番号】000125347

【氏名又は名称】学校法人近畿大学

(73)【特許権者】

【識別番号】392030184

【氏名又は名称】エステック株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110001427

【氏名又は名称】特許業務法人前田特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】白石 浩平

(72)【発明者】

【氏名】山田 康枝

(72)【発明者】

【氏名】河済 博文

(72)【発明者】

【氏名】押村 光雄

(72)【発明者】

【氏名】加藤 基伸

(72)【発明者】

【氏名】永島 正嗣

(72)【発明者】

【氏名】崔 源煥

【審査官】 千葉 直紀

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１１−１０１６２６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１２−１５７２４４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Macromolecules, 2012, Vol. 45, No. 9, pp. 3910-3918

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｍ １／００−３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

基板の上に設けられた複数の細胞接着スポットを備え、
前記細胞接着スポットは、その表面に固定された上限臨界溶液温度を示す温度応答性ポリマーを有し、
前記温度応答性ポリマーは、アクリルニトリル又はメタアクリルニトリルに由来するモノマー単位と、アクリルアミド又はメタアクリルアミドに由来するモノマー単位とのモル比が、６：９４以上、２０：８０以下であり、
前記温度応答性ポリマーの重合度は、２０以上、８００以下であり、
前記細胞接着スポットにおける前記温度応答性ポリマーの密度は、１μｇ／ｃｍ²以上、３００μｇ／ｃｍ²以下であり、
前記基板は、表面に周期が１μｍ以上、５μｍ以下で、高さが１μｍ以下の周期的な凹凸構造を有している、細胞処理用基板。

【請求項2】

前記細胞接着スポットは、凹部である、請求項１に記載の細胞処理用基板。

【請求項3】

前記細胞接着スポットの接触角は、前記上限臨界溶液温度よりも高い温度において、前記上限臨界溶液温度よりも高い温度と比べて１０％以上低下する、請求項１又は２に記載の細胞処理用基板。

【請求項4】

前記温度応答性ポリマーは、クロロフィリンに由来するモノマー単位を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞処理用基板。

【請求項5】

前記細胞接着スポットにおける前記温度応答性ポリマーの密度は、１μｇ／ｃｍ²以上、３．５μｇ／ｃｍ²以下である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞処理用基板。

【請求項6】

前記基板の前記細胞接着スポット以外の部分は、前記温度応答性ポリマーの上限臨界溶液温度以上の下限臨界溶液温度を有する温度応答性ポリマーが固定されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞処理用基板。

【請求項7】

請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞処理用基板を準備する工程と、
前記上限臨界溶液温度未満の温度において、前記細胞接着スポットに細胞を接着させる工程と、
前記細胞接着スポットに接着された細胞を、細胞の特性に基づいて標的細胞と、不要細胞とに分類する工程と、
前記標的細胞が固定された細胞接着スポットの温度を、選択的に前記上限臨界溶液温度以上にすることにより、前記標的細胞を前記細胞接着スポットから遊離させて回収する工程とを備えている、細胞処理方法。

【請求項8】

前記細胞を選択的に回収する工程は、前記標的細胞が固定された細胞接着スポットに選択的にレーザ光を照射する工程を含む、請求項７に記載の細胞処理方法。

【請求項9】

前記温度応答性ポリマーは、クロロフィリンに由来するモノマー単位を含み、
前記レーザ光は、前記クロロフィリンが吸収する波長の光である、請求項８に記載の細胞処理方法。

【請求項10】

請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞処理用基板を収容する培養部と、
前記複数の細胞接着スポットのそれぞれについて接着された細胞の光学的データを取得し、前記光学的データに基づいて前記細胞が、標的細胞であるか不用細胞であるかを判定し、前記標的細胞であると判定した細胞が接着した細胞接着スポットの温度を選択的に前記上限臨界溶液温度以上とする制御部とを有している細胞自動分取装置。

【請求項11】

基板の表面に開始剤を固定する工程と、
前記開始剤を用いて原子移動ラジカル重合を行い、温度応答性ポリマーを重合すると共に固定する工程とを備え、
前記温度応答性ポリマーは、アクリルニトリル又はメタアクリルニトリルに由来するモノマー単位と、アクリルアミド又はメタアクリルアミドに由来するモノマー単位とのモル比が、６：９４以上、２０：８０以下であり、
重合度は、２０以上、８００以下であり、
細胞接着スポットにおける前記温度応答性ポリマーの密度は、１μｇ／ｃｍ²以上、３００μｇ／ｃｍ²以下であり、
前記基板は、表面に周期が１μｍ以上、５μｍ以下で、高さが１μｍ以下の周期的な凹凸構造を有している、細胞処理用基板の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細胞処理用基板、その製造方法、細胞処理方法及び細胞自動分取装置に関する。

【背景技術】

【0002】

近年、基板上において細胞に遺伝子を導入する、固相トランスフェクションが注目を集めている。固相トランスフェクションは、液相において遺伝子導入を行う場合と比べて、細胞及び遺伝子の濃度を低くしても、導入の効率を向上させることができるという利点を有している。

【0003】

固相トランスフェクションは、基板に接着された細胞に対して遺伝子の導入を行うため、遺伝子の導入後に細胞を基板から遊離させて回収する必要がある。基板に接着された細胞を遊離させる方法として、接着された細胞の一部をトリプシンにより分解する方法がある。しかし、トリプシンを用いた細胞の回収は、細胞にダメージを与える。細胞にダメージを与えることなく細胞を回収する方法として、接着領域に温度応答性ポリマーを用いることにより接着領域における接着性を制御し、細胞を遊離する方法が検討されている（例えば、特許文献１を参照。）。

【0004】

従来の温度応答性ポリマーはそのほとんどが、下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）を示すポリマーである。ＬＣＳＴを示すポリマーを用いて細胞の接着性を制御する場合には、温度を低くした際に細胞が遊離する。一方、細胞が接着されている部分の温度を局所的に低くすることは困難である。このため、基板に必要な細胞と不要な細胞とが混在して接着されている場合には、あらかじめ不要な細胞を何らかの方法で除去した後、必要な細胞を回収している。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特開２０１２−１５７２４４号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

しかしながら、一般的な固相トランスフェクションにおける導入率は１％以下である。このため、基板上の多量の不要細胞を除去する労力は膨大である。このため、細胞が接着されているスポットの温度を局所的に高くして細胞を遊離させることができる、上限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ）を示すポリマーによる、接着性の制御が求められている。また、固相トランスフェクション以外の細胞操作においても、同様にＵＣＳＴを示すポリマーによる、接着性の制御が求められている。

【0007】

しかし、重合の容易さ、基板への固定の容易さ、イオン性の物質が多量に溶解している細胞培養用の培地中における特性等を十分に満たすＵＣＳＴを示すポリマーは知られていない。このため、スポットの温度を選択的に高くすることにより細胞を脱離させることができる細胞処理用基板は実用化されていない。

【0008】

本願の課題は、細胞接着スポットの温度を選択的に上昇させることにより、必要とする細胞を容易に回収できる細胞処理用基板を実現することである。

【課題を解決するための手段】

【0009】

細胞処理用基板の一態様は、基板の上に設けられた複数の細胞接着スポットを備え、細胞接着スポットは、その表面に固定された上限臨界溶液温度を示す温度応答性ポリマーを有し、温度応答性ポリマーは、アクリルニトリル又はメタアクリルニトリルに由来するモノマー単位と、アクリルアミド又はメタアクリルアミドに由来するモノマー単位とのモル比が、６：９４以上、２０：８０以下であり、温度応答性ポリマーの重合度は、２０以上、８００以下であり、細胞接着スポットにおける温度応答性ポリマーの密度は、１μｇ／ｃｍ²以上、３００μｇ／ｃｍ²以下である。

【0010】

細胞処理用基板の一態様において、細胞接着スポットは、凹部としてよい。

【0011】

細胞処理用基板の一態様において、細胞接着スポットの接触角が、上限臨界溶液温度よりも高い温度において、上限臨界温度よりも低い温度と比べて１０％以上低下する構成としてよい。

【0012】

細胞処理用基板の一態様において、温度応答性ポリマーは、クロロフィリンに由来するモノマー単位を含んでいてもよい。

【0013】

細胞処理方法の一態様は、細胞処理用基板を準備する工程と、上限臨界溶液温度未満の温度において、細胞接着スポットに細胞を接着させる工程と、細胞接着スポットに接着された細胞を、細胞の特性に基づいて標的細胞と、不要細胞とに分類する工程と、標的細胞が固定された細胞接着スポットの温度を、選択的に上限臨界溶液温度以上にすることにより、標的細胞を細胞接着スポットから遊離させて回収する工程とを備えている。

【0014】

細胞処理方法の一態様において、細胞を選択的に回収する工程は、標的細胞が固定された細胞接着スポットに選択的にレーザ光を照射する工程を含んでいてもよい。

【0015】

この場合において、温度応答性ポリマーは、クロロフィリンに由来するモノマー単位を含み、レーザ光は、クロロフィリンが吸収する波長の光としてもよい。

【0016】

細胞自動分取装置の一態様は、細胞処理用基板を収容する培養部と、複数の細胞接着スポットのそれぞれについて接着された細胞の光学的データを取得し、光学的データに基づいて細胞が、標的細胞であるか不用細胞であるかを判定し、標的細胞であると判定した細胞が接着した細胞接着スポットの温度を選択的に上限臨界溶液温度以上とする制御部とを有している。

【0017】

細胞処理用基板の製造方法は、基板の表面に開始剤を固定する工程と、開始剤を用いて原子移動ラジカル重合を行い、温度応答性ポリマーを重合すると共に固定する工程とを備え、温度応答性ポリマーは、アクリルニトリル又はメタアクリルニトリルに由来するモノマー単位と、アクリルアミド又はメタアクリルアミドに由来するモノマー単位とのモル比が、６：９４以上、２０：８０以下であり、重合度は、２０以上、８００以下であり、細胞接着スポットにおける温度応答性ポリマーの密度は、１μｇ／ｃｍ²以上、３００μｇ／ｃｍ²以下である。

【発明の効果】

【0018】

本発明に係る細胞処理用基板によれば、細胞接着スポットの温度を選択的に上昇させることにより、必要とする細胞を容易に回収できる。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】（ａ）〜（ｃ）はそれぞれ一実施形態に係る細胞処理用基板を示す断面図である。

【図2】一実施形態に係る自動細胞分取装置を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0020】

本実施形態の細胞処理用基板は、基材の上に設けられた複数の細胞接着スポットを備え、その表面には上限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ）を示す温度応答性ポリマーが固定されている。

【0021】

−温度応答性ポリマー−
ＵＣＳＴを示す温度応答性ポリマーとしては、ポリアクリル酸、ポリメタクリルアミド、ポリアクリル酸ウラシル、ポリ（メタ）アクリル酸Ｎ−アスパラギンアミド、ポリアクリル酸Ｎ−グルタミンアミド、ポリ（アリルアミン−co−アリルウレア）、及びポリ（メタ）アクリルアミド−co−Ｎ−アセチルアクリルアミド）等の水素結合型ポリマー、並びにポリ(N-(3-dimethyl(methacryloyloxyethyl)ammonium propaneスルホン酸塩若しくは炭酸塩、ポリ(3-[N-(3-methacrylamidopropyl)-N,N-dimethyl]ammoniopropaneスルホン酸塩若しくは炭酸塩等の両イオン性型ポリマーが知られている。本実施形態においては、温度応答性ポリマーとして、アクリルニトリル又はメタアクリルニトリル（以下、アクリルニトリル及びメタアクリルニトリルをまとめて（メタ）アクリルニトリルと表記する。）に由来する第１のモノマー単位、アクリルアミド又はメタアクリルアミド（以下、アクリルアミド及びメタアクリルアミドをまとめて（メタ）アクリルアミドと表記する。）に由来する第２のモノマー単位を含むポリマーを用いる。なお、本明細書において「モノマーに由来するモノマー単位」とは、当該モノマーを重合して得られるホモポリマーにおける繰り返し構造単位に対応する構造単位をいう。

【0022】

温度応答性ポリマーにおける第１のモノマー単位と第２のモノマー単位とのモル比は、６：９４以上、好ましくは８：９２以上、より好ましくは１２：８８以上である。そして、２０：８０以下、好ましくは１８：８２以下、より好ましくは１４：８６以下である。また、温度応答性ポリマーにおける第１のモノマー単位及び第２のモノマー単位の合計のモル含有率は、２０ｍｏｌ％以上、好ましくは３０ｍｏｌ％以上、より好ましくは５０ｍｏｌ％以上である。温度応答性ポリマーは、第１のモノマー単位及び第２のモノマー単位以外のモノマー単位を含んでいなくても、含んでいてもよい。

【0023】

温度応答性ポリマーは、ＵＣＳＴにおいて、培養細胞の接着又は増殖時において細胞が接着できる足場となる細胞接着性の状態と、細胞が遊離する細胞非接着性の状態とがシャープに変化することが好ましい。ＵＣＳＴは、培養細胞に応じて、細胞の接着及び増殖が効果的にできる温度域にあることが好ましい。標的細胞が一般的な細胞の場合には、ＵＣＳＴは２０℃以上が好ましく、２５℃以上がより好ましく、３０℃以上がさらに好ましい、そして５０℃以下が好ましく、４５℃以下がより好ましく、４０℃以下がさらに好ましい。特に、培養に適した３７℃付近において細胞接着性の状態となるようにすることが好ましい。ＵＣＳＴは、実施例に示すように温度可変ステージ上での水に対する接触角測定により求めることができる。

【0024】

温度応答性ポリマーは、第１のモノマー単位と第２のモノマー単位とが、ランダムに配置されているランダム共重合体でかまわないが、第１のモノマー単位及び第２のモノマー単位がそれぞれブロックを形成したブロック共重合体であってもよい。また、温度応答性ポリマーは、直鎖のポリマーでかまわないが、多数の分岐を有するハイパーブランチポリマー、複数のポリマー鎖が一点で結合した星形ポリマー、星形ポリマーの各腕がさらに分岐したポリマー、又は中心から規則的に分岐したデンドリマー等の分岐ポリマーとすることもできる。さらに、複数のポリマー鎖が架橋されたはしご状ポリマー、網目状ポリマー、又は相互侵入網目状ポリマー等となっていてもよく、ロタキサン又はカテナン等であってもよい。

【0025】

本実施形態の温度応答性ポリマーは、第３のモノマー単位を含んでいてもよい。第３のモノマー単位の含有率を変化させることにより温度応答性ポリマーのＵＣＳＴを制御することができる。第３のモノマー単位は例えば、アルキル（メタ）アクリレート等の疎水性のモノマーに由来するモノマー単位とすることができる。この場合、アルキル基の炭素数は１〜１４程度が好ましく、中でもブチル基が好ましい。また、水素結合性モノマーに由来するモノマー単位とすることもできる。水素結合性モノマーとしては、例えば、アルキル（メタ）アクリルアミド、フマル酸エステル、イタコン酸エステル、N,N,N',N'-テトラ置換マレイミド、N,N-置換マレイミド、N,N,N',N'-テトラ置換フマルアミド(N,N,N',N'-tetraalkylfumaramide)、フマル酸N,N'-置換アミド(N,N-alkylfumaramates)等を用いることができる。アルキル（メタ）アクリルアミドは、例えばN-イソプロピルアクリルアミドとすることができる。また、2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine（ＭＰＣ）等の両イオン性モノマー、（メタ）アクリル酸等のアニオン性モノマー、及びアリルアミン等のカチオン性モノマーに由来するモノマー単位とすることもできる。

【0026】

温度応答性ポリマーにおける第３のモノマー単位のモル含有率は、必要とするＵＣＳＴに応じて選択すればよく、好ましくは０．１ｍｏｌ％以上、より好ましくは０．５ｍｏｌ％以上である。第３のモノマー単位は、温度応答性ポリマーにおける第１のモノマー単位及び第２のモノマー単位の残部としてもよい。

【0027】

第３のモノマー単位は、第１のモノマー単位及び第２のモノマー単位と共にランダム共重合体となっていてかまわない。また、第３のモノマー単位はブロックとして温度応答性ポリマー中に存在していてもよい。また、第１のモノマー単位及び第２のモノマー単位を含む主鎖から分岐したグラフト鎖となっていてもよい。

【0028】

温度応答性ポリマーは、さらに他のモノマー単位を含む３元以上の多元重合体であってもよい。

【0029】

また、温度応答性ポリマーを固定した接着スポットは、ＵＣＳＴ以上の温度における水に対する接触角が、ＵＣＳＴ未満の温度における接触角よりも小さく、好ましくは１０％以上、より好ましくは１５％以上小さくなるようにすればよい。接触角は、実施例に示すように温度可変ステージ上で、溶液に対する接触角測定により求めることができる。なお、本実施形態において、特に断りがない限り、接触角は水に対する接触角である。

【0030】

温度応答性ポリマーは、ＵＣＳＴ以下の温度では、ポリマー鎖間（分子間）にイオン結合又は水素結合等が生じポリマー鎖が沈殿した状態となり、高い疎水性を示す。一方、ＵＣＳＴ以上の温度では、分子間の結合が分子内の結合に変化するため溶解状態となると考えられる。本実施形態の温度応答性ポリマーの場合には、−ＣＮと−ＣＯＮＨ₂との間に水素結合が生じていると考えられる。

【0031】

溶液の塩濃度及びイオン強度等は、分子間及び分子内の水素結合に影響を与えるため、温度応答性ポリマーの特性は、溶液の塩濃度等に影響を受けると考えられる。また、溶液中において自由に動ける場合と異なり、スポットに固定された温度応答性ポリマーは、密度（グラフト量）の影響も大きく受けると考えられる。具体的には、密度が高くなると、溶液の塩濃度の影響をより受けやすくなると考えられる。

【0032】

疎水性のポリマー鎖は、溶液の塩濃度が高い場合には、よりコンパクトになろうとする。ポリマー鎖の密度が高い場合には、ポリマー鎖間での−ＣＮと−ＣＮＨ₂との間の結合が発達しやすいために、疎水性が高くなると考えられる。密度が高い場合には、温度を高くしても、−ＣＮと−ＣＮＨ₂との間の水素結合が十分に切断されず、接触角の変化が小さくなる。従って、ポリマー鎖の密度を高くしすぎないことが好ましい。一方、温度が低い場合にポリマー鎖間において十分に水素結合が生じ、疎水性となるためには、ポリマー鎖の固定化密度をある程度以上高くすることが好ましい。

【0033】

また、ポリマー鎖間及びポリマー鎖内において、十分に水素結合が生じるように、温度応答性ポリマーの重合度はある程度高いことが好ましい。また、重合度が高い方が、基板自体と細胞との相互作用を小さくすることもできる。一方、ポリマー鎖同士の相互作用を小さくする、及びポリマー鎖の長さをできるだけ一定にそろえるという観点からは温度応答性ポリマーの重合度を高くしすぎない方が好ましい。従って、温度応答性ポリマーの重合度は、２０以上、好ましくは５０上、より好ましくは１００以上、よりさらに好ましくは２００以上、そして８００以下、好ましくは７００以下、より好ましくは６００以下である。温度応答性ポリマーの分子量は、実施例に示すように、走査型プローブ顕微鏡観察により求めることができる。

【0034】

細胞接着スポットにおける温度応答性ポリマーのグラフト量は、１μg／ｃｍ²以上、好ましくは５μg／ｃｍ²以上、より好ましくは１０μg／ｃｍ²以上、そして３００μg／ｃｍ²以下、好ましくは１５０μg／ｃｍ²以下、より好ましくは１００μg／ｃｍ²以下である。グラフト量は、実施例に示すように、重合後の基板の重量変化により求めることができる。ここでいうグラフト量とは、１ｃｍ²当たりに固定されているポリマーの数（モル数）にポリマーの分子量を乗じた値に相当する。従って、重合度が同じ場合には、グラフト量が多いほど固定されているポリマーの数が多いことを意味し、ポリマーの数が同じ場合には、グラフト量が多いほど重合度が高いことを意味する。

【0035】

一例として、温度応答性ポリマーのグラフト量が３．６μｇ／ｃｍ²のガラス基板１及び１．９μｇ／ｃｍ²のガラス基板２について、純水及び生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム溶液）についての接触角を比較した。基板への温度応答性ポリマーの固定は、実施例において述べる方法と同様の方法とした。重合開始点を導入するためのシランカップリング剤（３−アミノプロピルトリメトキシシラン）の仕込み濃度を、ガラス基板１は１ｍＭとし、ガラス基板２は０．５ｍＭとした。この場合の、温度応答性ポリマーの重合度は、１３０であった。

【0036】

純水の場合には、ガラス基板１とガラス基板２とはいずれも、２５℃における接触角は７０°程度であり、３８℃における接触角は６０°程度であった。しかし、生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム溶液）の場合には、ガラス基板１では２５℃における接触角が約６５°となり、３８℃における接触角も約６５°となった。３８℃において２０秒保持すると接触角は約６０°に低下した。これは、塩濃度が高い溶液において、分子間から分子内への水素結合の組み替えが生じにくくなったことにより、応答性が低下したためであると考えられる。ガラス基板２では、２５°における接触角が約６０°となり、３８℃における接触角は約５０°となった。３８℃において２０秒間保持した後の接触角も約５０°であり変化は認められなかった。

【0037】

塩濃度が高い溶液中における温度応答性ポリマーの応答速度を速くするという観点からはグラフト量を３．５μｇ／ｃｍ²以下としてもよく、２μｇ／ｃｍ²以下としてもよい。

【0038】

−細胞処理用基板−
図１（ａ）〜（ｃ）に示すように温度応答性ポリマー２０４は、基材２０１の細胞接着スポット２０３に固定されている。基材２０１は、特に限定されない。例えば、ガラス基板、シリコン基板、ダイヤモンド様カーボン基板、若しくはセラミクス基板等の無機性基板、ＩＴＯ（酸化インジウムスズ）、若しくは金・チタン・クロム等の金属性基板、又は樹脂基板等の有機性基板等を用いることができる。中でも、ガラスは表面の修飾が容易であり好ましい。

【0039】

細胞接着スポット２０３は、図１（ａ）に示すように周囲よりも低い凹部であっても、図１（ｂ）に示すように周囲よりも突出した凸部であっても、図１（ｃ）に示すように周囲と同じ平坦な部分であってもよい。細胞接着スポット２０３を図１（ａ）に示すような凹部とすることにより、基材２０１の上に形成した細胞接着スポット２０３のほぼすべてに細胞を接着させることが可能となることを本願発明者らは見出した。また、細胞を確実に保持することができ、温度応答性ポリマー２０４を接着状態とした場合には細胞の脱離がほとんど生じなくなる。さらに凹部から細胞がはみ出しにくくなるため、接着された細胞が細胞接着スポット２０３の周囲の領域からの影響を受けにくくなる。このため、細胞の変形等が生じにくくなるという利点も得られる。さらに、凹部の大きさを細胞に合わせて調整することにより、１つの細胞接着スポット２０３に１つの細胞だけを接着しやすくすることが容易にできるという利点がある。

【0040】

凹部又は凸部となった細胞接着スポット２０３は、基材２０１の上に、スポット形成材料２０２を堆積した後、選択的に除去すればよい。細胞接着スポット２０３となる部分を除去すれば、図１（ａ）に示すような凹部となった細胞接着スポット２０３が形成でき、細胞接着スポット２０３となる部分以外を除去すれば、図１（ｂ）に示すような凸部となった細胞接着スポットが形成できる。また、マスク等を用いて選択的に堆積してもよい。

【0041】

スポット形成材料２０２は、特に限定されないが、堆積及び加工が容易で、細胞に対する毒性が小さい材料が好ましい。例えば、金、若しくはクロムとチタンとの合金等の金属、酸化チタン等の金属酸化物、セラミックス、ダイヤモンド様カーボン、ヒドロキシアパタイト、又は樹脂等を用いることができる。スポット形成材料２０２は、積層材料であってもよい。スポット形成材料２０２は基材２０１と同じ材料であっても、異なる材料であってもよい。基材２０１と異なる材料とすれば、基材２０１を残して除去することが容易にできるため好ましい。また、細胞接着スポット２０３と基材２０１の他の部分とが異なる材料である方が、細胞接着スポット２０３に選択的に温度応答性ポリマー２０４を固定することが容易となるという利点も得られる。

【0042】

スポット形成材料２０２は、その材質に応じて化学気相堆積法（ＣＶＤ法）、スパッタリング法、スピンコーティング法等の方法により基材２０１の上に堆積すればよい。また、スポット形成材料２０２の除去は、エッチング法又はリソグラフィー法等により行えばよい。また、マスク等を用いて、スポット形成材料２０２を選択的に堆積することにより細胞接着スポット２０３を形成してもよい。

【0043】

細胞接着スポット２０３は、取り扱う細胞の大きさにもよるが、直径ｄを２０μｍ〜５００μｍ程度とすればよい。また、細胞接着スポット２０３同士の中心間の間隔ｐは直径ｄに応じて決めればよいが、３０μｍ〜５００μｍ程度のマトリックス状に配置すればよい。細胞接着スポット２０３が凹部の場合には、深さは数ｎｍから数十μｍとすることが好ましい。細胞接着スポット２０３が凸部の場合には、高さは数ｎｍから数μｍとすることが好ましい。

【0044】

細胞接着スポット２０３を含む基板２０１の表面は平滑であってもよいが、周期が１μｍ〜５μｍ程度で、高さが１μｍ程度の周期的な凹凸構造を有していてもよい。基板２０１の表面に周期的な凹凸構造を設けることにより、基板１０１上において細胞への標的物資の導入等を行う場合には、導入効率を高めることができる。凹凸構造はどのようなものであってもよいが、例えば、円錐状、角錐状、円錐台状、角錐台状、円筒状又は角筒状等の凸部又は凹部とすることができる。これらの凸部又は凹部の表面にさらに周期的な凸部又は凹部が設けられた形状であってもよい。凹凸構造の形状、周期及び高さ等は特に限定されないが、周期が１μｍ以上、５μｍ以下程度で、高さが１μｍ以下程度の周期的な凹凸構造は、リソグラフィーを用いて容易に形成することができ好ましい。

【0045】

凹凸構造は、細胞接着スポット２０３を含む基板２０１の全面に形成してもよく、選択的に形成してもよい。例えば、細胞接着スポット２０３である凹部又は凸部のみに形成してもよく、細細胞接着スポット２０３以外の部分のみに形成してもよい。

【0046】

細胞接着スポット２０３への温度応答性ポリマー２０４の固定方法は特に限定されない。細胞接着スポット２０３の表面に重合開始点を導入し、導入した重合開始点を用いて温度応答性ポリマー２０４を重合すると共に固定すれば、温度応答性ポリマー２０４の密度及び分子量を容易に制御することができるので好ましい。

【0047】

例えば、基材２０１がガラス又はシリコンである場合には、３−アミノプロピルトリメトキシシラン等のシランカップリング剤を用いて、基材２０１の表面にまずアミノ基を有するリンカーを導入する。次に、導入されたアミノ基に、酸クロライドを有する開始剤である４，４’−アゾビス（２−シアノ吉草酸）クロライド（Ｖ５０１−Ｃｌ）を結合させる。このようにして基材２０１の表面に導入した開始剤を用いて、モノマーを重合することにより、温度応答性ポリマー２０４が固定された基材２０１を容易に得ることができる。リンカーのアミノ基と重合開始剤の酸クロライドとを反応させる例を示したが、これに限らずどのようにしてリンカーと重合開始剤とを結合させてもよい。

【0048】

シリコンと反応する部位を有する（２−ブロモ−２−メチル）プロピオニルオキシヘキシルトリエトキシシラン又は２−フェニル−２−[（２，２，６，６−テトラメチルピペリジノ）オキシ]オクチルトリエトキシシラン等を用いれば、リンカーを用いることなく重合開始剤を基材２０１に導入できる。この場合には、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）法等により導入促進ポリマーを形成すればよい。ＡＴＲＰ法は、分子量の制御が容易にできるため好ましい。

【0049】

なお、ＡＴＲＰ法に限らず熱重合法、光重合法又は付加開裂移動型（ＲＡＦＴ）重合法等のどのような重合方法を用いてポリマーの重合を行ってもよい。さらに、導入する開始剤を適宜選択することによりアニオン重合又はカチオン重合を用いてもよい。

【0050】

重合開始剤を基材２０１に固定するのではなく、基材２０１にプラズマ照射等を行い、基材２０１の表面にラジカルを発生させ、発生させたラジカルを重合開始点として導入促進ポリマーの重合を行ってもよい。基材２０１が樹脂である場合には、プラズマ照射等により基材２０１の表面にラジカルを容易に発生させることができるので、この方法は有用である。

【0051】

細胞接着スポット２０３に重合開始点を導入して、温度応答性ポリマー２０４を重合する場合には、細胞接着スポット２０３における温度応答性ポリマー２０４のグラフト量は、重合開始点の量と、重合度とによって決まる。シランカップリング剤を用いる場合には、重合開始点の量は、シランカップリング剤の仕込み量によって決まる。このため、塩濃度が高い溶液中においても、十分な温度応答特性を示すようにするためには、シランカップリング剤を導入する際のシランカップリング剤の仕込み濃度を、０．１ｍＭ以上とすることが好ましく、０．３ｍＭ以上とすることがより好ましい。そして、２ｍＭ以下とすることが好ましく、１ｍＭ以下とすることがより好ましく、０．８ｍＭ以下とすることがさらに好ましい。

【0052】

細胞処理用基板の細胞接着スポット２０３以外の部分は、細胞の非特異吸着が生じにくい状態となっていることが好ましい。例えば、細胞非接着性ポリマー２０５が固定されていることが好ましい。

【0053】

細胞非接着性ポリマー２０５は、基材２０１及びスポット形成材料２０２よりも細胞との相互作用が小さく、細胞の非特異的な接着が少ない材料であればどのような材料であってもよい。一般的に細胞は親水性の表面には接着しにくいため、細胞非接着性ポリマー２０５は、基材２０１及びスポット形成材料２０２よりも親水性が高いポリマーが好ましい。例えば、ポリ２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン等の合成リン脂質系ポリマー、ポリ２−エトキシアクリレート又はポリエチレングリコール等とすればよい。合成リン脂質系ポリマーは、メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンと２−（メタ）アクリロイルオキシエチルイソシアネートとの共重合体等であってもよい。ポリエチレングリコールは、ポリ（メタ）アクリル酸ポリエチレングリコール又はポリ（メタ）アクリル酸ポリエチレングリコールアルキルエステル等とすればよい。

【0054】

また、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド、ポリスチレンスルホン酸の水溶性塩、ポリアクリル酸の水溶性塩、ポリグルタミン酸の水溶性塩及びポリビニルピロリドン等のうちの少なくとも１つとからなる混合高分子の含水ゲル成型物等を用いてもよい。ポリ（ＭＰＣ）等の双性構造イオンのポリマー、ポリ（Ｏ−メタクリロイル−Ｌ−セリン）等の両性イオン構造のポリマー並びにポリアクリル酸及びポリエチレンイミン等のポリイオンコンプレックスを用いてもよい。さらに、これらのポリマーセグメントに、ランダム、ブロック又はグラフト状に他の共重合セグメントが含まれている構成としてもよい。合成ポリマーに限らず細胞非接着性のタンパク質等の天然高分子を用いてもよい。細胞非接着性のタンパク質としては、例えばアルブミンを用いることができる。また、親水性にするのではなく、含フッ素ポリマー等を用いて高撥水性の表面とすることにより細胞非接着性を実現してもよい。この他、細胞又は微生物等を細胞接着スポット２０３以外の部分に吸着させることにより、細胞接着スポット２０３以外の部分をターゲット細胞が吸着しにくい表面としてもよい。

【0055】

細胞非接着性ポリマー２０５の細胞処理用基板への固定は、温度応答性ポリマー２０４の固定と同様に、リンカーを用いる方法、表面に固定した開始剤を用いて重合する方法等により行うことができる。また、プラズマ照射等により表面にラジカルを形成し、これを重合開始点として重合する方法を用いることもできる。さらに、イオン結合、疎水結合等により固定してもよい。

【0056】

細胞非接着性ポリマー２０５を固定する代わりに、細胞処理用基板の細胞接着スポット２０３以外の部分を、細胞非接着性の材料を用いて形成してもよい。細胞非接着性の材料は、例えばチタン合金又は酸化チタン等を挙げることができる。また、細胞接着スポット２０３以外の部分をプラズマ照射等により親水化して細胞非接着性としたり、界面活性剤等の低分子物質を用いて細胞非接着性としたりしてもよい。

【0057】

また、細胞非接着性ポリマー２０５に変えて、細胞接着スポット２０３とは異なる特性を有する温度応答性ポリマーを固定してもよい。例えば、細胞接着スポット２０３以外の部分にＬＣＳＴを有する温度応答性ポリマーを固定することができる。細胞接着スポット２０３以外の部分に固定する温度応答性ポリマーは、細胞を細胞接着スポット２０３に吸着させる温度において親水性となっていればよい。但し、細胞接着スポット２０３から細胞を遊離させる際にも親水性であることが好ましい。このため、細胞接着スポット２０３以外の部分に固定する温度応答性ポリマーのＬＣＳＴは、細胞接着スポット２０３に固定する温度応答性ポリマーのＵＣＳＴ以上、好ましくは３℃以上、より好ましくは５℃以上高くすればよい。また、細胞接着スポット２０３に細胞を吸着させる温度において親水性となるような、低いＵＣＳＴを有する温度応答性ポリマーを用いることも可能である。

【0058】

−使用方法−
細胞接着スポットへの細胞の接着は、細胞を細胞処理用基板に播種した後、ＵＣＳＴ以下の温度を維持することにより容易に行うことができる。細胞接着スポットに接着された細胞を選択的に標識して、必要とする標的細胞を識別できるようにした後、標的細胞が接着された細胞接着スポットの温度をＵＣＳＴ以上とすれば、標的細胞だけを細胞接着スポットから遊離させることができる。

【0059】

細胞接着スポットの局所的な加温は特に限定されないが、レーザ光を照射することにより行うことができる。特に、全反射照明蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦ）等を用いてエバネセント波が生じるようにレーザ光を照射すれば、細胞にダメージを与えることなく、選択した細胞接着スポットを局所的に加温することが容易にできる。

【0060】

照射するレーザ光の波長は特に限定されないが、細胞へのダメージの低減及びエネルギーの効率の観点から、６００ｎｍ以上が好ましく、８００ｎｍ以上がより好ましく、そして２４００ｎｍ以下が好ましく、２０００ｎｍ以下がより好ましい。特に、温度応答性ポリマーの特異的な吸収波長の光を照射することにより、細胞へのダメージを低減しつつ、効率よく温度応答性ポリマーを加温することができる。（メタ）アクリルアミドと（メタ）アクリルニトリルとの共重合体の場合、アセトアミド及びアセトニトリルの吸収スペクトルから、１４８４ｎｍ、１９７２ｎｍ、及び２１７６ｎｍ等に吸収ピークが存在すると考えられる。従って、これらの吸収ピーク又はその近傍の波長のレーザ光を照射すれば、効率よく温度応答性ポリマーを加温することができる。

【0061】

温度応答性ポリマーがさらに効率よくレーザ光を吸収するように、温度応答性ポリマーに色素等を組み込んでもよい。色素としては例えば、ローダミン、カルコン、オーロン、アントシアニン類、及びフラボン類等を用いることができる。特に、クロロフィル等は吸収した光を熱エネルギーとして放出するため、より効率よく温度応答性ポリマーを加温することができる。クロロフィルを温度応答性ポリマーに導入する場合には、銅クロロフィリン又はその塩（例えばナトリウム塩）（Chlph）を共重合させればよい。温度応答性ポリマーにおけるChlphに由来するモノマー単位のモル含有率は、特に限定されないが、０．１ｍｏｌ％以上、好ましくは０．５ｍｏｌ％以上、より好ましくは１ｍｏｌ％以上、そして５ｍｏｌ％以下、好ましくは３ｍｏｌ％以下、より好ましくは２ｍｏｌ％以下とすることができる。Chlphは４００ｎｍ付近に吸収ピークを有しているため、Chlphを導入した温度応答性ポリマーの場合には、４００ｎｍ〜４５０ｎｍ程度の波長のレーザ光を用いて加温することができる。

【0062】

レーザ光による加温に限らず、赤外線照射を行ったり、細胞接着スポットの位置にマイクロヒータを配置したりすることにより選択的な加温を行ってもよい。

【0063】

細胞の標識は特に限定されないが、抗体を用いた蛍光標識等を用いることができる。標的細胞を標識すればよいが、不要な細胞を標識してもよい。

【0064】

全反射照明蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦ）と、レーザ光源と、制御部とを組み合わせることにより、必要とする細胞を自動的に細胞接着スポットから遊離させて回収する細胞自動分取装置を実現することができる。

【0065】

以下に、図２を用いて本実施形態の細胞自動分取装置３００の動作を説明する。まず、チャンバー３３１内に収容された細胞処理用基板２００に、供給部３２２から細胞浮遊液が供給される。この際に、細胞接着スポットが細胞接着性となるようにチャンバー３３１の温度をＵＣＳＴ未満の温度とする。これにより、細胞浮遊液中の細胞は、細胞接着性となっている接着スポットに接着される。

【0066】

細胞接着スポットに接着された細胞を必要に応じて培養する。培養は通常は二酸化炭素（ＣＯ₂）雰囲気において行う。培養の際に、供給部３２２から必要に応じて、培養に必要な薬液を供給したり、分化を促す試薬を供給したりしてもよい。供給部３２２は、供給する細胞浮遊液及び試薬の種類等に応じて複数設けられていてもよい。細胞を培養した後、供給部３２２から標的細胞を特異的に認識する標識試薬を供給し、標的細胞を標識する。標識試薬は標的細胞を特異的に標識できればどのようなものであってもよい。例えば、標的細胞を特異的に認識する一次抗体と、一次抗体を特異的に認識し、色素が結合された二次抗体とすればよい。

【0067】

次に、接着スポットに接着された細胞の光学像をデータとして制御部３０２に取り込み、標的細胞かどうかの判定を行う。本実施形態においては、色素標識されている場合には標的細胞と判定し、色素標識されていない場合には不要な細胞と判定する。具体的にはＴＩＲＦである観察用光学系３０１により細胞接着スポットに接着された細胞を観察し、色素による蛍光の有無により標的細胞かどうかの判定を行う。観察用光学系３０１は、目視観察用の顕微鏡部３１１と光学像を画像データへ変換するデータ変換部３１２とを有している。なお、目視観察用の顕微鏡部３１１は必要に応じて設ければよく、なくてもかまわない。

【0068】

データ変換部３１２は、例えば冷却ＣＣＤ（Charge Coupled Device）カメラ等の撮像素子とすればよい。データ変換部３１２を光電子増倍管等として、光子のカウントを行うことにより蛍光の有無を判定してもよい。本実施形態の細胞自動分取装置３００における蛍光標識励起用の光は、蛍光標識観察用光源３１５Ａから供給される。なお、蛍光標識観察用光源３１５Ａは、通常光の光源を用いればよいが、レーザ光源を用いることもできる。

【0069】

データ変換部３１２の出力は制御部３０２に入力される。制御部３０２は入力された画像データに基づいて細胞接着スポットに接着されている細胞が、標的細胞か不要細胞かを判定する。標的細胞であると判定した場合には、温度制御用レーザ光源３１５Ｂを駆動し、細胞接着スポットの温度をＵＣＳＴ以上とする。これにより、標的細胞が細胞接着スポットから剥離する。剥離させた細胞は回収部３２３に回収する。本実施形態の細胞自動分取装置３００では、温度制御用レーザ光源３１５Ｂからのレーザ光は、エバネセント波として細胞接着スポットに照射される。このため、レーザ光により細胞がダメージを受けることはほとんどない。

【0070】

制御部３０２は、位置制御部３２４を駆動して、光学的データの取り込み、標的細胞かどうかの判定及び標的細胞の剥離をすべての細胞接着スポットに対して、又はあらかじめ定められた細胞接着スポットに対して行う。光学的データの取り込み、標的細胞かどうかの判定は、複数の細胞接着スポットに対してまとめて行ってもよい。

【0071】

本実施形態において、標的細胞を特異的に標識する例を示したが、不要な細胞を特異的に標識してもよい。この場合は、標識されていない細胞が接着された細胞接着スポットの温度を上昇させて、標的細胞を回収すればよい。標的細胞と不用な細胞とのそれぞれに異なる標識を行ってもよい。また、抗体を用いた標識ではなく、細胞染色等により標識を行ってもよい。さらに、標識は必ずしも必要ではなく、細胞の形態の差異等により、標的細胞かどうかを判定することも可能である。細胞機能の違いにより誘起される赤外又は近赤外吸収、ラマン散乱、化学発光、屈折率、細胞接着面のプラズモン吸収、細胞接着面の光熱変換効率又は酸化還元電流等の違いにより標的細胞かどうかを判定してもよい。複数の判定方法を組み合わせることも可能である。

【0072】

蛍光標識観察用レーザ光源と、温度制御用レーザ光源とを別々に設ける例を示したが、これらを兼用することも可能である。この場合には、蛍光標識観察の際と温度制御の際とでレーザ光源の出力レベルを変化させる構成としてもよい。

【実施例】

【0073】

＜細胞処理用基板の製造＞
−細胞接着スポットの形成−
基板は、１０ｍｍ角で厚さが０．２１ｍｍのガラス基板又はポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）基板を用いた。基板の表面にクロム及びチタンの合金（Ｃｒ／Ｔｉ）膜及び金膜を順次堆積した。細胞接着スポットの形成は以下のようにした。まず、金膜上にスピンコーターにより感光性レジストをコーティングした後、石英ガラス上に選択的にクロムコーティングをしたフォトマスクを重ねた。紫外光照射を行い、フォトマスクのクロムコーティングが施されていない箇所（ガラス露出部）を透過した紫外光により感光性レジストを露光した。次に、レジストの露光部を現像液により除去した。続いて、薬液を用いたウェットエッチングを行い、金膜を選択的に除去した。この後、アセトンにより残ったレジストを除去した。これにより、凹部である細胞接着スポットを形成した。

【0074】

細胞接着スポットは、直径５０μｍとし、細胞接着スポットの中心間の間隔は１００μｍとした。８０×８０個の細胞接着スポットをアレイ状に形成した。

【0075】

−温度応答性ポリマーの固定−
ガラス基板の場合には、まず、リンカーである３−アミノプロピルトリメトキシシラン（アズマックス社製）を細胞接着スポットに固定した。具体的には、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）により１ｍＭに調製した３−アミノプロピルトリメトキシシラン溶液に細胞接着スポットを形成した基板を浸漬し、６０℃で３時間反応させた。

【0076】

次に、開始剤である２−ブロモイソブチルブロマイド（ＢｉＢＢ）をリンカーと結合させた。具体的には、トルエン４ｍｌに、トリエチルアミン７０ｍｇ、４−ジエチルアミノピリジン３．５２ｍｇを溶解し、３−アミノプロピルトリメトキシシランを固定した基板を浸漬し−５℃とする。臭化２−ブロモイソブチル５０ｍｇを０．５ｍｌのトルエンに溶解させた溶液を、シリンジを用いてゆっくり適下した、かき混ぜながら、−５℃で３０分、さらに２５℃で４時間反応させた。

【0077】

次に、アクリルアミド（ＡＡｍ、和光純薬工業(株)社製）４７５．４ｍｇ（６．６９ｍｍｏｌ）、アクリロニトリル（ＡＮ、東京化成(株)社製）７０．２ｍｇ（１．３１ｍｍｏｌ）、臭化銅（Ｉ）（和光純薬工業(株)社製）１０ｍｇ、N,N,N',N'',N''−ペンタメチルヂエチレントリアミン（和光純薬工業(株)社製）１４６μｌ、及びアスコルビン酸１２３ｍｇを８ｍｌのジメチルスルホオキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させたモノマー溶液に開始剤を固定した基板を浸漬し、４０℃で６．５時間反応させた。これにより、ポリ（ＡＡｍ−ＡＮ）である温度応答性ポリマーを細胞接着スポットの表面に重合して固定した。グラフト量は、６.２μｇ／ｃｍ²であった。温度応答性ポリマーのグラフト量は、温度応答性ポリマーのグラフト前の基板の重量とポリマーグラフト重合後の基板の重量との差から求めた。また、後で述べる方法により測定した重合度は、５２０であった。なお、重合時間を２時間とした場合の重合度は１３０、４時間とした場合の重合度は３９０であった。

【0078】

ＰＥＴ基板の場合には、基板にアルゴン（Ａｒ）プラズマを照射することにより、細胞接着スポットに重合開始点を導入した。Ａｒプラズマは以下の条件で照射した。
反応気圧：０．１Ｐａ
Ａｒ流量：１０ｓｃｃｍ
高周波電力：
反応温度：室温
照射時間：６０秒
重合開始点を導入した後、アクリルアミド（ＡＡｍ、和光純薬工業(株)社製）４７５．４ｍｇ（６．６９ｍｍｏｌ）、アクリロニトリル（ＡＮ、東京化成(株)社製）７０．２ｍｇ（１．３１ｍｍｏｌ）を８ｍｌのＤＭＳＯに溶解させたモノマー溶液に重合開始点を導入した基板を浸漬し、６０℃で２０時間反応させた。これにより、ポリ（ＡＡｍ−ＡＮ）である温度応答性ポリマーを細胞接着スポットの表面に重合して固定した。グラフト量は、５４.２μｇ／ｃｍ²であった。また、後で述べる方法により測定した重合度は、１２５であった。

【0079】

−細胞非接着性ポリマーの固定−
ＭＰＣ（シグマアルドリッチ社製）０．５００ｇ及びブチルメタクリレート（東京化成工業(株)製：ＢＭＡ）０．９６３ｇ、アゾビスイソ吉草酸ジメチル（和光純薬工業(株)製）１９．５ｍｇを５ｍｌのエタノールに溶解させたモノマー溶液と６０℃で１５時間反応させ、ポリ（ＭＰＣ−ＢＭＡ）を得た。０．１ｗｔ％のポリ（ＭＰＣ−ＢＭＡ）エタノール溶液に、金膜の表面をヨウ素とヨウ化アンモニウムとの混合溶液によりエッチングした基板を４℃、１２時間、浸漬した後、水／エタノール（８／２(v/v)）溶液に４℃、１時間浸漬してガラススポット部のポリ（ＭＰＣ−ＢＭＡ）を除き、基板の細胞接着スポット以外の部分に、細胞非接着性ポリマーを固定した。

【0080】

−遺伝子導入用基板の物性評価−
・接触角：
接触角は、以下のようにして測定した。エルマ製ゴニオメータ式接触角測定機Ｇ−１型を用いてステージ温度を所定の温度とした後、基板上に１５μｌの水滴を置き接触角を測定した。測定は計５回のうち、最大値及び最小値を除いた平均値を接触角とした。ステージ温度を変えて接触角を測定し、接触角が大きく変化する温度をＵＣＳＴとした。

【0081】

温度応答性ポリマーを固定したガラス基板の３１℃における水に対する接触角は５９°、４０℃における接触角は４６°、ＵＣＳＴは３６．５℃であった。温度応答性ポリマーを固定したＰＥＴ基板の３１℃における接触角は７８°、４０℃における接触角は６５°、ＵＣＳＴは３６．５℃であった。温度応答性ポリマーを固定していないガラス基板の３１℃における接触角は、２１°、４０℃における接触角は２１°であった。温度応答性ポリマーを固定していないＰＥＴ基板の３１℃における接触角は、７５°、４０℃における接触角は７５°であった。

【0082】

・分子量：
細胞接着スポットに固定した温度応答性ポリマーの分子量（数平均分子量Ｍｎ）は、以下のようにして測定した。走査型プローブ顕微鏡を用いてガラススポット部の高低差を測定し、基板から伸びているポリマーブラシの平均長さを求め、繰り返し単位の炭素−炭素結合長０．１５４ｎｍから重合度を見積もった。

【0083】

（実施例１）
温度応答性ポリマーを固定したガラス基板にヒーラ（ＨｅＬａ）細胞を３×１０⁵個／ｍｌの濃度に調製した細胞浮遊液８００μｌを播種し、３０℃、２４時間、５％ＣＯ₂雰囲気中で、基板への細胞の接着・培養を行った。リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で、非接着細胞を除去した。さらに、５％ＣＯ₂雰囲気において３７℃の温度で３０分の培養を行った。培地はＭＥＭ培地（MinimumEssential Medium、ＧＩＢＣＯ社製：ＭＥＭ）と、ウシ胎仔血清（ＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製：ＦＣＳ）と、非必須アミノ酸含有ＭＥＭ（MEM non-essential amino acid、ＧＩＢＣＯ社製：ＮＥＡＡ）とを８９：１０：１に混合して用いた。

【0084】

細胞を培養した後、３０℃を保持した状態で上澄み液を静かに除去し、基板を蛍光顕微鏡又は位相差顕微鏡により観察し、基板上に接着された細胞数を計測した。細胞数を計測した後、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液１００μｌ×３回により基板を洗浄し、洗浄後の細胞数を計測した。さらに、３７℃にて３０分間静置した後、３７℃を保持した状態でリン酸緩衝液１００μｌ×３回により基板を洗浄し、洗浄後の細胞数を計測した。

【0085】

洗浄前の細胞数と、３０℃における洗浄後の細胞数とを比較することにより３０℃における剥離率を算出し、３０℃における洗浄後の細胞数と３７℃における洗浄後の細胞数とを比較することにより３７℃における剥離率を算出した。３０℃における剥離率は０％であり、３７℃における剥離率は９８％であった。

【0086】

（実施例２）
温度応答性ポリマーを固定したＰＥＴ基板を用いた以外は、実施例１と同様にして剥離率を求めた。３０℃における剥離率は１８％であり、３７℃における剥離率は７５％であった。

【0087】

（比較例１）
温度応答性ポリマーを固定していないガラス基板を用いた以外は、実施例１と同様にして剥離率を求めた。３０℃における剥離率は５３％であり、３７℃における剥離率は９％であった。

【0088】

（比較例２）
温度応答性ポリマーを固定していないＰＥＴ基板を用いた以外は、実施例１と同様にして剥離率を求めた。３０℃における剥離率は２２％であり、３７℃における剥離率は２５％であった。

【0089】

表１に各実施例及び比較例の剥離率をまとめて示す。

【0090】

【表1】

【産業上の利用可能性】

【0091】

本発明に係る細胞処理用基板、その製造方法、細胞処理方法及び細胞自動分取装置は、細胞接着スポットの温度を選択的に上昇させることにより、必要とする細胞を容易に回収でき、固相トランスフェクションをはじめとする細胞処理等に有用である。

【符号の説明】

【0092】

２００ 細胞処理用基板
２０１ 基材
２０２ スポット形成材料
２０３ 細胞接着スポット
２０４ 温度応答性ポリマー
２０５ 細胞非接着性ポリマー
３００ 細胞自動分取装置
３０１ 観察用光学系
３０２ 制御部
３１１ 顕微鏡部
３１２ データ変換部
３１５Ａ 蛍光標識観察用レーザ光源
３１５Ｂ 温度制御用レーザ光源
３２２ 供給部
３２３ 回収部
３２４ 位置制御部
３３１ チャンバー

【図1】

【図2】