特許 6119089 磁化可能な球状ポリビニルアルコール微粒子、その製造方法及び使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6119089

(24)【登録日】2017年4月7日

(45)【発行日】2017年4月26日

(54)【発明の名称】磁化可能な球状ポリビニルアルコール微粒子、その製造方法及び使用

(51)【国際特許分類】

   C08J 3/12 20060101AFI20170417BHJP

【ＦＩ】

   C08J3/12 ZCEX

【請求項の数】28

【全頁数】21

(21)【出願番号】特願2015-521994(P2015-521994)

(86)(22)【出願日】2013年7月18日

(65)【公表番号】特表2015-524493(P2015-524493A)

(43)【公表日】2015年8月24日

(86)【国際出願番号】EP2013002145

(87)【国際公開番号】WO2014015966

(87)【国際公開日】20140130

【審査請求日】2015年11月27日

(31)【優先権主張番号】102012014536.5

(32)【優先日】2012年7月21日

(33)【優先権主張国】DE

(73)【特許権者】

【識別番号】515018068

【氏名又は名称】パーキンエルマー ケマーゲン テクノロジー ゲーエムベーハー

【氏名又は名称原語表記】ＰＥＲＫＩＮＥＬＭＥＲ ＣＨＥＭＡＧＥＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥ ＧＭＢＨ

(74)【代理人】

【識別番号】100098682

【弁理士】

【氏名又は名称】赤塚 賢次

(72)【発明者】

【氏名】オスター ユルゲン

(72)【発明者】

【氏名】ゾマー トーマス

(72)【発明者】

【氏名】アー ブラサード ローサー

【審査官】 中川 裕文

(56)【参考文献】

【文献】 特表平１１−５１０８３６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 独国特許出願公開第１０１０３６５２（ＤＥ，Ａ１）

【文献】 特開昭４６−００６１９１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００３−５２８１８１（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０８Ｊ ３／００− ３／２８

９９／００

Ｃ０８Ｋ ３／００− １３／０８

Ｃ０８Ｌ １／００−１０１／１４

Ｃ１２Ｎ １５／００− １５／０２

１５／０９

１５／１１３−１５／１１７

１５／８７３−１５／８７７

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

０．５〜３μｍの範囲の粒径分布を有する磁化可能な球状ポリビニルアルコール微粒子
の製造方法であって、
ナノ粒子状の磁化可能材料を、ポリビニルアルコールを溶解状態で 含む水相に分散させる工程と、
前記水相と混和せず、少なくとも１種の乳化剤を含む有機相に前記水相を添加し、４０
℃以上の温度で撹拌することによってエマルションを得る工程と、
撹拌を継続しながら、ポリビニルアルコールを架橋させるために適した少なくとも１種
の水溶性架橋剤を添加する工程と、
を含むことを特徴とする方法。

【請求項2】

前記ナノ粒子状の磁化可能材料は、５〜２５０ｎｍの範囲の粒径を有する磁化可能なナノ粒子を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

ナノ結晶磁鉄鉱を前記ナノ粒子状の磁化可能材料として使用することを特徴とする、請
求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記水相を前記有機相に添加する前に、遠心分離によって前記水相を処理して２５０ｎｍを超える粒径を有する粒子を除去することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

前記水相中のポリビニルアルコールの濃度が、２重量％以下であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

前記水相中の前記ナノ粒子状の磁化可能材料の濃度が、０．５〜７．５重量％であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

前記水非混和性有機相が、植物油、合成油、鉱油、シリコーン油及びパラフィン油から
なる群から選択される１種以上の物質を含むことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか
１項に記載の方法。

【請求項8】

前記有機相に含まれる乳化剤の割合（比率）が、０．１〜１０重量％であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

前記架橋剤が、二官能アルデヒド、酸塩化物及びジビニルスルホンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

前記架橋剤を液体として添加し、前記架橋剤を、前記水相に対して、０．１〜１０体積％の割合（比率）で使用することを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

二官能アルデヒドを前記架橋剤として使用し、酸を添加して架橋反応を行うことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

少なくとも５０℃の温度で撹拌することによって前記エマルションを得ることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

回転子−固定子原理に従って動作する分散混合機を使用して前記エマルションを得るこ
とを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

ナノ粒子状の磁化可能材料を、ポリビニルアルコールを溶解状態で含む水相に、前記水相中のポリビニルアルコールの濃度が２．０重量％以下となるように分散させる工程と、
前記水相と混和せず、少なくとも１種の乳化剤を含む有機相に前記水相を添加し、少な
くとも４０℃の温度で撹拌することによってエマルションを得る工程と、
撹拌を継続しながら、ポリビニルアルコールを架橋させるために適した少なくとも１種
の水溶性架橋剤を添加する工程と、
を含むことを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項15】

２５０ｎｍ以下の粒径を有するナノ粒子状の磁化可能材料を、ポリビニルアルコールを溶解状態で含む水相に、前記水相中のポリビニルアルコールの濃度が２．０重量％以下となるように分散させる工程と、
前記水相と混和せず、少なくとも１種の乳化剤を含む有機相に前記水相を添加し、少な
くとも４０℃の温度で撹拌することによってエマルションを得る工程と、
架橋剤としての少なくとも１種の二官能アルデヒドを添加すると共に、１Ｎ〜３Ｎの塩
酸を前記水相に対して１０体積％以下の量で添加する工程と、
を含むことを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項16】

ナノ粒子状の磁化可能材料を、ポリビニルアルコールを溶解状態で含む水相に、前記水相中のポリビニルアルコールの濃度が２．０重量％以下となるように分散させる工程と、
前記水相と混和せず、少なくとも１種の乳化剤を含む有機相に前記水相を添加し、回転
子−固定子原理に従って動作する分散混合機を使用し、５００〜４０００ｒｐｍの範囲の
回転子速度で、４０℃以上の温度で撹拌することによって、１０Ｌ以上のエマルションを
得る工程と、
撹拌を継続しながら、ポリビニルアルコールを架橋するために適した少なくとも１種の
水溶性架橋剤を添加する工程と、
を含むことを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項17】

ナノ粒子状の磁化可能材料を、ポリビニルアルコールを溶解状態で含む水相に、前記水相中のポリビニルアルコールの濃度が２．０重量％以下となるように分散させる工程と、
前記水相と混和せず、少なくとも１種の乳化剤を含む有機相に前記水相を添加し、回転
子−固定子原理に従って動作する分散混合機を使用し、５００〜４０００ｒｐｍの範囲の
回転子速度で、少なくとも４０℃の温度で撹拌することによって、１０Ｌ以上のエマルションを得る工程と、
架橋剤としての少なくとも１種の二官能アルデヒドを添加すると共に、酸を添加する工程と、
を含むことを特徴とする、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項18】

１００μＳ／ｃｍ未満のコンダクタンスを有する脱イオン水に磁化可能なナノ粒子を懸濁させる工程と、
得られたナノ粒子水懸濁液を超音波ホモジナイザで処理する工程と、
を含む処理方法を前記ナノ粒子状の磁化可能材料に対して行うことを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項19】

前記処理方法が、２５０ｎｍを超える粒径を有する粒子を前記ナノ粒子懸濁液から除去する遠心分離工程を含むことを特徴とする、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記磁化可能材料は、磁鉄鉱ナノ粒子であって、前記磁鉄鉱ナノ粒子は、１００μＳ／ｃｍ未満のコンダクタンスを有する脱イオン水に磁化可能なナノ粒子を懸濁させる工程と、
得られたナノ粒子水懸濁液を超音波で処理する工程と、
前記ナノ粒子水懸濁液を１０００〜３０００×ｇで遠心分離する工程と、
を含む方法により調製されることを特徴とする請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項21】

０．５〜３μｍの範囲の粒径分布を有し、ナノ粒子状の磁化可能材料を、少なくとも５０重量％の割合で含む、磁化可能な球状ポリビニルアルコール微粒子。

【請求項22】

１.２５〜２．２５μｍの範囲の粒径分布を有する、請求項２１に記載の磁化可能な球状ポリビニルアルコール微粒子。

【請求項23】

−３５ｍＶ以下のゼータ電位を有することを特徴とする、請求項２１又は２２に記載の磁化可能な球状ポリビニルアルコール微粒子。

【請求項24】

リアルタイム定量ＰＣＲに使用した場合に、Ｃｔ値の変化を生じさせないか、２％以下のＣｔ値の上昇を生じさせることを特徴とする、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の磁化可能な球状ポリビニルアルコール微粒子。

【請求項25】

ナノ粒子状の磁化可能材料を、少なくとも６０重量％以下の割合で含むことを特徴とする、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の磁化可能な球状ポリビニルアルコール微粒子。

【請求項26】

共有結合又は非共有結合を介した生体分子又はリガンドの結合を可能とする官能基を有することを特徴とする、請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の磁化可能な球状ポリビニルアルコール微粒子。

【請求項27】

１以上の生体分子又はリガンドが共有結合又は非共有結合によって結合されることを特徴とする、請求項２１〜２６のいずれか１項に記載の磁化可能な球状ポリビニルアルコール微粒子。

【請求項28】

請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法によって製造された磁化可能なポリビニル
アルコール微粒子又は請求項２１〜２７のいずれか１項に記載の磁化可能なポリビニルア
ルコール微粒子の、細胞、核酸、ペプチド、タンパク質、毒素、ウイルス、細菌、抗体、
酵素、抗原又は受容体の分離、精製又は濃縮、診断又は法医学的検出法、免疫検定法、Ｄ
ＮＡ配列決定、ＰＣＲ産物精製、細胞分画、タンパク質単離、アフィニティ精製、免疫沈
降反応、組織適合検査、オリゴヌクレオチド合成又はペプチド合成のための使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、特に診断検出法における使用又は生体分子の単離及び精製に適した磁化可能な球状ポリビニルアルコール微粒子に関する。また、本発明は、前記微粒子をより大きな規模で製造することができる製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

上述した種類の磁性粒子は、多くの診断法や、生物医学又は生体分子研究に使用されている。通常、磁性粒子は、コロイド状の超常磁性材料を含む球状粒子であり、超常磁性材料は、ポリマーマトリックスに埋め込まれているか、ポリマーシェルによって覆われている。通常、磁性粒子は１〜２０μｍの粒径を有する微粒子である。

【0003】

磁化可能な微粒子は、選択的に（場合によっては選択的かつ可逆的に）生体分子又は細胞等の標的物質を結合させることができるため、特に自動化処理における使用に適している。磁化可能な微粒子は、磁場を与えることによって一時的に固定することができるため、遠心分離工程を行うことなく液体媒体から分離することができる。これにより、多段階処理においても容易に自動化を行うことができ、時間を大きく節約することができる。

【0004】

磁化可能なポリマー系微粒子並びにその製造方法及び使用は、例えば、特許文献１や、特許文献１に引用された刊行物に記載されている。

【0005】

特許文献１は、細胞、核酸、タンパク質、ウイルス又は細菌の分画や、免疫検定法、ＤＮＡ配列決定又はＤＮＡ合成における使用に適した、ポリビニルアルコールのビーズ状又は球状粒子を開示している。

【0006】

特許文献１に記載された粒子は、１０〜２００ｎｍの粒径を有する磁性コロイドが封入されたポリビニルアルコールのポリマーマトリックスを含む。ビーズ状又は球状ポリマー粒子は、１〜１０μｍ、好ましくは１〜４μｍの粒径を有する。

【0007】

特許文献１に記載された磁化可能なポリマー粒子を製造する場合には、磁性コロイドが分散されたポリビニルアルコール水溶液を、室温において、ポリマー相と混和せず、少なくとも２種類の乳化剤を含む有機相（例えば、植物油）に撹拌によって懸濁させる。懸濁時には、水酸基と反応する水溶性架橋剤（グルタルアルデヒド等）を添加することによってポリビニルアルコールを架橋させる。その後、例えば、生体分子を結合させることができるスペーサー分子へのグラフトによって、生体分子の特異的な結合のためにポリビニルアルコール粒子を変性させることができる。

【0008】

しかしながら、特許文献１に記載された製造方法及びそれによって得られる粒子は様々な欠点を有することが判明した。

【0009】

第１に、特許文献１に記載された方法によって製造された磁化可能なポリマー粒子は広過ぎる粒径分布を有し、粒径分布はバッチ間で変動する場合がある（すなわち、バッチ再現性が不十分である）。特許文献１に記載された方法によって製造された粒子を分離処理に使用すると、粒径分布の変動によって収量が不均一となるため、多くの用途においては特許文献１に記載された方法によって製造された粒子を使用することは不可能である。

【0010】

また、特許文献１に記載された方法によって製造された磁化可能なポリマー粒子は、０．５μｍ未満の粒径を有する粒子及び３μｍを超える粒径を有する粒子を高い割合で含む。

【0011】

０．５μｍ未満の粒径を有する粒子は、十分な分離速度又は外部磁界における移動度を有していないため、通常使用される磁場強度を使用する場合には、粒子は非常にゆっくりと分離され、総処理時間に悪影響を与える。また、非常にゆっくりと分離されるか、全く分離されない粒子は不純物となり、その後の反応又は測定（紫外線測定やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等）を妨げ、不正確な結果を生じさせる。

【0012】

３μｍを超える粒径を有する粒子は、重力場において比較的迅速に沈降し、生体分子を結合させる能力が大きく制限されるという欠点を有する。そのため、適切な手段（再分散）によって沈降に対処することが必要となる場合がある。また、磁化可能なポリマー粒子の粒径が大きくなると、全質量又は懸濁量に対する総表面積が減少する。これにより、分離対象物質（生体分子又は細胞）の収量が低下する。小さ過ぎる（＜０．５μｍ）粒子及び大き過ぎる（＞３μｍ）粒子の存在により、例えば自動核酸精製における磁気分離処理が困難となる。

【0013】

また、特許文献１に記載された方法によって製造された磁化可能なポリビニルアルコール粒子では、磁化可能材料（磁鉄鉱／酸化鉄）の含有量が比較的低い（約７〜２４重量％）。そのため、磁場における粒子の分離性が不十分又は不利である。

【0014】

粒径、粒径分布及び磁鉄鉱含有量における上述した欠点のために、特許文献１に記載された方法によって製造された磁化可能な粒子の有用性は限定され、特に自動分離法及び分析法にはあまり適していない。

【0015】

特に、特許文献１に記載された磁化可能なポリマー粒子には、ＰＣＲ法に使用した場合に阻害作用を示し、検出感度が低下すると共に測定の精度及び信頼度が悪影響を受けるという欠点があることが判明した。ＰＣＲ技術は分子生物学研究及び医療診断に広く使用されており、磁化可能な微粒子の使用はこれらの方法の自動化に関して重要になっているため、特許文献１に記載された粒子の阻害作用は非常に不利である。

【0016】

また、特許文献１に記載された製造方法は、より大きな規模における磁化可能なポリビニルアルコール粒子の製造には適していないことが判明した。特許文献１に記載された製造方法によれば、反応バッチの容量は最大約５Ｌに制限され、磁化可能なポリマー粒子の収量は非常に低い。そのため、特許文献１に記載された製造方法により、必要とされる品質特性（特に、狭い粒径分布）を有する磁化可能なポリビニルアルコール粒子をより大量に費用効率よく製造することは不可能である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0017】

【特許文献1】国際公開第９７／０４８６２Ａ１号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0018】

上述した欠点及び要件に鑑み、本発明の目的は、０．５〜３μｍの範囲の狭い粒径分布を有し、所期の用途、特に自動方法に使用した場合に、高い処理速度（すなわち、高い生産高）、標的物質の（特に、生成物の純度に関する）分離効率の向上及び／又は高い収量を得ることを可能とし、ＰＣＲ用途においては阻害作用を有さないか、小さな阻害作用のみを示すことを特徴とする、上述した種類の磁化可能なポリビニルアルコール粒子を提供することにある。

【0019】

本発明の別の目的は、本発明に係る磁化可能な微粒子を製造することができる製造方法、特に、本発明に係る磁化可能な微粒子をバッチ間一貫性を保ちながら製造することができる製造方法を提供することにある。本発明の別の目的は、上述した狭い粒径分布を有する本発明に係る磁化可能な微粒子をより大きな規模（反応バッチに対して２００ｇ以上、好ましくは５００ｇ以上、より好ましくは１ｋｇ以上の量）で製造することができる製造方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0020】

上記目的は、独立請求項に記載された製造方法及び磁化可能な球状ポリビニルアルコール微粒子、従属請求項に記載された特別又は好適な実施形態並びに以下の記載から明らかとなるであろう実施形態によって達成される。本発明の方法の特徴、特にその全体により、以下に記載するように、向上した粒子特性を有する磁化可能な球状ポリビニルアルコール微粒子を得ることができる。

【0021】

本発明に係る方法は、０．５〜３μｍの範囲の狭い粒径分布を有し、及び／又は製造規模（例えば、１バッチあたり２００ｇ以上）において上述した有利な特性を有する磁化可能な球状ポリビニルアルコール微粒子の製造を可能とするものであって、少なくとも、
（１）ナノ粒子状の磁化可能材料、好ましくは磁鉄鉱を、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を溶解状態で含む水相（ポリビニルアルコール水溶液）に分散させる工程と、
（２）前記水相と混和せず、少なくとも１種の乳化剤を含む有機相に前記水相を添加し、２５℃以上の温度で撹拌することによってエマルションを得る工程と、
（３）撹拌を継続しながら、ポリビニルアルコールを架橋させるために適した少なくとも１種の水溶性架橋剤を添加する工程と、
を含む。

【0022】

特定の理論に縛られることを望むものではないが、磁化可能な球状ポリビニルアルコール粒子の形成時には、分散工程（工程（１））において、ナノ粒子状の磁化可能材料（例えば、磁鉄鉱）の各粒子上に薄いＰＶＡ層が形成され、粒子凝集体の形成が防止されると推測される。工程（２）によって得られたエマルション内では、ＰＶＡ及びＰＶＡで被覆された磁化可能ナノ粒子を含む水相が、有機相及び乳化剤と共に、球状ミセルを含むエマルションを形成している。架橋（工程（３））により、ナノ粒子は粒子表面上の多数のＰＶＡ鎖の共有結合を介して安定化する。

【0023】

特に、高い乳化温度（工程（２）、２５℃以上）により、小さ過ぎる粒径（特に、＜０．５μｍ）を有する粒子の形成が抑制され、最大粒径が増加し、得られる粒子は、表面容量（ｓｕｒｆａｃｅ ｃａｐａｃｉｔｙ）及び沈降挙動に対する磁化率（ｍａｇｎｅｔｉｓａｂｉｌｉｔｙ）（及び分離性）の最適な比率を示す。また、本発明に係る方法を使用することにより、ナノ粒子状の磁化可能材料をポリビニルアルコール層内により効率的に封入することができる。これにより、阻害作用を減少させるか、阻害作用の発生を防止することができる。

【発明を実施するための形態】

【0024】

本発明に係る製造方法によって得られる粒子は、光学顕微鏡で観察した場合に実質的に球状（ボール状又はビーズ状）である。

【0025】

「磁化可能」という用語は、外部磁界に暴露された場合に粒子が磁気的に引き付けられ、例えば液体媒体から分離されるように、粒子を磁化することができることを意味する。磁場を消失させると、粒子は磁化されていない状態に戻り、好ましくは約０又は０の残留磁気を有する。

【0026】

「ポリビニルアルコール微粒子」という用語は、本発明に係る磁化可能な微粒子がポリビニルアルコールを含むことを意味する。ポリビニルアルコールは、場合によっては他の物質との組み合わせにより、ナノ粒子状の磁化可能材料が埋め込まれるか、封入されるマトリックスを形成する。好適な実施形態によれば、磁化可能な微粒子のポリマーマトリックスはポリビニルアルコールのみからなる。

【0027】

本発明に係る方法によって得られる磁化可能なポリビニルアルコール微粒子は、０．５〜３μｍ、好ましくは０．５〜１μｍの範囲の狭い粒径分布を有する。別の好適な実施形態によれば、ポリビニルアルコール微粒子は、１．２５〜２．２５μｍの範囲の粒径分布を有する。

【0028】

「狭い粒径分布」という用語は、特に、粒子の少なくとも７５％、好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％が、０．５〜３μｍ又は０．５〜１μｍの範囲の粒径を有することを意味する。

【0029】

粒径分布は、好ましくは単峰性（すなわち、０．５〜３μｍ又は０．５〜１μｍの範囲内に単一の極大のみが存在する）である。

【0030】

特に、ポリビニルアルコール水溶液に分散させるナノ粒子状の磁化可能材料としては、強磁性又は超常磁性コロイド粒子を使用することができ、ナノ結晶磁鉄鉱が特に好ましい。

【0031】

ナノ粒子状の磁化可能材料は、好ましくは５〜２５０ｎｍ、より好ましくは５〜１００ｎｍ、特に好ましくは５〜５０ｎｍの範囲の粒径を有する。

【0032】

本発明の好適な実施形態によれば、ナノ粒子状の磁化可能材料、好ましくは磁鉄鉱ナノ粒子は、以下の特徴を有する方法によって製造又は前処理する：
５００μＳ／ｃｍ未満、好ましくは１００μＳ／ｃｍ未満、より好ましくは５μＳ／ｃｍ未満のコンダクタンスを有する脱イオン水に磁化可能なナノ粒子を懸濁させる；
ナノ粒子水懸濁液を超音波ホモジナイザで処理する。

【0033】

磁化可能なナノ粒子は、公知の方法（例えば、Ｓｉｐｏｓ Ｐ．：「Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｏｆ Ｓｉｚｅ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｍａｇｎｅｔｉｔｅ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙ Ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｆｌｕｉｄｓ」；Ｒｏｍａｎｉａｎ ｒｅｐｏｒｔｓ ｉｎ ｐｈｙｓｉｃｓ ２００６；５８（３）：２２９−２３３：ＹＥ ＸＲ ｅｔ ａｌ．：「Ｒｏｏｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｏｌｖｅｎｔ−ｆｒｅｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｍｏｎｏｄｉｓｐｅｒｓｅ ｍａｇｎｅｔｉｔｅ ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌｓ」，Ｊ．Ｎａｎｏｓｃｉ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６，Ｖｏｌ．６，Ｎｏ．３，ｐｐ．８５２−８５６）によって製造することができる。

【0034】

ナノ粒子の製造及びそのさらなる処理は、表面活性物質を添加することなく行うことが好ましい。

【0035】

ナノ粒子懸濁液に対して上記超音波処理を行うことにより、存在する可能性のある粒子凝集体を広範囲にわたって破壊することができる。超音波処理は、フロー法（ｆｌｏｗ ｍｅｔｈｏｄ）を使用して行うことが好ましい。

【0036】

超音波出力は、少なくとも１０００Ｗとすることが好ましい。超音波への暴露時間は、好ましくは少なくとも１０分間、より好ましくは少なくとも０．５時間、最も好ましくは少なくとも１時間である。

【0037】

上述した超音波処理を行うために適当な超音波ホモジナイザは公知であり、市販されている（例えば、Ｄｒ．Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ Ｓｏｎｏｐｕｌｓ ２０００ Ｗ、Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ ＧｍｂＨ，Ｄ−１４５１３テルトー）。

【0038】

また、ナノ粒子懸濁液をさらに処理する前に遠心分離工程を行い、２５０ｎｍを超える粒径を有する粒子、好ましくは１００ｎｍを超える粒径を有する粒子を除去することが有利である。遠心分離は、１０００〜３０００×ｇで行うことが好ましい。

【0039】

上述した方法で前処理した磁化可能なナノ粒子は、上述した有利な特性（特に、上述した範囲の狭い粒径分布）を有する本発明の磁化可能なポリビニルアルコール微粒子の製造に特に適している。

【0040】

２５０ｎｍ以下、好ましくは１００ｎｍ以下の粒径を有するナノ粒子状の磁化可能材料、特に磁鉄鉱を使用することにより、磁化可能材料、特に磁鉄鉱を比較的高い割合（比率）で含む磁化可能な球状ポリビニルアルコール微粒子を製造することができる。

【0041】

上記割合（比率）は、少なくとも５０重量％であることが好ましい。特に好適な実施形態によれば、本発明の粒子は、５０〜６０重量％（平均値：約５５重量％）の磁鉄鉱含有量を有する。

【0042】

水相の調製に使用されるポリビニルアルコールは、５０，０００〜３００，０００の平均モル質量及び７０〜９９．９モル％（好ましくは８０〜９５モル％）の加水分解度を有するポリビニルアルコールであることが好ましい。例えば、「Ｍｏｗｉｏｌ」（Ｋｕｒａｒａｙ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ、フランクフルト・アム・マイン）として入手できるポリビニルアルコールが適当である。

【0043】

水相中のポリビニルアルコールの濃度は、好ましくは２重量％以下、より好ましくは０．１〜２重量％、最も好ましくは０．５〜１．５重量％である。

【0044】

水相中のポリビニルアルコールの濃度を２．０重量％以下、特に１．５重量％以下に制限することは、大き過ぎる粒径（特に、３μｍを超える粒径）を有し、沈降特性が粒子の使用（特に自動核酸精製）に悪影響を及ぼす粒子の形成の防止に大きく貢献する。また、ポリビニルアルコールの濃度を２．０重量％、好ましくは１．５重量％に制限することにより、磁化可能材料（例えば、磁鉄鉱）を高い割合（比率）（好ましくは５０重量％以上、より好ましくは５０〜６０重量％）で含む磁化可能なポリマー粒子を得ることができる。

【0045】

磁化可能材料、好ましくは磁鉄鉱は、０．５〜７．５重量％、より好ましくは１〜５重量％の割合（比率）で水相に添加することが好ましい。

【0046】

本発明に係る方法の第１の工程における分散処理は、通常は、分散装置（例えば、ＵＬＴＲＡ−ＴＵＲＲＡＸＲ（登録商標））又はプロペラミキサーを使用して、公知の方法によって行うことができる。必要に応じて、ポリビニルアルコールができるだけ完全に溶解されるように、加熱しながら分散処理を行うことができる。

【0047】

本発明に係る方法の好適な実施形態では、ポリビニルアルコールと磁化可能材料を含む水相は、有機相に添加する前に超音波ホモジナイザによって均質化する。これにより、必要に応じて、磁化可能材料の粒径（流体力学的径）を２５０ｎｍ未満、好ましくは１００ｎｍ未満に減少させることができる。また、上記均質化工程は、存在する粒子凝集体（ｐａｒｔｉｃｌｅ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ ｏｒ ａｇｇｌｏｍｅｒａｔｅｓ）のサイズを減少させることができるという利点も有する。適当な超音波ホモジナイザは公知であり、市販されている（例えば、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ 社（ゲッティンゲン）製「Ｌａｂｓｏｎｉｃ Ｐ」、「Ｄｒ．Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ Ｓｏｎｏｐｕｌｓ ２０００ Ｗ」）。

【0048】

本発明に係る製造方法の特徴によれば、ポリマーを含む水相に乳化剤を添加する必要はない。

【0049】

本発明に係る方法の第２の工程又はさらなる工程では、前記水相と混和せず、少なくとも１種の乳化剤を含む有機相に前記水相を添加する。そして、混合物を２５℃以上の温度で撹拌することによってエマルションを得る。温度は、好ましくは３０℃又は４０℃以上、より好ましくは少なくとも５０℃、特に５５〜６５℃、特に好ましくは６０℃である。予期せぬことに、粒子を高い温度で製造することにより、非常に小さな粒子（粒径：０．５μｍ未満）の形成を抑制又は防止することができ、上記温度（３０℃以上、４０℃以上、５０℃以上又は６０℃以上）とすることによって特に有利な作用が得られることが判明した。

【0050】

乳化処理は、使用する分散又は撹拌装置の種類、エマルションの量等に応じて通常は１０秒間〜１５分間行う。

【0051】

エマルションは、公知の方法により、通常の分散又は撹拌装置を使用して、例えば５００〜５０００ｒｐｍの撹拌速度で撹拌を行うことによって得ることができる。

【0052】

本発明によれば、回転子−固定子原理に従って動作する分散混合機を使用してエマルションを得ることが特に有利であることが判明した。回転子の速度は、通常は５００〜４０００ｒｐｍの範囲である。通常は、分散混合機の混合ヘッドを、密閉容器に収容された乳化対象の液体に浸漬する。容器の容量は１００Ｌ以下、例えば１０〜１００Ｌ又は数百Ｌ、例えば１００〜５００Ｌとすることができる。

【0053】

分散又は乳化処理は、上述した分散混合機を使用し、実質的に空気を導入することなく行う。分散混合機は、（回転子を取り囲む）固定子に複数の垂直溝が設けられた混合ヘッドを備えていることが好ましい。回転時には、液体の垂直で下向きの流れ及び液体の水平な流れが生じ、液体の水平な流れにより、乳化対象の液体が混合ヘッドの溝を通過し、処理中に生じる高い剪断力及び混合ヘッド内に形成される乱流のために、非常に効率的で十分な撹拌及び均質化を達成することができる。これにより、特に、懸濁液内における架橋剤の迅速な分散を促進することができる。

【0054】

上述した種類の分散混合機は公知であり、例えば、ｙｓｔｒａｌ ＧｍｂＨ（Ｄ−７９２８２ Ｂａｌｌｒｅｃｈｔｅｎ−Ｄｏｔｔｉｎｇｅｎ）から入手できる分散混合機（「ｙｓｔｒａｌ Ｄｉｓｐｅｒｍｉｘ」）を使用することができる。

【0055】

分散混合機を上述したように使用する場合には、特に効率的な解砕と懸濁を行うことができる。また、分散混合機は高い循環性能を有しているため、局所的な過熱を防止し、架橋剤を迅速な分散させることができる。これにより、望ましくないミセルの「合体（ｃｏａｌｅｓｃｅｎｃｅ）」が抑制又は防止される（すなわち、「複数のビーズ」又は２以上のミセルの組み合わせの形成が防止される）。

【0056】

上述した種類の分散混合機の使用は、処理するエマルションの量が多い場合（１０Ｌ以上）に特に有利であり、バッチ間一貫性は可能な限り一定に維持される。

【0057】

上述した分散方法は、大量のバッチを処理する場合においてのみ特に有利というわけではなく、磁化可能なポリビニルアルコール微粒子の収量を高める点においても有利である。例えば、バッチ量（エマルションの量）が１００Ｌである場合、磁化可能な球状ポリビニルアルコール粒子の収量は少なくとも２００ｇである。

【0058】

特に、植物油（例えば、菜種油又はひまわり油）、鉱油、合成油、シリコーン油、パラフィン油及びこれらの混合物を水非混和性有機相として好適に使用することができる。

【0059】

通常、水非混和性有機相は、水相に対して過剰量で使用する。水非混和性有機相の体積分率は、好ましくは水相の体積の３〜５０倍、特に３〜２５倍、より好ましくは３〜１５倍である。

【0060】

エマルションの調製に使用される乳化剤は、好ましくは、プロピレンオキシド−エチレンオキシドブロック共重合体（ポロキサマー、例えば、Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ（登録商標）、Ｔｅｔｒｏｎｉｃ（登録商標）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標））、ポリソルベート（ソルビタン脂肪酸エステルとポリエチレングリコールをエーテル化することによって形成される化合物；例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）、好ましくはＴｗｅｅｎ（登録商標） ８０）、ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、ソルビタンラウレート、ソルビタンステアレート、ソルビタンオレエート、ソルビタンセスキオレエート；例えば、Ａｒｌａｃｅｌ（登録商標）、Ｓｐａｎ（登録商標）、Ｄｅｈｙｍｕｌｓ（登録商標））、ポリエトキシ化脂肪酸（エチレンオキシド付加脂肪酸エステル）、脂肪酸エタノールアミド、アルキルアミンエトキシレート（例えば、ラウリル、オレイル又はステアリルアミン−ＰＥＧエーテル、トリエタノールアミン−ＰＥＧエーテル）炭素原子数８〜１８の脂肪アルコールへのエチレンオキシド及び／又はプロピレンオキシド付加物（例えば、Ｂｒｉｊ（登録商標）、Ｅｕｍｕｌｇｉｎ（登録商標）、Ｐｏｌｉｄｏｃａｎｏｌ）、ポリオキシエチル化硬化ヒマシ油（例えば、ＤＥＨＹＭＵＬＳ（登録商標） ＨＲＥ７）、ヒマシ油誘導体のブロック共重合体、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−エチレンジアミンブロック共重合体、ポリヒドロキシ脂肪酸とポリエチレンオキシドのポリオキシエチレンブロック共重合体（例えば、Ｈｙｐｅｒｍｅｒ（登録商標） Ａ７０）アルキルフェノールエトキシレート（特に、２〜１００個のエチレンオキシド単位を有するオクチルフェノール又はノニルフェノール；例えば、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ−１００）、アルキルフェノールプロポキシレート、ペンタエリスリトール脂肪酸エステル（例えば、ペンタエリスリチルモノラウレート）、ペンタエリスリトール脂肪酸エステルとクエン酸−脂肪族アルコールエステルの混合エステル（例えば、Ｄｅｈｙｍｕｌｓ（登録商標） ＦＣＥ）、ポリエチレングリコール、アルキルベンゼンスルホン酸、アルキルベンゼンスルホネート、ポリグリセリン、糖アルコール又はアルキルグリコシドと炭素原子数８〜２２の飽和及び／又は不飽和直鎖又は分岐脂肪酸の部分エステル、ポリヒドロキシ脂肪酸−ポリエチレングリコールブロック共重合体、ホスファチジルコリン又はホスファチジルエタノールアミン等のホスホグリセリドから選択される。２種以上の乳化剤の混合物又は組み合わせを使用することもできる。

【0061】

好ましい乳化剤の混合物は、（１）Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ８０（ポリオキシエチレン（２０）−ソルビタンモノオレエート）及び／又は（２）Ａｒｌａｃｅｌ（登録商標） ８３（ソルビタンセスキオレエート）、（３）ＤＥＨＹＭＵＬＳ（登録商標） ＨＲＥ、７（エチレンオキシド付加（ＰＥＧ−７）、硬化ヒマシ油、（４）Ｈｙｐｅｒｍｅｒ（登録商標） Ａ７０（ポリヒドロキシ脂肪酸とポリエチレンオキシドのポリオキシエチレンブロック共重合体）を主要な成分として含む。

【0062】

好ましい乳化剤の混合物は、少なくとも１種の親油性乳化剤と少なくとも１種の親水性又は両親媒性乳化剤を含む混合物である。親油性乳化剤は、通常は３〜８のＨＬＢ値を有する非イオン性界面活性剤であり、Ｗ／Ｏ乳化剤とも呼ばれる。親水性又は両親媒性乳化剤は、通常は８〜１８のＨＬＢ値を有し、Ｏ／Ｗ乳化剤とも呼ばれる。

【0063】

親油性乳化剤の例としては、ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、Ｓｐａｎ（登録商標） ４０）、レシチン、ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標） Ｌ３１、Ｌ６１、Ｌ８１）、ＰＥＧオレイルエーテル（ｚ．Ｂ．Ｂｒｉｊ（登録商標） ９３）が挙げられる。

【0064】

親水性又は両親媒性乳化剤の例としては、ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロック共重合体（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標） Ｌ−６４、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標） １０Ｒ５）、ＰＥＧヘキサデシルエーテル（例えば、Ｂｒｉｊ（登録商標） Ｃ１０）、ＰＥＧオクタデシルエーテル（ｚ．Ｂ．Ｂｒｉｊ（登録商標） Ｓ１０）、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレントリデシルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ６０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ２０）、ポリオキシエチレンステアリルエーテル（例えば、Ｂｒｉｊ（登録商標） Ｓ１００）、ポリエトキシ化硬化ヒマシ油が挙げられる。

【0065】

乳化剤又は２種以上の乳化剤の混合物は、水非混和性相（油相）を乳化のために水相に添加する前に、水非混和性相（油相）に添加（又は溶解）する。

【0066】

乳化剤又は乳化剤の混合物は、有機相に対して、０．１〜１０重量％、より好ましくは１〜７．５重量％の割合（比率）で使用することが好ましい。

【0067】

乳化工程又は乳化工程の後の工程において、ポリビニルアルコールの架橋に適した少なくとも１種の水可溶性架橋剤を添加し、球状ポリビニルアルコール粒子は共有結合性架橋によって安定化する。

【0068】

架橋剤は乳化処理時に添加することが好ましい。この場合、２つの相は、当初は架橋剤の非存在下で撹拌によって分散又は乳化され、その後、架橋剤を添加し、架橋反応が終了するまで撹拌処理を継続する（通常は、架橋剤の添加後約１０秒間〜５分間）。架橋工程は、乳化工程に関して上述したような高い温度で行うことが好ましい。乳化工程において使用する高い温度（２５℃）を架橋反応時にも維持することができる。

【0069】

二官能アルデヒド、特にグルタルアルデヒド及び酸塩化物又はジビニルスルホンを使用することが好ましく、グルタルアルデヒドが特に好ましい。一方、ジアミン（例えば、ヘキサメチレンジアミン）の架橋剤としての使用は、遊離アミノ基が生体分子と望ましくない副反応を生じるために好ましくない。

【0070】

架橋剤は、通常は液体、すなわち、溶液（例えば、水溶液）としてエマルションに添加し、溶液は、架橋剤を１〜４０重量％（好ましくは５〜２５重量％）の総濃度で含むことが好ましい。好適な実施形態によれば、１２．５％グルタルアルデヒド水溶液を使用する。

【0071】

エマルションに添加する架橋剤は、水相に対して、０．１〜１０体積％、より好ましくは１〜７．５体積％の割合（比率）で使用することが好ましい。

【0072】

また、架橋工程は、好ましくは酸を添加した状態で、二官能アルデヒド、特にグルタルアルデヒドを使用して行う。この場合、架橋反応が大きく促進される。本発明によれば、予期せぬことに、ポリマー水相に対して、１０体積％以下、好ましくは５体積％以下、より好ましくは３．２体積％以下の酸を添加することによってグルタルアルデヒドによって生じる架橋を促進することができ、ナノ粒子状の磁化可能材料の凝集体の形成を防止することができることが判明した。体積百分率は１Ｎ〜３Ｎ ＨＣｌに関するものである。

【0073】

酸の添加は、乳化工程前に行う（すなわち、酸を水相に添加する）ことが好ましい。あるいは、乳化時又は乳化完了後に酸を添加することもできる。

【0074】

ＨＣｌに加えて、ａ）１〜３Ｎ硝酸（ポリマー相に添加、最大１０体積％）、ｂ）１〜３Ｎ硫酸（ポリマー相に添加、最大５体積％）、ｃ）ＨＢｒ、ｄ）酢酸、ｅ）リン酸も添加する酸として適当である。

【0075】

また、特に高い温度（６０℃）において酸濃度が高い（１０体積％以上）場合には、ナノ粒子状の磁化可能材料、特に磁鉄鉱の分解が生じ、鉄イオンが放出されてしまうことが判明した。そのため、架橋工程時に添加する酸の量を減少させることにより、磁化可能材料、好ましくは磁鉄鉱を高い割合（比率）（少なくとも５０重量％又は９０重量％以下）で含む磁化可能なポリビニルアルコール粒子を得ることができる。

【0076】

通常、架橋反応は、架橋剤の添加後約１０秒間〜５分間で完了する。その後、磁化可能な球状ポリビニルアルコール微粒子を公知の方法（例えば、遠心分離又は磁気分離）によって液体反応混合物から分離することができる。粒子に付着した不純物（例えば、油、乳化剤）を分離するために、適当な溶媒又は溶媒混合物（例えば、水、エタノール、メタノール、２−プロパノール、ｎ−ヘキサン、アセトン、メチルエチルケトン）を使用して、微粒子の再懸濁及び遠心分離又は磁気分離によって微粒子を洗浄することができる。

【0077】

好適な実施形態において、本発明に係る方法は少なくとも以下の工程を含む。
ナノ粒子状の磁化可能材料、好ましくは磁鉄鉱を、ポリビニルアルコールを溶解状態で含む水相に、水相中のポリビニルアルコールの濃度が２．０重量％以下、好ましくは０．１〜２．０重量％、より好ましくは０．５〜１．５重量％、水相中の磁化可能材料又は磁鉄鉱の濃度が好ましくは０．５〜７．５重量％、より好ましくは１〜５重量％となるように分散させる工程と、
前記水相と混和せず、少なくとも１種の乳化剤を含む有機相に前記水相を添加し、少なくとも５０℃、好ましくは５５〜６５℃、より好ましくは６０℃の温度で撹拌することによってエマルションを得る工程と、
撹拌を継続しながら、ポリビニルアルコールを架橋させるために適した少なくとも１種の水溶性架橋剤を添加する工程。

【0078】

別の好適な実施形態において、本発明に係る方法は少なくとも以下の工程を含む。
２５０ｎｍ以下、好ましくは１００ｎｍ以下の粒径を有するナノ粒子状の磁化可能材料、好ましくは磁鉄鉱を、ポリビニルアルコールを溶解状態で含む水相に、水相中のポリビニルアルコールの濃度が２．０重量％以下、好ましくは０．１〜２．０重量％、より好ましくは０．５〜１．５重量％、水相中の磁化可能材料又は磁鉄鉱の濃度が好ましくは０．５〜７．５重量％、より好ましくは１〜５重量％となるように分散させる工程と、
前記水相と混和せず、少なくとも１種の乳化剤を含む有機相に前記水相を添加し、少なくとも２５℃、好ましくは５０〜６５℃、より好ましくは６０℃の温度で撹拌することによってエマルションを得る工程と、
架橋剤としての少なくとも１種の二官能アルデヒドを添加する共に、塩酸（１Ｎ〜３Ｎ）を水相に対して５体積％以下の量で添加する工程。

【0079】

さらに別の好適な実施形態において、本発明に係る方法は少なくとも以下の工程を含む。
ナノ粒子状の磁化可能材料、好ましくは磁鉄鉱を、ポリビニルアルコールを溶解状態で含む水相に、水相中のポリビニルアルコールの濃度が２．０重量％以下、好ましくは０．１〜２．０重量％、より好ましくは０．５〜１．５重量％、水相中の磁化可能材料又は磁鉄鉱の濃度が好ましくは０．５〜７．５重量％、より好ましくは１〜５重量％となるように分散させる工程と、
前記水相と混和せず、少なくとも１種の乳化剤を含む有機相に前記水相を添加し、回転子−固定子原理に従って動作する分散混合機を使用し、５００〜４０００ｒｐｍの範囲の回転子速度で、２５℃以上、好ましくは５０〜６５℃、より好ましくは６０℃の温度で撹拌することによって、１０Ｌ以上のエマルションを得る工程と、
撹拌を継続しながら、ポリビニルアルコールを架橋させるために適した少なくとも１種の水溶性架橋剤を添加する工程。

【0080】

特に好適な実施形態において、本発明に係る方法は少なくとも以下の工程を含む。
ナノ粒子状の磁化可能材料、好ましくは磁鉄鉱を、ポリビニルアルコールを溶解状態で含む水相に、水相中のポリビニルアルコールの濃度が２．０重量％以下、好ましくは０．１〜２．０重量％、より好ましくは０．５〜１．５重量％、水相中の磁化可能材料又は磁鉄鉱の濃度が好ましくは０．５〜７．５重量％、より好ましくは１〜５重量％となるように分散させる工程と、
前記水相と混和せず、少なくとも１種の乳化剤を含む有機相に前記水相を添加し、回転子−固定子原理に従って動作する分散混合機を使用し、５００〜４０００ｒｐｍの範囲の回転子速度で、少なくとも５０℃、好ましくは５５〜６５℃、より好ましくは６０℃の温度で撹拌することによって、１０Ｌ以上のエマルションを得る工程と、
架橋剤としての少なくとも１種の二官能アルデヒド、好ましくはグルタルアルデヒドを添加する共に、塩酸（１Ｎ〜３Ｎ）を水相に対して１０体積％以下、好ましくは５体積％以下、より好ましくは３．２体積％以下の量で添加する工程。

【0081】

上記実施形態のそれぞれは、上述した特徴の１以上と組み合わせることができる。

【0082】

特に好適な実施形態によれば、本発明に係る製造方法の第１の工程で使用するナノ粒子状の磁化可能材料、好ましくは磁鉄鉱に対して、以下の工程を含む処理方法を行う。
１００μＳ／ｃｍ未満、好ましくは５μＳ／ｃｍ未満のコンダクタンスを有する脱イオン水に磁化可能なナノ粒子を懸濁させる工程と、
ナノ粒子水懸濁液を、好ましくは少なくとも１０００Ｗの超音波出力及び少なくとも１０分間、好ましくは少なくとも０．５時間の超音波処理時間で超音波ホモジナイザによって処理する工程。ここで、超音波処理は連続法（フロー法）を使用して行うことが好ましい。

【0083】

本発明に係る方法によれば、０．５〜３μｍの範囲の狭い粒径分布を有する磁化可能な球状ポリビニルアルコール微粒子を、例えば、１バッチあたり少なくとも２００ｇの量で得ることができる。バッチのサイズ、すなわち、製造に使用されるエマルションの量は、５Ｌ以上、好ましくは１０Ｌ以上、例えば５０〜１５０Ｌ又は数百Ｌ（例えば、２００〜５００Ｌ）とすることができる。

【0084】

必要に応じて、（上述した本発明に必須の限界値を考慮に入れて）以下のパラメータの１以上を変更することによって粒径を調節することができる。
ポリマー濃度（ポリマー濃度が低いと粒径が減少する）；
乳化時の撹拌速度（撹拌速度が高いと粒径が減少する）；
乳化剤の選択及び乳化剤濃度。

【0085】

本発明に係る方法によって製造されたポリビニルアルコール微粒子は、さらなる変性を行うことなく、例えば、ポリビニルアルコールの遊離ＯＨ基への結合によって生体分子を結合させるために使用することができ、生体分子、細胞等の結合を可能とするために公知の様々な反応によって活性化又は変性することもできる。変性反応を使用することにより、例えば、官能基又はスペーサー分子等を粒子マトリックス又は粒子表面に結合させることができる。

【0086】

そのような公知の活性化又は変性反応の好ましい例は、特許文献１及び特許文献１に引用されている刊行物に記載されている。特に、臭化シアン（リガンド、例えば抗体の第一アミノ基への結合用）、エピクロルヒドリン、１、１’−カルボニルジイミダゾール又はヘキサメチレンジイソシアナート等の活性化試薬による活性化が挙げられる。

【0087】

Ｃｅｒ（ＩＶ）塩の触媒作用下におけるビニルモノマー（特にアクリルモノマー）のグラフト重合によってスペーサー分子を導入することができる（特許文献１及び特許文献１に引用されている刊行物を参照）。

【0088】

磁化可能なポリビニルアルコール微粒子に結合したスペーサーは、例えば生体分子の結合に使用することができる。

【0089】

また、本発明は、上述した本発明に係る製造方法のいずれかによって得られる、０．５〜３μｍの範囲の粒径分布を有する磁化可能な球状ポリビニルアルコール微粒子に関する。微粒子は、０．８〜３μｍ、より好ましくは０．５〜１μｍの範囲の粒径分布を有することが好ましい。別の好適な実施形態によれば、微粒子は、１．２５〜２．２５μｍの範囲の粒径分布を有する。

【0090】

「・・・の範囲の粒径分布」とは、粒子の少なくとも７５％、好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％が、当該範囲の粒径を有することを意味する。

【0091】

本発明に係る微粒子の粒径分布は、単峰性（すなわち、実質的に単一の極大のみを有する）であってもよい。

【0092】

粒径は公知の方法で測定することができ、例えば、ＤＬＳ／ＰＣＳ（動的光散乱法／光子相関分光法）によって測定することができる。粒径に測定に適した測定装置は市販されている（例えば、「ＤｅｌｓａＮａｎｏ Ｃ」、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社（Ｄ−４７８０７クレーフェルト）製）。

【0093】

ＰＣＳ法は、サンプルの平均粒径及び関連する多分散指数（ＰＤＩ）（粒径分布の幅の尺度）を測定する。本発明に係る方法で製造された狭い粒径分布を有する磁化可能な微粒子の場合には、多分散指数（ＰＤＩ）は好ましくは０．２５以下、より好ましくは０．１〜０．２５である。

【0094】

好適な実施形態によれば、本発明に係る磁化可能な微粒子は、ナノ粒子状材料、特に磁鉄鉱の含有量が、少なくとも５０重量％、好ましくは少なくとも６０重量％、より好ましくは少なくとも７５重量％、特に９０重量％以下であることを特徴とする。これは、特に、水相中のポリビニルアルコール濃度を最大１．５重量％に制限することによって達成することができる。磁鉄鉱の含有量が高く、粒径分布が狭いため、磁化可能な微粒子は、磁場において向上した分離特性を示す。

【0095】

磁化可能無機材料の含有量は、公知の方法、例えば燃焼分析によって測定することができる。

【0096】

本発明によれば、磁化可能な微粒子が高い磁鉄鉱含有量を有する場合には、小さな粒径（例えば、０．５〜１μｍ）であっても、良好な磁気分離特性を得ることができる。従って、本発明に係る特に好ましい粒子は、０．５〜１μｍの範囲の粒径分布及び５０〜９０重量％、好ましくは５０〜７５重量％、より好ましくは５０〜６０重量％の磁鉄鉱含有量を有する粒子である。

【0097】

本発明に係る方法によって製造されるか、本発明に係る方法によって得られる磁化可能な微粒子は、磁鉄鉱含有量が高い（少なくとも５０重量％、好ましくは５０〜６０重量％、より好ましくは少なくとも６０重量％）にもかかわらず、上述した検出方法、特にＰＣＲに使用した場合に、非特異的結合（特にタンパク質の非特異的結合）は顕著に減少する。このような非特異的結合の減少は、本発明に係る製造方法によって磁化可能材料（例えば、磁鉄鉱）の特に効率的な封入を達成することができるためである。その結果、非特異的結合の原因となる遊離磁鉄鉱（又はナノ粒子状の磁化可能材料）の割合（比率）は非常に小さくなる。

【0098】

磁鉄鉱のより効率的な封入及び遊離磁鉄鉱の割合（比率）の減少は、従来の粒子（例えば、特許文献１）と比較した場合の粒子のゼータ電位における測定可能な変化によって証明される（実施例３及び表１を参照）。本発明に係る方法によって製造されるか、本発明に係る方法によって得られる粒子は、ゼータ電位の絶対値に対して、少なくとも１５％、好ましくは２５％、特に３０％増加したゼータ電位を示すことが好ましい。観察されるゼータ電位における変化は、粒子表面に存在する遊離磁鉄鉱の減少（粒径及び粒子表面積は同じ）によるものであり、ゼータ電位は磁鉄鉱の封入効率の尺度と見なすことができると考えられる。磁性微粒子のゼータ電位は、好ましくは−３５ｍＶ以下、より好ましくは−４０ｍＶ以下である。

【0099】

従って、本発明は、ナノ粒子状の磁化可能材料を含み、−３５ｍＶ以下、より好ましくは−４０ｍＶ以下のゼータ電位を有する、磁化可能な球状ポリビニルアルコール微粒子を含む。

【0100】

粒径分布は、好ましくは０．５〜３μｍ、より好ましくは０．５〜１μｍ又は１．２５〜２．２５μｍの範囲である。

【0101】

ナノ粒子状の磁化可能材料、特に磁鉄鉱の含有量は、好ましくは少なくとも５０重量％、より好ましくは少なくとも６０重量％、最も好ましくは少なくとも７５重量％であり、ナノ粒子状の磁化可能材料、特に磁鉄鉱の含有量は９０重量％以下であることができる。

【0102】

本発明に係る方法によって製造されるか、本発明に係る方法によって得られる粒子は、ＰＣＲ用途に使用した場合に、公知の微粒子と比較して、ＰＣＲ反応に対して顕著に低い阻害作用を示すか、阻害作用を全く示さないことを特徴とする（実施例４、表３及び表４を参照）。ＰＣＲ反応バッチに阻害成分が存在すると、増幅反応の遅延及びＣｔ値の上昇が生じる。リアルタイム定量ＰＣＲでは、Ｃｔ値は、蛍光シグナルが閾値を超え、ＰＣＲの指数期が開始するまでに必要なサイクル数を示す。Ｃｔ値はサンプルに含まれる核酸の量と反比例するため、阻害成分（抑制作用を有する微粒子等）の存在によって不正確な結果が得られる。

【0103】

予期せぬことに、本発明に係る方法によって製造されるか、本発明に係る方法によって得られる磁化可能な微粒子をＰＣＲ用途に使用すると、Ｃｔ値は変化しないか、２％以下、好ましくは１％以下、より好ましくは０．５％以下しか増加しないことが判明した。

【0104】

そのため、本発明は、ナノ粒子状の磁化可能材料を含む磁化可能な球状ポリビニルアルコール微粒子であって、ＰＣＲ法に使用した場合に、Ｃｔ値の変化を生じさせないか、好ましくは２％以下、より好ましくは１％以下、特に０．５％以下の僅かなＣｔ値の変化しか生じさせない微粒子を含む。

【0105】

粒径分布は、好ましくは０．５〜３μｍ、より好ましくは０．５〜１μｍ又は１．２５〜２．２５μｍの範囲である。ナノ粒子状の磁化可能材料、特に磁鉄鉱の含有量は、好ましくは少なくとも５０重量％、より好ましくは少なくとも６０重量％、最も好ましくは少なくとも７５重量％であり、ナノ粒子状の磁化可能材料、特に磁鉄鉱の含有量は９０重量％以下であることができる。

【0106】

本発明に係る磁化可能な微粒子は、共有結合又は非共有結合を介した生体分子又はリガンドの結合を可能とする官能基を有する。適当な官能基としては、ポリビニルアルコールマトリックスの水酸基及び上述したようにその後の変性反応によって導入された基が挙げられる。好適な実施形態によれば、官能基はスペーサー分子を介してポリビニルアルコールに結合している。

【0107】

共有結合又は非共有結合を介して磁化可能な微粒子に結合することができる適当な生体分子又はリガンドとしては、特に、抗体、アビジン、ビオチン、プロテインＡ、プロテインＧ、レクチン、オリゴ糖、オリゴヌクレオチド、酵素、酵素抑制剤、酵素基質、受容タンパク質、アルブミン、ゼラチン、グルタチオン、アミノ酸、ペプチド、ホルモン及び／又は神経伝達物質が挙げられる。また、アフィニティークロマトグラフィー又は診断目的に使用されるその他の生体分子又はリガンドも基本的に適当である。

【0108】

ナノ粒子状の磁化可能材料、好ましくは磁鉄鉱の含有量が高く（少なくとも５０重量％）、０．５〜３μｍの範囲の狭い粒径分布を有するため、磁化可能な球状ポリビニルアルコール微粒子は、自動分離法、特に自動核酸精製における使用に特に適している。粒径分布が狭いため、特に自動核酸精製において磁化可能な微粒子を完全に分離することができる。

【0109】

また、５０重量％以上であって、９０重量％以下の磁化可能材料を含むことができる、本発明に係る磁化可能な球状ポリビニルアルコール微粒子によれば、粒径が小さいにもかかわらず、非常に良好な磁気分離特性（すなわち、高収量での迅速、完全かつ再現可能な分離）を達成することができる。そのため、本発明に係る微粒子は、より多量のサンプル（例えば、１０ｍＬの全血からのゲノムＤＮＡの単離）の処理に特に適している。

【0110】

また、本発明に係るポリビニルアルコール微粒子は、粒径が小さく、総活性表面積が大きく、小さな粒子によって各サンプルを精製することができるため、非常に少量のサンプル（例えば、１０μＬ）の処理にも適している。

【0111】

本発明に係るポリビニルアルコール微粒子は、例えば、細胞、核酸、ペプチド、タンパク質、毒素、ウイルス、細菌、抗体、酵素、抗原又は受容体を分離、精製又は濃縮するために使用することができる。好ましい応用分野としては、診断又は法医学的検出法、免疫検定法、ＤＮＡ配列決定、ＰＣＲ産物精製、細胞分画、タンパク質単離、アフィニティ精製、免疫沈降反応、組織適合検査、オリゴヌクレオチド合成又はペプチド合成が挙げられる。

【0112】

本発明によれば、特に自動分離法に適した、向上した分離特性を有する磁化可能な微粒子が提供される。また、本発明に係る製造方法により、高いバッチ間一貫性を保ちながら、粒子を大きな規模で製造することができる。

【実施例】

【0113】

実施例１：磁鉄鉱コロイド懸濁液の調製
磁鉄鉱コロイド：公知の方法を使用して、上述したようにナノ結晶磁鉄鉱を調製した。次に、遠心分離（３０００×ｇ、１回５分間）を繰り返し、懸濁液のコンダクタンス値が５００μＳ／ｃｍとなるまで脱塩水に再懸濁させることにより、懸濁液を塩を含まなくなるまで洗浄した。本発明に従って調製した磁鉄鉱は、僅かに負であって、ゼロに近いゼータ電位（約−４．５〜−０．５ｍＶの範囲）を有していた。

【0114】

このようにして得られた磁鉄鉱１８０ｇを脱塩水に懸濁させ、インライン超音波法（フロー法）によって少なくとも１０００Ｗの出力で２時間処理した（Ｄｒ．Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ Ｓｏｎｏｐｕｌｓ ２０００ Ｗ、Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ ＧｍｂＨ，Ｄ−１４５１３テルトー）。

【0115】

次に、６００ｍＬの１２．５％ポリビニルアルコール溶液（重量％）を添加し、超音波処理を２時間行った。その後、懸濁液に対して２０００×ｇで１０分間遠心分離を行った。１００ｎｍ以下の粒径、２．８％の磁鉄鉱含有量及び１．４％のＰＶＡ含有量を有するＰＶＡ含有磁鉄鉱懸濁液を得た。粒径はＰＣＳ（「ＤｅｌｓａＮａｎｏ Ｃ」、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）で測定した。

【0116】

実施例２：磁化可能なポリビニルアルコール微粒子の調製
実施例１で得た磁鉄鉱コロイド５０００ｍＬを６６０ｍＬのＨＣＬ（２．５Ｍ）と十分に混合した。得られた懸濁液を、１．５体積％のＴＷＥＥＮ（登録商標）、０．５体積％のソルビタンセスキオレエート、２．５体積％のＤｅｈｙｍｕｌｓ（登録商標） ＨＲＥ及び０．７５体積％のＨｙｐｅｒｍｅｒ（登録商標）を含む市販の植物油６０Ｌに（有機相を６０℃に加熱した後に）添加した。

【0117】

次に、分散混合機（Ｙｓｔｒａｌ Ｄｉｓｐｅｒｍｉｘ）を使用し、６０℃で１０分間撹拌（撹拌速度：３５００ｒｐｍ）を行った。５５０ｍＬの１２．５％グルタルアルデヒド水溶液を添加した後、撹拌を３５分間継続した（Ｙｓｔｒａｌ Ｄｉｓｐｅｒｍｉｘ、３５００ｒｐｍ）。

【0118】

粒子を懸濁液から磁気的に分離し、水（有機溶媒を含まず）で繰り返し洗浄して、１〜３μｍの粒径及び５５重量％の磁鉄鉱含有量を有する磁鉄鉱粒子２５０ｇを得た。多分散指数（ＰＤＩ）は０．１〜０．２５だった。粒径及びＰＤＩはＰＣＳ（「ＤｅｌｓａＮａｎｏ Ｃ」、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）で測定した。

【0119】

実施例３：ゼータ電位の測定
本発明に係る磁化可能な微粒子は、特に、生化学的検出法（特にＰＣＲ）において、従来の粒子と比較して、より少ない非特異的結合を生じさせたり、阻害成分がより少ない等という点において特徴付けられる。本発明によれば、上記利点は、磁化可能材料（磁鉄鉱）の封入が改善され、粒子表面に露出された遊離（非封入）磁鉄鉱が少ないことによって得られるものと考えられる。

【0120】

非封入磁鉄鉱の存在は粒子の表面特性の変化を引き起こすため、表面特性の変化はゼータ電位（実質的に表面電荷数に比例）を測定することによって調べることができると考えられる。この仮説について以下のように実験を行った。

【0121】

本発明に係るポリビニルアルコール微粒子を実施例２に記載した方法で調製した。比較のために、特許文献１の実施例２に従って磁性ポリビニルアルコール粒子を調製した。各粒子の粒径は１〜３μｍの範囲だった。次に、複数の粒子バッチから得たサンプルを使用してゼータ電位を測定した。結果を表１に示す。

【0122】

【表1】

【0123】

本発明に係る方法によって調製した粒子は約−４０ｍＶの平均ゼータ電位を有しており、特許文献１に従って調製した粒子と比較して、ゼータ電位の絶対値に対して３０％増加していた。

【0124】

この知見は、本発明に係る粒子では遊離磁鉄鉱の割合（比率）が減少しているという仮説を確証するものである。総表面積における遊離磁鉄鉱の割合（比率）が低下し、ポリビニルアルコールで被覆された総表面積の割合（比率）が大きくなると、表面に存在する潜在的に酸化可能な官能基（及び潜在的電荷キャリア）の数が増加する。これは、ゼータ電位の対応する変化として現れる（表１を参照）。粒子の粒径及び総表面積は一定（１〜３μｍ）であったため、本発明に係る粒子の場合には、観察されたゼータ電位の変化は遊離磁鉄鉱の割合（比率）の減少によって生じたものと考えられる。

【0125】

この仮定は、粒子をナノ結晶磁鉄鉱と共に培養することによって磁性ポリマー粒子のゼータ電位が再び（絶対値に対して）低下したさらなる実験によって確証された。磁鉄鉱はファン・デル・ワールス相互作用によって粒子表面に結合し、粒子表面の一部を覆うため、下部に存在する電荷は隠される（アクセスできなくなる）。これにより、予想通りゼータ電位の（絶対値に対する）低下が生じた（表２を参照）。

【0126】

【表2】

【0127】

表２に示すゼータ電位測定に使用した粒子は、本発明に係る方法（表１及び実施例２を参照）によって調製した粒子である。「＋Ｍ」は、各サンプルを遊離磁鉄鉱と共に培養したことを意味する。

【0128】

本発明に係る磁化可能なポリビニルアルコール粒子は、従来のポリビニルアルコール粒子（特許文献１）よりも負のゼータ電位を有するため、凝集体を形成し、凝集反応を示す傾向が低い。

【0129】

実施例４：ＰＣＲに使用した場合の本発明に係る磁化可能なポリビニルアルコール微粒子の挙動
ＰＣＲサンプルにおける磁化可能なポリビニルアルコール微粒子の存在のＰＣＲに対する阻害作用を調べた。本発明に係る微粒子（実施例２及び３を参照）を従来の粒子（特許文献１の実施例３を参照）と比較した。

【0130】

ＰＣＲに使用したテンプレートＤＮＡは、バクテリオファージＰｈｉ Ｘ１７４の所定のファージ力価でヒト血漿をスパイクし、そこから核酸を抽出することによって得た。次に、リアルタイムＰＣＲによって核酸を増幅した。磁化可能なポリマー粒子の阻害作用も調べるために、調査対象の磁化可能なポリビニルアルコール微粒子を増幅反応に添加した（２５μｇ、５０μｇ又は１００μｇ／反応バッチ）（表３及び４を参照）。

【0131】

リアルタイムＰＣＲで測定したＣｔ値を表３及び４に示す。Ｃｔ値は、蛍光シグナルが閾値を超えるまでに必要なサイクル数を示す。陽性対照（磁化可能なポリマー粒子を添加しないＰＣＲ反応）では、Ｃｔ値は２５．００だった。

【0132】

【表3】

【0133】

１〜５列に示すデータは、本発明に係る粒子の異なるバッチに関するものである。

【0134】

表３に示すように、Ｃｔ値は２５から変化しなかった。これは、核酸の増幅は反応に添加した粒子によって阻害されなかったことを意味している。

【0135】

【表4】

【0136】

１〜５列に示すデータは、特許文献１に係る粒子の異なるバッチに関するものである。

【0137】

表３（本発明に係る粒子）とは対照的に、従来の粒子をＰＣＲに添加すると、粒子の添加量（２５／５０／１００μｇ）の関数としてＣｔ値が上昇した。１００μｇの粒子を添加した場合には、Ｃｔ値は２８に上昇した。Ｃｔ値の上昇は、蛍光シグナルの生成の遅延、すなわち、ＤＮＡの増幅の遅延を意味する。そのため、上記遅延は、阻害作用を示さなかった本発明に係る粒子（表３）とは異なり、従来の磁性粒子（特許文献１）は阻害作用を示したことを示している。