特許 6121421 Ｃ．ディフィシルの毒素Ａおよび毒素Ｂタンパク質の単離ポリペプチドならびにその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6121421

(24)【登録日】2017年4月7日

(45)【発行日】2017年4月26日

(54)【発明の名称】Ｃ．ディフィシルの毒素Ａおよび毒素Ｂタンパク質の単離ポリペプチドならびにその使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/08 20060101AFI20170417BHJP

   A61K 38/00 20060101ALI20170417BHJP

   A61P 1/12 20060101ALI20170417BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20170417BHJP

   C07K 14/33 20060101ALI20170417BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20170417BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/08ZNA

   A61K37/02

   A61P1/12

   A61P31/04

   C07K14/33

   !C12N15/00 A

【請求項の数】13

【全頁数】77

(21)【出願番号】特願2014-527505(P2014-527505)

(86)(22)【出願日】2011年9月5日

(65)【公表番号】特表2014-525249(P2014-525249A)

(43)【公表日】2014年9月29日

(86)【国際出願番号】EP2011065304

(87)【国際公開番号】WO2012028741

(87)【国際公開日】20120308

【審査請求日】2014年8月22日

(73)【特許権者】

【識別番号】514054812

【氏名又は名称】バルネバ オーストリア ジーエムビーエイチ

(73)【特許権者】

【識別番号】514055358

【氏名又は名称】インターセル ユーエスエー， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100097456

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 徹

(72)【発明者】

【氏名】ラリー エリングスワース

(72)【発明者】

【氏名】デビット フライヤー

(72)【発明者】

【氏名】ジング‐フイ チアン

(72)【発明者】

【氏名】スティーブン フフルマン

(72)【発明者】

【氏名】ステファニー クルエプフェル‐スタール

(72)【発明者】

【氏名】グレゴリー グレン

(72)【発明者】

【氏名】カースティン ウェストリトスチニグ

【審査官】 北村 悠美子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１０／０１７３８３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００２−５１４８８６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００７／１４６１３９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００８／１５２４２９（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １４／００−１４／８２５

Ｃ０７Ｋ １９／００

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

a)配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する単離ポリペプチド、又は
b)配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する単離ポリペプチドであって、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａ及びＢに対する免疫反応を誘導することができる、前記単離ポリペプチド
を含む、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａ及びＢに対する免疫反応を誘導するための、免疫原性組成物又はワクチン組成物。

【請求項2】

前記ポリペプチドが、致死用量の１０^２、１０^３および１０^４のクロストリジウム・ディフィシル芽胞の胃内投与後における、前記単離ポリペプチドをワクチン接種されたハムスターの１００％生存率をもたらす、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記ポリペプチドが、クロストリジウム・ディフィシルの毒素ＡのＣ末端ドメインから得られる１９反復単位を含む、請求項１または２に記載の組成物。

【請求項4】

前記ポリペプチドが、クロストリジウム・ディフィシルの毒素ＢのＣ末端ドメインから得られる２３反復単位を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項5】

前記ポリペプチドが、配列番号４に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項6】

アジュバントをさらに含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項7】

前記アジュバントがａｌｕｍを含む、請求項６記載の組成物。

【請求項8】

Ｃ．ディフィシル関連疾患（ＣＤＡＤ）の予防および治療における使用のための、請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項9】

ＣＤＡＤのリスクを有する対象におけるＣＤＡＤの予防における使用のための、請求項８記載の組成物。

【請求項10】

ＣＤＡＤのリスクを有する前記対象は、ｉ）６５歳を超える対象、もしくは２歳未満の対象；ｉｉ）ＡＩＤＳを有する対象；ｉｉｉ）免疫抑制薬を投与されている、もしくは投与される予定がある対象；ｉｖ）入院の予定がある対象、もしくは入院している対象；ｖ）集中治療を受けている、もしくは受ける予定がある対象；ｖｉ）消化管手術を受けている、もしくは受ける予定がある対象；ｖｉｉ）長期介護を受けている、もしくは受ける予定がある対象；ｖｉｉｉ）頻繁な、および／もしくは長期的な抗生物質の使用を必要とする共存症を有する対象；またはｉｘ）再発性ＣＤＡＤを有する対象である、請求項９記載の組成物。

【請求項11】

Ｃ．ディフィシル関連疾患（ＣＤＡＤ）の予防および治療における使用のための単離ポリペプチドであって、
a)該単離ポリペプチドが、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するか、又は
b)該単離ポリペプチドが、配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、かつ、配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する該ポリペプチドが、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａ及びＢに対する免疫反応を誘導することができる、
前記単離ポリペプチド。

【請求項12】

ＣＤＡＤのリスクを有する対象におけるＣＤＡＤの予防における使用のための、請求項１１記載のポリペプチド。

【請求項13】

ＣＤＡＤのリスクを有する前記対象は、ｉ）６５歳を超える対象、もしくは２歳未満の対象；ｉｉ）ＡＩＤＳを有する対象；ｉｉｉ）免疫抑制薬を投与されている、もしくは投与される予定がある対象；ｉｖ）入院の予定がある対象、もしくは入院している対象；ｖ）集中治療を受けている、もしくは受ける予定がある対象；ｖｉ）消化管手術を受けている、もしくは受ける予定がある対象；ｖｉｉ）長期介護を受けている、もしくは受ける予定がある対象；ｖｉｉｉ）頻繁な、および／もしくは長期的な抗生物質の使用を必要とする共存症を有する対象；またはｉｘ）再発性ＣＤＡＤを有する対象である、請求項１２記載のポリペプチド。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａおよび毒素Ｂの受容体結合ドメインを含有する単離ポリペプチド、ならびにそのワクチンとしての使用に関する。この単離ポリペプチドは、両毒素に対する抗毒素免疫を提供する。

【背景技術】

【0002】

クロストリジウム・ディフィシルは、院内感染抗生物質関連下痢の主要な原因であり、病院、養護施設および他の介護施設における大きな健康問題となっている。病院に対する費用は、欧州において２０億ドル、米国において３２億ドルと見積もられている。

【0003】

原因物質は、環境全体に一般的に見られるが、健常成人人口の２〜３％の腸管にも存在する、グラム陽性芽胞形成性嫌気性細菌である。Ｃ．ディフィシル関連疾患（ＣＤＡＤ）は、通常は抗生物質投与の結果である正常な結腸細菌叢の破壊により誘導される。環境中のＣ．ディフィシル芽胞への暴露後、生物は腸粘膜においてコロニー形成する可能性があり、そこで疾患原因毒素の産生がＣＤＡＤをもたらし得る。疾患は、軽度の合併症を伴わない下痢から、重度の偽膜性大腸炎および中毒性巨大結腸症まで様々となり得る。

【0004】

ＣＤＡＤは、医療環境においてますます問題となってきている。最近の研究では、抗生物質を与えられた入院患者の３１％においてＣ．ディフィシルがコロニー形成し、コロニー形成したそれらの患者の５６％が、続いてＣＤＡＤを発症することが報告されている。概して、Ｃ．ディフィシルは、全ての抗生物質関連下痢の１０〜２５％、抗生物質関連大腸炎の５０〜７５％、および抗生物質関連偽膜性大腸炎の９０〜１００％の原因である。ＣＤＡＤの治療には、原因抗生物質の停止と、それに続くメトロニダゾールまたはバンコマイシンによる処置が伴う。抗生物質治療が停止された後の再発は、患者の約２０％に生じ、これは多くの場合Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）によるコロニー再形成の結果である。

【0005】

２００３年、カナダのケベック州におけるＣ．ディフィシルの発生は、Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ １／０２７（ＮＡＰ１）として知られるＣ．ディフィシルのより毒性の強い株の出現を示した。ＮＡＰ１は、以前の株と比較して、より高い毒性、より低い転帰、ならびにより高い疾病率および死亡率に関連している。この株の出現は、ＣＤＡＤの発生の阻止の試みにおいてすでに生じている問題を増大させる。

【0006】

再発性疾患の予防のためのフィダキソマイシン（Ｄｉｆｉｃｉｄ（登録商標））は、狭域大環状抗生物質の新たなクラスにおいて最初の物質である（Ｒｅｖｉｌｌ，Ｐ．；Ｓｅｒｒａｄｅｌｌ，Ｎ．；Ｂｏｌｏｓ，Ｊ．（２００６）．”Ｔｉａｃｕｍｉｃｉｎ Ｂ：ｍａｃｒｏｌｉｄｅ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｄｉａｒｒｈｅａ”．Ｄｒｕｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｕｔｕｒｅ ３１ （６）：４９４-４９７）．これは、放線菌ダクチロスポランギウムアウランチアクム（Ｄａｃｔｙｌｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ）亜種ハムデネシス（ｈａｍｄｅｎｅｓｉｓ）から得られる発酵産物である。フィダキソマイシンは、非全身性、つまり血流への吸収が極僅かであり、殺菌性であり、また、病原性クロストリジウム・ディフィシルの選択的根絶を示し、正常な健康腸細菌叢を構成する複数種の細菌に対する破壊が極僅かである。結腸における正常な生理学的状態の維持は、クロストリジウム・ディフィシル感染症再発の可能性を低減し得る（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｓｔｕａｒｔ（２００９−０６）．”Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｒｉｓｋ ｆａｃｔｏｒｓ，ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ，ａｎｄ ｏｕｔｃｏｍｅｓ”．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ５８（６）：４０３−４１０）。この新たなクラスの抗生物質の導入はＣＤＡＤの治療を改善することが考えられるが、特に高齢者および免疫力のない患者等の高リスク患者においては、まだ予防薬の医学的必要性が存在する。

【0007】

ＣＤＡＤは、Ｃ．ディフィシルにより産生される２つの外毒素、毒素Ａおよび毒素Ｂ（それぞれＣＴＡおよびＣＴＢとも呼ばれる）の作用の結果である。それらの毒素は共に、複数の官能性ドメインを有する高分子量（〜３００ｋＤａ）の分泌タンパク質である（Ｖｏｔｈ ＤＥ ａｎｄ Ｂａｌｌａｒｄ ＪＤ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ １８：２４７−２６３（２００５））。両毒素のＮ末端ドメインは、Ｒｈｏ様ＧＴＰａｓｅを修飾するＡＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ活性を含有する。この修飾は、アクチン重合の損失および細胞骨格の変化を引き起こし、結腸上皮密着結合の破壊をもたらす。これは、結腸への過度の流体滲出、および結果として下痢をもたらす。中央ドメインは、疎水性ドメインを含有し、膜輸送に関与すると推測される。両毒素のＣ末端ドメインは、標的細胞への毒素結合に関与する反復単位（ＲＵ）と呼ばれる複数の相同領域を含有する（Ｈｏ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ １０２：１８３７３−１８３７８（２００５））。反復単位は、短鎖（２１〜３０アミノ酸）または長鎖（〜５０アミノ酸）として分類される。反復単位は、組み合わさってクラスタを形成し、それぞれ、通常１つの長鎖および３〜５個の短鎖反復単位を含有する。全長毒素Ａは、８個のクラスタに組織化される３９個の反復単位（ＡＲＵ）を有し（Ｄｏｖｅ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ．５８：４８０−４８８（１９９０）、一方全長毒素Ｂは、５個のクラスタに組織化される２４個の反復単位（ＢＲＵ）を含有する（Ｂａｒｒｏｓｏ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：４００４（１９９０）； Ｅｉｃｈｅｌ−Ｓｔｒｅｉｂｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ ９６：１０７−１１３ （１９９２））。

【0008】

動物モデルおよび臨床の両方からのいくつかの研究では、Ｃ．ディフィシル関連疾患からの保護における抗毒素抗体の役割が示されている。ホルマリン不活性化毒素Ａおよび毒素Ｂで免疫化されたハムスターは、高レベルの抗毒素抗体を生成し、Ｃ．ディフィシル細菌の致死的負荷から保護された（Ｇｉａｎｎａｓｃａ ＰＪ ａｎｄ Ｗａｒｎｙ Ｍ，Ｖａｃｃｉｎｅ ２２：８４８−８５６（２００４））。さらに、マウス抗毒素抗体の受動伝達は、用量依存的にハムスターを保護した。Ｋｙｎｅ Ｌら（Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ ３５７：１８９−１９３ （２００１））は、ＣＤＡＤの初期発現時の抗毒素Ａ抗体反応の発達が、疾患再発に対する保護と相関することを報告した。

【0009】

保護的抗毒素抗体により認識される決定基は、受容体結合ドメインとして機能する反復単位を含有するＣ末端ドメインに局在している。最初に、Ｌｙｅｒｌｙら（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２１ ：２９−３２ （１９９０））は、３３個の反復単位を含有する毒素ＡのＣ末端ドメインが、中和抗毒素抗体の産生を誘導することができ、Ｃ．ディフィシル感染から保護し得ることを明らかにした。この研究において、ハムスターには、細菌による負荷の前に精製組み換えポリペプチドが複数回皮下投与されたが、部分的な保護しか達成されなかった。別の研究（Ｒｙａｎ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５：２９４１ −４９（１９９７））では、ＣＴＡのＣ末端からの７２０アミノ酸残基を含有する単離ポリペプチド、および大腸菌溶血素Ａ（コレラ菌において発現）の分泌シグナルが、ウサギＣＤＡＤモデルにおいて、少用量のＣＴＡに対して保護的な全身性および粘膜免疫を誘導することが示された。

【0010】

また、両毒素ＡおよびＢのＣ末端ドメインに対する抗体反応は、完全保護を達成するために必要であることが報告された（Ｋｉｎｋ ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６６：２０１８−２５ （１９９８），Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，７３６，１３９（１９９８））。この研究は、各毒素のＣ末端ドメインが、毒素中和抗体の産生において最も効果的であることを明らかにした。これは、ハムスター致死モデルにおいてＣＴＡおよびＣＴＢのＣ末端ドメインに対して惹起された、経口送達トリ抗体（抗毒素）の有効性を実証した。結果はまた、抗毒素が、人間におけるＣＤＡＤの治療および管理において効果的となり得ることを示している。別の研究において、ヒト抗毒素ＡおよびＢモノクローナル抗体が、ハムスターにおけるＣ．ディフィシル誘導死に対する保護を付与すると報告された（Ｂａｂｃｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７４：６３３９−６３４７（２００６））。いずれかの毒素の受容体結合ドメインに対する抗体によってのみ保護が観察され、また両抗毒素ＡおよびＢ抗体による処置後に、向上した保護が観察された。

【0011】

一方、Ｗａｒｄら（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７：５１２４−３２（１９９９））は、アジュバント活性の研究のために、Ｃ．ディフィシル毒素Ａからの１４反復単位（１４ＣＴＡ）を考慮した。反復単位は、Ｎ末端ポリヒスチジンタグでクローン化および発現され（１４ＣＴＡ−ＨＩＳ）、または、破傷風毒素からの非毒性結合ドメインに融合された（１４ＣＴＡ−ＴＥＴＣ）。鼻腔内投与された両方の融合タンパク質は、マウスにおいて抗毒素Ａ血清抗体を産生したが、粘膜表面における反応を示さなかった。大腸菌易熱性毒素（ＬＴ）またはその突然変異型ＬＴＲ７２との併用投与後に、向上した全身性および粘膜抗毒素Ａ反応が観察された。データに基づき、Ｗａｒｄらは、クロストリジウム病原体に対するヒトワクチンにおける粘膜アジュバントとしての、非毒性１４ＣＴＡ−ＴＥＴＣ融合の使用を示唆した。

【0012】

Ｃ．ディフィシル毒素の反復単位ドメインに対する最近の生化学的研究は、安定な三元構造を形成するための最小配列要件に注目している（Ｄｅｍａｒｅｓｔ Ｓ Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．３４６：１１９７−１２０６（２００５））。毒素Ａから得られる１１反復単位ペプチドは、正しい三元構造を有するが、毒素ＡおよびＢからの６および７反復単位はそれを有さないことが判明した。正しく折り畳まれた１１反復単位セグメントは、受容体結合特性を維持することが判明した。第２の研究は、６、１１または１５反復単位を含有する毒素Ａ断片の機能的特性を検査した（Ｄｉｎｇｌｅ Ｔ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １８：６９８−７０６（２００８））。１１および１５反復単位のみが、抗毒素Ａ抗体の毒素中和能力を競合的に阻害することができた。３つ全ての断片が、赤血球凝集活性を有することが判明したが、より長い断片は、より短いものよりも高い赤血球凝集活性を示した。データは、毒素受容体結合ドメイン構造および免疫原性が、１１〜１４を超える反復を含有するドメイン断片において保持されることを示している。

【0013】

また、Ｔｈｏｍａｓら（ＷＯ９７／０２８３６、米国特許第５，９１９，４６３号（１９９９））は、粘膜アジュバントとしてのＣ．ディフィシル毒素Ａ、毒素Ｂおよびそのある特定の断片（例えば、反復単位の一部または全てを含有するＣ末端ドメイン）を開示した。彼らは、ＣＴＡまたはＣＴＢの鼻腔内投与が、複数のマウス区画において、ヘリコバクター・ピロリウレアーゼ、オボアルブミン、またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）等の異種抗原への粘膜免疫反応を大幅に向上させ、ヘリコバクターによる負荷に対する保護に関連することを示した。さらに、毒素Ａ融合タンパク質のアジュバント活性が評価され、ＡＲＵ（毒素Ａ反復単位）を含むＣＴＡの７９４Ｃ末端アミノ酸残基が、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）に融合し、結果的なポリペプチドＧＳＴ−ＡＲＵが大腸菌において発現した。この研究は、血清および粘膜分泌物における併用投与された抗原に対するＧＳＴ−ＡＲＵによる免疫反応の著しい向上を実証した。

【0014】

これらの研究は全て、Ｃ．ディフィシル毒素Ａもしくは毒素Ｂ、またはそれらの断片、またはそれらの組み合わせを含む非毒性組み換えタンパク質の、ＣＤＡＤに対する活性ワクチンの生成のための潜在的な使用を示唆している。現在、Ｃ．ディフィシルに対するワクチンは市販されていないが、ホルマリン解毒全毒素ＡおよびＢからなる候補ワクチンが、人間におけるフェーズＩおよびＩＩａ試験において評価されている。このワクチンによる非経口免疫化は、抗毒素ＩｇＧおよび毒素中和抗体反応を誘導することが報告されている（Ｋｏｔｌｏｆｆ ＫＬ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９：９８８−９９５（２００１）；Ａｂｏｕｄｏｌａ Ｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７１：１６０８−１６１０（２００３））。

【0015】

文献は、さらに、Ｃ．ディフィシルの毒素ＡおよびＢ受容体結合ドメインの両方を含有する組み換え融合タンパク質の構築が、全体またはその断片において、ワクチン開発のための効率的および商業的に実行可能な手法であることを示している。そのような手法は、Ｖａｒｆｏｌｏｍｅｅｖａらにより、毒素Ａの７００塩基対断片および毒素Ｂの１３００塩基対断片の２つの部分からなる融合タンパク質として試みられている（Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｉｃｒｏｂ．ａｎｄ Ｖｉｒｏｌ．３：６−１０（２００３））。この手法はまた、ＢｅｌｙｉおよびＶａｒｆｏｌｏｍｅｅｖａ（ＦＥＭＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２５：３２５−９（２００３））により説明されており、３つの部分：Ｃ．ディフィシル毒素Ａおよび毒素Ｂの反復単位で構成される２つのＣ末端ドメインに続く、ウェルシュ菌エンテロトキシンＣｐｅの断片からなる組み換え融合タンパク質の構築を示している。融合タンパク質は、大腸菌において発現されたが、生成物は封入体内に蓄積し、安定ではなかった。さらに、この研究において達成された純粋な生成物の収量（培地１００ｍｌ当たり５０μｇ）は、著しく低いものであった。

【0016】

Ｗｉｌｋｉｎｓら（ＷＯ００／６１７６２、米国特許第６，７３３，７６０号（２００４））もまた、組み換えＣ．ディフィシル毒素ＡおよびＢ反復単位（組み換えＡＲＵおよび組み換えＢＲＵ）、ならびにＣＤＡＤに対するワクチンの調製のための多糖類複合体の使用を説明している。得られる組み換えＡＲＵタンパク質は、８６７個のアミノ酸残基を含み、一方組み換えＢＲＵタンパク質は、６２２個のアミノ酸の長さを含有している。前に言及した研究とは異なり、この研究は、大腸菌における組み換えＡＲＵおよびＢＲＵ可溶性タンパク質の高レベルの発現を実証した。組み換えＡＲＵおよび多糖類複合化組み換えＡＲＵをワクチン接種されたマウスは、共に高レベルの中和抗毒素Ａ抗体を有し、またＣ．ディフィシル毒素Ａによる致死的負荷から極めて保護された。さらに、Ｗｉｌｋｉｎｓらは、ワクチン調製のための、ＡＲＵおよびＢＲＵの両方からなる組み換え融合タンパク質の使用を示唆した。

【0017】

ＣＤＡＤに対するワクチンの開発に関心が集まっている。ＡＲＵおよびＢＲＵからなる組み換え融合タンパク質が、ワクチンとして潜在的に有用となり得る。

【発明の概要】

【0018】

本発明は、Ｃ．ディフィシルからの毒素Ａおよび毒素Ｂの設計、生成および使用のための新たなツールおよび方法を提供する。本発明は、配列番号２（Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５）またはその誘導体、配列番号４（Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１）を含む単離ポリペプチドＣ−ＴＡＢを提供する。Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１は、毒素ＢのＣ末端ドメインの２３反復単位に融合した、毒素ＡのＣ末端ドメインの１９反復単位を含む。本発明はまた、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドを含む組成物および製剤を含む。組成物または製剤は、単離ポリペプチド、追加の抗原、アジュバント、および／または賦形剤を含有してもよい。代替として、組成物または製剤は、本質的に、アジュバントまたは他の活性成分を含まない単離ポリペプチドからなってもよい（但し、担体、緩衝剤および／または安定剤等の賦形剤を随意に含む）。さらに、本発明の組成物または製剤は、特に、例えば再発性ＣＤＡＤを有する対象、または頻繁および／もしくは長期の抗生物質の使用を必要とする対象において、抗生物質等の他の薬物と併用して投与されてもよい。

【0019】

本発明はまた、本発明の単離ポリペプチドを含むワクチンを提供する。ワクチンは、さらに、アジュバント、例えば例えばａｌｕｍ、ＡＤＰ−リボシル化外毒素から得られるアジュバント、またはその他を含んでもよい。ワクチンは、単一投薬計画、２回投薬計画（例えば最初の投薬から３日から２０日以内、例えば１０日から１５日後に投与される）、３回投薬計画（例えば最初の投薬から約７日後および約２１日後に投与される）、または４回以上の投薬計画、好ましくは２回または３回投薬計画で投与されてもよく、用量は、２０μｇから２００μｇの量の本発明のポリペプチドを含む。

【0020】

本発明は、それを必要とする対象に、本発明の単離ポリペプチドを投与することにより、ＣＤＡＤ等の疾患の１つ以上の症状を予防、治療、または軽減する方法を提供する。Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドは、筋肉内または他の送達経路により対象に投与され得る。

【0021】

一実施形態において、本発明は、例えば以下のプロファイルを有する対象等のＣＤＡＤのリスクを有する対象に、本発明の単離ポリペプチドまたは前記ポリペプチドを含む組成物を投与することにより、ＣＤＡＤ等の疾患を予防する方法を提供する：ｉ）より弱い免疫系を有する対象、例えば高齢対象（例えば６５歳を超える対象）もしくは２歳未満の対象等；ｉｉ）免疫力のない対象、例えばＡＩＤＳを有する対象等；ｉｉｉ）免疫抑制薬を投与されている、もしくは投与される予定がある対象；ｉｖ）入院の予定がある対象、もしくは入院している対象；ｖ）集中治療（ＩＣＵ）を受けている、もしくは受ける予定がある対象；ｖｉ）消化管手術を受けている、もしくは受ける予定がある対象；ｖｉｉ）養護施設等の長期介護を受けている、もしくは受ける予定がある対象；ｖｉｉｉ）頻繁な、および／もしくは長期的な抗生物質の使用を必要とする共存症を有する対象；ｉｘ）上述のプロファイルの２つ以上を有する対象である対象、例えば消化管手術を受ける予定がある高齢対象等；ｘ）炎症性大腸炎を有する対象；ならびに／またはｘｉ）再発性ＣＤＡＤを有する対象、例えばＣＤＡＤの１つ以上のエピソードを経験している対象等。

【0022】

一実施形態において、本発明は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドを生成する方法を提供する。Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドは、大腸菌発現系等の細菌発現系を使用して、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドをコードする核酸から生成され得る。

【0023】

一実施形態において、本発明は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドを提供し、毒素Ａの１９反復単位が、少なくとも４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸残基からなるリンカーを介して、毒素Ｂの２３反復単位に接続している。例として、本発明のリンカーは、配列ＲＳＭＨ（Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ）（配列番号２または配列番号４のアミノ酸４３９〜４４２）を含んでもよい。

【0024】

別の実施形態において、本発明は、例えばＡＲＵおよび／またはＢＲＵにおいて少なくとも１つの突然変異（例えば、挿入、置換または欠失）を含む、単離ポリペプチドの変異体を提供する。変異体の配列は、配列番号２に対する８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一性を有してもよい。

【0025】

本発明はまた、組み換えＤＮＡ操作、細菌発酵およびタンパク質精製により、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドまたはその変異体を生成するための方法を提供する。一実施形態において、本発明は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドをコードする核酸を構築するための方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、大腸菌発現系等の細菌発現系を使用して、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドを生成する方法を提供する。

【0026】

本発明は、さらに、それを必要とする人間等の対象におけるＣＤＡＤを予防および治療するための方法を提供する。この方法において、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１は、対象に単独で投与されるか、またはａｌｕｍもしくはその他等の１種以上のアジュバントと併用投与される。対象は、Ｃ．ディフィシルへの暴露のリスクがある健常個人、Ｃ．ディフィシル感染症の治療を受けた、もしくはそれから回復したが、Ｃ．ディフィシルによる再感染のリスクがある人間対象、または、現在Ｃ．ディフィシルに感染しており、その状態がＣ．ディフィシル毒素中和抗体の誘導により改善され得る人間対象であってもよい。

【0027】

本発明は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１を含む免疫原性組成物を提供する。免疫原性組成物は、さらに、抗原特異的免疫応答を向上させるアジュバントおよび／または薬学的に許容される担体および／またはそれを必要とする対象への適用に好適な製剤中の他の構成成分を含んでもよい。免疫原性組成物は、筋肉内（ＩＭ）送達、皮内（ＩＤ）送達、皮下（ＳＣ）送達、腹腔内（ＩＰ）送達、経口送達、経鼻送達、口腔送達、または直腸送達により送達され得る。

【0028】

本発明の別の実施形態において、免疫原性組成物は、天然Ｃ．ディフィシル毒素に結合してその細胞毒性活性を中和する抗体を生じさせ、そのようにしてＣ．ディフィシル関連疾患（ＣＤＡＤ）に対する長期活性保護、および／または治療を提供する。

【0029】

したがって、本発明は、それを必要とする対象におけるＣ．ディフィシル関連疾患の予防または治療に有用な免疫原性組成物を提供する。

【0030】

別の実施形態において、本発明は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１をコードする核酸およびその断片または変異体を提供する。本発明はまた、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１をコードする核酸を含む発現ベクターを提供する。

【0031】

本発明の別の実施形態は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１に特異的な、中和、ヒト化、モノクローナル、キメラおよびポリクローナル抗体等の抗体およびその断片を提供する。抗体またはその断片は、毒素Ａおよび／または毒素Ｂを認識することができる。

【0032】

別の実施形態は、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むワクチンを提供する。

【0033】

本発明の別の実施形態は、本発明の核酸、ポリペプチドおよび／または抗体を含む診断キットを提供する。

【0034】

本発明の他の実施形態および利点は、以下の説明において部分的に記載され、また一部は本説明から明らかとなり得るか、または本発明の実践から学習され得る。

【図面の簡単な説明】

【0035】

【図1A】Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５単離ポリペプチド（配列番号１）をコードする核酸を示す図である。

【図1B】Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５単離ポリペプチド（配列番号２）のアミノ酸配列を示す図である。毒素Ａと毒素Ｂとの間のアミノ酸リンカーに下線が引かれている。

【0036】

【図2A】Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチド（配列番号３）をコードする核酸を示す図である。

【図2B】Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチド（配列番号４）のアミノ酸配列を示す図である。毒素Ａと毒素Ｂとの間のアミノ酸リンカーに下線が引かれている。

【0037】

【図3】Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５の用量の増加およびａｌｕｍアジュバントとの併用送達による、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５ワクチン接種マウスにおける抗体産生の向上を示す表である。マウスは、ＩＭ注射により２回のワクチン接種を受けた。第１および第２の注射から２週間後に、抗Ｃ−ＴＡＢ、抗毒素Ａおよび抗毒素Ｂ抗体のＩｇＧ力価をＥＬＩＳＡにより評価した。

【0038】

【図4】２回のＩＭ注射によりａｌｕｍあり、およびなしで増加用量のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５を受けたマウスにおける、抗Ｃ−ＴＡＢ、抗毒素Ａ、および抗毒素Ｂ ＩｇＧ誘導のグラフ表示である。

【0039】

【図5】ａｌｕｍの存在下または非存在下でＣ−ＴＡＢ．Ｇ５で免疫化されたマウスにおける、片対数用量範囲にわたる抗体力価を示す表である。ＩｇＧ力価は、第２の免疫化から２週間後にＥＬＩＳＡにより評価した。データは、ａｌｕｍがワクチン接種マウスにおける抗体産生を大幅に増強することを示している。

【0040】

【図6】Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５をワクチン接種され（ａｌｕｍありおよびａｌｕｍなし）、次いで致死用量の毒素Ａまたは毒素Ｂに暴露されたマウスにおける保護効果を示す表である。２週間間隔で２回のワクチン接種（ＩＭ）を受けたマウスを、３週間後に負荷（ＩＰ）した。毒素Ａおよび毒素Ｂ中和抗体（ＴＮＡ）を、第２の注射から２週間後に評価し、致死的負荷後に生存した動物のパーセントを決定した。Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５の増加用量は、より高いＴＮＡ産生と共に、致死的負荷に対する増加した保護をもたらした。ａｌｕｍの存在はＴＮＡ産生をさらに増加させると共に、より低い用量でのより高い生存率をもたらした。

【0041】

【図7】ワクチン接種幼若（６〜７週齢）および老齢（１８ヶ月齢）マウスにおける、抗体反応およびＣ−ＴＡＢ．Ｇ５の保護有効性の比較を示す表である。２週間間隔で２回のワクチン接種（ＩＭ）を受けたマウスに、３週間後に負荷した（ＩＰ）。抗Ｃ−ＴＡＢ、抗毒素Ａおよび抗毒素Ｂ抗体のＥＬＩＳＡ ＩｇＧ力価、ＴＮＡ産生ならびに全体的な生存率を評価した。幼若マウスは、ａｌｕｍなしであってもより高い抗体反応を示し、両群とも、ａｌｕｍの存在下でワクチン接種された場合、改善された生存率を示した。

【0042】

【図8】ワクチン接種幼若および老齢マウスにおける、抗Ｃ−ＴＡＢ ＩｇＧ抗体増加の反応速度の比較を示すグラフである。幼若マウスは、より速い速度およびより早期のＩｇＧ産生を示し、両群とも、ａｌｕｍの存在下でワクチン接種された場合、改善された反応を示した。

【0043】

【図9】Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１またはトキソイドＡおよびＢ混合物（１：１）で免疫化されたマウスにおける、抗Ｃ−ＴＡＢ、抗毒素Ａおよび抗毒素Ｂ抗体産生の比較を示す表である。マウスは、ＩＭ注射により２回のワクチン接種を受けた。第２の注射から２週間後に、抗Ｃ−ＴＡＢ、抗毒素Ａおよび抗毒素Ｂ抗体のＩｇＧ力価をＥＬＩＳＡにより評価した。トキソイドによる免疫化は、毒素分子のＮ末端部分に対する抗体を誘導し、一方で、Ｃ−ＴＡＢによる免疫化は、毒素分子のＣ末端部分に対する抗体を誘導する。

【0044】

【図10】Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１またはトキソイドＡおよびＢ混合物により免疫化されたマウスにおける、ＴＮＡ産生および毒素ＡまたはＢによる負荷に対する保護の比較を示す表である。２週間間隔で２回のワクチン接種（ＩＭ）を受けたマウスに、３週間後に毒素Ａまたは毒素Ｂの致死用量を負荷した（ＩＰ）。

【0045】

【図11】ａｌｕｍありおよびなしでＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１で免疫化されたハムスターにおける、抗Ｃ−ＴＡＢ（Ａ）、抗毒素Ａ（Ｂ）、および抗毒素Ｂ（Ｃ）ＩｇＧ産生を示す表である。ハムスターは、０日目および１４日目にＩＭ注射により３回のワクチン接種を受けた。１４、２８および３５日目に、抗Ｃ−ＴＡＢ、抗毒素Ａおよび抗毒素Ｂ抗体のＩｇＧ力価をＥＬＩＳＡにより評価した。

【0046】

【図12】ａｌｕｍありまたはなしでＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１で免疫化されたハムスターにおける、抗Ｃ−ＴＡＢ ＩｇＧ抗体増加のグラフ表示である。

【0047】

【図13】ａｌｕｍありまたはなしでＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１で免疫化されたハムスターにおける、ＴＮＡおよび保護の比較を示す表である。第３のワクチン接種から２週間後、ハムスターは、ＩＰ注射により致死用量の毒素Ａまたは毒素Ｂを受けた。

【0048】

【図14】致死用量のＣ．ディフィシル芽胞の胃内投与後の、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１でワクチン接種されたハムスターの生存率を示すグラフである。生存率データは、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存率適合曲線としてプロットし、統計分析はログランク分析を使用して行った。全ての芽胞用量（１０^２、１０^３および１０^４）において、ワクチン接種群内のハムスターの１００％生存率が観察され、プラセボ群と比較して生存率が有意に向上した。

【0049】

【図15】ａｌｕｍの存在下または非存在下でＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１で免疫化されたカニクイザルにおける、抗Ｃ−ＴＡＢ、抗毒素Ａ、および抗毒素Ｂ抗体産生を示す表である。サルの２つの群（各群３匹、４〜６歳）が、２５０μｇのａｌｕｍあり、またはなしで、２００μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１を受けた。試験の０、１４、２８および４２日目に、血液試料を採取した。ＥＬＩＳＡ法を使用して、抗Ｃ−ＴＡＢ、抗毒素Ａおよび抗毒素Ｂ ＩｇＧ力価を評価した。

【0050】

【図16】ＰＢＳまたはヒスチジン緩衝液中１μｇ〜３０μｇの用量範囲にわたり送達されたＣ−ＴＡＢ．Ｇ５およびＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１の免疫原性の比較を示すグラフである。マウスは、２週間間隔で２回のワクチン接種（ＩＭ）を受けた。第２の注射から２週間後に、抗Ｃ−ＴＡＢ、抗毒素Ａおよび抗毒素Ｂ抗体のＩｇＧ力価をＥＬＩＳＡにより評価した。ＰＢＳまたはヒスチジン緩衝液中で送達されたＣ−ＴＡＢ．Ｇ５とヒスチジン緩衝液中で送達されたＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１との間で、３つ全ての抗体力価は有意には異ならなかった（Ｔ−検定分析）。

【0051】

【図17】マウスにおけるＣ−ＴＡＢ．Ｇ５、Ｃ−ＴＡＢＮＣＴＢおよびＣ−ＴＡＤＣＴＢの免疫原性の比較を示す表である。マウスは、ＩＭ注射により、２週間間隔で各組み換えタンパク質の２回のワクチン接種を受けた。全ての免疫化は、ａｌｕｍアジュバントの非存在下で行った。第２の注射から２週間後に、抗Ｃ−ＴＡＢ、抗毒素Ａおよび抗毒素Ｂ抗体のＩｇＧ力価をＥＬＩＳＡにより評価した。３つ全ての融合タンパク質が、高い免疫原性を示す。

【0052】

【図18】マウスにおける天然毒素Ｂによる負荷に対する保護を示す表である。マウスは、図１７に関して示したように免疫化され、３週間後に、ＩＰ注射により致死用量の天然毒素Ｂを負荷された。

【0053】

【図19】ａｌｕｍの非存在下または存在下でＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１またはＣ−ＴＡＤＣＴＢをワクチン接種されたハムスターにおける、ＴＮＡおよび保護の比較を示す表である。第３のワクチン接種から２週間後、ハムスターは、ＩＰ注射により致死用量の毒素Ａまたは毒素Ｂを受けた。

【0054】

【図20】異なる計画においてＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１で免疫化されたマウスにおける、ＴＮＡ産生および毒素Ａまたは毒素Ｂによる負荷に対する保護を示す表である。０、３および１４日目、または０、７および２１日目、または０、１４、および２８日目にＩＭ注射により３回ワクチン接種されたマウスの群の間の、ＴＮＡ産生および保護の比較。最後の注射から３週間後に、マウスに致死用量の毒素Ａまたは毒素Ｂを負荷した（パネルＡは表形式、パネルＢはグラフ形式である）。

【0055】

【図21】１０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１および１２．５μｇのａｌｕｍ（１００μｌ中）の単回投与で免疫化されたマウスにおける、Ｃ．ディフィシル毒素Ａ（５５ｎｇ／マウス）での負荷に対する保護（生存率）を示すグラフである。前記負荷は、免疫化から２１日後、３５日後または４９日後に行われた。

【発明を実施するための形態】

【0056】

概説
本発明は、毒素Ａの１９反復単位（ＲＵ）および毒素Ｂの２３反復単位（ＲＵ）またはそのペプチド断片もしくは変異体を含む、単離ポリペプチドＣ−ＴＡＢ．Ｇ５（配列番号２）またはその誘導体、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１（配列番号４）の使用を含む、Ｃ．ディフィシル毒素ＡおよびＢに対する保護的および／または治療的免疫反応を誘導するための免疫原性組成物を提供する。

【0057】

本発明はまた、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドを生成する方法、ならびに哺乳動物におけるＣＤＡＤの予防および／または治療に有用な組成物（例えばワクチン）を調製する方法を提供する。以下の説明は、組み換え単離ポリペプチドの構築、発現、および精製、特異的免疫反応を誘導するため、および対象における保護を評価するための抗原としてのその使用のさらなる詳細および例を提供する。対象は、動物または人間であってもよい。

【0058】

本発明の方法および組成物における使用のためのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドは、いくつかの標準的方法のいずれかを使用して調製され得る。例えば、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１は、標準的組み換えＤＮＡ技術を使用して生成されてもよく、好適な宿主細胞は、毒素コード核酸断片の一部を含有する適切な発現ベクターにより形質転換される（例えば、Ｄｏｖｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８：４８０−８（１９９０）、およびＢａｒｒｏｓｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １８：４００４（１９９０）を参照されたい）。広範な発現系のいずれも、組み換えポリペプチドを生成するために使用され得る。Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１は、原核宿主細胞（例えば、大腸菌または桿菌等の細菌）または真核宿主細胞（例えば、酵母細胞、哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ１、ＮＩＨ３Ｔ３、もしくはＪＥＧ３細胞）、または昆虫細胞（例えば、ヨトウガ（ＳＦ９）細胞））において産生され得る。そのような細胞は、例えば、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から入手可能である。形質転換およびトランスフェクションの方法、ならびに発現ベクターの選択は、選択される宿主系に依存する。形質転換およびトランスフェクションの方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＩＳＢＮ：０４７１３２９３８Ｘにより説明されている。また、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１、特に短鎖断片は、化学合成により、例えば、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９８４，２ｎｄ ｅｄ．，Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ，Ｅｄｓ．，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．において説明されている方法、または標準的ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳方法により生成され得る。

【0059】

Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１配列に加えて、本発明は、機能的に活性で免疫原性であるその変異体を提供する。変異体は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１と同じレベルの免疫原性を有してもよい。変異体は、配列番号２または配列番号４と比較してアミノ酸置換、欠失、または挿入を有してもよい。Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５もしくはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１またはその変異体をコードする遺伝子は、標準的方法を使用して作製され得る（以下を参照されたく、また、例えば Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，上記参照も参照されたい）。

【0060】

Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１配列に加えて、本発明は、追加的な反復を含むＣ−ＴＡＢ．Ｇ５のさらなる誘導体を提供する。例として、融合タンパク質、Ｃ−ＴＡＢＮＣＴＢ（配列番号１８、配列番号１７によりコードされる）は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５と同様に、ＣＴＡの１９反復単位（アミノ酸２２７２〜２７１０）、ＣＴＢの２３反復単位（アミノ酸１８５０〜２３６６）、およびＣＴＢのＣ末端に融合したＣＴＢのさらなる追加的な１０反復（アミノ酸１８３４〜２０５７）を含む。さらなる変異体、Ｃ−ＴＡＤＣＴＢ融合タンパク質（配列番号２０、配列番号１９によりコードされる）は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５（ＣＴＡの１９反復およびＣＴＢの２３反復）、ならびにＣ−ＴＡＢ．Ｇ５のＣ末端に融合したＣＴＢの追加的な２４反復単位（アミノ酸１８３４〜２３６６）を含む。また、変異体は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５の追加的な複製またはその一部を含んでもよい。例えば、Ｃ−ＴＡＤＣＴＢは、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５に存在するＣＴＢの反復単位の二重部分を含んでもよい。

【0061】

本発明は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１をコードする核酸を細菌宿主細胞に導入すること、およびＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１を発現させることを含む、大腸菌等の細菌系における高レベル発現Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１のための方法を提供する。

【0062】

さらに、本発明のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドは、アジュバントに共有結合または架橋してもよい（例えば、Ｃｒｙｚ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ １３：６７−７１（１９９４）；Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４１：１４９５−５０１（１９８８）およびＣｚｅｒｋｉｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５７：１０７２−７７（１９８９）を参照されたい）。

【0063】

本発明は、ＣＤＡＤから保護し、それに対する治療を提供する、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドを含むワクチンを提供する。本発明のワクチンは新規な抗体を含み、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、皮下（ＳＣ）、経口、経鼻、口腔、または直腸経路で送達され得る。ワクチンは、免疫保護を提供するか、または受動免疫化のための抗体を誘導し得る。

【0064】

本発明のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドは、ＣＤＡＤに対し免疫化するためのワクチンを提供する。本発明のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドまたはその変異体は、Ｃ．ディフィシル関連疾患、例えばＣＤＡＤに対する保護範囲を、これまで知られていない、または公開されていないレベルまで拡大することを目標とする組合せワクチン候補である。Ｃ．ディフィシル関連疾患からの保護またはその重症度の低下を提供する単一ワクチンのこの概念は、世界規模での公衆衛生管理、特に流行病の重症度の低減（例えば、養護施設、クルーズ船）における独特の進歩を示す。

【0065】

本明細書において使用される場合、「毒素Ａタンパク質」または「毒素Ｂタンパク質」とは、ＣＤＡＤの主な原因であるＣ．ディフィシルの毒性タンパク質を指す。毒素Ａおよび毒素Ｂは、Ｃ末端結合ドメインにおける免疫原性を担う複数の反復単位を含む。

【0066】

本明細書において使用される場合、「野生型」または「天然」とは、宿主細胞において内因的に見られるような核酸またはアミノ酸配列を含む全長タンパク質を指す。

【0067】

本明細書において使用される場合、「クロストリジウム・ディフィシル関連疾患」、「クロストリジウム・ディフィシル関係疾患」、「クロストリジウム・ディフィシル−関連疾患」、「クロストリジウム・ディフィシル毒素媒介疾患」、「クロストリジウム・ディフィシル感染」および「ＣＤＡＤ」という用語は、直接的または間接的に、クロストリジウム・ディフィシルの感染により引き起こされる疾患を指す。

【0068】

「抗原」は、生物の免疫細胞に提示されると特定の免疫反応を誘導する物質を指す。例えば、抗原は、核酸、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、糖タンパク質、炭水化物、脂質、糖脂質、リポタンパク質、融合タンパク質、リン脂質、またはそれらの組合せの複合体であってもよい。抗原は、Ｂ細胞受容体（すなわち、Ｂ細胞の膜上の抗体）またはＴ細胞受容体により認識される、単一の免疫原性エピトープ、または複数の免疫原性エピトープを含んでもよい。抗原は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）または病原菌もしくは微生物全体、例えば細菌もしくはビリオン等として提供されてもよい。抗原は、不活性または弱毒化生ウイルスであってもよい。抗原は、細胞全体もしくは膜のみからの、抽出物もしくは溶解物から得られてもよく、または、抗原は、化学合成または組み換え手段により生成されてもよい。抗原は、単独で、またはアジュバントと共に投与され得る。単一の抗原分子は、抗原およびアジュバント特性の両方を有してもよい。

【0069】

「アジュバント」とは、おそらくは抗原提示細胞の活性化による抗原特異的免疫反応を特異的または非特異的に増強するために使用される任意の物質を意味する。アジュバントの例は、油エマルジョン（例えば、完全または不完全フロイントアジュバント）、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ不完全Ｓｅｐｐｉｃアジュバント、例えばＩＳＡ、水中油エマルジョンアジュバント、例えばＲｉｂｉアジュバント系、ムラミールジペプチドを含有するシンタックスアジュバント製剤、アルミニウム塩アジュバント（ＡＬＵＭ）、ポリカチオン性ポリマー、特にポリカチオン性ペプチド、特にポリアルギニンまたは少なくとも２つのＬｙｓＬｅｕＬｙｓモチーフを含有するペプチド、特にＫＬＫＬＬＬＬＬＫＬＫ、定義された塩基コンテクスト内に非メチル化シトシン−グアニンジヌクレオチド（ＣｐＧ）を含有する免疫刺激オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）（例えばＷＯ９６／０２５５５に記載）またはイノシンおよびシチジンに基づくＯＤＮ（例えばＷＯ０１／９３９０３に記載）またはデオキシイノシンおよび／もしくはデオキシウリジン残基を含有するデオキシ核酸（ＷＯ０１／９３９０５およびＷＯ０２／０９５０２７に記載）、特にＯｌｉｇｏ（ｄＩｄＣ）_１３（ＷＯ０１／９３９０３およびＷＯ０１／９３９０５に記載）、神経活性化合物、特にヒト成長ホルモン（ＷＯ０１／２４８２２に記載）、またはそれらの組み合わせ、ケモカイン（例えば、デフェンシン １もしくは２、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１−α、ＭＩＰ−２、インターロイキン−８、またはサイトカイン（例えば、インターロイキン−１β、−２、−６、−１０もしくは−１２；インターフェロン−γ；腫瘍壊死因子−α；または顆粒球単球コロニー刺激因子）（Ｎｏｈｒｉａ ａｎｄ Ｒｕｂｉｎ，１９９４において考察されている）、ムラミールジペプチド変異体（例えば、ムラブチド、トレオニル−ＭＤＰまたはムラミールトリペプチド）、ＭＤＰの合成変異体、熱ショックタンパク質または変異体、森林型熱帯リーシュマニアＬｅＩＦの変異体（Ｓｋｅｉｋｙ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１： １５２７−１５３７）、トリプシン切断部位での変異体を含む細菌ＡＤＰ−リボシル化外毒素の非毒性変異体（ｂＡＲＥ）（Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｌｅｍｅｎｔｓ，（１９９５）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６３ （５）：１６１７-１６２３）および／または作用性ＡＤＰ−リボシル化（Ｄｏｕｃｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７）または化学的解毒ｂＡＲＥ（トキソイド）、ＱＳ２１、Ｑｕｉｌｌ Ａ、Ｎ−アセチルムラミール−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミル−Ｌ−アラニン−２−［１，２−ジパルミトイル−ｓ−グリセロ−３−（ヒドロキシホスホリルオキシ）］エチルアミド（ＭＴＰ−ＰＥ）ならびに代謝可能な油および乳化剤を含有する組成物を含む。アジュバントは、抗原の経路と同じ経路により、または抗原の経路とは異なる経路により、抗原と共に投与されてもよく、または単独で投与されてもよい。単一のアジュバント分子は、アジュバントおよび抗原特性の両方を有してもよい。

【0070】

「効果的な量」とは、抗原に関しては、抗原特異的免疫反応を誘導もしくは向上させる、または薬物に関しては、状態を治療もしくは診断するのに十分な治療薬剤の量を意味する。免疫反応のそのような誘導は、例えば免疫保護、脱感作、免疫抑制、自己免疫疾患の調整、癌の免疫学的監視の増強、または確立された感染性疾患に対する治療的ワクチン接種等の治療を提供し得る。治療は、治癒、改善、または予防を含む。

【0071】

「核酸」とは、単一のデオキシリボ核酸塩基もしくはリボ核酸、またはホスホジエステル結合により繋がったその配列を意味する。

【0072】

「治療薬剤」とは、疾患の処置、疾患の症状の軽減、疾患の予防、または疾患の診断において使用され得る任意の分子を意味する。例えば、治療薬剤は、抗原または薬物であってもよい。

【0073】

「対象」とは、動物を意味する。対象は、任意の脊椎動物を含む任意の動物であってもよい。対象は、家畜、実験動物（ラット、ハムスター、スナネズミ、もしくはマウス等のげっ歯類を含むがこれらに限定されない）またはペット動物であってもよい。一実施形態において、動物は、哺乳動物であってもよい。哺乳動物の例は、人間、霊長類、有袋類、イヌ、サル、げっ歯類、ネコ、類人猿、クジラ、イルカ、ウシ、ブタ、およびウマを含む。対象は、疾患の処置を必要としていてもよく、または予防的処置を必要としていてもよい。

【0074】

本明細書において使用される場合、「抗体」という用語は、特定の抗原に特異的に結合する能力を有する免疫グロブリン分子または免疫グロブリン分子の断片を意味する。抗体は、免疫学の分野における当業者に周知である。本明細書において使用される場合、「抗体」という用語は、全長抗体分子だけでなく、抗原結合能力を保持する抗体分子の断片も意味する。そのような断片はまた、当該技術分野において周知であり、通常ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方で使用される。具体的には、本明細書において使用される場合、「抗体」という用語は、全長免疫グロブリン分子だけでなく、周知の活性断片Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、およびＦｄ等の抗原結合活性断片も意味する。

【0075】

本明細書において使用される場合、「変異体」は、野生型ポリペプチドとは異なるタンパク質および／またはポリペプチドおよび／またはペプチドを含んでもよく、１つ以上の残基が機能的に類似した残基で保存的に置換されており、さらにこれは、野生型ポリペプチドの実質的に同一の機能的特性を示す。保存的置換の例は、１つの非極性（疎水性）残基の別の残基（例えばイソロイシン、バリン、ロイシンもしくはメチオニン）別の残基との置換、１つの極性（親水性）残基の別の残基との置換（例えばアルギニンとリシンとの間、グルタミンとアスパラギンとの間、グリシンとセリンとの間）、１つの塩基性残基の別の残基（例えばリシン、アルギニンもしくはヒスチジン）との置換、または１つの酸性残基の別の残基（例えばアスパラギン酸もしくはグルタミン酸）との置換を含む。変異体は、本明細書に記載のポリペプチドの機能的特性も示す、本発明のポリペプチドに実質的に同一の三元構造を有する任意のポリペプチドを含んでもよい。変異体は、野生型ポリペプチドの突然変異であってもよい。

【0076】

本明細書において使用される場合、「治療」は、個人または細胞の自然経過を改変する試みにおいて使用される任意の種類の干渉を含み得る。治療は、例えば、単独の、または当該技術分野において一般的に知られている他の治療法と組み合わせた薬学的組成物の投与を含み得るが、これに限定されない。「治療」は、予防的に、または病理学的事象の開始後に行われてもよい。

【0077】

本明細書において使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、活性成分と組み合わされると、成分が生物活性を保持するのを可能にし、対象の免疫系と非反応性である任意の材料を含み得る。薬学的に許容される担体および／または賦形剤は、緩衝剤、安定剤、希釈剤、保存剤、および可溶化剤を含み得る。一般に、担体または賦形剤の性質は、使用されている具体的な投与様式に依存する。例えば、非経口製剤は、通常、ビヒクルとして、水、生理食塩水、平衡塩溶液、デキストロース水溶液、グリセロール等の薬学的および生理学的に許容される流体を含む注射液を含む。固体組成物（例えば、粉末、ピル、錠剤、またはカプセル形態）の場合、従来の非毒性固体担体は、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムを含み得る。生物学的に中性の担体に加えて、投与される薬学的組成物は、微量の非毒性補助物質、例えば湿潤または乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝剤等、例えば酢酸ナトリウムまたはモノラウリン酸ソルビタンを含有してもよい。

【0078】

本明細書において使用される場合、「融合」は、本発明に従い配置される順番またはコンテクストにおいて、互いに自然に関連して見られない配列を含む核酸およびポリペプチドを示し得る。融合核酸またはポリペプチドは、核酸またはポリペプチドの自然配列全体を含むとは限らない。融合タンパク質は、通常のペプチド結合により互いに結合した、２つ以上のセグメントを有する。融合核酸は、通常のホスホジエステル結合により互いに結合した、２つ以上のセグメントを有する。
単離ポリペプチド

【0079】

本発明は、Ｃ．ディフィシル毒素Ａの１９反復単位およびＣ．ディフィシル毒素Ｂの２３反復単位を含む、それぞれ配列番号２および配列番号４に記載のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドを提供する。Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５のホモログ、例えばＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸だけＣ−ＴＡＢ．Ｇ５と異なってもよい。Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１ポリペプチドは、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５と同じ毒素ＢのＣ末端ドメインを含有するが、Ｃ．ディフィシル６３０株から得られる対応するＣ−ＴＡＢ．Ｇ５ポリペプチドのホモログであるＣ．ディフィシルＶＰＩ−１０４６３株から得られる毒素ＡのＣ末端ドメインを含有しない融合タンパク質であり、１５５〜１５６位において２個のアミノ酸だけ異なる。配列番号３に記載されるＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１コード配列は、大腸菌宿主細胞内での改善された発現のためにコドン最適化された。本発明のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドは、Ｃ．ディフィシル毒素Ａおよび毒素Ｂの毒性作用の中和に効果的となり得る。

【0080】

毒素Ａおよび毒素Ｂは、それぞれＣ．ディフィシル株６３０のｔｒｄＡ（配列番号５）およびｔｒｄＢ（配列番号７）遺伝子によりコードされる。構造的には、Ｃ．ディフィシル毒素は、ＡＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼドメイン、システインプロテアーゼドメイン、疎水性領域、および受容体結合領域を含む。Ｃ末端ドメインは、極めて反復的な単位（ＲＵ）（組み合わせ反復オリゴペプチド（ＣＲＯＰＳ）としても知られる）を含有する。ＲＵは、長鎖または短鎖オリゴペプチドであってもよく、反復するコンセンサスＹＹＦモチーフを有する２０から５０個のアミノ酸を含み得る。ＲＵは、クラスタとしてグループ化される。一例として、毒素Ａ、野生型ｔｒｄＡ遺伝子（配列番号５）によりコードされた株６３０（配列番号６）は、３９個のＲＵを有する。３９個のＲＵは、８個のクラスタにグループ化される。毒素Ｂ、野生型ｔｒｄＢ遺伝子（配列番号７）によりコードされた株６３０（配列番号８）は、５個のクラスタにグループ化される２４個のＲＵを含有する。以下の表１および２は、ｔｒｄＡ遺伝子およびｔｒｄＢ遺伝子によりコードされたＣ．ディフィシル毒素Ａおよび毒素ＢにおけるＲＵのそれぞれのアミノ酸位置を示す。

【0081】

表１：毒素Ａ反復単位（ＡＲＵ）

【表1】

【0082】

表２：毒素Ｂ反復単位（ＢＲＵ）

【表2】

【0083】

したがって、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５およびＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドは、それぞれ、Ｃ．ディフィシル毒素ＡのＣ末端ドメインからの１９ＲＵ、およびＣ．ディフィシル毒素ＢのＣ末端ドメインからの２３ＲＵを含む。Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１は、配列番号８の毒素Ｂアミノ酸１８５０〜２３６６に融合した配列番号６の毒素Ａアミノ酸２２７２〜２７１０を含む。Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドは、それぞれ、配列番号２および配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む。

【0084】

また、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドにおける各ＲＵは、Ｃ．ディフィシル毒素Ａまたは毒素Ｂの変異体からのものであってもよい。Ｃ−ＴＡＢ単離ポリペプチドにおけるこれらのＲＵはまた、Ｃ．ディフィシル毒素Ａまたは毒素Ｂの自然発生物または変異体の組み合わせであってもよい。

【0085】

Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドにおけるＲＵは、長鎖ＲＵおよび短鎖ＲＵを含み、長鎖ＲＵおよび短鎖ＲＵは、クラスタとして配列される。本発明のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドは、Ｃ．ディフィシル毒素Ａの３個から５個の短鎖ＲＵに続く１個の長鎖ＲＵの４個のクラスタ、およびＣ．ディフィシル毒素Ｂの３個から５個の短鎖ＲＵに続く１個の長鎖ＲＵの５個のクラスタを含む。

【0086】

短鎖および長鎖ＲＵは、保存されたモチーフを含有する。短鎖反復単位は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６個のアミノ酸を含んでもよい。各短鎖反復単位は、ＹＹＦ、ＦＹＦ、ＹＦＦ、ＦＹＩ、またはＨＹＦ等の保存されたチロシンモチーフを含んでもよい。短鎖反復単位は、続く反復単位が長鎖反復単位である場合、チロシンモチーフの前にアスパルテート／ヒスチジン残基をさらに含んでもよい。長鎖反復単位は、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５個のアミノ酸を含んでもよい。各長鎖反復単位は、ＦＥＹＦ、ＦＫＹＦ、またはＹＫＹＦ等のチロシン反復モチーフを含んでもよい。

【0087】

本発明において、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドの毒素Ａおよび毒素Ｂ部分は、直接互いに融合していてもよい。毒素Ａおよび毒素Ｂ部分は、リンカー領域により隔てられていてもよい。リンカー領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１から１５、２０から３０、４０、４５、または５０個のアミノ酸を含んでもよい。Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドにおける各毒素反復単位が、その発現および折り畳まれた形状において、潜在的エピトープを最適に暴露し、その免疫原性を保持するように位置付けられるように、リンカー領域は、毒素Ａおよび毒素Ｂ部分の位置付けを改変するために適合されてもよいことが、当業者に認識される。Ｃ−ＴＡＢ単離ポリペプチドにおけるＲＵおよびクラスタもまた、リンカーにより隔てられていてもよい。一実施形態において、リンカーは、ペプチドＲＳＭＨ（配列番号２または配列番号４の４３９〜４４２）を含む。

【0088】

本発明のＣ−ＴＡＢ単離ポリペプチドは、配列番号２または配列番号４と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性または配列類似性を有してもよい。当該技術分野において知られているように、２つのポリペプチドまたはポリヌクレオチドの間の「類似性」は、１つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドのアミノ酸またはヌクレオチド配列およびその保存されたヌクレオチドまたはアミノ酸置換を、第２のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列と比較することにより決定される。また、２つのポリペプチドまたは２つのポリヌクレオチド配列の２つの鎖の間の照合の同一性により決定される、そのような配列の間の配列関連性の程度を意味する「同一性」が、当該技術分野において知られている。同一性および類似性は共に、容易に計算され得る（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１）。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の間の同一性および類似性を測定するいくつかの方法が存在するが、「同一性」および「類似性」という用語は、当業者に周知である（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１；およびＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）。２つの配列の間の同一性または類似性を決定するために一般的に使用される方法は、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ，Ｍａｒｔｉｎ Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９４およびＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．４８：１０７３（１９８８）において開示されるものを含むが、これらに限定されない。

【0089】

本発明のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドは、免疫原性である。例えば、本発明のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドは、対応する細菌毒素Ａの免疫活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％を有してもよく、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドは、対応する細菌毒素Ｂの免疫活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％を有してもよい。本発明のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドは、ＣＤＡＤの症状の治療、予防、または軽減のためのワクチンとして使用され得る。

【0090】

また、本発明のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドは、それぞれ配列番号２または配列番号４を有するＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドの変異体を含む。変異体は、単離ポリペプチドの活性、機能または形状に対する影響が僅かである、または影響を有さないアミノ酸挿入、置換および／または欠失を有してもよい。そのような置換の例は、１つの非極性残基の別の残基との置換、１つの極性残基の別の残基との置換、１つの塩基性残基の別の残基との置換、または１つの酸性残基の別の残基との置換を含む。Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチド変異体は、さらに、天然毒素Ａまたは毒素Ｂの細胞外ドメインのアミノ酸配列と比較して、ポリペプチドの活性、機能および／または構造に対する影響が僅かであるアミノ酸の挿入、置換および／または欠失を含んでもよい。当業者には、非天然アミノ酸が使用されてもよいことが認識される。非天然アミノ酸は、例えば、ベータ−アラニン（ベータ−Ａｌａ）、または他のオメガ−アミノ酸、例えば３−アミノプロピオン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸（２，３−ｄｉａＰ）、４−アミノ酪酸等、アルファ−アミンイソ酪酸（Ａｉｂ）、サルコシン（Ｓａｔ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、シトルリン（Ｃｉｔ）、ｔ−ブチルアラニン（ｔ−ＢｕＡ）、ｔ−ブチルグリシン（ｔ−ＢｕＧ）、Ｎ−メチルイソロイシン（Ｎ−ＭｅＩｌｅ）、フェニルグリシン（Ｐｈｇ）、およびシクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、システイン酸（Ｃｙａ）２−ナフチルアラニン（２−Ｎａｌ）；１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）；ベータ−２−チエニルアラニン（Ｔｈｉ）；ならびにメチオニンスルホキシド（ＭＳＯ）を含む。

【0091】

本発明のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、様々な宿主細胞における発現を向上させるようにコドン最適化されてもよい。コドン最適化は、対象宿主細胞におけるタンパク質発現を向上させるために、天然配列の１つ以上のコドンを、その宿主細胞の遺伝子、または細胞が由来する宿主の遺伝子においてより頻繁に使用されるコドンで置き換えることにより、ヌクレオチド配列を変更することを指す。様々な種が、特定のアミノ酸のある特定のコドンに対する特定の偏りを示す。本発明は、大腸菌における向上した発現のために、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を提供する。

【0092】

本発明のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドは、任意の既知の技術により調製され得る。例えば、単離ポリペプチドは、遺伝子操作により発現され得る。例として、組み換えＤＮＡの翻訳である。Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドはまた、合成的に調製され得る。例として、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドは、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（Ｊ．Ａｍ Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４）（参照により本明細書に組み入れられる）により最初に説明された固相合成技術を使用して合成され得る。他のポリペプチド合成技術は、例えば、Ｋｅｎｔら（１９８５）のＳｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｅｄｓ．Ａｌｉｔａｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，２９５−３５８．において見出すことができる。

【0093】

本発明のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドは、実質的に純粋な形態で単離する、または得ることができる。実質的に純粋とは、タンパク質および／またはポリペプチドおよび／またはペプチドが、自然またはｉｎ ｖｉｖｏシステムにおいて共に見出すことができる他の物質を、その使用目的のために現実的および適切な程度まで実質的に含まないことを意味する。具体的には、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドは、例えば、抗体生成、配列決定、または薬学的調製物の生成において有用となるように、十分に純粋であり、宿主細胞の他の生物学的構成物質を十分に含まない。当該技術分野において周知の技術により、実質的に純粋なポリペプチドは、本明細書に開示される核酸およびアミノ酸配列に照らして生成され得る。本発明の実質的に精製された単離ポリペプチドは、薬学的調製物中の薬学的に許容される担体と混合され得るため、単離ポリペプチドは、調製物のある特定の重量パーセントのみを占めることができる。それにもかかわらず、単離ポリペプチドは、生体系内で関連し得る物質から実質的に分離されているという点で、実質的に純粋である。

【0094】

本発明は、さらに、追加的なポリペプチドを含む単離Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドを提供する。追加的なポリペプチドは、より大きなポリペプチドの断片であってもよい。一実施形態において、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドに融合した、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の追加的なポリペプチドがある。いくつかの実施形態において、追加的なポリペプチドは、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドのアミノ末端に対して融合している。他の実施形態において、追加的なポリペプチドは、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドのカルボキシル末端に対して融合している。さらなる実施形態において、追加的なポリペプチドは、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドに隣接している。さらなる実施形態において、追加的なポリペプチドは、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドの毒素Ａ部分と毒素Ｂ部分との間に分散している。

【0095】

いくつかの実施形態において、追加的なポリペプチドは、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドの分泌または細胞内局在の誘導を補助する。そのようなポリペプチドは、「シグナル配列」と呼ばれる。分泌シグナルは、例えば、共に参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，２９１，２１２号および米国特許第５，５４７，８７１号において説明されている。分泌シグナル配列は、分泌ペプチドをコードする。分泌ペプチドは、細胞からのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１の分泌を誘導するように作用するアミノ酸配列である。分泌ペプチドは、一般に、疎水性アミノ酸のコアを特徴とし、典型的には、新たに合成されたタンパク質のアミノ末端に見られる（但しこれに限らない）。分泌ペプチドは、分泌中に、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドから切断されてもよい。分泌ペプチドは、分泌経路を通過する際に成熟タンパク質からのシグナルペプチドの切断を可能とするプロセシング部位を含有してもよい。プロセシング部位は、シグナルペプチド内にコードされてもよく、または、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発により、シグナルペプチドに追加されてもよい。分泌シグナル配列は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１の分泌を可能とするための複雑な一連の翻訳後プロセシングステップに必要となり得る。シグナル配列は、開始コドンのすぐ後に続いてもよく、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１のアミノ末端部でシグナルペプチドをコードする。シグナル配列は、停止コドンに先行してもよく、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１のカルボキシ末端部でシグナルペプチドをコードする。ほとんどの場合、シグナル配列は、シグナルペプチダーゼと呼ばれる特定のプロテアーゼにより切断される。分泌シグナル配列の例は、ｏｍｐＡ、ｐｅｌＢ、およびＳＴ ｐｒｅ−ｐｒｏを含むが、これらに限定されない。

【0096】

いくつかの実施形態において、追加的なポリペプチドは、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドの安定化、構造および／または精製を補助する。いくつかの実施形態において、追加的なポリペプチドは、エピトープを含んでもよい。他の実施形態において、追加的なポリペプチドは、親和性タグを含んでもよい。例として、エピトープおよび／またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５もしくはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドへの親和性タグを含むポリペプチドの融合は、ポリペプチドの精製および／または同定を補助し得る。例として、ポリペプチドセグメントは、Ｈｉｓ−タグ、ｍｙｃ−タグ、Ｓ−ペプチドタグ、ＭＢＰタグ（マルトース結合タンパク質）、ＧＳＴタグ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）、ＦＬＡＧタグ、チオレドキシンタグ、ＧＦＰタグ（緑色蛍光タンパク質）、ＢＣＣＰ（ビオチンカルボキシル担体タンパク質）、カルモジュリンタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ＨＳＶ−エピトープタグ、Ｖ５−エピトープタグ、およびＣＢＰタグであってもよい。そのようなエピトープおよび親和性タグの使用は、当業者に知られている。

【0097】

さらなる実施形態において、追加的なポリペプチドは、ポリペプチドの切断のための部位を含むＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドを提供し得る。一例として、ポリペプチドは、ペプチド結合の加水分解により切断され得る。いくつかの実施形態において、切断は、酵素により行われる。いくつかの実施形態において、切断は、細胞内で生じる。他の実施形態において、切断は、切断酵素の人為的操作および／または人為的導入により生じる。例として、切断酵素は、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、トロンビン、および／または第Ｘａ因子を含み得る。切断は、ポリペプチドからのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドの容易な単離を可能とする。切断は、さらに、毒素Ｂ部分からの毒素Ａ部分の分離を可能とし得る。切断はまた、例えば発現タンパク質を精製するために使用されるエピトープの切断により、ポリペプチドに融合したＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドの他のポリペプチドからの単離を可能とし得る。

【0098】

Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドは、さらに、同じ有機合成ペプチドと共有しない追加の構造的変化、例えばアデニル化、カルボキシル化、グリコシル化、ヒドロキシル化、メチル化、リン酸化またはミリスチル化を有してもよい。これらの追加の構造的変形は、さらに、組み換え発現系の適切な選択により、選択または優先されてもよい。一方、融合ポリペプチドは、その配列が、有機合成の原理および慣習により延長されてもよい。

【0099】

本発明はまた、Ｃ．ディフィシル毒素Ａから得られるポリペプチド部分およびＣ．ディフィシル毒素Ｂから得られるポリペプチド部分を含む、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドをコードする核酸を提供する。核酸は、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはそのポリマーの一本鎖もしくは二本鎖形態を含んでもよい。本発明は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドをコードするリボ核酸を提供する。本発明はまた、ストリンジェントな条件下で、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドをコードする核酸およびその補体にハイブリダイズする核酸を提供する。ストリンジェントな条件とは、プローブとフィルタ結合核酸との間の相同性の程度を指し、ストリンジェンシーが高い程、プローブとフィルタ結合核酸との間のパーセント相同性が高い。ストリンジェントな洗浄のための温度は、核酸のＴｍに基づいて決定され得る（Ｇ／Ｃ含量に基づく）。ストリンジェントな条件は、さらに、標準クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）等の緩衝液中の塩の濃度に影響され得る。本発明は、配列番号１との約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列類似性または配列同一性を有する核酸を提供する。

【0100】

Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドは、さらに、リンカー領域、例えば約５０、４０、３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１アミノ酸残基未満のリンカーを含んでもよい。リンカーは、毒素Ａから得られたポリペプチド部分またはその一部、および毒素Ｂから得られたポリペプチド部分に、またはそれらの間に共有結合し得る。

【0101】

本発明は、それぞれ配列番号１または配列番号３に縮重するＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドをコードする核酸を提供する。遺伝子コードの縮重は、毒素Ａタンパク質、毒素Ｂタンパク質および／または対象単離ポリペプチドのヌクレオチド配列の多様性を可能とするが、依然として天然ＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを生成する。「コドン最適化」（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，５４７，８７１号に記載されている）として知られるこの手順は、そのような改変されたＤＮＡ配列を設計する手段を提供する。コドン最適化遺伝子の設計は、生物におけるコドン使用頻度、最近接頻度、ＲＮＡ安定性、２次構造形成の可能性、合成経路、およびその遺伝子の意図される将来のＤＮＡ操作を含む、様々な因子を考慮すべきである。特に、酵母発現系が使用される場合は酵母により、または昆虫細胞発現系が使用される場合は昆虫細胞により最も容易に認識されるコドンで所与の単離ポリペプチドをコードするコドンを改変するために、利用可能な方法が使用され得る。また、遺伝子コードの縮重は、同じアミノ酸配列がコードされ、多くの異なる様式で翻訳されることを可能にする。例えば、ロイシン、セリンおよびアルギニンは、それぞれ６個の異なるコドンによりコードされるが、バリン、プロリン、トレオニン、アラニンおよびグリシンは、それぞれ４個の異なるコドンによりコードされる。しかしながら、そのような同義コドンの使用頻度は、真核生物および原核生物の間のゲノム間で変動する。例えば、哺乳動物の間での同義コドン選択パターンは非常に類似しているが、酵母（例えばＳ．セレビシアエ）、細菌（例えば大腸菌）および昆虫（例えばキイロショウジョウバエ）等の進化的に遠い生物は、明確に異なるゲノムコドン使用頻度パターンを示す（Ｇｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，８，４９−６２（１９８０）；Ｇｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，９，４３−７４（１９８１）；Ｍａｒｏｙａｍａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１４，１５１−１９７（１９８６）；Ａｏｔａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１６，３１５−４０２（１９８８）；Ｗａｄａ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９ Ｓｕｐｐ．，１９８１−１９８５（１９９１）；Ｋｕｒｌａｎｄ，Ｃ．Ｇ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２８５，１６５−１６９（１９９１））。コドン選択パターンのこれらの差は、ペプチド延長速度の調整により、個々の遺伝子の全体的発現レベルに寄与するようである（Ｋｕｒｌａｎｄ，Ｃ．Ｇ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２８５，１６５−１６９（１９９１）；Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｓ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，３，２８９５−２８９８ （１９８４）；Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｍ．Ａ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２０７，３６５−３７７（１９８９）；Ｒａｎｄａｌｌ，Ｌ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ． Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７，３７５−３７９（１９８０）；Ｃｕｒｒａｎ，Ｊ．Ｆ．，ａｎｄ Ｙａｒｕｓ，Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２０９，６５−７７（１９８９）；Ｖａｒｅｎｎｅ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１８０，５４９−５７６（１９８４）、Ｖａｒｅｎｎｅ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ，Ｂｉｏｌ．，１８０，５４９−５７６（１９８４）；Ｇａｒｅｌ，Ｊ．−Ｐ．，Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．，４３，２１１−２２５（１９７４）；Ｉｋｅｍｕｒａ，Ｔ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１４６，１−２１（１９８１）；Ｉｋｅｍｕｒａ，Ｔ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５１，３８９−４０９（１９８１））。

【0102】

合成遺伝子のための好ましいコドン使用頻度は、組み換えタンパク質発現に使用されることが意図される細胞／生物の抽出（または可能な限り密接に関連した）ゲノムから得られる核遺伝子のコドン使用率を反映すべきである。

【0103】

同一性を決定するための好ましい方法は、試験される２つの配列の間の最大の一致を与えるように設計される。同一性および類似性を決定する方法は、コンピュータプログラムにおいて体系化される。２つの配列間の同一性および類似性を決定するための好ましいコンピュータプログラム方法は、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２（１）：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０））を含むが、これらに限定されない。上述の類似性または同一性の程度は、２つの配列間の同一性の程度として決定され、しばしば第２の配列からの第１の配列の誘導を示す。２つの核酸間の同一性の程度は、当該技術分野において知られたコンピュータプログラム、例えばＧＣＧプログラムパッケージ内に提供されるＧＡＰを使用して決定され得る（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３ （１９７０））。本発明のために２つの核酸間の同一性の程度を決定する目的で、ＧＡＰは、以下の設定で使用される：ＧＡＰ生成ペナルティ５．０およびＧＡＰ伸長ペナルティ０．３。

【0104】

また、本発明は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドをコードする核酸を含むベクターを提供する。ベクターは、異なる生成環境の間の移送のため、または宿主細胞における発現のための制限およびライゲーションにより、所望の配列が挿入されてもよいいくつかの核酸のいずれであってもよい。ベクターは、典型的にはＤＮＡで構成されるが、ＲＮＡベクターもまた利用可能である。ベクターは、プラスミドおよびファージミドを含むが、これらに限定されない。クローニングベクターは、宿主細胞内で複製することができ、さらに１つ以上のエンドヌクレアーゼ制限部位を特徴とするベクターであり、その部位では、ベクターは、測定可能な様式で切断されてもよく、また、新たな組み換えベクターが宿主細胞内で複製する能力を保持するように所望のＤＮＡ配列がライゲーションされてもよい。プラスミドの場合、所望の配列の複製は、プラスミドが宿主細菌内でコピー数の増加を示すと共に何回も、または宿主が有糸分裂により再生する前に宿主当たり１回だけ生じ得る。ファージの場合、複製は、溶解段階の間能動的に、または溶原段階の間受動的に生じ得る。

【0105】

ベクターは、さらに、プロモーター配列を含有してもよい。プロモーターは、通常、核酸の転写を開始するための部位を含有するコード領域の上流に位置する、非翻訳核酸を含んでもよい。また、プロモーター領域は、遺伝子発現の調節因子として機能する他の要素を含んでもよい。本発明のさらなる実施形態において、発現ベクターは、発現ベクターが組み込まれた細胞の選択を補助するための追加的領域を含有する。プロモーター配列は、多くの場合、転写開始部位によりその３’末端で境界され（包含的）、上流側（５’方向）に伸長して、バックグラウンドを超える検出可能なレベルで転写を開始するために必要な最少数の塩基または要素を含む。プロモーター配列内では、転写開始部位、およびＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメインが見られる。真核プロモーターは、必ずではないが、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含有することが多い。

【0106】

ベクターは、さらに、ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた細胞の同定および選択における使用に好適な、１つ以上のマーカー配列を含有してもよい。マーカーは、例えば、抗生物質または他の化合物に対する抵抗性または感受性を増加または低下させるタンパク質をコードする遺伝子、当該技術分野において知られている標準的アッセイによりその活性が検出可能な酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）をコードする遺伝子、および、形質転換またはトランスフェクトされた細胞、宿主、コロニーまたはプラークの表現型に明らかに影響する遺伝子を含む。好ましいベクターは、作用可能に結合したＤＮＡセグメント内に存在する構造遺伝子産物の自己複製および発現が可能なベクターである。

【0107】

発現ベクターは、調節配列に作用可能に結合し、ＲＮＡ転写産物として表現され得るように、所望の核酸が制限およびライゲーションにより挿入され得るベクターである。発現は、内在性遺伝子、導入遺伝子または細胞内のコード領域の転写および／または翻訳を指す。

【0108】

コード配列および調節配列は、コード配列の発現または転写を調節配列の影響または制御下に置くように共有結合している場合に、作用可能に結合している。コード配列が機能タンパク質に翻訳されることが望ましい場合は、５’調節配列におけるプロモーターの誘導がコード配列の転写をもたらす場合、および２つのＤＮＡ配列の間の結合の性質が、（１）フレームシフト突然変異の導入をもたらさない、（２）コード配列の転写を誘導するプロモーター領域の能力に干渉しない、または（３）タンパク質に翻訳される対応するＲＮＡ転写産物の能力に干渉しない場合、２つのＤＮＡ配列は作用可能に結合していると言われる。したがって、プロモーター領域が、得られる転写産物が所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳され得るようにそのＤＮＡ配列の転写をもたらすことができる場合、プロモーター領域はコード領域に作用可能に結合している。

【0109】

本発明のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドは、宿主細胞内にコード核酸を発現させることにより生成され得る。核酸は、宿主細胞に形質転換またはトランスフェクトされ得る。したがって、本発明のいくつかの態様は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドをコードする核酸の形質転換および／またはトランスフェクションを含む。形質転換は、外来または異種核酸の原核細胞の内部への導入である。トランスフェクションは、外来または異種核酸の真核細胞の内部への導入である。形質転換またはトランスフェクト核酸は、細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡ内に統合（共有結合）されてもよく、またはされていなくてもよい。例えば、原核細胞においては、形質転換核酸は、プラスミドまたはウイルスベクター等のエピソーム要素上で維持され得る。真核細胞に関しては、安定にトランスフェクトされた細胞は、トランスフェクト核酸が染色体複製を通して娘細胞により遺伝されるように染色体内に統合された細胞である。この安定性は、トランスフェクトされた核酸を含有する娘細胞の集団を含む細胞株またはクローンを確立する真核細胞の能力により示される。

【0110】

高等真核細胞培養を使用して、脊椎動物または昆虫を含む無脊椎細胞から本発明のタンパク質を発現させてもよく、その増殖手順は既知である（例えば、Ｋｒｕｓｅ ｅｔ ａｌ． （１９７３） Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。

【0111】

また、核酸の複製およびコードされたＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドの発現のための宿主細胞およびベクターも提供される。原核細胞または真核細胞の任意のベクターまたは宿主細胞が使用され得る。そのような目的のための多くのベクターおよび宿主細胞が、当該技術分野において知られている。所望の用途のための適切な組を選択することは、十分に当該技術の範囲内である。

【0112】

毒素Ａおよび毒素ＢをコードするＤＮＡ配列、またはその一部は、Ｃ．ディフィシル、ならびに当該技術分野において知られている他の既知の毒素Ａおよび毒素Ｂ発現原核生物から得られる、様々なゲノムまたはｃＤＮＡライブラリからクローニングされ得る。プローブベースの方法を使用してそのようなＤＮＡ配列を単離するための技術は、従来の技術であり、当業者に周知である。そのようなＤＮＡ配列を単離するためのプローブは、公開されたＤＮＡまたはタンパク質配列に基づいてもよい。代替として、Ｍｕｌｌｉｓら（米国特許第４，６８３，１９５号）およびＭｕｌｌｉｓ（米国特許第４，６８３，２０２号）（参照により本明細書に組み込まれる）により開示されているポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法が使用されてもよい。ライブラリの選択およびそのようなＤＮＡ配列の単離のためのプローブの選択は、当該技術のレベルの範囲内である。

【0113】

好適な宿主細胞は、原核生物または真核生物から得ることができる。好適な原核宿主は、シュードモナス属、例えば緑膿菌、大腸菌、ブドウ球菌属、例えば黄色ブドウ球菌およびＳ．エピデルミス、セラチア・マルセッセンス、桿菌属、例えば枯草菌および巨大菌、クロストリジウム・スポロゲネス、エンテロコッカス・フェカリス、マイクロコッカス属、例えばＭ．ルテウスおよびＭ．ロゼウス、ならびにプロテウス・ブルガリスを含む。高等真核細胞において本発明のポリペプチドを発現させるための好適な宿主細胞は、酵母、例えばサッカロマイセス（例えばＳ．セレビシアエ）；２９３（ヒト胎児腎臓）（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７３）；２９３Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）；２９３Ｔおよび変異体２９３Ｔ／１７（２９３ｔｓＡ１６０９ｎｅｏおよび変異体ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１１２６８）（ＳＶ４０ Ｔ抗原により形質転換されたヒト胎児腎臓）；ＣＯＳ−７（ＳＶ４０で形質転換されたサル腎臓ＣＶＩ系）（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）；ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓細胞）（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１０）；ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞）；マウスセルトリ細胞；ＣＶＩ（サル腎臓細胞）（ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）；ＶＥＲＯ７６（アフリカミドリザル腎臓細胞）（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８７）；ＨｅＬａ（ヒト子宮癌細胞）（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）；ＭＤＣＫ（イヌ腎臓細胞）（ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４）；ＢＲＬ３Ａ（バッファローラット肝臓細胞）（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２）；Ｗ１３８（ヒト肺細胞）（ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５）；ＨｅｐＧ２（ヒト肝細胞）（ＨＢ８０６５）；ならびにＭＭＴ ０６０６５２（マウス乳腺腫瘍）（ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）を含む。

【0114】

他の実施形態において、本発明は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドを含む単離ポリペプチドならびに追加的なポリペプチドをコードする核酸を提供する。融合ポリペプチドの産生のための真核発現系を構築するために有用なベクターは、適切な転写活性化配列、例えばプロモーターおよび／またはオペレーターに作用可能に結合した単離ポリペプチドをコードする核酸を含む。他の典型的な特徴は、適切なリボソーム結合部位、停止コドン、エンハンサー、ターミネーター、またはレプリコン要素を含み得る。これらの追加的な特徴は、従来のスプライス技術、例えば制限エンドヌクレアーゼ分解およびライゲーション等により、適切な部位（複数を含む）でベクターに挿入され得る。

【0115】

いくつかの実施形態において、追加的な核酸は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドをコードする核酸に融合されてもよい。融合核酸は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドのコドンリーディングフレームをシフトさせずに、精製および／または免疫原性および／または安定性を補助し得るポリペプチドをコードしてもよい。融合核酸は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドから切断されてもよい、またはされなくてもよい分泌配列をコードしてもよい。融合核酸は、発現ポリペプチドを大きく延長しなくてもよい。融合核酸は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドに対して、６０個未満の余分なアミノ酸をコードしてもよい。いくつかの実施形態において、融合核酸は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドをコードする核酸に続く。他の実施形態において、融合核酸は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドをコードする核酸に先行する。他の実施形態において、融合核酸は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドをコードする核酸に隣接している。

【0116】

いくつかの実施形態において、融合核酸は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドの精製を補助するポリペプチドをコードしてもよい。いくつかの実施形態において、融合核酸は、エピトープおよび／または親和性タグをコードする。精製を補助するポリペプチドの例は、Ｈｉｓ−タグ、ｍｙｃ−タグ、Ｓ−ペプチドタグ、ＭＢＰタグ、ＧＳＴタグ、ＦＬＡＧタグ、チオレドキシンタグ、ＧＦＰタグ、ＢＣＣＰ、カルモジュリンタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ＨＳＶ−エピトープタグ、Ｖ５−エピトープタグ、およびＣＢＰタグを含むが、これらに限定されない。他の実施形態において、融合核酸は、切断へと誘導される、または切断されやすい部位を有するＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドをコードしてもよい。一実施形態において、融合核酸は、酵素的切断の部位を含むポリペプチドをコードしてもよい。さらなる実施形態において、酵素的切断は、さらに他のポリペプチドからのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチド、および他の融合ポリペプチドセグメントの単離を補助し得る。例として、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドをコードする核酸とエピトープとの間に配置される酵素的切断部位をコードする中間核酸が、発現されたＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドおよびエピトープの後の分離を可能としてもよい。そのような部位はまた、毒素Ａ部分と毒素Ｂ部分との間に存在してもよい。

【0117】

また、本発明は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドの発現および提供を補助するように設計される発現系を提供する。発現系は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドをコードする核酸で形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を含んでもよい。宿主細胞は、原核生物であってもよい。原核生物は、大腸菌であってもよい。宿主細胞は、真核細胞であってもよい。

【0118】

発現系は、さらに、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドをコードする核酸での形質転換またはトランスフェクトに成功した宿主細胞の選択を補助する薬剤を含んでもよい。例えば、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドをコードする核酸は、さらに、抗生物質に抵抗する宿主細胞を補助する遺伝子、例えばカナマイシンまたはゲンタマイシンまたはアンピシリンまたはペニシリンに抵抗する遺伝子を発現してもよい。そのような抵抗性遺伝子は、当業者に知られているように、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドをコードする核酸を適切に組み込んだ宿主細胞の選択を可能とする。

【0119】

本発明の別の態様は、抗体の生成に関する。本発明に包含される抗体の例は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドで対象を免疫化することにより生成される抗体を含むが、これに限定されない。Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５もしくはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドでの免疫化により生成される抗体は、毒素Ａもしくは毒素Ｂに特異的に結合することができ、または、それらはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５もしくはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドと交差反応することができる。本発明のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドにより生成される抗体は、当該技術分野において周知の方法を使用して特性決定され得る。

【0120】

本発明のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドを使用することにより生成される抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｃ等）、キメラ抗体、二重特異性抗体、重鎖のみの抗体、ヘテロ結合抗体、単鎖（ＳｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、その変異体、抗体部分を含む単離ポリペプチド、ヒト化抗体、ならびに、抗体のグリコシル化変異体、抗体のアミノ酸配列変異体、および共有結合的に修飾された抗体を含む、必要な特性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾構造を包含し得る。好ましい抗体は、マウス、ラット、ヒト、ウサギ、イヌ、ブタ、ヒトコブラクダ、ラクダ、ラマ、ネコ、霊長類、または任意の他の源から得られる（キメラ、断片および／またはヒト化抗体を含む）。

【0121】

他の実施形態において、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドでの免疫化により生成された抗体は、次いで、当該技術分野において知られている方法によりヒト化される。ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンから得られる最小配列を含有する免疫グロブリン分子である。さらに他の実施形態において、特定のヒト免疫グロブリンタンパク質を発現するように操作された市販のマウスを使用することにより、完全ヒト抗体が得られる。他の実施形態において、抗体は、キメラである。キメラ抗体は、２つの異なる抗体からの特性を組み合わせた抗体である。キメラ抗体を調製する方法は、当該技術分野において知られている。

【0122】

他の実施形態において、抗体をコードするヌクレオチド配列が得られ、次いで発現または増殖のためにベクターにクローニングされる。別の実施形態において、抗体は、当該技術分野において知られている方法を使用して、組み換えにより作製および発現される。例として、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドは、これらの技術により組み換え抗体を単離するために、抗原として使用され得る。抗体は、宿主細胞内で組み換えにより抗体を発現させるために、遺伝子配列を使用して組み換えにより作製され得る。抗体の変異体および組み換え抗体を作製するための方法は、当該技術分野において知られている。

【0123】

他の実施形態において、抗体は、例えば天然毒素Ａもしくは毒素Ｂの単離もしくは精製、または生物学的試料もしくは検体中の天然毒素Ａもしくは毒素ＢもしくはＣ．ディフィシルの検出における使用のために、当該技術分野における従来の方法により担体に結合される。
組成物および製剤

【0124】

本発明はまた、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドを含む組成物を提供する。組成物は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物であってもよい。本発明の方法において使用される組成物は、一般に、限定ではなく例として、効果的な量の本発明のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５もしくはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチド（例えば、免疫反応を誘導するのに十分な量）、またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５もしくはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドに対する抗体（例えば、感染症を緩和する、感染症の症状を軽減する、および／もしくは感染症を予防するのに十分な量の中和抗体の量）を含む。薬学的組成物は、さらに、当該技術分野において知られている薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤を含んでもよい（一般に、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，（２００５）Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓを参照されたい）。

【0125】

本発明のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドは、ＣＤＡＤに罹患した人間および／または動物を免疫化または治療するための方法に使用され得る。したがって、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドは、薬学的組成物中で使用され得る。本発明の薬学的組成物は、さらに、薬学的に許容される担体および／または賦形剤を包含し得る。本発明において有用な薬学的に許容される担体および／または賦形剤は、従来のものであり、緩衝剤、安定剤、希釈剤、保存剤、および可溶化剤を含み得る。Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ （１９７５）は、本明細書において開示されるポリペプチドの薬学的送達に好適な組成物および製剤を説明している。一般に、担体または賦形剤の性質は、使用されている具体的な投与様式に依存する。例えば、非経口製剤は、通常、ビヒクルとして、水、生理食塩水、平衡塩溶液、デキストロース水溶液、グリセロール等の薬学的および生理学的に許容される流体を含む注射液を含む。固体組成物（例えば、粉末、ピル、錠剤、またはカプセル形態）の場合、従来の非毒性固体担体は、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムを含み得る。生物学的に中性の担体に加えて、投与される薬学的組成物は、微量の非毒性補助物質、例えば湿潤または乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝剤等、例えば酢酸ナトリウムまたはモノラウリン酸ソルビタンを含有してもよい。

【0126】

一実施形態において、薬学的組成物は、さらに、アジュバント等の免疫刺激性物質を含んでもよい。アジュバントは、投与方法に基づいて選択することができ、鉱物油系アジュバント、例えばフロイント完全および不完全アジュバント、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ不完全Ｓｅｐｐｉｃアジュバント、例えばＩＳＡ、水中油エマルジョンアジュバント、例えばＲｉｂｉアジュバント系、ムラミールジペプチドを含有するシンタックスアジュバント製剤、水酸化アルミニウムまたはアルミニウム塩アジュバント（ａｌｕｍ）、ポリカチオン性ポリマー、特にポリカチオン性ペプチド、特にポリアルギニンまたは少なくとも２つのＬｙｓＬｅｕＬｙｓモチーフを含有するペプチド、特にＫＬＫＬＬＬＬＬＫＬＫ、定義された塩基コンテクスト内に非メチル化シトシン−グアニンジヌクレオチド（ＣｐＧ）を含有する免疫刺激オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）（例えば、ＷＯ９６／０２５５５に記載）またはイノシンおよびシチジンに基づくＯＤＮ（例えばＷＯ０１／９３９０３に記載）またはデオキシイノシンおよび／もしくはデオキシウリジン残基を含有するデオキシ核酸（ＷＯ０１／９３９０５およびＷＯ０２／０９５０２７に記載）、特にＯｌｉｇｏ（ｄＩｄＣ）_１３（ＷＯ０１／９３９０３およびＷＯ０１／９３９０５に記載）、神経活性化合物、特にヒト成長ホルモン（ＷＯ ０１／２４８２２に記載）、またはそれらの組み合わせを含み得る。そのような組み合わせは、例えば、ＷＯ０１／９３９０５、ＷＯ０２／３２４５１、ＷＯ０１／５４７２０、ＷＯ０１／９３９０３、ＷＯ０２／１３８５７、ＷＯ０２／０９５０２７およびＷＯ０３／０４７６０２に記載のものに従う。好ましくは、アジュバントは、水酸化アルミニウムアジュバントである。

【0127】

許容される担体、賦形剤、または安定剤は、投与される用量および濃度で被投与者に対し非毒性である。担体、賦形剤または安定剤は、さらに緩衝剤を含んでもよい。賦形剤の例は、炭水化物（例えば単糖類および二糖類）、糖（例えばスクロース、マンニトール、およびソルビトール）、ホスフェート、シトレート、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸およびメチオニン）、保存剤（例えば、フェノール、ブタノール、ベンザノール；アルキルパラベン、カテコール、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、塩化ヘキサメトニウム、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、およびｍ−クレゾール）、低分子量ポリペプチド、タンパク質（例えば、血清アルブミンまたは免疫グロブリン）、親水性ポリマーアミノ酸、キレート剤（例えばＥＤＴＡ）、塩形成対イオン、金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質錯体）、ならびに非イオン性界面活性剤（例えばＴＷＥＥＮ（商標）およびポリエチレングリコール）を含むが、これらに限定されない。

【0128】

本発明の薬学的組成物は、さらに、所望の効果を向上および／または補完するように作用する追加的薬剤を含んでもよい。例として、サブユニットワクチンとして投与されている本発明のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドの免疫原性を向上させるために、薬学的組成物は、さらにアジュバントを含んでもよい。

【0129】

薬学的組成物の例は、免疫原性組成物であってもよい。本発明は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドを含む免疫原性組成物を提供する。免疫原性組成物は、さらに、哺乳動物における注射に好適な製剤中の薬学的に許容される担体もしくは他の担体および／または賦形剤を含んでもよい。免疫原性組成物は、免疫原性組成物が注射または別様に導入された場合に哺乳動物宿主において免疫反応を惹起する材料の任意の組成物である。免疫反応は、液性、細胞性、またはその両方であってもよい。ブースター効果は、同じ免疫原性組成物に対する哺乳動物宿主の後の暴露後の、免疫原性組成物に対する増加した免疫反応を指す。液性反応は、免疫原性組成物に対する暴露後の哺乳動物宿主による抗体の産生をもたらす。

【0130】

本発明の免疫原性組成物は、人間および他の動物を含む哺乳動物宿主における免疫反応を惹起する。免疫反応は、細胞依存的反応または抗体依存的反応またはその両方であってもよく、さらに、反応は、哺乳動物宿主における免疫記憶またはブースター効果を提供し得る。これらの免疫原性組成物は、ワクチンとして有用であり、Ｃ．ディフィシルの株による感染に対する、哺乳動物対象または宿主による保護反応を提供し得る。

【0131】

本発明は、さらに、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドをコードする核酸を構築して、微生物宿主においてＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチド構成成分を発現させ、宿主の培養物からＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドを回収し、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドを第２のタンパク質構成成分に複合化し、複合タンパク質および多糖類構成成分を回収することにより、免疫原性組成物を生成するための方法を含む。Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドをコードする核酸は、一定および安定な選択的圧力により宿主の成長を通して維持され得る。発現ベクターの維持は、選択的遺伝子型をコードする遺伝子配列の発現ベクターへの組込みによりもたらすことができ、微生物宿主細胞におけるその発現は、選択的発現型をもたらす。また、選択的遺伝子型配列は、条件致死突然変異を補完する遺伝子を含んでもよい。他の薬物耐性遺伝子または致死突然変異を補完する遺伝子等の他の遺伝子配列が、発現ベクター内に組み込まれてもよい。微生物宿主は、グラム陽性細菌、大腸菌等のグラム陰性細菌、酵母、糸状菌、哺乳動物細胞、昆虫細胞、または植物細胞を含み得る。

【0132】

また、本発明の方法は、約５０ｍｇ／リットル（培養物）を超えるレベル、約１００ｍｇ／リットルを超えるレベル、約５００ｍｇ／リットルを超えるレベル、または約１ｇ／リットルを超えるレベルの、宿主におけるＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドの発現のレベルを提供する。本発明はまた、タンパク質が、硫酸アンモニウム沈殿に続くイオン交換クロマトグラフィー等の、タンパク質の単離および回収の技術分野における当業者に知られた任意の数の方法により回収され得ることを提供する。

【0133】

本発明は、さらに、アミド化反応等の当業者に知られたいくつかの手段のうちの１つにより、タンパク質構成成分が第２のタンパク質構成成分に複合化されることを提供する免疫原性組成物を調製するための方法を含む。

【0134】

また、本発明は、ＣＤＡＤを治療および予防するための、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドを含む製剤を提供する。一実施形態において、製剤は、本発明のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチド、アジュバント、および薬学的に許容される担体を含んでもよい。別の実施形態において、製剤は、本発明のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５もしくはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドを含む、または本質的に１つ以上の本発明のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５もしくはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドからなる。製剤は、本発明のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドおよびアジュバントを含んでもよい。製剤は、さらに、追加的な抗体または薬物を含んでもよい。さらに、製剤は、１つ以上の薬物を含んでもよく、また単離ポリペプチドおよび／またはアジュバントに加えて１つ以上の薬物を含んでもよい。

【0135】

Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドを含む製剤は、液体または乾燥形態であってもよい。乾燥製剤は、容易に保存および輸送され得る。乾燥製剤は、ワクチンの製造場所からワクチン接種が行われる地点までに必要なコールドチェーンを打破する。代替として、製剤の乾燥活性成分自体が、抗体提示細胞により取り込まれ処理される固体微粒子形態を提供することによる改善であってもよい。これらの可能なメカニズムは、本発明またはその均等物の範囲を制限するように議論されず、本発明の作用に対する洞察を提供し、免疫化およびワクチン接種における本製剤の使用をガイドするように議論される。

【0136】

Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドの乾燥製剤は、微細または顆粒粉末、凍結乾燥粉末、均一膜、ペレット、および錠剤等の様々な形態で提供され得る。製剤には、空気乾燥、高温による乾燥、凍結乾燥、フリーズドライもしくは噴霧乾燥、固体基板上へのコーティングもしくは噴霧後の乾燥、固体基板上への振り掛け、急速冷凍に次ぐ真空下での低速乾燥、またはそれらの組み合わせが行われてもよい。異なる分子が製剤の活性成分である場合、それらは、溶液中で混合されてから乾燥されてもよく、または乾燥形態のみで混合されてもよい。

【0137】

液体または固体形態、例えば乾燥形態のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドを含む製剤は、同じもしくは離れた部位において、または同時もしくは頻繁な繰り返しの適用により１つまたはそれ以上のアジュバントが適用されてもよい。製剤は、製剤の投与が複数の抗原に対する免疫反応を誘導するように、他の抗原を含んでもよい。そのような場合、他の抗原は、異なる抗原に特異的な免疫反応を誘導するように、異なる化学構造を有してもよい。投与前に、少なくとも１つの抗原および／またはアジュバントが乾燥形態で維持されてもよい。後の貯蔵部からの液体の放出または製剤の乾燥成分を含有する貯蔵部への液体の進入は、少なくとも部分的にその成分を溶解する。

【0138】

また、固体（例えば、ナノメートルまたはマイクロメートル寸法の粒子）が製剤中に組み込まれてもよい。固体形態（例えば、ナノ粒子またはマイクロ粒子）は、活性成分の分散または可溶化を補助する、抗原提示細胞によりオプソニン化され得る基質への、アジュバント、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５もしくはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチド、またはその両方の結合点を提供する、あるいはそれらの組み合わせを提供することができる。シート、ロッド、またはビーズとして形成された多孔質固体からの製剤の持続放出は、デポー製剤として作用する。

【0139】

製剤の少なくとも１つの成分または構成成分（すなわち、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチド、アジュバント、または薬物）は、製剤の投与前に乾燥形態で提供されてもよい。この製剤はまた、従来の腸内、粘膜、または非経口免疫化技術と併せて使用されてもよい。

【0140】

Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドを含む製剤は、生物製剤およびワクチンの適切な規制当局（例えば、食品医薬品局、ＥＭＥＡ）に認可される無菌条件下で製造され得る。随意に、乾燥剤、賦形剤、安定剤、保湿剤、保存剤、またはそれらの組み合わせ等構成成分が、免疫学的に不活性であるとしても、製剤中に含まれてもよい。しかしながら、それらは、他の所望の特性または特徴を有し得る。

【0141】

薬学的製剤を製造するためのプロセスは周知である。製剤の構成成分は、薬学的に許容される担体またはビヒクル、および随意の添加剤（例えば、希釈剤、結合剤、賦形剤、安定剤、乾燥剤、保存剤、着色剤）の任意の組み合わせと組み合わされてもよい。固体担体の使用、および乾燥構成成分または免疫原性もしくはアジュバント活性の安定剤の可溶化を補助する賦形剤の添加が、好ましい実施形態である。一般に、Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６^ｔｈ Ｅｄ．（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００３）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２２^ｎｄ（Ｇｅｎｎａｒｏ，２００５，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，２^ｎｄ Ｅｄ．（様々な編集者、１９８９−１９９８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ）；およびＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｎｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ）を参照されたい。

【0142】

製薬産業において適正製造基準が知られており、政府機関（例えば食品医薬品局、ＥＭＥＡ）により規制されている。無菌液体製剤は、製剤の意図される構成成分を十分な量の適切な溶媒に溶解し、続いて汚染微生物を除去するための濾過により滅菌することにより調製され得る。一般に、製剤の様々な滅菌された構成成分を、基本的分散媒を含有する無菌ビヒクルに組み込むことにより、分散液が調製される。無菌であることが要求される固体形態の生成には、真空乾燥またはフリーズドライが使用され得る。

【0143】

一般に、固体剤形（例えば、粉末、顆粒、ペレット、錠剤）は、製剤の少なくとも１つの活性成分または構成成分から作製され得る。

【0144】

好適な錠剤化手順が知られている。また、製剤は、少なくとも１つの活性成分の固体形態をカプセル化する、または区画もしくはチャンバ内で液体から隔離することにより生成されてもよい。各用量のサイズおよび対象への投薬の間隔を使用して、錠剤、カプセル、区画またはチャンバの好適なサイズおよび形状を決定することができる。

【0145】

製剤は、人間または動物への投与に好適な薬学的に許容される組成物を提供するために、担体または好適な量のビヒクルと共に、効果的な量の活性成分（例えば、薬物、抗原およびアジュバント）を含有する。

【0146】

用量内の活性成分の相対量、例えばＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドの量、および投薬スケジュールは、対象（例えば、動物または人間）に対する有効な投与のために、適切に調節され得る。この調節はまた、対象の具体的な疾患または状態、および治療または予防が意図されるかどうかに依存し得る。対象への製剤の投与を単純化するために、各単位用量は、単一ラウンドの免疫化のための所定量の活性成分を含有する。

【0147】

加水分解および変質を含むポリペプチドの不安定性または分解のいくつかの場合が存在する。変質の場合、タンパク質の配置または三次元構造が乱され、タンパク質は、その通常の球状構造から広がる。自然の配置へのリフォールディングではなく、疎水性相互作用が分子同士の凝塊化（すなわち凝集）、または異常な配置へのリフォールディングを引き起こし得る。これらの結果のいずれも、免疫原性またはアジュバント活性の減退または喪失を伴い得る。そのような問題を低減または防止するために、安定剤が添加されてもよい。

【0148】

製剤、またはその生成における任意の中間体は、保護薬剤（すなわち、抗凍結剤および乾燥安定剤）で前処理され、次いで氷結晶形成を最小限化する冷却速度および最終温度に供されてもよい。抗凍結薬剤の適切な選択および事前に選択された乾燥パラメータの使用により、ほぼいずれの製剤も、好適な所望の最終用途のために凍結調製され得る。

【0149】

以下の議論において、賦形剤、安定剤、乾燥剤、および保存剤等の随意の添加剤は、その機能により説明されることを理解されたい。したがって、特定の化学物質は、賦形剤、安定剤、乾燥剤、および／または保存剤のある組み合わせとして作用し得る。そのような化学物質は、直接的に免疫反応を誘導しないため、免疫学的に不活性であるが、抗原またはアジュバントの免疫活性を向上させることにより、例えば、抗原もしくはアジュバントの改質、または乾燥および溶解サイクル中の変質を低減することにより、反応を増加させる。

【0150】

安定剤は、シクロデキストリンおよびその変異体を含む（米国特許第５，７３０，９６９号を参照されたい）。スクロース、マンニトール、ソルビトール、トレハロース、デキストラン、およびグリセリン等の好適な保存剤もまた、最終製剤を安定化するために添加され得る（Ｈｏｗｅｌｌ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ， １９８３）。非イオン性界面活性剤、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルクロン酸、Ｄ−グルクロン酸の塩、トレハロース、デキストラン、ヒドロキシエチルデンプン、およびそれらの混合物から選択される安定剤が、製剤に添加されてもよい。随意に血清アルブミンを含むアルカリ金属塩または塩化マグネシウムの添加は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドを安定化することができ、フリーズドライによりさらに安定性が向上され得る。Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドはまた、デキストラン、コンドロイチン硫酸、デンプン、グリコーゲン、インスリン、デキストリン、およびアルギニン酸塩からなる群から選択されるサッカリドと接触させることにより安定化され得る。添加され得る他の糖は、単糖類、二糖類、糖アルコール、およびそれらの混合物（例えば、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、スクロース、マルトース、ラクトース、マンニトール、キシリトール）を含む。ポリオールは、ポリペプチドを安定化することができ、水混和性または水溶性である。好適なポリオールは、マンニトール、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、トリメチルグリコール、ビニルピロリドン、グルコース、フルクトース、アラビノース、マンノース、マルトース、スクロース、およびそれらのポリマーを含む、ポリヒドロキシアルコール、単糖類および二糖類であってもよい。血清アルブミン、アミノ酸、ヘパリン、脂肪酸およびリン脂質、界面活性剤、金属、ポリオール、還元剤、金属キレート剤、ポリビニルピロリドン、加水分解ゼラチン、ならびに硫酸アンモニウムを含む様々な賦形剤もまた、ポリペプチドを安定化し得る。

【0151】

一例として、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチド製剤は、賦形剤または安定剤の好適な選択により、スクロース、トレハロース、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）およびポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）ミクロスフェア内で安定化され得る（Ｓａｎｃｈｅｚ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。スクロース、またはトレハロースは、非還元性サッカリドであり、したがってタンパク質等のアミノ基を有する物質とアミノカルボニル反応を引き起こさないため、添加剤として有利に使用され得る。スクロースまたはトレハロースは、サッカリド等の他の安定剤と組み合わされてもよい。

【0152】

さらに、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドを含む製剤は、例えば麻酔薬、鎮痛剤、抗炎症剤、ステロイド、抗生物質、抗関節炎薬、食欲減退薬、抗ヒスタミン剤、および抗新生物薬剤等の治療薬剤を含んでもよい。そのような治療薬剤の例は、リドカインおよび非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を含む。別の実施形態において、治療薬剤は、抗原およびアジュバントである。さらに別の実施形態において、抗原および／またはアジュバントを含む製剤が、別個であるが、例えば麻酔薬、鎮痛剤、抗炎症剤、ステロイド、抗生物質、抗関節炎薬、食欲減退薬、抗ヒスタミン剤、および抗新生物薬剤等の他の治療薬剤と共に適用されてもよい。好ましい実施形態において、抗生物質は、フィダキソマイシン、メトロニダゾールまたはバンコマイシンである。

【0153】

Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドを含む製剤は、例えば筋肉内等の様々な投与経路を介して送達され得る。

【0154】

ポリマーは、製剤に添加されてもよく、活性成分の賦形剤、安定剤、および／または保存剤として作用すると共に、乾燥形態の活性成分を溶解するために使用される溶液を飽和する活性成分の濃度を低減し得る。そのような低減は、ポリマーが、「空」の空間を充填することにより溶液の有効体積を低減するために生じる。したがって、抗原／アジュバントの量は、飽和溶液の量を低減することなく保存され得る。重要な熱力学的考慮は、飽和溶液中の活性成分が、より低濃度の領域に「駆動」されるという点である。溶液中では、ポリマーもまた製剤の可溶化された成分の抗原／アジュバント活性を安定化および／または保存することができる。そのようなポリマーは、エチレンまたはプロピレングリコール、ビニルピロリドン、ならびに０−シクロデキストリンポリマーおよびコポリマーを含む。

【0155】

投与に好適なＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドを含む製剤の単一または単位用量が提供される。単位用量のアジュバントおよび／またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５もしくはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドの量は、約０．００１μｇから約１０ｍｇの広い範囲内のいずれかとなり得る。この範囲は、約０．１μｇから約１ｍｇであってもよく、より狭い範囲は、約５μｇから約５００μｇである。他の好適な範囲は、約２０μｇから約２００μｇの間、例えば約２０μｇ、約７５μｇ、または約２００μｇ等である。Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドの好ましい用量は、約２０μｇから、または２００μｇ以下である。Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドとアジュバントとの間の比は、約１：１または約１：１．２５であってもよいが、より高い比が使用されてもよく（例えば、約１：１０以下）、または、アジュバントに対するＣ−ＴＡＢ単離ポリペプチドのより低い比が使用されてもよい（例えば、約１０：１以上）。

【0156】

Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドは、抗原として使用されてもよく、免疫細胞に提示されてもよく、抗原特異的免疫反応が誘導される。これは、Ｃ．ディフィシル等の病原体による感染の前、間、または後に生じ得る。製剤の免疫原性がアジュバント活性を必要としない程十分である場合は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドのみが必要で、追加的なアジュバントが必要でなくてもよい。製剤は、製剤の適用が複数の抗原に対して免疫反応を誘導する（すなわち多価である）ように、追加的な抗原を含んでもよい。抗原特異的リンパ球が免疫反応に関与してもよく、Ｂリンパ球が関与する場合、抗原特異的抗体が免疫反応の一端を担い得る。上述の製剤は、当該技術分野において知られた乾燥剤、賦形剤、保湿剤、安定剤、および保存剤を含んでもよい。

【0157】

本発明のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドを含む製剤は、対象（例えば、疾患の予防、感染症の影響からの保護、ＣＤＡＤ等の疾患の症状の低減もしくは軽減、またはそれらに組み合わせ等の治療を必要とする人間または動物）を治療するために使用され得る。例えば、本発明のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドを含む製剤は、例えば以下のプロファイルを有する対象等のＣＤＡＤのリスクを有する対象を治療するために使用され得る：ｉ）より弱い免疫系を有する対象、例えば高齢対象（例えば６５歳を超える対象）もしくは２歳未満の対象等；ｉｉ）免疫力のない対象、例えばＡＩＤＳを有する対象等；ｉｉｉ）免疫抑制薬を投与されている、もしくは投与される予定がある対象；ｉｖ）入院の予定がある対象、もしくは入院している対象；ｖ）集中治療（ＩＣＵ）を受けている、もしくは受ける予定がある対象；ｖｉ）消化管手術を受けている、もしくは受ける予定がある対象；ｖｉｉ）養護施設等の長期介護を受けている、もしくは受ける予定がある対象；ｖｉｉｉ）頻繁な、および／もしくは長期的な抗生物質の使用を必要とする共存症を有する対象；ｉｘ）上述のプロファイルの２つ以上を有する対象である対象、例えば消化管手術を受ける予定がある高齢対象等；ｘ）炎症性大腸炎を有する対象；ならびに／またはｘｉ）再発性ＣＤＡＤを有する対象、例えばＣＤＡＤの１つ以上のエピソードを経験している対象等。

【0158】

治療は、病原体による感染に対して、または毒素分泌により引き起こされるもの等の病原性作用に対して対象にワクチン接種してもよい。製剤は、既存の疾患を治療するため、保護的に疾患を予防するため、疾患の重症度および／もしくは期間を低減するため、疾患の症状を改善するため、またはそれらの組み合わせのために治療的に使用され得る。

【0159】

Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドを含む製剤は、経口、皮下、皮内、静脈内、動脈内、筋肉内、心臓内、髄腔内、胸腔内、腹腔内、心室内、および／または舌下経路を含むがこれらに限定されない様々な投与経路により送達され得る。

【0160】

また、製剤は、１つ以上のアジュバントまたはアジュバントの組み合わせを含んでもよい。通常、アジュバントおよび製剤は、抗原への提示の前に混合されるが、代替として、短い時間間隔内に別個に提示されてもよい。

【0161】

アジュバントは、例えば、油エマルジョン（例えば、完全または不完全フロイントアジュバント）、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ不完全Ｓｅｐｐｉｃアジュバント、例えばＩＳＡ、水中油エマルジョンアジュバント、例えばＲｉｂｉアジュバント系、ムラミールジペプチドを含有するシンタックスアジュバント製剤、水酸化アルミニウムまたはアルミニウム塩アジュバント（ＡＬＵＭ）、ポリカチオン性ポリマー、特にポリカチオン性ペプチド、特にポリアルギニンまたは少なくとも２つのＬｙｓＬｅｕＬｙｓモチーフを含有するペプチド、特にＫＬＫＬＬＬＬＬＫＬＫ、定義された塩基コンテクスト内に非メチル化シトシン−グアニンジヌクレオチド（ＣｐＧ）を含有する免疫刺激オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）（例えばＷＯ９６／０２５５５に記載）またはイノシンおよびシチジンに基づくＯＤＮ（例えばＷＯ０１／９３９０３に記載）またはデオキシイノシンおよび／もしくはデオキシウリジン残基を含有するデオキシ核酸（ＷＯ０１／９３９０５およびＷＯ０２／０９５０２７に記載）、特にＯｌｉｇｏ（ｄＩｄＣ）_１３（ＷＯ０１／９３９０３およびＷＯ０１／９３９０５に記載）、神経活性化合物、特にヒト成長ホルモン（ＷＯ０１／２４８２２に記載）、またはそれらの組み合わせ、ケモカイン（例えば、デフェンシン １もしくは２、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１−α、ＭＩＰ−２、インターロイキン−８、またはサイトカイン（例えば、インターロイキン−１β、−２、−６、−１０もしくは−１２；インターフェロン−γ；腫瘍壊死因子−α；または顆粒球単球コロニー刺激因子）（Ｎｏｈｒｉａ ａｎｄ Ｒｕｂｉｎ，１９９４において考察されている）、ムラミールジペプチド変異体（例えば、ムラブチド、トレオニル−ＭＤＰまたはムラミールトリペプチド）、ＭＤＰの合成変異体、熱ショックタンパク質または変異体、森林型熱帯リーシュマニアＬｅＩＦの変異体（Ｓｋｅｉｋｙ ｅｔ ａｌ．，１９９５）、トリプシン切断部位での変異体を含む細菌ＡＤＰ−リボシル化外毒素の非毒性変異体（ｂＡＲＥ）（Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｌｅｍｅｎｔｓ，１９９５）および／または作用性ＡＤＰ−リボシル化（Ｄｏｕｃｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７）または化学的解毒ｂＡＲＥ（トキソイド）、ＱＳ２１、Ｑｕｉｌｌ Ａ、Ｎ−アセチルムラミール−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミル−Ｌ−アラニン−２−［１，２−ジパルミトイル−ｓ−グリセロ−３−（ヒドロキシホスホリルオキシ）］エチルアミド（ＭＴＰ−ＰＥ）ならびに代謝可能な油および乳化剤を含有する組成物であって、油および乳化剤は、実質的に全てが１ミクロン未満の直径を有する油滴を有する水中油エマルジョンの形態で存在する組成物（例えば、ＥＰ０３９９８４３を参照されたい）を含む。また、免疫化に有用な他のアジュバントに関して、Ｒｉｃｈａｒｄｓ ｅｔ ａｌ．（１９９５）を参照されたい。

【0162】

アジュバントは、抗体もしくは細胞エフェクター、特定の抗体アイソタイプ（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、分泌ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、および／もしくはＩｇＧ４）、または特定のＴ細胞サブセット（例えば、ＣＴＬ、Ｔｈ１、Ｔｈ２および／もしくはＴ_ＤＴＨ）（例えば、Ｍｕｎｏｚ ｅｔ ａｌ．，１９９０；Ｇｌｅｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５を参照されたい）を優先的に誘導するように選択され得る。

【0163】

非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドまたはモチーフは、Ｂ細胞およびマクロファージを活性化することが知られている（Ｓｔａｃｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。ＤＮＡの他の形態がアジュバントとして使用されてもよい。細菌ＤＮＡは、免疫系にその病原性の源を認識させ、先天性免疫応答を刺激して適応免疫反応をもたらすパターンを有する構造のクラスに含まれる（Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ ａｎｄ Ｊａｎｅｗａｙ，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９（１）：４−９）。これらの構造は、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）と呼ばれ、リポ多糖類、テイコ酸、非メチル化ＣｐＧモチーフ、二本鎖ＲＮＡ、およびマンニン（ｍａｎｎｉｎ）を含む。ＰＡＭＰは、炎症反応を媒介し、Ｔ細胞機能の共刺激因子として作用し、エフェクター機能を制御することができる内因性シグナルを誘導する。これらの反応を誘導するＰＡＭＰの能力は、アジュバントとしての可能性において役割を果たし、その標的は、マクロファージおよび樹枝状細胞等のＡＰＣである。ＰＡＭＰはまた、異なる共刺激分子を誘導し、異なるエフェクター機能を制御して、免疫反応、例えばＴｈ２からＴｈ１の反応をガイドするために、他のアジュバントと併せて使用されてもよい。

【0164】

本発明の他の態様は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドのワクチン剤としての使用に関する。本発明のワクチンまたは免疫原性組成物は、効果的な量の抗原を使用し得る。後のＣ．ディフィシルに対する暴露からの対象の保護をもたらすように、対象に特定の十分な免疫反応を生成させる量の抗原が含まれる。抗原は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドであってもよい。一実施形態において、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドは、単独で、またはアジュバントと組み合わせて投与される。

【0165】

本発明の別の態様は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドのサブユニットワクチンとしての使用を含む。サブユニットワクチンは、病原体の断片の接種薬剤としての使用を指す。当業者には、サブユニットワクチンが、病原体の特定部分または領域に対する抗体を生成する手段を提供することが分かる。

【0166】

ワクチン投与の投薬スケジュールおよびその有効性は、当該技術分野において知られている方法により決定され得る。ワクチンの量および免疫化計画は、特定の抗原および使用されるアジュバント、投与の様式および頻度、ならびに所望の効果（例えば、保護および／または治療）に依存し得る。一般に、本発明のワクチンは、１μｇから１００ｍｇの間、例えば６０μｇから６００μｇの間等の範囲の量で投与され得る。Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドを含むワクチンの単一用量は、約１μｇから約１ｍｇ、好ましくは約５μｇから約５００μｇ、より好ましくは約２０μｇから約２００μｇの範囲内であってもよい。Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドとａｌｕｍ等のアジュバントとの間の比は、約１：１、例えば１：１．２５等であってもよいが、より高い比が使用されてもよく（例えば、約１：１０以下）、またはより低い比が使用されてもよい（例えば、約１０：１以上）。一実施形態において、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドを含むワクチンにおいて、アジュバントである水酸化アルミニウムが、約５０μｇ／ｍＬから約２００μｇ／ｍＬの範囲内、好ましくは約１２５μｇ／ｍＬ（最終製剤）の量で使用される。

【0167】

Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドを含むワクチンは、経口、静脈内、皮下、動脈内、筋肉内、心臓内、髄腔内、胸腔内、腹腔内、心室内、および／または舌下により投与され得る。

【0168】

免疫化計画は、当該技術分野において知られている方法により決定され得る。ワクチンの投与は、当業者により必要に応じて決定されるように繰り返されてもよい。例えば、準備用量に続いて１回、２回、３回、またはより多くのブースター用量が、１週間毎、２週間毎または１月毎の間隔で投与されてもよい。本発明の一実施形態において、準備用量に続いて１回または２回のブースター投与が、約７日から約１４日の間隔で、例えば初回投薬から７日後および２１日後等に投与される。好ましい実施形態において、治療上効果的な量のワクチンが、２回または３回、１４日＋／−１、２または３日（２週間毎）の間隔で対象に投与される。本発明の一実施形態において、治療上効果的な量のワクチンが１回投与される。

【0169】

さらに別の態様は、本発明に従い治療され得る集団に関する。一実施形態において、集団は、Ｃ．ディフィシルへの暴露のリスクを有する健常個人、特に入院または介護施設での滞在間際の個人、ならびに病院、養護施設および他の介護施設内の者を含む。別の実施形態において、集団は、抗生物質治療の停止後に再発した以前に感染していた患者、または抗生物質治療が効果的でない患者を含む。

【0170】

本発明の１つのさらなる実施形態において、集団は、少なくとも１８歳以上の個人を含む。１つの好ましい実施形態において、人間対象は、１８歳から６５歳である。別の好ましい実施形態において、人間対象は、６５歳を超える高齢者である。後者の年齢群は、Ｃ．ディフィシル感染を受ける最も脆弱な集団である。いくつかのさらなる実施形態において、人間対象は、１８歳より若い。
Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドの使用方法

【0171】

本発明はまた、単離ポリペプチドを使用する方法を提供する。例えば、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドは、Ｃ．ディフィシルに関連した疾患を予防または治療するために使用され得る。例として、本発明の単離ポリペプチドを対象の免疫系に導入することは、対象が単離ポリペプチドに対する抗体を産生することを含む免疫反応を誘導し得る。そのような抗体は、Ｃ．ディフィシルの認識に有用である。

【0172】

本発明は、単離ポリペプチドを対象に送達する方法であって、単離ポリペプチドを対象に投与することを含む方法を提供する。単離ポリペプチドは、液体または固体として投与され得る。単離ポリペプチドは、さらに、薬学的に許容される担体を含んでもよい。

【0173】

また、本発明は、毒素Ａおよび／または毒素Ｂを認識しそれに結合する抗体の可変ドメインを識別および単離するための方法であって、免疫反応を生成するためのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドの使用と、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドに応答して生成された抗体を精製し、次いで特性決定することとを含む方法を提供する。識別されたエピトープは、さらなる抗体またはその断片のクローニングに使用され得る。

【0174】

本発明の一態様は、１つには、Ｃ．ディフィシルの治療、予防、および検出に関する。いくつかの実施形態において、動物等の対象は、Ｃ．ディフィシルの治療および／または予防および／または検出を受ける。他の実施形態において、動物は人間である。例えば、本発明のポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｖｏでＣ．ディフィシルに対する抗体を惹起するために使用され得る。さらなる例として、本発明のポリペプチドは、対象がＣ．ディフィシルに対する抗体を生成するかどうかを決定するために使用され得る。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、抗体を単離するために使用され得る。例として、ポリペプチドは、親和性マトリックスに結合され得る。

【0175】

さらなる例として、本発明の核酸は、細胞を形質転換および／またはトランスフェクトして、本発明のポリペプチドおよび／または抗体を組み換えにより生成するために使用され得る。本発明の核酸はまた、例えば、対象がＣ．ディフィシルに感染しているかどうかを決定するために使用され得る。例として、これは、放射性標識ハイブリダイゼーションの方法を使用して達成され得る。

【0176】

さらなる例として、本発明の抗体は、Ｃ．ディフィシルによる感染を認識するために使用され得る。例として、抗体は、天然毒素Ａおよび／または毒素Ｂを抗原として認識し得る。本発明の抗体はまた、Ｃ．ディフィシルによる感染と闘うために使用され得る。例として、ヒト化抗体または抗体断片またはモノクローナル抗体は、Ｃ．ディフィシル感染に対する対象自身の免疫反応を使用し得る。さらなる例として、本発明の抗体は、サイトカインまたは毒素または酵素またはマーカーと結合して、感染症の治療および検出を補助し得る。

【0177】

本発明のさらなる態様は、診断アッセイに関する。本発明は、当該技術分野において知られた多くのアッセイと共に使用される。当業者には、本発明のポリペプチド、核酸および抗体の、広範な研究ベースの使用が認識される。本発明のポリペプチド、抗体および核酸は、例えば、放射性、化学発光性、蛍光性および／または染色分子等で標識化され得る。本発明の抗体、核酸およびポリペプチドは、ＤＮＡアッセイ（例えばサザンブロット法）、ＲＮＡアッセイ（例えばノーザンブロット法）、タンパク質アッセイ（例えばウェスタンブロット法）、クロマトグラフィー分析（例えばガス、液体、ＨＰＬＣ、サイズ排除）、免疫測定法（例えばＥＬＩＳＡ）、ならびに構造アッセイ（例えば結晶学およびＮＭＲ分光法）等のアッセイにおける使用に役立つ。本発明の抗体、ポリペプチドおよび核酸は、さらに、プローブとして使用され得る。プローブからのシグナルを増幅するアッセイもまた、当業者に知られている。
キット

【0178】

本発明は、例として、これらに限定されないが、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５もしくはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドをコードする核酸、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５もしくはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチド、および／またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５もしくはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドに対する抗体を含むキットを提供する。キットは、１つ以上の容器と、本明細書に記載の本発明の方法のいずれかに従う使用のための説明とを含んでもよい。本発明のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５もしくはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドおよび／または抗体は、Ｃ．ディフィシルを検出するための免疫測定法を含む様々なアッセイにおいて使用され得る。一実施形態において、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドは、生体試料中の抗体の検出を目的とした抗原として機能するように役立つ。容器は、単位用量、大量包装（例えば、複数用量包装）または副次的単位用量であってもよい。本発明のキットは、好適な包装内にある。また、特定のデバイス、例えば吸入器、経鼻投与デバイス、または注入デバイスと組み合わせた使用のための包装も企図される。キットは、無菌アクセスポートを有してもよい。容器もまた、無菌アクセスポートを有してもよい。キットは、随意に、緩衝剤等の追加的構成成分および解釈情報を提供し得る。

【0179】

キットは、Ｃ．ディフィシルの存在を検出するために、またはＣ．ディフィシルに関連した疾患、例えばＣＤＡＤを検出するために使用され得る。また、キットは、Ｃ．ディフィシルに関連した疾患を予防または治療するために使用され得る。また、本発明のキットは、Ｃ．ディフィシルに関連した疾患の症状を軽減するために使用され得る。

【0180】

さらなる説明なしに、当業者は、上記説明および以下の例示的な実施例を使用して、請求される発明を作製および利用することができると考えられる。したがって、以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を具体的に指摘するものであり、決して本開示の残りを制限するものとして解釈されるべきではない。本出願を通して参照される全ての論文、出版物、特許および文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【実施例】

【0181】

実施例１：Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５およびＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１単離ポリペプチドの調製。
本実施例は、大腸菌細胞における発現のためのＣ．ディフィシル毒素Ａ（ＣＴＡ）およびＢ（ＣＴＢ）の一部を含む単離ポリペプチドの調製を説明する。後述の方法は、ＣＴＡおよびＣＴＢを含む様々な単離ポリペプチドを作製するために使用され得る。一例として、ＣＴＡのＣ末端ドメインの一部およびＣＴＢのＣ末端ドメインの一部を含む単離ポリペプチドが説明される。
実施例１．１：Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５およびＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１遺伝子コンストラクトのクローニング。

【0182】

Ｃ末端ドメインのアミノ酸２０２６から２７１０をコードするＣＴＡ遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＹＰ−００１０８７１３７）の一部を、以下のプライマーを使用して、Ｃ．ディフィシル株６３０（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−１３８２）のゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅した。
順方向：５’−ｃａｃｃＡＣＴＡＧＴａｔｇａａｃｔｔａｇｔａａｃｔｇｇａｔｇｇｃ−３’（配列番号９）および
逆方向：５’−ＣＴＣＧＡＧｔｔａｇｃｃａｔａｔａｔｃｃｃａｇｇｇｇｃ−３’（配列番号１０）。
順方向プライマーによる増幅は、ＳｐｅＩ部位を形成し、逆方向プライマーによる増幅は、Ｘｈｏｌ部位を形成した。

【0183】

Ｃ末端ドメインのアミノ酸１８５０から２３６６をコードするＣＴＢ遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＹＰ−００１０８７３５）の一部を、以下のプライマーを使用してＰＣＲにより増幅した。
順方向：５’−ｃａｃｃＡＴＧＣＡＴａｔｇａｇｔｔｔａｇｔｔａａｔａｇａａａａｃａｇ−３’（配列番号１１）および
逆方向：５’−ｇｇｃＣＴＣＧＡＧｃｔａｔｔｃａｃｔａａｔｃａｃｔａａｔｔｇａｇｃ−３’（配列番号１２）。
順方向プライマーによる増幅は、Ｎｓｉｌ部位を形成し、逆方向プライマーによる増幅は、Ｘｈｏｌ部位を形成した。

【0184】

ＰＣＲ反応は、ＰＣＲ Ｓｕｐｅｒ−Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用して行った。サイクル条件は、９５℃で２分、９５℃で４５秒、５５℃で５０秒、６８℃で８分（３０サイクル）、および７２℃で１０分であった。ＰＣＲ生成物は、迅速遺伝子抽出キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で精製し、ＰＣＲ ２．１ ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にライゲーションした。ライゲーション混合物を使用して、大腸菌Ｍｅｃｈ−１細胞を熱ショックにより形質転換した。形質転換体をＩｍＭｅｄｉａ Ａｍｐ Ｂｌｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のプレート上に播種した。白色コロニーを採取し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する４ｍｌのＬＢ培地を有する１５ｍｌ管内で培養した。培養物を３７℃で一晩インキュベートし、プラスミドを迅速プラスミドミニプレップキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で抽出した。

【0185】

ＰＣＲ ２．１−ＴＯＰＯ／ＴＡベクター中のＣＴＡ遺伝子断片をＳｐｅＩおよびＸｈｏＩ，で分解させ、断片を、同じくＴ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅを使用してＳｐｅＩおよびＸｈｏＩで分解させた中間ベクターにクローン化した。次いで、３つの制限部位（ＢｇＬＩＩ−ＮｓｉＩ−ＳａｃＩ）を含有するリンカーを、以下の合成プライマーの組を使用して、ＰＣＲによりＣＴＡ遺伝子断片の３’端部に挿入した。
順方向：５’−ＡＧＡＴＣＴＡＴＧＣＡＴＧＡＧＣＴＣｃｔｃｇａｇｃｃｃａａａａｃｇａａａｇｇｃｔｃａｇｃ−３’（配列番号１３）
逆方向：５’−ｃｇｇｔｃｃｇｇｇｇｃｃａｔａｔａｔｃｃｃａｇｇｇｇｃｔｔｔｔａｃｔｃｃ−３’（配列番号１４）。

【0186】

ＰＣＲ ２．１−ＴＯＰＯ／ＴＢ中のＣＴＢ遺伝子断片を、Ｎｓｉｌ およびＸｈｏｌで分解させ、分解されたＣＴＢ遺伝子断片を、同じくＮｓｉＩおよびＸｈｏＩで分解させたＣＴＡ遺伝子およびリンカーを含有する中間ベクターにライゲーションした。ＣＴＢ遺伝子をリンカーに３’位で挿入し、コンストラクト配列５’−ＣＴＡ−リンカー−ＣＴＢ−３’を形成した。この融合コンストラクトは、Ｃ−ＴＡＢ．Ｖ１中間ベクターと呼ばれる。

【0187】

Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５遺伝子を、以下のプライマーを使用して、Ｃ−ＴＡＢ．Ｖ１中間ベクターからＰＣＲにより増幅した。
順方向：５’−ｃａｃｃＣＣＡＴＴＧａｔｇｇｔａａｃａｇｇａｇｔａｔｔｔａａａｇｇａ（配列番号１５）
逆方向：５’−ＣＴＣＧＡＧｃｔａｔｔｃａｃｔａａｔｃａｃｔａａｔｔｇａｇｃｔｇ（配列番号１６）。
ＰＣＲ反応は、ＰＣＲ Ｓｕｐｅｒ ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用して行った。サイクル条件は、９５℃で２分、９５℃で４５秒、５５℃で５０秒、６８℃で４分（３０サイクル）および７２℃で１０分であった。ＰＣＲ生成物は、迅速遺伝子抽出キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で精製し、ＰＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にライゲーションした。ライゲーション混合物を使用して、大腸菌Ｍｅｃｈ−１細胞を熱ショックにより形質転換した。形質転換体をＩｍＭｅｄｉａ Ａｍｐ Ｂｌｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のプレート上に播種した。白色コロニーを採取し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する４ｍｌのＬＢ培地を有する１５ｍｌ管内で培養した。培養物を３７℃で一晩インキュベートし、プラスミドを迅速プラスミドミニプレップキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で抽出した。ＰＣＲ ２．１−ＴＯＰＯＴＡベクター中のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５融合遺伝子を、ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ 制限酵素で分解させた。これらのＣ−ＴＡＢ断片を、同じ制限酵素で分解させたｐＥＴ２８発現ベクターにライゲーションした。この得られたコンストラクトは、アミノ酸１８５１から２３６６からの毒素ＢのＣ末端ドメインに融合した、アミノ酸２２７２から２７１０からの毒素ＡのＣ末端ドメインをコードする。ｐＥＴ２８／Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５コンストラクトを、発現のために大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５融合遺伝子を含有する５つのコロニーを、分析のために選択した。

【0188】

Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１コード配列は、大腸菌宿主細胞内での改善された発現のためのコドン最適化により得られた。コドン使用量は、大腸菌遺伝子のコドンバイアスに基づいて適合させた。さらに、ｍＲＮＡ半減期を延長するようにＧＣ含量を調節し、非常に高い（＞８０％）または非常に低い（＜３０％）ＧＣ含量の領域を回避した。したがって、最適化された遺伝子は、大腸菌における高く安定な発現率を可能とする。コドン最適化されたＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１遺伝子は、ｉｎ ｓｉｔｕで合成し、発現ベクターｐＥＴ−２８ｂ（＋）にサブクローニングした。

【0189】

ＤＮＡ配列決定：ｄ−ローダミン染色によるダイターミネーターサイクル配列決定化学を使用して、プラスミドＤＮＡ配列を確認した。Ｊｅｌｌｙｆｉｓｈソフトウェアを使用して配列決定データを分析した。
実施例１．２：大腸菌における組み換えＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１融合タンパク質の発現

【0190】

Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５およびＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１遺伝子コンストラクトの発現は、大腸菌における発現のための標準的手順を使用して行うことができる。

【0191】

組み換えＣ−ＴＡＢ融合タンパク質の発現のためのコロニーのスクリーニング：スクリーニングのために、コロニーを採取し、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む４ｍｌのＬＢ培地を有する１５ｍｌのＦａｌｃｏｎ管内で成長させた。管を２５０ｒｐｍで混合しながら３７℃で一晩培養した。初期成長期の後、各管からの１ｍｌの培養物を２４ウェル組織培養プレートに移し、１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクト−プラノシド（ＩＰＴＧ）で３０℃で３時間発現を誘導した。微小遠心分離機での１２，０００ｇで１分間の遠心分離により、細胞ペレットを回収した。細胞ペレット溶解物を調製し、可溶性分画をＣ−ＴＡＢ融合タンパク質の発現に関してＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析により分析した。陽性クローンをさらなる評価のために選択した。

【0192】

Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５発現のための回分発酵：それぞれ３０μｇ／ｍｌカナマイシンを添加した１５０ｍｌのＳｕｐｅｒ Ｂｒｏｔｈ培地を含有する５００ｍｌの振とうフラスコ内で、種培養物を成長させた。ＯＤ_６００が２〜２．５に達するまで、培養物を２７５ｒｐｍで連続撹拌しながら２８℃で１２時間成長させた。振とうフラスコを使用して、１０ＬのＳｕｐｅｒ Ｂｒｏｔｈを含有する発酵槽を植菌した。ＯＤ_６００＝３．５〜４となるまで、培養物を３７℃で約４．５時間成長させた。生成物発現の誘導のため、０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、２５℃でさらに４時間成長を継続させた。次いで、遠心分離により細胞を回収し、細胞ペーストを−７０℃で凍結保存した。この発酵プロセスにより達成された典型的な生成物特異的発現速度は、約２００ｍｇ／ｍｌであった。

【0193】

Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１調製のための流加回分発酵：５００μｌの一定量の種バンクのグリセロールストック（−７５℃で保存）を使用して、１Ｌ振とうフラスコ内の３０μｇ／ｍｌカナマイシンを添加した１００ｍｌの前培養培地を植菌した。前培養物を、ＯＤ_６００＝１．０〜２．０に達するまで、約１５０ｒｐｍでの一定撹拌下で３７℃で約７時間インキュベートした。流加回分発酵を行うことができるプロセス制御システムを装備した標準的産業用１５Ｌ発酵槽内で、２５ｍＬの前培養物を使用して７Ｌの回分発酵培地を植菌した。グルコースが枯渇するまで、７Ｌの回分培養段階を３７℃で１２時間実行した（ＯＤ_６００＝１２〜１５）。次いで、急激供給モードにより、特定の成長速度定数μ＝０．２５／時間で３７℃で６時間（ＯＤ_６００＝４０〜５０）、グルコース供給段階（バイオマス生成）を開始した。一定供給段階への切り替えおよび１ｍＭ ＩＰＴＧ（生成物生成）の最終濃度での誘導の１時間前に、温度を３０℃に低下させて、封入体形成のリスクを低減した。３０℃における一定供給での生成物発現段階をさらに５時間継続し（ＯＤ_６００＝約１００）、２３時間の全発酵プロセス時間および約８．２Ｌの最終培養物体積を得た。遠心分離により約１．２ｋｇの湿潤細胞バイオマスを回収し、−７０℃以下で保存した。そのような流加回分発酵により達成された典型的な生成物特異的発現速度は、最大１．３ｇ／Ｌであった。
実施例１．３：組み換えＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１融合タンパク質の精製。

【0194】

Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５分析試料の精製：凍結細胞ペーストを解凍して、ｐＨ５．６の１０ｍＭクエン酸／ＮａＯＨ緩衝液中に再懸濁し、細胞スラリーを５５０バールでホモジナイザ（ＧＥＡ Ｎｉｒｏ Ｓｏａｖｉホモジナイザ）に２回通過させた。懸濁液を２回、つまり１３５００ｒｐｍで３０分を１回、および２回目に超遠心分離機内で１８０００ｒｐｍで１時間遠心分離した。上澄みをプールし、５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ３）でｐＨを５．６に調節した。浄化された細胞溶解物を、ｐＨ５．６の１０ｍＭクエン酸／ＮａＯＨ緩衝液と共にＳＰ急速流動カラムに通過させた。タンパク質を、２０ｍＭ ＮａＰｉ中０ｍＭから５００ｍＭに増加する塩化ナトリウムの線形勾配で溶出した。Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５を含有する分画をプールした。蒸留Ｈ_２Ｏにより伝導度を５ｍＳ／ｃｍまで下方調節した。２５ｍＭの最終濃度までトリスを添加した。プールした分画をＤＥＡＥ急速流動カラムに通過させた。タンパク質を、２５ｍＭトリス中５０ｍＭから５００ｍＭに増加する塩化ナトリウムの線形勾配で溶出した。再び、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５を含有する分画をプールし、０．４Ｍの最終濃度まで１．５Ｍクエン酸Ｎａ（ｐＨ７．５）を添加した。Ｃ−ＴＡＢ．Ｖ１プールを、２５ｍＭトリス、０．４Ｍクエン酸Ｎａ（ｐＨ ７．５）で平衡化されたフェノールセファロースＨＰカラムに投入した。Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５融合タンパク質を、５ｍＭトリス（ｐＨ７．５）を使用して線形勾配で低下する塩濃度で溶出した。全てのカラムを、ＡＫＴＡ Ｐｒｉｍｅクロマトグラフィーシステムにより監視した。精製されたＣ−ＴＡＢ融合タンパク質を、５０Ｋ膜を使用してＰＢＳに緩衝液交換した。

Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１バルク調製物の精製：バイオマスを、処理まで−８０℃で保存した。４５０ｇの凍結細胞ペースト（２．９０Ｌの発酵槽に相当）を、４体積の溶解緩衝液（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、約０．６ｍＳ／ｃｍ）で希釈し（例えば４５０ｇのペースト＋１８００ｍＬの緩衝液）、このようにして約１時間±０．５時間、機械的撹拌下で解凍した。随意の残りの塊を、Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘを使用して（例えば８０００ｒｐｍで５分間）再懸濁することができる。細胞溶解は、Ｎｉｒｏ Ｓｏａｖｉ Ｐａｎｄａ高ホモジナイザで行う（６４０±２５バール、３サイクル）。熱交換器を使用して溶解物を１０℃未満まで冷却し、遠心分離までこの温度で維持する。粗細胞溶解物を、１４０００ｒｐｍ（３００００ｇ）で４℃で３０分間、バッチ遠心分離ステップ（Ｂｅｃｋｍａｎｎ Ａｖａｎｔｉ ＪＬＡ ６０．２５）に供する。上澄みを回収してプールする。濾過ステップの詰まりのリスクを低減するために、ペレットの半液体部分も廃棄する。次いで、プールされた上澄みをＳｕｐｅｒｃａｐ ＰＤＨ４ １００／５インチ深さのフィルタカプセル（Ｐａｌｌ社）（２５０ｃｍ²有効濾過面積）を通して濾過する。フィルタハウジング内の残りの溶解物を、溶解緩衝液で洗い流す。浄化後、１Ｍトリス原液（ｐＨ７．５）の一定量を、２５ｍＭ．の最終濃度まで溶解物に添加する。最終溶解物の緩衝組成物は、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、２５ｍＭトリス（ｐＨ７．５、伝導度約６ｍＳ／ｃｍ）である。溶解物は濾過後もまだ若干混濁している可能性があるが、これはその後の捕捉ステップに影響しない。捕捉ステップは、直径５０ｍｍ、充填層高さ２０ｃｍ、充填層体積約４００ｍＬの寸法を有するＸＫ５０／３０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）において、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）で室温で行う。投入密度は、約０．８ｇから１．２ｇバイオマス／ｍＬゲルである。プロセスは、Ａｋｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）により行い、２８０ｎｍで監視する。平衡化は、１００ｃｍ／時間で、約５ＣＶの２５ｍＭトリス、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、２５ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５、伝導度約５ｍＳ／ｃｍ）を用いて、ｐＨ、伝導度および２８０ｎｍ吸光度が安定するまで行う。溶解物を７５ｃｍ／時間でカラムに投入し、通過物を廃棄する。全ての濾過された溶解物を投入したら、２８０ｎｍ吸光度が安定化するまで、流動を約５ＣＶの平衡化緩衝液で再開する。５ＣＶの２５ｍＭトリス、１７５ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５、伝導度１９ｍＳ／ｃｍ）による洗浄ステップ２の間に不純物をカラムから除去する。３ＣＶの２５ｍＭトリス、３７５ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５、伝導度３６ｍＳ／ｃｍ）での段階的溶出により、Ｃ−ＴＡＢタンパク質をカラムから溶出する。２８０ｎｍ吸光度が増加し始めたら（通常１ＣＶ後）、Ｃ−ＴＡＢ含有分画の回収を開始し、約０．５ＣＶから１．０ＣＶの間継続する。Ｃ−ＴＡＢを含有するプールされた分画は、２〜８℃で一晩保存することができる。中間精製ステップは、直径５０ｍｍ、充填層高さ２０ｃｍ、充填層体積約４００ｍＬの寸法を有するＸＫ５０／３０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）において、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）で室温で行う。最大投入密度は、約４〜５ｍｇ Ｃ−ＴＡＢ／ｍＬゲルである。プロセスは、Ａｋｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）により行い、２８０ｎｍで監視する。平衡化、洗浄および線形勾配溶出ステップを、過度の背圧（＞４バール）により妨げられない限り、２００ｃｍ／時間（６５ｍＬ／分）の最大流速で行う。ｐＨ、伝導度および２８０ｎｍ吸光度が安定となるまで、約５〜１０ＣＶの緩衝液Ｇで２００ｃｍ／時間で平衡化を行う。投入前に、ＳＰ−ＦＦ樹脂上へのＣ−ＴＡＢの結合を可能とするようにＤＥＡＥプールを調節する必要がある。最終伝導度が３．５ｍＳ／ｃｍ（ｐＨ５．５±０．１）以下となるまで、ＳＰ−ＦＦ平衡化緩衝液（１０ｍＭクエン酸、２ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ５．５±０．１、伝導度約２ｍＳ／ｃｍ））でＤＥＡＥプールを２５倍希釈する。必要な場合は、所望の伝導度を達成するために追加のＭｉｌｌｉＱ水を添加する。ＳＰ−ＦＦ上へのＣ−ＴＡＢの結合を可能とするためには、低い伝導度が極めて重要であることに留意されたい。試料を１５０ｃｍ／時間でカラムに投入し、通過物を廃棄する。試料の投入後、２８０ｎｍ吸光度が安定化するまで、流動を約５ＣＶの平衡化緩衝液で２００ｃｍ／時間で再開する。０％平衡化緩衝液から、１０ＣＶを超える３０％ ２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）まで、１００ｃｍ／時間の線形勾配により溶出を行う。分画を回収し、ＵＶ２８０ｎｍ吸光度によりプールを行う。プールは、ピーク最大値の１５％で開始し、ピーク最大値の１５％で終了する。１．５Ｍクエン酸原液（ｐＨ８．０）を使用して、プールをすぐに４００ｍＭのクエン酸（最終ｐＨ７、約４９ｍＳ／ｃｍ）まで調節する。調節されたＳＰＦＦプールは、ｐＨ７および約４９ｍＳ／ｃｍを有するべきであり、２〜８℃で一晩保存される。

【0195】

ポリッシングクロマトグラフィーステップは、直径５０ｍｍ、充填層高さ１５ｃｍ、充填層体積約３００ｍＬの寸法を有するＸＫ５０／３０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）において、Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）で室温で行う。投入密度は、約４〜５ｍｇ Ｃ−ＴＡＢ／ｍＬゲルである。プロセスは、Ａｋｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）により行い、２８０ｎｍで監視する。平衡化、投入、洗浄および溶出ステップを、過度の背圧（＞４バール）により妨げられない限り、１００ｃｍ／時間（３３ｍＬ／分）の最大流速で行う。そのような場合、流速を低下させる必要がある。平衡化は、１００ｃｍ／時間で、約５〜１０ＣＶの２５ｍＭトリス、４００ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．５、４６ｍＳ／ｃｍ）を用いて、ｐＨ、伝導度および２８０ｎｍ吸光度が安定するまで行う。試料を１００ ｃｍ／時間でカラムに投入し、通過物を廃棄する。試料の投入後、２８０ｎｍ吸光度が安定化するまで、流動を約５ＣＶの平衡化緩衝液で１００ｃｍ／時間で再開する。１００％平衡緩衝液／０％ ５ｍＭトリス（ｐＨ７．５、０．５ｍＳ／ｃｍ）から、２０ＣＶを超える１００％ ５ｍＭトリス（ｐＨ７．５、０．５ｍＳ／ｃｍ）まで、１００ｃｍ／時間の線形勾配により溶出を行う。分画を回収し、ＵＶ２８０ｎｍ吸光度によりプールを行う。プールは、ピーク最大値の約１０〜１５％で開始し、ピーク最大値の約２０％で終了する。調節されたプールを、２〜８℃で一晩保存する。最終Ｃ−ＴＡＢ原薬タンパク質溶液の調製は、室温で操作される３０ｋＤａカットオフ接線流濾過（ＴＦＦ、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ２膜、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により達成される。タンパク質溶液は、透過物ｐＨが６．５±０．２と等しくなるまで、製剤緩衝液（２０ｍＭヒスチジン、７５ｍＭ ＮａＣｌ、５％スクロース、０．０２５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０（ｐＨ６．５））に対して膜分離される。

【0196】

２８０ｎｍでのＵＶ測定に従い、Ｃ−ＴＡＢ（タンパク質濃度１ｍｇ／ｍＬ、１ｃｍキュベット）の２８０ｎｍにおける比吸光係数として１．５６６を使用して、最終タンパク質濃度を２ｍｇ／ｍＬに調製する。

【0197】

ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析：全細胞溶解物および精製Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１融合タンパク質を、ベータ−メルカプトエタノールを含有するＮｕ−Ｐａｇｅ試料緩衝液中に再懸濁し、１０分間煮沸した。試料（２５μｌ）を３〜８％トリス−アセテートゲル上に投入した。電気泳動（１５０Ｖで１時間）後、単純に青色染色によりゲルを染色することによりタンパク質を可視化し、またはウェスタンブロット分析に使用した。

【0198】

Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１特異的発現を、毒素特異的抗体を使用したウェスタンブロット分析により決定した。１０％メタノール中の１×トランスファー緩衝液を使用して、タンパク質を２３Ｖで６０分間ＰＶＤＦ膜に移した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中０．５％のカゼインで、膜を室温で１時間ブロックした。毒素Ｂに対するモノクローナル抗体（ＧｅｎＷａｙ；クローンＢ４２６Ｍ）または独自に得た毒素Ａに対するモルモットポリクローナル抗体（Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｓ）と共に、トランスファー膜を室温で２時間インキュベートした。洗浄した膜を、ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合化抗モルモットＩｇＧまたは抗マウスＩｇＧと共にインキュベートした。ブロットを洗浄し、ＡＥＣ基質を添加した。ブロットを穏やかに混合しながら５〜１０分間インキュベートした。ブロットを水で濯ぎ、発色を停止させた。

【0199】

ＲＢＣ血球凝集：毒素Ｂではなく毒素Ａの細胞結合ドメインは、ウサギ赤血球（ＲＢＣ）を凝集することができることが示されている。凝集プロセスは、毒素Ａ がウサギＲＢＣに対する血液抗体において見られるグリカン配列に結合した結果である。試料（Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５および天然毒素Ａ）を、ＰＢＳ中で１００μｇ／ｍｌに希釈する。Ｖ字底マイクロタイタープレート内で、２倍連続希釈物をプレートにわたり２回調製し、１００μｇ／ｍｌから開始して５０μｌの希釈物を各ウェルに残す。５０マイクロリットルの０．７５％ウサギＲＢＣ／ＰＢＳ懸濁液をマイクロタイタープレートの各ウェルに添加し、プレートを室温で１時間インキュベートする。プレート底部でのＲＢＣペレット形成の失敗により、血球凝集が示される。試料の血球凝集力価は、ＲＢＣペレットが観察されない最大試料希釈物を有するウェル内に存在するタンパク質の濃度により表現される。
実施例２：マウスにおけるａｌｕｍの存在下および非存在下での組み換えＣ−ＴＡＢ．Ｇ５融合タンパク質の用量力価測定。

【0200】

本試験は、Ｃ−ＴＡＢ有効性アッセイとしての、ａｌｕｍアジュバントあり、およびなしでのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５のｉｎ ｖｉｖｏ用量力価測定の実現可能性を決定するためのものであった。使用したａｌｕｍは、Ａｌｙｄｒａｇｅｌ（水酸化ａｌｕｍ、Ｂｒｅｎｎｔａｇ社）であった。８週から９週齢の間のＣ５７ＢＬ／６雌マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ．）を、免疫化に使用した。全ての動物は、０日目に右大腿筋への筋肉内（ＩＭ）注射（５０μｌ）による第１の免疫化を受けた。第２の免疫化は、１４日目に左大腿筋へのＩＭ注射により行った。全部で７２匹のマウスを、以下のようにワクチン接種された１２の群に分割した。
・群１：ＰＢＳのみ
・群２：１００（１５４）ｎｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５
・群３：３００（４６２）ｎｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５
・群４：１，０００（１，５４０）ｎｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５
・群５：３，０００（４，６２０）ｎｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５
・群６：１０，０００（１５，４００）ｎｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５
・群７：５０μｇのａｌｕｍを含むＰＢＳ
・群８：５０μｇのａｌｕｍ ＯＨを含む１０．０（１５．４）ｎｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５
・群９：５０μｇのａｌｕｍ ＯＨを含む３０．０（４６．２）ｎｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５
・群１０：５０μｇのａｌｕｍ ＯＨを含む１００（１５４）ｎｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５
・群１１：５０μｇのａｌｕｍ ＯＨを含む３００（４６２）ｎｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５
・群１２：５０μｇのａｌｕｍ ＯＨを含む１，０００（１，５４０）ｎｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５

【0201】

本試験では、まず、標準プロトコルＱｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ（商標）Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）に従い、タンパク質濃度を測定した。後に、実施例１．３に記載の手順に従い、２８０ｎｍでのＵＶ測定によりタンパク質濃度（括弧内に示す）を再び測定した。追跡調査では、ＵＶ法によりタンパク質濃度を測定した。

【0202】

第１の免疫化から２週間後（試験１４日目）、および第２の免疫化から２週間後（試験２８日目）に、全ての動物から血液試料を回収した。分析まで血清を−２０℃で保存した。

【0203】

血清ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ：Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５もしくはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１（Ｃ−ＴＡＢと呼ばれる）、毒素Ａおよび毒素Ｂまたはそのトキソイドに対し惹起された血清抗体を、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）において評価した。簡潔に述べると、１．０μｇ／ｍｌの毒素Ａ、毒素ＢまたはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５単離ポリペプチドの原液を、ＰＢＳ中で調製し、１００μｌを９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。４℃で一晩のインキュベーション後、プレートを洗浄し、０．５％カゼインブロック緩衝液でブロックした。プレートを再び洗浄し、試験血清の連続２倍希釈物をプレートに加えた。第２の４℃で一晩のインキュベーション後、プレートを洗浄し、ペルオキシダーゼ複合化抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）と共にインキュベートした。室温で２時間のインキュベーション後、プレートを再び洗浄し、ペルオキシダーゼ基質（２，２’−アジノビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホネート）を添加し、室温で２時間発色させた。５０μｌの２％ＳＤＳをウェルに添加することにより、反応を停止させた。プレートを４０５ｎｍの吸収でＥＬＩＳＡプレートリーダーで読み出した。血清抗体力価は、ＥＬＩＳＡ単位の幾何平均として報告されるが、これは、１．０のＯＤ ４０５ｎｍ読み出しをもたらす血清希釈である。陰性対照として、第１の免疫化の前にプレブリードされた動物から得られた事前免疫化血清のプール試料を使用して、抗体反応を評価した。

【0204】

Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５を与えられた動物は、抗体力価の用量依存的な増加を示し、ａｌｕｍアジュバントは、より低いＣ−ＴＡＢ．Ｇ５の用量で大幅に改善された抗体力価を可能にした。図３は、抗Ｃ−ＴＡＢ、抗毒素Ａおよび抗毒素Ｂ ＩｇＧの力価を示す。図４は、ａｌｕｍの存在下または非存在下での抗体力価のグラフ比較を示す。
実施例３：マウスにおけるＣ−ＴＡＢ．Ｇ５の免疫原性および保護効果

【0205】

本試験は、Ｃ．ディフィシル毒素Ａまたは毒素Ｂの致死的負荷を受けたワクチン接種マウスにおける、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５の免疫原性および保護効果を評価するためのものであった。６〜７週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ．）を本試験に使用した。全ての動物は、０日目に右大腿筋への筋肉内（ＩＭ）注射（５０μｌ）による第１のワクチン接種を受けた。第２のワクチン接種は、１４日目に左大腿筋へのＩＭ注射により行った。１１６匹のマウスを、以下のようにワクチン接種された群に分割した。
・群１：ＰＢＳのみ
・群２：３μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５
・群３：１０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５
・群４：３０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５
・群５：３μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５＋５０μｇのａｌｕｍ ＯＨ
・群６：１０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５＋５０μｇのａｌｕｍ ＯＨ
・群７：３０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５＋５０μｇのａｌｕｍ ＯＨ
・群８：ＰＢＳのみ
・群９：３μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５
・群１０：１０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５
・群１１：３０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５
・群１２：３μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５＋５０μｇのａｌｕｍ ＯＨ
・群１３：１０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５＋５０μｇのａｌｕｍ ＯＨ
・群１４：３０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５＋５０μｇのａｌｕｍ ＯＨ

【0206】

第２の免疫化から２週間後（試験２８日目）に、全ての動物から血液試料を回収した。分析まで血清を−２０℃で保存した。次いで、Ｃ−ＴＡＢ、毒素Ａおよび毒素Ｂに対する血清抗体力価を、ＥＬＩＳＡにより測定し、ＥＬＩＳＡ単位（ＥＵ）として報告した。

【0207】

図５は、第２の免疫化から２週間後（試験２８日目）に評価された、マウスにおけるＣ−ＴＡＢ、毒素Ａおよび毒素Ｂに対する血清抗体力価を示す。本試験は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５融合タンパク質がマウスにおいて極めて免疫原性であり、アジュバントを添加しなくても、毒素Ａおよび毒素Ｂの両方に対して強い抗体反応を誘導し得ることを示した。Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５免疫原性は、水酸化ａｌｕｍとの併用送達により大きく増強され得る（１対数超）。ａｌｕｍあり、またはなしでＣ−ＴＡＢ．Ｇ５を与えられた動物は、片対数用量範囲にわたり抗体反応の２倍の増加を示した。

【0208】

抗体力価の評価に加えて、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５による免疫化により生成された抗体を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ毒素中和アッセイ（ＴＮＡ）において、天然毒素ＡおよびＢを中和する能力に関して評価した。

【0209】

毒素中和抗体アッセイ（ＴＮＡ）。ｉｎ ｖｉｔｒｏ分析のために、１２５μｌの毒素Ａ（５ｎｇ／ｍｌ）または毒素Ｂ（１ｎｇ／ｍｌ）を、免疫化マウスから得られた抗血清の１２５μｌの連続希釈物と共にインキュベートした。３７℃で１時間のインキュベーション後、毒素：血清混合物を、Ｖｅｒｏ細胞（サル腎臓細胞）を含有するマイクロタイターウェルに加え、マイクロタイタープレートを１８時間インキュベートした。毒素ＡまたはＢおよびＶｅｒｏ細胞のインキュベーションは、細胞形態の変化、および非接着性細胞の除去後の毒素処理細胞の中性赤色染色により測定される細胞接着の喪失をもたらした。血清の毒素中和力価は、毒素活性の５０％低減をもたらす血清希釈として報告される。

【0210】

ＴＮＡアッセイの結果を図６に示す。データは、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５のみでの免疫化後に生成された抗体が、天然毒素Ａの毒性活性を中和することができるが、毒素Ｂは中和できないことを示している。Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５がａｌｕｍと併用送達された場合、ＴＮＡ力価は、抗毒素Ａ ＴＮＡにおいて約６倍の増加を伴って増強され、抗毒素Ｂ ＴＮＡにおいてはわずかに２分の１低い力価であった。このデータは、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５単離ポリペプチドが、天然毒素中に存在する抗体認識抗原エピトープを保持するだけでなく、機能的毒素中和抗体の生成に必要とされる重要な抗原エピトープも含むことを示している。このように、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５は、Ｃ．ディフィシル毒素Ａおよび毒素Ｂの毒性作用の中和に効果的であり、したがってワクチン接種に有用である。

【0211】

抗体反応の評価に加えて、マウスを天然毒素の致死的負荷から保護するＣ−ＴＡＢ．Ｇ５免疫化の能力を決定した。第２のワクチン接種から３週間後（試験３５日目）に、ワクチン接種および非ワクチン接種群（Ｎ＝８）内の動物は、２５ｎｇの毒素Ａまたは５０ｎｇの毒素Ｂの致死用量を腹腔内（ＩＰ）投与により受けた。マウスの生存率をその後９日間にわたり監視したが、その結果を図６に示す。本実験は、ａｌｕｍアジュバントの非存在下でのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５によるマウスの免疫化が、天然毒素Ａによる致死的負荷に対し１００％の保護、および毒素Ｂ負荷に対する５０％の保護を付与することができることを実証した。Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５のＡｌｕｍとの併用送達は、毒素Ｂに対する保護免疫を１００％保護まで向上させた。このデータは、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５ワクチン接種が、致死的負荷モデルにおいて、マウスを毒素Ａおよび毒素Ｂの両方の毒性作用から保護するのに十分な免疫反応を誘導することを示している。
実施例４：幼若および老齢マウスにおける、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５の免疫原性および保護効果の評価。

【0212】

本試験は、幼若および老齢マウスにおけるＣ−ＴＡＢ．Ｇ５に対する免疫反応を比較するためのものであった。それぞれ６〜７週齢および１８ヶ月齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ．）を本試験に使用した。全ての動物は、０日目に右大腿筋への筋肉内（ＩＭ）注射（５０μｌ）による第１のワクチン接種を受けた。第２のワクチン接種は、１４日目に左大腿筋へのＩＭ注射により行った。１９２匹のマウスを、以下のようにワクチン接種された群に分割した。
−群１：幼若マウスへのＰＢＳ
−群２：老齢マウスへのＰＢＳ
−群３：幼若マウスへの１０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５
−群４：幼若マウスへの３０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５
−群５：老齢マウスへの１０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５
−群６：老齢マウスへの３０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５
−群７：幼若マウスへの１０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５＋５０μｇのａｌｕｍ ＯＨ
−群８：幼若マウスへの３０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５＋５０μｇのａｌｕｍ ＯＨ
−群９：老齢マウスへの１０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５＋５０μｇのａｌｕｍ ＯＨ
−群１０：老齢マウスへの３０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５＋５０μｇのａｌｕｍ ＯＨ
−群１１：幼若マウスへのＰＢＳ
−群１２：老齢マウスへのＰＢＳ
−群１３：幼若マウスへの１０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５
−群１４：幼若マウスへの３０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５
−群１５：老齢マウスへの１０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５
−群１６：老齢マウスへの３０μｇのＣ−ＴＡＢ ５^ｔｈ
−群１７：幼若マウスへの１０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５＋５０μｇのａｌｕｍ ＯＨ
−群１８：幼若マウスへの３０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５＋ ５０μｇのａｌｕｍ ＯＨ
−群１９：老齢マウスへの１０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５＋５０μｇのａｌｕｍ ＯＨ
−群２０：老齢マウスへの３０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５＋５０μｇのａｌｕｍ ＯＨ

【0213】

第２のワクチン接種から３週間後（試験３５日目）に、ワクチン接種および非ワクチン接種群（Ｎ＝６）内の動物は、２５ｎｇの毒素Ａまたは５０ｎｇの毒素Ｂの腹腔内（ＩＰ）注射により致死的負荷を受けた。マウスの生存率をその後９日間にわたり監視した。

【0214】

第１の免疫化から２週間後（試験１４日目）、および第２の免疫化から２週間後（試験２８日目）に、全ての動物から血液試料を回収した。分析まで血清を−２０℃で保存した。次いで、Ｃ−ＴＡＢ、毒素Ａおよび毒素Ｂに対する血清抗体力価を、ＥＬＩＳＡにより測定し、ＥＬＩＳＡ単位（ＥＵ）として報告した。毒素Ａおよび毒素Ｂ中和抗体（ＴＮＡ）を、細胞毒性量の組み換え毒素Ａおよび毒素Ｂで処理されたＶｅｒｏ細胞を使用して決定した。

【0215】

Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５ワクチンを与えられた幼若動物は、老齢動物と比較してより大幅に高いレベルの試験した全ての抗体を示した。水酸化ａｌｕｍの存在下でＣ−ＴＡＢ．Ｇ５をワクチン接種された幼若マウスにおいて特に高い抗体力価が得られた（図７）。毒素Ｂ ＴＮＡ力価において特に顕著な改善が達成された。同時に、毒素Ａおよび毒素Ｂ負荷に耐える能力において、幼若マウスと老齢マウスとの間に大きな差はなかった。しかしながら、両群とも、ａｌｕｍの存在下でワクチン接種された場合、改善された保護率を示した。図７は、幼若マウス対老齢マウスにおけるＣ−ＴＡＢ．Ｇ５免疫原性および保護効果の比較を示す。図８は、幼若および老齢マウスにおける抗Ｃ−ＴＡＢ抗体増加の反応速度を示す。
実施例５：Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１ならびにとトキソイドＡおよびＢの免疫原性および保護効果の比較。

【0216】

本試験は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１対トキソイドＡ／Ｂの免疫原性および保護効果を比較するためのものであった。使用したトキソイドＡ／Ｂは、等量（１：１）のトキソイドＡ（ロット＃１００９１３２）およびトキソイドＢ（ロット＃１００９１３３）の混合物であった。トキソイドは、ホルマリン固定により調製され、ＴｅｃｈＬａｂにより提供された。６〜７週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ．）を本試験に使用した。全ての動物は、０日目に右大腿筋への筋肉内（ＩＭ）注射（５０μｌ）による第１のワクチン接種を受けた。第２のワクチン接種は、１４日目に左大腿筋へのＩＭ注射により行った。１８０匹のマウスを、以下のようにワクチン接種された群に分割した。
−群１：ＰＢＳのみ
−群２：１０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１
−群３：３０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１
−群４：１０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１＋５０μｇのａｌｕｍ ＯＨ
−群５：１０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１＋５０μｇのａｌｕｍ ＯＨ
−群６：３０μｇのトキソイドＡ／Ｂ
−群７：１０μｇのトキソイドＡ／Ｂ
−群８：３０μｇのトキソイドＡ／Ｂ＋５０μｇのａｌｕｍ ＯＨ
−群９：３０μｇのトキソイドＡ／Ｂ＋５０μｇのａｌｕｍ ＯＨ
−群１０：ＰＢＳ
−群１１：１０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１
−群１２：３０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１
−群１３：１０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１＋５０μｇのａｌｕｍ ＯＨ
−群１４：３０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１＋５０μｇのａｌｕｍ ＯＨ
−群１５：１０μｇトキソイドＡ／Ｂ
−群１６：３０μｇのトキソイドＡ／Ｂ
−群１７：１０μｇのトキソイドＡ／Ｂ＋５０μｇのａｌｕｍ ＯＨ
−群１８：３０μｇのトキソイドＡ／Ｂ＋５０μｇのａｌｕｍ ＯＨ

【0217】

第２のワクチン接種から３週間後（試験３５日目）に、ワクチン接種および非ワクチン接種群（Ｎ＝６）内の動物は、２８ｎｇの毒素Ａまたは５０ｎｇの毒素Ｂの腹腔内（ＩＰ）注射により致死的負荷を受けた。マウスの生存率をその後９日間にわたり監視した。

【0218】

第１の免疫化から２週間後（試験１４日目）、および第２の免疫化から２週間後（試験２８日目）に、全ての動物から血液試料を回収した。分析まで血清を−２０℃で保存した。次いで、Ｃ−ＴＡＢ、毒素Ａおよび毒素Ｂに対する血清抗体力価を、ＥＬＩＳＡにより測定し、ＥＬＩＳＡ単位（ＥＵ）として報告した。毒素Ａおよび毒素Ｂ中和抗体（ＴＮＡ）を、細胞毒性量の組み換え毒素Ａおよび毒素Ｂで処理されたＶｅｒｏ細胞を使用して決定した。

【0219】

本研究は、２回のワクチン接種後のマウスにおけるＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１およびトキソイドＡ／Ｂの免疫原性および保護効果を実証する。Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１を与えられた動物は、トキソイドＡ／Ｂを与えられた動物と比較して、より低いが有意な抗Ｃ−ＴＡＢ抗体力価を示した。また、ａｌｕｍの併用送達は、全ての試験された抗体反応を大きく増強した。結果として、ａｌｕｍの存在下でＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１またはトキソイドＡ／Ｂで免疫化された動物において達成された抗Ｃ−ＴＡＢおよび抗毒素Ａ抗体のレベルは、同様である。マウスがＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１で免疫化された場合、トキソイドＡ／Ｂで免疫化されたマウスと比較して、抗毒素Ｂ抗体は僅かにより低い抗体力価が観察された。注目すべきことに、毒素分子のＣ末端部分におけるＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１認識エピトープに対して生成された抗体とは異なり、トキソイド免疫化により誘導された抗体は、毒素分子のＮ末端部分に特異的であり、これは抗毒素ＥＬＩＳＡにおいて読み出された。したがって、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１およびトキソイドＡ／Ｂで免疫化されたマウスにおいて生成された抗毒素Ａおよび抗毒素Ｂ抗体は、異なる特異性の抗体であり、したがって直接比較することはできない。しかしながら、データは、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１免疫化に対する抗体反応が、トキソイドによる免疫化の場合と同様に著しく高いことを示している。さらに、毒素負荷試験は、マウスを致死的負荷から保護するＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１免疫化の能力が、トキソイドＡおよびＢの保護効果に匹敵することを実証した。図９は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１およびトキソイドＡ／Ｂの免疫原性の比較を示す。図１０は、トキソイドＡ／Ｂで免疫化されたマウスと比較して、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１で免疫化されたマウスに対する毒素中和および保護データを示す。
実施例５．１：異なる免疫化計画におけるＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１の抗体力価および保護効果の比較。

【0220】

本研究は、異なる免疫化計画で３回のワクチン投薬を受けたマウスにおける、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１の免疫原性および保護効果を比較するためのものであった。６〜７週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ．）を本試験に使用した。１３５匹のマウスを、１４の群に分割した。群番号２〜１３における全ての動物は、以下に示す日に、右大腿筋または左大腿筋への筋肉内（ＩＭ）注射（５０μｌ）により、３回のワクチン接種を受けた。群１および８内のマウスは、ワクチン接種を受けず、陰性対照として役立った。以下のように免疫化を行った。

【0221】

【表3】

【0222】

試験０、３、７、１４、２１、２８、３５および４２日目に、全ての動物から血液試料を回収した。分析まで血清を−２０℃で保存した。Ｃ−ＴＡＢ、毒素Ａおよび毒素Ｂに対する血清抗体力価を、ＥＬＩＳＡにより測定し、ＥＬＩＳＡ単位（ＥＵ）として報告した。試験４２日目に、毒素Ａおよび毒素Ｂ中和抗体（ＴＮＡ）を、細胞毒性量の組み換え毒素Ａおよび毒素Ｂで処理されたＶｅｒｏ細胞を使用して決定した。

【0223】

最後のワクチン接種から３週間後（試験４９日目）に、ワクチン接種および非ワクチン接種群（Ｎ＝８）内の動物は、２８ｎｇの毒素Ａまたは５０ｎｇの毒素Ｂの腹腔内（ＩＰ）注射により致死的負荷を受けた。マウスの生存率をその後９日間にわたり監視した。

【0224】

本試験は、第３のワクチン接種から２週間後または試験３５および４２日目に測定された全ての抗体力価が、全ての免疫計画において同等であるが、０／１４／２８の免疫化計画が最良の免疫反応を示すことを実証している。第２のワクチン接種から２週間後に測定された抗体力価を比較すると、０／１４／２８の免疫化計画が、０／７／２１の免疫化計画よりも良好であり、０／３／１４の免疫化計画よりもはるかに良好である。本試験により、抗原が水酸化アルミニウムと併用注射された場合、抗毒素Ａ／Ｂ抗体力価が大幅に向上することが確認された（データは示さず）。試験はまた、ａｌｕｍと共に２回のワクチン投薬が２週間の間隔をおいて行われた場合でも、３回のワクチン投薬後に得られるレベルに匹敵する高い抗体レベルを惹起し得ることを示している。

【0225】

毒素Ａ／Ｂ中和抗体のレベルは、０／７／２１および０／１４／２８の免疫化計画において、０／３／１４の免疫化計画よりもはるかに高い。

【0226】

毒素Ａによる負荷に対する完全な保護は、０／７／２１および０／１４／２８の免疫化計画においてａｌｕｍを必要としないが、０／３／１４においては必要とする。ａｌｕｍありでの０／１４／２８の免疫化計画は、毒素Ｂ負荷に対して最も高いレベルの保護（８７．５％）を誘導し、一方０／７／２１の免疫化計画は、３７．５％の保護を提供し、０／３／１４は、２８．６％の保護を示す。本試験の結果を図２０に示す。
実施例６：ハムスターにおける組み換えＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１融合タンパク質の免疫原性および保護効果の評価。

【0227】

本試験は、異なる動物モデルにおける、アジュバントあり、またはなしで投与された組み換え融合タンパク質Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１の免疫原性をさらに評価するためのものであった。

【0228】

７週齢を超える体重８０ｇから９０ｇの雌ハムスター（Ｈａｒｌａｎ社）を本試験に使用した。全ての動物は、０日目に右大腿筋へのボーラス（５０μｌ）筋肉内（ＩＭ）注射による第１のワクチン接種を受けた。第２のワクチン接種は１４日目に左大腿筋へのＩＭ注射により行われ、第３のワクチン接種は２８日目にＩＭ注射により行われた。ハムスターを群（Ｎ＝６）に分割し、以下のようにワクチン接種した。
・群１：製剤緩衝液のみ
・群２：１０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１
・群３：１０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１＋１００μｇのａｌｕｍ ＯＨ
・群４：３０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１
・群５：３０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１＋１００μｇのａｌｕｍ ＯＨ
・群６：１００μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１
・群７：１００μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１＋１００μｇのａｌｕｍ ＯＨ
・群１０：製剤緩衝液のみ
・群１１．１０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１
・群１２．１０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１＋１００μｇのａｌｕｍ ＯＨ
・群１３．３０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１
・群１４．３０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１＋１００μｇのａｌｕｍ ＯＨ
・群１５．１００μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１
・群１６．１００μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１＋１００μｇのａｌｕｍ ＯＨ

【0229】

第３のワクチン接種から２週間後（試験４２日目）に、ワクチン接種および非ワクチン接種群（Ｎ＝６）内の動物は、７５ｎｇの毒素Ａまたは１２５ｎｇの毒素Ｂの腹腔内（ＩＰ）注射により致死的負荷を受けた。４４日目に毒素Ａまたは毒素Ｂ負荷の用量力価測定にさらに１２匹のハムスターを使用した。ハムスターの生存率をその後８日間にわたり監視した。

【0230】

第１の免疫化から２週間後（試験１４日目）、第２の免疫化から２週間後（試験２８日目）、および第３の免疫化から２週間後（試験３５日目）に、全ての動物から血液試料を回収した。分析まで血清を−２０℃で保存した。次いで、Ｃ−ＴＡＢ、毒素Ａおよび毒素Ｂに対する血清抗体力価を、ＥＬＩＳＡにより測定し、ＥＬＩＳＡ単位（ＥＵ）として報告した。毒素Ａおよび毒素Ｂ中和抗体（ＴＮＡ）を、細胞毒性量の組み換え毒素Ａおよび毒素Ｂで処理されたＶｅｒｏ細胞を使用して決定した。

【0231】

本試験は、ハムスターが、マウスと同様に、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１ワクチン接種に肯定的に反応することを実証した。Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１を与えられた動物は、全ての試験された抗体力価において用量依存的な増加を示し、一方ａｌｕｍアジュバントは、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５の全ての用量において抗体力価を大幅に改善した。最大の抗体力価は、第２の投与から２週間後（試験２８日目）に観察された。図１１（Ａ〜Ｃ）は、免疫化されたハムスターの各群に対する抗体力価を示す。図１２は、水酸化ａｌｕｍの存在下または非存在下でのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５で免疫化されたハムスターにおける抗Ｃ−ＴＡＢ抗体増加の反応速度を示す。

【0232】

ＴＮＡアッセイの結果を図１３に示す。これらの結果は、マウスに対して得られたものと同様であり、ハムスターにおいてＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１融合タンパク質に対して生成された抗体が、Ｃ．ディフィシル毒素Ａおよび毒素Ｂの毒性作用の中和に効果的であることを示している。

【0233】

また、図１３は、致死的毒素負荷後のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１で免疫化されたハムスターにおける保護データを示す。アジュバントの非存在下でのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１によるワクチン接種でも、高い保護が達成された。ワクチンにａｌｕｍを添加することにより、保護レベルは１００％まで改善された。
実施例７：クリンダマイシン処理ハムスターにおけるＣ．ディフィシル芽胞負荷に対するＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１融合タンパク質の保護効果。

【0234】

抗生物質治療後、Ｃ．ディフィシルは、消化管にコロニー形成する可能性があり、毒素を生じる場合は、抗生物質関連下痢を引き起こし得る。人間のＣ．ディフィシル関連疾患（ＣＤＡＤ）は、動物をコロニー形成、下痢および死亡し易くするために、通常は毒素産生株での植菌から数日以内にクリンダマイシンを使用してハムスターにおいてモデル化される。Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１ワクチン有効性を評価するために、ワクチン接種および非ワクチン接種ハムスターにクリンダマイシンおよびＣ．ディフィシル株６３０を負荷した。１００μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１を、１２５μｇの水酸化ａｌｕｍアジュバントと混合した。体重約１００ｇの雌成体ハムスターが、０、１４および２８日目に筋肉内（ＩＭ）注射により３回のワクチン接種を受けた。プラセボはＰＢＳであった。４８匹のハムスターを、以下のようにワクチン接種される８匹の群に分割した。
群１：ＰＢＳのみ＋１０^２芽胞負荷
群２：Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１＋１０^２芽胞負荷
群３：ＰＢＳのみ＋１０^３芽胞負荷
群４：Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１＋１０^２芽胞負荷
群５：ＰＢＳのみ＋１０^４芽胞負荷
群６：Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１＋１０^４芽胞負荷

【0235】

４２日目に、全ての群内の全ての動物は、１０ｍｇリン酸クリンダマイシン／ｋｇ体重の経口投薬を受けた。４３日目に、全ての群内の全ての動物に、Ｃ．ディフィシル株６３０の洗浄芽胞を強制経口投与により投薬した。３つのレベルの芽胞負荷を使用した（約１０^２、１０^３および１０^４）。治療を行わずに観察を５４日目まで継続した。試験の終了時に、全ての生存動物は、５日間以上疾患を有さなかった。

【0236】

０、１４、２８、４２および５４日目（試験終了）に、血液試料を採取して、血清学的試験のための血清を得た。１日目および４２日目に、ハムスターの肛門から直接、または必要に応じて寝床の中から糞便を回収した。

【0237】

結果を、ハムスターにおける芽胞負荷後の生存率曲線を示す図１４に示す。生存率データは、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存率適合曲線としてプロットし、統計分析はログランク分析を使用して行った。全ての芽胞用量において、ワクチン接種群内のハムスターの１００％生存率が観察され、プラセボ群と比較して生存率が有意に向上した：１０^２芽胞でｐ＝０．０２４５、１０^３芽胞でｐ＝０．０００６、１０^４芽胞でｐ＜０．０００１。
実施例８：サルにおけるＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１の免疫原性および保護効果。

【0238】

本試験は、カニクイザルにおけるＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１の免疫原性および保護を評価するためのものであった。４歳から６歳の間の年齢および２ｋｇから４ｋｇの間の体重の６匹の雌のカニクイザルを、本試験に使用した。３匹のサルの２つの群を準備し、第１の群（群１）に２００μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１を与え、第２の群（群２）に２００μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１および２５０μｇのａｌｕｍを与えた。ａｌｕｍアジュバントとして、Ｒｅｈｙｄｒａｇｅｌ（Ｒｅｈｅｉｓ社、ロット＃５３４４０１、ＰＢＳ中で２ｍｇ／ｍｌに希釈）を使用した。血液採取または免疫化の前に、（必要に応じて）動物を剃毛した。

【0239】

第１（試験０日目）および第３（試験２８日目）の免疫化は左腕（三角筋）に施し、第２の免疫化（試験１４日目）は右腕（三角筋）に施した。群１には、０．５ｍｌ １×ＰＢＳ中の２００μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１のみをＩＭ注射により与え、群２には、０．５ｍｌ １×ＰＢＳ中の２００μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１および２５０μｇのａｌｕｍをＩＭ注射により与えた。

【0240】

確立された時点（試験０、１４、２８および４２日目）に、標準的方法により得た２〜３ｍＬの全血を血清分離管に採取した。血清試料を約−２０℃で凍結した。次いで、ＥＬＩＳＡ法を使用して、抗Ｃ−ＴＡＢ、抗毒素Ａおよび抗毒素Ｂ ＩｇＧ力価を評価した。抗体力価は、ＥＬＩＳＡ単位（ＥＵ）で示された。

【0241】

図１５は、増加用量のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１が、３つ全てのタンパク質を認識する抗体産生の増加をもたらし、一方ａｌｕｍの存在が抗体レベルを大幅に改善したことを示している。最大抗体力価は、４２日目の２回のワクチン接種において観察された。これらのデータは、それを必要とする対象のワクチン接種のための組み換えＣ−ＴＡＢ．Ｇ５またはＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１融合タンパク質の使用の実現可能性を明確に示している。
実施例９：Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５およびＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１の免疫原性の比較。

【0242】

本試験は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５およびＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１の免疫原性、ならびにＣ−ＴＡＢが供給される２つの異なる緩衝液の効果を比較するためのものであった。８週から９週齢の間のＣ５７ＢＬ／６雌マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ．）を免疫化に使用した。全ての動物は、０日目に右大腿筋への筋肉内（ＩＭ）注射（５０μｌ）による第１の免疫化を受けた。第２の免疫化は、１４日目に左大腿筋へのＩＭ注射により行った。全部で７２匹のマウスを、以下のようにワクチン接種された１２の群に分割した。
群１：１μｇのＰＢＳ中のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５
群２：３μｇのＰＢＳ中のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５
群３：１０μｇのＰＢＳ中のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５
群４：３０μｇのＰＢＳ中のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５
群５：１μｇのヒスチジン緩衝液中のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５
群６：３μｇのヒスチジン緩衝液中のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５
群７：１０μｇのヒスチジン緩衝液中のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５
群８：３０μｇのヒスチジン緩衝液中のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５
群９：１μｇのヒスチジン緩衝液中のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１
群１０：３μｇのヒスチジン緩衝液中のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１
群１１：１０μｇのヒスチジン緩衝液中のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１
群１２：３０μｇのヒスチジン緩衝液中のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１

【0243】

第２の免疫化から２週間後（試験２８日目）に、全ての動物から血液試料を回収した。分析まで血清を−２０℃で保存した。Ｃ−ＴＡＢ、毒素Ａおよび毒素Ｂに対する血清抗体力価を、ＥＬＩＳＡにより測定し、ＥＬＩＳＡ単位として報告した。

【0244】

図１６は、全ての抗体力価（抗Ｃ−ＴＡＢ、抗毒素Ａおよび抗毒素Ｂ）が、３つのワクチン製剤において１〜３０μｇの容量範囲にわたって有意に異ならなかったことを示している（Ｔ−検定分析により明らかなように）。ＰＢＳと比較して、ヒスチジン緩衝液中のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５製剤において、若干高い抗体産生が達成された。Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５およびＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１ヒスチジン製剤での免疫化の間では有意な差は観察されなかった。したがって、本試験は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５およびＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１コンストラクトの同等の免疫原性を実証した。
実施例１０：代替Ｃ−ＴＡＢＮＣＴＢおよびＣ−ＴＡＤＣＴＢ融合タンパク質の調製および評価。

【0245】

本実施例は、Ｃ．ディフィシル ＶＰＩ−１０４６３株から得られたＣＴＡのＣ末端ドメインの１つの部分およびＣＴＢのＣ末端ドメインの２つの部分を含む２つの他の融合タンパク質の調製について説明する。Ｃ−ＴＡＢＮＣＴＢ融合タンパク質（配列番号１８）は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５と同様に、ＣＴＡの１９反復単位（アミノ酸２２７２〜２７１０）、ＣＴＢの２３反復単位（アミノ酸１８５０〜２３６６）、およびＣＴＢのＣ末端に融合したＣＴＢのさらなる追加的な１０反復（アミノ酸１８３４〜２０５７）を含む。Ｃ−ＴＡＤＣＴＢ融合タンパク質（配列番号２０）は、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５配列（ＣＴＡの１９反復およびＣＴＢの２３反復）、ならびにＣ−ＴＡＢ．Ｇ５のＣ末端に融合したＣＴＢの追加的な２４反復単位（アミノ酸１８３４〜２３６６）を含む。したがって、Ｃ−ＴＡＤＣＴＢは、ＣＴＢの反復単位の二重部分を含む。Ｃ−ＴＡＢＮＣＴＢおよびＣ−ＴＡＤＣＴＢ遺伝子コンストラクトのクローニングは、実施例１．１に記載のものと同様の様式で行った。組み換え融合タンパク質は、大腸菌細胞において発現され、実施例１．２に記載のような標準的手順を使用して精製した。単離ポリペプチドを、動物における免疫原性および保護試験において評価した。
実施例１０．１：マウスにおけるＣ−ＴＡＢ．Ｇ５、Ｃ−ＴＡＢＮＣＴＢおよびＣ−ＴＡＤＣＴＢの免疫原性および保護効果の比較。

【0246】

本試験は、２対数範囲にわたる５回の抗原投薬でワクチン接種されたマウスにおける、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５、Ｃ−ＴＡＢＮＣＴＢおよびＣ−ＴＡＤＣＴＢの免疫原性および保護効果を比較するためのものであった。６〜７週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ．）を本試験に使用した。全ての動物は、２回のワクチン接種を受け、第１のワクチン接種は、０日目に右大腿筋への筋肉内（ＩＭ）注射（５０μｌ）により行われた。第２のワクチン接種は、１４日目に左大腿筋へのＩＭ注射により行った。全ての免疫化は、ａｌｕｍの非存在下で行った。第２の免疫化から２週間後（試験２８日目）に、血液試料を回収した。分析まで血清を−２０℃で保存した。Ｃ−ＴＡＢ、毒素Ａおよび毒素Ｂに対する血清抗体力価を、ＥＬＩＳＡにより測定し、図１７に示されるＥＬＩＳＡ単位（ＥＵ）として報告した。

【0247】

本試験は、代替融合タンパク質Ｃ−ＴＡＤＣＴＢおよびＣ−ＴＡＢＮＣＴＢ、ならびにＣ−ＴＡＢ．Ｇ５が、極めて免疫原性であり、アジュバントを添加しなくても毒素Ａおよび毒素Ｂの両方に対する強い抗体反応を誘導することができることを実証した。

【0248】

抗体反応の評価に加えて、マウスを天然毒素Ｂの致死的負荷から保護するＣ−ＴＡＤＣＴＢおよびＣ−ＴＡＢＮＣＴＢ免疫化の能力を決定した。第２のワクチン接種から３週間後（試験３５日目）に、ワクチン接種および非ワクチン接種群（Ｎ＝６）内の動物は、５０ｎｇの毒素Ｂの致死用量を腹腔内（ＩＰ）投与により受けた。マウスの生存率をその後９日間にわたり監視したが、その結果を図１８に示す。本実験は、ａｌｕｍの非存在下での３３μｇのＣ−ＴＡＤＣＴＢによるマウスの免疫化は、天然毒素Ｂによる致死的負荷に対する１００％の保護を付与することができるが、一方同じ用量のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５およびＣ−ＴＡＢＮＣＴＢは、部分的な保護のみを誘導することを実証した。このデータは、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５と同様に、２つの他の融合タンパク質Ｃ−ＴＡＤＣＴＢおよびＣ−ＴＡＢＮＣＴＢが、天然毒素による致死的負荷に対して保護的となり得ることを示している。
実施例１０．２：ハムスターにおけるＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１およびＣ−ＴＡＤＣＴＢの免疫原性および保護効果の比較。

【0249】

本試験は、異なる動物モデルにおける、ａｌｕｍアジュバントあり、またはなしで投与された代替融合タンパク質Ｃ−ＴＡＤＣＴＢの免疫原性をさらに評価するためのものであった。

【0250】

試験は、実施例６において説明される通りに設計された：雌ハムスターを、１００μｇの水酸化ａｌｕｍの存在下または非存在下で、ＩＭ注射により３回ワクチン接種した（試験０、１４および２８日目）。第３のワクチン接種から２週間後（試験４２日目）に、全ての動物は、７５ｎｇの毒素Ａまたは１２５ｎｇの毒素Ｂの腹腔内（ＩＰ）注射により致死的負荷を受けた。試験１４、２８および３５日目に血液試料を回収し、Ｃ−ＴＡＢ、毒素Ａおよび毒素Ｂに対する血清抗体力価をＥＬＩＳＡにより決定した。毒素Ａおよび毒素Ｂ中和抗体（ＴＮＡ）を３５日目の血清において測定した。ハムスターの生存率を監視し、保護の％として報告した。

【0251】

本試験は、融合タンパク質Ｃ−ＴＡＤＣＴＢが、マウスと同様に、ハムスターにおいて抗毒素抗体反応を誘導し得ることを実証した。ａｌｕｍアジュバントは、全ての試験された抗体力価を大幅に改善した。図１９に示されるＴＮＡアッセイの結果は、Ｃ−ＴＡＤＣＴＢに対して生成された抗体が、Ｃ．ディフィシル毒素Ａおよび毒素Ｂの毒性作用の中和において効果的であることを示している。図１９はまた、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１またはＣ−ＴＡＤＣＴＢで免疫化されたハムスターに対する保護データの比較を示す。両方の組み換え融合タンパク質でのワクチン接種により、高い保護が達成された。
実施例１１：Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１を含む薬学的組成物の安全性、免疫原性および用量反応を評価する非盲検第１相試験

【0252】

３つの異なる用量：Ａｌ（ＯＨ）_３（ａｌｕｍ）ありで２０μｇ、それぞれＡｌ（ＯＨ）_３ありまたはなしで７５μｇおよび２００μｇで、筋肉内（ＩＭ）注射により、０、７および２１日目の３回のワクチン接種で投与される、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１、切断されたクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ディフィシル）毒素Ａおよび毒素Ｂからなる組み換え融合タンパク質を含む薬学的組成物。
試験目的
主目的：
・第３のワクチン接種から６か月後までの、Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１を含む薬学的組成物の安全性および忍容性を調査すること。
副次的目的：
・最適な用量および製剤の第１の指標を得るための、第１のワクチン接種後０、７、１４、２１、２８、１１３、２０１日目における、３つの異なる用量および２種の製剤に対するワクチン抗原Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１ならびにＣ．ディフィシルの天然毒素ＡおよびＢに対して測定される免疫反応を調査すること。
・Ｃ．ディフィシル毒素ＡおよびＢをｉｎ ｖｉｔｒｏで中和するＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１ワクチン誘導ＩｇＧ抗体の能力を調査すること。
試験デザイン

【0253】

本試験は、１８歳以上６５歳未満の健常成人におけるパートＡ、および６５歳以上の健常高齢者におけるパートＢからなる、非盲検部分無作為化用量増加第１相試験であり、後者の年齢群は、Ｃ．ディフィシル感染を受ける最も脆弱な集団である。パートＡは、アジュバントありの２０μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１ワクチン、およびそれぞれアジュバントありまたはなしの７５μｇおよび２００μｇのＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１ワクチンの安全性およびそれに対する用量反応を試験するために、１２人の健常成人対象の５つの治療群において、０、７および２１日目のワクチン接種スケジュールで行う。安全性および免疫原性は、パートＡの全ての成人対象が第３のワクチン接種を受けた後に分析され、全ての安全性データは、パートＢからの対象の参加の前に、Ｄａｔａ Ｓａｆｅｔｙ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｂｏａｒｄ（ＤＳＭＢ）により見直される。中間解析の間に安全性のない、または効果のない治療群（すなわち、有意なＩｇＧ反応を誘導しない用量）が特定された場合、これらの治療群は中止され、パートＢに持ち込まれることはない。
試験のパートＢは、高齢集団における用量確定を探求するものである。したがって、パートＢは、群当たり２０名の高齢健常対象の５つの治療群において行う。０、７および２１日目のワクチン接種スケジュールを適用する。本試験デザインにより、成人および高齢者の両方における用量反応の比較が可能となる。後者の年齢群は、Ｃ．ディフィシルワクチンの主要な標的集団であり、年齢に基づく、または年齢−リスクに基づく予防ワクチン接種手法において、Ｃ．ディフィシルワクチンの発達経路における２つの標的指標、すなわち再発性Ｃ．ディフィシル下痢の予防および原発性Ｃ．ディフィシル感染症の予防に対し最も脆弱な集団を示す。しかしながら、高齢対象は、若年成人よりもワクチン接種に対し反応性が低い可能性があり、したがって、早期発達段階からの高齢標的集団における用量確定が必要である。パートＡからの全ての成人がワクチン接種された後の中間解析によって、高齢群内の対象を、ワクチンの潜在的に安全でない、または効果のない用量（例えば最低用量）および／または製剤（例えば非アジュバント製剤）に暴露するリスクを軽減するために、安全でない、または成人において有意なＩｇＧ反応を誘導しない用量／製剤を中止することができる。
Ｃ−ＴＡＢ．Ｇ５．１ワクチンは、標準的方法により生成された、２０ｍＭ Ｌ−ヒスチジン、７５ｍＭ ＮａＣｌ、５％スクロース、０．０２５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０（ｐＨ６．５）中のＣ−ＴＡＢ．Ｇ５．１の水溶液である。
配列：

【表4】

好ましい態様：
好ましいポリペプチドおよびその使用：
１．配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。

２．配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。

３．クロストリジウム・ディフィシルの毒素ＡのＣ末端ドメインから得られる１９反復単位、およびクロストリジウム・ディフィシルの毒素ＢのＣ末端ドメインから得られる２３反復単位を含む、態様１または２に記載の単離ポリペプチド。

４．配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する、態様１に記載の単離ポリペプチド。

５．配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する、態様１に記載の単離ポリペプチド。

６．配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド。

７．前記単離ポリペプチドをワクチン接種されたハムスターは、全ての芽胞用量（１０^２、１０^３および１０^４）において、致死用量のＣ．ディフィシル芽胞の胃内投与に対し生存する、態様６に記載のポリペプチド。

８．クロストリジウム・ディフィシルの毒素ＡのＣ末端ドメインから得られる１９反復単位を含む、態様６または７に記載のポリペプチド。

９．クロストリジウム・ディフィシルの毒素ＢのＣ末端ドメインから得られる２３、３３または４７反復単位を含む、態様６から８のいずれか１つに記載のポリペプチド。

１０．配列番号２、配列番号４、配列番号１８、配列番号２０および配列番号２、配列番号４、配列番号１８または配列番号２０のいずれかと９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるポリペプチドからなる群から選択される、態様６から９のいずれか１つに記載のポリペプチド。

１１．単離されている、態様６から１０のいずれか１つに記載のポリペプチド。

１２．医薬品における使用のための、態様６から１１のいずれか１つに記載のポリペプチド。

１３．ＣＤＡＤの予防および治療のための、態様６から１１のいずれか１つに記載のポリペプチド。

１４．ＣＤＡＤのリスクを有する対象におけるＣＤＡＤの予防のための、態様６から１１のいずれか１つに記載のポリペプチド。

１５．ＣＤＡＤのリスクを有する対象におけるＣＤＡＤの予防のための、態様６から１１のいずれか１つに記載のポリペプチドであって、ＣＤＡＤのリスクを有する前記対象は、ｉ）６５歳を超える対象、もしくは２歳未満の対象；ｉｉ）ＡＩＤＳを有する対象；ｉｉｉ）免疫抑制薬を投与されている、もしくは投与される予定がある対象；ｉｖ）入院の予定がある対象、もしくは入院している対象；ｖ）集中治療を受けている、もしくは受ける予定がある対象；ｖｉ）消化管手術を受けている、もしくは受ける予定がある対象；ｖｉｉ）養護施設等の長期介護を受けている、もしくは受ける予定がある対象；ｖｉｉｉ）頻繁な、および／もしくは長期的な抗生物質の使用を必要とする共存症を有する対象；またはｉｘ）再発性ＣＤＡＤを有する対象である、ポリペプチド。

１６．医薬品における使用のための医薬の製造のための、態様６から１１のいずれか１つに記載のポリペプチドの使用。

１７．ＣＤＡＤの予防および治療のための医薬の製造のための、態様６から１１のいずれか１つに記載のポリペプチドの使用。

１８．ＣＤＡＤのリスクを有する対象におけるＣＤＡＤの予防のための医薬の製造のための、態様６から１１のいずれか１つに記載のポリペプチドの使用。

１９．ＣＤＡＤのリスクを有する対象におけるＣＤＡＤの予防のための医薬の製造のための、態様６から１１のいずれか１つに記載のポリペプチドの使用であって、ＣＤＡＤのリスクを有する前記対象は、ｉ）６５歳を超える対象、もしくは２歳未満の対象；ｉｉ）ＡＩＤＳを有する対象；ｉｉｉ）免疫抑制薬を投与されている、もしくは投与される予定がある対象；ｉｖ）入院の予定がある対象、もしくは入院している対象；ｖ）集中治療を受けている、もしくは受ける予定がある対象；ｖｉ）消化管手術を受けている、もしくは受ける予定がある対象；ｖｉｉ）養護施設等の長期介護を受けている、もしくは受ける予定がある対象；ｖｉｉｉ）頻繁な、および／もしくは長期的な抗生物質の使用を必要とする共存症を有する対象；またはｉｘ）再発性ＣＤＡＤを有する対象である、使用。

２０．態様１から１１のいずれか１つに記載のポリペプチドを含む、対象におけるＣ．ディフィシル感染を検出するための診断キット。

好ましい核酸：
１ａ．態様１から１１のいずれか１つに記載のポリペプチドのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。

２ａ．態様１から１１のいずれか１つのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列から本質的になる、態様１ａに記載の核酸。

３ａ．配列番号１、配列番号３、配列番号１７および配列番号１９の群から選択されるヌクレオチド配列を含む、態様１ａまたは２ａに記載の核酸。

４ａ．配列番号１、配列番号３、配列番号１７および配列番号１９の群から選択されるヌクレオチド配列から本質的になる、態様１ａまたは２ａに記載の核酸。

好ましい薬学的組成物：
１ｃ．態様１から１１のいずれか１つに記載のポリペプチドまたは態様１ａから４ａのいずれか１つに記載の核酸、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、薬学的組成物。

２ｃ．Ｃ．ディフィシル毒素ＡおよびＢの両方を中和する抗体を惹起する、態様１ｃに記載の薬学的組成物。

３ｃ．Ｃ．ディフィシル毒素ＡおよびＢに対する、対象における防御免疫反応を惹起する、態様１ｃまたは態様２ｃに記載の薬学的組成物。

４ｃ．アジュバントをさらに含む、態様１ｃから３ｃのいずれか１つに記載の薬学的組成物。

５ｃ．アジュバントが、ａｌｕｍを含む、態様４ｃに記載の薬学的組成物。

６ｃ．追加的な抗原または薬物をさらに含む、態様１ｃから５ｃのいずれか１つに記載の薬学的組成物。

好ましい抗体：１ｄ．態様１から１１のいずれか１つに記載のポリペプチドに対する抗体であるが、Ｃ．ディフィシル毒素Ａ（配列番号６）およびＢ（配列番号８）のいずれかまたは両方を認識しない抗体。

好ましい方法
１ｅ．態様１から１０のいずれか１つに記載のポリペプチドを生成するための方法であって、宿主細胞内に、ポリペプチドをコードする核酸を導入することと、ポリペプチドの発現を可能とする条件下で宿主細胞を培養することと、ポリペプチドを単離することとを含む方法。

２ｅ．宿主細胞は、大腸菌である、態様１ｅに記載の方法。

３ｅ．対象におけるＣ．ディフィシル関連疾患（ＣＤＡＤ）を治療および／または予防する方法であって、それを必要とする対象に、態様１から１１のいずれか１つに記載の単離ポリペプチドを投与することを含む方法。

４ｅ．対象においてＣ．ディフィシルの毒素ＡおよびＢの両方に対する特異的免疫反応を誘導する方法であって、態様１から１１のいずれか１つに記載のポリペプチドを対象に、または態様１ｃから６ｃのいずれか１つに記載の薬学的組成物を投与することを含む方法。

５ｅ．対象におけるＣ．ディフィシル感染により引き起こされる原発性疾患を予防する方法であって、態様１から１１のいずれか１つに記載のポリペプチドを対象に、または態様１ｃから６ｃのいずれか１つに記載の薬学的組成物を投与することを含む方法。

６ｅ．Ｃ．ディフィシル関連疾患（ＣＤＡＤ）のリスクを有する対象における Ｃ．ディフィシル感染により引き起こされる原発性疾患を予防する方法であって、ＣＤＡＤのリスクを有する前記対象は、ｉ）６５歳を超える対象、もしくは２歳未満の対象；ｉｉ）ＡＩＤＳを有する対象；ｉｉｉ）免疫抑制薬を投与されている、もしくは投与される予定がある対象；ｉｖ）入院の予定がある対象、もしくは入院している対象；ｖ）集中治療を受けている、もしくは受ける予定がある対象；ｖｉ）消化管手術を受けている、もしくは受ける予定がある対象；ｖｉｉ）養護施設等の長期介護を受けている、もしくは受ける予定がある対象；ｖｉｉｉ）頻繁な、および／もしくは長期的な抗生物質の使用を必要とする共存症を有する対象；またはｉｘ）再発性ＣＤＡＤを有する対象であり、前記方法は、態様１から１１のいずれか１つに記載のポリペプチドを前記対象に、または態様１ｃから６ｃのいずれか１つの薬学的組成物を投与することを含む方法。 ７ｅ．ポリペプチドまたは薬学的組成物は、対象に、筋肉内、皮内、皮下、経口、経鼻、または経直腸投与、好ましくは筋肉内投与される、態様１ｅから６ｅのいずれか１つに記載の方法。

８ｅ．ポリペプチドまたは薬学的組成物は、短い間隔（１週間毎または２週間毎）に少なくとも２回以内の投薬で対象に投与される、態様１ｅから７ｅのいずれか１つに記載の方法。

９ｅ．生体試料中のＣ．ディフィシルを検出する方法であって、生体試料を態様１から１１のいずれか１つに記載のポリペプチドと接触させることと、生体試料に対するポリペプチドの結合を検出することとを含み、ポリペプチドの結合は、生体試料中のＣ．ディフィシルの存在を示す方法。

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11A】

【図11B-C】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20A】

【図20B】

【図21】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]