特許 6126083 マイクロ流体デバイス内で外部ヒータ・システムを使用するシステムおよび方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6126083

(24)【登録日】2017年4月14日

(45)【発行日】2017年5月10日

(54)【発明の名称】マイクロ流体デバイス内で外部ヒータ・システムを使用するシステムおよび方法

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/00 20060101AFI20170424BHJP

   G01N 37/00 20060101ALN20170424BHJP

   C12Q 1/68 20060101ALN20170424BHJP

【ＦＩ】

   C12M1/00 A

   !G01N37/00 101

   !C12Q1/68 A

【請求項の数】34

【全頁数】34

(21)【出願番号】特願2014-511552(P2014-511552)

(86)(22)【出願日】2012年5月17日

(65)【公表番号】特表2014-515927(P2014-515927A)

(43)【公表日】2014年7月7日

(86)【国際出願番号】US2012038427

(87)【国際公開番号】WO2013101295

(87)【国際公開日】20130704

【審査請求日】2015年5月14日

(31)【優先権主張番号】61/487,069

(32)【優先日】2011年5月17日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/487,081

(32)【優先日】2011年5月17日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/487,269

(32)【優先日】2011年5月17日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】507028217

【氏名又は名称】キヤノン ユー．エス． ライフ サイエンシズ， インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＣＡＮＯＮ Ｕ．Ｓ． ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥＳ， ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100094112

【弁理士】

【氏名又は名称】岡部 讓

(74)【代理人】

【識別番号】100096943

【弁理士】

【氏名又は名称】臼井 伸一

(74)【代理人】

【識別番号】100102808

【弁理士】

【氏名又は名称】高梨 憲通

(74)【代理人】

【識別番号】100128646

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 恒夫

(74)【代理人】

【識別番号】100128668

【弁理士】

【氏名又は名称】齋藤 正巳

(74)【代理人】

【識別番号】100134393

【弁理士】

【氏名又は名称】木村 克彦

(74)【代理人】

【識別番号】100136799

【弁理士】

【氏名又は名称】本田 亜希

(72)【発明者】

【氏名】カーセイ，ジョナサン，エス．

(72)【発明者】

【氏名】ハッサン，ケントン，シー．

【審査官】 北田 祐介

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００６−５１７０２４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２０１０／０１６５７８４（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特開２０１１−０７１３０１（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｍ １／００−３／１０

Ｃ１２Ｑ １／００−３／００

Ｇ０１Ｎ ３３／００−３３／９８

Ｇ０１Ｎ ３５／００−３７／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ａ）複数の液溜めまたは流路を有するマイクロ流体デバイスと、
ｂ）前記マイクロ流体デバイス上に配設された前記液溜めまたは流路がヒートスプレッダと熱的に連通するようにして前記マイクロ流体デバイスに固着されるヒートスプレッダであって、該ヒートスプレッダの高伝導性の配向が、前記複数の液溜めまたは流路を有する面に平行に整列される、ヒートスプレッダと、
ｃ）前記ヒートスプレッダを加熱するための加熱手段と、
ｄ）１つもしくは複数の温度センサーを備える、前記流路または液溜めの１つもしくは複数の温度を測定するための測定手段とを備える、マイクロ流体デバイス用加熱システム。

【請求項2】

前記測定手段が、前記マイクロ流体デバイス内に埋め込まれた温度センサーおよび前記マイクロ流体デバイスの前記ヒートスプレッダに取り付けられた交換可能な外部の温度センサーを含む群から選択された、１つまたは複数の温度センサーを含む、請求項１に記載のシステム。

【請求項3】

前記外部センサーが、前記マイクロ流体デバイス上の温度帯域の熱キャパシタンスに合致する熱キャパシタンスを有する、請求項２に記載のシステム。

【請求項4】

前記埋め込みセンサーが、前記複数の液溜めまたは流体流路内のサンプルとの直接接触を防ぐように不活性化される、請求項２に記載のシステム。

【請求項5】

前記埋め込みセンサーが、ガラス、二酸化シリコン、窒化シリコン、シリコン、ポリシリコン、パリレン、ポリイミド、カプトン、またはベンゾシクロブテン（ＢＣＢ）のうち１つもしくは複数を含む不活性化材料を使用して不活性化される、請求項４に記載のシステム。

【請求項6】

前記ヒートスプレッダに取り付けられた外部抵抗ヒータをさらに備える、請求項１に記載のシステム。

【請求項7】

（ｉ）前記ヒートスプレッダに取り付けられた外部抵抗ヒータおよび外部温度センサーと、（ｉｉ）少なくとも１つの埋め込み温度センサーとをさらに備える、請求項１に記載のシステム。

【請求項8】

前記埋め込み温度センサーが抵抗温度検出器（ＲＴＤ）である、請求項７に記載のシステム。

【請求項9】

前記少なくとも１つの埋め込みＲＴＤが、温度センサーとヒータの両方として作用する、請求項８に記載のシステム。

【請求項10】

前記少なくとも１つの埋め込み温度センサーおよび前記ヒートスプレッダが、前記マイクロ流体デバイス上で空間的に離れて位置する、請求項７に記載のシステム。

【請求項11】

前記少なくとも１つの埋め込み温度センサーが、少なくとも部分的に前記ヒートスプレッダの下方にある、請求項７に記載のシステム。

【請求項12】

前記ヒートスプレッダが少なくとも一方向で対称である、請求項１に記載のシステム。

【請求項13】

前記ヒートスプレッダが、異方性熱伝導材料から、または異方性熱伝導材料を含む複合材料から作られる、請求項１に記載のシステム。

【請求項14】

異方性熱伝導熱界面材料が、前記ヒートスプレッダを前記マイクロ流体デバイスに接続する、請求項１に記載のシステム。

【請求項15】

前記異方性熱伝導材料が、グラファイト、グラフェン、天然由来もしくは合成由来のダイヤモンド、またはカーボンナノチューブ（ＣＮＴ）から成る群から選択される、請求項１３に記載のシステム。

【請求項16】

前記異方性熱伝導熱界面材料が、グラファイト、グラフェン、天然由来もしくは合成由来のダイヤモンド、またはカーボンナノチューブ（ＣＮＴ）から成る群から選択される、請求項１４に記載のシステム。

【請求項17】

前記異方性熱伝導材料が、最も高い熱伝導性を示すその配向が、前記複数の液溜めまたは流路が前記マイクロ流体デバイス上に配設される向きと整列されるようにして構成される、請求項１３に記載のシステム。

【請求項18】

前記異方性熱伝導熱界面材料が、最も高い熱伝導性を示すその配向が、前記複数の液溜めまたは流路が前記マイクロ流体デバイス上に配設される向きと整列されるようにして構成される、請求項１４に記載のシステム。

【請求項19】

前記ヒートスプレッダが、１つまたは複数のセンサーを取り付けるための１つまたは複数の陥凹部を含む、請求項１に記載のシステム。

【請求項20】

前記ヒートスプレッダ上に位置する少なくとも１つの温度センサーの上の絶縁体をさらに備える、請求項１に記載のシステム。

【請求項21】

前記ヒートスプレッダが、高圧を加えることによって前記マイクロ流体デバイスに固着される、請求項１に記載のシステム。

【請求項22】

前記高圧が、空気圧、ばねアセンブリ、打込みねじ、または自重によって発生する、請求項２１に記載のシステム。

【請求項23】

前記ヒートスプレッダが前記マイクロ流体デバイスに恒久的に固着される、請求項２１に記載のシステム。

【請求項24】

前記恒久的な接合がシアノアクリレート系接着剤を用いて作られる、請求項２３に記載のシステム。

【請求項25】

前記ヒートスプレッダが、相互接続の熱伝導性を増加させるナノ粒子またはマイクロ粒子を含む材料を使用して、前記マイクロ流体デバイスに固着される、請求項１に記載のシステム。

【請求項26】

前記ナノ粒子またはマイクロ粒子が、銀、金、アルミニウムおよびその合金、銅およびその合金、亜鉛、錫、鉄、ＣＮＴ、グラファイト、天然ダイヤモンド、人工ダイヤモンド、アルミナ、シリカ、チタニア、酸化亜鉛、酸化錫、酸化鉄、ならびに酸化ベリリウムを含む群から選択される、請求項２５に記載のシステム。

【請求項27】

前記ヒートスプレッダあるいは前記１つもしくは複数の流体流路または液溜めの温度を調節する冷却手段をさらに備える、請求項１に記載のシステム。

【請求項28】

前記冷却手段が、前記１つもしくは複数の流体流路または液溜めの中に存在するサンプルから熱損失を制限するように構成される、請求項２７に記載のシステム。

【請求項29】

前記冷却手段が、熱損失を制限することによって、前記マイクロ流体デバイス上の温度帯域内の温度の均一性を改善する、請求項２７に記載のシステム。

【請求項30】

前記冷却手段がＰＷＭファンまたはブロワーである、請求項２７に記載のシステム。

【請求項31】

核酸融解分析が前記マイクロ流体デバイス上で起こる、請求項１に記載のシステム。

【請求項32】

核酸融解分析の前にＤＮＡの増幅が前記マイクロ流体デバイス上で起こる、請求項３１に記載のシステム。

【請求項33】

前記核酸融解分析が、前記マイクロ流体デバイス上に提供される生体サンプルの遺伝子型を決定する、請求項３１に記載のシステム。

【請求項34】

前記加熱手段が、ペルチェ・デバイス、高温のガスもしくは流体との接触、光子線、レーザー、赤外線、および他の形態の電磁放射から成る群から選択される、請求項１に記載のシステム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、いずれも２０１１年５月１７日付けで出願された、米国仮特許出願第６１／４８７，２６９号、第６１／４８７，０８１号、および第６１／４８７，０６９号の利益を主張し、それらの内容全体を参照により本明細書に組み込む。

【0002】

下記の米国特許および出願も参照し、それら各々の全体を本明細書に組み込む。２０１１年５月１７日付けで発行された「Unsymmetrical Cyanine Dyes for High Resolution Nucleic Acid Melting Analysis」という名称の米国特許第７，９４３，３２０号、２００７年２月１日付けでＵＳ２００７／００２６４２１号として公開された「Method and apparatus for generating thermal melting curves in a microfluidic device」という名称の米国特許出願第１１／３５２，４５２号、２００７年１０月４日にＵＳ２００７／０２３１７９９号として公開された「Method and Apparatus for Applying Continuous Flow and Uniform Temperature to Generate Thermal Melting Curves in a Microfluidic Device」という名称の米国特許出願第１１／３８１，８９６号、２０１１年３月３日付けでＵＳ２０１１／００４８５４７号として公開された「Microfluidic Devices, Methods and Systems for Thermal Control」という名称の米国特許出願第１２／８２５，４７６号、２０１１年８月３１日付けで出願された「Thermal Calibration」という名称の米国特許出願第１３／２２３，２５８号、２０１２年３月１日付けでＵＳ２０１２／００５１３９０号として公開された「Compound Calibrator for Thermal Sensors」という名称の２０１１年８月３１日出願の米国特許出願第１３／２２３，２７０号、ならびに２０１２年３月１日付けでＵＳ２０１２／００５２５６０号として公開された「System and Method for Rapid Serial Processing of Multiple Nucleic Acid Assays」という名称の２０１１年８月３１日出願の米国特許出願第１３／２２３，２９０号。

【0003】

本発明は、マイクロ流体デバイス用加熱システム、および生体反応を行うためのマイクロ流体デバイスの温度制御に関する。より詳細には、本発明は、マイクロ流体デバイス内のヒートスプレッダを利用して、外部ヒータ・システムの温度を校正、決定および制御するためのシステムおよび方法に関する。

【背景技術】

【0004】

核酸の検出は、医学、法科学、生産加工、作物および動物育種、ならびに他の多くの分野の中核を成す。疾病状態（例えば、がん）、感染性の微生物（例えば、ＨＩＶ）、遺伝系統、遺伝標識などを検出する能力は、疾病の診断および予後、マーカー利用選抜、犯罪現場の特徴の識別、工業用微生物の伝播能力、ならびに他の多くの技術のためのユビキタス技術である。対象となる核酸の完全性の決定は、感染またはがんの病理学に関連する可能性がある。

【0005】

少量の核酸を検出する最も効果的かつ基本的な技術の１つは、核酸配列の一部または全体を多数回複製し、次に増幅産物を分析するというものである。ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を増幅するための周知の技術である。ＰＣＲを用いて、単一テンプレートＤＮＡ分子から始まる数百万のＤＮＡコピーを生成することができる。ＰＣＲは、「変性」、「アニーリング」、および「伸長」の段階を含む。これらの段階は、多数回繰り返されるサイクルの一部であるので、プロセスの終了時には、検出され分析される十分な数のコピーが存在する。ＰＣＲに関する全般的な詳細については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ Ｅｄ．），Ｖｏｌｓ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２０００）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ２００５）、ならびにＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）を参照されたい。

【0006】

変性、アニーリング、および伸長というＰＣＲプロセスの段階は、異なる温度で生じ、標的ＤＮＡ分子サンプルにそれら自体を複製させる。温度サイクリング（熱サイクリング）の要件は、特定の核酸サンプルおよびアッセイに応じて変わる。変性段階で、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）が熱的に分離されて一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）となる。アニーリング段階で、プライマーが一本鎖ＤＮＡ分子に付着される。一本鎖ＤＮＡ分子は、ＰＣＲ溶液中のヌクレオチドと一本鎖ＤＮＡとの間の特異的結合を通して、伸長段階で再び二本鎖ＤＮＡへと成長する。一般的な温度は、変性の場合は９５℃、アニーリングの場合は５５℃、伸長の場合は７２℃である。温度は、各段階において、数分の一秒〜数十秒であってもよい特定の時間量の間保持される。ＤＮＡは各サイクルで二重にされ、一般に、特定の用途に十分なＤＮＡを生成するには２０〜４０サイクルを要する。標的の産物の良好な収率を得るためには、異なる段階におけるサンプル温度を指定の温度に精密に制御しなければならない。

【0007】

さらに最近は、例えば、マイクロ流体デバイス内での増幅反応を伴うもの、ならびに増幅した核酸をデバイス内またはデバイス上で検出し分析する方法といった、ＰＣＲおよび他の増幅反応を行うための多数の高スループットの方策が開発されてきている。増幅のためのサンプルの熱サイクリングは、通常、２つの方法のうち１つで遂行される。第１の方法では、従来のＰＣＲ機器に非常に類似して、サンプル溶液をデバイスに取り込み、温度を時間内に循環させる。第２の方法では、温度帯域を空間的に変動させることによって、サンプル溶液を継続的に給送する。例えば、Ｌａｇａｌｌｙ ｅｔ ａｌ．（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７３：５６５−５７０（２００１））、Ｋｏｐｐ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８０：１０４６−１０４８（１９９８）、Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７５：６０２９−６０３３（２００３））、Ｈａｈｎ ｅｔ ａｌ．（ＷＯ２００５／０７５６８３）、Ｅｎｚｅｌｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（米国特許第６，９６０，４３７号）、ならびにＫｎａｐｐ ｅｔ ａｌ．（米国特許出願公開第２００５／００４２６３９号）を参照されたい。

【0008】

多くの検出方法は、ＤＮＡを特性決定するために、元のＤＮＡ分子のコピーを定められた多数個（例えば、数百万個）必要とする。所望のコピー数に対してサイクルの合計数が固定されるので、プロセス時間を低減する唯一の手法はサイクルの長さを低減することである。したがって、合計のプロセス時間は、サンプルをプロセス段階の温度まで迅速に加熱および冷却する一方で、プロセス段階の持続時間の間それらの温度を精密に維持することによって、大幅に低減することができる。

【0009】

融解分析の技術は、増幅に続いて核酸分子を分析するための標準的なツールになってきている。融解分析は、高分解能融解（ＦＩＲＭ）、熱融解、および融解曲線分析といった分野でも言及されており、増幅の変性段階の原理に依存している。つまり、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）が高温に晒されるにつれて、特定の温度でｄｓＤＮＡは一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）へと分離され、それによって、光検出し分析することができる蛍光マーカーなど、任意の結合検出剤が放出される。これらの技術は広く使用されているが、ほとんどのシステムは、サンプルが挿入されて、加熱空気を通してサンプル・チューブ／毛細管を回転させるか、または勾配に沿った位置に基づいてサンプルを異なる温度に晒す温度勾配を確立する、ヒータブロックに依存する。したがって、温度測定は、ヒータブロック、空気、または温度勾配の両端の測定に基づく。

【0010】

例えば、Ｉｄａｈｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．およびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｕｔａｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎによる米国特許第７，７８５，７７６号は、第１９欄において、「円筒状の毛細管がアルミニウム製のシリンダによって完全に取り囲まれているため、高分解能機器は、より高いサンプル中の温度均一性をも担保する」ことを記載している。

【0011】

同様に、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｕｔａｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎによる米国特許第７，５８２，４２９号は、第３段落において、「様々なタイプのサーモサイクラーがＰＣＲを行うことについて文献で説明されてきた。本発明の実施形態とともに採用されてもよいＨＲＭを備えた一部のタイプのサーモサイクラーとしては、ＡＢ７３００、ＨＲ−１ＴＭ、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０（登録商標）、Ｍａｓｔｅｒ Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）、ＬｉｇｈｔＳｃａｎｎｅｒ（登録商標）、およびＲｏｔｏｒＧｅｎｅ（商標）が挙げられるが、それらに限定されない。これらの機器はそれぞれ、一般的に、リアルタイムＰＣＲ反応およびその後に続くＨＲＭを提供する。」として、融解能力を備えた多数の市販機器の概略を提供している。しかし、これらのデバイスはそれぞれ、チューブもしくは毛細管が挿入されるヒータブロックを使用するか、またはＲｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ Ｑなどのように空気中で回転される毛細管を特徴とする。

【0012】

さらに、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｕｔａｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎによる米国特許出願第１２／５１４，６７１号は、空間的温度勾配（即ち、温度が意図的に非均一にされる）に基づいた融解分析の一般的な代替の構成について説明している。

【0013】

融解温度または曲線形状の小さな変化を精密に区別することができるような、十分に再現可能な融解曲線を作り出す、高スループットのデバイスが望ましい。具体的には、これらの融解曲線を作り出す加熱システムは、融解曲線の小さな変化が、単に加熱システムの望ましくない偏差ではなく、対象サンプルにおける偏差（即ち、突然変異）に帰することができる、高い再現性を有さなければならない。

【0014】

当該分野は、大型の固定ヒータブロックを使用して、対象サンプルを並列処理するための方法について説明している。スループットは、固定数の対象サンプルを保持し、ゆっくりと加熱されるヒータブロックのサイズによって制限される。加熱ブロックが大きいと、温度の非均一性によって再現性も劣る。毛細管に基づくものを含む他の方策は、スループットと再現性との間の均衡の点で同様の欠点を有する。

【0015】

したがって、当該分野において、各サンプルを制御された均一な温度プロファイルに晒す高スループットのシステムが必要とされている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0016】

【特許文献1】ＷＯ２００５／０７５６８３

【特許文献2】米国特許第６，９６０，４３７号

【特許文献3】米国特許出願公開第２００５／００４２６３９号

【特許文献4】米国特許第７，７８５，７７６号

【特許文献5】米国特許第７，５８２，４２９号

【特許文献6】米国特許出願第１２／５１４，６７１号

【特許文献7】米国特許出願第１３／２２３，２５８号

【非特許文献】

【0017】

【非特許文献1】Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ Ｅｄ．），Ｖｏｌｓ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２０００）

【非特許文献2】Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ２００５）

【非特許文献3】ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）

【非特許文献4】Ｌａｇａｌｌｙ ｅｔ ａｌ．（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７３：５６５−５７０（２００１））

【非特許文献5】Ｋｏｐｐ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８０：１０４６−１０４８（１９９８）

【非特許文献6】Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７５：６０２９−６０３３（２００３））

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0018】

本発明は、核酸の解離挙動の分析および核酸の識別に有用なマイクロ流体デバイスを含む、マイクロ流体デバイスのための方法およびシステムに関する。より具体的には、本発明の実施形態は、核酸の変性データの分析を含む、マイクロ流体デバイスを加熱するための方法およびシステムに関する。さらに、本発明の実施形態は、マイクロ流体デバイス用加熱システムを校正するための方法およびシステムに関する。

【0019】

一実施形態では、本発明は、マイクロ流体デバイス用加熱システムであって、１つもしくは複数の液溜めまたは流路を有するマイクロ流体デバイスと、前記マイクロ流体デバイス上に配設された液溜めまたは流路がヒートスプレッダと熱的に連通するようにしてマイクロ流体デバイスに固着されるヒートスプレッダと、ヒートスプレッダを加熱するための加熱手段と、１つもしくは複数の温度センサーを備える、流路または液溜めの１つもしくは複数の温度を測定するための測定手段とを備える、加熱システムを提供する。この実施形態によれば、測定手段は、マイクロ流体デバイス内に埋め込まれた温度センサーおよびマイクロ流体デバイスの外部の温度センサーを含む群から選択された、１つもしくは複数の温度センサーを含む。一実施形態では、１つまたは複数の外部センサーは、マイクロ流体デバイス上の温度帯域の熱キャパシタンスに合致する熱キャパシタンスを有する。さらなる実施形態では、埋め込みセンサーは、１つもしくは複数の液溜めまたは流体流路内のサンプルとの直接接触を防ぐように不活性化される。別の実施形態では、不活性化材料は、ガラス、二酸化シリコン、窒化シリコン、シリコン、ポリシリコン、パリレン、ポリイミド、カプトン、またはベンゾシクロブテン（ＢＣＢ）のうち１つもしくは複数を含む。

【0020】

一実施形態では、システムは外部抵抗ヒータをさらに備える。さらなる実施形態では、システムは、（ｉ）ヒートスプレッダに取り付けられた外部抵抗ヒータおよび外部温度センサーと、（ｉｉ）少なくとも１つの埋め込み抵抗温度検出器（ＲＴＤ）とをさらに備える。さらなる別の実施形態では、少なくとも１つの埋め込みＲＴＤは、温度センサーおよびヒータの両方として作用する。一実施形態では、少なくとも１つのＲＴＤおよびヒートスプレッダは、マイクロ流体デバイス上で空間的に離れて位置する。別の実施形態では、少なくとも１つのＲＴＤは、少なくとも部分的にヒートスプレッダの下方に位置する。

【0021】

一実施形態では、ヒートスプレッダは少なくとも一方向で対称である。別の実施形態では、ヒートスプレッダは、異方性熱伝導材料から、または異方性熱伝導材料を含む複合材料から作られる。さらなる実施形態では、異方性熱伝導熱界面材料は、ヒートスプレッダをマイクロ流体デバイスに接続する。さらに別の実施形態では、異方性熱伝導材料は、グラファイト、グラフェン、天然由来もしくは合成由来のダイヤモンド、またはカーボンナノチューブ（ＣＮＴ）から成る群から選択される。別の実施形態では、異方性熱伝導材料は、最も高い熱伝導性を示すその配向が、１つもしくは複数の液溜めまたは流路がマイクロ流体デバイス上に配設される向きと整列されるようにして構成される。

【0022】

別の実施形態では、システムは、１つまたは複数のセンサーを取り付けるための１つまたは複数の陥凹部を含むヒートスプレッダをさらに備える。さらなる実施形態では、ヒートスプレッダ上に位置する少なくとも１つの温度センサーの上に絶縁体が存在する。一実施形態では、ヒートスプレッダは、高圧を加えることによってマイクロ流体デバイスに固着される。さらなる実施形態では、高圧は、空気圧、ばねアセンブリ、打込みねじ、または自重によって発生する。さらに別の実施形態では、ヒートスプレッダは、マイクロ流体デバイスに恒久的に固着される。一実施形態では、恒久的な接合はシアノアクリレート系接着剤を用いて作られる。

【0023】

一実施形態では、ヒートスプレッダは、相互接続の熱伝導性を増加させるナノ粒子またはマイクロ粒子を含む材料を使用して、マイクロ流体デバイスに固着される。別の実施形態では、ナノ粒子またはマイクロ粒子は、銀、金、アルミニウムおよびその合金、銅およびその合金、亜鉛、錫、鉄、ＣＮＴ、グラファイト、天然ダイヤモンド、人工ダイヤモンド、アルミナ、シリカ、チタニア、酸化亜鉛、酸化錫、酸化鉄、ならびに酸化ベリリウムを含む群から選択される。

【0024】

別の実施形態では、システムは、ヒートスプレッダあるいは１つもしくは複数の流体流路または液溜めの温度を調節する冷却手段をさらに備える。一実施形態では、冷却手段は、１つもしくは複数の流体流路または液溜めの中に存在するサンプルからの熱損失を制限するように構成される。別の実施形態では、冷却手段は、熱損失を制限することによって、温度帯域内の温度の均一性を改善する。さらなる実施形態では、冷却手段はＰＷＭファンまたはブロワーである。

【0025】

一実施形態では、本発明は、マイクロ流体デバイス上で起こる核酸融解分析を行うために構成されたシステムを提供する。別の実施形態では、核酸融解分析の前にＤＮＡの増幅がマイクロ流体デバイス上で起こる。さらなる実施形態では、核酸融解分析は、マイクロ流体デバイス上に提供される生体サンプルの遺伝子型を決定する。

【0026】

本発明の１つの態様では、１つもしくは複数の流体流路または液溜めを有し、マイクロ流体デバイスと熱接触している熱伝導性のヒートスプレッダを有するマイクロ流体デバイスを提供することと、ヒートスプレッダの温度を上昇させて、マイクロ流体デバイス上にほぼ均一な温度帯域を作り出すため、加熱手段を使用することと、ヒートスプレッダあるいは１つもしくは複数の流体流路または液溜めの温度を決定するため、測定手段を使用することとを含む、マイクロ流体デバイスを均一に加熱する方法が提供される。

【0027】

一実施形態では、測定手段は、マイクロ流体デバイス内に埋め込まれた温度センサー、およびマイクロ流体デバイスの外部の温度センサーを含む群から選択された、１つまたは複数の温度センサーを含む。別の実施形態では、ヒートスプレッダは、１つまたは複数の温度センサーを取り付けるための１つまたは複数の陥凹部を含む。さらなる実施形態では、ヒートスプレッダ上に位置する少なくとも１つの温度センサーの上に絶縁体が存在する。一実施形態では、外部温度センサーはマイクロ流体デバイスまたはヒートスプレッダと接触している。別の実施形態では、温度センサーは加熱手段をさらに制御する。

【0028】

一実施形態では、マイクロ流体デバイスは外部抵抗ヒータをさらに備える。さらなる実施形態では、マイクロ流体デバイスは、（ｉ）ヒートスプレッダに取り付けられた外部抵抗ヒータおよび外部温度センサーと、（ｉｉ）少なくとも１つの埋め込み抵抗温度検出器（ＲＴＤ）とをさらに備える。さらなる別の実施形態では、少なくとも１つの埋め込みＲＴＤは、温度センサーおよびヒータの両方として作用する。一実施形態では、少なくとも１つのＲＴＤおよびヒートスプレッダは、マイクロ流体デバイス上で空間的に離れて位置する。別の実施形態では、少なくとも１つのＲＴＤは、少なくとも部分的にヒートスプレッダの下方に位置する。

【0029】

一実施形態では、方法は、得られた温度測定値に応答して、ヒートスプレッダあるいは１つもしくは複数の流体流路または液溜めの温度を調節するため、冷却手段を使用するステップをさらに含む。一実施形態では、冷却手段は、１つもしくは複数の流体流路または液溜めの中に存在するサンプルからの熱損失を制限するように構成される。別の実施形態では、冷却手段は、熱損失を制限することによって温度帯域内の温度の均一性を改善する。さらなる実施形態では、冷却手段はＰＷＭファンまたはブロワーである。

【0030】

別の実施形態では、温度センサーは、ヒートスプレッダに取り付けられた少なくとも１つの交換可能な外部センサーを含む。さらなる実施形態では、ヒートスプレッダは少なくとも一方向で対称である。一実施形態では、ヒートスプレッダは、異方性熱伝導材料から、または異方性熱伝導材料を含む複合材料から作られる。別の実施形態では、異方性熱伝導熱界面材料は、ヒートスプレッダをマイクロ流体デバイスに接続する。さらなる実施形態では、異方性熱伝導材料は、グラファイト、グラフェン、天然由来もしくは合成由来のダイヤモンド、またはカーボンナノチューブ（ＣＮＴ）から成る群から選択される。さらなる別の実施形態では、異方性熱伝導材料は、最も高い熱伝導性を示すその配向が、１つもしくは複数の液溜めまたは流路がマイクロ流体デバイス上に配設される向きと整列されるようにして構成される。

【0031】

一実施形態では、ヒートスプレッダは、高圧を加えることによってマイクロ流体デバイスに固着される。別の実施形態では、ヒートスプレッダは、マイクロ流体デバイスに恒久的に固着される。さらなる実施形態では、恒久的な接合はシアノアクリレート系接着剤を用いて作られる。別の実施形態では、ヒートスプレッダは、相互接続の熱伝導性を増加させるナノ粒子またはマイクロ粒子を含む材料を使用して、マイクロ流体デバイスに固着される。さらに別の埋め込みでは、ナノ粒子またはマイクロ粒子は、銀、金、アルミニウムおよびその合金、銅およびその合金、亜鉛、錫、鉄、ＣＮＴ、グラファイト、天然ダイヤモンド、人工ダイヤモンド、アルミナ、シリカ、チタニア、酸化亜鉛、酸化錫、酸化鉄、ならびに酸化ベリリウムを含む群から選択される。

【0032】

一実施形態では、方法は、加熱手段を校正することをさらに含み、加熱手段の校正は、滑らかな加熱プロファイルが存在するかを判断するため、ヒートスプレッダと接触している少なくとも１つのセンサーからの温度データを分析することと、必要であれば滑らかな加熱プロファイルを得るように加熱手段を調節することとを含む。別の実施形態では、加熱手段の校正は、マイクロ流体デバイスの外部にあってマイクロ流体と熱的に連通している温度センサーの動的応答を監視するため、マイクロ流体デバイス上に埋め込まれた１つまたは複数のセンサー素子からのデータを分析することを含む。一実施形態では、加熱手段の校正は、既知の熱的特性を有する対照サンプルを１つもしくは複数の流体流路または液溜めに導入することをさらに含む。別の実施形態では、既知の熱的特性は核酸の融解温度であり、および対照サンプルが野生型ＤＮＡ、単位複製配列、オリゴヌクレオチドあるいはそれの混合物の１つ以上を含む。さらなる実施形態では、対照サンプルは超保存エレメント（ＵＣＥ）を含む。さらなる別の実施形態では、対照サンプルは、未知のサンプルを含有する１つもしくは複数の流体流路または液溜めと同じ均一な温度帯域にある１つもしくは複数の流体流路または液溜めに導入される。

【0033】

別の実施形態では、１つまたは複数の外部センサーは、マイクロ流体デバイス上の温度帯域の熱キャパシタンスに合致する熱キャパシタンスを有する。別の実施形態では、加熱は、１つもしくは複数の流体流路または液溜めの中の任意の核酸を含有するサンプルが核酸融解分析に掛けられるように、ヒートスプレッダの温度を第１の温度から第２の温度まで上昇させることを含む。

【0034】

一実施形態では、サンプル中に存在する任意の核酸は、融解分析の前にマイクロ流体デバイス上で核酸増幅に掛けられる。別の実施形態では、核酸融解分析はサンプルの遺伝子型を決定する。

【0035】

別の実施形態では、１つまたは複数の埋め込み温度センサーは、マイクロ流体デバイス上の液溜めまたは流体流路の下方に位置する。一実施形態では、埋め込みセンサーは、１つもしくは複数の液溜めまたは流体流路の中のサンプルとの直接接触を防ぐように不活性化される。さらなる実施形態では、不活性化材料は、ガラス、二酸化シリコン、窒化シリコン、シリコン、ポリシリコン、パリレン、ポリイミド、カプトン、またはベンゾシクロブテン（ＢＣＢ）のうち１つもしくは複数を含む。

【0036】

１つの態様では、本発明は、マイクロ流体デバイス上の加熱手段を校正する方法であって、１つまたは複数のマイクロ流体流路と、マイクロ流体デバイスと熱的に連通しており、マイクロ流体デバイスに固着されたヒートスプレッダおよびヒートスプレッダと熱的に連通している１つもしくは複数の温度センサーを備える加熱手段と、マイクロ流体流路を通して流体を移動させるための手段と、温度測定手段と、光検出システムと、分析手段とを備える、マイクロ流体デバイスを提供することと、既知の熱的性質を有する対照サンプルを１つもしくは複数のマイクロ流体流路に導入することと、対照サンプルをマイクロ流体流路内へと移動させることと、加熱手段によってマイクロ流体流路の温度を徐々に上昇させることと、光検出システムを用いて光信号について対照サンプルを監視するか、またはヒートスプレッダと接触している少なくとも１つのセンサーからの温度データを監視することと、滑らかな加熱プロファイルが存在するかを判断するため、温度データを分析することと、必要であれば滑らかな加熱プロファイルを得るように加熱手段を調節することとを含む、方法を提供する。一実施形態では、対照サンプルは、野生型ＤＮＡ、単位複製配列、オリゴヌクレオチド、またはそれらの混合物のうち１つもしくは複数を含む。別の実施形態では、対照サンプルは超保存エレメント（ＵＣＥ）を含む。さらなる実施形態では、既知の熱的性質は核酸の融解温度である。

【0037】

一実施形態では、マイクロ流体デバイスは外部抵抗ヒータをさらに備える。さらなる実施形態では、マイクロ流体デバイスは、（ｉ）ヒートスプレッダに取り付けられた外部抵抗ヒータおよび外部温度センサーと、（ｉｉ）少なくとも１つの埋め込み抵抗温度検出器（ＲＴＤ）とをさらに備える。さらなる別の実施形態では、少なくとも１つの埋め込みＲＴＤは、温度センサーおよびヒータの両方として作用する。一実施形態では、少なくとも１つのＲＴＤおよびヒートスプレッダは、マイクロ流体デバイス上で空間的に離れて位置する。別の実施形態では、少なくとも１つのＲＴＤは、少なくとも部分的にヒートスプレッダの下方に位置する。

【0038】

別の態様では、本発明は、マイクロ流体デバイス上で核酸融解分析を行う方法であって、１つまたは複数のマイクロ流体流路と、マイクロ流体デバイスと熱的に連通しており、マイクロ流体デバイスに固着されたヒートスプレッダ、外部ヒータ、およびヒートスプレッダと熱的に連通している１つもしくは複数の温度センサーを備える加熱手段と、マイクロ流体流路を通して流体を移動させるための手段と、温度測定手段と、光検出システムと、分析手段とを備える、マイクロ流体デバイスを提供することと、生体サンプルをマイクロ流体流路に導入することと、サンプルをマイクロ流体流路内へと移動させることと、加熱手段によってマイクロ流体流路の温度を徐々に上昇させることと、光検出システムを用いて光信号についてサンプルを監視することと、サンプルの融解温度を決定するため、検出された光信号を分析することとを含む、方法を提供する。一実施形態では、サンプルは、核酸融解分析の前にマイクロ流体デバイス内で核酸増幅を受ける。別の実施形態では、検出された光信号を分析するステップは、融解温度プロットを準備することを含む。さらなる実施形態では、光信号は蛍光信号である。一実施形態では、マイクロ流体デバイスは、少なくとも１つの埋め込み抵抗温度検出器（ＲＴＤ）をさらに備える。別の実施形態では、少なくとも１つの埋め込みＲＴＤは、温度センサーおよびヒータの両方として作用する。さらなる実施形態では、少なくとも１つのＲＴＤおよびヒートスプレッダは、マイクロ流体デバイス上で空間的に離れて位置する。別の実施形態では、少なくとも１つのＲＴＤは、少なくとも部分的にヒートスプレッダの下方に位置する。

【0039】

１つの態様では、本発明は、１つまたは複数のマイクロ流体流路を備えるマイクロ流体デバイスと、マイクロ流体デバイスと熱的に連通しており、マイクロ流体デバイスに固着されたヒートスプレッダおよびヒートスプレッダと熱的に連通している１つもしくは複数の温度センサーを備える加熱手段と、マイクロ流体流路を通して流体を移動させるための手段と、温度測定手段と、光検出システムと、分析手段とを備える、マイクロ流体システムを提供する。

【図面の簡単な説明】

【0040】

【図1】システム図である。

【図2】マイクロ流体チップの図である。

【図3】ヒートスプレッダを有するマイクロ流体チップを示す図である。

【図4】対称的なヒータ・システム配置の図である。

【図5A】対称的なヒータ・システム配置の図である。

【図5B】対称的なヒータ・システム配置の図である。

【図6】システム図である。

【図7】システム図である。

【図8】ヒートスプレッダおよびヒートシンクを備えたマイクロ流体チップの上面図および下面図を示すＣＡＤ図である。

【図9】一実施形態によるマイクロ流体チップを示す図である。

【図10A】一実施形態によるマイクロ流体チップを示す図である。

【図10B】ヒートスプレッダと熱接触しているマイクロ流体チップの範囲を示す感熱写真である。

【図11】一実施形態によるマイクロ流体チップを示す図である。

【図12】ヒータ電圧（Ｖ）対時間（ｓ）のグラフである。

【図13】サーミスタを制御するための回路を示す図である。

【図14】校正中の帯域２における蛍光強度を示す図である。

【図15A】帯域２の校正チェック中に得られる蛍光対温度、即ち微分曲線を示すグラフである。

【図15B】帯域２の校正チェック中に得られる蛍光対温度、即ち微分曲線を示すグラフである。

【図16A】帯域２の校正チェック中に得られる蛍光対温度、即ち微分曲線を示すグラフである。

【図16B】帯域２の校正チェック中に得られる蛍光対温度、即ち微分曲線を示すグラフである。

【図17】相対温度対帯域２の始まりからの距離のグラフである。

【図18A】融解プロファイルおよび正規化プロットを示す図である。

【図18B】融解プロファイルおよび正規化プロットを示す図である。

【図19A】融解プロファイルおよび正規化プロットを示す図である。

【図19B】融解プロファイルおよび正規化プロットを示す図である。

【図20A】流路間の温度差を示す温度対マイクロ流体流路数のグラフである。

【図20B】流路間の温度差を示す温度対マイクロ流体流路数のグラフである。

【図20C】流路間の温度差を示す温度対マイクロ流体流路数のグラフである。

【図20D】流路間の温度差を示す温度対マイクロ流体流路数のグラフである。

【図21A】流路間の温度差を示す温度対マイクロ流体流路数のグラフである。

【図21B】流路間の温度差を示す温度対マイクロ流体流路数のグラフである。

【図21C】流路間の温度差を示す温度対マイクロ流体流路数のグラフである。

【図21D】流路間の温度差を示す温度対マイクロ流体流路数のグラフである。

【図22A】温度対経過時間のグラフである。

【図22B】温度対経過時間のグラフである。

【図22C】温度対経過時間のグラフである。

【図22D】温度対経過時間のグラフである。

【図23A】温度対経過時間のグラフである。

【図23B】温度対経過時間のグラフである。

【図23C】温度対経過時間のグラフである。

【図23D】温度対経過時間のグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0041】

マイクロ流体デバイス用加熱システム、ならびに生体反応を行うためのマイクロ流体デバイスの温度制御のシステムおよび方法の実施形態を、図面を参照して本明細書に記載する。

【0042】

図１は、本発明の一実施形態によるマイクロ流体システム１００を示す。図１に示されるように、マイクロ流体システム１００は、マイクロ流体デバイス１０１と温度制御回路１０２とを有する。温度制御回路１０２は、システム・コントローラ１０３と、ヒータ制御・測定回路１０４と、デジタル・アナログ変換器（ＤＡＣ）１０５と、アナログ・デジタル変換器（ＡＤＣ）１０６とを有する。ＤＡＣ １０５およびＡＤＣ １０６は、システム・コントローラ１０３およびヒータ制御・測定回路１０４とは別個のものとして図１に示されているが、その代わりに、ＤＡＣ １０５およびＡＣＤ １０６は、システム・コントローラ１０３またはヒータ制御・測定回路１０４の一部であってもよい。それに加えて、温度制御回路１０２は、マイクロ流体デバイス１０１を監視する光学システム１０７を含んでもよい。

【0043】

コンパクトなマイクロ流体デバイスは、限定された空間内で多数の機能を要する。一実施形態では、本発明は、分子診断で使用される非常に効率的なマイクロ流体デバイス１０１である。２つの可能な特定の用途は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および高分解能熱融解である。

【0044】

ＰＣＲは、ＤＮＡ増幅を要する分子診断および他のゲノム分析用途における最も一般的かつ重大なプロセスの１つである。ＰＣＲでは、標的ＤＮＡ分子は、変性、アニーリング、および伸長という三段階の温度サイクルを通して複製される。変性ステップで、二本鎖ＤＮＡが熱的に分離されて一本鎖ＤＮＡとなる。アニーリング・ステップで、プライマーが一本鎖ＤＮＡとハイブリッド形成する。伸長ステップで、プライマーは、ポリメラーゼ酵素によってヌクレオチドを組み込んで、標的ＤＮＡ分子上で伸長される。

【0045】

一般的なＰＣＲ温度は、変性の場合は９５℃、アニーリングの場合は５５℃、伸長の場合は７２℃である。ステップの間の温度は、数分の一秒〜数秒の時間量の間保持されてもよい。原則として、ＤＮＡは各サイクルにおいて量が二倍になり、所望量の増幅を完了するには約２０〜４０サイクルを要する。標的の産物の良好な収率を得るためには、各ステップにおけるサンプル温度を各ステップに対する所望の温度に制御しなければならない。プロセス時間を低減するために、サンプルを所望の温度まで非常に迅速に加熱および冷却し、それらの温度を、各サイクルにおけるＤＮＡ分子の合成を完了するための所望の時間長の間保たなければならない。

【0046】

図２に示されるマイクロ流体デバイス１０１は、本発明の外部ヒータにしたがって利用することができる。図２２は、薄膜抵抗温度検出器（ＲＴＤ）２１２に隣接する複数のマイクロ流路２０２を示す。例えば、マイクロ流路２０２の下層にＲＴＤ ２１２があってもよい。ＲＴＤ ２１２は、精密な温度センサーならびに速応性のヒータとして機能する。さらに、廃熱を減少させるとともに、別個の機能的帯域２０４（即ち、帯域１またはＰＣＲ帯域）および２０６（即ち、帯域２またはＰＣＲ帯域）をより良好に熱的に隔離するため、薄膜ＲＴＤは、ＲＴＤ ２１２よりも伝導性が高い、リード線または電極２１０および２１１を含む。電極２１０および２１１は、任意の適切な導体材料であってもよく、好ましい一実施形態では金である。ＲＴＤ ２１２は、温度に対する良好な応答を示し、かつヒータとして使用することができる、任意の適切な抵抗材料から作られてもよい。適切なＲＴＤ材料としては、プラチナおよびニッケルが挙げられるが、それらに限定されない。

【0047】

図２に示されるように、マイクロ流体デバイス１０１は、基板２０１を横切って延在する複数のマイクロ流体流路２０２を有してもよい。図示される実施形態は８つの流路２０２を示すが、より少数またはより多数の流路を含むことができる。各流路２０２は、１つまたは複数の入口ポート２０３（図示される実施形態は、流路２０２当たり２つの入口ポート２０３を示す）と、１つまたは複数の出口ポート２０５（図示される実施形態は、流路２０２当たり１つの出口ポート２０５を示す）とを含んでもよい。各流路は、ＰＣＲ熱帯域２０４を通って延在する第１の部分と、熱融解帯域２０６を通って延在する第２の部分とを含んでもよい。シッパー（sipper）（図示なし）を使用して、液体を複数のマイクロ流体流路２０２に引き込むことができる。

【0048】

マイクロ流体デバイス２００は、薄膜抵抗熱検出器（ＲＴＤ）２１２の形態であってもよいヒータ素子をさらに含む。一実施形態では、１つまたは複数のヒータ素子２１２は、各マイクロ流体流路２０２と関連付けられ、マイクロ流体流路２０２に隣接して位置する。例えば、各マイクロ流体流路２０２は、１つまたは複数の加熱素子２１２上で上方に（あるいは別の方法でそれらに隣接して）載置されてもよい。図示される実施形態では、ヒータ素子２１２（１）〜（８）は、ＰＣＲ熱帯域２０４のマイクロ流体流路２０２と関連付けられ、ヒータ素子２１２（９）〜（１６）は、熱融解帯域２０６に位置するマイクロ流体流路と関連付けられる。例えば、ヒータ素子２１２（１）および２１２（９）は、ヒータ素子２１２（１）がＰＣＲ熱帯域２０４に位置し、ヒータ素子２１２（９）が熱融解帯域２０６に位置して、１つのマイクロ流体流路２０２と関連付けられる。

【0049】

ヒータ電極２１０および２１１は、複数の加熱素子２１２に電力を供給することができる。マイクロ流体デバイス１０１の基板２０１によって提供される限定された空間を最も良好に利用し、必要な電気接続の数を低減するため、複数のＲＴＤは一対の共通電極２１１を共有する。ヒータ電極２１０および２１１は、個別電極２１０および共通電極２１１を含む。共通電極の各対は、例えば、第１の共通電極２１１（ａ）および第２の共通電極２１１（ｂ）を含む。共通電極の対２１１によって、マイクロ流体センサーを三線モードで制御することが可能になる。

【0050】

図２の一例として、１６個のＲＴＤヒータ素子２１２（１）〜２１２（１６）と、１６個の個別電極２１０（１）〜２１０（１６）と、４つの共通電極対２１１（１）〜２１１（４）とが存在する。したがって、図２に示されるように、４つの第１の共通電極２１１（１ａ）〜２１１（４ａ）と、４つの第２の共通電極２１１（１ｂ）〜２１１（４ｂ）とが存在する。各ヒータ素子２１２は、個別電極２１０および一対の共通電極２１１に接続される。複数のヒータ素子２１２が一対の共通電極２１１を共有し、その結果、共通電極対２１１によって多重化される。例えば、ＲＴＤ ２１２（１）は、個別電極２１０（１）と、一対の共通電極２１１（１ａ）および２１１（１ｂ）とに接続される。

【0051】

図２に示されるマイクロ流体デバイス１０１および抵抗回路網は、四対の共通電極２１１それぞれに接続された４つのヒータ素子２１２を有するが、より多数またはより少数のＲＴＤが各共通電極対２１１によって多重化されてもよい。さらに、より多数またはより少数の共通電極対２１１が、ヒータ素子のより多数またはより少数の多重化された組を作り出すのに使用されてもよい。

【0052】

マイクロ流体デバイス１０１のヒータ素子２１２はそれぞれ、迅速な加熱および温度感知のために独立して制御することができる。その結果、ＰＣＲ熱帯域２０４におけるマイクロ流体流路２０２の温度は、熱融解帯域２０６におけるマイクロ流体流路２０２の温度とは独立して制御されてもよい。また、帯域２０４または２０６における各マイクロ流体流路２０２の温度は、帯域２０４または２０６における他のマイクロ流体流路２０２の温度とは独立して制御されてもよい。

【0053】

しかし、マイクロ流体デバイス１０１は、図２に示されるように、マイクロ流体流路２０２の加熱の均一性に対する制限を受ける。したがって、本発明の一実施形態では、図３に示されるように、熱ヒートスプレッダ３１３がマイクロ流体デバイス１０１に固着される。非限定的な一実施形態では、ヒートスプレッダ３１３は帯域２０６（即ち、帯域２または熱融解帯域）の上に固着されてもよい。

【0054】

本発明で記載されるヒートスプレッダ３１３および相互接続材料は、非均一な加熱の問題を解決し、物理的構成を通して均一性が担保されるため、高度に再現可能な融解曲線を作り出すことが可能になる。従来技術は、微小規模での均一性、またはサンプルが加熱システムと断続的に熱接触するように配置された場合は常に存在する再現性の問題に対処してこなかった。したがって、本発明は、これらの課題に対処し、結果として融解の改善をもたらす（したがって、その目的のために設計されたシステム上での遺伝子型決定を改善する）ヒートスプレッダ３１３をどのように設計し構築するかについて詳述する。

【0055】

一実施形態では、適切なヒートスプレッダ３１３材料としては、銅およびその合金、アルミニウムおよびその合金、銀、セラミックス（特に、アルミナおよび酸化ベリリウム）、ならびにグラファイトおよび人工ダイヤモンド（化学蒸着（ＣＶＤ）ダイヤモンド・ウェハなど）などの異方性導電材料が挙げられるが、それらに限定されない。さらに、ヒートスプレッダ３１３は、上述の材料のいずれかを含む複合材料から作られてもよい。熱拡散能力を向上させる高熱伝導材料が含まれることを条件として、複合材料のヒートスプレッダ３１３は、ポリマー樹脂などの低熱伝導材料ベースであってもよい。複合材料のヒートスプレッダ３１３に含めるのに適した他の材料としては、例外的かつ異方性の熱伝導性を有する、グラフェンおよびカーボンナノチューブ（ＣＮＴ）（単層および多層ＣＮＴの両方）が挙げられる。

【0056】

異方性のヒートスプレッダ３１３は、最も高い熱伝導性をもたらす配向が、マイクロ流体デバイス１０１上に配設されるサンプル液溜め／マイクロ流路２０２間の温度の均一性を促進するように整列されるようにして、構成されるのが好ましい。１つの特定の例では、所与の面に複数のマイクロ流路が埋め込まれたマイクロ流体デバイス１０１の場合、ヒートスプレッダ３１３の高伝導性の配向は、マイクロ流路２０２を特徴づける面に平行に整列されるであろう。

【0057】

本発明のいくつかの非限定的な実施形態では、加熱システム（ヒートスプレッダ３１３、加熱手段、および任意の外部センサーを含む）は、サンプル液溜め／マイクロ流路２０２および融解分析領域２０６に関して対称である。システムを対称にすることは、熱の均一性を促進して、各サンプルが同じ熱プロファイルを経験することを担保するという理由で好ましい。１つまたは複数の対称中心線が、熱の均一性を向上させるために使用されてもよい。好ましくは、ヒートスプレッダ３１３は、融解分析領域２０６に関して対称的に位置する。加熱素子（１つもしくは複数）および任意の温度センサーも、好ましくは、融解分析領域に関して対称的に位置する。いくつかの対称的な加熱システム配置の非限定例は、図４および図５Ａ〜Ｂに示され、それらの図は対称中心線を示す破線を有する。

【0058】

ヒートスプレッダ３１３は、ヒートスプレッダ３１３およびマイクロ流体デバイス１０１の効率的な相互接続を通して、温度の均一性を担保する（融解の再現性を担保する）ように構成すべきである。相互接続の熱抵抗を最小限に抑えるため、ヒートスプレッダ３１３をマイクロ流体デバイス１０１に押し付けて、エアギャップを排除するか、または少なくとも最小限に抑えるべきである。一実施形態では、熱グリース、シリコーン、グラファイト、鉱油、金属箔（特に、錫、鉛、インジウム、銀、およびこれらの合金）、ナノ粒子配合グリースおよびシリコーン、ならびに他のギャップ充填材料が、ヒートスプレッダ３１３とマイクロ流体デバイス１０１との間の断続的な接合の熱伝導性を向上させてもよい。

【0059】

一実施形態では、断続的な接合がヒートスプレッダ３１３とマイクロ流体デバイス１０１との間で作られる場合、圧力下で行われることが好ましい。圧力は、システムの重量によって引き起こすことができるが、１５０ｐｓｉ（１０３４．２ｋＰａ）以上の高圧が好ましくは使用される。圧力の上限は、デバイスを構築するのに使用される材料の強度によって決定される。一実施形態では、１０〜１５０ｐｓｉ（６８．９〜１０３４．２ｋＰａ）の範囲の圧力が好ましい。別の実施形態では、空気圧、ばねアセンブリ、打込みねじ、および自重のすべてが、必要な圧力を提供するのに使用されてもよい。

【0060】

代替実施形態では、熱の均一性は、マイクロ流体デバイス１０１に対するヒートスプレッダ３１３の恒久的な接合を使用することによって担保することができる。ヒートスプレッダ３１３をマイクロ流体デバイス１０１に恒久的に接合するための、様々な方法が開発された。ヒートスプレッダ３１３は、好ましくは、ボイド・フリーの接合をもたらす薄い熱伝導材料を使用して、マイクロ流体デバイス１０１に接合される。好ましくは、シアノアクリレート系接着剤（クレイジー・グルー、または強力瞬間接着剤と呼ばれることが多い、例えばＬｏｃｔｉｔｅ ４２０）は、非常に粘性が低いために、広げて薄いボンドラインにすることができるため、接合に使用される。代替の接着剤としては、光活性化型（紫外線を含む）、室温硬化型、もしくは加熱硬化型接着剤、または当業者には知られている、ボイド・フリーの接合の形成を可能にする類似の性質を有する他の任意の接着剤が挙げられる。熱伝導性であって厚さが均一であることに加えて、接着剤は、融解分析に必要な温度（一般的に、ＤＮＡの融解分析の場合、約１００℃以下）において安定していることが好ましい。

【0061】

あるいは、ヒートスプレッダ接合３１３に対するマイクロ流体デバイス１０１は、グラファイト、グラフェン、ダイヤモンド（天然および人工由来のものを含む）、またはＣＮＴ（単層および多層ＣＮＴを含む）が挙げられるがそれらに限定されない異方性熱界面材料（ＴＩＭ）によって作ることができる。これらの材料は、少なくとも一方向で例外的な熱伝導性を示す。異方性材料は、最も高い熱伝導性をもたらす配向が、マイクロ流体デバイス１０１上に配設されるサンプル液溜め／マイクロ流路２０２間の温度の均一性を促進するように整列されるようにして、構成されるのが好ましい。いくつかの実施形態では、ＴＩＭは、ＴＩＭの接着を促進する感圧性接着剤（ＰＳＡ）などの、１つまたは複数の追加の接着剤層を含んでもよい。これらの追加の接着剤層は、シリコーンもしくはアクリル系接着剤、または当業者には知られている他のものであってもよい。

【0062】

あるいは、マイクロ流体デバイスを加熱システムに接合するのに使用される接着剤は、接合の全体的な熱伝導性を向上するため、熱伝導性粒子を含んでもよい。これらの粒子は、ナノスケールまたはマイクロスケールであってもよく、金属、炭素、およびセラミック粒子を含んでもよい。いくつかの適切な粒子としては、銀、金、アルミニウムおよびその合金、銅およびその合金、亜鉛、錫、鉄、ＣＮＴ、グラファイト、ダイヤモンド、アルミナ、シリカ、チタニア、酸化亜鉛、酸化錫、酸化鉄、および酸化ベリリウムが挙げられるが、それらに限定されない。これらの同じタイプの粒子は、上述したナノ粒子配合グリースおよびシリコーンで使用されてもよい。

【0063】

加熱システムとマイクロ流体デバイスとの間の薄いボンドラインを担保するため、本発明の一実施形態によれば、高圧下で接合がなされる。一実施形態では、高圧は、空気圧、ばねアセンブリ、打込みねじ、または自重によって作ることができる。あるいは、使用される圧力は１ｐｓｉ（６．９ｋＰａ）程度の低いもの、またはそれより少ないものであってもよい。圧力の上限は、デバイスを構築するのに使用される材料の強度によって決定される。非限定的な一実施形態では、１０〜１５０ｐｓｉ（６８．９〜１０３４．２ｋＰａ）の範囲の圧力が好ましい。

【0064】

本発明の一実施形態では、本明細書に記載するヒートスプレッド・デバイス３１３および相互接続材料は、マイクロ流体システム１００に含まれてもよく、より具体的には、図６に示されるような融解分析用の包括的な加熱システムに含まれてもよい。一実施形態では、包括的な加熱システムは、融解分析用に処理される１つまたは複数のサンプルを保持する、マイクロ流体デバイス１０１を含んでもよい。サンプルは、液溜めまたはマイクロ流路２０２内にあってもよく、静止しているか、またはデバイスを通って流れていてもよい。包括的な加熱システム６２２は、マイクロ流体デバイス１０１の融解分析領域における熱の均一性を促進するように構成される、ヒートスプレッダ３１３をさらに含んでもよい。ヒートスプレッダ３１３は、良好な熱伝導性を備えた材料（任意に、複合材料）から形成され、マイクロ流体デバイス１０１と密接に接触していなければならない。ヒートスプレッダとマイクロ流体デバイスとの間の接触は、熱抵抗が低いものでなければならず、いくつかの実施形態では、恒久的な接合である。加熱手段６１９は、ジュール加熱および非ジュール加熱を含んでもよい。加熱手段の非限定例としては、ペルチェ・デバイス、高温のガスもしくは流体との接触、光子線、レーザー、赤外線、または他の形態の電磁放射が挙げられる。加熱手段６１９は、好ましくは、表面実装抵抗器などの単純で安価な抵抗ヒータである。包括的な加熱システム６２２はまた、加熱システム６２２の冷却を提供する任意の冷却手段６２０を含んでもよい。いくつかの実施形態では、任意の冷却手段６２０は、１つもしくは複数のファンまたはブロワーであることができる。さらに、いくつかの実施形態では、任意に、１つまたは複数の外部センサー６２１がヒートスプレッダ３１３と熱的に連通していてもよい。これらのセンサー６２１は、ヒートスプレッダ３１３の温度の基準、および融解分析領域２０６における温度の推定値を提供してもよい。

【0065】

別の実施形態では、包括的な加熱システム６２２は、加熱および温度感知を制御する加熱システム・コントローラ１０４を含んでもよい。さらに、包括的な加熱システム６２２は、マイクロ流体デバイス１０１自体の上に埋め込まれた加熱システムとセンサー２１２との間の連通を可能にする任意の構成を含んでもよい。包括的な加熱システム６２２はまた、一実施形態では、加熱システム・コントローラ１０４を制御するシステム・コントローラ１０３、ならびに図７に示されるような、マイクロ流体デバイス１０１と併せて利用されてもよい他の任意のシステムを含んでもよい。

【0066】

具体的には、流体制御および光制御システムが、融解分析を行うのに必要とされることがある。システム・コントローラ１０３は、サンプル調製およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの融解分析、またはマイクロ流体デバイス上に含まれることがある他の任意の機能とは直接関係がない、マイクロ流体デバイスの他の態様を制御してもよい。

【0067】

一実施形態では、光学システムは、マイクロ流体デバイスおよびそれが含有するサンプルを照明するデバイス７２８を含む。光学システムはまた、マイクロ流体デバイス上のサンプルからの蛍光放射に基づく強度データを収集する、画像化デバイス７２７を含む。流体システムは、マイクロ流体デバイス上のあらゆる流体フローを始動および制御するため、ポンプ７２４および圧力制御素子７２５を含んでもよい。システム・コントローラ１０３は、コントローラが制御する熱／光学システムから収集する熱／光データを使用して、１つもしくは複数の融解曲線または熱的性質曲線を作り出してもよい。

【0068】

図３は、陥凹部３１４がヒートスプレッダ３１３に作られる、本発明の一実施形態をさらに示す。陥凹部３１４は、当業者には知られている任意の方法によって、ヒートスプレッダ３１３に形成されてもよい。本発明の非限定的な一実施形態では、封入サーミスタ３１６をヒートスプレッダ３１３上に提供することができる。好ましい一実施形態では、封入サーミスタ３１６は陥凹部３１４内に位置する。さらなる実施形態では、陥凹部３１４は、伝導性エポキシまたは当該分野で知られている他の材料など、熱伝導材料で埋め戻されてもよい。封入サーミスタ３１６は、温度センサーとして機能し、陥凹部３１４内におけるその配置により、サーミスタ３１６は、ヒートスプレッダ３１３の温度を精密に感知する一方で熱損失を低減することができるであろう。本発明の非限定的な一実施形態では、サーミスタ３１６は、当業者には知られている他の温度センサーと置き換えることができ、したがって、本出願は、サーミスタ３１６が温度センサー３１６と交換可能であるものとして理解されるべきである。いくつかの実施形態では、熱損失を制限するとともに、感知素子（１つもしくは複数）３１６とヒートスプレッダ３１３との間における温度の良好な一致を担保にするため、高い気泡率を備えた発泡体または他の適切な材料などの絶縁体が、加熱システムの外側に添加されてもよい。

【0069】

図３は、熱を供給するための、ヒートスプレッダ３１３上における膜抵抗器３１７の配置をさらに示す。当業者であれば、本発明に記載されるような代替の加熱源が、膜抵抗器３１７の代わりに用いられてもよく、したがって、本出願は、膜抵抗器３１７がヒータ３１７と交換可能であるものとして理解されるべきであることを認識するであろう。いくつかの非限定的な実施形態では、ヒータ３１７に取り付ける前に、ヒートスプレッダ３１３上に不活性化層３１５が提供される。不活性化層は、ヒータ３１７とヒートスプレッダ３１３との間の電気的短絡を防ぐのに利用されてもよい。一実施形態では、単純な黒色塗料の層が、短絡を防ぐのに十分なことがある。別の実施形態では、本明細書に記載されるような他の適切な不活性化材料が使用されてもよい。

【0070】

本発明の態様を具体化するマイクロシステムのＣＡＤモデルが、上面図および下面図の両方として図８に示される。この例示的なシステムは、ＰＣＲおよびそれに続く高分解能融解分析用に設計されており、いくつかの態様において、参照により本出願に組み込まれる特許および特許出願に記載されているシステムに類似している。システムは、マイクロ流路２０２と関連付けられた特性を制御し測定する、複数のマイクロ流路２０２および複数の電極２１０、２１１を特徴とするマイクロ流体デバイス１０１を含む。この例では、融解領域にある埋め込み電極２１０、２１１は、融解分析用のサンプル温度を決定する温度センサーとして使用される。ヒートシンク８２９は、デバイスのＰＣＲ部分に対して付加的な冷却を提供するため、デバイスの上流側部分に恒久的に固着される。銅板のヒートスプレッダ３１３は、融解領域にあるデバイスの下流側部分に恒久的に固着される。この実例となる実施形態では、膜抵抗器３１７および封入サーミスタ３１６は、それぞれ熱を提供し、温度を感知するため、ヒートスプレッダ３１３上に含まれる。

【0071】

別の非限定的な実施形態では、本発明のいくつかの態様を具体化するプロトタイプが図９に示される。このプロトタイプでは、アルミニウム板のヒートスプレッダ３１３は、ガラス製マイクロチップに恒久的に固着され、２つの膜抵抗器３１７が加熱に使用され、単一の抵抗温度検出器（ＲＴＤ）３１６が温度感知に使用される。この加熱システムは、２つの対称中心線（リード線を無視する）を特徴とする。この非限定的な実施形態は、２つ以上のヒータおよび／または２つ以上の温度センサーが、本発明のヒートスプレッダ３１３と併せて利用されてもよいことを実証している。

【0072】

本発明のいくつかの態様を具体化する別のプロトタイプが図１０Ａに示される。このプロトタイプは、単一のヒータ３１７を特徴とし、やはり２つの対称中心線（リード線を無視する）を特徴とする。図１０Ｂに示される熱画像は、ヒートスプレッダ３１３と熱接触しているマイクロ流体デバイス１０１の範囲によって達成される温度均一性を実証している。

【0073】

本明細書で考察されるヒートスプレッド・デバイスおよび相互接続材料を含む、本明細書に記載される方法およびシステムは、スタンドアロン型の融解分析プラットフォームで使用されてもよい。しかし、それらはまた、サンプル調製、ＤＮＡ抽出、ＤＮＡ増幅、およびＰＣＲが挙げられるがそれらに限定されない、他のプロセスおよびシステムと組み合わされてもよい。考察されるヒートスプレッド・デバイスおよび相互接続材料は、ＤＮＡ増幅（例えば、ＰＣＲ）およびそれに続く熱融解分析を行う、マイクロ流体プラットフォーム（図１１）上に含まれてもよい。この実例となる実施形態では、複数の対象サンプルを同時に並行して処理することができる。サンプル中のＤＮＡは、ＰＣＲ帯域で増幅され、次いでその直後に融解分析領域で融解される。サンプルの遺伝子型は、改善された融解分析システムを使用して決定されてもよい。この構成では、増幅および分析の両方に対して１つの器具のみが必要とされる。さらに、デバイスのＰＣＲ部分は、本明細書に記載されるようなデバイスの融解部分を校正するのに使用される対照を増幅するために使用されてもよい。このデバイスの微小規模によって迅速な加熱および冷却が可能になり、それによって処理時間が最小限に抑えられることが担保される。ヒートスプレッダおよび相互接続材料によって作り出される大面積の熱の均一性によって、並列のマイクロ流路それぞれを高い再現性で融解分析に使用できることが担保される。

【0074】

本発明はまた、コストおよびスループットの点で大きな利点を提供する使い捨てのマイクロ流体プラットフォームに基づく、本明細書に記載されるような融解分析方法に関する。記載される方法によって、均一性および一貫性が担保されることから、高い再現性の融解曲線を作り出すことが可能になる。従来技術は、マイクロシステムにおける融解分析の再現性、または温度勾配によって存在する再現性の問題に対処してこなかった。埋め込みセンサーは、動的な温度応答の問題に対する理想的な解決策である。さらに、制御／校正方法は、均一性および埋め込みセンサーを利用して、融解分析の質に対してより一層大きな向上を提供する。本発明はさらに、個々に、かつ組み合わせて、改善された融解の結果（およびその目的のために設計されたシステム上での改善された遺伝子型決定）をもたらす、融解システムのための制御方法について詳述する。

【0075】

また、任意に、一実施形態では、本発明の加熱システムは、ヒートスプレッダと熱的に連通している１つまたは複数の外部センサーを含んでもよい。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の外部センサーは、マイクロ流体デバイスまたはヒートスプレッダに恒久的に取り付けられる。これらのセンサーは、ヒートスプレッダの温度の基準、および融解分析領域における温度の推定値を提供する。非限定的な一実施形態では、センサー３１６は、図１３に示されるような回路を介して、システム・コントローラ１０３またはヒータ制御部１０４によって制御されてもよい。

【0076】

本発明のさらなる実施形態では、システムは、加熱および温度感知を制御する加熱システム・コントローラをさらに備える。任意に、加熱システム・コントローラは、図２に示されるような、マイクロ流体デバイス１０１自体の上に埋め込まれたセンサー２１２と通信して（そこからの信号を制御し受信して）もよい。これらの埋め込みセンサーは、融解帯域の温度測定に使用されてもよく、または熱が融解帯域に達する時間を感知するのに使用されてもよい。

【0077】

本発明は、また、加熱システム・コントローラが、加熱手段、冷却手段（例えば、ファンおよびブロワー）、ならびに融解領域もしくはヒートスプレッダにおける温度を決定するのに使用される任意のセンサーからの信号を制御し受信してもよいものと規定する。加熱手段は、比例積分偏差（ＰＩＤ）、オン／オフ、またはパルス幅変調（ＰＷＭ）制御が挙げられるがそれらに限定されない、当該分野で知られている任意の標準的な制御スキームを使用して制御されてもよい。加熱手段はまた、フィードバック制御によって決定される速度ではなく所定の速度で熱が提供される、「開ループ」モードで駆動されてもよい。開ループ制御の１つの方法は、図１２に示されるような、ヒータ電圧を傾斜した階段状にすることである。ヒータに滑らかな入力電圧を与えることによって、ヒートスプレッダの温度が滑らかに上昇して、より質の良い（より低ノイズの）融解曲線がもたらされるので、これらの開ループ方法は有利である。さらに、１つまたは複数の温度センサー（埋め込みもしくは外部）は、開ループを実行することができる滑らかな加熱プロファイルを生成するため、校正ステップで使用されてもよい。この滑らかな校正済みプロファイルを作成するため、第１のフィードバック制御を使用して必要とされるおよその電力（またはヒータ電圧）を決定して、所望の温度プロファイルを作成してもよい。電力（またはヒータ電圧）は、当業者には知られている曲線適合技術を使用して、所定のモデル（例えば、傾斜階段モデルなど）に適合させることができる。次に、適合されたヒータ電力または電圧プロファイルを使用して、フィードバック・コントローラによって作り出される望ましくないノイズを伴わずに、滑らかな加熱プロファイルを作成することができる。

【0078】

融解領域２０６における熱の均一性を促進し、加熱手段の電力要件を低減するため、本発明の一実施形態では、冷却システムを制御するために様々な方法が任意に使用されてもよい。１つの例示的な冷却システム制御方法は、気流が加熱システムに直接衝突するのを防ぐ、物理的な障壁またはバッフルを含めるというものである。気流が加熱システムに衝突するのを防ぐ物理的な障壁によって、熱損失が減少し、それによって熱勾配が低下する。熱勾配がより低いことで、融解分析領域における温度の均一性はより良好であり、任意の外部センサーの温度は、融解されているサンプルの温度とより良好に一致する。別の冷却システム制御方法は、任意の冷却ファン／ブロワーのパルス幅変調（ＰＷＭ）を含む。あるいは、当業者には知られている他の制御メカニズムを使用することができる。ファンおよびブロワーは、融解分析後の冷却を加速させるために含まれてもよく、または、ＰＣＲのための急速冷却を促進するなど、融解分析に直接関係しない他のシステム機能の役割を果たしてもよい。一実施形態では、上述の理由で融解分析用の加熱システムの上の気流を制限するため、即ち熱損失を低減し、均一性を促進するため、ＰＷＭを使用することができる。別の実施形態では、融解後など、デバイスを冷却しなければならないときに、迅速な冷却のための高いデューティサイクル（ＤＣ）を使用することができる。融解中など、デバイスを加熱しなければならないとき、気流を制限する低いＤＣを使用することができる。

【0079】

本発明のいくつかの実施形態は、上述したような外部センサーを含んでもよい。これらは、融解領域２０６内の１つもしくは複数の温度を感知するのに使用されてもよく、またはヒートスプレッダ３１３を制御するのに使用されてもよく、または両方を行ってもよい。ＲＴＤ、サーミスタ、ダイオード、他の半導体デバイス、熱電対、高温測定、熱反射、または当該分野で知られている他のデバイス／方法を含む外部センサーは、事実上接触性または非接触性であってもよい。外部センサーは、好ましくは、その動的な熱応答に関してマイクロ流体デバイスに合致する。熱は、加熱手段から融解領域および外部センサーの両方まで移動しなければならないので、熱が両方の場所に同時に達することが好ましい。センサーと融解領域との間の良好な過渡的な一致を担保するため、センサーおよびマイクロ流体デバイスの熱キャパシタンスは合致しなければならない。

【0080】

具体的には、それら２つの質量に比熱容量を乗じたものは、ほぼ等しくあるべきである（ｍ１＊ｃｐ１〜ｍ２＊ｃｐ２）。２つがより緊密に合致するほど、過渡的な一致はより良好になる。さらに、加熱手段から同様の距離に、センサーおよびマイクロ流体デバイスを位置させるように注意しなければならない。また、これらの比較的低いコンダクタンスの材料が動的な不一致に寄与することがあるので、接合および注封材料の選択に注意しなければならない。例えば、埋め込み金属センサーを特徴とするガラス製のマイクロ流体デバイスと合致させるために、類似のサイズの金属センサー素子をやはり特徴とするガラス封入サーミスタを使用して、熱キャパシタンスを合致させてもよい。

【0081】

いくつかの実施形態では、融解分析のための融解領域の温度は、外部センサーに依存するのではなく、マイクロ流体デバイス自体の上の１つまたは複数の素子によって感知される。任意に、外部センサーは、加熱手段を制御するため、加熱システムに依然として含まれてもよい。マイクロ流体デバイス上の感知素子を含むデバイスの一例が、図２に示される。この非限定例では、８つの薄膜プラチナ・センサー（ＲＴＤ）が、融解されるサンプルを含有する８つの対象マイクロ流路の下にある。この例におけるセンサーは、マイクロ流路の下方にあり、サンプルがセンサーと直接接触するのを防ぐ、薄いガラスの不活性化層によって覆われる。金属は生体サンプルと反応することが知られているので、不活性化層は汚染源を防ぐ。さらに、不活性化は、センサー中の電流をサンプルから電気的に絶縁するので、サンプルの電解を防いでもよい。他の不活性化材料としては、二酸化シリコン、窒化シリコン、シリコン、ポリシリコン、パリレン、ポリイミド（例えば、カプトン）、およびベンゾシクロブテン（ＢＣＢ）が挙げられるがそれらに限定されない。マイクロ流路の側壁上にある、またはサンプル液溜め／流路間に位置するセンサーなど、他のセンサーからサンプルまでの構成が想到される。このように（微小規模で）流路に密着させてセンサーを配置することは、熱損失による影響がより少ないため、精度および再現性の点で利点を有する。容量性デバイス、抵抗性デバイス、半導体デバイス、および熱電対が挙げられるがそれらに限定されない、様々なセンサーを使用することができる。本明細書に記載される薄膜ＲＴＤを含む埋め込みセンサー構成は、加工が簡単で再現性が高いので好ましい。

【0082】

一実施形態では、マイクロ流体デバイス上に埋め込まれた１つまたは複数のセンサー素子はまた、外部センサーの動的応答を校正するのに使用されてもよい。センサーと融解領域との間における温度の過渡的な一致についての上述の考察を参照すると、埋め込みセンサーは、マイクロ流体デバイス上のセンサーと融解領域との間に存在することがある何らかの熱的遅れを決定するのに使用されてもよい。この構成では、融解分析のための精密な温度測定が外部センサーを用いて行われる場合、埋め込みセンサーは温度の測定において精密でなくてもよい。しかし、センサーで測定される温度プロファイルを、マイクロ流体デバイス上で融解したサンプルが経験する温度プロファイルに変換することができるように、埋め込みセンサーは、熱が到達する時間を精密に測定しなければならない。あるいは、埋め込みセンサーは、融解分析のための温度を測定するのに使用されてもよく、校正ステップは、外部センサーを使用して制御されてもよい加熱手段の制御を改善するのに使用されてもよい。

【0083】

望ましくない熱をサンプルに付加することなく、あらゆる埋め込みセンサーを読むように注意しなければならない。この問題は、一般に自己加熱と呼ばれる。自己加熱を低減するため、埋め込みセンサーは低圧／低電流で励起されるべきである。例えば、センサーは、分圧器回路の高抵抗感知抵抗器を使用して読まれてもよい。高抵抗感知抵抗器は、センサー素子を通る電流を制限し、望ましくない自己加熱を低減する。非限定的な一実施形態では、２．７ｋΩの感知抵抗器および１．５Ｖの電源とともに、〜３０Ωの埋め込みＲＴＤセンサーが使用される。センサーのこの例におけるワット損は、わずかに９マイクロワットであり、これは無視できる熱量である。

【0084】

いくつかの実施形態では、外部センサーは、デバイスの精度要件を満たすための校正を要する。この校正は、融解分析を処理する機器で行われてもよく、またはマイクロ流体デバイスの使用前に行われてもよい。

【0085】

いくつかの実施形態では、追加の校正を何ら伴わずに指定の公差を達成するように製造された「使い捨て」または「交換可能な」センサーを含むことによって、１つまたは複数の外部センサーを校正なしに使用することができる。「ポイント・マッチ」および「曲線追跡センサー」の両方が使用されてもよい。ポイント・マッチ・センサーは、特定の温度点において指定の公差内で精密であるように指定される。曲線追跡センサーは、２つのポイント間のすべての温度において指定の公差内で精密である（例えば、０〜１００℃で±０．２℃、または０〜７０℃で±０．１℃）ように指定される。適切な交換可能なサーミスタは、特に、ＨｏｎｅｙｗｅｌｌおよびＧＥから入手可能である。

【0086】

いくつかの実施形態では、１つもしくは複数の外部または埋め込みセンサーは、その融解性質が周知である対照を取り込むまたは流すことによって、校正されてもよい。対照を融解することによって、融解領域の温度が正確に校正されてもよい。対照は、野生型ＤＮＡ、単位複製配列、オリゴヌクレオチド、または単位複製配列もしくはオリゴヌクレオチドの混合物であることができる。対照は、ヒトゲノムＤＮＡ、別の有機体からのＤＮＡ、または完全な合成物に基づくものであることができる。対照はまた、ヒト、ラット、およびマウスのゲノムのオルソロガス領域間で確実に保存される、いわゆる超保存エレメント（ＵＣＥ）であることができる。ＵＣＥの利益は、すべてのヒトゲノムサンプルに存在し、かつ同一であることである。対照は、サンプル液溜め／流路の１つまたは複数で使用されてもよい。対照は、試験中のサンプルを分析するための融解の実行と同時に（並列化を利用）、またはその前に実行されてもよい。対照はまた、融解分析のために望ましい再現性の目標を達成するために繰り返されてもよい。均一性を改善する（冷却の向上、および熱伝導性のヒートスプレッダなど）上述の加熱システムの態様によって、試験中のものとは異なる対照を流路に通すことが可能になることに留意されたい。具体的には、本発明の加熱システムによって、両方の流路が同じ大きな熱的に均一な帯域内に位置するため、同じ熱プロファイルを経験することが担保されるので、対照を１つの流路に通す一方で、未知のサンプルを別の流路に通すことができる。別個の液溜め／流路に対照を入れることは、近接した間隔の並列したマイクロ流路を特徴とするデバイスにとって、理想的な構成である。

【実施例】

【0087】

熱の均一性および融解温度の安定性
試験条件およびカートリッジ性能
ヒートスプレッダおよび外部ヒータを特徴とする４つのマイクロ流体カートリッジ上に１７個の融解物のロングパネルを通すことによって、温度の均一性および融解の安定性を評価した。パネルは、ＵＣＥ １７と２Ｃ９＊３アッセイとの間で交互にした（合計で、ＵＣＥ １７の９個の融解物および８個の２Ｃ９＊３）。２つのアッセイを使用して、２つの異なる標的の安定性および均一性をある程度比較した。同じ２つのアッセイの複数の融解物は、統計値、ならびに時間に伴う浮動を決定するのに有用であった。

【0088】

ＰＣＲ試薬（ブランキング溶液、ＤＮＡサンプル・バッファー、＊３プライマー、ＵＣＥ １７プライマー、ポリメラーゼ、ＲＦＣａｌおよびＣＵＬＳバッファー）を、機器によって自動混合した。ＰＣＲを行い、それに続いて熱融解を行った。ＰＣＲおよび熱融解の条件は次の通りであった。０．２５秒の漸増遷移を含めて９５℃で２分、０．２５秒の漸減遷移を含めて５５℃で１．５分、さらに、６．５秒の漸増遷移を含めて７２℃で６．５分。熱融解条件は、標準的に１℃／秒で６５℃から９５℃までの傾斜を含んでいた。

【0089】

外部温度センサーは、プラチナ・トレース測定と比較して、温度がずれることが見出された。ずれは、マイクロ流体カートリッジごとに変動したが、所与のマイクロ流体カートリッジに対しては、時間に伴って、かつ複数の流路にわたって同じであった。サーミスタの読取り値からの温度のずれは、校正済みＰｔトレースよりも７．５℃〜１１．７℃低い範囲であった。

【0090】

このずれは、ヒートスプレッダおよびサーミスタのリード線に衝突する冷却気流に関係するものと考えられた。外部温度センサーを依然として使用して、温度の傾斜を制御し、融解物を検出することができるが、測定される融解範囲および温度は、Ｐｔトレースの測定値と比べてずれることになる。

【0091】

温度の均一性
上述したＰＣＲおよび熱融解の実行中、外部ヒータを有さないカートリッジで実行される対照よりも、外部ヒータははるかに均一に融解することが観察された。外部ヒータを有さないカートリッジで使用されるプラチナ（Ｐｔ）トレースの加熱によって、単位複製配列が最初に融解帯域（帯域２）の中央で融解するときに顕著である大きな温度勾配がもたらされた。流路１および８は、プラチナ・トレースの加熱を備えたカートリッジ内で最初に流路の内部から融解することが観察された。銅板が帯域２全体にわたって温度を有効に均等化したので、これらの効果は外部ヒータ・カートリッジ内では存在しなかった。この改善された温度の均一性の結果、外部加熱システムにおける融解曲線は従来のシステムのものよりも急であった。さらに、外部ヒータによって、内部または外部の流路からの融解物間の差はなかった。図１４は、試験された８個のカートリッジすべてに対する帯域２の校正チェック融解物を示す（米国特許出願第１３／２２３，２５８号および米国特許出願第１３／２２３，２７０号に記載されている標準的な校正方法を使用）。外部ヒータ融解物は、従来のカートリッジで作られたものよりも良好に整列した。さらに、従来のカートリッジはすべて、流路２〜７に比べて流路１および８の融解曲線に歪みが示されたが、外部ヒータ・カートリッジのいずれもこの挙動を示さなかった。図１４は、温度の均一性を示す、外部ヒータを有する帯域２全体で同時に蛍光強度が減少したことを実証している。対照的に、プラチナ・トレース加熱では、顕著なホットスポットがトレースの中央にはっきり現れている。Ｐｔトレース加熱における温度勾配は、特に、内部よりも外部がより低温である流路１および８に関して問題である。

【0092】

図１５Ａおよび１５Ｂは、外部ヒータ・システムを用いた（左側）、および用いない（右側）帯域２の１校正チェックの結果を示す。外部ヒータによって、融解物はより良好に整列され、外部流路の挙動は内部流路に類似する。対照的に、流路１および８は、従来のカートリッジとは異なる融解形状を有する（このことは、高温機構の微分曲線において最も明白であり、外部流路はより低くより広いピークを有する）。

【0093】

図１６Ａおよび１６Ｂは、第２のカートリッジ組についての、外部ヒータ・システムを用いた（左側）、および用いない（右側）帯域２の２校正チェックの結果を示す。やはり、外部ヒータによって、融解物はより良好に整列され、外部流路の挙動は内部流路に類似することが分かった。対照的に、流路１および８は、従来のカートリッジとは異なる融解形状を有する（このことは、高温機構の微分曲線において最も明白であり、外部流路はより低くより広いピークを有する）。

【0094】

均一性の別の基準を、流路が単位複製配列で完全に充填された校正チェックからの画像データを使用することによって作った。所与の流路の長さに沿って位置する対象領域（ＲＯＩ）において融解がいつ生じたかを比較することによって（図１７）、相対温度分布を決定した（即ち、単位複製配列は最も高温の領域で最初に融解する）。図１７は、従来のカートリッジと比較した外部ヒータ・カートリッジの相対温度分布を示す。分布は、ＲＦＣａｌ単位複製配列におけるＲＦ２００ピークのＴｍに基づいている（これはより高温の機構である）。長さ方向の均一性は外部ヒータによって大幅に改善された。外部カートリッジは、長さ方向で測定した中心１ｍｍにおいて０．２℃（最大・最小）以内と均一である。使用したカートリッジは、ＣＡ−５７６（外部ヒータ）およびＣＡ−７０９（従来）であった。

【0095】

融解の結果
外部加熱システムに対する代表的な融解の結果が、ＣＡ−０５７６として特定される外部ヒータ・カートリッジに対する全パネル中に得られたＵＣＥ １７および＊３融解物をすべて示す、図１８Ａ〜Ｂおよび図１９Ａ〜Ｂに示される。したがって、図１８Ａ〜Ｂおよび図１９Ａ〜Ｂは、７２個すべてのＵＣＥ １７および６４個すべての＊３融解物をそれぞれ示す。融解温度（Ｔｍ）は、負の微分曲線の最大値を決定することによって計算した。正規化プロット（最大値を１００に、最小値を０に設定）は、融解の結果の再現性を実証する、融解物の厳密な分類をより良好に示している。

【0096】

図は、ＣＡ−０５７６に対するプラチナ・トレース温度測定に基づいたＵＣＥ １７の融解プロファイルを示す。微分曲線は、２℃のサビツキー・ゴーレイ（Savitsky-Golay）・フィルタ窓に基づいている。正規化プロット（最大値を１００に、最小値を０に設定）は、融解の厳密さをより良好に示している。

【0097】

図１９Ａ〜Ｂは、ＣＡ−０５７６に対するプラチナ・トレース温度測定に基づいた＊３の融解プロファイルを示す。微分曲線は、２℃のサビツキー・ゴーレイ（Savitsky-Golay）・フィルタ窓に基づいている。正規化プロット（最大値を１００に、最小値を０に設定）は、融解の厳密さをより良好に示している。

【0098】

流路ごとのＴｍのばらつき
１）各流路がＲＦＣａｌ単位複製配列を使用して校正したそれ自体のＰｔトレースを使用するもの、または、２）すべての流路のＴｍが単一の外部サーミスタに基づくものという、２つの異なる独立した方法を使用して、各流路に対してＴｍを計算した。２つの方法は、異なる物理的法則（薄膜抵抗器対半導体）で作動し、異なる回路（ＡＭＡＰカード対ブレッドボード回路）によって測定した。

【0099】

方法１の利点は、８個のＰｔトレースが流体流路に近いので、実際の流路温度を最も良好に推定した基準を提供することであった。しかし、Ｐｔトレースは特定のＲＦＣａｌ単位複製配列を用いた校正を必要とし、各センサーがそれ自体のエラーを有することがあるため、８個の異なるセンサーが存在することは、潜在的にエラーの増加に結び付く可能性がある。

【0100】

方法２の利点は、外部センサーが単一の予め校正済みの素子であることであった。したがって、流路ごとのＴｍのばらつきが観察された場合、それらは非均一な加熱、または融解温度の真のばらつきによるものであった（即ち、異なる流路内の単位複製配列が異なる温度で融解した）。

【0101】

流路ごとのばらつきは、ＵＣＥ １７融解物およびプラチナ・トレース温度測定値を使用して決定された。流路ごとのＴｍのばらつきの平均（個々の融解物それぞれに対して流路の両端間でＴｍの標準偏差を決定し、次に、パネルのすべての融解物に対する標準偏差すべてを平均化することによって計算した）は、外部ヒータの場合、０．１９±０．０６℃（標準偏差、ｎ＝３８）であった。流路ごとのＴｍのばらつきの平均は、非外部ヒータ制御カートリッジの場合、０．２２±０．０５℃（標準偏差、ｎ＝３６）であった。

【0102】

流路ごとのばらつきは、流路数の関数としてＴｍをプロットすることによって調査した（図２０）。８つのＰｔトレース測定で決定されたＴｍは、独立した外部センサー測定に良好に一致していた。しかし、Ｔｍの分布は２つのアッセイで異なっていた。さらに、パネルを２つのアッセイ間で交互にしたので、Ｔｍの分布が交互になることが観察された。流路ごとのＴｍのばらつきは、温度測定とは無関係であり（２つの独立した方法が一致しているため）、かつ温度の均一性とは無関係である（均一性は異なる分布の間で交互にならないので）ように見えた。

【0103】

図２０は、外部ヒータを備えた１７個の融解物のパネルに対する流路によるＴｍの分布を示す。奇数の融解物（ＵＣＥ １７）は左側に示され、偶数の融解物（＊３）は右側に示される。８つのＰｔトレース温度測定（各半分の左欄）は、外部センサー測定（各半分の右欄）と良好に一致している。しかし、Ｔｍの分布は２つのアッセイで異なっており、パネルが２つのアッセイ間で交互であるので、分布は交互であるように見える。図２０で報告されている実験で使用されたカートリッジは、ＣＡ−０５７６として特定された。

【0104】

流路ごとのばらつきを、非外部ヒータ制御カートリッジを用いた同様の分析を行うことによってさらに調査した。制御システムは、９番目の独立した温度測定（外部サーミスタ）を欠いていたが、パネルが２つのアッセイ間で交互であるので、Ｔｍの分布はやはり交互であることが観察された。一例では（エラー、情報源不明）、＊３融解物１０、１２、１４、および１６において、ＵＣＥ １７融解物１１、１３、１５、および１７には存在しなかった持続的な「Ｍ」字形が、Ｔｍ分布で観察された。

【0105】

図２１は、「Ｂａｋｅｒ」の従来のカートリッジのための１７個の融解物のパネルに対する、流路によるＴｍの分布を示す。Ｔｍの分布はやはり２つのアッセイで異なっていた。＊３融解物１０、１２、１４、および１６の「Ｍ」字形は、ＵＣＥ １７融解物１１、１３、１５、および１７には存在しないことが分かる。しかし、両方のアッセイに存在する傾向もある（例えば、Ｔｍ，１は常にＴｍ，２よりも高く、Ｔｍ，７は常にＴｍ，８よりも高い）。図２１で報告されている実験で使用されたカートリッジは、ＣＡ−０７０９として特定された。

【0106】

Ｔｍのドリフト
融解温度は、外部ヒータ（図２２エラー、情報源不明）および従来のカートリッジ（図２３）の両方で、パネル全体を通して低下に傾いていることが観察された。傾き（ｄＴｍ／ｄｔ）は分析した流路距離の９５％で負であった。平均の傾きは−０．００３６℃／分であり、これは、最初と最後のＵＣＥ １７融解物間におけるＴｍの０．４℃の減少と一致する。この効果の理由については追及しないが、この傾向は、２つの異なる加熱方法（Ｐｔトレース・ヒータ対外部ヒータ）、ならびに３つの異なる温度測定（加熱できないＰｔトレース・センサ、加熱もするＰｔトレース・センサ、および外部サーミスタ）で類似しているように見える。

【0107】

図２２は、「Ａｌｂｅｒｔ」の外部ヒータ・カートリッジを用いた、時間に伴うＵＣＥ １７のＴｍの浮動を示す。この図では、温度測定は埋め込みプラチナ・トレース・センサーに基づき、ＵＣＥ １７は９回融解した。明白なＴｍの下向きの傾向がある。図２２で報告されている実験で使用されたカートリッジは、ＣＡ−０４３５（左上）、ＣＡ−０５８３（右上）、ＣＡ−０５７６（左下）、およびＣＡ−０４４７（右下）として特定された。

【0108】

図２３は、「Ｂａｋｅｒ」の従来のカートリッジを用いた、時間に伴うＵＣＥ １７のＴｍの浮動を示す。ＵＣＥ １７は９回融解した。少数のアウトライヤーを除いて、明白なＴｍの下向きの傾向がある。図２３で報告されている実験で使用されたカートリッジは、ＣＡ−０７７７（左上）、ＣＡ−０７７６（右上）、ＣＡ−０７０９（左下）、およびＣＡ−０６９８（右下）として特定された。

【0109】

要約および結論
外部ヒータは、融解中の帯域２全域における蛍光の均一な減少、より急な融解遷移、ならびに内部のもの（流路２〜７）と同じ融解プロファイルを示す外部流路（１および８）によって証明されるように、温度の均一性の改善をもたらした。

【0110】

外部センサーは、冷却気流によって、プラチナ・トレース測定と比較して温度がずれ、それによってセンサー温度が低下した。これは、外部ヒータの上の気流を遮断することによって対処されてきた。それにも関わらず、外部センサーの使用は依然として、帯域２の温度を徐々に増減させる再現可能な方法であった。外部ヒータ・システムによって、単一の融解物のみが必要とされるので、帯域２の校正プロセスがより迅速に完了した。したがって、校正プロセスはより適時であり、単純であり、かつユーザ・フレンドリーであった。

【0111】

本発明の実施形態について、図面を参照して上記に十分に記載してきた。これらの好ましい実施形態に基づいて、本発明について記載してきたが、本発明の趣旨および範囲内で、記載された実施形態に対して特定の修正、変更、および代替の構成を行うことが可能であることが、当業者には明白であろう。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15A】

【図15B】

【図16A】

【図16B】

【図17】

【図18A】

【図18B】

【図19A】

【図19B】

【図20A】

【図20B】

【図20C】

【図20D】

【図21A】

【図21B】

【図21C】

【図21D】

【図22A】

【図22B】

【図22C】

【図22D】

【図23A】

【図23B】

【図23C】

【図23D】