特許 6130161 新規Ｌ−アルギニン酸化酵素、Ｌ−アルギニンの測定方法、Ｌ−アルギニンの測定用キットおよびＬ−アルギニン測定用の酵素センサ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6130161

(24)【登録日】2017年4月21日

(45)【発行日】2017年5月17日

(54)【発明の名称】新規Ｌ−アルギニン酸化酵素、Ｌ−アルギニンの測定方法、Ｌ−アルギニンの測定用キットおよびＬ−アルギニン測定用の酵素センサ

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20170508BHJP

   C12N 9/04 20060101ALI20170508BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20170508BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20170508BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20170508BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20170508BHJP

   C12Q 1/26 20060101ALI20170508BHJP

   C12N 1/20 20060101ALI20170508BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20170508BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C12N9/04 Z

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   C12Q1/26

   C12N1/20 A

   C12M1/34 E

【請求項の数】13

【全頁数】27

(21)【出願番号】特願2013-32588(P2013-32588)

(22)【出願日】2013年2月21日

(65)【公開番号】特開2014-161238(P2014-161238A)

(43)【公開日】2014年9月8日

【審査請求日】2016年2月18日

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）本発明に係る研究の一部は、独立行政法人科学技術振興機構、戦略的創造研究推進事業・総括実施型（ＥＲＡＴＯ）、浅野酵素活性分子プロジェクトの一環として行われたものであり、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願

【微生物の受託番号】NPMD  NITE P-1511

(73)【特許権者】

【識別番号】515157758

【氏名又は名称】公立大学法人 富山県立大学

(73)【特許権者】

【識別番号】000000066

【氏名又は名称】味の素株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100075409

【弁理士】

【氏名又は名称】植木 久一

(74)【代理人】

【識別番号】100129757

【弁理士】

【氏名又は名称】植木 久彦

(74)【代理人】

【識別番号】100115082

【弁理士】

【氏名又は名称】菅河 忠志

(74)【代理人】

【識別番号】100125243

【弁理士】

【氏名又は名称】伊藤 浩彰

(72)【発明者】

【氏名】浅野 泰久

(72)【発明者】

【氏名】松井 大亮

【審査官】 西村 亜希子

(56)【参考文献】

【文献】 特開昭６２−１１８８８２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１２−２００２１７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００２−２６２８９０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Database DDBJ/EMBL/GenBank [online], GenBank Accession No.AMWJ01000206.1，２０１２年１２月 ７日，<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/428759197>, 07-DEC-2012 uploaded, [retrieved on 2014-05-19]

【文献】 Database DDBJ/EMBL/GenBank [online], GenBank Accession No.EKX81514.1，２０１２年１２月 ７日，<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/EKX81514.1> 07-DEC-2012 uploaded, [retrieved on 2014-05-19]

【文献】 J. Gen. Microbiol.，１９８４年，Vol.130, No.1，pp.69-76

【文献】 ビタミン，２０１３年 １月２５日，Vol.87, No.1，pp.51-52

【文献】 J. Gen. Microbiol.，１９９１年，Vol.137, No.12，pp.2911-2918

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／０９

Ｃ１２Ｍ １／３４

Ｃ１２Ｎ １／１５

Ｃ１２Ｎ １／１９

Ｃ１２Ｎ １／２０

Ｃ１２Ｎ １／２１

Ｃ１２Ｎ ５／１０

Ｃ１２Ｎ ９／０４

Ｃ１２Ｑ １／２６

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記の（１）〜（３）の何れかのアミノ酸配列を有することを特徴とするＬ−アルギニン酸化酵素。
（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列；
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換および／または付加を有し、且つＬ−アルギニン酸化酵素活性を有するアミノ酸配列；
（３）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して９５％以上の相同性を有し、且つＬ−アルギニン酸化酵素活性を有するアミノ酸配列。

【請求項2】

請求項１に記載のアミノ酸配列（１）〜（３）の何れかをコードすることを特徴とする核酸。

【請求項3】

請求項２に記載の核酸を含むベクターにより形質転換されたものであることを特徴とする形質転換体。

【請求項4】

Ｌ−アルギニンを測定するための方法であって：
（Ａ）水と酸素の存在下、検体に請求項１に記載のＬ−アルギニン酸化酵素を作用させる工程；および
（Ｂ）上記Ｌ−アルギニン酸化酵素の作用による反応生成物の少なくとも一種の量を計測する工程
を含むことを特徴とする方法。

【請求項5】

工程（Ｂ）において測定する反応生成物が過酸化水素である請求項４に記載の方法。

【請求項6】

ペルオキシダーゼ反応により過酸化水素の量を計測する請求項５に記載の方法。

【請求項7】

工程（Ｂ）において測定する反応生成物がアンモニアである請求項４に記載の方法。

【請求項8】

工程（Ｂ）において測定する反応生成物がＬ−アルギニンの脱アミノ化生成物である請求項４に記載の方法。

【請求項9】

請求項１に記載のＬ−アルギニン酸化酵素を含むことを特徴とするＬ−アルギニンの測定用キット。

【請求項10】

反応用緩衝液、過酸化水素検出用試薬、アンモニア検出試薬、およびＬ−アルギニンの脱アミノ化生成物検出薬の少なくとも一つをさらに含む請求項９に記載のキット。

【請求項11】

Ｌ−アルギニン測定用の酵素センサであって、
検出用電極の表面または近傍に請求項１に記載のＬ−アルギニン酸化酵素が配置されており、且つ
検出用電極は過酸化水素検出用電極であることを特徴とする酵素センサ。

【請求項12】

過酸化水素検出用電極は、酵素式過酸化水素電極または隔膜式過酸化水素電極である請求項１１に記載の酵素センサ。

【請求項13】

Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＢＹＣ４１−１株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１５１１）。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、新規Ｌ−アルギニン酸化酵素、並びに当該新規Ｌ−アルギニン酸化酵素を用いるＬ−アルギニンの測定方法、それに用いる測定用キットおよび酵素センサ、また、当該新規Ｌ−アルギニン酸化酵素を産生する新規微生物に関するものである。より詳しくは、本発明は、Ｌ−アルギニンに対する基質特異性の高いＬ−アルギニン酸化酵素と、その利用方法などに関する。

【背景技術】

【0002】

生体内において、Ｌ−アルギニンを含むアミノ酸の濃度は恒常的に維持されている。しかし、高アルギニン血症などの先天性代謝異常や内臓疾患などにより、アミノ酸の血中濃度は大きく変動する。よって、Ｌ−アルギニンに限らず生体内のアミノ酸濃度は疾病などを検出する有用な手段となり得るため、１種類もしくは多種類のアミノ酸の血中濃度を測定することにより、疾病などの診断が可能となる。

【0003】

近年、アミノ酸の測定法として酵素を用いる方法が多数開発されている。酵素を用いる方法は、機器分析的手法と比べて安価で簡易に実施できるという利点がある。アミノ酸の測定用酵素としては、例えば、脱水素酵素（デヒドロゲナーゼ）や酸化酵素が多く用いられる。酸化酵素を用いる方法としては、アミノ酸に酸化酵素を作用させることで生成される過酸化水素をペルオキシダーゼで検出し、定量する方法が挙げられる。この検出と定量には、比色法、蛍光法、電極法のいずれの方法も利用可能である。

【0004】

例えばアルギニンを測定するための酵素として、より具体的には、アルギナーゼ、アルギニンキナーゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ、オクトピンデヒドロゲナーゼがある。

【0005】

アルギナーゼを用いる場合、アミノ酸にアルギナーゼを作用させることで生成される尿素を検出する。また、アルギナーゼによりアルギニンから生成される尿素を、ウレアーゼを用いて分解し、尿素の分解により生じたアンモニアを検出することもある（特許文献１）。さらに、それらの反応により生成した尿素もしくはアンモニアを、電極を用いたアルギニンセンサで検出する方法も知られている（特許文献２）。

【0006】

その他、アルギニンキナーゼを用いる方法として、ピルビン酸キナーゼと乳酸デヒドロゲナーゼとをカップリングさせることにより、ＮＡＤ⁺からＮＡＤＨへの変換に基づく吸光度３４０ｎｍを測定することで、アルギニンを定量する方法がある（非特許文献１）。

【0007】

また、アルギニンデカルボキシラーゼを用いる方法として、アルギニンにアルギニンデカルボキシラーゼを作用させることで生成される二酸化炭素を、イオン選択膜電極により検出する方法がある（非特許文献２）。

【0008】

さらに、オクトピンデヒドロゲナーゼを用いる場合、アルギニンにオクトピンデヒドロゲナーゼを作用させることにより、ＮＡＤ⁺からＮＡＤＨへの変換に基づく吸光度３４０ｎｍを測定することで、アルギニンを定量する方法がある（非特許文献３）。

【0009】

また、アミノ酸定量法に用い得る酸化酵素として、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）Ｐ２にＬ−アルギニン酸化酵素活性があるという報告がある（非特許文献４）。また、アースロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）Ｂ−０７８０やシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）Ａ−２６由来のアルギニン酸化酵素を用いた報告がある（特許文献３，４）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0010】

【特許文献1】特開平８−３３６３９９公報

【特許文献2】特開平８−３３８８２６公報

【特許文献3】特開昭５７−５０８８６公報

【特許文献4】特開昭６２−１１８８８２公報

【非特許文献】

【0011】

【非特許文献1】Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．，７６，１８５−１９３（１９８８）

【非特許文献2】Ａｎａｌ．Ｌｅｔｔ．，９，１−１１（１９７６）

【非特許文献3】Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，６６，３９３−３９９（１９７５）

【非特許文献4】Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３７，２９１１−２９１８（１９９１）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

上述したように、これまでにも酵素を用いてアルギニンを測定する方法は種々開発されている。しかしながら、例えばアルギナーゼを用い、生成される尿素を定量する方法では、尿サンプルなどの尿素が多く存在する試料での定量時には、アルギニンの量が過剰評価になるという問題がある。

【0013】

また、アルギニンキナーゼとピルビン酸キナーゼや乳酸デヒドロゲナーゼとをカップリングさせる方法では、試料中にピルビン酸や乳酸が含まれていると、同じくアルギニン酸の量が過剰評価される。

【0014】

さらに、アルギニンデカルボキシラーゼを用いた定量法でも、試料中の二酸化炭素が過剰評価につながると共に、この方法は電極以外の定量に不向きであるという問題がある。

【0015】

また、オクトピンデヒドロゲナーゼは基質特異性が低く、アルギニン以外の化合物にも作用することから、やはりアルギニン定量時に過剰評価になるとの問題がある。

【0016】

シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）Ｐ２のＬ−アルギニン酸化酵素に関しては、非特許文献４には精製や特性解明、配列決定が為されていないため、再現ができない。さらにアースロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）Ｂ−０７８０由来のＬ−アルギニン酸化酵素は、Ｌ−アルギニン以外にもＬ−リジンやＬ−アスパラギン酸、Ｌ−アラニン、Ｄ，Ｌ−トリプトファンに活性を示す。また、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）Ａ−２６由来のアルギニン酸化酵素は、Ｌ−リジンやＬ−フェニルアラニンにも酸化酵素活性を示す。また、原株からの精製酵素を用いていることから、生産量や純度に問題があると考えられる。

【0017】

Ｌ−アルギニンの酸化酵素による測定は、実現できれば、機器分析的手法と比べ安価で簡易に実施できるという観点から有用である。しかし上記のとおり、従来のＬ−アルギニン測定用酵素は一般に基質特異性が低く、正確な測定ができないので、例えば血漿のような多種類のアミノ酸を含有する試料については適用できない。また、生産性にも問題があることから、実用に供することができるものではなかった。

【0018】

そこで、本発明は、生体試料中のＬ−アルギニンを、多種類のアミノ酸を含有する試料のように他のアミノ酸が共存する場合であっても、特異的に測定可能である酵素的測定法に用いることができ、Ｌ−アルギニンに対する基質特異性が高いＬ−アルギニン酸化酵素を提供すること、さらにはこの酵素を用いたＬ−アルギニンの酵素的測定方法を提供することを目的とする。

【0019】

また、本発明は、上記酵素的測定方法を実施する際に利用できる測定用のキットを提供することも目的とする。

【0020】

加えて本発明は、上記酵素的測定方法に利用できる酵素センサを提供することも目的とする。

【0021】

さらに本発明は、上記Ｌ−アルギニン酸化酵素を産生する新規微生物を提供することも目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0022】

本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意検討した。その結果、新規なシュードモナス属菌株を自然界より分離し、当該微生物から、アミノ酸の中でもほぼＬ−アルギニンのみに対して高い基質特異性を示す新規なＬ−アルギニン酸化酵素を抽出、精製することに成功した。

【0023】

本発明者らが種々検討した結果、Ｌ−アルギニンに作用させる酵素としてシュードモナス属由来のＬ−アルギニン酸化酵素を用いることにより、検出可能な生成物がＬ−アルギニンから定量的に生じること、さらには、本酵素は、ほかのアミノ酸が共存していても、Ｌ−アルギニンに特異的に反応して、検出可能な生成物がＬ−アルギニンの存在量に比例して生成することを見出して本発明を完成した。

【0024】

本発明は、以下に示すとおりである。

【0025】

本発明に係るＬ−アルギニン酸化酵素は、下記の（１）〜（３）の何れかのアミノ酸配列を有することを特徴とする。

【0026】

（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列；
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換および／または付加を有し、且つＬ−アルギニン酸化酵素活性を有するアミノ酸配列；
（３）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して９５％以上の相同性を有し、且つＬ−アルギニン酸化酵素活性を有するアミノ酸配列。

【0027】

本発明に係る核酸は、上記アミノ酸配列（１）〜（３）の何れかをコードすることを特徴とし、本発明に係る形質転換体は、当該核酸を含むベクターにより形質転換されたものであることを特徴とする。これら核酸と形質転換体は、本発明に係るＬ−アルギニン酸化酵素の製造に有用である。

【0028】

本発明に係るＬ−アルギニンの測定方法は：
（Ａ）水と酸素の存在下、検体に上記の本発明に係るＬ−アルギニン酸化酵素を作用させる工程；および
（Ｂ）上記Ｌ−アルギニン酸化酵素の作用による反応生成物の少なくとも一種の量を計測する工程
を含むことを特徴とする。

【0029】

上記工程（Ｂ）において測定する反応生成物としては、過酸化水素、アンモニア、およびＬ−アルギニンの脱アミノ化生成物を挙げることができる。また、反応生成物である過酸化水素の量は、例えば、ペルオキシダーゼ反応により計測することができる。

【0030】

本発明に係るＬ−アルギニンの測定用キットは、上記のＬ−アルギニン酸化酵素を含むことを特徴とする。さらに、反応用緩衝液、過酸化水素検出用試薬、アンモニア検出試薬、およびＬ−アルギニンの脱アミノ化生成物検出薬の少なくとも一つを含むものであってもよい。

【0031】

本発明に係るＬ−アルギニンの測定用キットは、Ｌ−アルギニン酸化酵素を含むことを特徴とする。

【0032】

本発明に係るＬ−アルギニン測定用の酵素センサは、検出用電極の表面または近傍に上記の本発明に係るＬ−アルギニン酸化酵素が配置されており、且つ、検出用電極は過酸化水素検出用電極であることを特徴とする。

【0033】

当該酸素センサにおいて、過酸化水素検出用電極としては、酵素式過酸化水素電極または隔膜式過酸化水素電極を挙げることができる。

【0034】

上記の本発明に係るＬ−アルギニン酸化酵素は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＢＹＣ４１−１株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１５１１）から単離精製することができる。当該微生物は新規なものであり、本発明に含まれるものとする。

【発明の効果】

【0035】

本発明に係るＬ−アルギニン酸化酵素は、Ｌ−アルギニンに対する基質特異性が非常に高い。よって、このＬ−アルギニン酸化酵素を用いることで、他のアミノ酸など多くの夾雑物を含む試料においても、Ｌ−アルギニンを特異的に迅速かつ簡便に測定することが可能である。特に、血漿、血清、尿のような生体試料に対し本発明は有効であり、ペルオキシダーゼ等の酵素とカップリングさせることにより、発色法や蛍光法でＬ−アルギニンを測定できる。また、本発明に係るＬ−アルギニンの測定用キットとＬ−アルギニン測定用の酵素センサは、上記のとおり夾雑物を含む試料においても正確にＬ−アルギニンを測定できるものとして非常に有用である。

【図面の簡単な説明】

【0036】

【図1】図１は、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列に基づく簡易分子系統樹である。ＳＩＩＤ１２４００は、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＢＹＣ４１−１株を示す。左下の線はスケールバー、系統枝の分岐に位置する数字はブートストラップ値、株名の末尾のＴはその種の規準株（Ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ）を示す。

【図2】図２は、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＢＹＣ４１−１株の生理・生化学性状試験の結果を表す図である。図２（１）は結果を示し、図２（２）は試験項目の説明を示す。

【図3】図３は、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＢＹＣ４１−１株由来のＬ−アルギニン酸化酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。

【図4】図４は、Ｌ−アルギニン酸化酵素の基質特異性を試験した結果を示すグラフである。

【図5】図５は、精製したＬ−アルギニン酸化酵素標品を用いた、０〜２００μＭのＬ−アルギニン溶液を検体とした場合の吸光度測定結果を示す。図５（１）は血漿試料の測定結果を示し、図５（２）は水溶液と血漿試料におけるＬ−アルギニン濃度と吸光度との関係を示す。

【図6】図６は、本発明に係るＬ−アルギニン酸化酵素の活性と温度との関係を示すグラフである。

【図7】図７は、本発明に係るＬ−アルギニン酸化酵素の活性と反応液のｐＨとの関係を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0037】

以下、先ず、本発明に係るＬ−アルギニン酸化酵素につき説明する。

【0038】

＜Ｌ−アルギニン酸化酵素＞
本発明に係るＬ−アルギニン酸化酵素は、下記の（１）〜（３）の何れかのアミノ酸配列を有することを特徴とする。

【0039】

（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列；
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換および／または付加を有し、且つＬ−アルギニン酸化酵素活性を有するアミノ酸配列；
（３）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して９５％以上の相同性を有し、且つＬ−アルギニン酸化酵素活性を有するアミノ酸配列。

【0040】

なお、本発明において酵素が「（特定の）アミノ酸配列を有する」とは、その酵素のアミノ酸配列が特定されたアミノ酸配列を含んでいればよく、且つ、その酵素の機能が維持されていることを意味する。その酵素において特定されたアミノ酸配列以外の配列としては、ヒスチジンタグや固定化のためのリンカー配列の他、−Ｓ−Ｓ−結合などの架橋構造などが挙げられる。

【0041】

配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列（１）を有し、Ｌ−アルギニン酸化酵素活性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質である酵素は、シュードモナス属菌株を新たに自然界より分離し、本微生物が産生する酵素として抽出、精製したものである。この点については実施例において詳述する。

【0042】

本発明のタンパク質が有するＬ−アルギニン酸化酵素活性は、酸素と水の存在下、Ｌ−アルギニンに作用して過酸化水素とアンモニアを生成する。この作用の測定方法は、実施例に記載の測定方法（定量方法）を用いることにより確認できる。

【0043】

本発明に係るＬ−アルギニン酸化酵素は、Ｌ−アルギニンの他、Ｌ−リジンに対してわずかに酸化酵素活性を示す以外、Ｌ−オルニチン、Ｌ−チロシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−システイン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−プロリン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−バリン、Ｄ−アルギニンに対しては、全く活性を示さない。

【0044】

本発明に係るアミノ酸配列（２）の「１から数個のアミノ酸の欠失、置換および／または付加を有するアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は、欠失等を有するタンパク質が、酸素と水の存在下、Ｌ−アルギニンに作用して過酸化水素とアンモニアを生成する酵素である限り、特に限定されない。前記「１から数個」の範囲は、前記酸化酵素活性を有するタンパク質である割合が高いことから、例えば、１個以上、３０個以下、好ましくは１個以上、２０個以下、より好ましくは１個以上、１０個以下、さらに好ましくは１個以上、７個以下、一層好ましくは１個以上、５個以下、特に好ましくは１個以上、３個以下程度であることができる。

【0045】

本発明に係るアミノ酸配列（２）の「配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列」における相同性は、当該相同性を有するタンパク質が、酸素と水の存在下、Ｌ−アルギニンに作用して過酸化水素とアンモニアを生成する酵素である限り、特に限定されない。当該相同性は９５％以上であれば特に限定されないが、好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、特に好ましくは９９．５％以上である。

【0046】

本発明の上記Ｌ−アルギニン酸化酵素は、上記（１）から（３）に規定されるアミノ酸配列を有するものである限りその由来は特に限定されるものではない。例えば、本発明のＬ−アルギニン酸化酵素は、各種遺伝子工学的技術により製造した組換えタンパク質であってもよいし、化学合成により製造した合成タンパク質であってもよく、或いは配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＬ−アルギニン酸化酵素の遺伝子ホモログを有する特定の生物種（例えば、細菌）から、或いは、当該生物種に変異原を与えることによりアミノ酸配列（２）または（３）を有するＬ−アルギニン酸化酵素を産生し得る変異体を獲得して、産生するタンパク質を抽出および精製することによって製造したタンパク質であってもよい。

【0047】

異種発現による生産法としては、例えば、同様の活性を有する生物種より抽出したゲノムＤＮＡから該当する遺伝子をＰＣＲにて増幅しｐＥＴもしくはｐＵＣなどに組み込んだプラスミドベクターを構築したのち、ＢＬ２１やＪＭ１０９などの宿主菌株に形質転換し、培養する方法が挙げられる。これら以外の公知の方法も適宜用いることができる。

【0048】

本発明に係るＬ−アルギニン酸化酵素の取得方法は特に制限されず、化学合成により合成したタンパク質でもよいし、遺伝子組換え技術により作製した組換えタンパク質でもよい。組換えタンパク質を作製する場合には、後述するように当該タンパク質をコードする遺伝子（ＤＮＡ）を取得する。このＤＮＡを適当な発現系に導入することにより、上記Ｌ−アルギニン酸化酵素を産生することができる。

【0049】

本発明に係るＬ−アルギニン酸化酵素は、上記Ｌ−アルギニン酸化酵素をコードする遺伝子をベクター上に搭載し、このベクターによって宿主細胞を形質転換した後、形質転換させた宿主細胞を培養して培養物中に前記遺伝子がコードするタンパク質を蓄積し、蓄積したタンパク質を収集することを含む、生産方法により調製することができる。

【0050】

本発明に係るＬ−アルギニン酸化酵素をコードする遺伝子は、本発明の一態様である。即ち、本発明は、下記の何れかのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子を包含する。

【0051】

（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換および／または付加を有し、且つＬ−アルギニン酸化酵素活性を有するアミノ酸配列
（３）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して９５％以上の相同性を有し、且つＬ−アルギニン酸化酵素活性を有するアミノ酸配列

【0052】

本発明のＬ−アルギニン酸化酵素をコードする遺伝子の取得方法は特に限定されない。本発明のＬ−アルギニン酸化酵素をコードする遺伝子は、例えば、配列番号２に記載のアミノ酸配列および配列番号１に記載した塩基配列の情報に基づいて、化学合成、遺伝子工学的手法または突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することができる。

【0053】

例えば、配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法等を用いて行うことができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ．，１９８９（以下、モレキュラークローニング第２版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）等に記載の方法に準じて行うことができる。

【0054】

本明細書中の配列表の配列番号２に記載したアミノ酸配列または配列番号１に示す塩基配列の情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いてシュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＢＹＣ４１−１株のｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより本発明の遺伝子を単離することができる。ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーは、常法により作製することができる。

【0055】

ＰＣＲ法により本発明のＬ−アルギニン酸化酵素をコードする遺伝子を取得することもできる。例えば、上記シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＢＹＣ４１−１株のｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーを鋳型として使用し、配列番号１に記載した塩基配列等を増幅できるように設計した１対のプライマーを用いてＰＣＲを行う。ＰＣＲの反応条件は適宜設定すればよい。次いで、増幅されたＤＮＡ断片を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）等の宿主で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることができる。

【0056】

上記したプローブまたはプライマーの調製、ゲノムライブラリーの構築、ゲノムライブラリーのスクリーニング、並びに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、モレキュラークローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載の方法に準じて行うことができる。

【0057】

上記Ｌ−アルギニン酸化酵素の遺伝子は適当なベクター中に挿入して使用することができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限定されず、例えば、自立的に複製するベクター（例えばプラスミド等）でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。好ましくは、ベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいて上記遺伝子は、転写に必要な要素（例えば、プロモーター等）が機能的に連結されている。プロモータは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。

【0058】

細菌細胞で作動可能なプロモータとしては、バチルス・ステアロテルモフィルス・マルトジェニック・アミラーゼ遺伝子（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃ ａｍｙｌａｓｅ ｇｅｎｅ）、バチルス・リケニホルミスα−アミラーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅ ｇｅｎｅ）、バチルス・アミロリケファチエンス・ＢＡＮアミラーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＢＡＮ ａｍｙｌａｓｅ ｇｅｎｅ）、バチルス・サブチリス・アルカリプロテアーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｓｕｂｔｉｌｉｓ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｇｅｎｅ）若しくはバチルス・プミルス・キシロシダーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ ｘｙｌｏｓｉｄａｓｅ ｇｅｎｅ）のプロモータ、またはファージ・ラムダのＰＲ若しくはＰＬプロモータ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｌａｃ、ｔｒｐ若しくはｔａｃプロモータなどが挙げられる。

【0059】

哺乳動物細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＳＶ４０プロモータ、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモータまたはアデノウイルス２主後期プロモータなどがある。昆虫細胞で作動可能なプロモータの例としては、ポリヘドリンプロモータ、Ｐ１０プロモータ、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス塩基性タンパクプロモータ、バキュウロウイルス即時型初期遺伝子１プロモータ、またはバキュウロウイルス３９Ｋ遅延型初期遺伝子プロモータ等がある。酵母宿主細胞で作動可能なプロモータの例としては、酵母解糖系遺伝子由来のプロモータ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモータ、ＴＰＩ１プロモータ、ＡＤＨ２−４ｃプロモータなどが挙げられる。糸状菌細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＡＤＨ３プロモータまたはｔｐｉＡプロモータなどがある。

【0060】

また、上記Ｌ−アルギニン酸化酵素の遺伝子は必要に応じて、適切なターミネータに機能的に結合されてもよい。Ｌ−アルギニン酸化酵素の遺伝子を含む組換えベクターは更に、ポリアデニレーションシグナル（例えばＳＶ４０またはアデノウイルス５Ｅ１ｂ領域由来のもの）、転写エンハンサ配列（例えばＳＶ４０エンハンサ）などの要素を有していてもよい。Ｌ−アルギニン酸化酵素の遺伝子を含む組換えベクターは更に、該ベクターが宿主細胞内で複製することを可能にするＤＮＡ配列を具備してもよく、その一例としてはＳＶ４０複製起点（宿主細胞が哺乳類細胞のとき）が挙げられる。

【0061】

Ｌ−アルギニン酸化酵素の遺伝子を含む組換えベクターはさらに選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはシゾサッカロマイセス・ポンベＴＰＩ遺伝子等のようなその補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、または例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン若しくはヒグロマイシンのような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。Ｌ−アルギニン酸化酵素の遺伝子、プロモータ、および所望によりターミネータおよび／または分泌シグナル配列をそれぞれ連結し、これらを適切なベクターに挿入する方法は当業者に周知である。

【0062】

Ｌ−アルギニン酸化酵素の遺伝子を含む組換えベクターを適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製することができる。Ｌ−アルギニン酸化酵素の遺伝子を含む組換えベクターを導入される宿主細胞は、Ｌ−アルギニン酸化酵素の遺伝子を発現できれば任意の細胞でよく、細菌、酵母、真菌および高等真核細胞等が挙げられる。

【0063】

細菌細胞の例としては、バチルスまたはストレプトマイセス等のグラム陽性菌または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）等のグラム陰性菌が挙げられる。これら細菌の形質転換は、プロトプラスト法、または公知の方法でコンピテント細胞を用いることにより行えばよい。哺乳類細胞の例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＬ細胞またはＣＨＯ細胞等が挙げられる。哺乳類細胞を形質転換し、該細胞に導入されたＤＮＡ配列を発現させる方法も公知であり、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を用いることができる。

【0064】

酵母細胞の例としては、サッカロマイセスまたはシゾサッカロマイセスに属する細胞が挙げられ、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、またはシゾサッカロマイセス・ポンべ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）等が挙げられる。酵母宿主への組換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。

【0065】

他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、またはトリコデルマに属する細胞である。宿主細胞として糸状菌を用いる場合、ＤＮＡ構築物を宿主染色体に組み込んで組換え宿主細胞を得ることにより形質転換を行うことができる。ＤＮＡ構築物の宿主染色体への組み込みは、公知の方法に従い、例えば相同組換えまたは異種組換えにより行うことができる。

【0066】

昆虫細胞を宿主として用いる場合には、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、タンパク質を発現させることができる（例えば、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ１；およびカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載）。

【0067】

バキュロウイルスとしては、例えば、ヨトウガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。

【0068】

昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、（１９９２）〕、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵巣細胞であるＨｉＦｉｖｅ（インビトロジェン社製）等を用いることができる。

【0069】

組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法またはリポフェクション法等を挙げることができる。

【0070】

上記の形質転換体は、導入された遺伝子の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養する。形質転換体の培養物から、本発明で用いるＬ−アルギニン酸化酵素を単離精製するには、通常のタンパク質の単離、精製法を用いればよい。例えば、本発明で用いるＬ−アルギニン酸化酵素が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常のタンパク質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セファロース等の樹脂を用いた陰イオン交換クロマトグラフィ法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ファルマシア社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィ法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィ法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィ法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、本発明のＬ−アルギニン酸化酵素を精製標品として得ることができる。

【0071】

上記アミノ酸配列（１）（配列番号２）を有するＬ−アルギニン酸化酵素は、本発明に係る新規微生物であるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＢＹＣ４１−１株により産生されるものである。当該ＢＹＣ４１−１株は、下記の通り寄託機関に寄託されている。
（ｉ） 寄託機関の名称およびあて名
名称： 独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター
あて名： 日本国 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８
（ｉｉ） 寄託日： ２０１３年１月１８日
（ｉｉｉ） 受領番号： ＮＩＴＥ ＡＰ−１５１１
（ｉｖ） 受託番号： ＮＩＴＥ Ｐ−１５１１

【0072】

＜Ｌ−アルギニンの定量方法＞
本発明に係るＬ−アルギニンの測定方法は、
（Ａ）水と酸素の存在下、検体に、上記の本発明に係るＬ−アルギニン酸化酵素を作用させる工程；および
（Ｂ）上記Ｌ−アルギニン酸化酵素の作用による反応生成物の少なくとも一種の量を計測する工程を含むことを特徴とする。

【0073】

本発明の方法で、検体として用いられる生体試料は、Ｌ−アルギニンの有無を判断すべきものや、Ｌ−アルギニンの量や濃度などを測定すべき試料であれば、如何なるものでもよい。例えば、血液、血清、血漿、臓器の一部のホモジェネート、尿などの生体試料を挙げることができる。また、生体試料にＬ−アルギニン酸化酵素を作用させて生じる生成物を如何なる方法で測定するかに応じて、生体試料の種類を適宜選択することができる。より具体的には、発色剤や蛍光剤を利用して上記生成物を定量する場合には無色の水溶液であることが好ましく、血清や血漿などが例として挙げられる。

【0074】

Ｌ−アルギニン酸化酵素によるＬ−アルギニンの酸化反応を以下の反応式Ａに示す。

【0075】

【化1】

【0076】

本発明に係るＬ−アルギニン酸化酵素は、上記式Ａに示す反応を触媒する。

【0077】

工程（Ａ）におけるＬ−アルギニン酸化酵素の混合量は、１０ｍＵ／ｍｌ（アルギニン１μｍｏｌを１分間で消費する活性を１Ｕとする）以上とすることが適当である。また、酵素反応液における水の混合量は、サンプル中のＬｙｓ濃度などに応じて適宜決定できるが、例えば、５〜９５％の範囲とすることができる。Ｌ−アルギニン酸化酵素の混合量の上限は特にないが、実用的には、例えば、１００ｍＵ／ｍｌ以下であることができる。しかし、Ｌ−アルギニン酸化酵素の混合量および水の混合量は、この範囲に限定する意図ではなく、適宜調整できる。

【0078】

さらに、Ｌ−アルギニン酸化酵素および水に加えて、好ましくは、Ｌ−アルギニン酸化酵素の至適ｐＨを考慮したｐＨを示す緩衝液を含むことができる。ｐＨは適宜調整すればよいが、本発明に係るＬ−アルギニン酸化酵素の至適ｐＨが５．０から７．５であるので、５．０以上、７．５以下程度とすることができる。

【0079】

次いで、前記混合により得られた反応液を酸素の存在下に所定時間放置する。Ｌ−アルギニン酸化酵素によるＬ−アルギニン酸化反応においては、反応式Ａに示すように、Ｌ−アルギニン脱アミノ化生成物である５−グアニジノ−２−オキソペンタン酸と共に、アンモニア（ＮＨ₃）と過酸化水素（Ｈ₂Ｏ₂）が生成物として得られる。上記反応を空気中で実施することで、反応液中の溶存酸素として上記酸素は供給される。反応液中酸素を供給する目的で反応液に空気などの酸素含有気体を強制的に供給する必要は通常はない。酵素反応に必要とされる酸素量が微量であり、溶存酸素により十分に賄えるためである。反応温度は適宜調整すればよいが、当該酵素の至適温度は４５℃付近であるので、例えば、２０℃以上、６０℃以下とすることができる。酵素反応時間は、使用する酵素量などにもよるが、例えば、１０分間以上、１時間以下程度の範囲とすることができる。しかし、この範囲に限定する意図ではなく、適宜調整できる。

【0080】

工程（Ｂ）では、酵素反応後の反応液中に存在する本発明酵素の作用による反応生成物の少なくとも一種の量を計測する。

【0081】

測定対象である生成物が過酸化水素である場合、例えばペルオキシダーゼ反応を用いて測定する方法など公知の方法により、過酸化水素の定量が可能である。ペルオキシダーゼ反応を用いて測定する場合、使用可能なペルオキシダーゼは過酸化水素の定量に利用可能な酵素であればよく、例えば西洋わさび由来ペルオキシダーゼが挙げられる。また、使用するペルオキシダーゼの基質となり得るものであれば発色剤として使用可能であり、西洋わさび由来ペルオキシダーゼを用いる場合には４−アミノアンチピリン：フェノールなどが挙げられる。西洋わさび由来ペルオキシダーゼを用いる過酸化水素定量のための反応は以下に示す通りである。
２Ｈ₂Ｏ₂ ＋ ４−アミノアンチピリン ＋ フェノール → キノンイミン色素 ＋ ４Ｈ₂Ｏ

【0082】

４−アミノアンチピリン等の発色剤や蛍光剤は、使用されるペルオキシダーゼの種類によって適宜選択することが可能である。

【0083】

Ｌ−アルギニン酸化酵素の反応生成物である過酸化水素は、過酸化水素電極を用いた電流検出型センサを用いて測定することもできる。過酸化水素電極としては、例えば、ペルオキシダーゼを牛血清アルブミンとともにグルタルアルデヒドに固定化した膜とフェロセンをカーボンペーストに含有させたものを電極として用いるセンサを挙げることができる。

【0084】

測定すべき生成物をアンモニアとする場合には、アンモニア検出薬を用いて測定することができる。アンモニア検出薬としては、例えば、フェノールと次亜塩素酸の組み合わせによるインドフェノール法を挙げることができる。具体的には、サンプルをフェノール・ニトロプルシド溶液および過塩素酸溶液と混合して発色させ、６３５ｎｍの吸光度を測定することにより、アンモニア定量が可能である。

【0085】

定量に用いられる生成物がＬ−アルギニンの脱アミノ化生成物である５−グアニジノ−２−オキソペンタン酸である場合には、５−グアニジノ−２−オキソペンタン酸を３−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｏｎｅ ｈｙｄｒａｚｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅと反応させてｈｙｄｒａｚｏｎｅ誘導体を分光測定することにより、５−グアニジノ−２−オキソペンタン酸を測定することができる。

【0086】

＜Ｌ−アルギニンの定量用キット＞
本発明に係るＬ−アルギニンの定量用キットは、以下の試薬を含むことを特徴とする。
（Ｋ１）Ｌ−アルギニン酸化酵素

【0087】

上記Ｌ−アルギニン酸化酵素は、上記の本発明に係るＬ−アルギニン酸化酵素である。

【0088】

本発明のキットは、さらに、（Ｋ２）反応用緩衝液、（Ｋ３）過酸化水素検出用試薬、（Ｋ４）アンモニア検出薬および（Ｋ５）Ｌ−アルギニンの脱アミノ化生成物である５−グアニジノ−２−オキソペンタン酸検出薬の少なくとも一つを含むことができる。

【0089】

（Ｋ２）反応用緩衝液は、反応液中を定量反応に適したｐＨに維持するために用いられる。後述の実施例に示すＬ−アルギニン酸化酵素は、ｐＨ３．５−８．５の範囲の緩衝液であることが望ましい。

【0090】

（Ｋ３）過酸化水素検出用試薬は、過酸化水素の検出を、例えば、発色もしくは蛍光によって行う場合に用いる。過酸化水素検出用試薬としては、例えば、ペルオキシダーゼとその基質となり得る発色剤の組合せであることができる。具体的には、西洋わさびペルオキシダーゼと２−アミノアンチピリン・フェノールの組み合わせを挙げることができる。

【0091】

（Ｋ４）アンモニア検出薬としては、フェノールを挙げることができる。例えば、フェノールと次亜塩素酸の組み合わせによるインドフェノール法を適用できる。

【0092】

（Ｋ５）Ｌ−アルギニンの脱アミノ化生成物である５−グアニジノ−２−オキソペンタン酸検出薬としては、３−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｏｎｅ ｈｙｄｒａｚｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅを挙げることができる。例えば、５−グアニジノ−２−オキソペンタン酸と３−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｏｎｅ ｈｙｄｒａｚｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅを反応させて、ｈｙｄｒａｚｏｎｅ誘導体を分光測定することができる。

【0093】

＜酵素センサ＞
本発明に係るＬ−アルギニン測定用の酵素センサは、検出用電極の表面または近傍にＬ−アルギニン酸化酵素が配置されており、且つ、検出用電極は過酸化水素検出用電極であることを特徴とする。この酵素センサに用いるＬ−アルギニン酸化酵素は、上記の本発明に係るＬ−アルギニン酸化酵素である。

【0094】

前記検出用電極は過酸化水素検出用電極である。過酸化水素検出用電極は、酵素式過酸化水素電極または隔膜式過酸化水素電極であることができる。Ｌ−アルギニン酸化酵素がＬ−アルギニンと反応することで過酸化水素が生成するので、この過酸化水素を過酸化水素検出用電極で検出することができる。酵素式過酸化水素電極としては、例えば、ペルオキシダーゼを牛血清アルブミンとともにグルタルアルデヒドに固定化した膜とフェロセンをカーボンペーストに含有させたものを電極として用いるセンサを挙げることができる。隔膜式過酸化水素電極は、隔膜により過酸化水素と反応する電極が隔離されたタイプの電極である。

【0095】

本発明に係る酵素センサにおいて、Ｌ−アルギニン酸化酵素は、検出用電極の表面または検出用電極の近傍に配置されることが好ましく、検出用電極の表面に配置される場合には、検出用電極の表面に固定化されても固定化されなくてもよい。検出用電極の表面に固定化されることで、本発明のセンサを繰り返し利用できる利点がある。

【実施例】

【0096】

以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。

【0097】

なお、酵素の活性は、以下のように測定した。

【0098】

試験例１： Ｌ−アルギニン酸化酵素の活性の測定
（１）Ｌ−アルギニン酸化酵素活性測定用試薬の調製
表１の配合に従って調製した。

【0099】

【表1】

【0100】

また、使用した基質（アミノ酸）は、以下のとおりである。

【0101】

【表2】

【0102】

（２）Ｌ−アルギニン酸化酵素の活性測定法
Ｌ−アルギニン酸化酵素活性は、Ｌ−アミノ酸の酸化で生成される過酸化水素量を、表１の発色液を用いて比色法で求めた。具体的には、１ｃｍ石英セル中、発色液、表２に示すアミノ酸の１００ｍＭ溶液および酵素液を２：２：１（容量比）の割合で混合し、３０℃で反応させ、吸光度計を用いて反応開始から連続的（約１秒間隔）に５５０ｎｍの吸光度を測定した。Ｌ−アルギニン酸化酵素活性の基質は、表２に示した２０種類のアミノ酸（１００ｍＭ溶液）を用い、ブランクでは、基質の代わりに１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を添加した。得られた吸光度変化により、下記計算式に基づきＬ−アルギニン酸化酵素活性を算出した。尚、上記条件で１分間に１マイクロモルの過酸化水素を与える酵素量を１Ｕとした。得られた吸光度変化より、下記計算式に基づきＬ−アルギニン酸化酵素の酵素活性を算出した。

【0103】

（３）Ｌ−アルギニン酸化酵素活性の計算式
活性値（Ｕ／ｍｌ）＝｛ΔＯＤ／ｍｉｎ（ΔＯＤｔｅｓｔ−ΔＯＤｂｌａｎｋ）×３．１（ｍｌ）×希釈倍率｝／｛１３×１．０（ｃｍ）×０．１（ｍｌ）｝
３．１（ｍｌ）：全液量
１３：ミリモル吸光係数
１．０ｃｍ：セルの光路長
０．１（ｍｌ）：酵素サンプル液量

【0104】

実施例１： 本発明に係るＬ−アルギニン酸化酵素産生菌の検討
（１） スクリーニング
富山県内各地から土壌試料を採取し、上記試験例１に準拠して各土壌に含まれる微生物のＬ−アルギニン酸化酵素活性を試験し、Ｌ−アルギニン酸化酵素活性を有する微生物をスクリーニングした。その結果、Ｌ−アルギニン酸化酵素活性を有するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＢＹＣ４１−１株を見出した。

【0105】

当該ＢＹＣ４１−１株について、以下のとおり検討した。

【0106】

（２） １６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＢＹＣ４１−１株から常法に従ってゲノムＤＮＡを抽出し、得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲにより１６Ｓ ｒＤＮＡを増幅し、塩基配列を決定した。当該微生物の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列を配列番号７に示す。決定された配列に基づいて、アポロンＤＢ−ＢＡ８．０ Ｂｌａｓｔにより、相同性の高い微生物を検索した。結果を表３に示す。

【0107】

【表3】

【0108】

また、図１に、当該微生物（図１中、「ＳＩＩＤ２４００」で示す）の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列に基づく簡易分子系統樹を示した。表３と図１のとおり、ＢＹＣ４１−１株の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列に対し高い相同性を示し、Ｐ．ｊａｐｏｎｉｃａ ＩＡＭ１５０７１株に対して９９．６％と最も高い相同性を示したが、何れの基準菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列とも一致しなかった。また、アポロンＤＢ−ＢＡ８．０に対する相同性検索で得られた上位１０塩基配列を用いた１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列に基づく簡易分子系統解析の結果、ＢＹＣ４１−１株は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属の種で形成されるクラスターに含まれ、Ｐ．ｊａｐｏｎｉｃａとクラスターを形成し、近縁であることが示された。

【0109】

以上のとおり、本発明に係るＢＹＣ４１−１株は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する新規な微生物であることが明らかとなった。

【0110】

（３） 生理・生化学性状試験
本発明に係るＢＹＣ４１−１株の生理・生化学性状を試験した。第一次試験の結果を表４に、第二次試験の結果を図２と表５に示す。

【0111】

【表4】

【0112】

【表5】

【0113】

第一次試験の結果、ＢＹＣ４１−１株は運動性を有するグラム陰性桿菌であり、グルコースを酸化し、カタラーゼ反応とオキシダーゼ反応に陽性を示した（表４）。第二次試験の結果、ＢＹＣ４１−１株は硝酸塩を還元せず、アルギニンジヒドロラーゼ活性を示し、グルコース、ｎ−カプリン酸およびｄｌ−リンゴ酸を資化し、Ｌ−アラビノース、Ｄ−マンノースおよびマルトースなどを資化しなかった（図２）。また、追加試験の結果、ＢＹＣ４１−１株は嫌気条件下で生育し、４２℃で生育せず、アルカリフォスファターゼ、エステラーゼ（Ｃ４）およびエステラーゼ リパーゼ（Ｃ８）などの活性を示した（表５）。これらの性状は、１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列解析の結果において近縁性が示唆されたＰ．ｊａｐｏｎｉｃａの性状と類似点が認められたものの、相違も確認された。特に、Ｌ−アラビノースおよびマルトースを資化せず、リパーゼ（Ｃ１４）活性を示さない点は、Ｐ．ｊａｐｏｎｉｃａの性状と異なった。

【0114】

以上の結果から、本発明に係るＢＹＣ４１−１株はＰ．ｊａｐｏｎｉｃａに最も近縁なＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．であるが、Ｐ．ｊａｐｏｎｉｃａとは異なる新規なものであると判断した。

【0115】

実施例２： 本発明に係るＬ−アルギニン酸化酵素の取得
（１） シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＢＹＣ４１−１株由来のＬ−アルギニン酸化酵素の精製
（ｉ） シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＢＹＣ４１−１株の培養
上記実施例１のシュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＢＹＣ４１−１株を、５ｍｌのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｄｉｕｍ Ａ培地（２．０％ポリペプトン，１．０％硫酸カリウム，０．１４％塩化マグネシウム，０．２％Ｌ−アルギニン、ｐＨ７．０）に植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで１２時間前培養した。その後、５００ｍｌのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｄｉｕｍ Ａ培地を含む２Ｌの坂口フラスコに植菌し、３０℃、９６ｒｐｍで２４時間培養した。培養後、１２，０００×ｇで２０分間遠心分離し、菌体を得た。

【0116】

（ｉｉ） 無細胞抽出液の調製
上記で得られた菌体を生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）で洗浄した後、培地２０Ｌ分の菌体を１００ｍＬの２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）（ＫＰＢ）に懸濁した。１００ｍＬの菌体液を１５分間超音波処理し、８，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離し、得られた上清を無細胞抽出液とした。

【0117】

（ｉｉｉ） 陰イオン交換カラムクロマトグラフィ（Ｑ−セファロース）
２０ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．０）により平衡化したＱ−セファロース樹脂１００ｍｌをカラムに充填し、２０ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．０）で透析した上記無細胞抽出液を吸着させた。５００ｍＬの２０ｍＭ ＫＰＢでカラムを洗浄した後、２０ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．０）５００ｍｌおよび５００ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．０）５００ｍｌを用いて、グラジエントによりＮａＣｌ濃度を徐々に上げ、酵素を溶出させた。フラクションコレクターを用いて、１０ｍＬずつ試験管にフラクションを採取し、活性が認められたフラクションを集めた。

【0118】

（ｉｖ） 疎水性クロマトグラフィ（Ｏｃｔｙｌ−セファロース）
活性が得られたフラクションに、終濃度が２Ｍになるように硫酸アンモニウムを添加し、これを酵素液とした。２Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．０）により平衡化したＯｃｔｙｌ−セファロース樹脂１００ｍｌをカラムに充填し、活性フラクションを吸着させた。５００ｍＬの２Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．０）でカラムを洗浄した後、２Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ ＫＰＢ２５０ｍｌおよび２０ｍＭ ＫＰＢ２５０ｍｌを用いて、グラジエントにより硫酸アンモニウム濃度を徐々に下げ、酵素を溶出させた。活性が確認された非吸着画分を５Ｌの同緩衝液（×３回）で、１晩透析を行った。

【0119】

（ｖ） 疎水性クロマトグラフィ（ＲＥＳＯＵＲＣＥ ＰＨＥ）
中圧高速液体クロマトグラフィ（ＦＰＬＣ、カラム：２Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ ＫＰＢで平衡化したＲＥＳＯＵＲＣＥ ＰＨＥ ６ｍｌカラム）を用いた。サンプルループに限外濾過により透析した酵素液２ｍｌを注入し、２Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ ＫＰＢおよび２０ｍＭ ＫＰＢを用いて、ＦＰＬＣのグラジエントシステムにより、酵素を溶出させた。各フラクション（０．５ｍｌ）から活性が認められたフラクションを集め、１晩透析した。透析した後、限外濾過を用いて酵素液を２ｍＬまで濃縮した。

【0120】

（ｖｉ） 強イオン交換カラムクロマトグラフィ（ＭｏｎｏＱ ＨＲ１０／１００）
中圧高速液体クロマトグラフィ（ＦＰＬＣ、カラム：２０ｍＭ ＫＰＢで平衡化したＭｏｎｏＱ ＨＲ １０／１００カラム）を用いた。サンプルループに限外ろ過（セントリコンチューブ）により濃縮した酵素液２００μＬを注入し、２０ｍＭ ＫＰＢおよび０．５ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ ＫＰＢの２つの溶媒を用いて、ＦＰＬＣのグラジエントシステムにより、酵素を溶出させた。各フラクション（０．５ｍＬ）から活性が認められたフラクションを集め、１晩透析した。透析した後、セントリコンを用いて酵素液を２００μＬまで濃縮した。以上の精製状況を、表６にまとめる。

【0121】

【表6】

【0122】

（２） ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による上記株由来Ｌ−アルギニン酸化酵素の分子量測定
泳動ゲルとして、３６％アクリルアミド５．２５ｍｌ、０．６８Ｍトリス−ＨＣＬ緩衝液（ｐＨ８．８）８．２５ｍＬ、１％ＳＤＳ １．５８ｍＬ、１０％ＴＥＭＥＤ １８７μＬ、２％ＡＰＳ ５６２．５μＬの組成を有するゲルに、３６％ポリアクリルアミド０．５ｍＬ、０．１７９Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）３．５ｍＬ、１％ＳＤＳ ０．５ｍＬ、１０％ＴＥＭＥＤ １２５μＬ、２％ＡＰＳ ３７５μＬの組成を有する濃縮ゲルを重層したものを用い、緩衝液（グリセロール２００μＬ、１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）４０μＬ、水３６０μＬ、２−メルカプトエタノール２００μＬおよび１０％ＳＤＳ ２００μＬ）と等量混合した精製酵素サンプル１０μＬを、ランニング緩衝液（トリス３．０ｇ、グリシン１４．１ｇおよびＳＤＳ １０ｇ）中、３０ｍＡで電気泳動を行った。その後、ゲルをタンパク染色液（ＣＢＢ２．５ｇ、メタノール５００ｍＬ、酢酸５０ｍＬおよび水４５０ｍＬ）で１時間染色し、脱色液（メタノール：酢酸：水＝３：１：６）でバンドが鮮明になるまで脱色した。

【0123】

分子量マーカー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）としては、以下のものを用いた。

【0124】

ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ（９７，４００）
ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ （６６，２６７）
ａｌｄｏｌａｓｅ （４２，２００）
ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ （３０，０００）
ｓｏｙｂｅａｎ ｔｒｙｐｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ （２０，０００）

【0125】

図３にシュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＢＹＣ４１−１株由来Ｌ−アルギニン酸化酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真を示した。

【0126】

（３） シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＢＹＣ４１−１株由来のＬ−アルギニン酸化酵素のＮ末端アミノ酸配列の決定
精製酵素のＮ末端アミノ酸配列は、株式会社ニッピに分析を依頼した。精製したシュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＢＹＣ４１−１株由来Ｌ−アルギニン酸化酵素をＥｄｍａｎ分解法によりＮ末端側から１５残基決定した。

【0127】

実施例３： 本発明に係るＬ−アルギニン酸化酵素の取得
（１） シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＢＹＣ４１−１株由来Ｌ−アルギニン酸化酵素遺伝子のクローニング
（ｉ） シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＢＹＣ４１−１株の染色体ＤＮＡの抽出
上記実施例１のシュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＢＹＣ４１−１株をＴＧＹ培地３ｍＬに植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで１２時間培養した。培養液１ｍＬを、１５，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離し、集菌した。菌体をＳＴＥ緩衝液（ＮａＣｌ ０．５８ｇ、１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１ｍＬおよび０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）２００μＬを水で１００ｍＬに定量したもの）１ｍＬで洗浄した後、同緩衝液に懸濁した。６８℃で１５分間加熱した後、１５，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離し、上清を除いた。別途、リゾチーム５ｍｇ、１０ｍｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅ １０ｍＬ（以下、当該溶液を「１液」という）を準備した。また、グルコース０．９ｇ、１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）２．５ｍｌ、０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）２ｍＬを含む溶液に超純水を加え、総量を１００ｍＬにした。当該溶液１ｍＬと、上記１液１０ｍＬを混合した。上記遠心分離沈殿物を、当該混合液３００μＬに懸濁した。３７℃で３０分間インキュベートした後、プロテイナーゼＫ液（プロテイナーゼＫ １０ｍｇ／１液１ｍＬ）６μＬを加え、穏やかに混合し、３７℃で１０分間インキュベートした。Ｎ−ラウロイルザリコシン３ｍｇを加えて、穏やかに混合した後、３７℃で３時間インキュベートし、フェノール−クロロホルム処理を穏やかに２回行った。上清３００μＬに５Ｍ ＮａＣｌ溶液１０μＬとエタノール６００μＬを加えて混合した後、１５，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。７０％エタノールで洗浄した後、風乾し、ＴＥ緩衝液１００μＬに溶解し、目的とする染色体ＤＮＡを得た。

【0128】

（ｉｉ） ＰＣＲによるシュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＢＹＣ４１−１株由来のＬ−アルギニン酸化酵素遺伝子の増幅
ＰＣＲ反応液の組成は、水３５μＬ、１０×ＬＡ Ｔａｑ ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、２ｍＭ ｄＮＴＰ ５μＬ、１００ｐｍｏｌプライマー１（５’−ＴＡＴＡＡＴＣＡＴＡＴＧＡＧＣＣＡＧＡＣＣＣＡＧＣＣＡＴＴＧＧＡＴＧ−３’）（配列番号３）１μＬ、１００ｐｍｏｌプライマー２（５’−ＴＡＴＴＡＣＴＣＧＡＧＴＣＡＴＧＣＴＴＴＧＡＴＣＣＣＴＧＴＧＴＡＧＧＣＧ−３’）（配列番号４）１μＬ、鋳型ＤＮＡ２μＬおよびＬＡ Ｔａｑ １μＬとした。ＰＣＲ反応の条件は、（ｉ）９８℃で５分間、（ｉｉ）９６℃で１０秒間、（ｉｉｉ）５０℃で５秒間、（ｉｖ）７２℃で２分間、および（ｉｉ）までを３０サイクルとした。増幅した遺伝子は、アガロースゲル電気泳動により確認した。増幅した遺伝子をＶＩＯＧＥＮＥ（ＵＳＡ）社のＧｅｌ−Ｍゲル抽出キットを用いて抽出した。

【0129】

（ｉｉｉ） シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＢＹＣ４１−１株由来のＬ−アルギニン酸化酵素遺伝子配列のシーケンシング
遺伝子の両方の鎖についてシーケンシングを行うため、プライマー１とプライマー２を用いてシーケンス反応を行った。反応液組成は、１．６μＬの各プライマー、１．６μＬの鋳型ＤＮＡ、１μＬのＢｉｇＤｙｅプレミックスソリューション、１．５μＬの５ｘＢｉｇＤｙｅシーケンシングバッファーと４．９μＬの滅菌水とし、全量１０μＬとした。ＰＣＲ反応の条件は、（ｉ）９６℃で２分間、（ｉｉ）９６℃で１０秒間、（ｉｉｉ）５０℃で５秒間、（ｉｖ）６０℃で４分間、（ｖ）（ｉｉ）〜（ｉｖ）を２５回、および（ｖｉ）７２℃で５分間とした。ＰＣＲ産物に、１μＬの３Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）、１μＬの０．１２５Ｍ ＥＤＴＡと２５μＬのエタノールを加え、室温で１５分間放置した後、１５，０００ｒｐｍ、４℃で８分間遠心分離することにより沈殿させた。上清を廃棄した後、１０μＬの Ｈｉ Ｄｉ Ｆｏｒｍａｍｉｄｅを加え、１００℃で５分間加熱した後に、氷水で急冷したものをＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒで塩基配列の解読をした。得られたシーケンスデータの解析はＧｅｎｅｔｙｘで行い、それぞれのプライマーで増幅した断片を連結した。配列番号２に、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＢＹＣ４１−１株由来のＬ−アルギニン酸化酵素遺伝子配列から予測される１次構造を示した。

【0130】

（ｉｖ） シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＢＹＣ４１−１株由来Ｌ−アルギニン酸化酵素遺伝子による大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９）の形質転換
ライゲーション反応の組成は、ＰＣＲ産物５μＬ、ｐＴ７ Ｂｌｕｅ Ｔ−Ｖｅｃｔｅｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）１μＬ、ライゲーションミックス（Ｔａｋａｒａ）６μＬとし、１６℃で３０分間反応させた。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９）のコンピテントセル１００μＬに１２μＬのライゲーション反応液を加え、ヒートショック法で形質転換した。８０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地（１．０％ポリペプトン，０．５％イースト抽出物および１．０％ ＮａＣｌ）に生育したコロニーを数株選抜してプラスミド抽出し、０．７％アガロース電気泳動により、インサートの有無を確認した。

【0131】

（２） シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＢＹＣ４１−１株由来のＬ−アルギニン酸化酵素遺伝子の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ＤＥ３））における発現
（ｉ） シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＢＹＣ４１−１株由来のＬ−アルギニン酸化酵素遺伝子の増幅
ＰＣＲ反応液の組成は、水３５μＬ、１０×ＬＡ Ｔａｑ ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、２ｍＭ ｄＮＴＰ ５μＬ、１００ｐｍｏｌプライマー１（５’−ＡＴＡＴＴＣＴＡＧＡＧＡＡＧＧＡＧＧＣＡＴＡＧＴＧＧＡＴＧＡＧＣＣＡＧＡＣＣＣＡＧＣＣＡＴＴ−３’）（配列番号５）１μＬ、１００ｐｍｏｌプライマー２（５’−ＡＴＡＴＣＴＣＧＡＧＴＣＡＴＧＣＴＴＴＧＡＴＣＣＣＴＧＴＧＴ−３’）（配列番号６）１μＬ、鋳型ＤＮＡ２μＬおよびＬＡ Ｔａｑ １μＬとした。ＰＣＲ反応の条件は、（ｉ）９８℃で５分間、（ｉｉ）９６℃で１０秒間、（ｉｉｉ）５０℃で５秒間、（ｉｖ）７２℃で２分間、および（ｉｉ）までを３０サイクルとした。

【0132】

（ｉｉ） シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＢＹＣ４１−１株由来Ｌ−アルギニン酸化酵素遺伝子によるｐＥＴ１５ｂベクターへの組換えと大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１）の形質転換
ＰＣＲ反応で得られた、ＰＣＲ産物５μＬに、１μＬ ＸｂａＩと１μＬ ＸｈｏＩを加え、３７℃で１時間インキュベートし、制限酵素処理を行った。ライゲーション反応は、５μＬ ＤＮＡ、１μＬ ｐＥＴ１５ｂ（増幅遺伝子と同様の制限酵素処理を行ったもの）、６μＬライゲーションＭｉｘとし、１６℃で３０分間インキュベートした。得られたライゲーション反応液全量を、ヒートショック法により、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１）に導入した。

【0133】

（ｉｉｉ） シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＢＹＣ４１−１株由来Ｌ−アルギニン酸化酵素遺伝子の発現と精製
８０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む４ＬのＬＢ培地（１．０％ポリペプトン、０．５％イースト抽出物、１．０％ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）に組換え大腸菌（ＢＬ２１）を植菌し、１６℃で１２時間培養後、０．５ｍＭ ＩＰＴＧを添加して、引き続き３０℃で１２時間培養してＬ−アミノ酸オキシダーゼを誘導した。大型遠心機を用いて５，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離することにより集菌し、生理食塩水（０．９％ ＮａＣｌ）で洗浄した後、１００ｍＬの２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）（ＫＰＢ）に懸濁した。１００ｍＬの菌体液を１５分間超音波処理し、８，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離することにより得られた上清を無細胞抽出液とした。無細胞抽出液を（１）（ｉｉｉ）〜（ｖｉ）と同様の手法で精製を行った。

【0134】

（３） シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＢＹＣ４１−１株由来Ｌ−アルギニン酸化酵素の活性測定
精製酵素標品の酵素活性を、基質濃度をより低い５ｍＭとした以外は表２におけるアミノ酸をそれぞれ単独に含有する測定試薬にて測定した。結果を図４と表７に示す。

【0135】

【表7】

【0136】

図４と表７のとおり、本発明に係るＬ−アルギニン酸化酵素は、Ｌ−アルギニンを基質として酸化する一方で、Ｌ−リジンをわずかに基質とするのみで、その他のアミノ酸には全く活性を示さなかった。このように、本発明に係るＬ−アルギニン酸化酵素は、Ｌ−アルギニンに対して高い特異性を示すことが明らかになった。

【0137】

実施例４： シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＢＹＣ４１−１株由来Ｌ−アルギニン酸化酵素を用いたＬ−アルギニンの定量
上記実施例１（１）にて精製したＬ−アルギニン酸化酵素標品を用いて、上記試験例１のＬ−アルギニン測定用試薬組成物を調製した。本試薬組成物を用い、Ｌ−アルギニン測定を実施した。検体として、０〜２００μＭのＬ−アルギニン水溶液と、Ｌ−アルギニンを０〜２００μＭ含む血漿試料を調製した。血漿試料の測定結果を図５（１）に、両試料のＬ−アルギニン濃度と吸光度との関係を図５（２）に示す。

【0138】

図５のとおり、Ｌ−アルギニン溶液を検体とした場合には十分な反応性が認められ、水溶液においても血漿においても、Ｌ−アルギニン濃度と吸光度測定データは良好な正の相関を示した。従って、本発明のＬ−アルギニン測定用試薬組成物を用いることにより、正確なＬ−アルギニンの測定を行うことができることが実証された。

【0139】

試験例２： 本発明に係るＬ−アルギニン酸化酵素の至適温度の検討
上記試験例１において、反応温度を２０〜６５℃に変化させ、本発明に係るＬ−アルギニン酸化酵素の活性を測定した。結果を図６に示す。

【0140】

図６のとおり、本発明に係るＬ−アルギニン酸化酵素は、おおよそ４５℃以上６０℃以下で最も高い活性を示した。なお、図６の縦軸は、最も活性の高かった５５℃における酵素活性を１００％とした場合の相対活性値である。

【0141】

試験例３： 本発明に係るＬ−アルギニン酸化酵素の至適ｐＨの検討
上記試験例１において、緩衝液を変更することにより反応液のｐＨを４〜１０に変化させ、本発明に係るＬ−アルギニン酸化酵素の活性を測定した。なお、ｐＨ４〜５．５ではクエン酸緩衝液を、ｐＨ５．５〜８．５ではリン酸緩衝液を、ｐＨ８．５〜９ではトリス塩酸緩衝液を、ｐＨ９〜１０ではグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液を用いた。結果を図７に示す。

【0142】

図７のとおり、本発明に係るＬ−アルギニン酸化酵素は、ｐＨ５．５で最も高い活性を示した。なお、図７の縦軸は、ｐＨ５．５での最も高い活性値を１００％とした場合の相対活性値を示す。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

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