特許 6131828 ケルセチンとｐ−クマル酸との反応生成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6131828

(24)【登録日】2017年4月28日

(45)【発行日】2017年5月24日

(54)【発明の名称】ケルセチンとｐ−クマル酸との反応生成物

(51)【国際特許分類】

   C07D 311/30 20060101AFI20170515BHJP

   A61K 31/352 20060101ALI20170515BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20170515BHJP

   A61P 1/02 20060101ALI20170515BHJP

   A23L 33/10 20160101ALI20170515BHJP

   C07B 61/00 20060101ALN20170515BHJP

【ＦＩ】

   C07D311/30

   A61K31/352

   A61P35/00

   A61P1/02

   A23L33/10

   !C07B61/00 300

【請求項の数】6

【全頁数】18

(21)【出願番号】特願2013-226942(P2013-226942)

(22)【出願日】2013年10月31日

(65)【公開番号】特開2015-86186(P2015-86186A)

(43)【公開日】2015年5月7日

【審査請求日】2016年7月28日

(73)【特許権者】

【識別番号】390020189

【氏名又は名称】ユーハ味覚糖株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100074561

【弁理士】

【氏名又は名称】柳野 隆生

(74)【代理人】

【識別番号】100124925

【弁理士】

【氏名又は名称】森岡 則夫

(74)【代理人】

【識別番号】100141874

【弁理士】

【氏名又は名称】関口 久由

(74)【代理人】

【識別番号】100163577

【弁理士】

【氏名又は名称】中川 正人

(72)【発明者】

【氏名】羽座 良美

(72)【発明者】

【氏名】來住 明宣

(72)【発明者】

【氏名】松川 泰治

(72)【発明者】

【氏名】松居 雄毅

(72)【発明者】

【氏名】山田 泰正

(72)【発明者】

【氏名】山田 一郎

【審査官】 早乙女 智美

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００７／０５６１８８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Li, Ming-Chan et al.，Isolation of Novel Phenolic Compounds with Multidrug Resistance (MDR) Reversal Properties from Onychium japonicum，Chemistry & Biodiversity，２０１１年，8(6)，pp. 1112-1120

【文献】 Li, Feng et al.，Study on the Constituents of Mexican Propolis and Their Cytotoxic Activity against PANC-1 Human Pancreatic Cancer Cells，Journal of Natural Products，２０１０年，73(4)，pp. 623-627

【文献】 Lee, In-Kyoung et al.，Cytotoxic benzyl dihydroflavonols from Cudrania tricuspidata，Phytochemistry，１９９６年，41(1)，pp. 213-216

【文献】 Yu, N.-J. et al.，Japonicins A and B from the flowers of Inula japonica，Journal of Asian Natural Products Research，２００６年，8(5)，pp. 385-390

【文献】 Merghem, Rachid et al.，Five 8-C-benzylated flavonoids from Thymus hirtus (Labiateae)，Phytochemistry，１９９５年，38(3)，pp. 637-640

【文献】 Huong, D. T. et al.，A new flavone and cytotoxic activity of flavonoid constituents isolated from Miliusa balansae (Annonaceae)，Pharmazie，２００５年，60(8)，pp. 627-629

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｄ ３１１／３０

Ａ６１Ｋ ３１／３５２

Ａ２３Ｌ １／３０

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ケルセチンとｐ−クマル酸との反応生成物であって、式（１）：

【化1】

で表される新規化合物又はその薬学的に許容可能な塩。

【請求項2】

ケルセチンとｐ−クマル酸との反応生成物であって、式（２）：

【化2】

で表される新規化合物又はその薬学的に許容可能な塩。

【請求項3】

請求項１又は２記載の新規化合物又はその薬学的に許容可能な塩を含有する抗癌剤。

【請求項4】

請求項１又は２記載の新規化合物又はその薬学的に許容可能な塩を含有する口腔癌細胞に対する抗癌剤。

【請求項5】

請求項１又は２記載の新規化合物又はその薬学的に許容可能な塩を含有する食品、医薬品又は医薬部外品。

【請求項6】

ケルセチンとｐ−クマル酸を金属塩存在下で加熱することにより、目的の化合物を生成することを特徴とする請求項１又は２記載の新規化合物又はその薬学的に許容可能な塩の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、抗癌活性を有する新規化合物、該新規化合物を含む抗癌剤、食品、医薬品及び医薬部外品に関する。また、本発明は、前記新規化合物の製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ケルセチンは植物の二次代謝産物の一つであり、多くの植物、食品等に存在する。例えば、ケルセチンおよびその配糖体は、タマネギ、ソバ、グリーンアスパラおよびかんきつ類等に多く含まれていることが知られている。

【0003】

ケルセチンおよびケルセチン誘導体に関しては、これまでにさまざまな研究がなされている。例えば、ケルセチンおよびケルセチン誘導体が、シクロオキシゲナーゼ２およびＮＦκＢの生合成阻害作用（特許文献１）、骨密度の向上（特許文献２）、破骨細胞分化抑制因子産生促進（特許文献３）、カルシウム吸収促進（特許文献４）等の効果を有することが報告されている。また、リン酸化ケルセチン（特許文献５）、ジヒドロケルセチン誘導体（特許文献６）等の報告もなされている。また、心臓血管疾患を治療するためのケルセチンに富んだリンゴ果皮抽出物に関する報告もあり（特許文献７）、ケルセチンおよびケルセチンの配糖体を含有した飲料（特許文献８、９）、錠剤またはカプセルの形態の食品（特許文献１０）に関する報告もなされている。
以上のようにケルセチンおよびケルセチン誘導体は、特定保健用食品の関与成分として配合されているなど注目されている成分である。

【0004】

一方、ｐ−クマル酸は、樹木の主成分であるリグニンやリグナンの前駆体となるほか、フラボノイド類やレスベラトロールなどのスチルベン類の機能性成分の前駆体にもなっており、天然界に比較的多く存在する成分である。また、ｐ−クマル酸としては、プラムをはじめとして、多くの果物の果実や果皮、プロポリスなどにも含まれていることが知られている。

【0005】

前記ｐ−クマル酸については、その生理機能に関連した先行技術がある。例えば、ｐ−クマル酸をはじめ、桂皮酸類を有効成分とする抗ヘリコバクター・ピロリ剤（特許文献１１）、フェルラ酸及び／又はｐ−クマル酸を有効成分とする皮膚改善剤（特許文献１２）、クマル酸をはじめ、プロポリスの抽出物に含まれる桂皮酸類を有効成分とする血管新生抑制剤（特許文献１３）が挙げられる。
また、ｐ−クマル酸誘導体に関連した先行技術がある。例えば、クマル酸を化学合成させたリグニン類を有効成分とする抗菌剤（特許文献１４）、カフェイン酸アミド誘導体又はエステル誘導体を有効成分とするアディポネクチン産生増強剤（特許文献１５）、ｐ−クマル酸二量体を原料とした抗菌剤であるベンゾフランカルボキサミド誘導体の合成方法（特許文献１６）が挙げられる。
また、前記ｐ−クマル酸やｐ−クマル酸誘導体は、植物中にも多く含まれていることから、リンゴ、ナシ又はモモの未熟果実の果実ポリフェノールとして、ｐ−クマル酸やｐ−クマル酸誘導体などを含む酸化防止剤、血圧降下剤、抗変異原性作用剤、アレルギー抑制剤、抗う蝕剤及び消臭剤（特許文献１７）が挙げられる。また、ｐ−クマル酸が弱いながらも抗癌活性を有するとの報告もある（非特許文献１）。

【0006】

このように、ｐ−クマル酸、ケルセチン、これらの誘導体は、優れた有用性を示すものが多いことから、原料やリード化合物としてのこれらを効率的に製造する技術開示もなされている。例えば、組み換え体を用いた微生物によるｐ−ヒドロキシ桂皮酸（ｐ−クマル酸）などの製造方法が知られている（特許文献１８）。また、多糖類を用いたケルセチンの精製方法も報告されている（特許文献１９）。

【0007】

また、厚生労働省の調べによると、平成２０年の日本人の死亡原因の約３０％が悪性新生物つまり癌である。現在の抗癌剤の研究では、日常的に摂取できる天然物由来の化合物としては、ケルセチンをはじめとするフラボノイド類等が知られている（非特許文献２）。
また、医療技術や薬の発達により多くの癌の発生数が横這い又は減少しているのに対し、現在でも増加している癌の１つが口腔癌であり、癌発生の５％を占めている。また、２０１５年には現在の４倍の罹患数になると予想されている。現在の抗癌剤の研究では、日常的に摂取できる天然物由来の化合物としては、フラボノイド類が知られている（非特許文献３）。
しかし、より抗癌活性が強く、日常的に摂取できる安全な癌、特に口腔癌の治療薬、予防薬の開発が望まれている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】特開２００１−２３３７６８号公報

【特許文献2】特開２００２−２３４８４４号公報

【特許文献3】特開２００７−１３７７７５号公報

【特許文献4】米国特許第５，４７８，５７９号明細書

【特許文献5】特表２０１２−５０５２５１号公報

【特許文献6】特許第４７９０５６１号公報

【特許文献7】特表２０１３−５２８１６３号公報

【特許文献8】特許第５２９８２３２号公報

【特許文献9】特開２０１２−１８３０６３号公報

【特許文献10】特開２０１３−２７４０３号公報

【特許文献11】特開平１１−１０６３３５号公報

【特許文献12】特許第３３３０９６１号公報

【特許文献13】特開２００７−２２３９４８号公報

【特許文献14】特許第４３９５６２３号公報

【特許文献15】特許第５２４６８３３号公報

【特許文献16】特開２００８−１８９５５４号公報

【特許文献17】特許第４１４２８５９号公報

【特許文献18】特表２００５−５２２１８０号公報

【特許文献19】国際公開第２００７／１３６０６８号

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ＆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，９，１１６３−１１７０（２０００）

【非特許文献2】Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｖｉｅｗｓ，２３（４），５１９−５３４（２００３）

【非特許文献3】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｅｎｔａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，８４，４０１−４０６（２００８）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

本発明者らは、ケルセチンやｐ−クマル酸に関する前記の状況を鑑みて、新規な生理活性又は強力な生理活性を有するケルセチンやｐ−クマル酸の誘導体の探索と、それらの製造方法を確立すべく鋭意検討した結果、意外にもケルセチンとｐ−クマル酸とを金属塩存在下で加熱するという簡便且つ安全な方法により、ケルセチン及びｐ−クマル酸に比べて優れた抗癌活性、特に口腔癌細胞に対しても優れた抗癌活性を有する新規化合物を製造することに成功し、本発明を完成させた。

【0011】

したがって、本発明は、ケルセチン及びｐ−クマル酸よりも優れた抗癌活性を有する新規化合物を提供し、さらに該新規化合物を効率よく、安全に製造する方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、前記新規化合物を含有することを特徴とする抗癌剤、口腔癌細胞に対する抗癌剤、さらには、食品、医薬品及び医薬部外品を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0012】

本発明の要旨は、
〔１〕ケルセチンとｐ−クマル酸との反応生成物であって、式（１）：

【0013】

【化1】

【0014】

で表される新規化合物又はその薬学的に許容可能な塩、
〔２〕ケルセチンとｐ−クマル酸との反応生成物であって、式（２）：

【0015】

【化2】

【0016】

で表される新規化合物又はその薬学的に許容可能な塩、
〔３〕前記〔１〕又は〔２〕記載の新規化合物又はその薬学的に許容可能な塩を含有する抗癌剤、
〔４〕前記〔１〕又は〔２〕記載の新規化合物又はその薬学的に許容可能な塩を含有する口腔癌細胞に対する抗癌剤、
〔５〕前記〔１〕又は〔２〕記載の新規化合物又はその薬学的に許容可能な塩を含有する食品、医薬品又は医薬部外品、
〔６〕ケルセチンとｐ−クマル酸を金属塩存在下で加熱することにより、目的の化合物を生成することを特徴とする前記〔１〕又は〔２〕記載の新規化合物又はその薬学的に許容可能な塩の製造方法、
に関する。

【発明の効果】

【0017】

本発明である前記式（１）又は（２）で表される新規化合物又はその薬学的に許容可能な塩（以下、「新規化合物」という。）は、ケルセチン及びｐ−クマル酸と比べて、抗癌活性に優れていることから、新規な抗癌剤として有用である。また、本発明の新規化合物は、口腔癌細胞に対する抗癌剤としても有用である。
また、本発明の新規化合物は、前記のような生理活性に優れることから、食品、医薬品及び医薬部外品に配合することで、抗癌活性に優れた食品、医薬品及び医薬部外品を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】図１は、実施例１で得られたクロマトグラムを示す。上から、反応前のクロマトグラム、（１）金属塩としてミネラルウォーターを用いたクロマトグラム、（２）リン酸三マグネシウム八水和物を用いたクロマトグラムを示している。図中、Ａ、Ｂのピークは本発明の新規化合物を含むピークを示す。なお、Ａのピークは前記式（１）で表される新規化合物、Ｂのピークは前記式（２）で表される新規化合物を示す。

【発明を実施するための形態】

【0019】

以下、本発明について詳細に説明する。

【0020】

本発明の新規化合物は、ケルセチンとｐ−クマル酸との反応生成物であって、式（１）：

【0021】

【化3】

【0022】

又は式（２）：

【0023】

【化4】

【0024】

で示される新規化合物又はその薬学的に許容可能な塩である。

【0025】

前記新規化合物の薬学的に許容可能な塩としては、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩、バリウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩；アルミニウムヒドロキシド塩等の金属ヒドロキシド塩；アルキルアミン塩、ジアルキルアミン塩、トリアルキルアミン塩、アルキレンジアミン塩、シクロアルキルアミン塩、アリールアミン塩、アラルキルアミン塩、複素環式アミン塩等のアミン塩；α−アミノ酸塩、ω−アミノ酸塩等のアミノ酸塩；ペプチド塩又はそれらから誘導される第１級、第２級、第３級若しくは第４級アミン塩等が挙げられる。これらの薬学的に許容可能な塩は、単独で又は２種以上を混合して用いることができる。

【0026】

本発明の新規化合物は、当該分野で周知の方法に従って化学合成することも可能ではあるが、反応工程が複雑となり、人体に有害な試薬、触媒、溶媒等を必要とする。また、化学合成では不純物を除去する煩雑さもあり、さらに安全性の観点から、前記新規化合物の精製を徹底する必要もあり、製造コストの面で工業的には不向きな方法である。

【0027】

そこで、本発明者らは、鋭意検討した結果、ケルセチンとｐ−クマル酸とを金属塩存在下で加熱することで、前記の化学合成法のように有害な試薬等や煩雑な工程を必要とせずに、本発明の新規化合物を効率的かつ安全に製造することができることを見出した。以下に、本発明の新規化合物の製造方法（以下、「本発明の製造方法」という）について具体的に説明する。

【0028】

本発明の製造方法では、前駆体としてケルセチンを用いる。ケルセチンは、天然由来のものであっても、化学合成された純度の高い化成品であっても良い。天然由来のケルセチンを用いる場合は、完全に精製されたものである必要はなく、後述のように所望の生成反応が進み最終的に本発明の新規化合物が得られるから、ケルセチン以外の成分を含む混合物も使用できる。また、ケルセチンには、塩等の誘導体も含まれる。
ただし、本発明の新規化合物の回収率の観点からは、ケルセチン換算で１重量％以上含有された混合物が原料として望ましい。
前記ケルセチンとしては、かんきつ類やタマネギの鬼皮、マメ科のエンジュの花蕾等の原料からの抽出物、凍結乾燥品等を使用してもよい

【0029】

また、本発明の製造方法では、前駆体としてｐ−クマル酸を用いる。ｐ−クマル酸は、天然由来のものであっても、化学合成された純度の高い化成品であっても良い。天然由来のｐ−クマル酸を用いる場合は、完全に精製されたものである必要はなく、後述のように所望の生成反応が進み最終的に本発明の新規化合物が得られるのであれば、ｐ−クマル酸以外の成分を含む混合物も使用できる。
ただし、本発明の新規化合物の回収量の観点からは、ｐ−クマル酸換算で１重量％以上含有された混合物が原料として望ましい。このようなｐ−クマル酸の原料としては、例えば、様々な果実やジュース、濃縮果汁、又は、破棄されることの多い果皮の抽出物、プロポリス又はその抽出物あるいは前記特許文献１８等に記載されるような微生物発酵によるｐ−クマル酸含有培養液等が挙げられる。

【0030】

本発明の製造方法では、ケルセチンやｐ−クマル酸、又はケルセチンとｐ−クマル酸との混合物を適切な溶媒に溶解させる。水と有機溶媒の配合比や、有機溶媒の種類については特に制限はなく、ケルセチンやｐ−クマル酸が十分に溶解すれば良い。中でも、水、メタノールやエタノールのみの溶媒、水とメタノール、水とエタノール等の混合液を使用することが、安全性やコスト面から好ましい。特に、本発明の新規化合物を含む反応後の組成物を、十分な精製をせずに食品等の原料として使用する場合には、安全性や法規面から溶媒として水、エタノールまたは含水エタノールを使用することが望ましい。

【0031】

得られるケルセチンやｐ−クマル酸を含有する溶液中のケルセチンやｐ−クマル酸の濃度については特に制限はないが、ケルセチンやｐ−クマル酸の濃度が高いほど溶媒使用量が少ない等のメリットがあるため、ケルセチンやｐ−クマル酸の濃度は各々の溶媒に対しケルセチンやｐ−クマル酸がそれぞれ飽和する濃度近くが好ましい。また、ケルセチンやｐ−クマル酸は前記溶液中において生成反応前に完全に溶解していなくともよい。例えば、ケルセチン含有溶液とｐ−クマル酸含有溶液とを混合する場合、それぞれの溶液中のケルセチン濃度、ｐ−クマル酸濃度がともに飽和濃度以上であっても、混合液とした場合には、飽和濃度近くになるように調整しておけばよい。

【0032】

次に、前記ケルセチン及びｐ−クマル酸を含有する溶液（以下、ケルセチン、ｐ−クマル酸含有溶液）のｐＨを８未満に調整することが好ましい。調整方法として、例えば、ケルセチン、ｐ−クマル酸含有溶液を調製した後にｐＨ調整剤を添加してｐＨを調整してもよいし、前記溶液の調製時に前もって溶媒のｐＨを調整しておいてもよい。ケルセチン、ｐ−クマル酸含有溶液の反応開始時のｐＨは８．０以上であれば、他の反応や目的化合物の分解も一方で生じるために最終的な本発明の新規化合物の回収量が低下する傾向がある。したがって、反応開始時のｐＨは３以上８未満が望ましい。

【0033】

本発明の製造方法では、前記ケルセチン、ｐ−クマル酸含有溶液中に金属塩を添加する。前記金属塩としては、酸性塩、塩基性塩、正塩のいずれでもよく、また、単塩、複塩、錯塩のいずれでもよい。さらに、金属塩は１種類であっても、複数種類の混合物であってもよい。金属塩の例としては、食品添加物として認可されているものが安全性の面で好ましい。例えば、食品に添加することが認められているマグネシウム塩、カルシウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、亜鉛塩、銅塩等が挙げられる。
また、前記金属塩の混合物としては、例えば、ミネラルプレミックス（田辺製薬株式会社、グルコン酸亜鉛、クエン酸鉄アンモニウム、乳酸カルシウム、グルコン酸銅、リン酸マグネシウムを主成分としたミネラル混合物）のように金属塩を数種類含む物質が挙げられる。また、複数の金属塩を含む混合物として、ミネラルウォーターも挙げることができる。
なお、前記金属塩の含有量としては、本発明の新規化合物を生成可能な量であればよく、特に限定はない。

【0034】

次に、金属塩存在下で、ケルセチン、ｐ−クマル酸含有溶液を加熱処理する。この加熱処理により、本発明の新規化合物の生成反応を行う。生成反応を効率的に進ませるために、ケルセチン、ｐ−クマル酸含有溶液の加熱温度は１１０℃以上に調整することが好ましい。例えば、開放容器にケルセチン、ｐ−クマル酸含有溶液を入れ、溶媒の沸点を超える高温で前記容器を加熱する、密閉容器にケルセチン、ｐ−クマル酸含有溶液を入れて前記容器を加熱する、レトルト装置、オートクレーブ、超臨界装置、プレッシャークッカー等を用いて加圧加熱する等、少なくとも部分的に溶液温度が１１０℃以上に達するように加熱することが好ましい。また、使用する溶媒の沸点から考え、加圧加熱が望ましい。回収効率面から、溶液温度が均一に１１０℃〜１５０℃になることが、さらに好ましい。加熱時間も加熱温度と同様に限られたものではなく、効率的に目的の反応が進行する時間条件とすればよい。特に、加熱時間は加熱温度との兼ね合いによるものであり、加熱温度に応じた加熱時間にすることが望ましい。例えば、１３０℃付近に加熱する場合は、５分〜６００分の加熱時間が望ましい。また、加熱は、一度でも良いし、複数回に分けて繰り返し加熱しても良い。複数回に分けて加熱する場合、蒸発した溶媒を補うために溶媒を新たに追加して行うことでより効率よく本発明の新規化合物が生成できるので好ましい。

【0035】

前記加熱処理による本発明の新規化合物の生成反応の終了は、例えば、ＨＰＬＣによる成分分析により本発明の新規化合物の生成量を確認して判断すればよい。

【0036】

得られる反応溶液中には、生成した本発明の新規化合物が含有されている。
また、安全な原料のみを用いた工程で本発明の新規化合物を製造した場合には、本発明の新規化合物を含む混合物の状態で食品、医薬品又は医薬部外品に使用することが可能である。例えば、天然由来のケルセチン、ｐ−クマル酸を含水エタノール溶媒に溶解し、ミネラルウォーターやミネラルプレミックスを添加して加熱処理した場合には、得られる反応溶液を食品、医薬品又は医薬部外品の原料の一つとして使用することが可能である。

【0037】

また、風味面での改良やさらなる高機能化を望む場合は、前記反応液を濃縮して本発明の新規化合物の濃度を高める、あるいは前記反応液を精製し本発明の新規化合物の純品を得ることができる。濃縮、精製は、公知の方法で実施可能である。例えば、クロロホルム、酢酸エチル、エタノール、メタノール等を用いた溶媒抽出法や炭酸ガスによる超臨界抽出法等で抽出して本発明の新規化合物を濃縮できる。また、カラムクロマトグラフィーを利用して濃縮や精製を施すことや、再結晶法や限外ろ過膜等の膜処理法も適用可能である。

【0038】

また、前記反応液から本発明の新規化合物を分離して回収する場合には、カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ等を用いてもよい。

【0039】

前記濃縮物や精製物を、必要に応じて、減圧乾燥や凍結乾燥して溶媒除去することで、粉末状の本発明の新規化合物を得ることができる。

【0040】

以上のようにして得られる本発明の新規化合物は、ケルセチン、ｐ−クマル酸に比べて、優れた抗癌活性、中でも口腔癌細胞に対する抗癌活性を有する。したがって、本発明の新規化合物を有効成分として含有する抗癌剤、口腔癌細胞に対する抗癌剤を提供することができる。

【0041】

特に、本発明の新規化合物の生理活性分野を考慮すると、癌予防・治療等の健康増進、さらには疾病治癒分野において用いることが好ましい。

【0042】

なお、本発明の新規化合物が持つさらなる効果効能は、得られた生理活性データより類推できる範囲で使用できる。

【0043】

本発明の新規化合物の原料であるケルセチン及びｐ−クマル酸はいずれも食物由来であり安全性にも優れるといえるため、本発明の新規化合物の安全性も同様に優れたものであると考えられる。
したがって、本発明の新規化合物は、食品、医薬品、医薬部外品等に配合して使用することができる。このような食品、医薬品、医薬部外品は、抗癌作用を有する食品、医薬品、医薬部外品となる。特に、抗癌作用が知られていない材料のみからなる抗癌作用のない食品、医薬品、医薬部外品でも、本発明の新規化合物を配合することで、簡単に抗癌作用を付与することができる。
なお、食品、医薬品、医薬部外品には、前記式（１）で表される新規化合物または前記式（２）で表される新規化合物をそれぞれ単独で配合してもよいし、両者を併用してもよい。また、特に記述のない場合は、後述の本発明の新規化合物の量は全ての本発明の新規化合物の量を示す。

【0044】

前記食品としては、例えば、飲料、アルコール飲料、ゼリー、菓子等、どのような形態でもよく、菓子類の中でも、その容量等から保存や携帯性に優れた、ハードキャンディ、ソフトキャンディ、グミキャンディ、タブレット等が挙げられるが、特に限定はない。また、本発明の新規化合物は、癌の中でも口腔癌に対する優れた抗癌活性を有することから、癌、口腔癌に対する予防を目的に、容易に摂取できるキャンディー、グミキャンディ、タブレット等にすることができる。なお、食品には、機能性食品、健康食品、健康志向食品等も含まれる。

【0045】

また、前記食品には、ヒトが食べる食品だけでなく、例えば、非ヒト動物、例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー等の哺乳類、鳥類、両生類、爬虫類等の治療剤又は飼料に配合してもよい。飼料としては、例えばヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ニワトリ等に用いる家畜用飼料、ウサギ、ラット、マウス等に用いる小動物用飼料、ウナギ、タイ、ハマチ、エビ等に用いる魚介類用飼料、イヌ、ネコ、小鳥、リス等に用いるペットフードが挙げられる。

【0046】

前記医薬品としては、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤等の固形製剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、ゲル剤等が挙げられる。錠剤、丸剤、顆粒剤、顆粒を含有するカプセル剤等の顆粒は、必要により、ショ糖等の糖類、マルチトール等の糖アルコールで糖衣を施したり、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等でコーティングを施してもよいし、胃溶性若しくは腸溶性物質のフィルムで被覆してもよい。また、製剤の溶解性を向上させるために、前記の製剤に公知の可溶化処理を施すこともできる。常法に基づいて、前記液剤を注射剤、点滴剤に配合して使用してもよい。

【0047】

医薬部外品としては、口腔に用いられる医薬部外品、例えば、歯磨き、マウスウォッシュ、マウスリンス、ドリンク剤が挙げられる。

【0048】

本発明の新規化合物を用いて食品、医薬品又は医薬部外品を調製する場合、本発明の効果が損なわれない範囲内で食品、医薬品又は医薬部外品に通常用いられる成分を適宜任意に配合することができる。
例えば、食品の場合には、水、アルコール、澱粉質、蛋白質、繊維質、糖質、脂質、ビタミン、ミネラル、着香料、着色料、甘味料、調味料、安定剤、防腐剤のような食品に通常配合される原料又は素材と組み合わせることができる。
医薬品や医薬部外品の場合には、主剤、基材、界面活性剤、起泡剤、湿潤剤、増粘剤、透明剤、着香料、着色料、安定剤、防腐剤、殺菌剤等に組み合わせ、常法に基づいて、液状、軟膏状又はスプレー噴射可能な最終形態等にすることができる。

【0049】

また、本発明の新規化合物を食品に添加する場合には、該食品中に、通常は０．００１〜２０重量％添加することが好ましい。

【0050】

本発明の新規化合物を医薬用途で使用する場合、例えば、その摂取量は、所望の改善、治療又は予防効果が得られるような量であれば特に制限されず、通常、薬剤の態様、患者の年齢、性別、体質その他の条件、疾患の種類並びにその程度等に応じて適宜選択される。前記摂取量は、例えば、１日当たり約０．１ｍｇ〜１，０００ｍｇ程度とするのがよく、これを１日に１〜４回に分けて摂取することができる。

【0051】

本発明の新規化合物を医薬部外品に添加する場合には、該医薬部外品中に、通常０．００１〜３０重量％添加するのが好ましい。

【0052】

次に、本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明はかかる実施例にのみ限定されるものではない。

【実施例】

【0053】

（実施例１：ケルセチンとｐ−クマル酸との反応生成検討）
ケルセチン二水和物（東京化成工業（株）製）１００ｍｇ、ｐ−クマル酸（和光純薬工業（株）製）１００ｍｇをエタノール２ｍＬに溶解し、これに（１）ミネラルウォーター（商品名「ゲロルシュタイナー」サッポロ飲料（株）製）２ｍＬ又は（２）リン酸三マグネシウム八水和物（和光純薬工業（株）製、ミネラルプレミックスの主成分）１００ｍｇ、水２ｍＬを加えて、ケルセチン、ｐ−クマル酸含有溶液（ｐＨ：（１）４．９、（２）５．５）を２種類調製した。このケルセチン、ｐ−クマル酸含有溶液をオートクレーブ（三洋電機（株）製、「ＳＡＮＹＯ ＬＡＢＯ ＡＵＴＯＣＬＡＶＥ」）にて１３０℃、６０分間加熱した。得られた反応溶液からそれぞれ１ｍＬを取り出して、メタノールにて５０ｍＬにメスアップし、このうちの１０μＬをＨＰＬＣにより分析した。

【0054】

ＨＰＬＣ分析は以下条件にて行った。
カラム：逆相用カラム「Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ（登録商標）Ｃ−３０−ＵＧ−５」（４．６ｍｍｉ．ｄ．×２５０ｍｍ）
移動相：Ａ・・・Ｈ₂Ｏ（０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ））， Ｂ・・・アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
注入：１０μＬ
検出：２５４ｎｍ
勾配（容量％）：１００％Ａ／０％Ｂから０％Ａ／１００％Ｂまで３３分間、１００％Ｂで７分間（全て直線）

【0055】

得られたクロマトグラムを図１に示す。上から、反応前、（１）、（２）の反応溶液のクロマトグラムをそれぞれ示している。反応後の（１）、（２）の反応溶液中から、ケルセチンやｐ−クマル酸以外のピークが検出され、複数の化合物が生成されていることが確認された。
反応前後で生成量に顕著な差があったのが、後述する新規化合物であるＡ、Ｂのピークである。

【0056】

（実施例２：ケルセチンとｐ−クマル酸との反応生成物の大量生成）
ケルセチン二水和物１ｇ、クマル酸１ｇをエタノール２０ｍＬに溶解し、ミネラルウォーター２０ｍＬを加えて、ケルセチン、ｐ−クマル酸含有溶液（ｐＨ＝４．９）を得た。このケルセチン、ｐ−クマル酸含有溶液をオートクレーブにて１３０℃、１８０分間加熱した。得られた反応溶液のうち１ｍＬをメタノールにて５０ｍＬにメスアップし、実施例１と同様にＨＰＬＣにより分析したところ、実施例１と同様のクロマトグラムが確認できた。

【0057】

（実施例３：新規化合物の単離・構造決定）
実施例２で得られた反応生成物のうち、図１のＡ、Ｂで示したピークに含まれる化合物を分取ＨＰＬＣにより単離し、常法により乾燥したところ、Ａのピークからは黄色粉末状の物質２１５ｍｇ、Ｂのピークからは黄色粉末状の物質８１．３ｍｇを得て、Ａのピークから得た物質をＵＨＡ７０４７、Ｂのピークから得た物質をＵＨＡ７０４８と命名した。

【0058】

次いで、前記ＵＨＡ７０４７及びＵＨＡ７０４８の分子量を高分解能Ｎｅｇａｔｉｖｅ−ＦＡＢ−ＭＳ（Ｆａｓｔ Ａｔｏｍ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ−Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）にて測定したところ、測定値はそれぞれ４２１．３７５５及び５４１．５２５６であり、理論値との比較から、以下の分子式を得た。
理論値Ｃ２３Ｈ１７Ｏ８（Ｍ−Ｈ^-）：４２１．３７６３
分子式Ｃ₂₃Ｈ₁₈Ｏ₈
理論値Ｃ３１Ｈ２５Ｏ９（Ｍ−Ｈ^-）：５４１．５２４８
分子式Ｃ₃₁Ｈ₂₆Ｏ₉

【0059】

次に、前記ＵＨＡ７０４７を核磁気共鳴（ＮＭＲ）測定に供し、¹Ｈ−ＮＭＲ、¹³Ｃ−ＮＭＲ及び各種２次元ＮＭＲデータの解析から、前記ＵＨＡ７０４７が前記式（１）で表される構造を有する新規化合物であることを確認した。したがって、前記式（１）で表される新規化合物は本発明の方法で効率的に生成できることが示された。

【0060】

なお、前記ＮＭＲ測定値については、ＵＨＡ７０４７を

【0061】

【化5】

【0062】

として、その¹Ｈ核磁気共鳴スペクトル、¹³Ｃ核磁気共鳴スペクトルを表１に示す。
値はδ、ｐｐｍで、溶媒はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ−ｄ₆）で測定した。

【0063】

【表1】

【0064】

次に、前記ＵＨＡ７０４８を核磁気共鳴（ＮＭＲ）測定に供し、¹Ｈ−ＮＭＲ、¹³Ｃ−ＮＭＲ及び各種２次元ＮＭＲデータの解析から、前記ＵＨＡ７０４８が前記式（２）で表される構造を有する新規化合物であることを確認した。したがって、前記式（２）で表される新規化合物は本発明の方法で効率的に生成できることが示された。

【0065】

なお、前記ＮＭＲ測定値については、ＵＨＡ７０４８を

【0066】

【化6】

【0067】

として、その¹Ｈ核磁気共鳴スペクトル、¹³Ｃ核磁気共鳴スペクトルを表２に示す。
値はδ、ｐｐｍで、溶媒はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ−ｄ₆）で測定した。

【0068】

【表2】

【0069】

また、ＵＨＡ７０４７、ＵＨＡ７０４８の物理化学的性状は、以下のようになった。
（性状）
黄色粉末
（溶解性）
水：難溶
メタノール：溶解
エタノール：溶解
ＤＭＳＯ：溶解
クロロホルム：溶解
酢酸エチル：溶解

【0070】

（実施例４：ＵＨＡ７０４７、ＵＨＡ７０４８のヒト骨髄球性白血病細胞に対する抗癌作用）
次に癌細胞に対する実施例３で得られたＵＨＡ７０４７、ＵＨＡ７０４８の効果を見るため、ＨＬ−６０細胞（Ｈｕｍａｎ ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ ｌｅｏｋｅｍｉａ ｃｅｌｌｓ：ヒト骨髄球性白血病細胞）を用いた癌細胞増殖抑制作用について試験した。

【0071】

ＨＬ−６０細胞の培養には、４ｍＭグルタミン（Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ シグマアルドリッチジャパン社製）、１％アンチバイオティック−アンチマイコティック（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ、ギブコ（ＧＩＢＣＯ）社製）、１０％ウシ胎児血清（Ｆｏｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）を含む高栄養培地「ＲＰＭＩ−１６４０」（シグマアルドリッチジャパン社製）を使用した。試験には細胞培養用９６ウェルプレート（コーニングジャパン（株）製）を用い、５×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように細胞数を調整したＨＬ−６０細胞を１ウェルあたり１００μＬずつ播種して試験に使用した。

【0072】

試料は、実施例３で得られたＵＨＡ７０４７、ＵＨＡ７０４８、原料のケルセチン、ｐ−クマル酸の４種類を用いた。試料調製は、各々の化合物をジメチルスルホキシド（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ：ＤＭＳＯ、和光純薬工業（株）製）にて溶解し、ＨＬ−６０細胞培養液中の最終濃度がそれぞれ６．３μＭ、１２．５μＭ、２５μＭ、５０μＭ及び1００μＭとなるように添加して、３７℃、５％ＣＯ₂の培養条件下で試験を開始した。なお、溶媒であるＤＭＳＯのみを同量添加したものをネガティブコントロールとした。

【0073】

生存細胞数の定量は「Ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ−８」（（株）同人化学研究所製）を用いたＭＴＴ法にて行った。つまり、試験開始より２４時間後、各ウェルにＣｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ−８溶液を１０μＬ添加し、よく攪拌した。３７℃、５％ＣＯ₂条件下で１時間の遮光反応を行った。その後にプレートリーダー（「ＭＵＬＴＩＳＫＡＮ ＦＣ」、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）を用いて測定波長４５０ｎｍの吸光度測定を行い、得られたデータをもとに細胞生存率を算出した。細胞生存率とは、溶媒であるＤＭＳＯのみを添加した培養液の生存細胞数を１００％とし、各化合物の濃度下における細胞の生存細胞数を相対値として算出した値である。各化合物濃度と細胞生存率の関係から、細胞増殖を５０％抑制する濃度ＩＣ₅₀（５０％阻害濃度）を算出した。その結果を表３に示す。
表３に示す結果から、ＵＨＡ７０４７、ＵＨＡ７０４８に優れた癌細胞増殖抑制能が認められた。この抗癌作用は、ケルセチンよりも高く、ｐ−クマル酸よりも高い抗癌活性を示した。したがってケルセチンとｐ−クマル酸を前記式（１）又は（２）で表される新規化合物に変換する高い有意性が示された。

【0074】

【表3】

【0075】

（実施例５：ＵＨＡ７０４７、ＵＨＡ７０４８のヒト口腔癌細胞に対する抗癌作用）
次に口腔癌細胞に対するＵＨＡ７０４７、ＵＨＡ７０４８の効果を見るため、ＳＣＣ−４細胞（ヒト舌扁平上皮癌細胞、ＡＴＣＣ社製）を用いた口腔癌細胞増殖抑制作用について試験した。

【0076】

ＳＣＣ−４細胞の培養には、４００ｎｇ／ｍＬヒドロコルチソン（Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ、シグマアルドリッチジャパン社製）、１％アンチバイオティック−アンチマイコティック（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ、ギブコ（ＧＩＢＣＯ）社製）、１０％ＦＢＳ（ＡＴＣＣ社製）を含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２（１：１）培地（ギブコ社製）を使用した。試験には細胞培養用９６ウェルプレート（コーニングジャパン（株）製）を用い、５×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように細胞数を調整したＳＣＣ−４細胞を１ウェルあたり１００μＬずつ播種した。これを３７℃、５％ＣＯ₂条件下で２４時間培養し、８０％コンフルエント以上の状態で試験に使用した。

【0077】

試料は、実施例３で得られたＵＨＡ７０４７、ＵＨＡ７０４８、ケルセチン及びｐ−クマル酸の４種類を用いた。試料調製は、各々の化合物をＤＭＳＯにて溶解し、０．６３ｍＭ、１．２５ｍＭ、２．５ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭとなるように調製した。これをＳＣＣ−４細胞培養液中の最終濃度がそれぞれ６．３μＭ、１２．５μＭ、２５μＭ、５０μＭ、及び１００μＭとなるように添加して３７℃、５％ＣＯ₂培養条件下で試験を開始した。なお溶媒であるＤＭＳＯのみを同量添加したものをネガティブコントロールとした。

【0078】

生存細胞数の定量は、実施例４と同様に、「Ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ−８」を用いたＭＴＴ法にて行った。つまり、試験開始より４８時間後、各ウェルにＣｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ−８溶液を１０μＬ添加して、よく攪拌した。３７℃、５％ＣＯ₂条件下で２０分間の遮光反応後にプレートリーダーを用いて測定波長４５０ｎｍの吸光度測定を行い、得られたデータをもとに細胞生存率を算出した。各化合物濃度と細胞生存率の関係から、細胞増殖を５０％抑制する濃度ＩＣ₅₀を算出した。その結果を表４に示す。
表４に示す結果から、ＵＨＡ７０４７、ＵＨＡ７０４８に優れた口腔癌細胞増殖抑制能が認められた。この抗癌作用は、ケルセチン及びｐ−クマル酸には全く認められなかった。したがってケルセチンとｐ−クマル酸を前記式（１）又は（２）で表される新規化合物に変換する高い有意性が示された。

【0079】

【表4】

【0080】

（実施例６：加熱温度によるＵＨＡ７０４７、ＵＨＡ７０４８の生成量の違い）
ケルセチン二水和物１００ｍｇ、p−クマル酸１００ｍｇ、エタノール２ｍＬ、ミネラルウォーター２ｍＬの混合溶液（ｐＨ＝４．９）を、オートクレーブにて７０℃、９０℃、１１０℃、１３０℃の各温度条件で２０分間加熱した。それぞれの温度条件で得られた反応後組成物１ｍＬをメタノールにて５０ｍＬにメスアップし、実施例１と同様にＨＰＬＣにより分析した。

【0081】

その結果、１１０℃以上でＵＨＡ７０４７、ＵＨＡ７０４８の生成は確認できた。ケルセチンおよびp−クマル酸の合計量からのＵＨＡ７０４７の生成比率（重量％）は、７０℃、９０℃が非生成、１１０℃が極微量、１３０℃が１０．３％、ＵＨＡ７０４８の生成比率（重量％）は、７０℃、９０℃が非生成、１１０℃が極微量、１３０℃が４％、となり、１３０℃での加熱により最も多くのＵＨＡ７０４７、ＵＨＡ７０４８が生成していた。

【0082】

（実施例７：ＵＨＡ７０４７、ＵＨＡ７０４８含有エキスの調製）
ケルセチン１ｇ（メディエンス（株））、プロポリス（アピ（株）、p−クマル酸含有素材）１０ｇ、エタノール１０ｍＬ、ミネラルウォーター１０ｍＬを加えて調製した混合溶液（ｐＨ＝３．５）を、オートクレーブにて１３０℃、１８０分間加熱した。得られた反応溶液を減圧加熱させて乾固し、ＵＨＡ７０４７、ＵＨＡ７０４８含有エキスを１１ｇ得た。得られたＵＨＡ７０４７、ＵＨＡ７０４８含有エキス１１ｇ中には、実施例３と同様の手法で確認したところＵＨＡ７０４７が０．００１５ｇ、ＵＨＡ７０４８が０．０００３ｇ含有されていた。必要に応じてこの作業を繰り返した。

【0083】

（実施例８：ＵＨＡ７０４７、ＵＨＡ７０４８を含有する食品）
実施例７で得たＵＨＡ７０４７、ＵＨＡ７０４８含有エキス１１ｇをあらかじめ１００ｍＬのエタノールに溶解させ、これに砂糖５００ｇ、水飴４００ｇを混合溶解し、生クリーム１００ｇ、バター２０ｇ、練乳７０ｇ、乳化剤１．０ｇを混合した後、真空釜にて−５５０ｍｍＨｇ減圧させ、１１５℃の条件下で濃縮し、水分値３．０重量％のミルクハードキャンディを得た。

【0084】

（実施例９：ＵＨＡ７０４７、７０４８を含有する医薬品）
実施例２，３と同様の方法で得たＵＨＡ７０４７をエタノールに溶解し、これを微結晶セルロースに添加して吸着させた後に、減圧乾燥させた。この吸着物を用いて常法に従い、打錠品を得た。処方は、ＵＨＡ７０４７を１０重量部、コーンスターチ２３重量部、乳糖１２重量部、カルボキシメチルセルロース８重量部、微結晶セルロース３２重量部、ポリビニルピロリドン４重量部、ステアリン酸マグネシウム３重量部、タルク８重量部の通りである。本打錠品は、癌の治癒を目的とする医薬品として有効に利用できる。
また、ＵＨＡ７０４７のかわりに実施例２，３と同様の方法で得たＵＨＡ７０４８を用いた以外は上記と同様の方法を用いて、ＵＨＡ７０４８を含有する医薬品を得た。

【0085】

（実施例１０：ＵＨＡ７０４７、ＵＨＡ７０４８を含有する医薬部外品）
実施例２、３の方法で得たＵＨＡ７０４７ １．２ｇを１０ｍＬのエタノールに溶解し、これにタウリン２０ｇ、ビタミンＢ１硝酸塩０．１２ｇ、安息香酸ナトリウム０．６ｇ、クエン酸４ｇ、砂糖６０ｇ、ポリビニルピロリドン１０ｇを溶解させた精製水を混合し、さらに精製水で１０００ｍＬにメスアップした。なお、ｐＨは、希塩酸を用いて３．２に調整した。得られた溶液１０００ｍＬのうち５０ｍＬをガラス瓶に充填し、８０℃で３０分間滅菌して、医薬部外品であるドリンク剤を完成させた。本ドリンク剤は、栄養補給の目的に加えて、癌患者における癌の拡散のリスクを低減したり、癌の発症のリスクを低減したり、癌の予防を目的とする医薬部外品として有効に利用できる。
また、ＵＨＡ７０４７のかわりに実施例２，３と同様の方法で得たＵＨＡ７０４８を用いた以外は上記と同様の方法を用いて、ＵＨＡ７０４８を含有する医薬部外品を得た。

【図1】