特許 6133275 有用な特徴を有する植物および関連する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6133275

(24)【登録日】2017年4月28日

(45)【発行日】2017年5月24日

(54)【発明の名称】有用な特徴を有する植物および関連する方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20170515BHJP

   A01H 1/00 20060101ALI20170515BHJP

   A01H 5/00 20060101ALI20170515BHJP

   A01H 5/10 20060101ALI20170515BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   A01H1/00 A

   A01H5/00 A

   A01H5/10

【請求項の数】14

【全頁数】65

(21)【出願番号】特願2014-509380(P2014-509380)

(86)(22)【出願日】2012年5月2日

(65)【公表番号】特表2014-517687(P2014-517687A)

(43)【公表日】2014年7月24日

(86)【国際出願番号】US2012036082

(87)【国際公開番号】WO2012151254

(87)【国際公開日】20121108

【審査請求日】2015年5月1日

(31)【優先権主張番号】61/540,236

(32)【優先日】2011年9月28日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/481,519

(32)【優先日】2011年5月2日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】513278954

【氏名又は名称】ボード・オブ・リージェンツ・オブ・ザ・ユニヴァーシティ・オブ・ネブラスカ

【氏名又は名称原語表記】ＢＯＡＲＤ ＯＦ ＲＥＧＥＮＴＳ ＯＦ ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＮＥＢＲＡＳＫＡ

(74)【代理人】

【識別番号】100114890

【弁理士】

【氏名又は名称】アインゼル・フェリックス＝ラインハルト

(74)【代理人】

【識別番号】100182545

【弁理士】

【氏名又は名称】神谷 雪恵

(74)【代理人】

【識別番号】100099483

【弁理士】

【氏名又は名称】久野 琢也

(72)【発明者】

【氏名】サリー アン マッケンジー

(72)【発明者】

【氏名】ロベルト デ ラ ロサ サンタマリア

【審査官】 北村 悠美子

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２００６／０２４８６１３（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 Proc. Natl. Acad. Sci. USA，２００７年，Vol.104, No.6，p.1766-1770

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ａ０１Ｈ １／００−５／１２

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

改善された収穫高を示す植物を産生するための方法であって：
ａ．親植物または植物細胞において１つ以上のＭＳＨ１遺伝子の発現を抑制して第１親植物を得るステップであって、上記ＭＳＨ１遺伝子の発現を、ＭＳＨ１遺伝子の発現を抑制することができるトランス遺伝子により抑制するか、あるいは内因性ＭＳＨ１遺伝子の突然変異により抑制するステップ；
ｂ．ＭＳＨ１機能が回復されたステップ（ａ）の第１親植物の子孫植物を回収するステップであって、トランス遺伝子についてヘテロ接合性である第１親植物を自家受粉するか、あるいは第１親植物をＭＳＨ１遺伝子発現が抑制されていない第２親植物と交配させるステップ;
および、
ｃ．ＭＳＨ１遺伝子の発現の抑制を受けていないがそれ以外では第１親植物または植物細胞と同質遺伝的であった植物と比較して改善された収穫高を示す子孫植物系を選択するステップであって、前記改善された収穫高が、前記子孫植物の細胞の核中の、染色体ＤＮＡのメチル化により改変された１つ以上の染色体座と関連し、遺伝性かつ可逆的であるステップ；
を含む、方法。

【請求項2】

前記トランス遺伝子が、阻害的低分子ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、共抑制センスＲＮＡ、および／またはアンチセンスＲＮＡを産生することによってＭＳＨ１の発現を抑制するトランス遺伝子の群から選択される、請求項１記載の方法。

【請求項3】

前記植物が作物である、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記作物が、トウモロコシ、ダイズ、綿、キャノーラ、小麦、米、トマト、タバコ、キビ、ジャガイモおよびソルガムからなる群から選択される、請求項３記載の方法。

【請求項5】

前記作物がソルガムである、請求項４記載の方法。

【請求項6】

前記改善された収穫高が、穂の長さ、穂の質量、乾燥バイオマス、湿潤バイオマス、１００種子質量、収穫指数、種子質量および／またはそれらの組み合わせを測定することにより特定される、請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。

【請求項7】

請求項１から６までのいずれか１項に記載の方法によって産生される植物であって、前記植物が、ＭＳＨ１遺伝子発現の抑制を受けていないがそれ以外は前記第１親植物または植物細胞に対して同質遺伝的であった親植物と比較して収穫高の改善を示し、かつ前記植物が収穫高の改善と関連する染色体ＤＮＡのメチル化により改変した染色体座を含む、前記植物。

【請求項8】

前記植物が近交系である、請求項７記載の植物。

【請求項9】

請求項７記載の植物から得られる種子であって、該種子またはそれから得られる植物が、ＭＳＨ１遺伝子の発現の抑制を受けていないがそれ以外は前記第１親植物または植物細胞に対して同質遺伝的であった親植物と比較して収穫高の改善を示し、かつ前記種子が前記収穫高の改善と関連する染色体ＤＮＡのメチル化により改変した染色体座を含む、前記種子。

【請求項10】

ＭＳＨ１遺伝子の発現の抑制によって誘導され、かつ収穫高の改善と関連した、子孫植物の細胞の核中の１以上の染色体座の１以上の改変を含む検出可能な量のメチル化された染色体ＤＮＡを含む、請求項７記載の植物から、またはそれ由来の種子からの加工産物。

【請求項11】

前記産物が、粗挽き粉、リント、外皮、または圧搾ケーキである、請求項１０記載の加工産物。

【請求項12】

多くの種子を産生する方法であって、請求項７記載の植物の個体群を自家受粉させるステップ、およびそれから種子を収穫するステップを含み、収穫された種子またはそれから得られた植物が、ＭＳＨ１遺伝子の発現の抑制を受けていないがそれ以外は前記第１親植物または植物細胞に対して同質遺伝的であった親植物と比較して収穫高の改善を示す、前記方法。

【請求項13】

改善された収穫高を付与することができる植物における１以上の改変された染色体座を同定するための方法であって：
ａ）前記改善された収穫高を示さない参照植物における１以上の染色体領域を、前記改善された収穫高を示す試験植物における１以上の対応する染色体領域と比較するステップであって、前記試験植物がＭＳＨ１を発現し、かつＭＳＨ１が抑制された親植物または植物細胞から、ＭＳＨ１遺伝子発現を抑制することができるトランス遺伝子についてヘテロ接合性である第１親植物を自家受粉するか、あるいはＭＳＨ１遺伝子発現を抑制することができるトランス遺伝子または内因性のＭＳＨ１遺伝子における突然変異を有する第２親植物を、ＭＳＨ１遺伝子発現が抑制されていない第３親植物と交配させることによって、ＭＳＨ１機能が回復した子孫植物を回収することにより得られるステップ；および、
ｂ）前記参照植物中に存在せず、ＭＳＨ１遺伝子の発現の抑制を受けていないがそれ以外は前記第１親植物または第２親植物に対して同質遺伝的であった植物と比較して収穫高の改善と関連する前記試験植物中に存在する１以上の染色体ＤＮＡのメチル化により改変された染色体座について選択するステップであって、前記改変された染色体座が前記試験植物細胞の核中にあるステップ
を含む、前記方法。

【請求項14】

前記選択が、前記改変された染色体座を含む植物もしくは子孫植物を単離すること、または前記改変された染色体座と関連する核酸を得ることを含む、請求項１３記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年９月２８日に出願され、その開示内容全体が参考として本明細書で援用される米国特許仮出願第６１／５４０２３６号の米国特許法第３５部門１１９条（ｅ）の下での利益、および２０１１年５月２日に出願され、その開示内容全体が参考として本明細書で援用される米国特許仮出願第６１／４８１５１９号の米国特許法第３５部門１１９条（ｅ）の下での利益を主張する。

【0002】

配列表の編入
サイズが７５，９３８バイト（オペレーティングシステムＭＳウインドウズで測定）であり、２０１２年５月１日に作製された、「４６５８９＿１０３２８９＿ＳＥＱ＿ＬＳＴ．ｔｘｔ」という名称のファイルに含まれる配列表は、本明細書と同時期に電子申請（米国特許商標局ＥＦＳ−Ｗｅｂファイリングシステムを使用）によって提出され、その開示内容全体が参考として本明細書で援用される。

【0003】

連邦政府支援の研究または開発に関する記述
本発明は、エネルギー省（ＤＥ−ＦＧ０２−０７ＥＲ１５５６４およびＤＥ−ＦＧ０２−１０ＥＲ１６１８９）および全米科学財団（ＩＯＳ０８２０６６８およびＩＯＳ１１２６９３５）からの交付金を受けて政府支援で行われた。政府は本発明に対して一定の権利を有する。

【0004】

発明の背景
ＭＳＨ１遺伝子は、陸生植物の遺伝子構造において少なくとも２つの重大な変化を受けたＭｕｔＳホモログを表す（Ａｂｄｅｌｎｏｏｒ ｅｔ ａｌ． ２００３）。ＭｕｔＳは、ミスマッチ修復および相同的組換えの抑制に関与する原核細胞遺伝子である。直接的タンパク質−ＤＮＡ相互作用のモデルと一致して、ＭＳＨ１は、ＤＮＡ結合ドメイン（ドメインＩ）およびＡＴＰａｓｅドメイン（ドメインＶ）をコード化するだけでなく、その発生の初期に遺伝子融合を受けて、カルボキシ末端ＧＩＹ−ＹＩＧ型エンドヌクレアーゼドメイン（ドメインＶＩ）を獲得した（Ａｂｄｅｌｎｏｏｒ ｅｔ ａｌ． ２００６）。タンパク質はさらに、ドメインＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶも獲得し、全ての陸生植物間でよく保存されているようである。遺伝子構造のこの複雑さは、ＭＳＨ１が植物において新規機能を獲得したことを示唆する。多くのＭｕｔＳホモログは真核系で特徴づけられるが、ＭＳＨ１の異常な特性を示すことが判明している陸生植物外の遺伝子はない。

【0005】

ＭＳＨ１機能は、ＭＳＨ１ヌル（ＥＭＳおよびＴ−ＤＮＡ挿入）突然変異体（すなわち、ｍｓｈ１突然変異体）を有するシロイヌナズナにおいて、そしてＭＳＨ１ ＲＮＡｉ抑制により他の植物種において、研究されてきた（Ｓａｎｄｈｕ ｅｔ ａｌ． ２００７；Ｘｕ ｅｔ ａｌ． ２０１１）。これらの研究から、葉の斑入り、細胞質雄性不稔（ＣＭＳ）、低成長速度表現型、遅延または隠花性表現型、および病原体に対する高い感受性をはじめとする、ＲＮＡｉ抑制の表現型の結果が種間でかなり類似していることが明らかになる。熱（Ｓｈｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ． ２０１０）、ハイライトストレス（Ｘｕ ｅｔ ａｌ． ２０１１）および他の環境ストレス条件（Ｈｒｕｚ ｅｔ ａｌ． ２００８）にさらされると、ＭＳＨ１転写産物レベルが著しく低下する。

【0006】

初期のＭＳＨ１調査は、植物ミトコンドリアゲノム安定性に対するその直接的影響を示唆した。シロイヌナズナにおけるヌルｍｓｈ１突然変異体は、４７のミトコンドリア繰り返し体で数世代にわたって重大なゲノム再編成を作成する増強された組換え活性を示す。ＭＳＨ１破壊のゲノム的結果は、準化学量論的移動（ＳＳＳ）の過程である（Ａｒｒｉｅｔａ−Ｍｏｎｔｉｅｌ ｅｔ ａｌ． ２００９）。ＳＳＳ活性は、ミトコンドリアゲノムの一部の相対的コピー数において劇的変化をもたらし、影響を受けたサブゲノム上に存在する遺伝子の選択的増幅または抑制を引き起こす。これらのゲノム変化に対する表現型の結果がある；ＳＳＳ過程は、細胞質雄性不稔の発現に関与し（Ｓａｎｄｈｕ ｅｔ ａｌ． ２００７）、また自然個体群における受精率への自然復帰に関与する（Ｊａｎｓｋａ ｅｔ ａｌ． １９９８； Ｂｅｌｌａｏｕｉ ｅｔ ａｌ． １９９８； Ｄａｖｉｌａ ｅｔ ａｌ． ２０１１； Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ， ２０１１）。実際、ＭＳＨ１は植物における繁殖戦略として雌性雄性異株の進化に関与する可能性がある（ＭｃＣａｕｌｅｙ ａｎｄ Ｏｌｓｏｎ， ２００８）。

【0007】

そのＭｕｔＳホモログとしてのクローニングおよび同定の前に、ＭＳＨ１遺伝子は最初にＧ． Ｒｅｄｅｉによってクロロプラストミューテーター（ＣＨＭ）と命名された。なぜなら、その突然変異は、クロロプラスト機能障害から誘導されるらしい斑入りおよび成長の改変をもたらしたからである（Ｒｅｄｅｉ １９７３）。実際、ＭＳＨ１は二重標的化タンパク質をコード化する。ＭＳＨ１−ＧＦＰトランス遺伝子融合タンパク質は、ミトコンドリアおよびプラスチド核様体の両方に局部集中する（Ｘｕ ｅｔ ａｌ． ２０１１）。核様体は、オルガネラゲノムを覆う小さな高密度のタンパク質−ＲＮＡ−ＤＮＡ複合体である。しかしながら、組換えが一般的なミトコンドリアと異なり、増強されたクロロプラスト繰り返し体媒介性組換えの証拠がｍｓｈ１突然変異体では観察されない。ＭＳＨ１破壊がプラスチドゲノムの複製特性に影響を及ぼす可能性がある。

【0008】

要約すれば、前述の参考文献において開示されたＭＳＨ１抑制の効果は、植物ミトコンドリアおよびプラスチドに対する効果に限定される。

【0009】

植物および動物の両方における環境センシングと後成的変化との関連を裏付ける証拠がある（Ｂｏｎａｓｉｏ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３０， ６１２， ２０１０）。これらの変化の継代遺伝性は依然として活発な調査の主題である（Ｙｏｕｎｇｓｏｎ ｅｔ ａｌ． Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｏｍ． Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔ． ９， ２３３，２００８）。以前の研究は、改変されたメチル化パターンが数世代にわたって高遺伝性であり、変異の定量分析に組み入れることができることを示した（Ｖａｕｇｈｎ ｅｔ ａｌ． ２００７； Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２００８； Ｊｏｈａｎｎｅｓ ｅｔ ａｌ． ２００９）。シロイヌナズナにおけるメチル化変化の以前の研究は、エピゲノムの循環選抜に対する従順さを示唆し、さらに新規かつ安定な後成的状態を確立することが実行可能であることも示唆する（Ｆ． Ｊｏｈａｎｎｅｓ ｅｔ ａｌ． ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ． ５， ｅ１０００５３０（２００９）；Ｆ． Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １８８， １０１５（２０１１）。シロイヌナズナｍｅｔ１およびｄｄｍｔ突然変異体の操作は、新規メチル化パターニングおよびエピ対立遺伝子の分離の両遺伝性を示すエピ−ＲＩＬ個体群の作成を可能にし、植物適応におけるエピゲノム変異の起こりうる影響を強調する（Ｆ． Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １８８， １０１５（２０１１））。自然個体群において、シロイヌナズナで検出されるエピ対立遺伝子の変異の大部分は、ゲノムの遺伝子リッチな領域内のＣｐＧメチル化として見出される（Ｃ． Ｂｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ４８０， ２４５（２０１１）， Ｒ．Ｊ． Ｓｃｈｍｉｔｚ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３４， ３６９（２０１１）。

【0010】

発明の概要
有用な特徴を示す植物を産生するための方法、有用な特徴を付与することができる植物における１以上の改変された染色体座を同定するための方法、有用な特徴を付与することができる修飾された染色体座を含む植物、有用な特徴を示す植物、細胞、葉、茎、花および種子を含むそれらの植物の部分を得るための方法、植物および植物の部分、ならびに飼料または粗びき粉などの加工産物をはじめとするそれらの植物および植物の部分の産物を使用する方法が、本明細書中で提供される。

【0011】

ある実施形態において、有用な特徴を示す植物を産生するための方法であって：ａ）第１親植物または植物細胞におけるＭＳＨ１遺伝子（複数可）の発現を抑制するステップ；ｂ）ステップ（ａ）の親植物、ステップ（ａ）の親植物の子孫、ステップ（ａ）の植物細胞から得られる植物、またはステップ（ａ）の植物細胞から得られる植物の子孫を、ＭＳＨ１が抑制されていない第２の植物と異系交配するステップ；ｃ）ステップ（ｂ）の異系交配から得られる子孫植物の個体群を少なくとも１つの有用な特徴についてスクリーニングするステップであって、子孫植物の個体群の一部がＭＳＨ１を発現するステップ；および、ｄ）ＭＳＨ１を発現する特徴を含む子孫植物を選択するステップであって、特徴が遺伝性かつ可逆的であるステップを含む方法が提供される。方法のある実施形態において、特徴は１以上の改変された染色体座と関連する。ある実施形態において、そのような改変された染色体座は、メチル化されている座を含み得る。ある実施形態において、有用な特徴を示す植物を産生するための方法であって：ａ）第１親植物または植物細胞におけるＭＳＨ１遺伝子（複数可）の発現を抑制するステップ；ｂ）ステップ（ａ）の親植物、ステップ（ａ）の親植物の子孫、ステップ（ａ）の植物細胞から得られる植物、またはステップ（ａ）の植物細胞から得られる植物の子孫を、ＭＳＨ１が抑制されていない第２の植物と異系交配するステップ；ｃ）ステップ（ｂ）の異系交配から得られる子孫植物の個体群を、少なくとも１つの有用な特徴についてスクリーニングするステップであって、子孫植物の個体群の一部がＭＳＨ１を発現するステップ；および、ｄ）ＭＳＨ１を発現する特徴を含む子孫植物を選択するステップであって、その特徴が１以上の突然変異した染色体座と関連するステップを含む方法が提供される。ある実施形態において、突然変異した染色体座は、ヌクレオチド反転、挿入、欠失、置換、またはそれらの組み合わせを含む。ある実施形態において、染色体は可逆的である突然変異を含む。ある実施形態において、染色体座は不可逆的である突然変異を含む。前記方法のいずれかのある実施形態において、方法は：ｉ）ステップ（ｄ）の自家受粉させた子孫植物、ｉｉ）ステップ（ｄ）の異系交配させた子孫植物、または、ｉｉｉ）ステップ（ｄ）の自家受粉させた子孫植物および異系交配させた子孫植物の両方から種子を産生するステップをさらに含む。ある実施形態において、方法は、特徴の存在について、種子または種子から成長させた植物を分析するステップをさらに含み得る。前記方法のいずれかのある実施形態において、第１親植物または植物細胞は、ＭＳＨ１の発現を抑制することができるトランス遺伝子を含む。方法のある実施形態において、トランス遺伝子は、阻害的低分子ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、共抑制センスＲＮＡ、および／またはアンチセンスＲＮＡを産生することによって、ＭＳＨ１の発現を抑制するトランス遺伝子の群から選択される。前記方法のいずれかのある実施形態において、第１親植物または植物細胞は、雌性植物と異なる雄性植物とを交配することによって得られ、この場合、雌性または雄性植物の少なくとも一方は、親植物の内因性ＭＳＨ１遺伝子の発現を抑制するトランス遺伝子を含み、植物はトランス遺伝子の導入前に同質遺伝的近交系であった。前記方法のいずれかのある実施形態において、第１親植物または植物細胞は、第１親植物または植物細胞におけるＭＳＨ１の抑制の前に第２の親植物と同質遺伝的であった。前記方法のいずれかのある実施形態において、特徴は、収穫高、雄性不稔、隠花性，生物ストレスに対する耐性、および非生物的ストレスに対する耐性からなる群から選択される。ある実施形態において、非生物的ストレスは、干ばつストレス、浸透圧ストレス、窒素ストレス、リンストレス、鉱物ストレス、熱ストレス、低温ストレス、および／または光ストレスからなる群から選択することができる。ある実施形態において、非生物的ストレスに対する耐性としては、干ばつ耐性、ハイライト耐性、熱耐性、低温耐性、および塩耐性を挙げることができる。方法のある実施形態において、生物ストレスは、植物真菌性病原体、植物細菌性病原体、植物ウイルス性病原体、昆虫、線虫、および草食動物、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択することができる。前記方法のいずれかのある実施形態において、特徴は、子孫植物のミトコンドリアにおける準化学量論的移動（ＳＳＳ）に起因しない。前記方法のいずれかのある実施形態において、特徴は雄性不稔であり、子孫植物のミトコンドリアにおける準化学量論的移動（ＳＳＳ）に起因しない。前記方法のいずれかのある実施形態において、ステップ（ｄ）における子孫植物またはその子孫は、ＭＳＨ１発現の抑制を受けていないが、それ以外は第１親植物または植物細胞親植物と同質遺伝的であった植物と比較して、特徴において改善を示す。前記方法のいずれかのある実施形態において、植物は作物である。前記方法のいずれかのある実施形態において、作物は、綿、キャノーラ、小麦、大麦、亜麻、オートムギ、ライムギ、芝草、サトウキビ、アルファルファ、バナナ、ブロッコリー、キャベツ、ニンジン、キャッサバ、カリフラワー、セロリ、かんきつ類、ウリ科植物、ユーカリ、ニンニク、ブドウ、タマネギ、レタス、エンドウ豆、ピーナツ、コショウ、ジャガイモ、ポプラ、マツ、ヒマワリ、ベニバナ、ダイズ、イチゴ、サトウダイコン、サツマイモ、タバコ、キャッサバ、カリフラワー、セロリ、かんきつ類、綿、ウリ科植物、ユーカリ、ニンニク、ブドウ、タマネギ、レタス、エンドウ豆、ピーナツ、コショウ、ジャガイモ、ポプラ、マツ、ヒマワリ、ベニバナ、イチゴ、サトウダイコン、サツマイモ、タバコ、キャッサバ、カリフラワー、セロリ、かんきつ類、ウリ科植物、ユーカリ、ニンニク、ブドウ、タマネギ、レタス、エンドウ豆、ピーナツ、コショウ、ポプラ、マツ、ヒマワリ、ベニバナ、ダイズ、イチゴ、サトウダイコン、タバコ、ジャトロファ、アマナズナ、およびリュウゼツランからなる群から選択される。前記方法のいずれかのある実施形態において、作物は、トウモロコシ、ダイズ、綿、キャノーラ、小麦、米、トマト、タバコ、キビ、およびソルガムからなる群から選択される。前記方法のいずれかのある実施形態において、作物はソルガムである。前記方法のいずれかのある実施形態において、作物はソルガムであり、そして特徴は、穂の長さ、穂の質量、乾燥バイオマス、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0012】

ＭＳＨ１の抑制によって生じる染色体座における改変および／または突然変異に起因する有用な特徴を示す、植物、種子をはじめとする植物の部分、または植物もしくは種子の産物も提供される。ある実施形態において、ＭＳＨ１の抑制によって生じる染色体座における改変および／または突然変異に起因する有用な特徴を示す植物種子、またはその産物は、ＭＳＨ１発現の抑制を受けていないがそれ以外は第１親植物または植物細胞と同質遺伝的であった、植物、種子をはじめとする植物の部分、または植物もしくは種子の産物と比較して、少なくとも１つの有用な特徴において改善を示す。ある実施形態において、ＭＳＨ１の抑制によって生じる染色体座における改変および／または突然変異に起因する有用な特徴を示す、本発明のそのような植物、種または産物は、ＭＳＨ１抑制によって誘導された１以上の染色体座における１以上の改変および／または突然変異を含み得る。ある実施形態において、前記方法のいずれかによって産生される植物または作物であって、作物が、ＭＳＨ１発現の抑制を受けていないがそれ以外は第１親植物または植物細胞と同質遺伝的であった植物と比較して、少なくとも１つの有用な特徴において改善を示すものが提供される。ある実施形態において、前述の植物または作物のいずれかは近交系であり、親植物（複数可）と比較して、少なくとも１つの有用な特徴において改善を示す。前述の植物または作物のいずれかから得られる種子も本明細書中で提供される。前述の植物、作物または種のいずれかから得られる加工産物であって、検出可能な量の染色体ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、プラスチドおよびミトコンドリアＤＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせを含むものも本明細書中で提供される。ある実施形態において、産物は、ＭＳＨ１抑制によって誘導された１以上の染色体座における１以上の改変および／または突然変異を含む検出可能な量の染色体ＤＮＡを含み得る。前述の加工産物のいずれかのある実施形態において、産物は、油、粗挽き粉、リント、外皮、または圧搾ケーキであり得る。

【0013】

本発明の前述の植物または作物のいずれかから種子を収穫することを含む、種子を産生する方法も提供される。ある実施形態において、本発明の植物または作物の個体群を自家受粉させるステップ、自家受粉させた植物を成長させるステップ、およびそれから種子を収穫するステップを含む、多くの種子を産生するための方法が提供される。ある実施形態において、収穫された種子またはそれから得られる植物は、少なくとも１つの有用な特徴において改善を示す。

【0014】

改善された特徴のいずれかを含む本発明の前述の植物または作物のいずれかの使用方法も本発明によって提供され、この方法は、改善された特徴を示す本発明の植物または作物を成長、繁殖、または栽培することを含む。本発明の前述の植物または作物のいずれかの種子を含む任意の植物の部分を収穫することを含む、改善された収穫高を得る方法も提供される。ある実施形態において、収穫された種子またはそれから得られた植物は、少なくとも１つの有用な特徴において改善を示す。

【0015】

ある実施形態において、有用な特徴を付与することができる植物中の１以上の改変された染色体座を同定するための方法が提供される。１つの実施形態において：ａ．有用な特徴を示さない参照植物中の１以上の染色体領域を、有用な特徴を示す試験植物中の１以上の対応する染色体領域と比較するステップであって、試験植物がＭＳＨ１を発現し、ＭＳＨ１が抑制されている親植物または植物細胞から得られたステップ；およびｂ．参照植物中に存在せず、有用な特徴に関連する、試験植物中に存在する１以上の改変された染色体座について選択するステップを含む方法が提供される。ある実施形態において、改変された染色体座は、染色体ＤＮＡメチル化状態、染色体座と関連するヒストンタンパク質の翻訳後修飾、またはそれらの任意の組み合わせを含む。ある実施形態において、選択は、改変された染色体座を含む植物もしくは子孫植物を単離すること、または改変された染色体座と関連する核酸を得ることを含む。ある実施形態において、参照植物および試験植物はどちらも、ＭＳＨ１が抑制された親植物または植物細胞から得られる子孫植物の個体群から得られる。ある実施形態において、参照植物および親植物または植物細胞はどちらも、親植物または植物細胞におけるＭＳＨ１の抑制前は同質遺伝的であった。ある実施形態において、有用な特徴は、収穫高、雄性不稔、隠花性、生物ストレス耐性、および非生物的ストレス耐性からなる群から選択される。ある実施形態において、非生物的ストレスは、干ばつストレス、浸透圧ストレス、窒素ストレス、リンストレス、鉱物ストレス、熱ストレス、低温ストレス、および／または光ストレスからなる群から選択することができる。ある実施形態において、非生物的ストレスに対する耐性としては、干ばつ耐性、ハイライト耐性、熱耐性、低温耐性、および塩耐性を挙げることができる。方法のある実施形態において、生物ストレス耐性は、植物真菌性病原体耐性、植物細菌性病原体耐性、植物ウイルス性病原体耐性、昆虫耐性、線虫耐性、および草食動物耐性、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択することができる。ある実施形態において、有用な特徴は、増大した耐倒伏性、増大した成長速度、増大したバイオマス、増大した分げつ、増大した分枝、遅延型開花期、および遅延型老化からなる群から選択される。前記方法のいずれかによって同定される改変された染色体座も本明細書中で提供される。そのような改変された染色体座は、染色体ＤＮＡメチル化状態、染色体座と関連したヒストンタンパク質の翻訳後修飾、またはそれらの任意の組み合わせを含む可能性がある。

【0016】

前記方法のいずれかによって同定される改変された染色体座のいずれかを含む植物も本明細書中で提供される。

【0017】

有用な特徴を示す植物を産生するための方法も本明細書中で提供される。ある実施形態において、これらの方法は：ａ．有用な特徴に関連する染色体修飾を植物に導入するステップであって、染色体修飾が、有用な特徴と関連するＭＳＨ１抑制によって誘導される改変された染色体座、有用な特徴と関連するＭＳＨ１抑制によって誘導される改変された染色体座と同じ遺伝的効果を提供するトランス遺伝子、または有用な特徴と関連するＭＳＨ１抑制によって誘導される改変された染色体座と同じ遺伝的効果を提供する染色体突然変異を含む、ステップ；および、ｂ．染色体修飾を含み、有用な特徴を示す植物について選択するステップを含む可能性がある。ある実施形態において、方法は：ｉ）ステップ（ｂ）の選択された植物の自家受粉させた子孫植物、ｉｉ）ステップ（ｂ）の選択された植物の異系交配させた子孫植物、またはｉｉｉ）ステップ（ｂ）の選択された植物の自家受粉させた子孫植物および異系交配させた子孫植物の両方から種子を産生するステップをさらに含む可能性がある。方法のある実施形態において、染色体修飾は改変された染色体座を含む可能性があり、植物は、染色体ＤＮＡメチル化状態、染色体座と関連するヒストンタンパク質の翻訳後修飾、またはそれらの任意の組み合わせについて分析することによって選択され、これは改変された染色体座と関連する。ある実施形態において、染色体修飾は、トランス遺伝子または染色体突然変異を含み、植物は、トランス遺伝子または染色体突然変異の存在について分析することによって選択される。他の実施形態において、植物は、有用な特徴の存在について分析することによって選択される。ある実施形態において、染色体修飾は改変された染色体座を含み、改変された染色体座は、染色体ＤＮＡメチル化状態、染色体座と関連したヒストンタンパク質の翻訳後修飾、またはそれらの任意の組み合わせを含む。ある実施形態において、改変された染色体座は、遺伝子の発現減少を含む遺伝的効果を有し、染色体修飾は、遺伝子の発現を減少させるトランス遺伝子または染色体突然変異を含む。改変された染色体座が遺伝子の発現減少を含む遺伝的効果を有し、染色体修飾がトランス遺伝子を含むある実施形態において、トランス遺伝子は、阻害的低分子ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、共抑制センスＲＮＡ、および／またはその遺伝子に対するアンチセンスＲＮＡを産生することによって遺伝子の発現を減少させる。ある実施形態において、改変された染色体座は、遺伝子の発現増加を含む遺伝的効果を有し、染色体修飾は、遺伝子の発現を増加させるトランス遺伝子または染色体突然変異を含む。前記方法のいずれかのある実施形態において、有用な特徴は、収穫高、雄性不稔、隠花性、生物ストレス耐性、および非生物的ストレス耐性からなる群から選択される。ある実施形態において、非生物的ストレスは、干ばつストレス、浸透圧ストレス、窒素ストレス、リンストレス、鉱物ストレス、熱ストレス、低温ストレス、および／または光ストレスからなる群から選択することができる。ある実施形態において、非生物的ストレスに対する耐性としては、干ばつ耐性、ハイライト耐性、熱耐性、低温耐性、および塩耐性を挙げることができる。方法のある実施形態において、生物ストレスは、植物真菌性病原体、植物細菌性病原体、植物ウイルス性病原体、昆虫、線虫、および草食動物、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択することができる。方法のある実施形態において、有用な特徴は、増大した耐倒伏性、増大した成長速度、増大したバイオマス、増大した分げつ、増大した分枝、遅延型開花期、および遅延型老化からなる群から選択される。前記方法のいずれかによって作成される植物も本明細書中で提供される。前記方法のいずれかのある実施形態において、植物は作物である。前記方法のいずれかのある実施形態において、作物は、綿、キャノーラ、小麦、大麦、亜麻、オートムギ、ライムギ、芝草、サトウキビ、アルファルファ、バナナ、ブロッコリー、キャベツ、ニンジン、キャッサバ、カリフラワー、セロリ、かんきつ類、ウリ科植物、ユーカリ、ニンニク、ブドウ、タマネギ、レタス、エンドウ豆、ピーナツ、コショウ、ジャガイモ、ポプラ、マツ、ヒマワリ、ベニバナ、ダイズ、イチゴ、サトウダイコン、サツマイモ、タバコ、キャッサバ、カリフラワー、セロリ、かんきつ類、綿、ウリ科植物、ユーカリ、ニンニク、ブドウ、タマネギ、レタス、エンドウ豆、ピーナツ、コショウ、ジャガイモ、ポプラ、マツ、ヒマワリ、ベニバナ、イチゴ、サトウダイコン、サツマイモ、タバコ、キャッサバ、カリフラワー、セロリ、かんきつ類、ウリ科植物、ユーカリ、ニンニク、ブドウ、タマネギ、レタス、エンドウ豆、ピーナツ、コショウ、ポプラ、マツ、ヒマワリ、ベニバナ、ダイズ、イチゴ、サトウダイコン、タバコ、ジャトロファ、アマナズナ、およびリュウゼツランからなる群から選択される。前記方法のいずれかのある実施形態において、作物は、トウモロコシ、ダイズ、綿、キャノーラ、小麦、米、トマト、タバコ、キビ、およびソルガムからなる群から選択される。前記方法のいずれかのある実施形態において、作物はソルガムである。前記方法のいずれかのある実施形態において、作物はソルガムであり、特徴は、穂の長さ、穂の質量、乾燥バイオマス、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0018】

植物、種子、葉、茎根、および花を含むがこれらに限定されない植物の部分、または植物、もしくは種子を含むがこれに限定されない植物の部分の産物であって、有用な特徴に関連する染色体修飾または有用な特徴に関連する染色体改変を含むものも本明細書中で提供される。ある実施形態において、植物の部分は、再生不可能な植物の部分または植物の部分の再生不可能な部分を含み得る。ある実施形態において、産物は、植物の部分から得られる飼料または粗挽き粉を含むが、これらに限定されない加工産物であり得る。ある実施形態において、染色体修飾に起因する有用な特徴を示す植物種子、またはその産物は、染色体修飾を含まない植物、種子をはじめとする植物の部分、または植物もしくは種子の産物と比較して、少なくとも１つの有用な特徴で改善を示す。ある実施形態において、有用な特徴を示すそのような植物、種子または産物は、有用な特徴と関連するＭＳＨ１抑制によって誘導される改変された染色体座、有用な特徴と関連するＭＳＨ１抑制によって誘導される改変された染色体座と同じ遺伝的効果を提供するトランス遺伝子、または有用な特徴と関連するＭＳＨ１抑制によって誘導される改変された染色体座と同じ遺伝的効果を提供する染色体突然変異を含む染色体修飾を含み得る。ある実施形態において、有用な特徴を示すそのような植物、植物の部分、種子または産物は、染色体ＤＮＡメチル化状態、染色体座と関連したヒストンタンパク質の翻訳後修飾、またはそれらの任意の組み合わせを含む改変された染色体座を含み得る。ある実施形態において、染色体ＤＮＡメチル化状態を含む改変された染色体座は、ＭＳＨ１抑制を受けていない植物、植物の部分、または植物産物において見いだされない改変された染色体座の特徴的な部分を含み得る。ある実施形態において、改変された染色体座の特徴的な部分は、少なくとも約２５ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、またはそれ以上のメチル化ＤＮＡ分子を含み得る。ある実施形態において、染色体変化を含まないがそれ以外は第１親植物または植物細胞と同質遺伝的であった植物と比較して、少なくとも１つの有用な特徴で改善を示す前記方法のいずれかによって産生される、植物、植物細胞、または植物産物が提供される。ある実施形態において、前述の植物のいずれも近交系であり、親植物と比較して少なくとも１つの有用な特徴で改善を示す。前述の植物、植物細胞、または作物から得られる種子も本明細書中で提供される。前述の植物、作物または種子を含むがこれに限定されない植物の部分のいずれかからの加工産物も本明細書中で提供され、産物は、改変された染色体座、有用な特徴と関連するＭＳＨ１抑制によって誘導される改変された染色体座と同じ遺伝的効果を提供するトランス遺伝子、または有用な特徴と関連するＭＳＨ１抑制によって誘導される改変された染色体座と同じ遺伝的効果を提供する染色体突然変異を含むが、これに限定されない前述の染色体修飾のいずれかを含む検出可能な量の染色体ＤＮＡを含む。前述の加工産物のいずれかのある実施形態において、産物は油、粗挽き粉、リント、外皮、または圧搾ケーキであり得る。

【0019】

種子を産生する方法であって、本発明の前述の植物または作物のいずれかから種子を収穫することを含む方法も本明細書中で提供される。ある実施形態において、多くの種子を産生するための方法であって、本発明の植物または作物の個体群を自家受粉させるステップ、自家受粉させた植物を成長させるステップ、およびそれから種子を収穫するステップを含む方法が提供される。

【0020】

改善された特徴のいずれかを含む本発明の前述の植物または作物のいずれかを使用する方法も本発明によって得られ、この方法は、改善された特徴を示す本発明の植物または作物を成長、繁殖、または栽培することを含む。改善された収穫高を得る方法であって、本発明の前述の植物または作物のいずれかの種子を含む任意の植物の部分を収穫することを含む方法も提供される。

【0021】

植物、植物の部分もしくは植物細胞を含むがこれに限定されないその部分、再生不可能な植物の部分もしくは植物細胞を含むがこれに限定されないその部分、または加工された植物産物のいずれかの任意の方法における使用も本明細書中で提供される。本明細書中で提供される植物、植物の部分もしくはそれらの部分、再生不可能な植物の部分もしくはそれらの部分、または加工された植物産物を使用することができる方法としては、育種における使用、バイオ燃料としての使用、動物飼料としての使用、ヒト用食品における使用、および任意の産業、食物、もしくは飼料製造方法における使用が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0022】

有用な特徴（複数可）を示す種子およびその種子から得られる植物であって、有用な特徴（複数可）における改善を示す植物も本明細書中で提供される。ある実施形態において、種子は、有用な特徴（複数可）と関連するか、または有用な特徴（複数可）を付与する改変された染色体座を含み得る。

【0023】

ある実施形態において、本明細書中で提供される、植物、植物の部分、再生不可能な植物の部分、植物細胞、再生不可能な植物細胞、植物産物または加工された植物産物は、有用な特徴と関連するＭＳＨ１抑制によって誘導される改変された染色体座、有用な特徴と関連するＭＳＨ１抑制によって誘導される改変された染色体座と同じ遺伝的効果を提供するトランス遺伝子、または有用な特徴と関連するＭＳＨ１抑制によって誘導される改変された染色体座と同じ遺伝的効果を提供する染色体突然変異を含む検出可能な量の染色体ＤＮＡを含み得る。ある実施形態において、染色体ＤＮＡメチル化状態を含む改変された染色体座は、ＭＳＨ１抑制を受けていない植物、植物細胞、再生不可能な植物細胞、植物の部分、再生不可能な植物の部分、植物産物、または加工された植物産物で見いだされない改変された染色体座の特徴的な部分を含み得る。ある実施形態において、改変された染色体座の特徴的な部分は、少なくとも約２５ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、５００ヌクレオチドまたはそれ以上のメチル化ＤＮＡ分子を含み得る。染色体ＤＮＡまたはその特徴的な部分を含む本明細書中で提供される加工産物としては、油、粗挽き粉、リント、外皮、または圧搾ケーキを含む産物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0024】

図面の簡単な説明
本明細書の一部に組み入れられ、本明細書の一部を形成する添付の図面は、本発明のある実施形態を説明する。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1】図１は、ＭＳＨ１抑制を受けたさまざまな植物において観察される、細胞質雄性不稔、斑入りおよび改変されたクロロプラスト発生、低下した成長速度および矮化、改変された開花期もしくは隠花性、減少したフラボノイド生合成およびアントシアニンの欠乏、増強された病原体感受性、改変された葉の形態、およびハイライト耐性などのさまざまな表現型を示す。

【図2】図２は、ＭＳＨ１抑制を受けたシロイヌナズナ（上）、トマト（中）、およびソルガム（下パネル）植物における葉斑入りを示す。

【図3】図３は、ＭＳＨ１抑制を受けたソルガム（上）およびトマト（下パネル）植物における矮化を示す。

【図4】図４は、ＭＳＨ１抑制を受けたシロイヌナズナにおけるミトコンドリアＤＮＡ再配列を示す。

【図5】図５は、ＭＳＨ１抑制を受けたトマト、タバコ、およびキビ植物で観察される活性酸素種（ＲＯＳ）の増加を示す。

【図6】図６は、ＭＳＨ１抑制を受けた結果として本明細書中で「不連続変異」（Ｖ_D）と称されるさまざまな種類の遺伝性表現型変異を示す植物を得るため、ならびに「量的変動」または「Ｖ_Q」およびさまざまな有用な特徴を示す可能性がある植物系を得るための例示的非限定的スキームを示す。

【図7】図７は、ＭＳＨ１抑制を受けなかった、それ以外は同質遺伝的な親植物（Ｃｏｌ−０）に対してバイオマスの増加を示すシロイヌナズナ植物系（ｍｓｈ１×Ｃｏｌ−０Ｆ₃）を示す。

【図8】図８は、ＭＳＨ１発現が抑制された植物の異系交配から誘導される、異なるソルガム系ＧＡＩＩ−１１（正方形）、ＧＡ１１−１５（三角形）、ＧＡＩＩ−２２（逆括弧）、ＧＡＩＩ−２４、およびＧＡＩＩ−２８（丸）で得られる草高（ｃＭ）の分布を示す。野生型参照系はｆｘＷＴ（菱形）である。

【図9】図９は、ＭＳＨ１発現が抑制された植物の異系交配から誘導される、異なるソルガム系ＧＡＩＩ−１１（正方形）、ＧＡ１１−１５（三角形）、ＧＡＩＩ−２２（逆括弧）、ＧＡＩＩ−２４、およびＧＡＩＩ−２８（丸）で得られる穂の質量（グラム）の分布を示す。野生型参照系はｆｘＷＴ（菱形）である。

【図10】図１０は、ＭＳＨ１発現が抑制された植物の異系交配から誘導される、異なるソルガム系ＧＡＩＩ−１１（正方形）、ＧＡ１１−１５（三角形）、ＧＡＩＩ−２２（逆括弧）、ＧＡＩＩ−２４、およびＧＡＩＩ−２８（丸）で得られる穀粒収量（グラム）の分布を示す。野生型参照系はｆｘＷＴ（菱形）である。

【図11】図１１のＡ〜Ｈは、シロイヌナズナおよびソルガムにおけるＭＳＨ１−エピ系の増大成長表現型を示す。ソルガムおよびシロイヌナズナエピ個体群を誘導するために使用されるトランス遺伝子および交配手順が示される。（Ａ）交配Ｔｘ４３０×ＭＳＨ１−ｄｒから誘導されるＦ１子孫の表現型。（Ｂ）屋外栽培されたエピＦ２、Ｆ３およびＦ４ソルガム系は、植物構造および高さにおいて変異を示す。（Ｃ）Ｔｘ４３０（左、６６ｇｍ、８ｍｍ茎）からの穂対エピ−Ｆ２個体（右、１１２ｇｍ、１１ｍｍ茎）からの穂。（Ｄ）Ｃで示される穂からの種子収量。（Ｅ）現地条件下でのＭＳＨ１−ｄｒソルガム表現型。（Ｆ）シロイヌナズナのエピ−Ｆ４系における増大したロゼット成長の証拠。（Ｇ）シロイヌナズナエピ−Ｆ４植物は、Ｃｏｌ−０と比較して増大した植物バイオマス、ロゼット直径および花茎直径を示す。＞６からの平均±ＳＥとして示されたデータ。（Ｈ）開花期のシロイヌナズナエピＦ４表現型。

【図12】図１２は、ソルガムＭＳＨ１−エピＦ２系における増大した表現型変異を示す。表現型分布を、２つの屋外植え付けで成長させた３つの独立したソルガムエピＦ２個体群からの草高および穀粒収量について示す。個体群平均を垂直の点線によって示す。

【図13】図１３のＡ、Ｂは、ソルガムＭＳＨ１−エピＦ２、Ｆ３およびＦ４系における表現型変異を示す。（Ａ）草高および穂あたりの穀粒収量について選択されたＭＳＨ１−エピＦ４系。草高に関して、系４ｂ−１０、１０．３および３ａ．２は低草高に選択され、他のすべては、高草高に選択された。穀粒収量に関して、系１５．２が低収量に選択され、他のすべては高収量に選択された。（Ｂ）４つの独立した個体群の選択に対する個々の個体群応答を示すボックスプロット。水平の点線はＴｘ４３０野生型の平均を表す。穀粒収量の場合、Ｆ３選択を温室で実施した。

【図14】図１４のＡ〜Ｅは、シロイヌナズナにおけるＭＳＨ１−エピ増大成長が、クロロプラスト効果と関連することを示す。（Ａ）ミトコンドリア半相補性系ＡＯＸ−ＭＳＨ１×Ｃｏｌ−０Ｆ１；（Ｂ）プラスチド−相補ＳＳＵ−ＭＳＨ１×Ｃｏｌ−０Ｆ２は、Ｃｏｌ−０野生型と同一であるようである、（Ｃ）Ｃｏｌ−０と比べたＳＳＵ−ＭＳＨ１由来Ｆ２系のロゼット直径および生バイオマス；（Ｄ）増大した成長を示すミトコンドリア相補ＡＯＸ−ＭＳＨ１×Ｃｏｌ−０Ｆ２；（Ｅ）ＡＯＸ−ＭＳＨ１由来Ｆ２系のロゼット直径および生バイオマスはＣｏｌ−０よりも有意に大きい（Ｐ＜０．０５）。（Ｆ）Ａ０Ｘ−ＭＳＨ１×Ｃｏｌ−０のＦ４世代での増大成長表現型。

【図15】図１５のＡ〜Ｃは、シロイヌナズナＣｏｌ−０野生型およびＭＳＨ１−エピＦ３系におけるゲノム規模での５−メチル−シトシンパターンを示す。（Ａ）ＣＧ、ＣＨＧおよびＣＨＨメチル化のゲノムの差次的および非差次的メチル化への相対的寄与。遺伝子間領域は棒グラフの最上部にあり、そのあと順番にＴＥ遺伝子、偽遺伝子、ｎｃＲＮＡ、３’−ＵＴＲ、５’−ＵＴＲ、イントロン、およびＣＤＳが続く。（Ｂ）各染色体に沿ったＣＧ−ＤＭＰおよびＣＧ−Ｎ−ＤＭＰの分布であって、データをＢｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ４８０， ２４５（２０１１）に使用された分析手順に並行して各染色体についての最高値に対して正規化する。（Ｃ）ＮＤＭＰパターンの類似点およびＤＭＰの相違点を示すためのＢｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（同書）の図１ｃからのＣｏｌ−０メチル化分析。

【図16】図１６は、ｍｓｈ１クロロプラスト半相補性系×Ｃｏｌ−０野生型の交配から得られるシロイヌナズナＦ１植物を示す。ｍｓｈ１のトランス遺伝子媒介クロロプラスト半相補性は野生型表現型を復元する。しかしながら、これらの半相補系をＣｏｌ−０と交配すると、約２５％の植物がＦ１においてさまざまな程度で葉の彎曲を示す。この表現型の原因はまだわかっていないが、誘導されたＦ２個体群ではもはや見られない。

【図17】図１７は、シロイヌナズナＣｏｌ−０、エピＦ４およびエピＦ５系における開花期の分布を示す。各分布を最低でも５０の植物に基づいてプロットする。

【図18】図１８のＡ、Ｂ、Ｃは、亜硫酸水素塩シーケンシングを使用した、シロイヌナズナ系ｃｏｌ−０とｍｓｈ１−エピｆ３との差次的にメチル化された領域の検証を示す。ＡＴ３Ｇ２７１５０（ＭＩＲ２１１１−５ｐの標的遺伝子）内のＤＭＲ領域のアラインメント。強調されたＧ（すなわち、図中で下線を引いたもの）は、Ｃｏｌ−０ではメチル化されず、ＭＳＨ１−エピＦ３ではメチル化されると予想される。図１８Ａ、Ｂ、およびＣの配列を配列表で以下のように提供する：ＡＴ３Ｇ２７１５０（配列番号２７）、Ｃｏｌ０−ＭＩＲ２−２（配列番号２８）、Ｃｏｌ０−ＭＩＲ２−３（配列番号２９）、Ｃｏｌ０−ＭＩＲ２−４（配列番号３０）、Ｃｏｌ０−ＭＩＲ２−５（配列番号３１）、Ｃｏｌ０−ＭＩＲ２−６（配列番号３２）、Ｃｏｌ０−ＭＩＲ２−１０（配列番号３３）、Ｃｏｌ０−ＭＩＲ２−ｌｌ（配列番号３４）、Ｃｏｌ０−ＭＩＲ２−１２（配列番号３５）、Ｃｏｌ０−ＭＩＲ２−２６（配列番号３６）、Ｃｏｌ０−ＭＩＲ２−２７（配列番号３７）、Ｃｏｌ０−ＭＩＲ２−２８（配列番号３８）、Ｃｏｌ０−ＭＩＲ２−２９（配列番号３９）、Ｆ３−Ｍｉｒ２−１（配列番号４０）、Ｆ３−Ｍｉｒ２−２（配列番号４１）、Ｆ３−Ｍｉｒ２−４（配列番号４２）、Ｆ３−Ｍｉｒ２−５（配列番号４３）、Ｆ３−Ｍｉｒ２−７（配列番号４４）、Ｆ３−Ｍｉｒ２−１１（配列番号４５）、Ｆ３−Ｍｉｒ２−１２（配列番号４６）、Ｆ３−Ｍｉｒ２−１５（配列番号４７）、Ｆ３−Ｍｉｒ２−１６（配列番号４８）、Ｆ３−Ｍｉｒ２−２７（配列番号４９）、およびＦ３−Ｍｉｒ２−２８（配列番号５０）。

【0026】

詳細な説明
Ｉ．定義
本明細書中で用いられる場合、「染色体修飾」という語句は：ａ）「改変された染色体座（複数可）」；ｂ）「突然変異した染色体座（複数可）」および「染色体突然変異（複数可）」；またはｃ）トランス遺伝子のいずれかを指す。

【0027】

本明細書中で用いられる場合、「改変された染色体座」（複数）または「改変された染色体座」（単数）という語句は、対応する親染色体座に対して遺伝性可逆的後成的変化を受けた染色体の部分を指す。改変された染色体座における遺伝性可逆的遺伝子変化としては、染色体ＤＮＡのメチル化、特にシトシン残基から５−メチルシトシン残基へのメチル化、および／またはヒストンタンパク質の翻訳後修飾、特にアセチル化、メチル化、ユビキチニル化、リン酸化、およびｓｕｍｏ化（小さなユビキチン様修飾タンパク質の共有結合）を含むがこれらに限定されないヒストン修飾が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本明細書中で用いられる場合、「染色体座」とは、細胞の核中に位置する染色体中の座を指す。

【0028】

本明細書中で用いられる場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含むが、限定されない」ことを意味する。

【0029】

本明細書中で用いられる場合、「突然変異した染色体座」（複数）（複数）、「突然変異した染色体座」（単数）、「染色体突然変異（複数可）」という語句は、対応する親の染色体座中のヌクレオチド配列と比べて、ヌクレオチド配列において遺伝性遺伝子変化を受けた染色体の部分を指す。突然変異した染色体座は、ヌクレオチド配列反転、挿入、欠失、置換、またはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない突然変異を含む。ある実施形態において、突然変異した染色体座は、可逆的である突然変異を含み得る。これに関連して、染色体の可逆的突然変異としては、転位性因子の挿入、転位性因子の欠損、およびある反転が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ある実施形態において、染色体座は不可逆的である突然変異を含む。これに関連して、染色体における不可逆的突然変異としては、欠失を挙げることができるが、これに限定されるものではない。

【0030】

本明細書中で用いられる場合、「不連続変異」または「Ｖ_D」という用語は、任意の組み合わせまたは単独のいずれかで観察されえる雄性不稔、矮化、斑入り、および／または遅延型開花期の特徴を含む、異なる遺伝性表現型変異を指す。

【0031】

本明細書中で用いられる場合、「ＭＳＨ−ｄｒ」という用語は、ＭＳＨ１抑制を受けた植物で観察される植物分げつ、高さ、節間伸長および気孔密度における変化を指す。

【0032】

本明細書中で用いられる場合、「量的変動」または「Ｖ_Q」という用語は、ＭＳＨ１発現が抑制された植物の異系交配から誘導される個々の子孫系で観察され、他の植物に対して不連続変異を示す表現型変異を指す。

【0033】

本明細書中で用いられる場合、「ミクロＲＮＡ」または「ｍｉＲＮＡ」という用語は、植物中に存在する天然ｍｉＲＮＡに実質的に類似したｍｉＲＮＡならびに人工ｍｉＲＮＡの両方を指す。ある実施形態において、トランス遺伝子は、植物中に存在する天然ｍｉＲＮＡに実質的に類似したｍｉＲＮＡまたは人工ｍｉＲＮＡのいずれかを産生するために使用することができる。

【0034】

本明細書中で用いられる場合、「改変された染色体座に関連する核酸を得る」という慣用句は、変更されていない共有結合した核酸からの改変された染色体座と関連した核酸の物理的分離または濃縮を提供する任意の方法を指す。これに関連して、核酸は必ずしも変化（すなわち、メチル化など）を含まないが、少なくとも改変された１以上のヌクレオチド塩基を含む。改変された染色体座に関連した核酸は、したがって、分子クローニング、ＰＣＲ、または配列データに基づく直接合成を含むが、これらに限定されない方法によって得られる。

【0035】

「機能的に連結された」という句は、本明細書中で用いられる場合、１つの配列が必要とされる機能を連結された配列に提供することができるような核酸配列の結合を指す。プロモータに関連して、「機能的に連結された」とは、関心対象の配列の転写がそのプロモータによって制御され、調節されるように、プロモータがその関心対象の配列に連結されることを意味する。関心対象の配列がタンパク質をコード化する場合、およびそのタンパク質の発現が望ましい場合、「機能的に連結された」とは、結果として得られる転写産物が効率的に翻訳されるような方法でプロモータが配列に連結されることを意味する。プロモータのコーディング配列に対する連結は転写融合であり、コード化されたタンパク質の発現が望ましい場合、結果として得られる転写産物中の第１翻訳開始コドンがコーディング配列の開始コドンとなるように連結される。あるいは、プロモータのコーディング配列に対する連結が翻訳融合であり、コード化されたタンパク質の発現が望ましい場合、結果として得られる翻訳産物が所望のタンパク質をコード化する翻訳オープンリーディングフレームとフレーム内にあるように連結されるように、プロモータと関連した５’非翻訳配列中に含まれる第１翻訳開始コドンは連結される。機能的に連結させることができる核酸配列としては、遺伝子発現機能を提供する配列（すなわち、遺伝子発現エレメント、たとえばプロモータ、５’非翻訳領域、イントロン、タンパク質コーディング領域、３’非翻訳領域、ポリアデニル化部位、および／または転写ターミネーター）、ＤＮＡ移入および／または組み込み機能を提供する配列（すなわち、部位特異的リコンビナーゼ認識部位、インテグラーゼ認識部位）、選択的機能を提供する配列（すなわち、抗生物質耐性マーカー、生合成遺伝子）、スコア可能なマーカー機能を提供する配列（すなわち、レポーター遺伝子）、配列のインビトロまたはインビボ操作を容易にする配列（すなわち、ポリリンカー配列、部位特異的組換え配列、相同的組換え配列）、および複製機能を提供する配列（すなわち、細菌複製起源、自律的複製配列、セントロメア配列）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0036】

本明細書中で用いられる場合、「ＭＳＨ１遺伝子（複数可）の発現を抑制する」という表現は、遺伝的または環境的操作を受けていないが、それ以外は同質遺伝的な植物または植物細胞で生じる機能的ＭＳＨ１活性のレベルに対して、植物または植物細胞で減少したレベルの機能的ＭＳＨ１活性を提供する遺伝的または環境的操作を指す。

【0037】

本明細書中で用いられる場合、「トランス遺伝子」という用語は、染色体修飾に関連して、宿主細胞で安定して維持される染色体に組み込まれた非相同源由来の任意のＤＮＡを指す。これに関連して、ＤＮＡの非相同源としては、宿主細胞生物と異なる生物由来のＤＮＡ、宿主細胞種と異なる種、異なる変種または同一変種のいずれかである同じ種の変種、任意のインビトロ修飾を受けたＤＮＡ、組み換えＤＮＡ、ならびにそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0038】

本明細書中で用いられる場合、「再生不可能な」という用語は、植物全体を生じさせることができない植物の部分または植物細胞を指す。

【0039】

ＩＩ．概略の記載
有用な特徴を示す植物をもたらす遺伝性および後成的および／または遺伝的変異を導入するための方法が、これらの方法によって得られる植物、植物種子、植物の部分、植物細胞、および加工植物産物とともに提供される。ある実施形態において、本発明によって提供される方法を使用して、変種植物または非ハイブリッド植物に後成的および／または遺伝的変異を導入することができ、その結果、有用な特徴が得られ、また有用な特徴によって付与される利点を示す、有する、または他の方法で反映する有用な植物、種子を含むがこれに限定されない植物の部分、植物細胞、および加工植物産物が得られる。他の実施形態において、これによって提供される方法を使用して、ハイブリダイゼーションも受けやすい植物に後成的および／または遺伝的変異を導入することができる。

【0040】

ほとんどの実施形態において、本発明によって提供される方法は、植物ＭＳＨ１遺伝子の発現を抑制すること、機能的植物ＭＳＨ１遺伝子の発現を回復すること、および１以上の有用な特徴を示す子孫植物を選択することを含む。ある実施形態において、これらの有用な特徴は、遺伝性可逆的後成的変化を受けた１以上の改変された染色体座、遺伝性遺伝子変化を受けた１以上の突然変異した染色体座、またはそれらの組み合わせのいずれに関連する。

【0041】

ＩＩＩ．植物または植物細胞におけるＭＳＨ１発現の抑制
一般的に、後成的および／または遺伝的変異植物を導入するための本発明によって提供される方法は、単にＭＳＨ１発現が変異を導入するために十分な時間抑制されることを必要とする。このように、さまざまなＭＳＨ１抑制方法を用いて、本発明によって提供される方法を実施することができ、その方法は特定の抑制技術に限定されない。

【0042】

ＭＳＨ１遺伝子およびＭＳＨ１遺伝子枯渇の効果はどちらも植物において高度に保存されるようであるので、本明細書中で提供される方法をさまざまな異なる植物または植物細胞に適用することができることがさらに予測される。シロイヌナズナ、ダイズ、トウモロコシ、ソルガム、米、ヤマカモジグサ、ビィニフェラ、綿、およびキュウリ由来のＭＳＨ１遺伝子の配列またはそのフラグメントが本発明によって提供される。ある実施形態において、そのような遺伝子を相同的または非相的同植物種のいずれかで直接使用して、相同的植物種または非相同植物種のいずれかにおいて内因性ＭＳＨ１遺伝子を抑制することができる。１つの種由来のＭＳＨ１遺伝子が相同的種および非相同的種の両方における内因性ＭＳＨ１遺伝子の抑制に有効であることが示されている非限定的例証がＳａｎｄｈｕ ｅｔ ａｌ． ２００７によって提供され、トマトＭＳＨ１配列を有するＭＳＨ１阻害的ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）を提供するトランス遺伝子は、トマトおよびタバコの両方の内因性ＭＳＨ１遺伝子を阻害することが示された。トウモロコシＭＳＨ１配列を有するＭＳＨ１阻害的ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）を提供するトランス遺伝子は、キビ、ソルガム、およびトウモロコシの内因性ＭＳＨ１遺伝子を阻害することができる。限定されないが、綿、キャノーラ、小麦、大麦、亜麻、オートムギ、ライムギ、芝草、サトウキビ、アルファルファ、バナナ、ブロッコリー、キャベツ、ニンジン、キャッサバ、カリフラワー、セロリ、かんきつ類、ウリ科植物、ユーカリ、ニンニク、ブドウ、タマネギ、レタス、エンドウ豆、ピーナツ、コショウ、ジャガイモ、ポプラ、マツ、ヒマワリ、ベニバナ、ダイズ、イチゴ、サトウダイコン、サツマイモ、タバコ、キャッサバ、カリフラワー、セロリ、かんきつ類、綿、ウリ科植物、ユーカリ、ニンニク、ブドウ、タマネギ、レタス、エンドウ豆、ピーナツ、コショウ、ジャガイモ、ポプラ、マツ、ヒマワリ、ベニバナ、イチゴ、サトウダイコン、サツマイモ、タバコ、キャッサバ、カリフラワー、セロリ、かんきつ類、ウリ科植物、ユーカリ、ニンニク、ブドウ、タマネギ、レタス、エンドウ豆、ピーナツ、コショウ、ポプラ、マツ、ヒマワリ、ベニバナ、ダイズ、イチゴ、サトウダイコン、タバコ、ジャトロファ、アマナズナ、およびリュウゼツランをはじめとする他の植物由来のＭＳＨ１遺伝子は、さまざまな技術によって得られ、それらの植物における対応するＭＳＨ１遺伝子または異なる植物におけるＭＳＨ１遺伝子のいずれかの発現を抑制するために使用することができる。さまざまな植物のＭＳＨ１遺伝子を得るための方法としては：ｉ）植物種由来の配列を含むアミノ酸配列および／またはヌクレオチド配列データベースを検索して、配列同一性比較によってＭＳＨ１遺伝子を同定する技術；ｉｉ）ゲノム配列からのＰＣＲまたは発現されたＲＮＡからのＲＴ−ＰＣＲのいずれかによってＭＳＨ１遺伝子をクローニングする技術；ｉｉｉ）ＰＣＲおよび／もしくはハイブリダイゼーションに基づく技術を使用してゲノムまたはｃＤＮＡライブラリからＭＳＨ１遺伝子をクローニングする技術；ｉｖ）ＭＳＨ１タンパク質に対する抗体を使用してＭＳＨ１含有クローンを同定する、発現ライブライブラリからＭＳＨ１遺伝子をクローニングする技術；ｖ）ｍｓｈ１突然変異体またはＭＳＨ１欠損植物の相補性によってＭＳＨ１遺伝子をクローニングする技術；あるいはｖｉ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、および／または（ｖ）の任意の組み合わせなどの技術が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ＭＳＨ１遺伝子の植物からの回収は、遺伝子の抑制をもたらす植物形質転換ベクターを構築し、植物をそのベクターで形質転換し、そしてそのベクターで形質転換された植物が、葉の斑入り、細胞質雄性不稔（ＣＭＳ）、低下成長速度表現型、遅延もしくは隠花性表現型、および病原体に対する増大した感受性をはじめとする、ＭＳＨ１発現が抑制された場合にさまざまな植物種で典型的に観察される特徴的な応答を示すかどうかを確認することによって、容易に決定または確認することができる。

【0043】

ある実施形態において、本明細書中で提供される方法で用いられるＭＳＨ１遺伝子またはそれらのフラグメントは、配列番号１、配列番号３〜１０、および配列番号１４を含むが、これらに限定されない本明細書中で提供される１以上のＭＳＨ１遺伝子またはそのフラグメントに対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を有するであろう。ある実施形態において、ＭＳＨ１タンパク質またはその部分をコード化する、本明細書中で提供される方法で用いられるＭＳＨ１遺伝子またはそのフラグメントは、配列番号２を含むがこれに限定されない本明細書中で提供される１以上のＭＳＨ１タンパク質、および配列番号３〜１０によってコード化されるＭＳＨ１タンパク質と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、もしくは１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有するであろう。ある実施形態において、本明細書中で提供される方法で用いられるＭＳＨ１遺伝子またはそれらのフラグメントは、配列番号５１および配列番号５２を含むがこれに限定されない本明細書中で提供される１以上のＭＳＨ１遺伝子またはそのフラグメント、そのオルトログ、またはそのホモログと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を有するであろう。ある実施形態において、ＭＳＨ１タンパク質またはその部分をコード化する、本明細書中で提供される方法で用いられるＭＳＨ１遺伝子またはそのフラグメントは、配列番号５１および配列番号５２によってコード化されるタンパク質を含むがこれに限定されない本明細書中で提供される１以上のＭＳＨ１タンパク質またはＭＳＨ１ホモログと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有するであろう。本明細書中で提供されるもの以外の植物由来のＭＳＨ１遺伝子も、多くのＭＳＨ１遺伝子を特性化する、コード化されたＤＮＡ結合ドメイン（ドメインＩ）、ＡＴＰａｓｅドメイン（ドメインＶ）、およびカルボキシ末端ＧＩＹ−ＹＩＧ型エンドヌクレアーゼドメイン（ドメインＶＩ）によって同定することができる（Ａｂｄｅｌｎｏｏｒ ｅｔ ａｌ． ２００６）。この点に関して、１８〜２０ヌクレオチド、さらに好ましくは２１ヌクレオチドまたはそれ以上のＭＳＨ１核酸フラグメントを使用して、内因性ＭＳＨ１遺伝子の抑制を行うことができると予想される。ある実施形態において、少なくとも１８、１９、２０、または２１ヌクレオチド〜約５０、１００、２００、５００もしくはそれ以上のヌクレオチドのＭＳＨ１核酸フラグメントを使用して、内因性ＭＳＨ１遺伝子の抑制を実施することができる。

【0044】

ある実施形態において、植物におけるＭＳＨ１の抑制は、トランス遺伝子で実施される。ＭＳＨ１の発現を抑制するために使用することができるトランス遺伝子としては、限定されないが、ＭＳＨ１のドミナントネガティブ突然変異体を産生するトランス遺伝子、阻害的低分子ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、共抑制センスＲＮＡ、および／またはアンチセンスＲＮＡが挙げられ、これらは内因性ＭＳＨ１遺伝子の阻害をもたらす。開示内容全体が参考として本明細書で援用される、トランス遺伝子による内因性植物遺伝子の抑制を記載する米国特許としては、米国特許第７，１０９，３９３号、米国特許第５，２３１，０２０号および米国特許第５，２８３，１８４号（共抑制法）；ならびに米国特許第５，１０７，０６５号および米国特許第５，７５９，８２９号（アンチセンス法）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ある実施形態において、ＭＳＨ１遺伝子に対する相同性を有する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子を産生するように特に設計されたトランス遺伝子を使用して、内因性ＭＳＨ１遺伝子の発現を減少させることができる。そのような実施形態において、ｄｓＲＮＡのセンス鎖配列を、アンチセンス配列からスペーサー配列、好ましくはｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）分子の形成を促進するものによって分離することができる。そのようなスペーサー配列の例としては、Ｗｅｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｊ．， ２７（６）：５８１−９０（２００１）， ａｎｄ Ｈａｍｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｊ．， １５：７３７−７４６ （１９９８）で記載されているものが挙げられるが、これに限定されるものではない。タバコおよびトマトにおけるＭＳＨ１を抑制することが示されている１つの例示的非限定的ベクターはＳａｎｄｈｕ ｅｔ ａｌ．， ２００７によって記載され、この場合、イントロン配列がＭＳＨ１配列のセンス鎖およびアンチセンス鎖を分離する。

【0045】

ある実施形態において、ＭＳＨ１抑制をもたらすトランス遺伝子は、機能的に連結されたＭＳＨ１阻害配列の誘導または下方調節のいずれかを提供する調節されたプロモータを含み得る。これに関連して、ＭＳＨ１阻害配列は、これらに限定されないが、ＭＳＨ１のドミナントネガティブ突然変異体、阻害的低分子ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、共抑制センスＲＮＡ、および／またはアンチセンスＲＮＡを含み得、これらは植物の内因性ＭＳＨ１遺伝子の阻害をもたらす。そのようなプロモータは、誘導剤または下方調節剤を提供するかまたは保留するかのいずれかによって、制御された時間中でＭＳＨ１の抑制をもたらすことができる。誘導性プロモータとしては、ＰＲ−ｌａプロモータ（米国特許出願第２００２００６２５０２号）またはＧＳＴ ＩＩプロモータ（ＷＯ１９９０／００８８２６Ａ１）が挙げられるが、これに限定されるものではない。他の実施形態において、誘導または抑圧することができる転写因子ならびにその転写因子によって認識され、ＭＳＨ１阻害配列に機能的に連結されたプロモータの両方が提供される。そのような転写因子／プロモータ系には：ｉ）メトキシフェノジド、テブフェノジド、および他の化合物によって誘導することができるＲＦ２ａ酸性ドメイン−エクジソン受容体転写因子／同族プロモータ（米国特許出願第２００７０２９８４９９号）；ｉｉ）テトラサイクリンで抑圧または抑圧解除することができるキメラテトラサイクリンリプレッサ転写因子／同族キメラプロモータ（Ｇａｔｚ， Ｃ．， ｅｔ ａｌ． （１９９２）． Ｐｌａｎｔ Ｊ． ２， ３９７−４０４）などが含まれるが、これらに限定されるものではない。

【0046】

さらに別の実施形態において、ＭＳＨ１抑制をもたらすトランス遺伝子がトランス遺伝子の除去をもたらす配列に隣接している、遺伝子組み換え植物が提供される。そのような配列としては、同族トランスポーゼースによって作用を受ける転位性因子配列が挙げられるが、これらに限定されるものではない。遺伝子組み換え植物において使用されるそのような系の非限定的例としては、ｃｒｅ−ｌｏｘおよびＦＬＰ−ＦＲＴ系が挙げられる。

【0047】

ＭＳＨ１抑制は、分子技術によって容易に同定、またはモニターすることができる。内因性ＭＳＨ１はインタクトであるが、その発現が阻害されるある実施形態において、ＭＳＨ１をコード化するＲＮＡの産生または蓄積をモニターすることができる。ＭＳＨ１ ＲＮＡ発現レベルをモニターするための分子法としては、半定量的または定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）技術の使用が挙げられるが、これに限定されるものではない。ＲＮＡｉ媒介抑制から起こるＭＳＨ１抑制をモニターするためのＭＳＨ１の半定量的ＰＣＲ技術の使用が記載されている（Ｓａｎｄｈｕ ｅｔ ａｌ． ２００７）。ＴａｑＭａｎ（商標）反応（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， Ｃａｌｉｆ． ＵＳ）、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（商標）もしくはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ（商標）プローブの使用、またはＢｕｓｔｉｎ， Ｓ． Ａ． （Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ （２００２） ２９， ２３−３９）で開示されている方法のいずれかをはじめとするさまざまな定量的ＲＴ−ＰＣＲ手順を使用することができる。定量的核酸配列に基づく増幅（Ｑ−ＮＡＳＢＡ（商標））またはＩｎｖａｄｅｒ（商標）技術（Ｔｈｉｒｄ Ｗａｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ．）などの他のＲＮＡ定量技術を使用することも可能である。

【0048】

ＭＳＨ１抑制が植物の内因性ＭＳＨ１遺伝子における突然変異の使用によって達成されるある実施形態において、ゲノムＤＮＡにおける突然変異の存在または不在は、さまざまな技術によって容易に決定することができる。半接合状態（すなわち、１つの染色体が突然変異したｍｓｈ１遺伝子を有し、他の染色体が野生型ＭＳＨ１遺伝子を有する場合）の突然変異の同定をもたらすある技術も使用することができる。挿入、欠失、ヌクレオチド置換、およびそれらの組み合わせを含むＭＳＨ１ ＤＮＡ配列における突然変異は、そのすべての開示内容全体が参考として本明細書で援用される、米国特許第５，４６８，６１３号、同第５，２１７，８６３号；同第５，２１０，０１５号；同第５，８７６，９３０号；同第６，０３０，７８７号；同第６，００４，７４４号；同第６，０１３，４３１号；同第５，５９５，８９０号；同第５，７６２，８７６号；同第５，９４５，２８３号；同第５，４６８，６１３号；同第６，０９０，５５８号；同第５，８００，９４４号；同第５，６１６，４６４号；同第７，３１２，０３９号；同第７，２３８，４７６号；同第７，２９７，４８５号；同第７，２８２，３５５号；同第７，２７０，９８１号および同第７，２５０，２５２号で開示されているものを含むが、これらに限定されないさまざまな有効な方法によって実施することができる。たとえば、突然変異は、米国特許第５，４６８，６１３号および同第５，２１７，８６３号で開示されているような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブに対するハイブリダイゼーションによって検出することができる。米国特許第５，２１０，０１５号は、アニールされたオリゴヌクレオチドの検出を開示し、この場合、アニールされていない５’標識ヌクレオチドが５’−３’エキソヌクレアーゼ活性によって放出される。米国特許第６，００４，７４４号は、ＤＮＡプライマー延長反応によるＤＮＡにおける突然変異の存在または不在の検出を開示している。米国特許第５，４６８，６１３号は、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを開示し、この場合、ヌクレオチド変異を含む配列を増幅させ、支持体に固定させ、そして標識された配列特異性オリゴヌクレオチドプローブに暴露させる方法によって、核酸配列における単一または複数のヌクレオチド変異を検出することができる。突然変異はさらに、米国特許第５，８００，９４４号で開示されるプローブライゲーション法によっても検出することができ、この方法では、関心対象の配列を増幅し、プローブとハイブリダイズさせ、続いてライゲーションを行って、プローブの標識された部分を検出する。米国特許第６，６１３，５０９号および同第６，５０３，７１０号、ならびにその中で見いだされる参考文献は、質量分析で突然変異を特定するための方法を提供する。本発明の方法はゲノムＤＮＡ試料中のＭＳＨ１遺伝子における突然変異の存在または不在を特定するための任意の多型性分類法と合わせて使用することができるので、突然変異を特定するこれらのさまざまな方法は、限定的というよりはむしろ例示的であることが意図される。さらに、使用されるゲノムＤＮＡ試料としては、植物から直接単離されたゲノムＤＮＡ、クローンされたゲノムＤＮＡ、または増幅されたゲノムＤＮＡを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。

【0049】

内因性植物ＭＳＨ１遺伝子における突然変異は、さまざまな供給源から、さまざまな技術によって得られる。ＭＳＨ１遺伝子において１以上の機能喪失型突然変異を含む相同的置換配列および２本鎖切断の両端での相同的配列は、染色体中に内在する野生型ＭＳＨ１配列の機能喪失型突然変異（複数可）を有するｍｓｈ１置換配列での相同的組換えおよび置換を提供することができる。そのような機能喪失型突然変異には、ＭＳＨ１機能の完全な損失または他の染色体座において改変（すなわち、遺伝性および可逆的後成的変化）もしくは他の染色体座において突然変異を誘発するために十分なＭＳＨ１機能の損失のいずれかをもたらすＭＳＨ１遺伝子内の配列の挿入、欠失、および置換が含まれるが、これらに限定されるものではない。ＭＳＨ１における機能喪失突然変異としては、フレームシフト突然変異、中途翻訳停止コドン挿入、ＤＮＡ結合ドメイン（ドメインＩ）、ＡＴＰａｓｅドメイン（ドメインＶ）、および／またはカルボキシ末端ＧＩＹ−ＹＩＧ型エンドヌクレアーゼドメインを含むがこれらに限定されない１以上の機能的ドメインの欠失などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。同様の効果を得るために内因性ＭＳＨ１植物遺伝子中に操作されるシロイヌナズナｍｓｈ１突然変異と類似した突然変異も本明細書中で提供される。内因性染色体配列を相同的２本鎖切断修復によって置換する方法がタバコおよびトウモロコシで報告されている（Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｊ． ４４， ６９３， ２００５；Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｊ． ６：９３， ２００８）。相同的置換ｍｓｈ１配列（すなわち、ＭＳＨ１配列において機能喪失型突然変異をもたらすもの）もまた、非相同的末端結合もしくは非相同的末端結合と相同的組換えとの組み合わせによって標的ヌクレアーゼ切断部位に導入することができる（Ｐｕｃｈｔａ， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｂｏｔ． ５６， １， ２００５； Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｊ． ４４， ６９３， ２００５で概説）。ある実施形態において、少なくとも１つの部位特異的２本鎖切断を内因性ＭＳＨ１遺伝子中にメガヌクレアーゼによって導入することができる。メガヌクレアーゼの遺伝的修飾は、特異的内因性ＭＳＨ１標的配列と正確に一致するか、または密接に関連する認識配列内で切断するメガヌクレアーゼを提供することができる（ＷＯ／０６０９７８５３Ａｌ、ＷＯ／０６０９７７８４Ａ１、ＷＯ／０４０６７７３６Ａ２、Ｕ．Ｓ．２００７０１１７１２８Ａ１）。したがって、標的ＭＳＨ１配列内で切断するヌクレアーゼを選択または設計することができると予想される。他の実施形態において、少なくとも１つの部位特異的２本鎖切断を、亜鉛フィンガーヌクレアーゼで内因性ＭＳＨ１標的配列に導入することができる。植物において相同的組換えを提供するために操作された亜鉛フィンガーヌクレアーゼの使用も開示されている（ＷＯ０３／０８０８０９、ＷＯ０５／０１４７９１、ＷＯ０７０１４２７５、ＷＯ０８／０２１２０７）。さらに別の実施形態において、内因性ＭＳＨ１遺伝子における突然変異は、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌによって記載されるＴＩＬＬＩＮＧ技術（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｌｏｃａｌ Ｌｅｓｉｏｎｓ ｉｎ Ｇｅｎｏｍｅｓ）の使用によって同定することができ、この場合、伝統的な化学的突然変異に続いてハイスループットスクリーニングを行って、内因性ＭＳＨ１遺伝子における点突然変異または他の突然変異を含む植物を同定する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２００４， １３５：６３０−６３６）。

【0050】

ある実施形態において、ＭＳＨ１抑制は、植物全体、または植物の生殖構造を、内因性ＭＳＨ１遺伝子の抑制をもたらすストレス条件にさらすことによって実施することができる。そのようなストレス条件としては、ハイライトストレス、および熱ストレスが挙げられるが、これらに限定されるものではない。例示的非限定的ハイライトストレス条件は、約３００〜約１２００マイクロモル光子／ｍ²へ約２４〜約１２０時間連続暴露することを含む。例示的非限定的熱ストレス条件は、約３２℃〜約３７℃の温度に約２時間〜約２４時間連続暴露することを含む。ＭＳＨ１抑制も提供することができる例示的非限定的熱、光、および他の環境ストレス条件は、熱（Ｓｈｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ． ２０１０）ハイライトストレス（Ｘｕ ｅｔ ａｌ． ２０１１）および他の環境ストレス条件（Ｈｒｕｚ ｅｔ ａｌ． ２００８）についても開示されている。

【0051】

ＭＳＨ１抑制が培養された植物細胞で実施される方法も本明細書中で提供される。ある実施形態において、ＭＳＨ１抑制は、内因性ＭＳＨ１遺伝子の抑制をもたらすストレス条件下で植物細胞を培養することによって実施することができる。そのようなストレス条件には、ハイライトストレスが含まれるが、これに限定されるものではない。例示的非限定的ハイライトストレス条件には、約３００〜約１２００マイクロモル光子ｓ／ｍ²に約２４〜約１２０時間連続暴露することが含まれる。例示的非限定的熱ストレス条件には、約３２℃〜約３７℃の温度に約２時間〜約２４時間連続暴露することが含まれる。ＭＳＨ１抑制を提供することができる例示的および非限定的熱、光、および他の環境ストレス条件は、熱（Ｓｈｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ． ２０１０）、ハイライトストレス（Ｘｕ ｅｔ ａｌ． ２０１１）および他の環境ストレス条件（Ｈｒｕｚ ｅｔ ａｌ． ２００８）についても開示されている。ある実施形態において、ＭＳＨ１抑制は、そのような抑制を提供する核酸を植物細胞に導入することによって、培養された植物細胞において実施される。培養された植物細胞でＭＳＨ１の抑制を提供するために用いることができる核酸としては、ＭＳＨ１遺伝子に対する阻害的低分子ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、共抑制センスＲＮＡ、および／またはアンチセンスＲＮＡを産生するトランス遺伝子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。培養された植物細胞においてＭＳＨ１の抑制を提供するために使用できる核酸には、内因性ＭＳＨ１遺伝子に対する阻害的低分子ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。ＭＳＨ１の阻害を提供するＲＮＡ分子は、エレクトロポレーションによって導入することができる。標的遺伝子を阻害するための培養された植物細胞に対する阻害的ＲＮＡの導入は、ある実施形態では、Ｖａｎｉｔｈａｒａｎｉ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．， ２００３， １００（１６）：９６３２−６）、Ｑｉ ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２００４ Ｄｅｃ １５；３２（２２）：ｅｌ ７９）、またはＪ． Ｃｈｅｏｎ ｅｔ ａｌ． （Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． （２００９）， １９（８）， ７８１−７８６）で開示されているようにして達成することができる。

【0052】

ＭＳＨ１抑制はさらに、植物表現型が観察される伝統的な方法によって容易に同定またはモニターすることができる。たとえば、ＭＳＨ１抑制は、葉斑入り、細胞質雄性不稔（ＣＭＳ）、低下成長速度表現型、遅延もしくは陰花性表現型、および／または病原体に対する増大した感受性を含むオルガネラ効果を観察することによって同定またはモニターすることができる。様々な植物におけるＭＳＨ１抑制を示す表現型を図１、２、および３に示す。ＭＳＨ１抑制と関連するこれらの表現型を本明細書中では「不連続変異」（Ｖ_D）と称する。ＭＳＨ１抑制はさらに、植物分げつ、高さ、節間伸長および気孔密度における変化（本明細書中で「ＭＳＨ１−ｄｒ」と称する）ももたらすことができ、これを使用して植物におけるＭＳＨ１抑制を同定またはモニターすることができる。他の生化学的および分子的特徴をさらに使用して、植物におけるＭＳＨ１抑制を同定またはモニターすることができる。そのような分子的特徴としては、細胞周期の調節、ジベレリン酸異化作用、オーキシン生合成、オーキシン受容体発現、開花および春化調節剤（すなわち、増大したＦＬＣおよび減少したＳＯＣ１発現）、ならびに増大したｍｉＲ１５６および減少したｍｉＲ１７２レベルに関与する遺伝子の発現における変化を挙げることができるが、これに限定されるものではない。そのような生化学的特徴としては、ＴＣＡ、ＮＡＤおよび炭水化物代謝経路のほとんどの化合物の上方調節、アミノ酸配列生合成の下方調節、ある植物におけるスクロースの枯渇、ある植物における糖または糖アルコールの増加、ならびにアスコルビン酸塩、アルファトコフェロール、およびストレス応答性フラボンアピゲニン、およびアピゲニン−７−オグルコシド、イソビテキシン、ケンフェロール３−Ｏ−ベータ−グルコシド、ルテオリン−７−Ｏ−グルコシド、およびビテキシンの増加を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。ある実施形態において、分子的、生化学的、および伝統的な方法の両方の組み合わせを使用して、植物におけるＭＳＨ１抑制を同定またはモニターすることができることがさらに想定される。

【0053】

ＩＶ．ＭＳＨ１抑制植物の子孫の回収、自家受粉および異系交配
植物におけるＭＳＨ１の抑制と、それに続いて子孫植物の回収をもたらす様々な方法であって、ＭＳＨ１機能が回復される方法が本明細書中で提供される。ある実施形態において、ＭＳＨ１阻害トランス遺伝子の発現を下方調節することにより、またはＭＳＨ１阻害トランス遺伝子をトランスポーゼースで除去することによって、そのような子孫植物を回収することができる。本明細書中で提供される方法のある実施形態では、ＭＳＨ１が標的植物または植物細胞において抑制され、ＭＳＨ１を発現する子孫植物が伝統的な遺伝的技術によって回収される。例示的非限定的一実施形態において、子孫植物は、ＭＳＨ１分離を提供するトランス遺伝子についてヘテロ接合性である植物を自家受粉させることによって得られる。そのようなヘテロ接合性植物の自家受粉（または植物細胞から再生されるヘテロ接合性植物の自家受粉）は、子孫植物個体群のサブセットから分離するためのトランス遺伝子を提供する。内因性ＭＳＨ１遺伝子（すなわち、ｍｓｈ１植物）における劣性突然変異の使用によってＭＳＨ１が抑制される場合、ｍｓｈ１／ｍｓｈ１植物を、さらに別の例示的非限定的実施形態において、ＭＳＨ１植物と交配、次いで自家受粉させて、機能的野生型ＭＳＨ１対立遺伝子についてホモ接合性である子孫植物を得ることができる。他の実施形態では、ＭＳＨ１が標的植物または植物細胞において抑制され、ＭＳＨ１を発現する子孫植物が分子遺伝的技術によって回復される。そのような分子遺伝的技術の非限定的例示的実施形態としては：ｉ）プロモータの活性に必要な誘導剤の撤収もしくはそのプロモータのリプレッサの導入による調節されたプロモータの制御下でのＭＳＨ１抑制トランス遺伝子の下方調節；または、ｉｉ）トランスポーゼース認識部位に隣接したＭＳＨ１抑制トランス遺伝子の、そのトランス遺伝子の除去をもたらす同族トランスポーゼースへの暴露が挙げられる。

【0054】

本明細書中で提供される方法のある実施形態において、雄性不稔、矮化、斑入り、および／または遅延型開花期を示し、機能的ＭＳＨ１を発現する、ＭＳＨ１発現が抑制された植物由来の子孫植物を得、独立育種系として維持する。そのような表現型は分離するようであり、したがって、例えば正常な成長速度を示し、斑入りを示さない細胞質雄性不稔植物、または高度に斑入りの発育不良雄性不稔植物を選択可能であることが見いだされた。本発明者等はこの現象を本明細書では不連続変異（Ｖ_D）と称する。この現象が分離によってＭＳＨ１阻害トランス遺伝子を喪失した自家受粉させた植物個体群で起こる際の例示的非限定的説明を図６で提供する。不連続変異（Ｖ_D）を示すそのような個々の系は、前述の伝統的な遺伝的技術、分子遺伝的技術、またはそれらの組み合わせによって得られることがさらに想定される。

【0055】

不連続変異（Ｖ_D）を示すＭＳＨ１発現が抑制された植物から得られる個々の系を、他の植物と交配して、不連続変異（Ｖ_D）と関連した表現型が欠損した（すなわち、雄性不稔、矮化、斑入り、および／または遅延型開花期）子孫植物を得ることができる。そのような異系交配の子孫を自家受粉させて、有意な表現型変異を示す個々の子孫系を得ることができることが意外にも見いだされた。ＭＳＨ１発現が抑制された植物の異系交配から誘導されるこれらの個々の子孫系で観察され、他の植物に対する不連続変異を示すそのような表現型変異を、本明細書中では「量的変動」（Ｖ_Q）と称する。ＭＳＨ１発現が抑制された植物と他の植物との異系交配から得られるある個々の子孫植物系は、１以上の特徴がいずれかの親の系と比べて改善され、選択することができる、有用な表現型変異を示す可能性がある。そのような個々の子孫系で選択することができる有用な表現型変異には、いずれかの親の系と比べた生および乾燥質量バイオマスの増加が含まれるが、これに限定されるものではない。不連続変異を示す植物と不連続変異を示さない植物との異系交配のＦ２子孫で起こるような現象の例示的非限定的説明を図６で提供する。

【0056】

ある実施形態において、不連続変異を示す個々の系の異系交配は、ＭＳＨ１抑制を受けていないが、それ以外は不連続変異を示す個々の系に対して同質遺伝的である植物に対するものであり得る。ある例示的実施形態において、不連続変異を示す系は、所与の生殖質においてＭＳＨ１を抑制することによって得られ、ＭＳＨ１抑制を受けなかった同じ生殖質を有する植物と異系交配させることができる。他の実施形態において、不連続変異を示す個々の系の異系交配は、ＭＳＨ１抑制を受けていないが、不連続変異を示す個々の系と同質遺伝的でない植物に対するものであり得る。したがって、ある実施形態において、不連続変異を示す個々の系の異系交配はさらに、不連続変異を示す個々の系で起こらない１以上の染色体多型性を含む植物、部分的もしくは全体的に異なる生殖質由来の植物、または異なる雑種強勢群の植物（そのような異なる雑種強勢群が存在する場合）に対するものでもあり得る。そのような異系交配をいずれかの方向で作成できることも認められている。したがって、不連続変異を示す個々の系を、そのような異系交配においてＭＳＨ１抑制を受けていない植物に対して花粉供与体または花粉受領体のいずれかとして使用することができる。ある実施形態において、異系交配の子孫を次いで自家受粉させて、別々にスクリーニングして親の系と比べて改善された特徴を有する系を同定することができる個々の系を確立する。改善された特徴を示すそのような個々の系を次いで選択し、さらに自家受粉させることによって繁殖させることができる。不連続変異を示す植物の不連続変異を示さない植物との異系交配のＦ２子孫が得られるこの手順の例示的非限定的説明を図６に示す。そのようなＦ２子孫系を親植物と比較した所望の特徴の改善についてスクリーニングし、そのような改善を示す系を選択する。

【0057】

Ｖ．有用な特徴を付与することができる植物中の改変された染色体座の比較および選択
有用な特徴を付与することができる改変された染色体座をさらに、有用な特徴を示さない参照植物およびＭＳＨ１抑制を受けた親植物または植物細胞から得られた試験植物の適切な比較分析を実施し、改変された座または改変された座を含む植物のいずれかを得ることによって、同定し、選択することができる。さまざまな参照植物および試験植物をそのような比較および選択で使用できることが予想される。ある実施形態において、有用な特徴を示さない参照植物としては：ａ）野生型植物；ｂ）所定の植物系の植物の所定のＦ２個体群内の植物の異なる亜個体群（ここで、Ｆ２個体群は図６で示される方法で得られる任意の適用可能な植物型または異種である）；ｃ）野生型表現型を示すＦ１個体群（ここで、Ｆ１個体群は、図６で示される方法で得られる任意の適用可能な植物型または異種である）；および／または、ｄ）それらの親植物または植物細胞においてＭＳＨ１の抑制の前の試験植物の親植物または親細胞に対して同質遺伝的である植物（すなわち、参照植物は、試験植物を得るために後にＭＳＨ１抑制を受けた植物または植物細胞と同質遺伝的である）のいずれかが挙げられるが、これに限定されるものではない。ある実施形態において、有用な特徴を示す試験植物としては：ａ）有用な特徴を示し、トランス遺伝子媒介ＭＳＨ１抑制を受けた親植物もしくは植物細胞から誘導された任意の非トランスジェニック分離個体、ｂ）有用な特徴を示す所定の植物系の植物の所定のＦ２個体群内の植物の異なる亜個体群（ここで、Ｆ２個体群は図６で示される方法で得られる任意の適用可能な植物型または異種である）；（ｃ）有用な特徴を示す（ａ）もしくは（ｂ）の植物から得られる任意の子孫植物；またはｄ）有用な特徴を示すＭＳＨ１抑制を受けた植物もしくは植物細胞、のいずれかが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0058】

一般的に、これらの比較の目的は、有用な特徴を示す試験植物と有用な特徴を示さない参照植物との低分子ＲＮＡプロフィールおよび／またはある染色体ＤＮＡ座のメチル化における差を特定することである。このように特定された改変された座を次いで単離し、植物において選択して、有用な特徴を示す植物を得ることができる。

【0059】

ある実施形態において、改変された染色体座は、試験植物において上方調節または下方調節される低分子ＲＮＡを特定することによって（参照植物と比較して）特定することができる。この方法は、一つには、改変された染色体座に基づき、ここで、低分子干渉ＲＮＡがＲＮＡ介在性ＤＮＡメチル化（ＲｄＤＭ）による特異的遺伝子標的のメチル化を引き起こす。ＲＮＡ介在性ＤＮＡメチル化（ＲｄＤＭ）法は記載されている（Ｃｈｉｎｎｕｓａｍｙ Ｖ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉ Ｃｈｉｎａ Ｓｅｒ Ｃ−Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． （２００９） ５２（４）： ３３１−３４３）。マイクロアレイに基づく方法（Ｆｒａｎｃｏ−Ｚｏｒｉｌｌａ ｅｔ ａｌ． Ｐｌａｎｔ Ｊ． ２００９ ５９（５）：８４０−５０）、大規模シーケンシングに基づく方法（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２１ ：１０５３−１０６９ （２００９））などを含むが、これらに限定されない任意の適用可能な技術基盤を使用して、試験および参照植物における低分子ＲＮＡを比較することができる。

【0060】

ある実施形態において、改変された染色体座は、座と関連し、試験植物においてメチル化もしくはアシル化されたヒストンタンパク質を特定することによって特定することができる（参照植物と比較して）。メチル化またはアシル化ヒストンと関連する染色体座の分析は、メチル化もしくはアシル化ヒストンを認識する抗体を使用してそれらの座を濃縮し、配列決定することによって達成することができる。Ｈ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ９ａｃ、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３、およびＨ３Ｋ３６ｍｅ３について特異的な抗体を使用することによるヒストンＨ３の特定のリジン残基のメチル化またはアセチル化に関連する染色体領域の同定は記載されている（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２０：２５９−２７６， ２００８； Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２１ ： １０５３−１０６９ （２００９）。

【0061】

ある実施形態において、試験植物（参照植物と比較して）における改変されたメチル化状態を有する染色体領域（ゲノムＤＮＡ）を特定することによって、改変された染色体座を特定することができる。改変されたメチル化状態は、参照植物と比較して、試験植物の１以上の染色体座におけるメチル化の存在または不在のいずれかを含み得る。任意の適用可能な技術基盤を用いて、試験植物および参照植物中の染色体座のメチル化状態を比較することができる。それらのメチル化状態において変化を有する染色体座を特定するために適用可能な技術としては、５−メチルシチジンを認識する抗体を用いたＤＮＡの免疫沈降に基づく方法、メチル化依存性制限エンドヌクレアーゼおよびＭｃｒＢＣ−ＰＣＲ法などのＰＣＲの使用に基づく方法（Ｒａｂｉｎｏｗｉｃｚ， ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． １３： ２６５８−２６６４ ２００３； Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２０：２５９−２７６， ２００８）、亜硫酸水素塩変換ＤＮＡのシーケンシング（Ｆｒｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８９ （５）： １８２７−３１ ；Ｔｏｓｔ ｅｔ ａｌ． ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３５ （１）： １５２−１５６， ２００３）、亜硫酸水素塩処理ＤＮＡのメチル化特異的ＰＣＲ分析（Ｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９３ （１８）： ９８２１−６， １９９６）、大規模シーケンシングに基づく方法（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２１ ： １０５３−１０６９ （２００９））、メチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー伸長法（ＭｓＳｎｕＰＥ； Ｇｏｎｚａｌｇｏ ａｎｄ Ｊｏｎｅｓ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５ （１２）： ２５２９−２５３１ ， １９９７）、蛍光相間分光法（Ｕｍｅｚｕ ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ４１５（２）：１４５−５０， ２０１１）、単分子リアルタイムシーケンシング法（Ｆ１ｕｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ７， ４６１−４６５）、高分解融解分析（Ｗｏｊｄａｃｚ ａｎｄ Ｄｏｂｒｏｖｉｃ （２００７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３５ （６）： ｅ４１）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0062】

ＶＩ．有用な特徴に関連する染色体修飾を植物に導入する
有用な特徴を付与することができるさまざまな染色体修飾を植物中鵜に導入するための方法、ならびに植物、植物部分、およびそれらの植物部分の産物も本明細書中で提供される。ＭＳＨ１の抑制によって誘導された染色体改変および／または染色体突然変異は、本明細書中で記載されるようにして特定することができる。いったん特定されると、染色体改変、染色体突然変異、またはＭＳＨ１の抑制によって誘導される染色体改変および／もしくは染色体突然変異と同じ遺伝的効果を提供するトランス遺伝子を含むが、これらに限定されない染色体修飾を宿主植物に導入して、所望の特徴を示す植物を得ることができる。これに関連して、「同じ遺伝的効果」とは、ＭＳＨ１抑制を受け、有用な特徴を示す植物で観察されるものと類似している１以上の内因性植物遺伝子の発現の増加および／または減少を提供する、導入された染色体修飾を意味する。ＭＳＨ１抑制を受け、遺伝子の発現の減少および有用な特徴の両方を示す植物において内因性遺伝子がメチル化されているある実施形態において、遺伝子の発現の減少および有用な特徴ももたらす他の植物中の染色体修飾が提供される。ＭＳＨ１抑制を受け、その遺伝子の発現の増加および有用な特徴の両方を示す植物において内因性遺伝子が脱メチル化されたある実施形態において、当該遺伝子の発現の増加および当該有用な特徴をもたらす他の植物における染色体修飾が提供される。

【0063】

ある実施形態において、導入される染色体修飾は染色体改変である。メチル化状態の差を含むが、これに限定されない染色体改変は、染色体改変を含む植物を染色体改変のない植物と交配し、そしてＦ１、Ｆ２、または交配の任意の次世代子孫植物における改変の存在について選択することによって導入することができる。さらに別の実施形態において、特定の標的遺伝子における染色体改変を、ＲＮＡ介在性ＤＮＡメチル化によってその遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡまたはヘアピンＲＮＡの発現によって導入することができる（Ｃｈｉｎｎｕｓａｍｙ Ｖ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉ Ｃｈｉｎａ Ｓｅｒ Ｃ−Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． （２００９） ５２（４）： ３３１−３４３； Ｃｉｇａｎ ｅｔ ａｌ． Ｐｌａｎｔ Ｊ ４３ ９２９−９４０， ２００５； Ｈｅｉｌｅｒｓｉｇ ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２７５ ４３７−４４９； Ｍｉｋｉ ａｎｄ Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ， Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ５６（４）：５３９−４９； Ｏｋａｎｏ ｅｔ ａｌ． Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ５３（ｌ）：６５−７７， ２００８）。

【0064】

ある実施形態において、染色体修飾は染色体突然変異である。染色体座の内因性遺伝子の発現の減少または増加をもたらす染色体突然変異としては、遺伝子中のヌクレオチド配列の挿入、欠失、および／または置換を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。染色体突然変異は、ミスセンスコドン、フレームシフト突然変異、中途翻訳停止コドン、プロモータ欠失、ｍＲＮＡプロセッシングなどを妨害する突然変異の導入を含むが、これらに限定されないさまざまなメカニズムによって遺伝子の発現を減少させることができる。遺伝子の発現増加をもたらす染色体突然変異としては、プロモータ置換、遺伝子からの負の調節エレメントの除去などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。染色体突然変異は、植物の特定遺伝子座に、任意の適用可能な方法によって導入することができる。内因性植物染色体座における染色体突然変異の導入のための適用可能な方法としては、相同的２本鎖切断修復（Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｊ． ４４， ６９３， ２００５； Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｊ． ６：９３， ２００８）、非相同的末端結合または非相同的末端結合と相同的組換えとの組み合わせ（Ｐｕｃｈｔａ， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｂｏｔ． ５６， １ ， ２００５； Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｊ． ４４， ６９３， ２００５で概説）、メガヌクレアーゼ誘発性部位特異的２本鎖切断修復（ＷＯ／０６０９７８５３Ａ１、ＷＯ／０６０９７７８４Ａ１、ＷＯ／０４０６７７３６Ａ２、Ｕ．Ｓ．２００７０１１７１２８Ａ１）、および亜鉛フィンガーヌクレアーゼ媒介相同的組換え（ＷＯ０３／０８０８０９、ＷＯ０５／０１４７９１、ＷＯ０７０１４２７５、ＷＯ０８／０２１２０７）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。さらに別の実施形態において、内因性植物染色体座における所望の突然変異は、記載されているように（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２００４， １３５：６３０−６３６）、ＴＩＬＬＩＮＧ技術（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｌｏｃａｌ Ｌｅｓｉｏｎｓ ｉｎ Ｇｅｎｏｍｅｓ）の使用によって特定することができる。

【0065】

他の実施形態において、所望の遺伝的効果を提供する染色体修飾は、トランス遺伝子を含み得る。ドミナントネガティブ突然変異体、阻害的低分子ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、共抑制センスＲＮＡ、および／またはアンチセンスＲＮＡなどを含むが、これらに限定されないさまざまなメカニズムによって遺伝子の発現の減少をもたらすことができるトランス遺伝子。トランス遺伝子による内因性植物遺伝子の抑制を記載する、その開示内容全体が参考として本明細書で援用される米国特許としては、米国特許第７，１０９，３９３号、米国特許第５，２３１，０２０号および米国特許第５，２８３，１８４号（共抑制法）；ならびに米国特許第５，１０７，０６５号および米国特許第５，７５９，８２９号（アンチセンス法）が挙げられる。ある実施形態において、染色体座の内因性遺伝子に対する相補性を有する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子を産生するために特に設計されたトランス遺伝子を使用して、その内因性遺伝子の発現を減少させることができる。そのような実施形態において、ｄｓＲＮＡのセンス鎖配列は、スペーサー配列、好ましくはｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）分子の形成を促進するものによってアンチセンス配列から分離することができる。そのようなスペーサー配列の例としては、Ｗｅｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｊ．， ２７（６）：５８１−９０ （２００１）、およびＨａｍｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｊ．， １５：７３７−７４６ （１９９８）で記載されているものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。内因性植物遺伝子をヘアピンＲＮＡのトランス遺伝子媒介発現で阻害するためのベクターは、それぞれのその開示内容全体が参考として本明細書で援用される、米国特許出願第２００５０１６４３９４号、同第２００５０１６０４９０号、および同第２００４０２３１０１６号で開示されている。

【0066】

染色体座の遺伝子の発現増大をもたらすトランス遺伝子としては、天然のプロモータよりも強力な非相同プロモータと融合した組み換え遺伝子、発現を増大させる、非相同イントロン、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域などのエレメントを含む組み換え遺伝子、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されるものではない。そのようなプロモータ、イントロン、５’非翻訳、３’非翻訳領域、および任意の必要なポリアデニル化領域を、本明細書中で提供される染色体修飾を作成するために有用なトランス遺伝子の一部を含む組み換えＤＮＡ分子中の関心対象のＤＮＡに機能的に連結させることができる。

【0067】

トランス遺伝子の発現に有用な例示的プロモータとしては、ウイルスＣａＭＶ３５ＳおよびＦＭＶ３５Ｓプロモータ（その開示内容全体が参考として本明細書で援用される米国特許第５，３７８，６１９号）、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）１９Ｓプロモータ、米ＡｃｔｌプロモータおよびＦｉｇｗｏｒｔモザイクウイルス（ＦＭＶ）３５Ｓプロモータ（その開示内容全体が参考として本明細書で援用される米国特許第５，４６３，１７５号）の増強または複製バージョンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。トランス遺伝子発現に有用な例示的イントロンとしては、トウモロコシｈｓｐ７０イントロン（その開示内容全体が参考として本明細書で援用される米国特許第５，４２４，４１２号）、米Ａｃｔｌイントロン（ＭｃＥｌｒｏｙ ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， Ｖｏｌ． ２， １６３−１７１）、ＣＡＴ−１イントロン（Ｃａｚｚｏｎｎｅｌｌｉ ａｎｄ Ｖｅｌｔｅｎ， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ ２１：２７１−２８０， Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２００３）、ｐＫＡＮＮＩＢＡＬイントロン（Ｗｅｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｊ． ２００１ ２７（６）：５８１−９０； Ｃｏｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００５， Ｐｌａｎｔ Ｊ ４３： ４４９−４５７）、ＰＩＶ２イントロン（Ｍａｎｋｉｎ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐ． １５（２）： １８６−１９６）および「スーパーユビキチン」イントロン（その開示内容全体が参考として本明細書で援用される米国特許第６，５９６，９２５号；Ｃｏｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００５， Ｐｌａｎｔ Ｊ ４３： ４４９−４５７）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。例示的ポリアデニル化配列としては、アグロバクテリウム腫瘍誘導（Ｔｉ）プラスミドノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）遺伝子およびエンドウ豆ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ Ｅ９遺伝子ポリアデニル化配列が挙げられるが、これに限定されるものではない。

【0068】

ＶＩＩ．ＭＳＨ１抑制植物または改善された特徴もしくは有用な特徴を示す修飾された染色体座を含む植物の異系交配された子孫のスクリーニングおよび選択
本明細書中で提供される方法によって得られる植物系は、さまざまな有用な特徴について、さまざまな技術を使用することによってスクリーニングすることができ、選択することができる。本明細書中で提供される特定の実施形態では、ＭＳＨ１発現が抑制された植物と他の植物との異系交配から得られる個々の子孫植物系を所望の有用な特徴についてスクリーニングし、選択する。

【0069】

ある実施形態において、スクリーンされ、選択される特徴は改善された植物収穫高である。ある実施形態において、そのような収穫高の改善は、非ストレス条件下で１以上の親系と比べた植物系の収穫高における改善である。非ストレス条件は、水、温度、栄養素、鉱物、および光が植物種の栽培に典型的な範囲内に含まれる条件を含む。栽培のそのような典型的な範囲は、不十分でも過剰でもない水、温度、栄養素、鉱物、および／または光の量または値を含む。ある実施形態において、そのような収穫高の改善は、非生物的ストレス条件下で親系（複数可）に対する植物系の収穫高における改善である。そのような非生物的ストレス条件には、水、温度、栄養素、鉱物、および／または光が不十分、過剰いずれかである条件が含まれるが、これに限定されるものではない。非生物的ストレス条件にはしたがって、干ばつストレス、浸透圧ストレス、窒素ストレス、リンストレス、鉱物ストレス、熱ストレス、低温ストレス、および／または光ストレスが含まれるが、これらに限定されるものではない。これに関連して、鉱物ストレスには、不十分または過剰のカリウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、マンガン、銅、亜鉛、ホウ素、アルミニウム、またはケイ素によるストレスが含まれるが、これに限定されるものではない。これに関連して、鉱物ストレスとしては、カドミウム、銅、ニッケル、亜鉛、鉛、およびクロムが含まれるがこれらに限定されない過剰量の重金属によるストレスが挙げられるが、これに限定されない。

【0070】

本明細書中で提供される方法によって得られる植物系における収穫高の改善は、限定されないが、穀粒、リント、葉、茎、または種子を含む湿潤または乾燥バイオマスの直接測定によって特定することができる。収穫高における改善はさらに、限定されないが、１００種子質量、収穫指数、および種子質量を含む収穫高に関連する特徴を測定することによって評価することができる。ある実施形態において、そのような収穫高の改善は、１以上の親系と比べた植物系の収穫高における改善であり、本明細書中で提供される方法によって得られる植物系を親植物と平行して成長させることによって容易に決定することができる。ある実施形態において、試験植物および対照植物のプロットが変異のために再現され、ランダム化され、制御される収穫高における差を決定するための野外実験を用いることができる（Ｇｉｅｓｂｒｅｃｈｔ ＦＧ ａｎｄ Ｇｕｍｐｅｒｔｚ ＭＬ． ２００４． Ｐｌａｎｎｉｎｇ， Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ， ａｎｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ． Ｗｉｌｅｙ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； Ｍｅａｄ， Ｒ． １９９７． Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｔｒｉａｌｓ． Ｉｎ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｖａｒｉｅｔｙ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ， ｅｄｓ． Ｋｅｍｐｔｏｎ ａｎｄ Ｆｏｘ． Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ． Ｌｏｎｄｏｎ．）。比較に適した収穫高データを得るために試験植物（すなわち、本発明の方法で得られる植物）をチェック植物（親または他の対照）で隔てる方法が、限定されないが、Ｃｕｌｌｉｓ， Ｂ． ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｅｎｖ． Ｓｔａｔ．１１ ：３８１−３９３；およびＢｅｓａｇ， Ｊ． ａｎｄ Ｋｅｍｐｔｏｎ， ＲＡ． １９８６． Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ ４２： ２３１−２５１．）のいずれかを含む文献で記載されている。

【0071】

ある実施形態において、スクリーンされ、選択される特徴は、親の系と比べて、生物的植物ストレスに対して改善された耐性である。生物的植物ストレスとしては、植物真菌性病原体、植物細菌性病原体、植物ウイルス性病原体、昆虫、線虫、および草食動物によって課されるストレスが挙げられるが、これらに限定されるものではない。ある実施形態において、アルテルナリア種、アスコキタ種、ボトリティス種；セルコスポラ種、コレトトリカム種、ディアポルテ種、ディプロディア種、エリシフェ種、フサリウム種、ゲウマノミセス種、ヘルミントスポリウム種、マクロフォミナ種、ネクトリア種、ペロノスポラ種、ファコスポラ種、フィアロフォラ種、フォマ種、フィマトトリカム種、フィトフトラ種、プラスモパラ種、プッチニア種、ポドスファエラ種、ピレノフォラ種、ピリクラリア種、ピチウム種、リゾクトニア種、セロチウム種、スクレロチニア種、セプトリア種、チエラビオプシス種、ウンシヌラ種、ベンツリア種、およびバーティシリウム種を含むが、これらに限定されない真菌性病原体に対する耐性を示す植物系のスクリーニングおよび選択が提供される。ある実施形態において、エルウィニア種、シュードモナス種、およびザンタモナス種を含むが、これらに限定されない細菌性病原体に対して耐性を示す植物系のスクリーニングおよび選択が提供される。ある実施形態において、アブラムシおよび他の穿孔性／吸汁性昆虫、たとえばライガス種、鱗翅類昆虫、たとえばアルミゲラ種、ヘリコベルパ種、ヘリオシス種、およびシュードプルシア種、ならびに鞘翅目昆虫、たとえばディアブロチカス種を含むが、これらに限定されない昆虫に対する耐性を示す植物系のスクリーニングおよび選択が提供される。ある実施形態において、メロイドジネ種、ヘテロデラ種、ベロのライムス種、ジチレンカス種、グロボデラ種、ナッコブス種、およびキシフィネマ種を含むが、これらに限定されない線虫に対する耐性を示す植物系のスクリーニングおよび選択が提供される。

【0072】

本明細書中で提供される方法によって得られる他の有用な特徴としては、種子中の油、タンパク質、またはデンプンの組成または量のいずれかにおける改善を含むが、これらに限定されないさまざまな種子品質特性が挙げられる。本明細書中で提供される方法によって得られるさらに他の有用な特徴としては、バイオマス、隠花性、雄性不稔、消化率、種子登熟期間、成熟度（所望により、早期または後期のいずれか）、減少した倒伏、および草高（所望により増加または減少のいずれか）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0073】

前述の特徴のいずれかに加えて、本明細書中で提供される方法によって得られるソルガムの特に有用な特徴としてはさらに：ｉ）農学的特徴（開花期、開花までの日数、開花までの日数（降雨後）、開花までの日数（降雨）；ｉｉ）真菌性疾患耐性（ソルガムべと病耐性（温室）、ソルガムべと病耐性（田畑）、ソルガム穀粒かび、ソルガム葉枯れ病耐性、ソルガムさび病耐性；ｉｉｉ）穀粒に関連する特徴：（穀粒乾燥質量、穀粒数、１平方メートル当たりの穀粒数、穂分の穀粒質量、種子の色、種子の光沢、種子サイズ）；ｉｖ）成長および発育段階に関連する特徴（基底ひこばえ数、収穫までの日数、成熟までの日数、節芽、草高、草高（降雨後））；ｖ）花序解剖学的形態および形態的特徴（脱粒性）；ｖｉ）虫害耐性（ソルガムシュートフライ耐性（降雨後）、ソルガムシュートフライ耐性（降雨）、ソルガム茎食い虫耐性）；ｖｉｉ）葉に関連する特徴（葉の色、主葉脈の色、葉脈の色、止め葉の質量、葉の質量、葉の残余の質量）；ｖｉｉｉ）鉱物およびイオン含有量に関連する特徴（発芽カリウム含有量、発芽ナトリウム含有量）；ｉｘ）穂に関連する特徴（穂の数、穂の稠密度および形状、穂労作、穂収穫指数、穂の長さ、穂の質量、穀粒を除く穂の質量、穂幅）；ｘ）植物化学化合物含有量（植物色素沈着）；ｘｉｉ）小穂解剖学的形態および形態的特徴（苞穎の色、苞穎被覆）；ｘｉｉｉ）茎に関連する特徴（葉質量、茎質量分の茎）；ならびにｘｉｖ）種々の特徴（茎葉関連特徴、代謝エネルギー、窒素消化率、有機物消化率、茎葉乾燥質量）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0074】

実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を証明するために含まれる。以下の実施例で開示されている技術は、本発明の実施において十分機能する本発明者によって発見された技術であり、したがって、その実施のための好ましい様式を構成するとみなすことができることは当業者には理解される。しかしながら、開示され、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく依然として同様の結果を得る特定の実施形態でなすことができる多くの変更を、当業者は本開示を考慮して理解するはずである。

【0075】

実施例１．ＭＳＨ１の抑制をもたらす遺伝子組み換え植物の構築
トマトおよびタバコにおいてＭＳＨ１の抑制をもたらすベクターを次のようにして構築した。ＭＳＨ１タンパク質のアミノ酸配列６５１〜８７０をコード化するセグメントを、プライマー配列ＴＯＭ−ＣＤ１Ｆ（５−ＣＧＣＡＧＧＴＡＴＣＡＣＧＡＧＧＣＡＡＧＴＧＣＴＡＡＧＧ−３；配列番号１１）およびＴＯＭ−ＣＤ１Ｒ（５−ＡＴＣＣＣＣＡＡＡＣＡＧＣＣＡＡＴＴＴＣＧＴＣＣＡＧＧＡＴＣＣＣＣＡＡＡＣＡＧＣＣＡＡＴＴＴＣＧＴＣＣ ＡＧＧ−３；配列番号１２）を使用することによってトマトＥＳＴ配列（配列番号５）から誘導し、イントロン配列を挟んで順方向および逆方向でクローンした。ベースベクターであるｐＵＣＲＮＡｉ−イントロンはシロイヌナズナ小型核リボタンパク質の第２のイントロン（Ａｔ４ｇ０２８４０；配列番号１３）を有する。ＣａＭＶ３５Ｓプロモータおよび転写ターミネーターは、構築およびネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）レポーター遺伝子の発現を調節し、そして挿入物は右縁および左縁組み込み配列に隣接している。アグロバクテリウム・ツメファシエンス株Ｃ５８Ｃｌ／ｐＭＰ９０（２８）を、タバコ（Ｈｏｒｓｃｈ ＲＢ， ｅｔ ａｌ．（１９８５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２７： １２２９−１２３１）およびトマト（ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ ｅｔ ａｌ． １９８６） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ５：８１−８４）での形質転換に使用した。

【0076】

キビおよびソルガムＲＮＡｉ系を同様の手順および材料によって誘導し、形質転換および植物再生はＨｏｗｅ ｅｔ ａｌ．の手順にしたがって実施した（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ２５：７８４−９１， ２００６）。キビのＲＮＡｉベクターはキビＭＳＨ１遺伝子に対するものであり、一方、ソルガムのＲＮＡｉベクターはソルガムＭＳＨ１遺伝子（配列番号６）に対するものであった。ＭＳＨ１Ｃ末端から１５７のアミノ酸をコード化するセグメントを、トウジンビエおよびソルガムの全ｃＤＮＡからプライマー：ｚｍ−ｍｓｆ８（５’−ＧＧＴＴＧＡＧＧＡＧＣＣＴＧＡＡＴＣＴＣＴＧＡＡＧＡＡＣ−３’；配列番号１５）およびｚｍ−ｍｓｒ８（５’−ＣＴＣＧＣＣＡＧＡＧＡＴＴＣＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＧＡＡＧ−３’；配列番号１６）を使用して増幅した。ＰＣＲ産物を、イントロン配列を挟んで順方向と逆方向とにクローンした。シロイヌナズナ小型核リボタンパク質の第２のイントロン（Ａｔ４ｇ０２８４０；配列番号１３）を有するベースベクターであるｐＵＣＲＮＡｉ−イントロンを用いて、Ｈ． Ｃｅｒｕｔｔｉ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｅｂｒａｓｋａ， Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ）によって提供された。ｐＰＺＰ２１２の誘導体であるベクターｐＰＴＮ２９０（Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ． １９９４， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．； ２５（６）：９８９−９４）を使用してＭｓｈｌ−ＲＮＡｉカセットを、その第１イントロンとカップリングしたトウモロコシユビキチン１プロモータの制御下で導入し、その転写はＣａＭＶ３５Ｓターミネーターによって停止させる。ＣａＭＶ３５Ｓプロモータおよびターミネーターは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）レポーター遺伝子の発現を調節し、挿入物は右縁および左縁組み込み配列に隣接している。アグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＮＴＬ４（Ｌｕｏ Ｚ−Ｑ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ｍｏｌ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔ．， １４（１）：９８−１０３）を、トウジンビエ・メインテイナーＴｉｆｔ２３ＤＢＥ１およびソルガムＴｘ４３０系からの胚を播種するために使用した。トウジンビエに使用した詳細な形質転換手順は、ソルガムと同じである（Ｈｏｗｅ ｅｔ ａｌ．， ２００６， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ２５：７８４−９１）。

【0077】

実施例２．ＭＳＨ１抑制の表現型効果
５つの植物種：ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ（Ｌ．） Ｍｅｒｒ）、トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ Ｌ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｌ．）、キビ（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｇｌａｕｃｕｍ （Ｌ．）Ｒ． Ｂｒ．）およびソルガム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ （Ｌ．）Ｍｏｅｎｃｈ）でＲＮＡｉの使用により遺伝子組換えで抑制されたＭＳＨ１発現。いずれの場合にも、細胞質雄性不稔、斑入りの証拠および改変された葉緑体発生、低下成長速度および矮化、改変された開花期または隠花性、増大した分枝、低下フラボノイド生合成およびアントシアニンの欠乏、増大した病原体感受性、ならびに改変された葉形態（図１を参照のこと）をはじめとする類似した変化が観察された。斑入り、矮化、およびミトコンドリアＤＮＡ再配列は、それぞれ図２、３、および４で示されるようにＭＳＨ１抑制を受けた様々な植物でも観察される。生理学的に、植物は、ＡＴＰの減少およびＲＯＳレベルの上昇、ミトコンドリア運動性の低下、マイトファジーの増加、ストレス応答経路の発現、ならびに改変されたサイトカイニンおよびＧＡ代謝（図５中のＲＯＳデータ）を示す。

【0078】

植物種間の顕著な表現型類似点は、ｍｓｈ１に関連する変化の多くがプログラムされた応答であることを示す。転写産物および代謝分析により新たな表現型に関連するいくつかの経路が特定された（第１表）。ソルガムおよびシロイヌナズナ転写産物プロファイリング実験は、低下成長表現型において細胞周期遺伝子の発現減少、改変された開花遺伝子発現（Ｆ１Ｃ）、およびＧＡ異化作用の増強（ＧＡ２０−ｏ×２およびＧＡ２０−ｏ×６）を示す。植物を、ジベレリン酸の適用で成長速度および開花誘導において回復させる。

【0079】

第１表．経路変化において対応を示すシロイヌナズナにおける試料転写産物／代謝プロファイリング結果

【表1】

【0080】

実施例３．暴露後のＴｘ４３０ソルガム系の遺伝的分析および分離によるＭＳＨ１ ＲＮＡｉトランス遺伝子の喪失
非トランスジェニック高矮化、遅延型開花、斑入りＴＸ４３０ソルガム植物を、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によってＭＳＨ１発現を阻害するトランス遺伝子についてヘテロ接合性であった親Ｔｘ４３０ソルガム植物からの子孫植物の分離個体群から得た。Ｔｘ４３０は、ＭＳＨ１発現を阻害するトランス遺伝子を含むトランスジェニックソルガム植物を得るために使用されるもとの遺伝子型であった。この非トランスジェニック、高矮化、遅延型開花、斑入りＴＸ４３０ソルガム植物の、花粉親として同質遺伝型ＴＸ４３０野生型による交配によって、野生型Ｆ１表現型を得、これはもとの矮化、遅延型開花または斑入り表現型の証拠を示さなかった（図６）。本発明者等はＲＮＡｉで誘発される変化はオルガネラであり、表現型の母性伝播を推測していたため、これは意外な結果であった。野生型ゲノムの導入はもとのＲＮＡｉで誘発される効果を中和した。これらのＦ１植物の自家受粉によって誘導されるＦ２個体群は量的変動（Ｖ_Q）と称される表現型の広域分布をもたらし、その一部を第２表に記載する。ＳＡＳ ＰＲＯＣ ＭＩＸＥＤを第２表におけるすべての分析について使用した。各特徴をモデルにおける固定効果で分析し、系中の異質分散を仮定し、推定値の標準誤差とともに評価した。均質分散モデルに対する異質分散モデルのカイ二乗試験を実施した。有意なカイ二乗値は、系分散間の統計的に有意な差を示す。少ない割合（約１／５０植物）は矮化、斑入り表現型を示し、約５０％は起こり得るミトコンドリア遺伝子病変として細胞質雄性不稔を示し（Ｈａｎｓｏｎ ａｎｄ Ｂｅｎｔｏｌｉｌａ， ２００４）、個体群の大部分は、地上の生バイオマス質量および乾燥質量バイオマス、穂の質量、ならびに他の有用な農学的特性において重要な量的変動を示す。これらのデータで特に興味深いのは、いくつかの特徴についていずれかの親より優れた個体群内で観察される能力である。もとの交雑種はＴＸ４３０×ＴＸ４３０（袋をかけた穂で温室内で作成）であるから、多様性の範囲は核遺伝的変異で合理的に説明することができない。

【0081】

第２表．ソルガムにおける表現型変異の評価

【表2】

【0082】

【表3】

【0083】

実施例４．ｍｓｈ１／ｍｓｈ１×ＭＳＨ１／ＭＳＨ１交雑種のシロイヌナズナＭＳＨ１／ＭＳＨ１Ｆ３子孫の分析
これらの実験では、劣性ｍｓｈ１突然変異を分離によって除去した。劣性ｍｓｈ１／ｍｓｈ１コロンビア生態型親をまず花粉供与体としての野生型コロンビア生態型植物と交配して（Ｃｏｌ−０ｍｓｈ１×Ｃｏｌ−０ｗｔ）、ｍｓｈ１／ＭＳＨ１植物のＦ１個体群を得た。Ｆ１子孫を（自家受粉させて、ｍｓｈ１座について分離するＦ２個体群を得る。ＭＳＨ１／ＭＳＨ１Ｆ２子孫は、Ｆ２個体群から選択され、自家受粉させて、選択されたＭＳＨ１／ＭＳＨ１Ｆ２親のＭＳＨ１／ＭＳＨ１Ｆ３子孫を得た。

【0084】

選択されたＦ３ＭＳＨ１／ＭＳＨ１シロイヌナズナ系における表現型変異を評価するために、測定値を第３表に示す野生型Ｃｏｌ−０のそれぞれの４つの植物および選択されたＦ３子孫系から平均した。生バイオマスはすべての地上の葉組織であり、根元直径は根−茎移行帯の直径であり、茎直径は花柄茎の茎であった。２つの植物個体群（すなわちＣｏｌ−０およびＭＳＨ１／ＭＳＨ１Ｆ３）子孫は遺伝的に同一であるはずだが、各パラメータは選択されたＦ３子孫系で２０〜２４％の増加を示した。各群からの植物を発育の同じ段階および同じ葉の枚数（各群の植物あたり平均４８枚の葉）になるように選択した。第３表のデータおよび図７に示される植物は、１つの選択されたＦ３個体群である。他の選択されたＦ３個体群（不図示）は野生型よりも一様に低い平均成長を示した。

【0085】

Ｃｏｌ−０ｍｓｈ１×Ｃｏｌ−０ｗｔ交雑種由来の１つのＭＳＨ１／ＭＳＨ１Ｆ３子孫は、図７および第３表で示される顕著に増加した成長を示した。そのような顕著に増加した成長は、交雑種のＦ３子孫がＣｏｌ−０親生殖質と比べて成長の増加を示す点で雑種強勢と類似している。しかしながら、これらの実験は、雑種強勢が２つの異なる遺伝的バックグラウンドの親系を交配することによって得られる場合と区別することができる。なぜなら、ここで使用される２つの親系はどちらもコロンビア生態型遺伝的バックグラウンドを有し、コロンビア生態型親の１つにおいて劣性ｍｓｈ１突然変異の存在だけが異なっていたからである。

【0086】

第３表．シロイヌナズナにおける表現型変異の評価

【表4】

【0087】

実施例５．ＭＳＨ１抑制ソルガムとの異系交配から得られたＦ２個体群中の個々のソルガム植物における草高、穂の質量、および穀粒収量の変異
図６および実施例３で記載するようなＭＳＨ１抑制を受けた親Ｔｘ４３０ソルガム植物由来のソルガム植物のＦ２個体群を草高（図８）、穂の質量（図９）、および穀粒収量（図１０）における変異について、個体群における個々の植物についての値を比較することによって分析した。

【0088】

Ｆ２個体群内の個々の植物間で重大な変異が観察された。さらに具体的には、あるソルガム系はこれらの特徴に関してＦ２個体群内の植物の特有の二相性分布を示した。たとえば、ソルガム系ＧＡＩＩ−１１のＦ２個体群は、約１０５〜１２５ｃＭの草高の植物の１つの亜個体群と、約１８５〜２１５ｃＭの草高の植物の別の亜個体群とを示した。これらの亜個体群は図８のプロット中の「ピーク」によって表された。亜個体群の同様の分布が、図８プロットにおいてソルガム系ＧＡｌ１−１５、ＧＡｌ１−２８およびＧＡｌ１−２４についても観察される。ＧＡｌ１−１１、ＧＡｌ１−１５、ＧＡｌ１−２８およびＧＡｌ１−２４Ｆ２個体群について、亜個体群の１組は重複していた、または野生型ＴＡ４３０対照草高よりも低い値を有していた。一方、別の亜個体群は野生型ＰＡ４３０対照植物よりも明らかに大きい値を有していた（図８）。ＧＡｌ１−１１、ＧＡｌ１−１５、ＧＡｌ１−２８およびＧＡｌ１−２４Ｆ２個体群における亜個体群および／または個々の植物はさらに、重複していた、または野生型ＴＡ４３０対照草高よりも低い値を有する穂の質量および穀粒収量を示し、一方、他の亜個体群または植物は野生型ＰＡ４３０対照植物よりも明らかに大きな値を有していた（図９および１０）。

【0089】

ソルガム草高、穂の質量、および穀粒収量の差が；ａ）所定のソルガム系のソルガム植物の所定のＦ２個体群内の植物の異なる亜個体群；および／または：ｂ）所定のソルガム系および野生型親対照系のソルガム植物の所定のＦ２個体群内の植物の異なる亜個体群間で観察されると結論づけられる。草高、穂数、および／または穀粒収量において所望の増加を示すソルガム植物のそれらの亜個体群が、それらの染色体ＤＮＡメチル化状態、それらの染色体ＤＮＡ配列、染色体座に関連するヒストンタンパク質の翻訳後修飾、またはそれらの任意の組み合わせにおいてある相違を含む可能性があり、この相違は、そのような有用な特徴に直接寄与する（すなわち、有用な特徴に対して直接的因果関係を有する）、またはそのような所望の特徴に直接寄与する座に対する遺伝的もしくは後成的連結（複数可）のいずれかに関連することがさらに想定される。

【0090】

実施例６．ＭＳＨ１抑制に関連する有用な特徴を示す植物における低分子ＲＮＡプロフィールおよびＤＮＡメチル化状態の特性化
有用な表現型を示さない参照植物および有用な特徴に関連する改変された染色体座を含む試験植物における低分子ＲＮＡプロフィールおよびＤＮＡメチル化状態の比較を用いて、改変された染色体座を特定することができる。さまざまな植物に一般化することができるそのような比較をする方法をこの実施例で提供する。

【0091】

特定の例示的実施形態において：ａ）所定のソルガム系のソルガム植物の所定のＦ２個体群内の植物の異なる亜個体群；および／または：ｂ）所定のソルガム系および野生型親対照系のソルガム植物の所定のＦ２個体群内の植物の異なる亜個体群におけるさまざまな染色体座の低分子ＲＮＡプロフィールおよびＤＮＡメチル化状態を比較する。これらの比較の目的は、有用な特徴を示すソルガム植物と有用な特徴を示さないソルガム植物との低分子ＲＮＡプロフィールおよび／またはある染色体ＤＮＡ座のメチル化における差を特定することである。そのような差を次に使用して、そのような有用な特徴に直接寄与するか、またいずれかの遺伝的連結（複数可）によって結合されるかもしくは後成的メカニズムを介してそのような有用な特徴に直接寄与する座に寄与するｓＲＮＡまたは染色体座を特定することができる。試験されるソルガム植物としては、野生型植物、野生型ＴＡ４３０対照草高と重複するかもしくは低い値を有するかのいずれかの草高、穂の質量、および／または穀粒収量を示すＧＡｌ１−１１、ＧＡｌ１−１５、ＧＡｌ１−２８およびＧＡｌ１−２４または他のソルガム系Ｆ２個体群における異なる亜個体群からの植物および／または個々の植物、ならびに野生型ＴＡ４３０対照植物よりも明らかに大きい草高、穂の質量、および／もしくは穀粒収量を示すＧＡｌ１−１１、ＧＡｌ１−１５、ＧＡｌ１−２８およびＧＡｌ１−２４または他のソルガム系Ｆ２個体群における異なる亜個体群からの植物および／または個々の植物を挙げることができる。そのような植物およびそのような亜個体群を、前記実施例５ならびに図８、９、および１０で例示的に記載する。

【0092】

野生型ソルガム（Ｔｘ４３０）、Ｆ１ソルガム、および異なる亜個体群由来の選択されたＦ２ソルガム植物の低分子ＲＮＡ（ｓＲＮＡ）プロフィールを決定する。調査されるソルガム亜個体群または植物としては、野生型植物、ならびにＧＡｌ１−１１、ＧＡｌ１−１５、ＧＡｌ１−２８およびＧＡｌ１−２４における亜個体群および／または個々の植物または前述の他のソルガムＦ２個体群を挙げることができる。たとえば、ＭＳＨ１抑制を受けるあるソルガム個体群は、重複するか、または野生型ＴＡ４３０対照草高よりも低い値を有する穂の質量および穀粒収量を示す可能性があり、一方、他のソルガム亜個体群または植物は、図９および１０において示すように野生型ＴＡ４３０対照植物よりも明らかに大きい値を有し得、種類を特定するための大規模シーケンシング（定性分析）およびこれらのさまざまな植物系中に存在するｓＲＮＡの相対量（定量分析）に付すことができる。そのような定性分析および定量的分析を次いで使用して、所定の表現型の存在または不在と、所定のｓＲＮＡの存在、不在、または相対的存在量との相関関係を確立することができる。

【0093】

ｓＲＮＡ個体群を特徴づけるための大規模シーケンシング技術を、限定されないが、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ２０１０； ５（１２）： ｅｌ５２２４； ｏｒ Ｇｌａｚｏｖ ｅｔ ａｌ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ２００９ Ｊｕｌ ２７；４（７）：ｅ６３４９によって記載されるものを含む方法によって記載されるようにして決定することができる。ある実施形態において、３つの生物学的複製物を各試料について配列決定することができ、ｓＲＮＡライブラリを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（商標）プロトコルにしたがって製造することができ、配列決定することができる。手短に言えば、低分子量ＲＮＡ（長さ１７〜２７ｎｔ）を全ＲＮＡからサイズ分画で単離することができる。３’および５’アダプタをｓＲＮＡにライゲーションした後、ＲＴ−ＰＣＲを実施して、ｓＲＮＡライブラリを構築する。ライブラリを精製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（商標）プロトコルにしたがって検証し、そしてライブラリのＩｌｌｕｍｉｎａ（商標）に基づく大規模シーケンシングを実施することができる。

【0094】

共通配列（ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、およびｓｎｏＲＮＡ）の除去後、残りのｓＲＮＡ配列をいくつかの分析に付す。最初の分析では、ＭＳＨ１機能の破壊によって改変されたｓＲＮＡ分布を特定するという見込みで、ゲノムにおけるｓＲＮＡの分布を評価する。ゲノムクラスタリングの分析を用いて、ゲノムにおけるｓＲＮＡを生成する座の分布を調べる。ｓＲＮＡクラスターは、各低分子ＲＮＡがＪｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００９）で記載されるその最近接から＜１００ｎｔであるｓＲＮＡの基として定義される。この定義に基づいて、クラスターの両端のｓＲＮＡは、クラスターの外側の２番目に近い低分子ＲＮＡから＞１００ｎｔ離れている（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２００９）。異なる植物系間のｓｉＲＮＡの差次的発現シグニチャーを比較して、破壊されたＭＳＨ１機能との関係を洞察することができる。これは、各植物系由来の各ライブラリにおけるｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの相対的存在量を比較することによって行われる。ＳＡＭｓｅｑ法を使用して、有意なレベルの差次的発現の統計分析を実施することができる。大規模シーケンシング分析において差次的発現パターンを示すいくつかのｓＲＮＡを、ＲＮＡゲルブロット分析を使用する検証のために選択することができる。

【0095】

さまざまな試料におけるＤＮＡメチル化およびｓＲＮＡレベルにおける改変間の関係に関する情報を得るために、ＤＮＡメチル化を含む領域（後述）を、この研究および他の公的に入手可能なデータベースから得られるｓＲＮＡに対してマッピングして、ｓＲＮＡによって潜在的に標的化されるＤＮＡメチル化を含む領域を特定することができる。

【0096】

異なる系から得られたｓＲＮＡおよびＤＮＡメチル化プロフィールを比較して、ＤＮＡメチル化含有量における変化が異なるＭＳＨ−１で誘導される表現型を示すさまざまな植物試料におけるｓＲＮＡ存在量における変化と相関するかどうかを決定することができる。そのような分析における１つの問題は、ｓＲＮＡが検出するには短すぎる可能性があるということである。ｓＲＮＡを、典型的には植物においてはるかに長い転写産物から生成させる。したがって、報告されているように、ＤＮＡメチル化の分析を、ｓＲＮＡを含む染色体座のいずれかの側での５００ｂｐに拡大することができる（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００９）。この分析は、ＤＮＡメチル化がｓＲＮＡによって潜在的に誘導され得るかどうかを示す。そのような研究を使用して、ＭＳＨ１抑制から得られるゲノムメチル化パターニングを改変するｓＲＮＡ個体群における検出可能な変化を特定することができる。そのような研究で特定されるｓＲＮＡおよび／またはゲノム領域のいずれかを、トランスジェニックまたは他のゲノム改変に基づくアプローチを使用して抑制および／または上方調節して、ＭＳＨ１抑制から得られる所望の表現型を得ることができる。

【0097】

さまざまな植物および植物系においてＭＳＨ１抑制によって誘導される有用な表現型と染色体変化との関連性は、全ゲノム亜硫酸水素塩シーケンシング実験におけるメチルＣ検出によっても決定することができる。ゲノム亜硫酸水素塩大規模シーケンシング法（Ｌｉｓｔｅｒ ２００９）を使用して、限定されないが、望ましい表現型または望ましくない表現型を示す植物を含むＭＳＨ１抑制を受けた植物、ならびに限定されないが、ＭＳＨ１抑制を受けていない親系を含む好適な対照植物のゲノムにおけるすべての可能なメチル化シトシンのゲノムの全体像を得ることができる。例示的方法において、約５マイクログラムのゲノムＤＮＡを単離することができ、非メチル化シトシンヌクレオチドのウラシルへの亜硫酸水素塩変換の効率についての内部対照として機能する２５ナノグラムの非メチル化ラムダＤＮＡでスパイクすることができる。ＤＮＡを音波処理して約３００ｂｐの平均的長さにすることができ、ＤＮＡライブラリを構築することができる。末端修復カクテルがｄＣＴＰを含まず、アダプタがメチル化シトシン（Ｉｌｌｕｍｉｎａ（商標））を含む修飾を含むＩｌｌｕｍｉｎａ（商標）Ｐａｉｒｅｄ Ｅｎｄプロトコルにしたがう例示的方法を使用することができる。アダプタにライゲートされたＤＮＡの亜硫酸水素塩変換に続いて、ウラシル非感受性ＰｆｕＴｕｒｂｏＣｘ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（商標））を用いたＰＣＲの限定されたサイクルを行うことができる。ゲル単離された２００〜３００ｂｐ産物をＩｌｌｕｍｉｎａ（商標）ＧＡＩＩ系で１１０塩基の長さに配列化する。標準的Ｉｌｌｕｍｉｎａ（商標）画像分析、ベースコーリングおよびプロセッシングパイプラインを使用して、初期プロセッシング化配列を得る。ある実施形態において、内部Ｉｌｌｕｍｉｎａ（商標）フィルターを通過する配列（純度＞０．６）だけをＦａｓｔＱファイル中にＰＨＲＥＤ様配列品質スコアとともに保存する。低質塩基（ＰＨＲＥＤスコア＜２）の第１Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ １２発生前に配列リードを整える。配列中の任意の残存するシトシン塩基をチミンに変換することができ、これのゲノム位置はメチルＣ包括度ファイルに保管される。ある実施形態において、２つの参照ゲノムを生成させることができる。「ワトソン」鎖に相当する第１参照ゲノムにおいて、シトシンをチミンに変換することができる。クリック鎖に相当する第２のものにおいて、グアニンをアデニンに変換することができる。同じ変換を内部対照ラムダＤＮＡについて実施することができ、これを非メチル化シトシンの変換効率について別の参照ゲノムとして分析する。Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列を２つの参照ゲノムとＢｏｗｔｉｅで整列させる（Ｌａｎｇｍｅａｄ ｅｔ ａｌ．， ２００９）。ある実施形態において、特有の出発位置を有するシーケンシングリードのみを採点する（同じ位置から開始する第２の配列を捨てて、データの特有のＰＣＲ増幅ひずみを最小限に抑える）。ラムダ内部対照について、９９％を超える非メチル化シトシンからチミンへの変換率を予想し、内部ラムダＤＮＡ対照配列を使用して測定される、予備実験および各ライブラリのシングルレーン分析（ライブラリのさらなるシーケンシングの前に）で確認する。亜硫酸水素塩処理されたラムダＤＮＡにおけるシトシンの発生率を配列包括度の関数として計算することができる（各配列リード数を包括度１とみなす）。シーケンシング誤差またはウラシルへの不完全変換によるシトシン発生について＜０．０１のｐ値となるように閾値を確立させる。

【0098】

２つの生物学的複製物を分析されるゲノムの各種類について使用することができる。包括度は各鎖について１０×である可能性がある。これは、個々の変異についてほとんどの位置で個々の生物学的複製物を比較するために十分な包括度でなければならない。２つの個体からの組み合わされた配列データは、異なる遺伝子型試料を比較した場合、各鎖の２０×包括度になるよう組み合わせられる。個々の生物学的複製物を使用して、包括度およびメチル化パーセンテージ閾値を確立して、特定の位置での差について＜０．０５の偽陽性率（ＦＤＲ）を有するようにすることができる。メチルＣ差を示す選択された領域を伝統的な亜硫酸水素塩ＰＣＲクローニング法によって分析して、全ゲノムデータおよびＦＤＲ予測を検証することができる。

【0099】

実施例７．ＭＳＨ１抑制に反応したメチル化および表現型変異の定量分析
ＭＳＨ１ ＲＮＡｉ由来の表現型変異体×野生型を交配することによって誘導されるＦ２個体群で出現する定量的表現型変異を利用することが可能である。ＭＳＨ１抑制を受けたさまざまなソルガム個体群および本明細書中で記載される対照ソルガム植物における遺伝率および量的変動を測定して、有用な特徴を付与する染色体改変を特定することができる。ある実施形態において、これらの方法は、ＳＮＰ発現および検出におけるソルガムショットガンシーケンシング実験によって特定される亜硫酸水素塩由来ＤＮＡ ＳＮＰ多型性の使用の使用を必要とする可能性がある。ソルガムゲノムは約１６２８ｃＭであり、本発明者等は約１ＳＮＰ／１０ｃＭ（センチモルガン）のＳＮＰマーカー密度を目標とする。したがって、ＱＴＬ分析についての１６３Ｍｅ−Ｃ部位が、５つの試料種（すなわち、（１）野生型、（２）大幅に低下した成長速度および遅延型開花を示すトランスジェニックＭＳＨ１ノックダウン植物、（３）改変された成長表現型を保持する非トランスジェニック分離個体、（４）Ｆ１植物（図（６）で示されるとおり、および（５）量的変動を示す選択されたＦ２植物（図６））までの全ゲノム分析におけるそれらの差次的メチル化に基づいて、ソルガムゲノム全体にわたって１０ｃＭの等間隔で選択される。

【0100】

２００のＦ２個体からのＤＮＡを亜硫酸水素塩処理して、その後のＰＣＲ産物においてＣ／ＴのＳＮＰを形成することができる。Ｃ／Ｔ比は各メチル化部位でのＭｅ−Ｃの度数に依存するであろう。Ｃ枯渇配列に対して設計されたＰＣＲプライマーを使用して、亜硫酸水素塩処理されたＤＮＡ中の標的化Ｍｅ−ＣＳＮＰ領域を増幅させる。Ｃ／Ｔ多型を、Ｈｙｂｐｒｏｂｅｓ（商標）（Ｒｏｃｈｅ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ， ＵＳＡ）を使用してＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０ＰＣＲシステムで検出する。Ｈｙｂｐｒｏｂｅｓ（商標）はＰＣＲ産物とハイブリダイズされた隣接プローブ間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）および分別溶融を使用して、Ｍｅ−Ｃ ＳＮＰ位置でのＣ／Ｔ度数を決定する。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）Ｐｒｏｂｅ Ｄｅｓｉｇｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、センサープローブの中央のＣ／Ｔ多型を有するＨｙｂＰｒｏｂｅｓを設計する。ＨｙｂＰｒｏｂｅｓ（商標）に対するハイブリダイゼーションのためのＭｅ−Ｃ鎖の最適非対称ＰＣＲを得るためのＰＣＲプライマー比を各ＳＮＰについて実験的に決定する。

【0101】

遺伝率分析。約２００までまたはそれ以上のＦ３ファミリーをソルガムで発生させることができる。ＤＮＡを各Ｆ２個体から抽出して、各Ｆ３ファミリーを生じさせることができる。Ｆ３ファミリーの再現された野外実験を実施して、ＭＳＨ１ ＲＮＡｉトランス遺伝子の継代効果によって生じる推定的後成的変異の遺伝率分析を実施することができる（すなわち、ＭＳＨ１抑制）。各種について、１本３メートルの列をランダム化完全ブロックデザインに２連で配置する。個体群を実験的田畑で成長させる。

【0102】

ＱＴＬ分析。２００のＦ２個体に関するマーカーデータとともに、表現型データをＱＴＬ分析で使用して、ＭＳＨ１により影響を受けたゲノム領域を、全バイオマスおよび種子収量について観察される変異を生じさせる前世代に入れる。メチル化部位変化に関する分離データを使用して遺伝子マップを構築し、続いて標準的複合区間マッピングを行う。

【0103】

実施例８．エピゲノムを改変して、植物成長における大幅な遺伝的変化を生じさせるためのＭｓｈｌ抑制の使用
Ｍｓｈｌ抑制を使用して、表現型および後成的変異を誘導し、作物種Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ （Ｌ．） Ｍｏｅｎｃｈおよびモデル植物Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ （Ｌ．） Ｈｅｙｎｈにおいて誘導された表現型を選択した。

【0104】

図１１は、シロイヌナズナおよびソルガムの両方についてこの研究で使用したトランス遺伝子および交配法を示す。ソルガムにおいて、全ての実験は近交系Ｔｘ４３０で実施し（Ｆ．Ｒ． Ｍｉｌｌｅｒ， Ｃｒｏｐ Ｓｃｉ． ２４， １２２４， １９８４）、一方、シロイヌナズナ実験は近交系生態型コロンビア−０で実施した。ＭＳＨ１−ＲＮＡｉトランス遺伝子を含まないＭＳＨ１−ｄｒソルガム植物を正常なＭＳＨ１転写産物レベルまで回復させる；それでもなお、それらは自家受粉の数世代にわたって改変された成長表現型を維持する。野生型近交系Ｔｘ４３０系と相互に交配させた場合、子孫は正常な表現型に修復される。ＭＳＨ１−エピＦ１と指定される誘導されるＦ１子孫は、もはや矮化、分げつ、遅延開花表現型を示さない。実際、植物は野生型よりも高く成長し、一般的により多くの種子をつける（図１１Ａ）。ＭＳＨ１−エピＦ１植物の自家受粉は植物表現型が著しく変わり得るＦ２個体群（ＭＳＨ１−エピＦ２）を生じたが、ＭＳＨ１−ｄｒ表現型を示さなかった（図１１Ｂ〜Ｄ）。温室で成長させた−ＭＳＨ１−エピＦ３ファミリーの割合は、約８％の頻度でＭＳＨ１−ｄｒ表現型を示し（第４表）、エピ−Ｆ４系で矮小表現型は現れなかった。

【0105】

第４表．ソルガムＴｘ４３０ＭＳＨ１−ｄｒ×Ｔｘ４３０から誘導され、温室で成長させたエピ−Ｆ３ファミリーにおけるＭＳＨ１−ｄｒ表現型の頻度（８．４％）
誘導されたエピ−Ｆ４ファミリーはＭＳＨ１−ｄｒ表現型の証拠を示さなかった（不図示）。

【0106】

【表5】

【0107】

Ｆ２植物、および自家受粉によって誘導されるその後の個体群は、穂および植物構造、分げつ時間および数、草高および地上のバイオマス、ならびに穂の収穫高成分および種子質量をはじめとする農学的性能特徴について変異を示した（草高および穀粒収量について第５表）。ｍｓｈ１突然変異体と野生型とを交配させ、それに続いてホモ接合性ＭＳＨ１／ＭＳＨ１Ｆ２植物について選択し、連続自家受粉することから誘導されるシロイヌナズナ個体群において、同様に大幅な成長の変化が観察された（図１１Ｆ〜Ｈ）。

【0108】

２０１０および２０１１年に現地条件下で成長させたソルガムＭＳＨ１−エピＦ２、ＭＳＨ１−エピＦ３、およびＭＳＨ１−エピＦ４個体群は、植物成長変化の大規模評価を可能にした（第５表、第６表、第７表）。表現型分布は、２つのソルガム野外実験の結果から明らかになり、ＭＳＨ１−エピＦ２において二峰性に近いパターンを示す（図１２）。すべての特徴は変異の定量的パターンを示した。Ｆ３およびＦ４子孫を現地条件下および温室条件下の両方で試験したところ、植物間で各世代で均一性が増加する草高の遺伝率を示し、穀粒収量をあげるための選択に反応したが、この特徴は温室中での成長の間それほど厳密な選択を受けなかった（図１３）。これらの結果は、観察される変異についての高度の遺伝率および選択応答を示唆する。

【0109】

成長速度、分枝、成熟および開花における変異をはじめとするソルガムＭＳＨ１−ｄｒおよびシロイヌナズナｍｓｈ１突然変異体系における改変された植物発育を、クロロプラスト変化によって調整した（以下の実施例９を参照のこと）。本発明者らは、これらのオルガネラの影響に対するＭＳＨ１−エピＦ２変異の関係の評価に関心があった。ミトコンドリア標的化ＭＳＨ１トランス遺伝子対クロロプラスト−標的化ＭＳＨ１トランス遺伝子をｍｓｈ１突然変異体系に導入することによって誘導されるシロイヌナズナＭＳＨ１半相補性系（Ｙ．−Ｚ． Ｘｕ ｅｔ ａｌ． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２３９：３４２８， ２０１１）は、その現象に対するミトコンドリアの寄与およびクロロプラストの寄与を識別する。ミトコンドリア半相補性系およびクロロプラスト半相補性系の両方を雌性として野生型（Ｃｏｌ−０）と交配して、Ｆ１およびｂＦ２子孫を得た。クロロプラスト相補系との交配から得られるＦ１植物は野生型と類似した表現型をもたらしたが、Ｆ１植物の約２５％は改変された葉萎縮および遅延型開花を示した（図１６）。この萎縮表現型はＭＳＨ１過剰発現の結果である可能性がある。なぜなら、Ｆ１植物は野生型ＭＳＨ１対立遺伝子およびトランス遺伝子の両方を含むからである。表現型は改変されたサリチル酸経路調節の効果、後成的に調節された過程と類似している（Ｔ．Ｌ．Ｓｔｏｋｅｓ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １６， １７１， ２００２）。ミトコンドリア相補系との交雑種からのＦ１子孫は、植物成長において表現型変異を示し、ＭＳＨ１−エピＦ３表現型と同様、３０％を超える植物が成長の増強、より大きなロゼット直径、より太い花柄茎およびより早い開花期を示した（図１４Ａおよび１７；第８表）。これらの結果は、ミトコンドリア対クロロプラスト相補Ｆ２個体群でさらに確認され（図１４Ｂ〜Ｅ）、ＭＳＨ１−エピＦ３が、ＭＳＨ１−ｄｒ発生再プログラミング現象を受けた植物に対してＭＳＨ１機能を回復させることから誘導される成長変化を増強したことを示唆する。

【0110】

どちらもＣｏｌ−０バックグラウンドであるシロイヌナズナ野生型およびＭＳＨ１−エピＦ３植物を、遺伝性ＭＳＨ１由来の表現型を伴う可能性があるメチローム変化の証拠について調査した。実験は、亜硫酸水素ナトリウム処理されたゲノムＤＮＡおよびゲノム規模でのｎｅｘｔ−ｇｅｎ配列分析を使用した（Ｌｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ １３３， ５２３， ２００８）。メチル化変化は広範囲に及び、差次的にメチル化された位置は主にＣｐＧ部位を含み、９１，０００を超える差次的にメチル化された位置が１７００を超える領域にある（第１１表、図１５Ａ）。メチル化変化のパターンは、改変された表現型の観察された遺伝率と一致し、ゲノムの遺伝子コーディング領域における変化の大部分は自然の後成的変異の研究から得られるデータと類似していた（Ｃ． Ｂｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ４８０， ２４５，２０１１； Ｒ．Ｊ． Ｓｃｈｍｉｔｚ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３４， ３６９， ２０１１）。この研究の野生型およびＭＳＨ１−エピＦ３系における非差次的メチル化パターンと、天然のメチル化変異の最近のシロイヌナズナ研究によって報告されているパターン（Ｃ． Ｂｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ４８０， ２４５，２０１１）とを比較することによって、パターンの顕著な対応性（図１５Ｂ、ＭＳＨ１−エピＦ５系２）が示され、２つの研究間でＣｏｌ−０ゲノムメチル化分析の一致が確認された。差次的にメチル化された位置について濃縮された染色体の領域についての２つの研究で顕著な差が明らかであった；図１５Ｃの説明目的で示された天然の変異のＢｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌの分析は、各染色体にわたる差次的メチル化のかなり均一な分布を示し、一方、ＭＳＨ１−エピＦ３系は、ゲノムの独立した領域に集中した差次的メチル化の不規則なパターンを明らかにした（図５Ｂ、赤線）。メチル化において変化を示すいくつかのＤＭＲを、標的化ＰＣＲ増幅および亜硫酸水素塩で処理されたＤＮＡ間隔のシーケンシングによって確認した（図１８、第９表）。これらの結果から、本発明者らはＭＳＨ１破壊を伴う発生的変異が植物のメチル化構造において顕著な変化を含むと推測する。トランス遺伝子からの独立性および多くの発生経路の関与を示すＭＳＨ１−ｄｒ表現型の遺伝的形質パターンはさらに、後成的変化がＭＳＨ１−ｄｒ系で起こることも示す。

【0111】

第５表．ソルガムＦ₂エピ系ファミリーの大部分は、野生型Ｔｘ４３０と比較して草高および穀粒収量における変異（ｐ値＜０．０５）において一貫して統計的に有意な増加を示す。データは２０１０年および２０１１年に現地条件下で成長させた植物から集めた。

【0112】

【表6】

【0113】

第６表．乾燥バイオマスについて測定した５つのソルガムエピ−Ｆ２系ファミリーのうち３つが野生型Ｔｘ４３０と比較して変異において統計的に有意な増加（ｐ値＜０．０５）を示す。データは２０１１年に現地条件下で成長させた植物から集めた。

【0114】

【表7】

【0115】

第７表．野生型Ｔｘ４３０と比較して、草高（３９系のうち３７）および穀粒収量（３９系のうち１１）において多くのエピ−Ｆ４ファミリーに関して有意差（ｐ値＜０．０５）を示すソルガムＦ₄世代データ。データは２０１１年に現地条件下で成長させた植物から集めた。

【0116】

【表8】

【0117】

【表9】

【0118】

第８表．半相補性系×Ｃｏｌ−０野生型の交配によって誘導される個々のシロイヌナズナＦ₂ファミリーからの表現型データの分析。ＳＳＵ−ＭＳＨ１は、ＭＳＨ１のプラスチド−標的化形態で形質転換された系を指す；ＡＯＸ−ＭＳＨ１は、ＭＳＨ１トランス遺伝子のミトコンドリアｌ標的化形態を含む系を指す。半相補性を用いた全ての遺伝実験において、トランス遺伝子の存在は、ＰＣＲに基づくアッセイで裏付けられた。

【0119】

【表10】

【0120】

第９表．シロイヌナズナ野生型Ｃｏｌ−０およびＭＳＨ１−エピＦ３系からの亜硫酸水素塩処理されたＤＮＡのＰＣＲに基づく分析によって誘導される４つのＤＭＲの試料差次的メチル化データ

【表11】

【0121】

【表12】

【0122】

第１０表．研究で使用されるプライマー
亜硫酸水素塩シーケンシングに関して：

【表13】

【0123】

第１１表．シロイヌナズナＣｏｌ−０およびＭＳＨ１−エピＦ３植物におけるゲノム規模での５−メチルシトシン分析

【表14】

【0124】

メチローム変化は結果として得られる個体群において明らかであったが、ＭＳＨ１−ｄｒ選択の野生型との交配から誘導される植物表現型は他の種類の誘導されたメチル化変化から報告されるものと類似していないようであった。シロイヌナズナ ｍｅｔｌ突然変異体を含む交雑種から生じるＥｐｉＲＩＬ個体群は、さまざまな変異表現型を生じさせた（Ｊ． Ｒｅｉｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ２３， ９３９ （２００９）。しかしながら、これら以前の研究は、ＭＳＨ１操作でみられる、増加した活力、著しく大きな植物および茎サイズ、または多くの種子産生を報告していない。

【0125】

実施例で使用する材料および方法は以下に記載するとおりである。

【0126】

植物材料および成長条件
シロイヌナズナＣｏｌ−０およびｍｓｈ１突然変異体系をシロイヌナズナストックセンターから入手し、メトロミックス中１２時間日光を当て、２２℃で成長させた。ＭＳＨ１−エピ系は、ＭＳＨ１−ｄｒ系を野生型植物と交配することによって誘導した。シロイヌナズナ植物バイオマスおよびロゼット直径を４週令植物で測定した。シロイヌナズナ開花期を最初に目に見える花芽が出現した日として測定した。半相補性交雑種に関して、ミトコンドリア１（ＡＯＸ−ＭＳＨ１）およびプラスチド（ＳＳＵ−ＭＳＨ１）相補ホモ接合性系をコロンビア−０野生型植物と交配した。各Ｆ１植物をトランス遺伝子および野生型ＭＳＨ１対立遺伝子について遺伝子型を同定し、別々に収集した。ＡＯＸ−ＭＳＨ１×Ｃｏｌ−０からの３つのＦ２ファミリーおよびＳＳＵ−ＭＳＨ１×Ｃｏｌ−０からの２つのＦ２ファミリーを成長パラメータについて評価した。すべてのファミリーを同じ条件下で成長させ、バイオマス、ロゼット直径および開花期を測定した。両側スチューデントｔ試験を使用してｐ値を算出した。

【0127】

これらの実験で使用されるソルガム生殖質は、Ｔｘ４３０近交系ソルガム系由来であった（Ｍｉｌｌｅｒ， １９８４）。いくつかのＴ３ソルガム同胞種は、温室条件下で成長させ、ＧＡＩＩ１−ＧＡＩＩ３０と指定される単一のＭＳＨ１−ｄｒ植物由来であった。系のそれぞれは、トランス遺伝子ヌルであることが確認された。それらのうちの６つ、ＧＡＩＩ１１、ＧＡＩＩ１５、ＧＡＩＩ２２、ＧＡＩＩ２４、ＧＡＩＩ２５、およびＧＡＩＩ２８を野生型近交系Ｔｘ４３０との交雑種で雌性として使用して、Ｆ１種子を誘導した。３つのさらなる植物、ＧＡＩＩ２２、ＧＡＩＩ２３、およびＧＡＩＩ２７を相反する交雑種において雄性として使用した。温室中の日中温度は７９〜８３°Ｆであり、夜は６９〜７３°Ｆであった。植物を短い（１０時間）日照時間で成長させた。

【0128】

Ｆ１子孫を同じ温室条件下で成長させ、子孫は５〜１９個体のサイズであった。誘導されるＴ４子孫を、Ｆ１を誘導するために用いられる６つの母系ｍｓｈ１−ｄｒ植物（ＧＡＩＩ１１、ＧＡＩＩ１５、ＧＡＩＩ２２、ＧＡＩＩ２４、ＧＡＩＩ２５、およびＧＡＩＩ２８）から成長させ、個体群は１５〜１９個体のサイズであった。全てのＦ１植物の自家受粉種子を個別に収穫して、対応するＦ２ファミリーを誘導した。

【0129】

野外実験
２０１０年および２０１１年の夏の間、Ｆ２ファミリーをリンカーン市ネブラスカ大学のハブロック試験場にて天水条件下、２つの野外実験で成長させた。実験を不完備型ブロックデザインで用意し、２０１０年の実験は１５ブロックからなる１ブロックあたり３０エントリー（３０×１５アルファ格子）の１つの複製から構成されていた。個々の系を列あたり１穂、長さ５ｍ、列間隔０．７５ｍ列間隔の列区画で植え付けた。Ｆ３種子を個々の植物から収穫した。

【0130】

２０１１年の実験は、それぞれ２８エントリーの７ブロック（２８×７アルファ格子）と、追加量１００ｋｇ／ｈａの窒素で施肥した２つの複製を含んでいた。２０１０年の実験からの４８試料を、Ｆ３を構成するように選択した。これらの試料は６のもとの交雑種由来であり、高いＦ２穀粒収量値および低いＦ２穀粒収量値を含んでいた。加えて、Ｆ３試料の温室で成長させた亜群１７を乾燥穂質量に基づいて選択して、Ｆ４種子を誘導した。したがって、２０１１年の野外実験は、それぞれＦ２、Ｆ３およびＦ４世代に対応する４８、７７、および４２エントリーと、対照の野生型Ｔｘ４３０を含んでいた。

【0131】

ソルガム表現型評価
２０１０および２０１１年の野外実験で、記録したソルガム表現型特徴には、草高（ＰＨ）、すなわち地面から穂先まで（ｃｍ）、穂の長さ（ＰＬ）、すなわち穂の基底部から先端まで（ｃｍ）、生穂の質量および乾燥した穂の質量（ＦＰＷおよびＤＰＷ）（ｇ）、生バイオマスおよび乾燥バイオマス収量（ＦＢＹおよびＤＢＹ）（ｇ）、ならびに総穀粒収量（ＮＧＹ）（ｇ）が含まれていた。ＰＨ、ＰＬ、ＦＰＷ、ＤＰＷおよびＮＧＹの試料サイズは、列あたりの列内植物が５から１０までランダムに変化した。自家受粉させるために開花前に健常な形の良い頭部に袋をかけ、生理的成熟後に収穫し、この時にＦＰＷを測定した。試料を８０°Ｆで３０日間乾燥した後、ＤＰＷおよびＮＧＹを測定した。バイオマス試料は３植物試料から構成され、袋に詰め、切断した後秤量して、ＦＢＷを得た。植物はランダムな列内選択であり、ＤＢＷのために試料を１６０°Ｆで１５日間完全に乾燥した。

【0132】

ＲＮＡｉトランス遺伝子のＰＣＲアッセイ
ソルガム材料中のＭＳＨ１−ＲＮＡｉトランス遺伝子の存在についてのＰＣＲアッセイは第Ｓ７表に記載したプライマーを使用した。反応条件は：９５℃で５分、９５℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で２分を３０サイクル；最後の延長期間は７２℃で１０分であった。正の対照および負の対照をそれぞれ確認されたトランスジェニック系および野生型Ｔｘ４３０から含めた。

【0133】

亜硫酸水素塩処理されたゲノムライブラリ構築およびシーケンシング
Ｃｏｌ−０およびエピ−Ｆ３植物から製造したシロイヌナズナゲノムＤＮＡ（約１５ｕｇ）を２００ｂｐ〜６００ｂｐのピーク範囲まで音波処理し、フェノール／クロロホルム精製し、エタノール沈殿させた。音波処理されたＤＮＡ（約１２ｕｇ）をマングビーンヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で処理し、フェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿させた。マングビーンヌクレアーゼ処理されたゲノムＤＮＡ（約３ｕｇ）を末端修復し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｓａｍｐｌｅｓ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）で３’末端アデニル化した。アデニル化ＤＮＡフラグメントを次いでメチル化アダプタ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）にライゲートした。試料を次いでカラム精製し、アガロース中で分画した。２８０ｂｐ〜４００ｂｐのフラクションをＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ）でゲル精製した。さらに３ｕｇのマングビーンヌクレアーゼ処理されたゲノムＤＮＡを使用して、処理を繰り返し、２つのフラクションをプールし、ＭｅｔｈｙｌＥａｓｙ Ｘｃｅｅｄキット（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ Ｐｔｙ Ｌｔｄ， Ｎｏｒｔｈ Ｒｙｄｅ， Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を使用して製造業者の指示にしたがって亜硫酸水素ナトリウム処理に付した。３つの独立ライブラリＰＣＲ濃縮を、インプットテンプレートとして合計３０ｕｌ硫酸水素塩で処理されたＤＮＡから１０ｕｌを用いて実施した。ＰＣＲ反応混合物は１０ｕｌのＤＮＡ、５ｕｌの１０×ｐｆｕＴｕｒｂｏ Ｃｘ緩衝液、０．７ｕｌのＰＥ１．０プライマー、０．７ｕｌのＰＥ２．０プライマー、０．５ｕｌのｄＮＴＰ（２５ｍＭ）、ｌｕｌのＰｆｕＴｕｒｂｏ Ｃｘ Ｈｏｔｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ， ＣＡ）、および合計５０ｕｌにするための水であった。ＰＣＲパラメータは２分間９５０Ｃであり、続いて９５０Ｃで３０秒、６５０Ｃで３０秒および７２０Ｃで１分、次いで７２０Ｃ で５分を１２サイクルであった。ＰＣＲ産物をカラム精製し、各ＰＣＲ反応からの等しい容積を合わせてプールして、１０ｎＭの最終濃度にした。

【0134】

ライブラリは、３つの３６サイクルＴｒｕｅＳｅｑシーケンシングキットｖ５でＩｌｌｕｍｉｎａ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＩＩでＤＮＡ配列決定して、各挿入物の一端からの配列の１１６ヌクレオチドを読み取る（Ｖ８プロトコル）。

【0135】

ＰＣＲ分析のためのＤＮＡの亜硫酸水素塩処理
製造業者の指示にしたがってＭｅｔｈｙｌＥａｓｙ Ｘｃｅｅｄを使用して、シロイヌナズナゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩処理した。第Ｓ７表に記載したプライマーを使用してＰＣＲを実施し、ＰＣＲ産物をクローンし（Ｔｏｐｏ ＴＡクローニングキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＤＮＡ配列決定した。配列アラインメントは、Ｔ−Ｃｏｆｆｅｅ多重配列アラインメントサーバーを使用して実施した（Ｃ Ｎｏｔｒｅｄａｍｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ３０２：２０５−２１７ ， ２０００）。

【0136】

差次的にメチル化されたシトシン（ＤＭＣ）のＤＮＡ配列分析および同定
Ｂｉｓｍａｒｋ（Ｆ Ｋｒｕｅｇｅｒ， ＳＲ Ａｎｄｒｅｗｓ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２７：１５７１−１５７２ （２０１１）を使用してＦａｓｔｑファイルをＴＡＩＲ１０参照ゲノムと整列させ、これを使用して、シトシンのメチル化状態を決定した。リードの最初の５０ヌクレオチドで１つのミスマッチが許容された。Ｂｉｓｍａｒｋはゲノムの位置に対して独自にマッピング可能なリードのみを保持する。

【0137】

少なくとも１つの遺伝子型について少なくとも２つのリードでメチル化として同定され、遺伝子型のそれぞれで少なくとも４回配列決定されたシトシン位置だけをＤＭＣの同定に使用した。これらのシトシン位置に関して、各遺伝子型についてメチル化または非メチル化を示すリードの数を、Ｒを使用して表にした（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）。各位置での差次的メチル化を試験するためにフィッシャーの直接検定を実施した。ゲノム全体にわたる複合試験についての調節を、Ｓｔｏｒｅｙ ａｎｄ Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ （ＪＤ Ｓｔｏｒｅｙ， Ｒ Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １００：９４４０−９４４５ （２００３）で示唆されているようにして実施し、０．０５の偽陽性率（ＦＤＲ）を差次的にメチル化されたシトシンを同定するために使用した。メチローム配列データはＧｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓにアクセッション番号ＧＳＥ３６７８３でアップロードされている。

【0138】

ゲノム構成に対するＤＭＣマッピングおよび差次的にメチル化された領域（ＤＭＲ）の同定
ＴＡＩＲ１０アノテーション（インターネットｆｔｐサイト"ｆｔｐ．ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ／ｈｏｍｅ／ｔａｉｒ／Ｇｅｎｅｓ／ＴＡＩＲ１０＿ｇｅｎｏｍｅ＿ｒｅｌｅａｓｅ／ ＴＡＩＲ１０＿ｇｆｆ３"で入手可能）を使用して、遺伝子コーディング領域、５’−ＵＴＲ、３’−ＵＴＲ、イントロン、偽遺伝子、非コーディングＲＮＡ、転位性因子遺伝子、および遺伝子間領域におけるＤＭＣまたは非特異的メチル化シトシンのカウントを測定した。遺伝子間領域は、任意のアノテーション特性に対応しない領域と定義された。

【0139】

各メチル化構成（ＣｐＧ、ＣＨＧ、ＣＨＨ）に関して、１００−ｂｐの増分で１−ｋｂウィンドウを用いてＤＭＣを多く含む領域についてゲノムをスキャンした。少なくとも４つのＤＭＣを有するウィンドウを保持し、重複するウィンドウを領域中に統合した。少なくとも１０のＤＭＣを有する領域を、領域中で最も遠いＤＭＣまで境界を整えて保持した。次いで領域中の全てのシトシン位でのすべてのメチル化／非メチル化リードカウントを統合することによって、フィッシャーの直接検定を各領域について実施した。すべての試験した領域について調節して、ＦＤＲを０．１に制御する。

【0140】

実施例１０．核酸配列および配列番号のまとめの表
第１２表．配列表で提供されるヌクレオチド配列

【表15】

【0141】

【表16】

【0142】

【表17】

【0143】

【表18】

【0144】

【表19】

【0145】

【0146】

【0147】

【0148】

本発明の原理を示し、記載してきたが、本発明をそのような原理から逸脱することなく、配列および詳細において修飾することができることは、当業者には明らかである。

【0149】

本発明の物質および方法をさまざまな実施形態および実例において記載してきたが、本発明の概念、趣旨および範囲から逸脱することなく、本明細書中に記載された物質および方法にさまざまな変更を加えることができることは、当業者には明らかであろう。当業者に自明のそのような類似の代替物および修飾はすべて、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の趣旨、範囲および概念内に含まれると考えられる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18A】

【図18B】

【図18C】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]