特許 6133837 ＣＤ５４発現レポーターシステムを含む免疫細胞の応用および新規なクローン細胞

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6133837

(24)【登録日】2017年4月28日

(45)【発行日】2017年5月24日

(54)【発明の名称】ＣＤ５４発現レポーターシステムを含む免疫細胞の応用および新規なクローン細胞

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/02 20060101AFI20170515BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20170515BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20170515BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/02ZNA

   C12N5/10

   !C12N15/00 A

【請求項の数】8

【全頁数】22

(21)【出願番号】特願2014-257422(P2014-257422)

(22)【出願日】2014年12月19日

(65)【公開番号】特開2015-119703(P2015-119703A)

(43)【公開日】2015年7月2日

【審査請求日】2014年12月19日

(31)【優先権主張番号】102147888

(32)【優先日】2013年12月24日

(33)【優先権主張国】TW

【微生物の受託番号】DSMZ  DSM ACC3257

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】390023582

【氏名又は名称】財團法人工業技術研究院

【氏名又は名称原語表記】ＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 初志

(74)【代理人】

【識別番号】100102118

【弁理士】

【氏名又は名称】春名 雅夫

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部 俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 利光

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100114889

【弁理士】

【氏名又は名称】五十嵐 義弘

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本 和弥

(72)【発明者】

【氏名】ライ フエイ‐ミン

(72)【発明者】

【氏名】クオ ゾン‐ケン

(72)【発明者】

【氏名】チャン ウェン シェン

(72)【発明者】

【氏名】ツェン シャン‐ウェン

【審査官】 福間 信子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００５−５２７６３７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１０−５３８６２８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００３−５２３２０１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１２／００２５０７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００６−３１１８５８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１０−５０４７４４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Clontech, 2010, pLVX-MetLuc Vector Information, PT4422-5

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）被験物および免疫細胞を準備する工程であって、
前記免疫細胞が、
ＣＤ５４遺伝子のプロモーターと、
前記ＣＤ５４遺伝子のプロモーターに接続して前記ＣＤ５４遺伝子のプロモーターの発現をレポートするレポーター遺伝子と、
を含むＣＤ５４発現レポーターシステムを含んでなる、工程、
（ｂ）前記被験物で前記免疫細胞を処理する工程、ならびに
（ｃ）前記被験物で処理した前記免疫細胞により生成された前記レポーター遺伝子生成物の発現を測定して、前記被験物が皮膚感作物質であるか否かを決定する工程、
を含み、
前記ＣＤ５４遺伝子のプロモーターの配列が配列番号：１の配列を含み、
前記免疫細胞のソースが、ＴＨＰ−１細胞、Ｕ９３７細胞またはＭＵＴＺ−３細胞を含む
皮膚感作物質を確認する方法。

【請求項2】

前記被験物で処理した前記免疫細胞により生成された前記レポーター遺伝子生成物の発現と、前記被験物で処理していない前記免疫細胞の前記レポーター遺伝子生成物の発現とを比較して、前記被験物が皮膚感作物質であるか否かを決定する、請求項１に記載の皮膚感作物質を確認する方法。

【請求項3】

前記被験物で処理した前記免疫細胞により生成された前記レポーター遺伝子生成物の発現が、前記被験物で処理していない前記免疫細胞の前記レポーター遺伝子生成物の発現よりも高い場合に、前記被験物が皮膚感作物質であると決定する、請求項２に記載の皮膚感作物質を確認する方法。

【請求項4】

前記レポーター遺伝子が、メトリディアルシフェラーゼ遺伝子、ホタルルシフェラーゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質遺伝子またはβ−グルクロニダーゼ遺伝子を含む、請求項１に記載の皮膚感作物質を確認する方法。

【請求項5】

前記ＣＤ５４発現レポーターシステムの配列が配列番号：２である、請求項１に記載の皮膚感作物質を確認する方法。

【請求項6】

前記免疫細胞が、２０１３年１２月４日に中華民国食品工業発展研究所生物資源保存および研究センターに受託番号ＢＣＲＣ Ｎｏ.９６０４７５として寄託され、２０１４年１１月１２日にドイツ微生物細胞培養収集機関に受託番号ＤＳＭ ＡＣＣ３２５７として国際寄託されたＴＨＰ−１細胞である、請求項５に記載の皮膚感作物質を確認する方法。

【請求項7】

前記被験物が、化粧品、薬品、化学物質または天然物質の抽出物を含む、請求項１に記載の皮膚感作物質を確認する方法。

【請求項8】

２０１３年１２月４日に中華民国食品工業発展研究所生物資源保存および研究センターに受託番号ＢＣＲＣ Ｎｏ.９６０４７５として寄託され、２０１４年１１月１２日にドイツ微生物細胞培養収集機関に受託番号ＤＳＭ ＡＣＣ３２５７として国際寄託された新規なクローン細胞（ｃｌｏｎｅｄ ｃｅｌｌ）。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明はＣＤ５４発現レポーターシステムを含む免疫細胞の応用に関し、特にこのＣＤ５４発現レポーターシステムを含む免疫細胞を、免疫調節物質の確認に用いる方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ＣＤ５４（分化抗原群５４（Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ５４）（細胞間接着分子−１ (Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ １, ＩＣＡＭ−１)としても知られている）は、ヒトにおいてＩＣＡＭ１遺伝子によりコードされるタンパク質である。この遺伝子は、通常内皮細胞(ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ)および免疫システムの細胞上に発現する表面糖タンパク質（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）をコードする。ＣＤ５４はＣＤ１１ａ／ＣＤ１８或いはＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８のインテグリン(ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ)に結合し、また、ライノウイルス（ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）にレセプター（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）として利用されもする。現在、ＣＤ５４は、免疫反応、特にアレルギー反応のバイオマーカーであることが既に分かっている。

【0003】

免疫反応は、例えば炎症反応、皮膚アレルギーなどの多くの疾病において重要な役割を果たすものである。よって、免疫システムを調節するための薬品が数多く開発されている。しかし、免疫システムが関与する生体分子および細胞の種類は極めて多いことから、動物生体内実験により評価を行う必要があり、これには多大な時間とコストがかかる。現在、免疫反応調節の試験を行うことのできる数多くの細胞実験モデルが存在するものの、分析の際にＥＬＩＳＡまたはフローサイトメーターで実験を行わなくてはならないことが多く、かつ通常の生体実験に比べて複雑である。

【0004】

感作性は、化粧品、各種化学品、農産物、環境毒、工業製品等の発売前の重要な安全性評価項目である。動物実験の倫理的問題およびその減少している傾向を受けて、欧米や日本の各研究機関および関連企業は動物実験に代わる代替的な実験方法の開発に多大なリソースを投じている。しかし、動物実験に代わる代替方式で国際的に公認となっているものは未だ出現していない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

したがって、ハイスループットの試験での使用に適した、動物実験を要さない免疫調節物質または感作物質を確認する新規な方法を開発することが、目下求められている。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明は、（ａ）被験物および免疫細胞を準備する工程であって、免疫細胞が、ＣＤ５４遺伝子のプロモーターと、ＣＤ５４遺伝子のプロモーターに接続してＣＤ５４遺伝子のプロモーターの発現をレポートするレポーター遺伝子と、を含むＣＤ５４発現レポーターシステムを含んでなる、工程、（ｂ）被験物で免疫細胞を処理する工程、ならびに（ｃ）被験物で処理した免疫細胞により生成されたレポーター遺伝子生成物の発現を測定して、被験物が免疫調節作用を有するか否かを決定する工程、を含む免疫調節物質を確認する方法を提供する。

【0007】

本発明はまた、（ａ）被験物および免疫細胞を準備する工程であって、免疫細胞が、ＣＤ５４遺伝子のプロモーターと、ＣＤ５４遺伝子のプロモーターに接続してＣＤ５４遺伝子のプロモーターの発現をレポートするレポーター遺伝子と、を含むＣＤ５４発現レポーターシステムを含んでなる、工程、（ｂ）被験物で免疫細胞を処理する工程、ならびに（ｃ）被験物で処理した免疫細胞により生成されたレポーター遺伝子生成物の発現を測定して、被験物が皮膚感作物質であるか否かを決定する工程、
を含む皮膚感作物質を確認する方法を提供する。

【0008】

本発明はさらに、２０１３年１２月４日に中華民国食品工業発展研究所生物資源保存および研究センター（Bioresource Collection and Research Center：ＢＣＲＣ）に受託番号ＢＣＲＣ Ｎｏ.９６０４７５として寄託した新規なクローン細胞（ｃｌｏｎｅｄ ｃｅｌｌ）を提供する。この細胞はまた、２０１４年１１月１２日に、国際寄託機関であるＤＳＭＺ（名称：ドイツ微生物細胞培養収集機関（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH）、あて名：Inhoffenstr. 7B D-38124 Braunschweig GERMANY）に受託番号：ＤＳＭ ＡＣＣ３２５７として国際寄託されている。

【0009】

以下に、本発明の基本的な諸特徴および種々の態様を列挙する。
〔１〕（ａ）被験物および免疫細胞を準備する工程であって、
前記免疫細胞が、
ＣＤ５４遺伝子のプロモーターと、
前記ＣＤ５４遺伝子のプロモーターに接続して前記ＣＤ５４遺伝子のプロモーターの発現をレポートするレポーター遺伝子と、
を含むＣＤ５４発現レポーターシステムを含んでなる、工程、
（ｂ）前記被験物で前記免疫細胞を処理する工程、ならびに
（ｃ）前記被験物で処理した前記免疫細胞により生成された前記レポーター遺伝子生成物の発現を測定して、前記被験物が免疫調節作用を有するか否かを決定する工程、
を含む、免疫調節物質を確認する方法。
〔２〕工程（ｃ）において、前記被験物で処理した前記免疫細胞により生成された前記レポーター遺伝子生成物の発現と、前記被験物で処理していない前記免疫細胞の前記レポーター遺伝子生成物の発現とを比較して、前記被験物が免疫調節作用を有するか否かを決定する、〔１〕の免疫調節物質を確認する方法。
〔３〕前記被験物で処理した前記免疫細胞により生成された前記レポーター遺伝子生成物の発現が、前記被験物で処理していない前記免疫細胞の前記レポーター遺伝子生成物の発現よりも高い場合に、前記被験物が免疫調節作用を有し、免疫調節物質であると決定する、〔１〕の免疫調節物質を確認する方法。
〔４〕工程（ｂ）が、免疫誘発物質を添加して前記細胞に免疫反応を生じさせる工程をさらに含む、〔１〕の免疫調節物質を確認する方法。
〔５〕工程（ｃ）において、前記被験物および前記免疫誘発物質で処理した前記免疫細胞が生成する前記レポーター遺伝子生成物の発現と、前記免疫誘発物質のみで処理した前記免疫細胞の前記レポーター遺伝子生成物の発現とを比較して、前記被験物が免疫調節作用を有するか否かを決定する、〔４〕の免疫調節物質を確認する方法。
〔６〕前記被験物および前記免疫誘発物質で処理した前記免疫細胞により生成された前記レポーター遺伝子生成物の発現が、前記免疫誘発物質のみで処理した前記免疫細胞の前記レポーター遺伝子生成物の発現よりも低い場合に、前記被験物が免疫抑制作用を有し、免疫抑制物質であると決定する、〔５〕の免疫調節物質を確認する方法。
〔７〕前記免疫誘発物質が、リポ多糖体(ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ, ＬＰＳ)、ホルボールミリスタートアセタート(ｐｈｏｒｂｏｌ ｍｙｒｉｓｔａｔｅ ａｃｅｔａｔｅ, ＰＭＡ)、またはコンカナバリンＡ (ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａ, Ｃｏｎ Ａ)を含む、〔４〕の免疫調節物質を確認する方法。
〔８〕工程（ｃ）において、前記被験物が免疫調節作用を有するか否かの決定は、前記被験物が抗炎症作用を有するか否かを決定することにより前記被験物が抗炎症物質であるか否かを決定することを含む、〔７〕の免疫調節物質を確認する方法。
〔９〕前記免疫細胞のソースが、ＴＨＰ−１細胞、Ｕ９３７細胞またはＭＵＴＺ−３細胞を含む、〔１〕の免疫調節物質を確認する方法。
〔１０〕前記ＣＤ５４遺伝子のプロモーターの配列が配列番号：１の配列を含む、〔１〕の免疫調節物質を確認する方法。
〔１１〕前記レポーター遺伝子が、メトリディアルシフェラーゼ（Ｍｅｔｒｉｄｉａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）遺伝子、ホタルルシフェラーゼ（ｆｉｒｅｆｌｙ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）遺伝子、緑色蛍光タンパク質（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ, ＧＦＰ）遺伝子またはβ−グルクロニダーゼ（β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）遺伝子を含む、〔１〕の免疫調節物質を確認する方法。
〔１２〕前記ＣＤ５４発現レポーターシステムの配列が配列番号：２である、〔１〕の免疫調節物質を確認する方法。
〔１３〕前記免疫細胞が、２０１３年１２月４日に中華民国食品工業発展研究所生物資源保存および研究センターに受託番号ＢＣＲＣ Ｎｏ.９６０４７５として寄託され、２０１４年１１月１２日にドイツ微生物細胞培養収集機関に受託番号ＤＳＭ ＡＣＣ３２５７として国際寄託されたＴＨＰ−１細胞である、〔１２〕の免疫調節物質を確認する方法。
〔１４〕前記被験物が、化粧品、薬品、化学物質または天然物質の抽出物を含む、〔１〕の免疫調節物質を確認する方法。
〔１５〕（ａ）被験物および免疫細胞を準備する工程であって、
前記免疫細胞が、
ＣＤ５４遺伝子のプロモーターと、
前記ＣＤ５４遺伝子のプロモーターに接続して前記ＣＤ５４遺伝子のプロモーターの発現をレポートするレポーター遺伝子と、
を含むＣＤ５４発現レポーターシステムを含んでなる、工程、
（ｂ）前記被験物で前記免疫細胞を処理する工程、ならびに
（ｃ）前記被験物で処理した前記免疫細胞により生成された前記レポーター遺伝子生成物の発現を測定して、前記被験物が皮膚感作物質であるか否かを決定する工程、
を含む、皮膚感作物質を確認する方法。
〔１６〕前記被験物で処理した前記免疫細胞により生成された前記レポーター遺伝子生成物の発現と、前記被験物で処理していない前記免疫細胞の前記レポーター遺伝子生成物の発現とを比較して、前記被験物が皮膚感作物質であるか否かを決定する、〔１５〕の皮膚感作物質を確認する方法。
〔１７〕前記被験物で処理した前記免疫細胞により生成された前記レポーター遺伝子生成物の発現が、前記被験物で処理していない前記免疫細胞の前記レポーター遺伝子生成物の発現よりも高い場合に、前記被験物が皮膚感作物質であると決定する、〔１６〕の皮膚感作物質を確認する方法。
〔１８〕前記免疫細胞のソースが、ＴＨＰ−１細胞、Ｕ９３７細胞またはＭＵＴＺ−３細胞を含む、〔１５〕の皮膚感作物質を確認する方法。
〔１９〕前記ＣＤ５４遺伝子のプロモーターの配列が配列番号：１の配列を含む、〔１５〕の皮膚感作物質を確認する方法。
〔２０〕前記レポーター遺伝子が、メトリディアルシフェラーゼ遺伝子、ホタルルシフェラーゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質遺伝子またはβ−グルクロニダーゼ遺伝子を含む、〔１５〕の皮膚感作物質を確認する方法。
〔２１〕前記ＣＤ５４発現レポーターシステムの配列が配列番号：２である、〔１５〕の皮膚感作物質を確認する方法。
〔２２〕前記免疫細胞が、２０１３年１２月４日に中華民国食品工業発展研究所生物資源保存および研究センターに受託番号ＢＣＲＣ Ｎｏ.９６０４７５として寄託され、２０１４年１１月１２日にドイツ微生物細胞培養収集機関に受託番号ＤＳＭ ＡＣＣ３２５７として国際寄託されたＴＨＰ−１細胞である、〔２１〕の皮膚感作物質を確認する方法。
〔２３〕前記被験物が、化粧品、薬品、化学物質または天然物質の抽出物を含む、〔１５〕の皮膚感作物質を確認する方法。
〔２４〕２０１３年１２月４日に中華民国食品工業発展研究所生物資源保存および研究センターに受託番号ＢＣＲＣ Ｎｏ.９６０４７５として寄託され、２０１４年１１月１２日にドイツ微生物細胞培養収集機関に受託番号ＤＳＭ ＡＣＣ３２５７として国際寄託された新規なクローン細胞（ｃｌｏｎｅｄ ｃｅｌｌ）。

【発明の効果】

【0010】

よって、本発明は、ハイスループットの試験での使用に適した、動物実験を必要としない免疫調節物質または皮膚感作物質を確認する新規な方法を提供し、動物実験に代わる方法を創出した。当該方法は、動物実験の倫理に関する問題およびその減少する傾向に合致している。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】本発明の１実施形態によるＣＤ５４−プロモーターｍＬｕｃ発現系を示している。

【図2】本発明の１実施形態による被験物質が皮膚感作物質であるか否かを決定する流れを示している。

【図3】本発明の１実施形態による被験物質が抗炎症物質であるか否かを決定する流れを示している。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本発明の１実施態様において、本発明は免疫調節物質を確認する方法を提供する。本発明に係る免疫調節物質を確認する方法は、下記の工程を含み得るが、限定はされない。

【0013】

先ず、被験物と、ＣＤ５４発現レポーターシステムを含む免疫細胞と、を準備する。

【0014】

上記被験物の例としては、例えば化粧品、薬品、化学物質、天然物質の抽出物等が挙げられるが、これらに限定されることはない。上記免疫細胞のソースの例としては、ＴＨＰ−１細胞、Ｕ９３７細胞、ＭＵＴＺ−３細胞等が挙げられるが、これらに限定されることはない。１実施形態において、上記免疫細胞のソースはＴＨＰ−１細胞である。

【0015】

上記免疫細胞のＣＤ５４発現レポーターシステムは、限定はされないが、ＣＤ５４遺伝子のプロモーター（ＣＤ５４ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）とレポーター遺伝子（ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ）とを含んでいてよく、このうち上記レポーター遺伝子は上記ＣＤ５４遺伝子のプロモーターに接続しており、ＣＤ５４遺伝子のプロモーターの発現をレポートする。

【0016】

１実施形態において、上記ＣＤ５４遺伝子のプロモーターの配列は、配列番号：１の配列を含み得る。別の実施形態において、上記ＣＤ５４遺伝子のプロモーターの配列は配列番号：１の配列であってよい。

【0017】

さらに、上記レポーター遺伝子の例としては、メトリディアルシフェラーゼ（Ｍｅｔｒｉｄｉａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）遺伝子、ホタルルシフェラーゼ（ｆｉｒｅｆｌｙ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）遺伝子、緑色蛍光タンパク質（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ, ＧＦＰ）遺伝子、β−グルクロニダーゼ（β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）遺伝子等が挙げられるが、これらに限定はされない。１実施形態において、上記レポーター遺伝子はメトリディアルシフェラーゼ遺伝子である。メトリディアルシフェラーゼ遺伝子生成物は細胞によって直接培養液に分泌されるため、その発現（例えば活性）を測定する際に、培地に対し直接ルシフェラーゼアッセイを行うことができ、細胞を破壊する必要がなく、分析時間を短縮できるという利点がある。

【0018】

１実施形態において、上記ＣＤ５４遺伝子のプロモーターの配列は配列番号：１の配列であり、上記免疫細胞のソースはＴＨＰ−１細胞である。別の実施形態では、上記ＣＤ５４遺伝子のプロモーターの配列は配列番号：1の配列であり、上記レポーター遺伝子はメトリディアルシフェラーゼ遺伝子である。また別の実施形態では、上記ＣＤ５４遺伝子のプロモーターの配列は配列番号：1の配列であり、上記免疫細胞のソースはＴＨＰ−１細胞であり、かつ上記レポーター遺伝子はメトリディアルシフェラーゼ遺伝子である。

【0019】

本発明に係る免疫調節物質を確認する方法の１実施形態において、ＣＤ５４遺伝子のプロモーターとレポーター遺伝子とを含む前記ＣＤ５４発現レポーターシステムの配列は、配列番号：２の配列を含み得る。特定の実施形態では、前記ＣＤ５４発現レポーターシステムの配列は配列番号：２の配列であってよく、つまりＣＤ５４発現レポーターシステムは、ＣＤ５４遺伝子のプロモーター−メトリディアルシフェラーゼ遺伝子（ＣＤ５４ ｐｒｏｍｏｔｅｒ− Ｍｅｔｒｉｄｉａ Ｌｕｃ）の形式である。この特定の実施形態で用いるＣＤ５４発現レポーターシステムを含む免疫細胞は、配列番号：２の配列を有するウィルスベクターをＴＨＰ−１細胞に感染させることによって得られる細胞であってよい。この細胞は、ＩＴＲＩ−５４Ｍと命名し、２０１３年１２月４日に財団法人食品工業発展研究所に受託番号ＢＣＲＣ Ｎｏ. ９６０４７５として寄託した細胞（２０１４年１１月１２日にドイツ微生物細胞培養収集機関（ＤＳＭＺ）に受託番号ＤＳＭ ＡＣＣ３２５７として国際寄託した細胞）であり得る。

【0020】

次いで、上記被験物で上記ＣＤ５４発現レポーターシステムを含む免疫細胞を処理する。１実施形態において、処理時間は約１〜２日であるが、これに限定はされない。また、１実施形態において、上記被験物で上記ＣＤ５４発現レポーターシステムを含む免疫細胞を処理する前に、先ず被験物のこの免疫細胞に対する細胞毒性分析を行って、この被験物のこの細胞に対する半数阻害濃度を測定し、これにより処理濃度を得ることができる。

【0021】

次いで、上記被験物で上記ＣＤ５４発現レポーターシステムを含む免疫細胞を処理した後に、上記被験物で処理した上記免疫細胞により生成されたレポーター遺伝子生成物の発現を測定して、上記被験物が免疫調節作用を有するか否かを決定する。

【0022】

本発明に係る免疫調節物質を確認する方法の１実施形態において、上記被験物で処理した免疫細胞により生成されたレポーター遺伝子生成物の発現を測定して上記被験物が免疫調節作用を有するか否かを決定する工程では、被験物で処理した免疫細胞により生成されたレポーター遺伝子生成物の発現と、被験物で処理していない上記免疫細胞のレポーター遺伝子生成物の発現とを比較して、被験物が免疫調節作用を有するか否かを決定する。被験物で処理した免疫細胞により生成されたレポーター遺伝子生成物の発現が、被験物で処理していない免疫細胞のレポーター遺伝子生成物の発現よりも高い場合、その被験物は免疫調節作用を有し、免疫調節物質であると決定する。

【0023】

本発明に係る免疫調節物質を確認する方法の別の１実施形態において、被験物でＣＤ５４発現レポーターシステムを含む免疫細胞を処理する工程は、免疫誘発物質を添加して免疫細胞に免疫反応を生じさせる工程をさらに含む。この実施形態において、被験物で処理した免疫細胞により生成されたレポーター遺伝子生成物の発現を測定して上記被験物が免疫調節作用を有するか否かを決定する工程では、被験物および免疫誘発物質で処理した免疫細胞により生成されたレポーター遺伝子生成物の発現と、免疫誘発物質のみで処理した免疫細胞のレポーター遺伝子生成物の発現とを比較して、被験物が免疫調節作用を有するか否かを決定する。被験物および免疫誘発物質で処理した免疫細胞により生成されたレポーター遺伝子生成物の発現が、免疫誘発物質のみで処理した免疫細胞のレポーター遺伝子生成物の発現よりも低い場合、その被験物は免疫抑制作用を有し、免疫抑制物質であると決定する。

【0024】

上記免疫反応誘発物質としては、限定はされないが、例えばリポ多糖体(ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ, ＬＰＳ)、ホルボールミリスタートアセタート(ｐｈｏｒｂｏｌ ｍｙｒｉｓｔａｔｅ ａｃｅｔａｔｅ, ＰＭＡ)、コンカナバリンＡ (ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａ, Ｃｏｎ Ａ)等のような、免疫反応を引き起こし得るあらゆる物質が挙げられる。

【0025】

１実施形態において、本発明に係る免疫調節物質を確認する方法で使用される免疫反応誘発物質は、リポ多糖体、ホルボールミリスタートアセタートまたはコンカナバリンＡであってよく、それらは炎症起因物質である。

【0026】

上記実施形態では、被験物で処理した免疫細胞により生成されたレポーター遺伝子生成物の発現を測定して上記被験物が免疫調節作用を有するか否かを決定する工程において、被験物が免疫調節作用を有するか否かの決定は、被験物が抗炎症作用を有するか否かを決定することによりその被験物が抗炎症物質であるか否かを決定することを含み得る。

【0027】

上記免疫細胞により生成されたレポーター遺伝子生成物の発現を測定する方式は、レポーター遺伝子生成物の性質を基に決定する（例えばその活性を測定することができる）。それぞれ異なるレポーター遺伝子生成物の発現の測定方式は、当業者には良く知られているものである。例えば、メトリディアルシフェラーゼ遺伝子生成物は、細胞によって直接培養液に分泌されるため、細胞を培養している培地に直接ルシフェラーゼアッセイを行ってメトリディアルシフェラーゼ遺伝子生成物の発現を測定することができる。

【0028】

本発明の別の実施態様において、本発明はさらに皮膚感作物質を確認する方法を提供する。本発明に係る皮膚感作物質を確認する方法は、下記の工程を含んでいてよいが、これらに限定はされない。

【0029】

被験物と、ＣＤ５４発現レポーターシステムを含む免疫細胞とを準備する工程。

【0030】

被験物は任意の物質であってよく、特に限定はない。上記の被験物の例としては、例えば化粧品、薬品、化学物質、天然物質の抽出物等が挙げられるが、これらに限定されることはない。上記免疫細胞のソースの例としては、ＴＨＰ−１細胞、Ｕ９３７細胞、ＭＵＴＺ−３細胞等が挙げられるが、これらに限定されることはない。１実施形態において、上記免疫細胞のソースはＴＨＰ−１細胞である。

【0031】

また、上記免疫細胞に含まれるＣＤ５４発現レポーターシステムは、限定はされないが、ＣＤ５４遺伝子のプロモーターとレポーター遺伝子とを含んでいてよく、このうち上記レポーター遺伝子は上記ＣＤ５４遺伝子のプロモーターに接続しており、ＣＤ５４遺伝子のプロモーターの発現をレポートする。

【0032】

１実施形態において、上記ＣＤ５４遺伝子のプロモーターの配列は、配列番号：１の配列を含み得る。別の実施形態において、上記ＣＤ５４遺伝子のプロモーターの配列は配列番号：１の配列であってよい。

【0033】

上述した本発明に係る免疫調節物質を確認する方法で用いたレポーター遺伝子に類似して、本発明に係る皮膚感作物質を確認する方法におけるレポーター遺伝子の例としては、メトリディアルシフェラーゼ遺伝子、ホタルルシフェラーゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子等が挙げられるが、これらに限定はされない。１実施形態において、上記レポーター遺伝子はメトリディアルシフェラーゼ遺伝子である。メトリディアルシフェラーゼ遺伝子生成物は、細胞によって直接培養液に分泌されるため、その発現（例えば活性）を測定する際に、培地に直接ルシフェラーゼアッセイを行うことができ、細胞を破壊する必要がなく、分析時間を短縮できるという利点がある。

【0034】

１実施形態において、上記ＣＤ５４遺伝子のプロモーターの配列は配列番号：１の配列であり、上記免疫細胞のソースはＴＨＰ−１細胞である。別の実施形態では、上記ＣＤ５４遺伝子のプロモーターの配列は配列番号：１の配列であり、上記レポーター遺伝子はメトリディアルシフェラーゼ遺伝子である。また別の実施形態では、上記ＣＤ５４遺伝子のプロモーターの配列は配列番号：1の配列であり、上記免疫細胞のソースはＴＨＰ−１細胞であり、かつ上記レポーター遺伝子はメトリディアルシフェラーゼ遺伝子である。

【0035】

本発明に係る皮膚感作物質を確認する方法の１実施形態において、ＣＤ５４遺伝子のプロモーターとレポーター遺伝子とを含む前記ＣＤ５４発現レポーターシステムの配列は、配列番号：２の配列を含み得る。特定の実施形態では、前記ＣＤ５４発現レポーターシステムの配列は配列番号：２の配列であってよい、つまりＣＤ５４発現レポーターシステムは、ＣＤ５４遺伝子のプロモーター−メトリディアルシフェラーゼ遺伝子（ＣＤ５４ ｐｒｏｍｏｔｅｒ− Ｍｅｔｒｉｄｉａ Ｌｕｃ）の形式である。この特定の実施形態において用いるＣＤ５４発現レポーターシステムを含む免疫細胞は、配列番号：２の配列を有するウィルスベクターをＴＨＰ−１細胞に感染させることによって得られる細胞であってよい。この細胞は、ＩＴＲＩ−５４Ｍと命名し、２０１３年１２月４日に財団法人食品工業発展研究所に受託番号ＢＣＲＣ Ｎｏ. ９６０４７５として寄託した細胞（２０１４年１１月１２日にドイツ微生物細胞培養収集機関（ＤＳＭＺ）に受託番号ＤＳＭ ＡＣＣ３２５７として国際寄託した細胞）であり得る。

【0036】

次いで、上記被験物で上記ＣＤ５４発現レポーターシステムを含む免疫細胞を処理する。１実施形態において、処理時間は約１〜２日であるが、これに限定はされない。

【0037】

また、１実施形態において、上記被験物で上記ＣＤ５４発現レポーターシステムを含む免疫細胞を処理する前に、先ず被験物のこの免疫細胞に対する細胞毒性分析を行って、この被験物のこの細胞に対する半数阻害濃度を測定し、これにより処理濃度を得ることができる。

【0038】

最後に、上記被験物で上記ＣＤ５４発現レポーターシステムを含む免疫細胞を処理した後に、上記被験物で処理した上記免疫細胞により生成されたレポーター遺伝子生成物の発現を測定して、上記被験物が皮膚感作物質であるか否かを決定する。

【0039】

１実施形態において、上記被験物で処理した上記免疫細胞により生成されたレポーター遺伝子生成物の発現を測定して上記被験物が皮膚感作物質であるか否かを決定する工程では、上記被験物で処理した上記免疫細胞により生成されたレポーター遺伝子生成物の発現と、上記被験物で処理していない免疫細胞のレポーター遺伝子生成物の発現とを比較して、上記被験物が免疫調節作用を有するか否かを決定する。被験物で処理した免疫細胞により生成されたレポーター遺伝子生成物の発現が、被験物で処理していない免疫細胞のレポーター遺伝子生成物の発現よりも高い場合、その被験物は皮膚感作物質であると決定する。

【0040】

上記免疫細胞により生成されたレポーター遺伝子生成物の発現を測定する方式は、レポーター遺伝子生成物の性質を基に決定する（例えばその活性を測定することができる）。それぞれ異なるレポーター遺伝子生成物の発現の測定方式は、当業者には良く知られているものである。例えば、メトリディアルシフェラーゼ遺伝子生成物は、細胞によって直接、培養液に分泌されるため、細胞を培養している培地に直接ルシフェラーゼアッセイを行ってメトリディアルシフェラーゼ遺伝子生成物の発現を測定することができる。

【0041】

また、本発明の別の１実施態様において、本発明はさらに、ＩＴＲＩ−５４Ｍと命名し、２０１３年１２月４日に財団法人食品工業発展研究所に受託番号ＢＣＲＣ Ｎｏ. ９６０４７５として寄託した新規なクローン細胞（ｃｌｏｎｅｄ ｃｅｌｌ）を提供する。この細胞はまた、国際寄託機関であるドイツ微生物細胞培養収集機関（ＤＳＭＺ）に国際寄託されている（寄託日：２０１４年１１月１２日、受託番号：ＤＳＭ ＡＣＣ３２５７）。

【0042】

この細胞は、ＣＤ５４遺伝子のプロモーター−メトリディアルシフェラーゼ遺伝子（ＣＤ５４ ｐｒｏｍｏｔｅｒ− Ｍｅｔｒｉｄｉａ Ｌｕｃ）の形式のＣＤ５４発現レポーターシステムを有し、ＣＤ５４発現レポーターシステムの配列は配列番号：２の配列である。

【実施例】

【0043】

実施例1
ＩＴＲＩ−５４Ｍ細胞の構築
ＬＶＸ−ＭｅｔＬｕｃ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社製、 ＰＴ４４２２−５)プラスミドの取扱説明書に従って、ＬＶＸ−ＭｅｔＬｕｃプラスミドを制限酵素ＢｓｔＢ ＩおよびＢａｍＨ Ｉで処理して、ＣＤ５４プロモーター配列（配列番号：１）をＬＶＸ−ＭｅｔＬｕｃプラスミド中にクローニングさせることにより、ＣＤ５４−ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｍＬｕｃ発現系（図１）を作製した。この発現系において、ＣＤ５４プロモーター−ｍＬｕｃの配列は配列番号：２の配列である。次いで、作製されたＣＤ５４−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｍＬｕｃ発現系を、Ｌｅｎｔｉ−Ｘ（登録商標）Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｌｏｗ（登録商標）Ｓｅｃｒｅｔｅｄ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ (Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社製、６３１７４６)を用い、２９３ＦＴ細胞中にトランスフェクションして、ＣＤ５４-ｍＬｕｃを有するＬｅｎｔｉｖｉｒｕｓを生成した。次に、このウィルスをＴＨＰ−１細胞に感染させた。ＴＨＰ−１細胞はＴＨＰ−１培地で培養した。その成分は、１０％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ社製、１０４３７)、４．５ｇ／Ｌ グルコース（Ｓｉｇｍａ社製、Ｇ７０２１)、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ(Ｓｉｇｍａ社製、Ｈ４０３４)、１×ペニシリンおよびストレプトマイシン (Ｂｉｏｗｅｓｔ社製、Ｌ００２２)、１ｍＭピルビン酸ナトリウム(ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅ) (Ｂｉｏｗｅｓｔ社製、Ｌ０６４２)、０．０５ｍＭ ２−メルカプトエタノール（２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ, ２−ＭＥ） (ＧＩＢＣＯ社製、２１９８５−０２３)を含んでなるＲＰＭＩ培地(ＧＩＢＣＯ社製、３１８００)であった。

【0044】

次いで、０．５〜１μｇ/ｍＬのピューロマイシン(Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社製、ａｎｔ−ｐｒ−１)でＴＨＰ−１細胞のスクリーニングを行った。２週間スクリーニングをした後、細胞を含んだ培地１００μＬ（濃度：細胞５個/ｍＬ）を９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、ＣＯＳＴＡＲ、３５９９）に加え、細胞数が増加したら、２４ウェルプレート(Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、ＣＯＳＴＡＲ、３５１６)、６ウェルプレート(Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、ＣＯＳＴＡＲ、３５２４)およびＴ２５フラスコ(Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、ＣＯＳＴＡＲ、４３０６３９) を順次用いて細胞を増幅させた。そして、各細胞株を、既知の感作物質(ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ)である１−クロロ−２,４−ジニトロベンゼン(１−ｃｈｌｏｒｏ−２,４−ｄｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅ, ＤＮＣＢ)と、非感作物質(ｎｏｎ−ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ) であるヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド(ｈｅｘａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ, ＣＴＡＢ)とを用いて試験し、反応の最も良い細胞株を選んで、ＩＴＲＩ−５４Ｍと命名し、２０１３年１２月４日に中華民国食品工業発展研究所生物資源保存および研究センターに受託番号ＢＣＲＣ Ｎｏ.９６０４７５として寄託した。この細胞はまた、国際寄託機関であるドイツ微生物細胞培養収集機関（ＤＳＭＺ）に国際寄託されている（寄託日：２０１４年１１月１２日、受託番号：ＤＳＭ ＡＣＣ３２５７）。

【0045】

実施例２
被験物質が皮膚感作物（または免疫調節物質）であるか否かの決定
本実験における被験物質が皮膚感作物であるか否かの決定の流れは図２に示すとおりである。図２と共に以下の詳細な工程の説明を参照されたい。

【0046】

１.被験物のＩＴＲＩ−５４Ｍ細胞に対する毒性試験
ＩＴＲＩ−５４Ｍ細胞はＴＨＰ−１培地で培養した。その成分は、１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ社製、１０４３７)、４．５ｇ/Ｌ グルコース（Ｓｉｇｍａ社製、Ｇ７０２１)、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ(Ｓｉｇｍａ社製、Ｈ４０３４)、１×ペニシリンおよびストレプトマイシン (Ｂｉｏｗｅｓｔ社製、Ｌ００２２)、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム (Ｂｉｏｗｅｓｔ社製、Ｌ０６４２)、０．０５ｍＭ ２−メルカプトエタノール(ＧＩＢＣＯ社製、２１９８５−０２３)、ならびに０．５μｇ／ｍＬピューロマイシンを含んでなるＲＰＭＩ培地(ＧＩＢＣＯ社製、３１８００)であった。

【0047】

表１に挙げた感作性があることが既知である参考化学物質サンプル、または表２に挙げた化粧品によく用いられるハーブ抽出物を、適した溶媒（ＤＭＳＯまたは２−ＭＥを含まないＴＨＰ−１培地）で溶解し、溶解後にそれをストック溶液(ｓｔｏｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎ)とした。次いで、ストック溶液を６〜８回、３倍連続希釈して、異なる希釈倍率のワーキング溶液(ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ)を作った。

【0048】

【表1】

【0049】

【表2】

【0050】

次いで、細胞毒性試験を行った(工程１０１)。１０μＬ／ウェルのワーキング溶液を９６ウェルプレートに添加した。次に、ＩＴＲＩ−５４Ｍ細胞を、２−ＭＥおよびピューロマイシンを含まないＴＨＰ−１培地中に懸濁させてから、細胞５×１０^４個／９０μＬ／ウェルの密度で上記９６ウェル細胞培養プレートに接種した。続いて、培養プレートをインキュベーター(ＮＵＡＩＲ社製、ｎｕ−５５１０)内に置き１日培養した。なお、被験物がＤＭＳＯ中に溶解している場合、最終的な被験物と細胞の接触時の培地中のＤＭＳＯ濃度を０．２％に制御する必要がある点に注意すべきである。

【0051】

次いで、１０μＬの５ｍｇ/ｍＬ ＭＴＴの培地を培養プレート中に加え、ＣＯ_２インキュベーターに入れて２時間培養してから、１００μＬの１０％ＳＤＳを培養プレートに加え、一晩静置した。そして、紫色の沈殿を溶解させ、連続波長マイクロプレートリーダーシステム(Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製、ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ ５)で波長５６０ｎｍにおける細胞の吸光値を測定した。

【0052】

対照群の平均吸光値を１００％の細胞生存率(％)とし、各種異なる濃度のサンプルを加えた実験群の細胞生存率（％）を算出した。細胞生存率の計算式は、（実験群吸光値／対照群吸光値）×１００％である。さらに各濃度の被験物の細胞増殖阻害率を算出した。細胞増殖阻害率の計算式は１−細胞生存率である。

【0053】

次いで、各実験群の細胞増殖阻害率でｘｙ散布図を作成し、ソフトウェアＧｒａｆｉｔを用いてＩＣ_５０の式により各被験物の５０％細胞増殖阻害のサンプル濃度(ＣＣ_５０)を求めた（工程１０３）。

【0054】

薬品がＭＴＴの色の判断に影響する場合は、Ｃｅｌｌ−Ｇｌｏ ｋｉｔを用いて細胞毒性試験を行った。その工程は以下のとおりである。

【0055】

細胞液３５μＬを、ルミネッセンス用の９６ウェルホワイトプレートに加えてから、その９６ウェルホワイトプレートにＣｅｌｌ−Ｇｌｏ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、Ｇ７５７１) ３５μＬを加え、振とう器に置いて１０分間振とうした。次いで、その９６ウェルホワイトプレート中に基質を加えたら、直ちにマイクロプレートルミノメーター(Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社製、ＭＰＬ４)で細胞が発したルミネッセンス強度(Ｒｌｕ/ｓ)を測定し、その回の実験の各濃度の被験物の細胞毒性基準値とした。

【0056】

細胞生存率の計算式は、（実験群ルミネッセンス値／対照群ルミネッセンス値）×１００％である。さらに、各濃度の被験物の細胞増殖阻害率を算出した。細胞増殖阻害率の計算式は、(１−細胞生存率)である。

【0057】

各実験群の細胞増殖阻害率でｘｙ散布図を作成し、ソフトウェアＧｒａｆｉｔを用いてＩＣ_５０の式により各被験物の５０％細胞増殖阻害濃度(ＣＣ_５０)を求めた。

【0058】

後続の実験では、各被験物のＣＣ_５０±２５％を、ＩＴＲＩ−５４Ｍ細胞のｍＬｕｃルシフェラーゼ活性の基準試験開始濃度として選んだ。

【0059】

１回目の実験で精確なＣＣ_５０を測定できなかった場合、実験結果を参考に、被験物濃度および希釈倍率を変えた。これにより最適な傾向線を得て、ＣＣ_５０を求めた。

【0060】

測定して得られた各被験物の５０％細胞増殖阻害の濃度は表３に示すとおりである。

【0061】

【表3】

【0062】

２.被験物のＩＴＲＩ−５４Ｍ細胞のｍ−Ｌｕｃ活性に対する影響の試験
上述により得られた各被験物のＣＣ_５０に基づき、各被験物の試験開始濃度を選択し（約ＣＣ_５０±２５％濃度であるが、精確なＣＣ_５０を得ることができない場合は、被験物の最大溶解可能濃度または最終濃度４０００μＭで試験を行う）、この濃度で被験物のストック溶液を調製した。次いで、その被験物のストック溶液を１．４倍で２回連続希釈して、別の２つの濃度のワーキング溶液を作り、合わせて３つの濃度の溶液を得た（工程１０５）。

【0063】

１０μＬ／ウェルのワーキング溶液を９６ウェルプレートに加えた。次に、ＩＴＲＩ−５４Ｍ細胞を２−ＭＥおよびピューロマイシンを含まないＴＨＰ−１培地中に懸濁させてから、細胞５×１０^４個／９０μＬ／ウェルの密度で上記９６ウェル細胞培養プレートに接種した。続いて、培養プレートをインキュベーター(ＮＵＡＩＲ社製、ｎｕ−５５１０)内に置き１日培養した。５０ｎｇ/ｍＬのリポ多糖体(ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ, ＬＰＳ)を陽性対照(ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ)とした。なお、被験物がＤＭＳＯ中に溶解している場合、最終的な被験物と細胞の接触時の培地中のＤＭＳＯ濃度を０．２％に制御する必要がある点に注意すべきである。

【0064】

次いで、上記培養プレートから細胞液を１０μＬ取り出し、ルミネッセンス用の９６ウェルホワイトプレートに加えた。そのホワイトプレートに、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ試薬(ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ社製、ＳＰＧＡ−Ｇ１００) ４０μＬを加えたら、直ちにマイクロプレートルミノメーター(Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社製、ＭＰＬ４)で細胞のルミネッセンス強度(Ｒｌｕ/ｓ)を測定した。（工程１０７）。

【0065】

対照群のルミネッセンス強度を基準として、各サンプル実験群のＣＤ５４プロモーター活性を促進する誘導率(ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ)を算出した。誘導率の計算式は、（実験群のルミネッセンス値／対照群のルミネッセンス値）である。ある被験物がｍＬｕｃ発現を促進しているという結果が出た場合、その被験物は感作物質であると決定した（工程１０９（工程１０９Ａおよび工程１０９Ｂを含む））。上記各被験物について測定されたＣＤ５４プロモーター活性を促進する誘導率の結果が表４に示されており、各被験物が感作物質であるかを決定した結果が表５に示されている。

【0066】

【表4】

【0067】

【表5】

【0068】

また、細胞液３５μＬを、ルミネッセンス用の９６ウェルホワイトプレートに加えてから、その９６ウェルホワイトプレートにＣｅｌｌ−Ｇｌｏ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製Ｇ７５７１) ３５μＬを加え、振とう器に置いて１０分間振とうした。次いで、その９６ウェルホワイトプレート中に基質を加えたら、直ちにマイクロプレートルミノメーター(Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社製、ＭＰＬ４)で細胞が発したルミネッセンス強度(Ｒｌｕ/ｓ)を測定し、その回の実験の各濃度の被験物の細胞毒性基準値とした。細胞生存率の計算式は、（実験群のルミネッセンス値／対照群のルミネッセンス値）×１００％である。

【0069】

実施例３
被験物質が抗炎症物質（または免疫調節物質）であるか否かの決定
本実験における被験物が抗炎症物質であるか否かを決定する流れは図３に示すとおりである。図３と共に以下の詳細な工程の説明を参照されたい。

【0070】

１．被験物のＩＴＲＩ−５４Ｍ細胞に対する毒性試験
ＩＴＲＩ−５４Ｍ細胞はＴＨＰ−１培地で培養した。その成分は、１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ社製、１０４３７)、４．５ｇ／Ｌグルコース（Ｓｉｇｍａ社製、Ｇ７０２１)、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ(Ｓｉｇｍａ社製、Ｈ４０３４)、１×ペニシリンおよびストレプトマイシン (Ｂｉｏｗｅｓｔ社製、Ｌ００２２)、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム (Ｂｉｏｗｅｓｔ社製、Ｌ０６４２)、０．０５ｍＭ ２−メルカプトエタノール(ＧＩＢＣＯ社製、２１９８５−０２３)、ならびに０．５μｇ／ｍＬピューロマイシンを含んでなるＲＰＭＩ培地(ＧＩＢＣＯ社製、３１８００)であった。

【0071】

表６に挙げた抗炎症能力を持つことが既知である被験物を、適した溶媒（ＤＭＳＯまたは２−ＭＥを含まないＴＨＰ−１培地）で溶解し、溶解後にそれをストック溶液(ｓｔｏｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎ)とした。次いで、ストック溶液を６〜８回、３倍連続希釈して、異なる希釈倍率のワーキング溶液(ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ)を作った。

【0072】

【表6】

【0073】

次いで、細胞毒性試験を行った(工程２０１)。１０μＬ／ウェルのワーキング溶液を９６ウェルプレートに添加した。次に、ＩＴＲＩ−５４Ｍ細胞を、２−ＭＥおよびピューロマイシンを含まないＴＨＰ−１培地中に懸濁させてから、細胞５×１０^４個／９０μＬ／ウェルの密度で上記９６ウェル細胞培養プレートに接種した。続いて、培養プレートをインキュベーター(ＮＵＡＩＲ社製、ｎｕ−５５１０)内に置き１日培養した。なお、被験物がＤＭＳＯ中に溶解している場合、最終的な被験物と細胞の接触時の培地中のＤＭＳＯ濃度を０．２％に制御する必要がある点に注意すべきである。

【0074】

次いで、５ｍｇ／ｍＬ ＭＴＴ １０μＬの培地を培養プレート中に加え、ＣＯ_２インキュベーターに入れて２時間培養してから、１０％ＳＤＳ １００μＬを培養プレートに加え、一晩静置した。そして、紫色の沈殿を溶解させ、連続波長マイクロプレートリーダーシステム(Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製、ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ ５)で波長５６０ｎｍにおける細胞の吸光値を測定した。

【0075】

対照群の平均吸光値を１００％の細胞生存率(％)とし、各種異なる濃度のサンプルを加えた実験群の細胞生存率（％）を算出した。細胞生存率の計算式は、（実験群の吸光値／対照群の吸光値）×１００％である。さらに各濃度の被験物の細胞増殖阻害率を算出した。細胞増殖阻害率の計算式は、１−細胞生存率である。

【0076】

次いで、各実験群の細胞増殖阻害率でｘｙ散布図を作成し、ソフトウェアＧｒａｆｉｔを用いてＩＣ_５０の式により各被験物の５０％細胞増殖阻害のサンプル濃度(ＣＣ_５０)を求めた（工程２０３）。

【0077】

薬品がＭＴＴの色の判断に影響する場合は、Ｃｅｌｌ−Ｇｌｏ ｋｉｔを用いて細胞毒性試験を行った。その工程は以下のとおりである。

【0078】

細胞液３５μＬを、ルミネッセンス用の９６ウェルホワイトプレートに加えてから、その９６ウェルホワイトプレートにＣｅｌｌ−Ｇｌｏ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、Ｇ７５７１) ３５μＬを加え、振とう器に置いて１０分間振とうした。次いで、その９６ウェルホワイトプレート中に基質を加えたら、直ちにマイクロプレートルミノメーター(Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社製、ＭＰＬ４)で細胞が発したルミネッセンス強度(Ｒｌｕ/ｓ)を測定し、その回の実験の各濃度の被験物の細胞毒性基準値とした。

【0079】

細胞生存率の計算式は、（実験群のルミネセンス値／対照群のルミネッセンス値）×１００％とした。さらに、各濃度の被験物の細胞増殖阻害率を算出した。細胞増殖阻害率の計算式は、(１−細胞生存率)である。

【0080】

各実験群の細胞増殖阻害率でｘｙ散布図を作成し、ソフトウェアＧｒａｆｉｔを用いてＩＣ_５０の式により各被験物の５０％細胞増殖阻害濃度(ＣＣ_５０)を求めた。

【0081】

後続の実験では、各被験物のＣＣ_５０±２５％を、ＩＴＲＩ−５４Ｍ細胞のｍＬｕｃルシフェラーゼ活性の基準試験開始濃度として選んだ。

【0082】

１回目の実験で精確なＣＣ_５０を測定できなかった場合、実験結果を参考に、被験物濃度および希釈倍率を変えた。これにより最適な傾向線を得てＣＣ_５０を求めた。

【0083】

測定して得られた各被験物の５０％細胞増殖阻害の濃度は表７に示すとおりである。

【0084】

【表7】

【0085】

２.被験物の、リポ多糖体(ＬＰＳ)により誘発されたＩＴＲＩ−５４Ｍ細胞におけるｍ−Ｌｕｃ活性に対する影響の試験
上述により得られた各被験物のＣＣ_５０に基づき、各被験物の試験開始濃度を選択し（約ＣＣ_５０±２５％濃度であるが、精確なＣＣ_５０を得ることができない場合は、被験物の最大溶解可能濃度または最終濃度４０００μＭで試験を行う）、この濃度で被験物のストック溶液を調製した。次いで、その被験物のストック溶液を２倍で３回連続希釈して、別の３つの濃度のワーキング溶液を作り、合わせて４つの濃度の溶液を得た（工程２０５）。

【0086】

１０μＬ／ウェルのワーキング溶液および１０μＬの１００ｎｇ／ｍＬのリポ多糖体(Ｓｉｇｍａ社製、Ｌ２８８０)を９６ウェルプレートに加えた。次に、ＩＴＲＩ−５４Ｍ細胞を２−ＭＥおよびピューロマイシンを含まないＴＨＰ−１培地中に懸濁させてから、細胞５×１０^４個／８０μＬ／ウェルの密度で上記９６ウェル細胞培養プレートに接種した。続いて、培養プレートをインキュベーター(ＮＵＡＩＲ社製、ｎｕ−５５１０)内に置き１日培養した。なお、被験物がＤＭＳＯ中に溶解している場合、最終的な被験物と細胞の接触時の培地中のＤＭＳＯ濃度を０．２％に制御する必要がある点に注意すべきである。

【0087】

次いで、上記培養プレートから細胞液を１０μＬ取り出し、ルミネッセンス用の９６ウェルホワイトプレートに加えた。そのホワイトプレートに、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ試薬(ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ社製、ＳＰＧＡ−Ｇ１００) ４０μＬを加えたら、直ちにマイクロプレートルミノメーター(Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社製、ＭＰＬ４)で細胞のルミネッセンス強度(Ｒｌｕ/ｓ)を測定した。（工程２０７）。

【0088】

対照群およびリポ多糖体誘発群のルシフェラーゼ活性を基準として、各サンプル被験物がリポ多糖体により誘発されたＣＤ５４プロモーター活性を阻害する阻害率(ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ)を算出した。阻害率の計算式は、（リポ多糖体誘発群のルミネッセンス値−被験物との共処理後のリポ多糖体誘発群のルミネッセンス値）／（リポ多糖体誘発群のルミネセンス値−未処理群のルミネッセンス値）である。阻害率が正の値であれば、その被験物がリポ多糖体により誘発された免疫反応を抑制する能力を有するということである。（工程２０９（工程２０９Ａおよび工程２０９Ｂを含む）。

【0089】

そして、各実験群のＣＤ５４プロモーター活性の阻害率でｘｙ散布図を作成し、ソフトウェアＧｒａｆｉｔを用い、ＩＣ_５０の式により、各被験物の、５０％の、リポ多糖体により誘発されたｍＬｕｃ活性を阻害する濃度（ＩＣ_５０）を求めた。結果は表７に示してある。

【符号の説明】

【0090】

１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１０９Ａ、１０９Ｂ、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２０９Ａ、２０９Ｂ...工程

【受託番号】

【0091】

寄託情報

寄託機関の名称およびあて名：
中華民国新竹市食品工業発展研究所生物資源保存および研究センター(Bioresource Collection and Research Center (BCRC), Food Industry Research and Development Institute, Hsinchu, Taiwan)
寄託日：
２０１３年１２月４日
受託番号：
ＢＣＲＣ Ｎｏ. ９６０４７５

寄託機関の名称およびあて名：
ドイツ微生物細胞培養収集機関（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH）
Inhoffenstr. 7B D-38124 Braunschweig GERMANY
寄託日：
２０１４年１１月１２日
受託番号：
ＤＳＭ ＡＣＣ３２５７

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]