特許 6134763 ＧＭ−ＣＳＦ及びインターフェロンαを用いて生成され、且つ熱処理され死滅したがん細胞を取り込んだ樹状細胞

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6134763

(24)【登録日】2017年4月28日

(45)【発行日】2017年5月24日

(54)【発明の名称】ＧＭ−ＣＳＦ及びインターフェロンαを用いて生成され、且つ熱処理され死滅したがん細胞を取り込んだ樹状細胞

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/17 20150101AFI20170515BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20170515BHJP

   A61K 38/00 20060101ALN20170515BHJP

   A61K 38/21 20060101ALN20170515BHJP

   A61K 39/00 20060101ALN20170515BHJP

   A61K 39/02 20060101ALN20170515BHJP

【ＦＩ】

   A61K35/17 A

   A61P35/00

   !A61K37/02

   !A61K37/66 C

   !A61K39/00 H

   !A61K39/02

【請求項の数】23

【全頁数】37

(21)【出願番号】特願2015-207617(P2015-207617)

(22)【出願日】2015年10月22日

(62)【分割の表示】特願2013-111446(P2013-111446)の分割

【原出願日】2007年6月29日

(65)【公開番号】特開2016-41725(P2016-41725A)

(43)【公開日】2016年3月31日

【審査請求日】2015年11月20日

(31)【優先権主張番号】60/817,916

(32)【優先日】2006年6月30日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】509004712

【氏名又は名称】ベイラー リサーチ インスティテュート

【氏名又は名称原語表記】ＢＡＹＬＯＲ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ

(74)【代理人】

【識別番号】100107984

【弁理士】

【氏名又は名称】廣田 雅紀

(72)【発明者】

【氏名】パルッカ アンナ カロリーナ

(72)【発明者】

【氏名】バンチェレイア ジャック エフ．

(72)【発明者】

【氏名】タケ ニコラス

(72)【発明者】

【氏名】バークホルダー スーザン

【審査官】 長岡 真

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００６／０４７５１５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００４−５０７２３８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 J. Exp. Med., 2000, vol.191, No.10, p.1777-1788

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３５／１７

Ａ６１Ｐ ３５／００

Ａ６１Ｋ ３８／００

Ａ６１Ｋ ３８／２１

Ａ６１Ｋ ３９／００

Ａ６１Ｋ ３９／０２

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

がん治療を必要とする対象におけるがんを治療するための、単離され、活性化された樹状細胞を含む組成物を作製する方法であって、
前記対象から単離された単球を、ＧＭ−ＣＳＦ及びインターフェロンαとともにインキュベートして単離された樹状細胞を形成するステップ、
前記単離された樹状細胞を、熱ショックを与え死滅させたがん細胞を含む組成物とともにインキュベートして、単離され、活性化された樹状細胞を形成するステップ、及び
前記単離され、活性化された樹状細胞をＬＰＳ及びＣＤ４０リガンドとともにインキュベートすることにより、前記単離され、活性化された樹状細胞を刺激するステップ
を含む方法。

【請求項2】

単離され、活性化された樹状細胞を低温保存するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

単離され、活性化された樹状細胞をインビトロ又はインサイチューでＣＤ８^＋Ｔ細胞と接触させて前記ＣＤ８^＋Ｔ細胞を活性化させるステップをさらに含む方法であって、活性化された前記ＣＤ８^＋Ｔ細胞が対象におけるがんに対して細胞傷害性である、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

熱ショックを与え死滅させたがん細胞が、患者から得た熱不活性化された黒色腫細胞である、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

熱ショックを与え死滅させたがん細胞が、患者と同一のがん細胞型である熱不活性化された黒色腫細胞である、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

熱ショックを与え死滅させたがん細胞が、１又は２以上のＣｏｌｏ８２９黒色腫細胞を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

熱ショックを与え死滅させたがん細胞が、樹立がん細胞系を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

熱ショックを与え死滅させたがん細胞が、黒色腫細胞である、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

熱ショックを与え死滅させたがん細胞が、１又は２以上の熱ショックを与え死滅させたＭｅｌ−２細胞、１又は２以上の熱ショックを与え死滅させたＭｅｌ−３細胞、１又は２以上の熱ショックを与え死滅させたＭｅｌ−４細胞、１又は２以上の熱ショックを与え死滅させたＭｅｌ−６細胞、１又は２以上の熱ショックを与え死滅させたＭｅｌ−９細胞、又はそれらの組合せを含む黒色腫細胞である、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

熱ショックを与え死滅させたがん細胞が、３８℃〜４６℃で４時間インキュベートされたがん細胞である、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

がん細胞を３８℃〜４６℃で４時間インキュベートし、熱ショックを与えたがん細胞を作製するステップ、及び
前記熱ショックを与えたがん細胞を、１６０Ｇｙで０．５時間γ線照射することにより死滅させて、熱ショックを与え死滅させたがん細胞を作製するステップ
を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

がん細胞を加熱して、熱ショックを与え死滅させたがん細胞を作製するステップを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

がん抗原提示樹状細胞を作製する方法であって、
ＧＭ−ＣＳＦ及びインターフェロンαの存在下において、単離された単球を樹状細胞に分化させるステップ、
１又は２以上のがん抗原を含むがん細胞を、前記樹状細胞が前記１又は２以上のがん抗原の提示を生じさせる条件下において、前記樹状細胞に取り込ませ、がん抗原提示樹状細胞を形成するステップであって、取り込ませる前に前記がん細胞に熱ショックを与えその後死滅させるステップ、及び
前記がん抗原提示樹状細胞をＬＰＳ及びＣＤ４０リガンドとともにインキュベートすることにより、前記がん抗原提示樹状細胞を刺激するステップ
を含む、方法。

【請求項14】

黒色腫抗原を提示する１又は２以上の成熟抗原提示樹状細胞を作製する方法であって、
細胞培養において、１又は２以上の単離された単球をＧＭ−ＣＳＦ及びインターフェロンαに曝露することによって、前記１又は２以上の単離された単球を分化させ、樹状細胞を形成するステップ、
１又は２以上の黒色腫抗原を含む、熱ショックを与え死滅させた黒色腫がん細胞を、前記樹状細胞が前記１又は２以上の黒色腫抗原を提示して成熟抗原提示樹状細胞となることを可能にする条件下において、前記樹状細胞に取り込ませるステップ、及び
前記成熟抗原提示樹状細胞をＬＰＳ及びＣＤ４０リガンドとともにインキュベートすることにより、前記成熟抗原提示樹状細胞を刺激するステップ
を含む、方法。

【請求項15】

黒色腫抗原を提示する抗原提示樹状細胞を作製する方法であって、
がんを有していると疑われる患者から単離された単球を、ＧＭ−ＣＳＦ及びインターフェロンαとともにインキュベートすることにより、樹状細胞に分化させるステップ、
熱ショックを与えその後死滅させた１又は２以上のがん細胞を含む組成物を、前記樹状細胞が前記組成物から１又は２以上の抗原を提示することを可能にする条件下において、前記樹状細胞に取り込ませるステップ、及び
前記取り込ませた樹状細胞をＬＰＳ及びＣＤ４０リガンドとともにインキュベートすることにより、前記取り込ませた樹状細胞を刺激するステップ
を含む、方法。

【請求項16】

対象においてＴ細胞の活性化を誘発し得る抗がんワクチンを作製する方法であって、
（ｉ）単球をＧＭ−ＣＳＦ及びインターフェロンαとともにインキュベートすることにより、前記単球から樹状細胞に分化させるステップ、
（ii）前記樹状細胞に、熱ショックを与えその後死滅させたがん細胞由来の抗原を提示させるステップ、及び
（iii）前記樹状細胞が前記抗原を提示した後に前記樹状細胞をＬＰＳ及びＣＤ４０リガンドとともにインキュベートすることにより、前記樹状細胞を刺激するステップ
を含む、前記方法。

【請求項17】

がん細胞が、死滅の際にアポトーシス性ではない、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

がん細胞が黒色腫細胞である、請求項１６に記載の方法。

【請求項19】

黒色腫細胞が対象に由来する、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

がん細胞が、３８℃〜４６℃で４時間加熱することにより処理されたがん細胞である、請求項１６に記載の方法。

【請求項21】

がん細胞が、１６０Ｇｙで０．５時間γ線照射することにより死滅させたがん細胞である、請求項１６に記載の方法。

【請求項22】

がんを有していると疑われる患者を治療するための薬剤の製造における、１又は２以上のがん抗原を提示し、Ｔ細胞を活性化する樹状細胞の使用であって、
前記樹状細胞が、
（ｉ）単球を、ＧＭ−ＣＳＦ及びインターフェロンαとともにインキュベートすることにより、前記単球から分化させ、
（ii）熱ショックを与えその後死滅させたがん細胞を取り込ませ、及び
（iii）がん細胞を取り込ませた後にＬＰＳ及びＣＤ４０リガンドとともにインキュベートすることにより刺激した樹状細胞である、使用。

【請求項23】

がんを有していると疑われる患者を治療するための薬剤の製造における、１又は２以上の抗原提示樹状細胞の使用であって、
単離された単球を、ＧＭ−ＣＳＦ及びインターフェロンαとともにインキュベートすることにより、樹状細胞に分化させるステップ、
熱ショックを与えその後死滅させたがん細胞を含む組成物を前記樹状細胞に取り込ませ、抗原提示樹状細胞を形成するステップ、及び
前記抗原提示樹状細胞をＬＰＳ及びＣＤ４０リガンドとともにインキュベートすることにより、前記抗原提示樹状細胞を刺激するステップ
を含む、使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、全体としてワクチンの分野に関するものであり、とりわけ、樹状細胞活性化因子を用いて生成され、且つ熱処理され死滅したがん細胞を取り込んだ樹状細胞を産生するための組成物及び方法に関するものである。

【背景技術】

【0002】

本発明の背景をがん細胞ワクチンに関連して記載するが、これは本発明の範囲を限定するものではない。

【0003】

単離、特徴付け、及び免疫応答の誘発のための数多くの方法が開発されている。例えば、Engleman, et al.に発行された米国特許第６８２１７７８号明細書において、γ／δ−Ｔ細胞受容体陽性Ｔ細胞を活性化するための樹状細胞のいくつかの使用方法が教示されている。簡潔に説明すると、抗原を提示するためのヒト樹状細胞を使用して、抗原特異的Ｔ細胞介在性の免疫応答を誘発する方法が教示されている。とりわけ、この開示には、ヒトの血液から樹状細胞を単離し、この細胞を抗原に暴露し、抗原をパルスした樹状細胞をプライミングされていないか又は弱くプライミングされた個体から得たγ／δ−Ｔ細胞受容体陽性Ｔ細胞（γ／δ−ＴＣＲ＋Ｔ細胞）と共培養して抗原特異的Ｔ細胞の増殖活性及び細胞傷害活性を刺激することが含まれる。そこに記載されている樹状細胞の抗原提示系は、広い用途範囲を有していると言われており、例えば、感染性の疾患及びがんに対する細胞養子免疫療法に用いるための、主要組織適合性複合体に非拘束性の多くの抗原特異的なＴ細胞を活性化及び増加させる。

【0004】

樹状細胞の操作のさらに別の例は、Gong, et al.に発行された米国特許第６６５２８４８号明細書において教示されており、これは樹状細胞ハイブリッドを教示している。Gongは、樹状細胞と非樹状細胞の融合により形成された融合細胞を含む免疫刺激性組成物、これらの組成物の使用方法、及び樹状細胞ハイブリッドの生成方法を教示している。

【0005】

Albert, et al.に発行された米国特許第６６０２７０９号明細書は、Ｔ細胞の誘発又は耐性化のために樹状細胞に抗原を送達するための、アポトーシス細胞の使用方法を含む。この開示は、樹状細胞に抗原を送達するために有用な、さらには抗原特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球及びヘルパーＴ細胞の誘発に有用な方法及び組成物を教示している。この開示はまた、細胞傷害性Ｔリンパ球の活性を評価するためのアッセイを提供するとも言われている。簡潔に説明すると、抗原はアポトーシス細胞によって樹状細胞に標的化され、このアポトーシス細胞は、樹状細胞への提示のために非天然抗原を発現するよう修飾され得る。アポトーシス細胞によってプライミングされた樹状細胞は、プロセシング、及びプロセシングされた抗原の提示、及び細胞傷害性Ｔリンパ球の活性の誘発が可能であるか、又はワクチン療法においても用い得ると言われている。

【0006】

Steinman, et al.に発行された米国特許第６４７５４８３号明細書は、自己免疫疾患を治療するための、樹状細胞前駆体のインビトロでの増殖方法、及び免疫原を産生するためのそれらの使用を開示した。この開示は、提供された樹状細胞前駆体の増殖培養物を産生するための方法、及び増殖している樹状細胞前駆体から成熟樹状細胞を培養下において産生するための方法を教示していると言われている。成熟樹状細胞の培養により、微粒子を含む、樹状細胞の修飾抗原又は抗原をパルスされた樹状細胞からなる新規なＴ細胞依存性抗原を産生する効果的な手段であって、この抗原がプロセシングされ、抗原で活性化された樹状細胞上に発現する手段が提供される。本発明の新規な抗原は、ワクチン又は疾患の治療のための免疫原として用い得る。これらの抗原はまた、若年性糖尿病及び多発性硬化症などの自己免疫疾患を治療するためにも用い得る。

【0007】

本発明は、樹状細胞（ＤＣ、dendritic cell）により調整され調節される免疫応答を誘発するための組成物及び方法を含む（Steinman, R. M. The dendritic cell system and its role in immunogenicity. Annu Rev Immunol 9, 271-96 (1991)、Banchereau, J. et al. Immunobiology of dendritic cells. Ann Rev Immunol 18, 767-811 (2000)）。ＤＣは、抗原を捕捉する態勢で末梢組織に存在する。これらの抗原は続いて、ＤＣが成熟し、流入領域二次リンパ器官に向かって移動するにつれ、小さなペプチドにプロセシングされる（Mellman, I. & Steinman, R. M. Dendritic cells: specialized and regulated antigen processing machines. Cell 106, 255-8 (2001)）。ここで、ＤＣはナイーブＴ細胞にペプチドを提示し、ひいてはヘルパーＴ細胞１（Ｔｈ１、T helper 1）型ＣＤ４^＋Ｔ細胞及び細胞溶解性ＣＤ８^＋Ｔ細胞の両方を伴う細胞性免疫応答を誘発する。ＤＣは、ナイーブＢ細胞（Caux, C. et al. CD34+ hematopoietic progenitors from human cord blood differentiate along two independent dendritic cell pathways in response to granulocyte-macrophage colony-stimulating factor plus tumor necrosis factor alpha: II. Functional analysis. Blood 90, 1458-70 (1997)）及び記憶Ｂ細胞（Jego, G. et al. Plasmacytoid dendritic cells induce plasma cell differentiation through type I interferon and interleukin 6. Immunity 19, 225-34 (2003)）を活性化する能力を介しての液性免疫の誘発において重要である。ＤＣはまた、ナチュラルキラー（ＮＫ、natural killer）細胞（Fernandez, N. C. et al. Dendritic cells directly trigger NK cell functions: cross-talk relevant in innate anti-tumor immune responses in vivo. Nat Med 5, 405-11 (1999)）及びＮＫＴ細胞（Kadowaki, N. et al. Distinct cytokine profiles of neonatal natural killer T cells after expansion with subsets of dendritic cells. J Exp Med 193, 1221-6 (2001)）を活性化し得る。ＤＣは多くの能力を有しているため、免疫オーケストラのすべての構成要素を指揮することができ、したがって、ワクチン接種のための基本的な標的及びツールである。

【0008】

エクスビボで生成され抗原を取り込んだＤＣは最近、免疫を向上させるためのワクチンとして用いられている（Davis, I. D., Jefford, M., Parente, P. & Cebon, J. Rational approaches to human cancer immunotherapy. J Leukoc Biol 73, 3-29 (2003)）。マウスにおける多くの研究により、腫瘍抗原を取り込んだＤＣが治療的且つ防御的な抗腫瘍免疫を誘発し得ることが示されている（Gilboa, E., Nair, S. K. & Lyerly, H. K. Immunotherapy of cancer with dendritic-cell-based vaccines. Cancer Immunol Immunother 46, 82-7 (1998)）。ＤＣ上に送達された抗原の免疫原性は、がん（Davis, I. D., Jefford, M., Parente, P. & Cebon, J. Rational approaches to human cancer immunotherapy. J Leukoc Biol 73, 3-29 (2003)）及び慢性的なＨＩＶ感染（Lu, W., Arraes, L. C., Ferreira, W. T. & Andrieu, J. M. Therapeutic dendritic-cell vaccine for chronic HIV-1 infection. Nat Med 10, 1359-1365 (2004)）を有する患者において示されており、したがって、ＤＣワクチンが効果的であり得ることの「原理の証明」を提供する。特徴的なタイプの免疫応答を誘発する特徴的なＤＣサブセットの同定、及び調節／抑制機能を有する細胞の増加におけるＤＣの役割により、がんを有する患者にとってのより良いワクチン接種戦略を設計するために試験すべき新規なパラメータが得られる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】米国特許第６８２１７７８号明細書

【特許文献2】米国特許第６６５２８４８号明細書

【特許文献3】米国特許第６６０２７０９号明細書

【特許文献4】米国特許第６４７５４８３号明細書

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】Steinman, R. M. The dendritic cell system and its role in immunogenicity. Annu Rev Immunol 9, 271-96 (1991)

【非特許文献2】Banchereau, J. et al. Immunobiology of dendritic cells. Ann Rev Immunol 18, 767-811 (2000)

【非特許文献3】Mellman, I. & Steinman, R. M. Dendritic cells: specialized and regulated antigen processing machines. Cell 106, 255-8 (2001)

【非特許文献4】Caux, C. et al. CD34+ hematopoietic progenitors from human cord blood differentiate along two independent dendritic cell pathways in response to granulocyte-macrophage colony-stimulating factor plus tumor necrosis factor alpha: II. Functional analysis. Blood 90, 1458-70 (1997)

【非特許文献5】Jego, G. et al. Plasmacytoid dendritic cells induce plasma cell differentiation through type I interferon and interleukin 6. Immunity 19, 225-34 (2003)

【非特許文献6】Fernandez, N. C. et al. Dendritic cells directly trigger NK cell functions: cross-talk relevant in innate anti-tumor immune responses in vivo. Nat Med 5, 405-11 (1999)

【非特許文献7】Kadowaki, N. et al. Distinct cytokine profiles of neonatal natural killer T cells after expansion with subsets of dendritic cells. J Exp Med 193, 1221-6 (2001)

【非特許文献8】Davis, I. D., Jefford, M., Parente, P. & Cebon, J. Rational approaches to human cancer immunotherapy. J Leukoc Biol 73, 3-29 (2003)

【非特許文献9】Gilboa, E., Nair, S. K. & Lyerly, H. K. Immunotherapy of cancer with dendritic-cell-based vaccines. Cancer Immunol Immunother 46, 82-7 (1998)

【非特許文献10】Lu, W., Arraes, L. C., Ferreira, W. T. & Andrieu, J. M. Therapeutic dendritic-cell vaccine for chronic HIV-1 infection. Nat Med 10, 1359-1365 (2004)

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明は、抗原提示細胞による抗原の活性化及び提示のための組成物及び方法を含む。より詳細には、本発明は、１つ又は複数の樹状細胞を、熱ショックを与えその後死滅させた１つ又は複数のがん細胞と共にインキュベートすることによって、１つ又は複数のがん抗原を提示しＴ細胞の活性化を誘発する１つ又は複数の樹状細胞を活性化することにより、がんを治療するための組成物を作製する方法を含む。本方法はまた、Ｔ細胞の活性化を誘発する条件下において、熱ショックを与えその後死滅させた１つ又は複数のがん細胞の残存物を含む抗原を抗原提示細胞にパルスするステップを含み得る。本方法はまた、熱ショックを与えその後死滅させたがん細胞でパルスされた１つ又は複数の抗原提示細胞を低温で保存するステップを含み得る。１つ又は複数の抗原提示細胞は、がん細胞の熱ショック及び死滅の後に得られる１つ又は複数のがん特異的抗原を１つ又は複数のＣＤ８＋Ｔ細胞又はＣＤ４＋Ｔ細胞に提示する樹状細胞であり得る。抗原提示細胞は、樹状細胞、単球、自己細胞、異種細胞、細胞断片、及び／又はそれらの組合せであり得る。

【0012】

いくつかの例において、１つ又は複数の抗原提示樹状細胞は、１つ又は複数の樹状細胞、例えばＩＦＮαで活性化された単球を含む。抗原提示細胞は、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮαと共に培養された単球に由来し得る。抗原提示細胞として、例えば、患者に由来する熱不活性化された黒色腫細胞等の１つ又は複数の黒色腫細胞に由来する熱ショックタンパク質を発現する、抗原提示樹状細胞を挙げることができる。或いは、１つ又は複数の熱不活性化された黒色腫細胞は、患者と同一の、基本的な細胞型であり得るか、又はがん細胞型のものでもあり得る。いくつかの実施形態において、がん細胞はＣｏｌｏ８２９黒色腫細胞である。一例では、がん細胞は、樹立がん細胞系、例えば、培養された黒色腫細胞、例えばＭｅｌ−２細胞、Ｍｅｌ−３細胞、Ｍｅｌ−４細胞、Ｍｅｌ−６細胞、及び／若しくはＭｅｌ−９細胞、又はそれらの組合せである。

【0013】

いくつかの実施形態において、がん細胞は、約３８℃から約４６℃で約０．５〜４時間加熱することにより処理される。がん細胞は、約１６０Ｇｙで約０．５時間γ線照射することにより死滅させることができ、且つ／又は、加熱、凍結解凍サイクル、フレンチプレス、せん断、直接的若しくは間接的な圧縮、凍結、クラッキング、乾燥、化学的物質への暴露、及び（アポトーシス以外の）細胞死を生じさせる生物学的作用物質などにより死滅させることができる。本発明はまた、その後に死滅し提示のためにプロセシングされる熱処理された細胞でパルスされた、１つ又は複数のパルスされた抗原提示細胞であって、除核樹状細胞と１つ又は複数の熱処理したがん細胞とを含み得る、Ｔ細胞の活性化を誘発し得る抗原提示細胞を加えることを含む。いくつかの実施形態において、組成物は、大腿前部又は上腕からなる群から選択される少なくとも１つの部位に皮下注射される。

【0014】

提示のための抗原を作製するために熱処理して死滅させるがん細胞の非限定的な例には、例えば線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、カポジ肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、横紋肉腫、結腸直腸がん、膵臓がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、脂腺がん、乳頭がん、乳頭腺がん、嚢胞腺がん、髄様がん、気管支がん、腎細胞がん、肝細胞がん、胆管がん、絨毛がん、セミノーマ、胎児性がん、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、肺がん、小細胞肺がん、膀胱がん、上皮がん、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、骨髄腫、リンパ腫、及び白血病に由来する細胞が含まれ得る。

【0015】

細胞をパルスするために用い得、且つ／又は治療の対象であるがんには、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、カポジ肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、横紋肉腫、結腸直腸がん、膵臓がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、脂腺がん、乳頭がん、乳頭腺がん、嚢胞腺がん、髄様がん、気管支がん、腎細胞がん、肝細胞がん、胆管がん、絨毛がん、セミノーマ、胎児性がん、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、肺がん、小細胞肺がん、膀胱がん、上皮がん、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、骨髄腫、リンパ腫、及び白血病が含まれ得る。

【0016】

さらに別の実施形態は、１つ又は複数の単球を１つ又は複数の樹状細胞に分化させ、熱ショックを与えその後死滅させた１つ又は複数のがん細胞を含む抗原提示組成物を１つ又は複数の樹状細胞に取り込ませることにより、がん抗原を提示する樹状細胞を作製する方法であって、１つ又は複数の樹状細胞が、１つ又は複数の樹状細胞による組成物内での１つ又は複数の抗原の提示を生じさせる条件下にある方法である。

【0017】

本発明の別の方法は、がんを有していると疑われる患者から１つ又は複数の単球を単離し、１つ又は複数の単球を１つ又は複数のＩＦＮα樹状細胞に成熟させ、且つ熱ショックを与えその後死滅させた１つ又は複数のがん細胞を有する抗原提示組成物を１つ又は複数のＩＦＮα樹状細胞に取り込ませることにより、黒色腫抗原を提示するＩＦＮα樹状細胞を作製する方法であって、取り込んだ１つ又は複数のＩＦＮα樹状細胞が、Ｔ細胞の活性化を誘発し得、且つ、１つ又は複数のＩＦＮα樹状細胞による組成物内での１つ又は複数の抗原の提示を可能にする条件下にある方法である。

【0018】

本発明はまた、Ｔ細胞の活性化を誘発し得るがん特異的ワクチンであって、抗原を提示するべく活性化され、熱ショックを与え熱ショックの後に死滅させた１つ又は複数のがん細胞である１つ又は複数の抗原を提示する、薬学的に効果的な量の１つ又は複数の樹状細胞を含むワクチンを含む。一実施形態において、がん細胞は、死滅の際に、熱ショックを与えるか又は熱処理して死滅させる（しかしアポトーシス性ではない）。本発明の別の例は、Ｔ細胞の活性化を誘発し得る黒色腫特異的ワクチンであって、ＩＦＮαに曝露され、且つ、熱ショックを与えその後死滅させた黒色腫細胞である抗原を取り込み提示する樹状細胞（ＩＦＮα樹状細胞）に成熟した、薬学的に効果的な量の１つ又は複数の単球を含み、１つ又は複数のＩＦＮα樹状細胞が、Ｔ細胞への１つ又は複数の黒色腫の提示を促進する条件下においてインキュベートされるワクチンである。このワクチンは、１つ又は複数のパルスされた除核抗原提示細胞を含む、Ｔ細胞の活性化のためにパルスされた調製物を加えるステップも含む方法により作製され得る。

【0019】

本発明のさらに別の方法は、抗原提示を含みＴ細胞の活性化を誘発する条件下において、活性化した樹状細胞に、熱ショックを与えその後死滅させたがん細胞を含む１つ又は複数のがん抗原を取り込ませること、及び１つ又は複数のがん抗原を提示する１つ又は複数の樹状細胞を、それを必要としている患者に投与してＴ細胞を活性化することにより、がん細胞の成長を有すると疑われる患者を治療する方法を含む。

【0020】

本発明のさらに別の方法は、ＩＦＮα及びＧＭ−ＣＳＦを用いて１つ又は複数の単球を単離し、成熟させ、これらのサイトカインで成熟した樹状細胞とすること、熱ショックを与えその後死滅させた１つ又は複数の熱処理したがん細胞を有する組成物を、Ｔ細胞の活性化を誘発し得る１つ又は複数の樹状細胞に負荷して、１つ又は複数の抗原提示樹状細胞を形成すること、並びに１つ又は複数の抗原提示樹状細胞を、それを必要としている患者に投与することにより、がんを有すると疑われる患者を治療する方法を含む。

【0021】

本発明の特徴及び利点のさらに十分な理解のために、本発明の詳細な説明について添付の図面と共に記載する。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】ＩＦＮ−ＤＣが細胞溶解性ＣＤ８＋Ｔ細胞を効果的に活性化させることを示す図である。ナイーブＣＤ８Ｔ細胞をＩＦＮ−ＤＣ（上図）又はＴＮＦ−ＤＣ（下図）と５日間培養した。Ｔ細胞を、抗ＣＤ８（縦座標）と、抗グランザイムＡ（左図）又は抗グランザイムＢ（右図）のいずれかとで染色した。二重陽性のＣＤ８^＋Ｔ細胞のパーセンテージ。

【図2】ＩＦＮ−ＤＣがインビトロで成熟刺激物質に対して差異的に応答することを示す図である。示した刺激物質に６時間晒したＩＦＮ−ＤＣの上清内へのサイトカイン分泌物の標準化された発現。スケールは０（青）〜２０（赤）。示したサイトカインのMultiplexサイトカインビーズ分析。Ｃｔｒｌは、活性化因子を加えなかったものである。

【図3】ＩＦＮ−ＤＣが比類なくＩＬ−７を分泌することを示す図である。詳細は図１に示す。６時間目でのＩＬ−７の分泌（縦座標、ｐｇ／ｍｌ）。赤のバーはＩＦＮ−ＤＣであり、緑のバーはＩＬ−４ＤＣである。

【図4】ＩＦＮ−ＤＣが腫瘍特異的ＣＴＬを効果的にクロスプライミングすることを示す図である。ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞を、死滅した腫瘍細胞を取り込んだＩＬ４−ＤＣ及びＩＦＮ−ＤＣに晒した。ＣＴＬの機能（縦座標）を２回の刺激サイクルの後に測定した。

【図5】ＩＦＮ−ＤＣが黒色腫に対してＣＴＬを効果的にクロスプライミングすることを示す図である。ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１^＋ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞を、死滅したＭｅ２９０黒色腫細胞を取り込んだＩＦＮ−ＤＣと共に培養した。培養物を７日目に１回ブーストし、５日後に、示したＥ：Ｔの比率で（横座標）、Ｍｅ２９０細胞及びコントロールのＫ５６２細胞からのクロムの放出を生じさせる能力（縦座標、特異的溶解）について、採取したＴ細胞を評価する。

【図6】ＩＦＮ−ＤＣが黒色腫特異的ＣＴＬを効果的にクロスプライミングすることを示す図である。死滅した黒色腫細胞（Ｍｅ２９０）又はメラノサイトのいずれかを取り込んだＩＦＮ−ＤＣとの培養物における、四量体に特異的なＣＤ８^＋Ｔ細胞の頻度。ＨＩＶの四量体をネガティブコントロールとして用いる。太字の値は四量体を結合しているＣＤ８^＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す。

【図7】黒色腫細胞の熱処理によりＨＳＰ７０が増大することを示す図である。ＳＫ Ｍｅｌ２８黒色腫細胞を過熱してＢＡで死滅させた。ポリリジンで事前処理したスライド上に細胞を載せ、固定し、透過化した。抗ＨＳＰ７０一次抗体を、テキサスレッドに結合したヤギ抗マウスＩｇＧにより追跡した。Leica TCS-NT SP共焦点顕微鏡（４０倍）。

【図8】熱処理した黒色腫細胞が、免疫原性、即ちＭｅ２７５細胞及びコントロールのＫ５６２細胞の死滅を増大させることを示す図である。取り込んでいないＤＣ（ＣＴＬ１）、コントロールの黒色腫体を取り込んだＤＣ（ＣＴＬ２）、及び熱ショックを与えた黒色腫体を取り込んだＤＣ（ＣＴＬ３）。プライミングを１４日間行った。^５１Ｃｒの放出（縦座標）。

【図9】熱処理した黒色腫細胞が、免疫原性、即ち４つの黒色腫ペプチド（４Ｐ；ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、チロシナーゼ、及びＭＡＧＥ−３）の混合物又はコントロールのＰＳＡペプチドをパルスしたＴ２細胞の死滅を増大させることを示す図である。コントロールの黒色腫体を取り込んだＤＣ（ＣＴＬ１）、及び熱ショックを与えた黒色腫体を取り込んだＤＣ（ＣＴＬ２）。^５１Ｃｒの放出（縦座標）。

【図10】熱処理し死滅させた黒色腫細胞を取り込んだＤＣによる、黒色腫特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞のプライミングを示す図である。ａ）２週間の培養の後の四量体の染色、及びｂ）ペプチドをパルスしたＤＣでの１回のブーストの後。図７及び明細書参照。

【図11】黒色腫細胞の熱処理が腫瘍抗原の転写を増強することを示す図である。リアルタイムＰＣＲ：冷たい（ｎｏｎ）、加熱した、及び過熱し、アクチノマイシンＤで処理した、Ｍｅ２９０黒色腫細胞。標準化した、発現の倍率（縦座標）。

【図12】死滅した腫瘍細胞における、熱により上方調節されるＭＡＧＥ Ａ１０に対するクロスプライミングを示す図である。ＤＣに、加熱していない（冷たい）又は加熱した（熱い）死滅した黒色腫細胞、即ちＨＬＡ−Ａ^＊０２０１^＋Ｍｅ２９０又はＨＬＡ−Ａ^＊０２０１陰性Ｓｋｍｅｌ２８を取り込ませる。２回の刺激の後、ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞を、ペプチドをパルスしたＤＣでブーストする。ＭＡＧＥ１０の四量体を用いたフローサイトメトリー染色。四量体を結合しているＣＤ３^＋Ｔ細胞の％。２回の研究。

【図13】熱処理した黒色腫体をＤＣに取り込ませると、ＣＤ８^＋細胞（上図）及びＣＤ４^＋Ｔ細胞（下図）の両方によるＩＬ−１０の分泌が減少し、ＩＦＮγの分泌が増加することを示す図。１回目又は２回目のＤＣでの刺激の示した時間後に、上清のルミネックス分析を行う。Ｃｔｒｌは取り込んでいないＤＣである。

【図14】本発明のワクチン製造プロセスの全体を概説するフローチャートである。

【図15】本発明のワクチン製造の詳細なステップ及びスケジュールを示す図である。

【図16】解凍後の凍結ワクチンの形態を示す図である。

【図17】解凍後の凍結ＩＦＮ−ＤＣワクチンの表現型を示す図である。

【図18】解凍後の凍結ワクチンによるサイトカイン分泌のプロフィールを示すグラフである。

【図19】凍結ワクチンによる自己ＣＤ８^＋Ｔ細胞のプライミングを示す図である。ＭＡＲＴ−１ペプチドをパルスした凍結／解凍ＩＦＮ−ＤＣで２回刺激した後の、コントロール及びＭＡＲＴ−１に特異的な四量体を結合しているＣＤ８^＋Ｔ細胞のパーセンテージ。

【発明を実施するための形態】

【0023】

本発明の様々な実施形態の実施及び使用を以下に詳細に述べるが、本発明は幅広い特定の状況において実現され得る多くの適用可能な発明概念を提供するものであることを理解されたい。本明細書において述べる特定の実施形態は、本発明を実施及び使用するための特定の方法を例示するものにすぎず、本発明の範囲を定めるものではない。

【0024】

この発明の理解を容易にするために、多くの用語を以下に定義する。本明細書において定義する用語は、本発明に関連する分野における当業者により一般に理解される意味を有する。本明細書における用語の単数での表記は単数のもののみを言うことを意図したものではなく、特定の例が例示に用いられ得る一般的な集合を含む。本明細書における用語は本発明の特定の実施形態を記載するために用いられるが、それらの使用は、特許請求の範囲に概説されているものを除き、本発明を限定するものではない。

【0025】

略語。ＧＭ−ＣＳＦ（Granulocyte macrophage-colony stimulating factor）は顆粒球マクロファージコロニー刺激因子であり、ＩＦＮ（Interferon）αはインターフェロンαであり、ＬＰＳ（lipopolysaccharide）はリポ多糖であり、ＴＮＦ（Tumor necrosis factor）は腫瘍壊死因子であり、ＣＲ（Complete response）は完全寛解であり、ＰＲ（Partial response）は部分寛解であり、ＳＤ（Stable disease）は安定性疾患であり、ＰＤ（Progressive disease）は進行性疾患であり、ＮＰＤ（Non-progressive disease）は非進行性疾患であり、ＮＥＤ（No evidence of disease）は疾患が認められないことであり、ＭＤＣ（Monocyte derived dendritic cells）は単球由来樹状細胞であり、ＣＴＬ（Cytotoxic T lymphocytes）は細胞傷害性Ｔリンパ球であり、ＮＫ（Natural Killer）細胞はナチュラルキラー細胞であり、ＮＫＴ（Natural Killer T）細胞はナチュラルキラーＴ細胞であり、ＮＤ（Not done）は実施しておらず、ＮＴ（Not tested）は試験しておらず、ＴＢＤ（To be determined）は未定である。

【0026】

がんの免疫療法。がんに対する患者の抵抗性を向上させるための多くの戦略が存在する。これらの戦略としては、１）微生物成分又はサイトカインでの免疫系の非特異的な活性化、２）抗体及び／又はＴ細胞での抗原特異的な養子免疫療法、並びに３）抗原特異的な活性免疫療法（ワクチン接種）がある。抗体の主な制限は、Ｔ細胞の標的が、ペプチドがＭＨＣ分子の複合体で細胞表面上に提示される、細胞内タンパク質であり得るのに対し、標的タンパク質が細胞表面上に発現していなくてはならないことである（Townsend, A. R., Gotch, F. M. & Davey, J. Cytotoxic T cells recognize fragments of the influenza nucleoprotein. Cell 42, 457-67 (1985)）。ヒトにおける特徴的な腫瘍抗原の同定により（Boon, T., Cerottini, J. C., Van den Eynde, B., van der Bruggen, P. & Van Pel, A. Tumor antigens recognized by T lymphocytes. Annu Rev Immunol 12, 337-65 (1994)、Rosenberg, S. A. Cancer vaccines based on the identification of genes encoding cancer regression antigens. Immunol Today 18, 175-82 (1997)）、Ｔ細胞養子療法（adoptive T-cell therapy） の開発が促された。しかし、ワクチン接種は、治療的なＴ細胞免疫（腫瘍特異的なエフェクターＴ細胞）と防御的なＴ細胞免疫（腫瘍の再発を制御し得る腫瘍特異的な記憶Ｔ細胞）との両方の誘発が期待されることから、依然として最も魅力的な戦略である（Pardoll, D. M. Cancer vaccines. Nat Med 4, 525-31 (1998)、Gilboa, E. The makings of a tumor rejection antigen. Immunity 11, 263-70 (1999)、Finn, O. J. Cancer vaccines: between the idea and the reality. Nat Rev Immunol 3, 630-41 (2003)）。

【0027】

がんを有するヒトの治療的なワクチン接種のための多くのアプローチが開発されており、それには、自己腫瘍細胞及び同種腫瘍細胞（様々なサイトカインを発現するよう修飾されることが多い）、ペプチド、タンパク質、並びにＤＮＡワクチンが含まれる（Davis, I. D., Jefford, M., Parente, P. & Cebon, J. Rational approaches to human cancer immunotherapy. J Leukoc Biol 73, 3-29 (2003)、Finn, O. J. Cancer vaccines: between the idea and the reality. Nat Rev Immunol 3, 630-41 (2003)、Antonia, S., Mule, J. J. & Weber, J. S. Current developments of immunotherapy in the clinic. Curr Opin Immunol 16, 130-6 (2004)、Hsueh, E. C. & Morton, D. L. Antigen-based immunotherapy of melanoma: Canvaxin therapeutic polyvalent cancer vaccine. Semin Cancer Biol 13, 401-7 (2003)、Sondak, V. K. & Sosman, J. A. Results of clinical trials with an allogenic melanoma tumor cell lysate vaccine: Melacine. Semin Cancer Biol 13, 409-15 (2003)）。これらのアプローチのすべては、ワクチンを宿主のＤＣとランダムに接触させることに依る。ワクチン抗原がＤＣと接触しない場合、免疫応答は生じ得ない。加えて、活性化されていないＤＣ又はＤＣの「正しくない」サブセットとの不適切な接触により、免疫応答のサイレンシングが生じ得る（Steinman, R. M., Hawiger, D. & Nussenzweig, M. C. Tolerogenic dendritic cells. Annu Rev Immunol 21, 685-711 (2003)）。これらの両方の場合により、現在のがんワクチンにおける欠点のいくつかが説明され得る。さらに、適切な免疫応答を誘発するために、インビボで腫瘍抗原がどのようにしてＤＣに送達される必要があるかは知られていない。したがって、がんに対する最適なワクチン接種のためのパラメータを確立することを可能にし得る、制御された条件下において腫瘍抗原を取り込んだ、エクスビボで生成した自己ＤＣに基づく研究が必要である。ワクチンとしてＤＣを用いる臨床研究は、エクスビボで非常に多くの自己ＤＣを生成する方法の発見により容易になった（Caux, C., Dezutter-Dambuyant, C., Schmitt, D. & Banchereau, J. GM-CSF and TNF-alpha cooperate in the generation of dendritic Langerhans cells. Nature 360, 258-61 (1992)、Romani, N. et al. Proliferating dendritic cell progenitors in human blood. J Exp Med 180, 83-93 (1994)、Sallusto, F. & Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med 179, 1109-18 (1994)）。がんにおけるＤＣワクチン接種の効果を向上させると考えられるべきパラメータには、ＤＣ関連因子、宿主関連因子、及びＤＣワクチンと他の療法との組合せが含まれる。２つのＤＣ関連パラメータ、即ち、新規なＤＣサブセット、及び腫瘍抗原を取り込ませるための新規な戦略を以下に簡単に述べる。

【0028】

ＤＣワクチンのパラメータ。ＤＣサブセット：ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４が単球を未成熟ＤＣに分化し得ることの発見（Romani, N. et al. Proliferating dendritic cell progenitors in human blood. J Exp Med 180, 83-93 (1994)、Sallusto, F. & Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med 179, 1109-18 (1994)、Peters, J. H. et al. Signals required for differentiating dendritic cells from human monocytes in vitro. Adv Exp Med Biol 329, 275-80 (1993)）により、ＤＣの生物学及び機能についての理解が非常に深まった。Nestle, et al.（Nestle, F. O. et al. Vaccination of melanoma patients with peptide- or tumor lysate-pulsed dendritic cells. Nat Med 4, 328-32 (1998)）（腫瘍溶解物を取り込んだＤＣを用いている）、及びSchuler及びその同僚（Thurner, B. et al. Vaccination with mage-3A1 peptide-pulsed mature, monocyte-derived dendritic cells expands specific cytotoxic T cells and induces regression of some metastases in advanced stage IV melanoma. J Exp Med 190, 1669-78 (1999)）（黒色腫ペプチドを取り込んだＤＣを用いている）による、転移性黒色腫を有する患者における先駆的な臨床研究に続き、いくつかの団体がＩＬ４−ＤＣをワクチンとして用いている（Davis, I. D., Jefford, M., Parente, P. & Cebon, J. Rational approaches to human cancer immunotherapy. J Leukoc Biol 73, 3-29 (2003)）。しかし、最近の発見によると、ＤＣの従来の生成方法に代わる新たな方法が指摘されている。例えば、黒色腫ペプチドをパルスしたＩＬ１５−ＤＣは、インビトロでの抗原特異的ＣＴＬの分化の誘発についてＩＬ４−ＤＣよりも効果的であるが、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を刺激するそれらの能力は同程度である（Mohamadzadeh, M. et al. Interleukin 15 skews monocyte differentiation into dendritic cells with features of Langerhans cells. J Exp Med 194, 1013-20 (2001)）。同様に、３日間の培養で生成したＩＦＮα−ＤＣは、特異的免疫の誘発に効果的であることが分かっている（Santini, S. M. et al. Type I interferon as a powerful adjuvant for monocyte-derived dendritic cell development and activity in vitro and in Hu-PBL-SCID mice. J Exp Med 191, 1777-88. (2000)）。したがって、これらの別個のＤＣワクチンの免疫原性は、臨床研究においてインビボで試験するに値するものである。

【0029】

抗原の取込み。ＤＣ上のＭＨＣクラスＩ分子及びＭＨＣクラスII分子への、特徴的な抗原に由来するペプチドの取込みは、ＤＣワクチン接種に最も一般に用いられる戦略である（Gilboa, E. The makings of a tumor rejection antigen. Immunity 11, 263-70 (1999)、Wang, R. F., Wang, X., Atwood, A. C., Topalian, S. L. & Rosenberg, S. A. Cloning genes encoding MHC class II-restricted antigens: mutated CDC27 as a tumor antigen. Science 284, 1351-4 (1999)）。この技術は「概念の証明」の研究に重要なものであるが、ペプチドの使用はさらなるワクチン開発を制限する。即ち、所与のＨＬＡ型に対する制限、よく特徴付けされた腫瘍関連抗原（ＴＡＡ、tumor-associated antigens）の数の制限、比較的迅速な外因性ペプチド−ＭＨＣ複合体の代謝回転のために注射後にＤＣが流入領域リンパ節内に到達する時点での抗原提示が比較的低くなること、及びＴ細胞クローンのレパートリーの誘発が限定されているために、腫瘍抗原の変化を制御する免疫系の能力を制限することである。これらのペプチドの多くは自然にプロセシングされたエピトープとは異なり得る。したがって、効率を向上させ、ＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＣＴＬの多くのクローンを伴う様々な免疫応答の生成を可能にするために、全抗原調製物をＤＣに取り込ませて、「自然な」プロセシング及びエピトープの選択を可能にすることが期待される。これらの戦略のすべてにおいて、組換えタンパク質、エキソソーム（Zitvogel, L. et al. Eradication of established murine tumors using a novel cell-free vaccine: dendritic cell-derived exosomes. Nat Med 4, 594-600 (1998)）、ウイルスベクター（Ribas, A., Butterfield, L. H., Glaspy, J. A. & Economou, J. S. Cancer immunotherapy using gene-modified dendritic cells. Curr Gene Ther 2, 57-78 (2002)）、プラスミドＤＮＡ、ＲＮＡのトランスフェクション（Boczkowski, D., Nair, S. K., Snyder, D. & Gilboa, E. Dendritic cells pulsed with RNA are potent antigen-presenting cells in vitro and in vivo. J Exp Med 184, 465-72 (1996)）、免疫複合体（Regnault, A. et al. Fcgamma receptor-mediated induction of dendritic cell maturation and major histocompatibility complex class I-restricted antigen presentation after immune complex internalization. J Exp Med 189, 371-80 (1999)）、及びＤＣ表面分子に特異的な抗体（Gilboa, E. The makings of a tumor rejection antigen. Immunity 11, 263-70 (1999)、Fong, L. & Engleman, E. G. Dendritic cells in cancer immunotherapy. Annu Rev Immunol 18, 245-73 (2000)）をＤＣに取り込ませる。

【0030】

別の技術は、貪食され死滅した腫瘍細胞のペプチドをＭＨＣクラスＩ分子（またクラスII分子）上に提示するＤＣの能力を利用することを伴う。これはクロスプライミングとして知られている（Albert, M. L., Sauter, B. & Bhardwaj, N. Dendritic cells acquire antigen from apoptotic cells and induce class I- restricted CTLs. Nature 392, 86-9 (1998)、Berard, F. et al. Cross-Priming of Naive CD8 T Cells against Melanoma Antigens Using Dendritic Cells Loaded with Killed Allogeneic Melanoma Cells. J Exp Med 192, 1535-1544 (2000)）。実際、死滅した同種の黒色腫細胞系、前立腺がん細胞系、又は乳がん細胞系で培養されたＤＣは、インビトロで、腫瘍抗原に対してナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞をプライミングする（Berard, F. et al. Cross-Priming of Naive CD8 T Cells against Melanoma Antigens Using Dendritic Cells Loaded with Killed Allogeneic Melanoma Cells. J Exp Med 192, 1535-1544 (2000)、Neidhardt-Berard, E. M., Berard, F., Banchereau, J. & Palucka, A. K. Dendritic cells loaded with killed breast cancer cells induce differentiation of tumor-specific cytotoxic T lymphocytes. Breast Cancer Res 6, R322-8 (2004)）。転移性黒色腫を有する２０人の患者が、これまでに、ＢＩＩＲで、死滅した同種の黒色腫細胞系に事前に曝露した単球由来の自己ＤＣでワクチン接種されている（月に８回のワクチン）。ワクチン接種は安全であることが明らかになり（自己免疫又は他の有害な事象がない）、黒色腫特異的なＴ細胞免疫の誘発をもたらした。２人の患者において、長時間の腫瘍の退縮が見られた。これらの結果は、ワクチン調製手法の効果を証明するための、さらなる臨床研究に値するものである。

【0031】

ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮαは樹状細胞ワクチンを誘導した。ＩＦＮの生物学におけるいくつかの最近の発見により、この分子ファミリーへの免疫学者の興味が再び喚起された。これらの発見には、１）形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ（plasmacytoid dendritic cells）、ヒト及びマウスのＤＣのサブセット）がウイルスシグナルに応じて大量のＩ型ＩＦＮを速やかに分泌することの実証（Siegal, F. P. et al. The nature of the principal type 1 interferon-producing cells in human blood [In Process Citation]. Science 284, 1835-7 (1999)）、未成熟の骨髄ＤＣを活性化する（Cella, M. et al. Maturation, activation, and protection of dendritic cells induced by double-stranded RNA. J Exp Med 189, 821-9 (1999)）、及びＤＣへの単球の分化を誘発する（Santini, S. M. et al. Type I interferon as a powerful adjuvant for monocyte-derived dendritic cell development and activity in vitro and in Hu-PBL-SCID mice. J Exp Med 191, 1777-88. (2000)、Montoya, M. et al. Type I interferons produced by dendritic cells promote their phenotypic and functional activation. Blood 99, 3263-71 (2002)）、ＩＦＮα／βの能力、３）記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞の生成（Sprent, J., Tough, D. F. & Sun, S. Factors controlling the turnover of T memory cells. Immunol Rev 156, 79-85 (1997)、Marrack, P., Kappler, J. & Mitchell, T. Type I interferons keep activated T cells alive. J Exp Med 189, 521-30 (1999)）及び抗体応答の刺激（Jego, G. et al. Plasmacytoid dendritic cells induce plasma cell differentiation through type I interferon and interleukin 6. Immunity 19, 225-34 (2003)、Le Bon, A. et al. Type i interferons potently enhance humoral immunity and can promote isotype switching by stimulating dendritic cells in vivo. Immunity 14, 461-70 (2001)、Proietti, E. et al. Type I IFN as a natural adjuvant for a protective immune response: lessons from the influenza vaccine model. J Immunol 169, 375-83 (2002)）における、ＩＦＮα／βの活性、４）全身性エリテマトーデスの発症におけるＩＦＮα／βの主要な役割（Blanco, P., Palucka, A. K., Gill, M., Pascual, V. & Banchereau, J. Induction of dendritic cell differentiation by IFN-alpha in systemic lupus erythematosus. Science 294, 1540-3 (2001)、Bennett, L. et al. Interferon and granulopoiesis signatures in systemic lupus erythematosus blood. J Exp Med 197, 711-23 (2003)）、５）ＬＰＳシグナル伝達及び敗血性ショックの進行におけるＩＦＮα／βの必須の役割によって示される、免疫系を活性化するための低レベルのＩＦＮα／βの分泌（Karaghiosoff, M. et al. Central role for type I interferons and Tyk2 in lipopolysaccharide-induced endotoxin shock. Nat Immunol 4, 471-7 (2003)）が含まれる。

【0032】

本発明者らにより、インフルエンザウイルスに特異的なヒトの液性応答の誘発においてＩＦＮαが必須であることが最近認められた（Jego, G. et al. Plasmacytoid dendritic cells induce plasma cell differentiation through type I interferon and interleukin 6. Immunity 19, 225-34 (2003)）。これにより、ＩＦＮαがＣＴＬの生成を、とりわけ腫瘍抗原に対するＣＴＬの生成を増強し得る可能性が提起された。

【0033】

ＩＦＮ−ＤＣは細胞溶解性ＣＤ８^＋Ｔ細胞を効果的に活性化する。ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮαと単球とを培養することにより単球から生成されたＤＣワクチン（ＩＦＮ−ＤＣ）の生物学的特性を、２つのこれまでの製品、即ちＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦ又はＩＬ−４のいずれかと単球とを培養することにより作製されたＤＣワクチン（それぞれＴＮＦ−ＤＣ又はＩＬ４−ＤＣ）と比較した。同種ＣＤ８^＋Ｔ細胞を各ＤＣサブセットと５日間培養し、その後、細胞選別により再精製し、フローサイトメトリーによって分析した。結果は、ＩＦＮ−ＤＣが、グランザイムＡ及びＢ（図１）並びにパーフォリン（図示せず）のような細胞溶解性Ｔ細胞分子を非常によく発現するＣＤ８^＋Ｔ細胞を誘発し得ることを顕著に示した。

【0034】

ＩＦＮ−ＤＣは成熟刺激物質に対して差異的に応答する。がんワクチンにおけるＩＦＮ−ＤＣの役割をさらに特徴付けするために、ＣＤ４０リガンド、イオノマイシン、並びに、ＬＰＳ（ＴＬＲ４）、ポリＩ：Ｃ（ＴＬＲ３）、及びザイモサン（ＴＬＲ２）などのＴＬＲリガンドを含む様々な活性化シグナルにインビトロで曝露したＩＦＮ−ＤＣにおいて、サイトカインの生物学的痕跡を分析した。精製された単球をＧＭ−ＣＳＦ及び組換えヒトＩＦＮα２ａと共に培養することにより生成したＩＦＮ−ＤＣを、様々な刺激物質、及び培養上清内へのサイトカイン／ケモカイン分泌物に曝露し、Multiplexサイトカインビーズ（Luminex社製）を用いて異なる時点で測定した。予備分析により、分泌されたサイトカインのプロフィールは４８時間の暴露にわたって顕著には変化しないことが明らかになった（図示せず）。図２に示すように、サイトカインの主要な応答は、ＬＰＳにより誘発され、その後、ポリＩ：Ｃ及びイオノマイシンにより誘発された。サイトカインのわずかな分泌のみが、ＣＤ４０リガンド又はザイモサンへの暴露で誘発された。これらの予備的な結果は、異なる活性化シグナルが、ＩＦＮ−ＤＣにおいてサイトカインの異なる痕跡を誘発することを示す。

【0035】

Ｔ細胞成長因子であるＩＬ−７の分泌はＩＦＮ−ＤＣ類独特のものである。単一のサイトカイン分析において、ＩＦＮ−ＤＣが検出可能なレベルのＩＬ−７を自然発生的に分泌する一方で（図３）、活性化されていないＩＬ４−ＤＣはそのような分泌が不可能であることが観察された。しかし、Ｉ型インターフェロン経路を活性化することが知られているシグナル（リポ多糖（ＬＰＳ）及びポリＩ：Ｃ）では生じるがＣＤ４０リガンド又はザイモサンでは生じない、ＩＬ４−ＤＣの活性化により、ＩＬ−７の分泌が誘発された（図３）。これらの結果により、１）ＩＦＮ−ＤＣによるＩＬ−７の分泌は、ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞をプライミングするＩＦＮ−ＤＣの優れた能力に関与している可能性がある；２）Ｉ型インターフェロンは骨髄ＤＣによるＩＬ−７の分泌を調節すると考えられるという、Ｔ細胞の活性化についての２つの重要な結論が得られる。

【0036】

ＩＦＮ−ＤＣは腫瘍特異的ＣＴＬを効果的にクロスプライミングする。ＩＦＮ−ＤＣが本当により強力にＣＴＬを刺激するかを決定するために、死滅した黒色腫細胞又は乳がん細胞をＤＣに取り込ませて、その後、このＤＣを用いて、精製されたＣＤ８^＋Ｔ細胞を２回の培養サイクルにおいてプライミングした。ＩＦＮ−ＤＣは、がん細胞を死滅させる能力を有するＣＴＬのプライミングにおいてＩＬ４−ＤＣよりも効果的であることが観察された（図４）。ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞をプライミングするＩＦＮ−ＤＣの能力を評価するために、本発明者らは、本発明者らが以前に確立した腫瘍抗原に対する、インビトロでのクロスプライミング系を用いた。この状況において、死滅した同種腫瘍細胞をＤＣに取り込ませて、このＤＣを、２週間の培養にわたって自己ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞をプライミングするために用いた。図５に示すように、死滅した同種ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１＋Ｍｅ２９０黒色腫細胞を取り込んだＩＦＮ−ＤＣは、免疫付与に用いられるＭｅ２９０細胞を死滅させる能力を有するＣＴＬのプライミングにおいて非常に効果的である。黒色腫特異的なＣＤ８^＋Ｔ細胞の存在は、四量体に特異的なＴ細胞の分析によってさらに裏付けられた。図６に示すように、誘発されたＣＤ８^＋Ｔ細胞はＭＡＲＴ−１に特異的なＴ細胞の亜集団を含む。

【0037】

したがって、ＩＦＮ−ＤＣは、ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞をクロスプライミングして、腫瘍抗原に特異的なＣＴＬに分化させることについて非常に効果的であるということが示されている。この所見は、がんワクチンについての、潜在的に高い治療的意義を有している。したがって、ＩＦＮ−ＤＣは、腫瘍特異的免疫の誘発においてより効果的であり、このことは、臨床症状にある患者におけるＩＦＮ−ＤＣのインビボでの活性のさらなる試験に値するものである。

【0038】

ＤＣワクチンを取り込ませるための、免疫原性の高い死滅した腫瘍細胞の生成。がん治療における、単独での、又は放射線治療の補助としての温熱療法の使用は、長年の間、臨床的な関心の対象であった（Woodhall, B., Pickrell, K. L., Georgiade, N. G., Mahaley, M. S. & Dukes, H. T. Effect of hyperthermia upon cancer chemotherapy; application to external cancers of head and face structures. Ann Surg 151, 750-9 (1960)）。温熱療法は、放射線治療及び／又は放射線免疫療法と組み合わせると特に効果的であると考えられる（総説は（Mattson, D. et al. Heat shock and the activation of AP-1 and inhibition of NF-kappa B DNA-binding activity: possible role of intracellular redox status. Int J Hyperthermia 20, 224-33 (2004)、Gius, D., Mattson, D., Bradbury, C. M., Smart, D. K. & Spitz, D. R. Thermal stress and the disruption of redox-sensitive signalling and transcription factor activation: possible role in radiosensitization. Int J Hyperthermia 20, 213-23 (2004)）参照）。温熱療法が放射線増感をもたらす分子メカニズムは明らかではないが、初期応答遺伝子及び熱ショック因子（ＨＳＦ、heat shock factors）の活性化、並びにその後の熱ショックタンパク質（ＨＳＰ、heat shock proteins）の活性化が、この事象に関与すると考えられる（Berwin, B. & Nicchitta, C. V. To find the road traveled to tumor immunity: the trafficking itineraries of molecular chaperones in antigen-presenting cells. Traffic 2, 690-7 (2001)）。ＨＳＰは異なるタンパク質のスーパーファミリーを構成し、このタンパク質は、例えばｈｓｐ７０のように、それらの分子量に従って運用上名付けられている。ほとんどのＨＳＰは構成的に発現し、温度上昇を含むストレス条件下においてさらに誘発される。ＨＳＰは、細胞質における生成からＥＲにおけるＭＨＣクラスＩへの結合までペプチドを介添えする、分子リレー系であると考えられている（Basu, S. & Srivastava, P. K. Heat shock proteins: the fountainhead of innate and adaptive immune responses. Cell Stress Chaperones 5, 443-51 (2000)、Frydman, J. Folding of newly translated proteins in vivo: the role of molecular chaperones. Annu Rev Biochem 70, 603-47 (2001)）。ＨＳＰ７０、ＨＳＰ６０、及びＧＰ９６は最近、抗原タンパク質又は抗原ペプチドとのクロスプライミングのための免疫アジュバントとして確立されている（Srivastava, P. K., Udono, H., Blachere, N. E. & Li, Z. Heat shock proteins transfer peptides during antigen processing and CTL priming. Immunogenetics 39, 93-8 (1994)、Srivastava, P. Interaction of heat shock proteins with peptides and antigen presenting cells: Chaperoning of the Innate and Adaptive Immune Responses. Annu Rev Immunol 20, 395-425 (2002)）。このプロセスにおいて、再構築されたｈｓｐ７０−ペプチド複合体又はｇｐ９６−ペプチド複合体を、ＣＤ９１（Basu, S., Binder, R. J., Ramalingam, T. & Srivastava, P. K. CD91 is a common receptor for heat shock proteins gp96, hsp90, hsp70, and calreticulin. Immunity 14, 303-13 (2001)）、ＣＤ４０（Becker, T., Hartl, F. U. & Wieland, F. CD40, an extracellular receptor for binding and uptake of Hsp70-peptide complexes. J Cell Biol 158, 1277-85 (2002)）、ＬＯＸ−１（Delneste, Y. et al. Involvement of LOX-1 in dendritic cell-mediated antigen cross-presentation. Immunity 17, 353-62 (2002)）、又はＴＬＲ２／４（Asea, A. et al. Novel signal transduction pathway utilized by extracellular HSP70: role of toll-like receptor (TLR) 2 and TLR4. J Biol Chem 277, 15028-34 (2002)）を介した受容体介在性のエンドサイトーシスを経て、ＤＣを含む抗原提示細胞（ＡＰＣ、antigen presenting cells）によって内在化した。したがって、本発明者らは、温熱療法がクロスプライミングを増強し得、それにより、腫瘍の退縮の増強を可能にするワクチンの製造に寄与することを認識した。

【0039】

加熱した黒色腫細胞。現在の調査の目的は、ワクチン接種の目的のための、免疫原性が高くＤＣの取込みに用い得る、改変された腫瘍細胞体を生み出すことであった。したがって、ＨＳＰ７０を過剰発現する黒色腫細胞系が実際により免疫原性であるという前提を確立したことで（図示せず）、この調査の焦点は今や、臨床級の状態におけるＨＳＰの発現を増大させるための手段の開発に変わった。したがって、黒色腫細胞の熱処理が、取り込んだＤＣの免疫原性を増大させ得るかどうかについて決定した。

【0040】

黒色腫細胞の熱処理によりＨＳＰ７０が増大する。黒色腫細胞系を４２℃で４時間インキュベートした（熱ショック）。予想通り、ＥＬＩＳＡ（図示せず）又は細胞内染色（図７）によるＨＳＰ発現の分析により、ＨＳＰ７０の顕著な上方調節が明らかになった（Mattson, D. et al. Heat shock and the activation of AP-1 and inhibition of NF-kappa B DNA-binding activity: possible role of intracellular redox status. Int J Hyperthermia 20, 224-33 (2004)）。死滅した黒色腫細胞（黒色腫体）を、ベツリン酸（ＢＡ、betulinic acid）の導入により、未処理の又は熱ショックで処理した細胞から生成した。

【0041】

熱処理した黒色腫体を取り込んだＤＣにより、黒色腫細胞を死滅させ得るＣＴＬが迅速に得られる。取り込んでいないＤＣ（ＣＴＬ１）、コントロールの黒色腫体を取り込んだＤＣ（ＣＴＬ２）、及び熱ショックを与えた黒色腫体を取り込んだＤＣ（ＣＴＬ３）を、精製したナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞と共に２週間培養した。Ｔ細胞の培養物を１回再刺激し（計２回の刺激）、可溶性のＣＤ４０リガンド及び低用量のＩＬ−７（１０Ｕ／ｍｌ、全培養物）と、２週目にＩＬ−２（１０Ｕ／ｍｌ）とを補った。再刺激の７日後にＴ細胞を分析した（全部で１４日間の培養）。

【0042】

熱処理したＭｅ２７５黒色腫体を取り込んだＤＣと共に培養したＴ細胞はＭｅ２７５細胞を死滅させ得るが、コントロールの黒色腫体を取り込んだＤＣと共に培養したものは死滅させ得ないことが認められた（図８）。Ｋ５６２の溶解が見られなかったため、死滅はＴ細胞に特異的なものであった。さらに、２回の刺激の後、Ｔ細胞は別のＨＬＡ−Ａ^＊０２０１黒色腫細胞系（Ｍｅ２９０）を死滅させ得（図示せず）、このことは、共通抗原に対するクロスプライミングが生じ得ることを示唆している。ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１ＭＣＦ７乳がん細胞が溶解しなかったため（図示せず）、死滅は黒色腫細胞に特異的なものであった。ｍＡｂ Ｗ６／３２を遮断するＭＨＣクラスＩで標的細胞を事前処理すると、異なるＥ：Ｔ比率でＭｅ２７５の死滅の６０％超が阻害されたため（図示せず）、最後に、ＭＨＣクラスＩの発現により、黒色腫細胞の死滅を少なくとも部分的に制限した。

【0043】

熱ショックを与えた黒色腫体を取り込んだＤＣにより、黒色腫特異的ＣＴＬが迅速に得られる。熱処理した黒色腫体でプライミングしたナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞は、４つの黒色腫ペプチドを取り込んだＴ２細胞を特異的且つ効果的に死滅させ得るが、ＰＳＡペプチドを取り込んだものは死滅させ得ない。黒色腫細胞系も破壊されたが、乳腺細胞系のＭＣＦ７細胞及びＫ５６２細胞は影響を受けなかった（図９）。熱処理して死滅させた黒色腫細胞を取り込んだＤＣにより、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞は効果的に、黒色腫特異的な細胞傷害性Ｔ細胞となった。

【0044】

四量体の結合分析によりこの所見が裏付けられ、最大０．４％のＣＤ８^＋Ｔ細胞がＭＡＲＴ−１に特異的であることが示された（図１０）。しかし他の特異性はほとんど検出されなかった。したがって、２回目の刺激の７日後、４つの黒色腫ペプチドの各々又はコントロールのＰＳＡペプチドをパルスした自己ＤＣでＴ細胞を再刺激した。これらの培養物を培養の７日後に分析した。結果は、黒色腫ペプチドをパルスしたＤＣでのブーストにより黒色腫特異的なＣＤ８^＋Ｔ細胞が増加する一方で（図１０）、コントロールのペプチドでのブーストにおいては増加の増大は見られない（図示せず）ことを示した。したがって、黒色腫細胞の熱処理により、黒色腫特異的な応答が増強する。

【0045】

黒色腫細胞の熱処理により、腫瘍抗原の転写が増強される。増強したクロスプライミングが熱ショックタンパク質の発現の増強によるものであろうという最初の仮説は、精製されたＨＳＰ７０、ＨＳＰ６０、及びＧＰ９６が抗原タンパク質又は抗原ペプチドとのクロスプライミングのための免疫アジュバントの役割を担うことを実証した研究と一致することが分かった（Srivastava, P. K., Udono, H., Blachere, N. E. & Li, Z. Heat shock proteins transfer peptides during antigen processing and CTL priming. Immunogenetics 39, 93-8 (1994)、Srivastava, P. Interaction of heat shock proteins with peptides and antigen presenting cells: Chaperoning of the Innate and Adaptive Immune Responses. Annu Rev Immunol 20, 395-425 (2002)）。しかし、コントロール及びＨＳＰ７０を形質導入したＳｋ−Ｍｅｌ２８細胞をマイクロアレイ分析したところ、ＭＡＧＥ−Ａ１０を含むいくつかの腫瘍抗原の転写の増大（図示せず）が観察された。したがって、ＭＡＧＥ腫瘍抗原ファミリーの異なるメンバーをコードする１２個の遺伝子をリアルタイムＰＣＲでの発現により測定した。これらの抗原は、ＭＡＧＥ−Ｂ３、ＭＡＧＥ−Ａ８（図１１）、ＭＡＧＥ−Ｂ４、及びＭＡＧＥ−Ａ１０（図示せず）を含むものであった。アクチノマイシンＤへの感受性に加え、ＭＡＧＥ−Ｂ３の発現は最大１万倍まで増大し、したがって、活性な転写が確認された（図１１）。

【0046】

したがって、ＭＡＧＥ−Ａ８及びＭＡＧＥ−Ａ１０に由来するＨＬＡ−Ａ^＊０２０１制限ペプチドを同定し、熱処理した黒色腫体を取り込んだＤＣがこれらの２つのエピトープに特異的なＣＴＬをプライミングし得るかどうかを決定するための分析を行った。図１２に示すように、熱いＨＬＡ−Ａ^＊０２０１^＋Ｍｅ２９０細胞又はＨＬＡ−Ａ^＊０２０１^ｎｅｇＳｋ−Ｍｅｌ２８細胞に対してプライミングされたＨＬＡ−Ａ^＊０２０１^＋ＣＴＬは、加熱していない黒色腫細胞に対してプライミングされたＣＴＬよりも、ＭＡＧＥ−Ａ１０四量体を結合しているＣＤ８^＋Ｔ細胞を高い頻度で提示した。

【0047】

したがって、温熱療法により増大した腫瘍抗原の転写は、クロスプライミングの増強に寄与し得る。熱処理して死滅させた黒色腫体を取り込んだＤＣは、自己ナイーブＣＤ８＋細胞又はＣＤ４＋Ｔ細胞を誘発してＩＦＮγのレベルを上昇させ、ＩＬ−１０調節／抑制Ｔ細胞のレベルの低下は、がんに対する患者の良好なワクチン接種における主要な障害の１つであると考えられる。図１３に示すように、熱処理して死滅させた黒色腫細胞をＤＣワクチンに取り込ませることにより、加熱していない腫瘍を取り込んだＤＣとの培養物と比較して、ＩＬ−１０の分泌が減少し、ＩＦＮγの産生が増大した。これらの結果は、臨床試験におけるインビボでのＤＣの取込みについての特有の戦略を支持するものである。したがって、熱処理して死滅させた黒色腫細胞をＤＣワクチンに取り込ませることにより、広範な黒色腫特異的な１型ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫が誘発される。

【0048】

本発明は、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮαを有する単球に由来し、且つ死滅した同種Ｃｏｌｏ８２９黒色腫細胞を取り込んだ、自己樹状細胞を含む。自己樹状細胞は、アフェレーシスにより得られた末梢血単核球からエルトリエーションにより分離された単球から製造される。単球を、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及びインターフェロンα（ＩＦＮα）の存在下での閉鎖系において培養し、加熱して死滅させた同種ＣＯＬＯ８２９腫瘍細胞を取り込ませて、冷凍保存する。ワクチンは液体窒素（気相）内に保存する。

【0049】

樹状細胞は、単球を単離するためにElutraシステム（Gambro BCT社製）を用いてプロセシングされたアフェレーシス生成物から製造される。単球をエルトリエーションバッグから培養バッグ（いずれも１００ｍｌ容積）に移し、１×１０^６個／１ｍｌ容積で７２時間培養する。この例において、培地は、組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ、Berlex社製）及びインターフェロンα２ｂ（５００ＩＵ／ｍｌ、Schering Plough社製）を補った無血清培地を含むものであった。しかし、当業者には、活性化を最大にするための、ＧＭ−ＣＳＦ及び／又はインターフェロンαへの細胞の暴露の量、タイミング、及び長さを漸増することが既知であろう。培養の最初の２４時間後、死滅したＣｏｌｏ８２９細胞をワクチンに取り込ませる。全部で７２時間の培養の後、樹状細胞を採取し、培地及びサイトカインを通常の生理食塩水で洗い落とす。１０％ＤＭＳＯ及び１０％Plasmalyteを含む自己血清内に細胞を再懸濁し、３０×１０^６個細胞／バイアルでクライオバイアル内に分配する。クライオバイアルを自動速度制御凍結装置を用いて凍結し、液体窒素（気相）内で保存する。

【0050】

【表1】

【0051】

単離。アフェレーシス。ＰＢＭＣを回収する。自己末梢血単核球を、COBE SPECTRA（商標）を用いてアフェレーシスにより得る。

【0052】

溶出（elutriation）。単球を単離する。次に、GAMBRO BCT ELUTRA（商標）で、末梢血単核球から単球を単離する。Elutraシステムは半自動の閉鎖系の遠心分離機であり、サイズ及び密度に基づいて細胞を複数の画分に分離するための連続的なカウンターフローエルトリエーション技術を用いるものである。Elutraシステムが対象とする用途は、単球の濃縮である。このシステムは、サイズ及び密度に基づいて細胞の５つの画分を自動的に回収する。画分５は濃縮された単球の集団（約９０％の純度、Ｎ＝７人の健康なボランティアのアフェレーシス）を含み、この集団を樹状細胞ワクチンの製造に用いる。

【0053】

培養。画分５を含むバッグを遠心分離し、緩衝生理食塩水を送り出し、廃棄する。CellGenix ＤＣ培地内に細胞を再懸濁し、細胞計数、生存率、及び表現型のためにサンプルを取り出す。単球の数を決定した後、１×１０^６個単球／ｍＬの濃度まで細胞を希釈し、無菌でAFC VueLife培養バッグに連結する。１００ｎｇ／ｍＬの濃度のサイトカインＧＭ−ＣＳＦ（Leukine（登録商標））（Berlex Inc.社製）及び５００ＩＵ／ｍＬの濃度のＩＦＮα−２ｂ（イントロンＡ）（Schering-Plough Corp.社製）を加え、培養のために、３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーター内に細胞を置く。

【0054】

取込み。培養の開始から２４時間後、死滅した腫瘍細胞（ＣＯＬＯ８２９）を抗原源として加え、同様にＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮα−２ｂの二次投与も行う。死滅したＣＯＬＯ８２９を、γ線照射を用いてバッチ内に調製し、無菌性とトリチウム化したチミジンの取り込みにより測定される増殖不能性とについて試験し、５０×１０^６個／ｍＬの濃度で１０％ＤＭＳＯと共にクライオバイアル内に凍結し、気相の窒素内で保存する。適当な数のクライオバイアルを解凍し、２個の樹状細胞当たり１個の死滅した腫瘍細胞をＤＣに取り込ませる。死滅したＣＯＬＯ８２９を培地で３回洗浄し、培養バッグに少量加える。

【0055】

樹状細胞の採取。培養の開始から７２時間後、細胞を採取しワクチンを冷凍保存する。培養バッグを遠心分離し、上清を送り、細胞を通常の生理食塩水で３回洗浄する。洗浄は、通常の生理食塩水のバッグを培養バッグに連結すること、通常の生理食塩水内に細胞を再懸濁すること、培養バッグを遠心分離すること、及び通常の生理食塩水を廃棄物回収バッグに送ることからなる。３回目の洗浄の後、凍結溶液希釈剤であるPlasmalyte内に細胞を再懸濁する。細胞計数及び生存率のためにサンプルを取り出す。

【0056】

速度制御された凍結。速度制御凍結装置を用いてバイアルを凍結した。バイアルを凍結室に置き、電子ソレノイドバルブを通して液体窒素を室内に入れる。気化はほぼ瞬間的であるため、液体窒素が室内へ入る速度の制御は、熱が吸収され凍結室及びその内容物から取り除かれる速度を直接制御する。

【0057】

冷凍保存。３０×１０^６個細胞／ｍＬの濃度で細胞を冷凍保存する。細胞数を決定した後、細胞を、自己血清で最終濃度の２倍に希釈する。細胞容積に等しい容積を含む凍結溶液バッグを調製する。凍結溶液は、２０％ＤＭＳＯ及び２０％plasmalyteを含む自己血清である。迅速に作業して、凍結溶液を細胞バッグに加え、ラベルを付したクライオバイアルに細胞を移す。ＤＭＳＯの最終濃度は１０％である。自動速度制御凍結装置を１℃／分で用いてクライオバイアルを凍結し、気相の窒素内に保存する。

【0058】

保存。長期保存のために、速度制御凍結装置から液体窒素のタンクへクライオバイアルを移す。在庫管理は、ＧＭＰに精通した者によりデータベース内に維持される。

【0059】

【表2】

【0060】

活性な薬学的成分の最終剤形の安定性。説明。１ｍＬの冷凍保存した細胞を含むバイアルを３７℃で速やかに解凍し、即座に、９ｍＬの無菌の通常の生理食塩水を含むシリンジ内に引き込んだ（注入の直前に臨床部位で細胞が解凍する条件）。通常の生理食塩水は、室温か、又は４℃（冷蔵）であった。次に、細胞を６個の試験管に均等に分配し、室温又は冷蔵で維持した。その後、希釈した細胞を様々な時点でアッセイした。

【0061】

【表3】

【0062】

【表4】

【0063】

【表5】

【0064】

【表6】

【0065】

ロットの出荷のための満足な結果は、生存細胞の少なくとも５０％の回収、及び、室温で解凍した１５分後の少なくとも５０％の生存率である。出荷試験は、凍結プロセスの開始時（第１）、中間（第２）、及び終了時（第３）に得られた３つのバイアルで行う。

【0066】

凍結ワクチンの特徴付け。上述した生存率及びＣＤ４＋Ｔ細胞とのＭＬＲを刺激する能力以外でさらに凍結ワクチンをさらに特徴付けするために、（１）形態及び表現型、（２）サイトカインの分泌、並びに／又は（３）自己ＣＤ８＋Ｔ細胞の分化を誘発する能力のうちの１つ又は複数を分析し得る。

【0067】

図１４は、本発明のワクチン製造プロセスの全体を概説するフローチャートである。ステップ１０において、ワクチン産生プロセスに包含するために患者を選択する。ステップ１２において、患者の血液アフェレーシスを行い、ステップ１４において得られ選択される、取り込ませるための細胞を単離する。ステップ１０、１２、及び１４は１日目に実施し得る。その後数日の間に、細胞を培養し（ステップ１６）、ステップ１６において得られ培養された、抗原を取り込んだ樹状細胞により提示される抗原（複数も）をこの細胞に取り込ませる（ステップ１８）。次に、ステップ２０において、さらなる使用のために細胞を凍結及び保存し得、且つ／又は最終的にはステップ２２において解凍、出荷し得る。最後に、ステップ２４において細胞ワクチンを注射に用い得る。一実施形態において、プロセス全体は約１０日間で行い得る。

【0068】

図１５は、細胞をエルトリエーションバッグに入れ（ステップ２６）、且つ１つ又は複数の培養バッグに移す（ステップ２８）、本発明のワクチンの製造の詳細なステップ及びスケジュールを示す。ステップ３０において、例えば、３日間の培養にわたって、１つ又は複数のサイトカインを０時間目に入れる。細胞をサイトカインに晒した後、細胞を死滅した標的細胞、例えばＣｏｌｏ６２９細胞に晒し、さらにサイトカインに晒してもよい。最後に、細胞を約７２時間後に採取し得、且つ／又は、凍結、試験、滅菌などをし得る。

【0069】

ＩＦＮα−ＤＣを、死滅したＣｏｌｏ８２９細胞を取り込んでいないか又は取り込んだ培養バッグ内で生成し、１、２、及び３週間にわたって−８０℃で凍結及び保存した。凍結した細胞を１、２、及び３週間目に解凍し、それらの形態をギムザ染色により評価した。図１６に示すように、取り込んだ及び取り込んでいないＩＦＮ−ＤＣの両方が、凍結／解凍の後にＤＣの形態を保持していた。

【0070】

図１７は、示した抗体を用いた表面の染色及びフローサイトメトリーにより分析した、凍結／解凍したワクチンの表現型の例を示す。ＤＣは、ＩＦＮαの存在下におけるそれらの生成と一致する、予想通りの表現型を示し、それには、ＣＤ１分子（ＣＤ１ａ及びＣＤ１ｂ／ｃ）の発現、間質性ＤＣであるＩＦＮ−ＤＣと一致するＣＤ１４の発現、高レベルのＨＬＡ−ＤＲ、並びに共刺激性のＣＤ８０分子及びＣＤ８６分子が含まれる。したがって、凍結／解凍したワクチンはＩＦＮ−ＤＣの形態及び表現型を保持している。

【0071】

Ｔ細胞と相互作用して、ＤＣは、Ｔ細胞の分化を調節するサイトカインを分泌する。したがって、本発明者らは、Ｔ細胞のシグナルに代わる可溶性ＣＤ４０リガンドに晒した場合の、（死滅したＣｏｌｏ８２９細胞を取り込んでいない又は取り込んだ）凍結／解凍したＩＦＮ−ＤＣにより分泌されるサイトカインを評価した。６時間及び２４時間の培養の後に、Multiplexサイトカイン分析（Luminex社製）を用いて上清を評価した。１ｎｇ／ｍｌを越えるレベルで分泌される３つの主要なサイトカインには、ＩＬ−８（〜１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６、及びＭＩＰ１αが含まれた。本発明者らによる事前の臨床研究から予想されたように、ＩＦＮ−ＤＣはＩＬ−７を分泌した（図１９）。さらに、低いレベルのＩＬ−１０を検出することができた（１００ｐｇ／ｍｌ未満）。しかし、取り込んでいないＤＣ又は取り込んだＤＣの培養物においてレベルが同様であったため（図１８）、ＩＬ−１０の分泌は死滅したＣｏｌｏ８２９細胞の取込みによるものではなかった。最終的に、ＩＬ−１０の分泌はドナーに関連するものであると考えられた（データは示していない）。

【0072】

ＤＣワクチンの最終的なパラメータは、自己ＣＤ８＋Ｔ細胞に腫瘍抗原を提示し、それらの分化を誘発する能力である。したがって、凍結／解凍したＨＬＡ−Ａ^＊０２０１＋ＩＦＮ−ＤＣを、ＬＰＳ（５又は１０ｎｇ／ｍｌ）で２４時間刺激し、最後の１０時間にＭＡＲＴ−１ペプチドをパルスし、精製した自己ＣＤ８＋Ｔ細胞の刺激物質として用いた。Ｔ細胞の培養物を７日目に１回ブーストし、ＩＬ−７及びＩＬ−２を補い、ブースト後５日目に四量体の染色によりＴ細胞の分化を評価した。図１９に示すように、培養１２日目に、１：１０のＤＣ：Ｔ細胞の比率（即ち、１０^６個のＴ細胞当たり１０^５個のＤＣ）で、〜２％のＣＤ８＋Ｔ細胞がＭＡＲＴ−１四量体を特異的に結合した。さらに、ＭＡＲＴ−１に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の分化は、１：３３、即ち１０^６個のＴ細胞当たり３０００個のＤＣという低いＤＣ：Ｔ細胞の比率でも見られた。これらの結果は、凍結されたＩＦＮ−ＤＣが、それらの形態、表現型、及び抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を増加させる能力を保持していることを示す。

【0073】

転移性黒色腫を有する患者における、生成物の製造及び出荷の実現可能性についての予備的データ。これまでに、本発明者らは、ステージIVの黒色腫を有する７人の患者における生成物の製造についてのデータを集めた。これらは、現在進行中の臨床試験の過程で得られた予備的な結果である（ＩＲＢ＃００５〜０６５、ＩＮＤ＃１２３３９）。化学療法を受けた転移性黒色腫を有する患者から得た細胞を用いたこれらの予備的なロット製造のデータは、先の節において記載した健康なドナーから得た細胞を用いて展開されたプロセスの実現可能性を示唆している。以下の表に、患者の物質を用いてこれまでに製造されたロットをまとめる。

【0074】

【表7】

【0075】

【表8】

【0076】

【表9】

【0077】

【表10】

【0078】

（参考文献）
発明者の参考文献
Banchereau, J., Palucka, A.K., Dhodapkar, M., Burkeholder, S., Taquet, N., Alexandre, R., Taquet, S., Coquery, S., Wittkowski, K., Bhardwaj, N., Pineiro, L., Steinman, R., and Fay, J. (2001). Immune and clinical responses in patients with metastatic melanoma to CD34+ progenitor-derived dendritic cell vaccine. Cancer Research. 61:6451-6458.
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