特許 6134783 外傷性脳損傷の処置のため、および神経因性細胞の移動の調節のための方法および組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6134783

(24)【登録日】2017年4月28日

(45)【発行日】2017年5月24日

(54)【発明の名称】外傷性脳損傷の処置のため、および神経因性細胞の移動の調節のための方法および組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/28 20150101AFI20170515BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20170515BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20170515BHJP

【ＦＩ】

   A61K35/28ZMD

   A61P25/00

   A61P43/00 105

   A61P43/00 107

【請求項の数】10

【全頁数】23

(21)【出願番号】特願2015-512636(P2015-512636)

(86)(22)【出願日】2013年3月13日

(65)【公表番号】特表2015-517520(P2015-517520A)

(43)【公表日】2015年6月22日

(86)【国際出願番号】US2013030895

(87)【国際公開番号】WO2013172944

(87)【国際公開日】20131121

【審査請求日】2015年9月3日

(31)【優先権主張番号】61/647,893

(32)【優先日】2012年5月16日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】503235673

【氏名又は名称】サンバイオ，インコーポレイティド

(73)【特許権者】

【識別番号】398014333

【氏名又は名称】ユニヴァーシティ オブ サウス フロリダ

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ボーロンガン， シーザー ブイ．

(72)【発明者】

【氏名】ケース， ケイシー シー．

【審査官】 安藤 公祐

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１０−５３６７５６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００７−５００７５７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Cell Transplantation，２０１０年，19，973-84

【文献】 J Cereb Blood Flow Metab，２００４年，24(2)，133-50

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３５／２８

Ａ６１Ｐ ２５／００

Ａ６１Ｐ ４３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

神経原性ニッチから脳損傷部位への内因性神経原性細胞の移動を誘導するための組成物であって、前記組成物は細胞の治療的有効量を含み、前記細胞は、
（ａ）骨髄付着幹細胞（ＭＳＣ）の培養物を提供するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の細胞培養物を、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）をコードする配列を含むポリヌクレオチドと接触させるステップであって、前記ポリヌクレオチドが完全長Ｎｏｔｃｈタンパク質をコードしないステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の前記ポリヌクレオチドを含む細胞を選択するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）の前記選択された細胞を選択なしでさらに培養するステップと
を含むプロセスによって得られる細胞であり、
前記組成物は対象の前記神経原性ニッチと前記脳損傷部位との間に投与されることを特徴とする、組成物。

【請求項2】

前記神経原性ニッチが脳室下帯である、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記脳損傷が外傷性脳損傷である、請求項１に記載の組成物。

【請求項4】

脳損傷を有する対象の神経原性細胞の増殖を刺激するための組成物であって、前記組成物は細胞の治療的有効量を含み、前記細胞は、
（ａ）骨髄付着幹細胞（ＭＳＣ）の培養物を提供するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の細胞培養物を、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）をコードする配列を含むポリヌクレオチドと接触させるステップであって、前記ポリヌクレオチドが完全長Ｎｏｔｃｈタンパク質をコードしないステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の前記ポリヌクレオチドを含む細胞を選択するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）の前記選択された細胞を選択なしでさらに培養するステップと
を含むプロセスによって得られる細胞であり、
前記組成物は前記対象の神経原性ニッチと前記脳損傷部位との間に投与されることを特徴とする、組成物。

【請求項5】

神経原性細胞が増殖して対象の脳損傷部位に移動するように誘導するための組成物であって、前記組成物は細胞の治療的有効量を含み、前記細胞は、
（ａ）骨髄付着幹細胞（ＭＳＣ）の培養物を提供するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の細胞培養物を、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）をコードする配列を含むポリヌクレオチドと接触させるステップであって、前記ポリヌクレオチドが完全長Ｎｏｔｃｈタンパク質をコードしないステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の前記ポリヌクレオチドを含む細胞を選択するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）の前記選択された細胞を選択なしでさらに培養するステップと
を含むプロセスによって得られる細胞であり、
前記組成物は前記対象の神経原性ニッチと前記脳損傷部位との間に投与されることを特徴とする、組成物。

【請求項6】

前記脳損傷が外傷性脳損傷である、請求項４または５に記載の組成物。

【請求項7】

前記神経原性細胞の前記移動が、前記神経原性ニッチから前記脳損傷部位への移動である、請求項５に記載の組成物。

【請求項8】

前記神経原性ニッチが脳室下帯である、請求項７に記載の組成物。

【請求項9】

前記対象がヒトである、請求項１〜８のいずれかに記載の組成物。

【請求項10】

前記骨髄付着幹細胞（ＭＳＣ）がヒトから得られる、請求項１〜９のいずれかに記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の引用
本願は、２０１２年５月１６日に出願した米国仮特許出願第６１／６４７，８９３号の優先権の利益を主張する。米国仮特許出願第６１／６４７，８９３号の明細書および図面は、全ての目的のためにその全体が本明細書に参考として援用される。

【0002】

連邦支援に関する表明
本明細書に記載される研究の一部は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ａｎｄ Ｓｔｒｏｋｅからの補助金により援助された。米国政府は、本明細書に開示される発明に一定の権利を有することができる。

【0003】

分野
本開示は、神経障害のための細胞療法の分野である。

【背景技術】

【0004】

背景
幹細胞は細胞発達の徹底的な検査のために最初に採用され^１、神経障害の処置のための細胞ベースの療法を含む再生医療の基礎になっている^２、３。幹細胞は成人期にも存在し^８、自己再生して複数の系統に分化し^９、正常なホメオスタシスに寄与し^１０、損傷した器官、すなわち脳において内因的に^{１１〜１４}、または移植後に^{１５〜２１}治療的有益性を発揮する能力を保有する。側脳室の脳室下帯（ＳＶＺ）および海馬歯状回の顆粒下帯は、成人脳で２つの主要な幹細胞ニッチであるが^{２２、２３}、静止神経幹細胞（ＮＳＣ）が他の脳領域で検出されている^２４。損傷後の内因性幹細胞の誘導は、再生医療で新しい機会を提供する^{２、３、１１〜２１}。

【0005】

多能性幹細胞以外の細胞も、中枢神経系の障害の処置で用いられている。一例として、脳卒中の処置のために、ＳＢ６２３細胞（外因性Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインが発現されている骨髄付着幹細胞（marrow adherent stem cell）に由来する細胞である）が、虚血発作部位で、またはその近くでの移植により用いられる。例えば、米国特許第８，０９２，７９２号およびYasuharaら（２００９年）Stem Cells Devel.１８巻：１５０１〜１５１３頁を参照。米国特許第７，６８２，８２５号は、中枢・末梢神経系のいくつかの障害の処置での、ＳＢ６２３細胞のさらなる使用を記載する。

【0006】

これらの科学的な進歩および一部の初期の臨床研究^{２５〜２７}にもかかわらず、細胞療法の我々の理解における基本的なギャップは、移植された細胞が傷害を受けた神経組織の修復を促進する機構についての知識である。今日まで、移植片生存および移植片持続性の増加は、血液学的および非血液学的障害で治療的有益性をもたらすことにおいて細胞移植療法の成功の要点とみなされている。したがって、移植された細胞の生存および持続性を長くすることに多くの努力が向けられている。したがって、大量の移植された細胞の持続性を必要としない有効な細胞療法の方法が有利であろう。

【0007】

外傷性脳損傷（ＴＢＩ）は、外部の機械的力から生じる脳への傷害を指す。ＴＢＩは、他の原因の中でも、転倒、火器の傷、スポーツ事故、建築事故および車両事故から生じる可能性がある。ＴＢＩの被害者は、いくつかの物理的、認知的、社会的、感情的および／または行動的障害を被ることがある。

【0008】

ＴＢＩの初期の物理的傷害を元に戻すためにできることは、ほとんどない。したがって、処置選択肢は、急性相でさらなる傷害を予防するための安定化、およびその後のリハビリテーションから主になる。これらの限定された選択肢のため、ＴＢＩの処置のためのさらなる方法および組成物が必要である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】米国特許第８，０９２，７９２号明細書

【特許文献2】米国特許第７，６８２，８２５号明細書

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】Yasuharaら（２００９年）Stem Cells Devel.１８巻：１５０１〜１５１３頁

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0011】

概要
本発明者らは、ＳＢ６２３細胞（すなわち、外因性Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインが発現されている髄接着幹細胞に由来する細胞）の移植が、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）の処置で用いることができることを発見した。ＴＢＩ後にＳＢ６２３細胞の移植を受けた動物は、ビヒクルだけの注射を受けた外傷動物と比較して、皮質コアおよび損傷周囲の皮質エリアへの傷害の有意な低減に加えて、有意に改善された運動および神経の機能を示した。

【0012】

本発明者らは、予想に反して、多数の移植された細胞の生存および持続性がＳＢ６２３細胞移植の治療的有益性に必要とされないことも見出した。驚くべきことに、治療的有益性は、頑強で安定した機能回復を開始するのに十分である、最小限で急性の移植片生存によって得ることができる。これは、２つの主要な問題：移植できる細胞の十分な供給の必要性および長期移植片生存の必要性を解決する。

【0013】

本発明者らは、ＴＢＩの処置でのＳＢ６２３細胞移植の有益な効果が、脳室下帯（ＳＶＺ）中の神経原性ニッチと損傷脳部位の間の生物学的ブリッジ（「バイオブリッジ」）の形成から生じることも発見した。免疫組織化学的に可視化され、レーザー捕捉されたこのバイオブリッジは、初期には高レベルの細胞外マトリックスメタロプロテイナーゼを発現し、移植された細胞の流れで特徴づけられた。移植の後の時間に、移植された細胞は新たに形成された宿主細胞と置き換えられ、バイオブリッジに移植細胞はほとんど残らなかった。したがって、移植されたＳＢ６２３細胞は、神経原性ＳＶＺと損傷した皮質の間に、神経原性ニッチから脳損傷部位への宿主神経原性細胞の後の移動を促進した経路を初期に形成した。

【0014】

この一連の事象は、ＴＢＩの処置のための新規の方法、すなわち、宿主神経原性細胞の移動を方向づける一時的経路を形成するＳＢ６２３細胞の移植を明らかにする。すなわち、移植されたＳＢ６２３細胞は、神経原性ニッチと損傷部位の間にバイオブリッジを初期に形成するが、このバイオブリッジが形成されると、移植された細胞は、損傷部位に移動する宿主神経原性細胞と置き換えられる。これらの知見により、神経原性ニッチから損傷した脳部位への宿主細胞の長距離移動が、内因性修復機構の開始のためのバイオブリッジとして働く移植されたＳＢ６２３細胞を通して達成することができることが明らかになる。

【0015】

したがって、本開示は、とりわけ、以下の実施形態を提供する：
１．対象の外傷性脳損傷を処置する方ための法であって、前記方法は、ＳＢ６２３細胞の治療的有効量を対象の脳に投与することを含み、ＳＢ６２３細胞が、（ａ）骨髄付着幹細胞（ＭＳＣ）の培養物を提供するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）の細胞培養物をＮｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）をコードする配列を含むポリヌクレオチドと接触させるステップであって、前記ポリヌクレオチドが完全長Ｎｏｔｃｈタンパク質をコードしないステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）のポリヌクレオチドを含む細胞を選択するステップと、（ｄ）ステップ（ｃ）の選択された細胞を選択なしでさらに培養するステップとによって得られる方法。
２．対象がヒトである、実施形態１に記載の方法。
３．ＭＳＣがヒトから得られる、実施形態１または２のいずれかに記載の方法。
４．外傷性脳損傷の処置のための対象への移植のための細胞であって、（ａ）ＭＳＣの培養物を提供するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）の細胞培養物をＮＩＣＤをコードする配列を含むポリヌクレオチドと接触させるステップであって、前記ポリヌクレオチドが完全長Ｎｏｔｃｈタンパク質をコードしないステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）のポリヌクレオチドを含む細胞を選択するステップと、（ｄ）ステップ（ｃ）の選択された細胞を選択なしでさらに培養するステップとを含むプロセスによって得られる細胞。
５．対象がヒトである、実施形態４に記載の細胞。
６．ＭＳＣがヒトから得られる、実施形態４または５のいずれかに記載の細胞。
７．神経原性ニッチから脳損傷部位への内因性神経原性細胞の移動を誘導するための方法であって、前記方法が、ＳＢ６２３細胞の治療的有効量を対象の脳に投与することを含み、ＳＢ６２３細胞が、（ａ）ＭＳＣの培養物を提供するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）の細胞培養物をＮｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）をコードする配列を含むポリヌクレオチドと接触させるステップであって、前記ポリヌクレオチドが完全長Ｎｏｔｃｈタンパク質をコードしないステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）のポリヌクレオチドを含む細胞を選択するステップと、（ｄ）ステップ（ｃ）の選択された細胞を選択なしでさらに培養するステップとによって得られる方法。
８．神経原性ニッチが脳室下帯である、実施形態７に記載の方法。
９．脳損傷が外傷性脳損傷である、実施形態７または８のいずれかに記載の方法。
１０．対象がヒトである、実施形態７〜９のいずれかに記載の方法。
１１．ＭＳＣがヒトから得られる、実施形態７〜１０のいずれかに記載の方法。
１２．対象の神経原性細胞の増殖を刺激するための方法であって、前記方法が、ＳＢ６２３細胞の治療的有効量を対象の脳に投与することを含み、ＳＢ６２３細胞が、（ａ）ＭＳＣの培養物を提供するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）の細胞培養物をＮｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）をコードする配列を含むポリヌクレオチドと接触させるステップであって、前記ポリヌクレオチドが完全長Ｎｏｔｃｈタンパク質をコードしないステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）のポリヌクレオチドを含む細胞を選択するステップと、（ｄ）ステップ（ｃ）の選択された細胞を選択なしでさらに培養するステップとによって得られる方法。
１３．脳損傷が外傷性脳損傷である、実施形態１２に記載の方法。
１４．対象がヒトである、実施形態１２または１３のいずれかに記載の方法。
１５．ＭＳＣがヒトから得られる、実施形態１２〜１４のいずれかに記載の方法。
１６．神経原性細胞が増殖して対象の脳損傷部位に移動するように誘導するための方法
であって、前記方法が、ＳＢ６２３細胞の治療的有効量を対象の脳に投与することを含み、ＳＢ６２３細胞が、（ａ）ＭＳＣの培養物を提供するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）の細胞培養物をＮｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）をコードする配列を含むポリヌクレオチドと接触させるステップであって、前記ポリヌクレオチドが完全長Ｎｏｔｃｈタンパク質をコードしないステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）のポリヌクレオチドを含む細胞を選択するステップと、（ｄ）ステップ（ｃ）の選択された細胞を選択なしでさらに培養するステップとによって得られる方法。
１７．脳損傷が外傷性脳損傷である、実施形態１６に記載の方法。
１８．対象がヒトである、実施形態１６または１７のいずれかに記載の方法。
１９．ＭＳＣがヒトから得られる、実施形態１６〜１８のいずれかに記載の方法。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
外傷性脳損傷の処置のための対象への移植のための細胞であって、
（ａ）ＭＳＣの培養物を提供するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の前記細胞培養物を、ＮＩＣＤをコードする配列を含むポリヌクレオチドと接触させるステップであって、前記ポリヌクレオチドが完全長Ｎｏｔｃｈタンパク質をコードしないステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の前記ポリヌクレオチドを含む細胞を選択するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）の前記選択された細胞を選択なしでさらに培養するステップと
を含むプロセスによって得られる細胞。
（項目２）
前記対象がヒトである、項目１に記載の細胞。
（項目３）
前記ＭＳＣがヒトから得られる、項目１または項目２に記載の細胞。
（項目４）
対象の外傷性脳損傷を処置するための方法であって、項目１〜３のいずれかに記載の細胞の治療的有効量を前記対象の脳に投与することを含む、方法。
（項目５）
神経原性ニッチから脳損傷部位への内因性神経原性細胞の移動を誘導するための方法であって、項目１〜３のいずれかに記載の細胞の治療的有効量を対象の脳に投与することを含む、方法。
（項目６）
前記神経原性ニッチが脳室下帯である、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記脳損傷が外傷性脳損傷である、項目５に記載の方法。
（項目８）
対象の神経原性細胞の増殖を刺激するための方法であって、項目１〜３のいずれかに記載のＳＢ６２３細胞の治療的有効量を対象の脳に投与することを含む、方法。
（項目９）
神経原性細胞が増殖して対象の脳損傷部位に移動するように誘導するための方法であって、項目１〜３のいずれかに記載のＳＢ６２３細胞の治療的有効量を対象の脳に投与することを含む、方法。
（項目１０）
前記脳損傷が外傷性脳損傷である、項目９に記載の方法。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】図１は、ラットでのボディスイング試験（ＥＢＳＴ）の上昇の結果を示す。値は、ベースライン（ＴＢＩの前）ならびにＴＢＩの７日、１カ月、２カ月および３カ月後について提供される。ラットは、ＳＢ６２３細胞の移植（「細胞」、各対の右端のバー）またはビヒクルの注入（「ビヒクル」、各対の左端のバー）のいずれかを受けた。「＊」は、ｐ＜０．０５での統計的有意性を示す。

【0017】

【図2】図２は、ＳＢ６２３細胞の移植（「細胞」）またはビヒクルの注入（「ビヒクル」）をその後受けたＴＢＩを施したラットでの、改変Ｂｅｄｅｒｓｏｎ神経学的検査での平均スコアを示す。値は、ベースライン（ＴＢＩの前）ならびにＴＢＩの７日、１カ月、２カ月および３カ月後について提供される。各対の左端のバーは、ビヒクルを注入したラットのスコアを表す。各対の右端のバーは、ＳＢ６２３細胞の移植を受けたラットのスコアを表す。「＊」は、ｐ＜０．０５での統計的有意性を示す。

【0018】

【図3】図３は、ラットがＲｏｔｏｒｏｄ機器の上に留まることができた秒数の平均値を示す。ラットは実験的ＴＢＩを施し、その後ＳＢ６２３細胞の移植（「細胞」）またはビヒクルの注入（「ビヒクル」）のいずれかを受けた。値は、ベースライン（ＴＢＩの前）ならびにＴＢＩの７日、１カ月、２カ月および３カ月後について提供される。各対の左端のバーは、ビヒクルを注入したラットのスコアを表す。各対の右端のバーは、ＳＢ６２３細胞の移植を受けたラットのスコアを表す。「＊」は、ｐ＜０．０５での統計的有意性を示す。

【0019】

【図4】図４Ａおよび４Ｂは、ＴＢＩを施したラットでの皮質コア（「コア」）および衝撃部位の内外の皮質領域（「損傷周辺」）への傷害についてのアッセイの結果を示す。図４Ａは、ビヒクルの注入（パネルａ１〜ｄ１）を受けたラットと比較した、ＳＢ６２３細胞の移植（パネルａ〜ｄ）を受けたラットからの脳のＨ＆Ｅ切片を示す。図４Ｂでは、結果はビヒクルの注入を受けたＴＢＩを施した動物に対する病変エリアパーセント（実施例８を参照）で表される。各対の左端のバーは、コア領域の値を示す。各対の右端のバーは、損傷周辺領域の値を示す。

【0020】

【図5】図５は、ＴＢＩの１カ月後および３カ月後にビヒクルの注入を受けたＴＢＩを施した動物と比較した、ＳＢ６２３細胞の移植を受けたＴＢＩを施した動物の脳室下帯（「ＳＶＺ」）および皮質（「ＣＴＸ」）でのＫｉ６７標識細胞のレベルを示す。「＊」は、高倍率の１視野につき観察された標識細胞の数の統計的に有意な増加を示す（ｐ＜０．０５）。

【0021】

【図6】図６は、ＴＢＩの１カ月後および３カ月後にビヒクルの注入を受けたＴＢＩを施した動物と比較した、ＳＢ６２３細胞の移植を受けたＴＢＩを施した動物の脳室下帯（「ＳＶＺ」）および皮質（「ＣＴＸ」）でのネスチン標識細胞のレベルを示す。「＊」は、高倍率の１視野につき観察された標識細胞の数の統計的に有意な増加を示す（ｐ＜０．０５）。

【0022】

【図7】図７は、ＴＢＩの１カ月後および３カ月後にビヒクルの注入を受けたＴＢＩを施した動物と比較した、ＳＢ６２３細胞の移植を受けたＴＢＩを施した動物の脳梁（「ＣＣ」）および皮質（「ＣＴＸ」）でのダブルコルチン標識細胞のレベルを示す。「＊」は、高倍率の１視野につき観察された標識細胞の数の統計的に有意な増加を示す（ｐ＜０．０５）。

【0023】

【図8】図８は、ＴＢＩの１カ月後および３カ月後に実験的ＴＢＩを施したラットの脳からのレーザー捕捉バイオブリッジのホモジネートでの溶解活性を示す。活性は、スキャニングザイモグラフゲルによって得られる、０．５ｎｇの組換えＭＭＰ−９に対する光学密度単位で表される。２セットの３本のバーの各々において、左端のバーはＴＢＩ後にビヒクルを注入したラットからのバイオブリッジでの相対活性を表し、中央のバーはＴＢＩ後にＳＢ６２３細胞を移植したラットからのバイオブリッジでの相対活性を表し、右端のバーは対照の偽手術をしたラットからのバイオブリッジでの相対活性を表す。

【発明を実施するための形態】

【0024】

詳細な説明
外傷性脳損傷（ＴＢＩ）の処置のための方法および組成物が、本明細書で開示される。脳での幹細胞（例えば、神経幹細胞、ニューロン幹細胞）の移動のモジュレーションのための方法および組成物も、本明細書で開示される。

【0025】

本発明者らは、ＴＢＩ後の細胞移植からもたらされる行動および組織学的改善が、大規模な移植片生存または長期の移植片持続性を必要としないという意外な発見をした。実際、これらの治療的有益性をもたらすのに、適度の急性の移植片生存だけが必要である。したがって、本発明者らは、脳で持続する必要がなく、衝撃を受けた皮質エリアへ新しい細胞を生成して推進するようにＳＶＺを誘導することが可能である移植された細胞の閾値用量を伴う、神経修復のための新規方法を発見した。したがって、大量の脳損傷を抑止するために複雑な内因性復元機構を開始するのに、最小有効用量の移植および移植された細胞の急性の生存で十分である。

【0026】

本開示の実施では、特に明記しない限り、細胞生物学、毒物学、分子生物学、生化学、細胞培養、免疫学、神経学、外科、組換えＤＮＡの分野および当業技術の範囲内である関連分野で標準の方法および従来の技術を採用する。そのような技術は文献に記載されており、したがって当業者ならば入手できる。例えば、Alberts, B.ら、「Molecular Biology of the Cell」、第５版、Garland Science、New York、NY、２００８年；Voet, D.ら「Fundamentals of Biochemistry: Life at the Molecular Level」、第３版、John Wiley & Sons、Hoboken、NJ、２００８年；Sambrook, J.ら、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、第３版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、２００１年；Ausubel, F.ら、「Current Protocols in Molecular Biology」、John Wiley & Sons、New York、１９８７年および定期最新版；Freshney, R.I.、「Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique」、第４版、John Wiley & Sons、Somerset、NJ、２０００年；ならびにシリーズ物「Methods in Enzymology」、Academic Press、San Diego、CAを参照。

【0027】

髄接着幹細胞（ＭＳＣ）
本開示は、対象の脳損傷部位にＳＢ６２３細胞を移植することによってＴＢＩを処置し、幹細胞移動をモジュレートする方法を提供する。ＳＢ６２３細胞は、髄接着間質細胞および間葉性幹細胞としても公知である、髄接着幹細胞（ＭＳＣ）でＮｏｔｃｈタンパク質の細胞内ドメインを発現させることによって、ＭＳＣから得られる。ＭＳＣは、骨髄から接着細胞（すなわち、組織培養プラスチックに接着する細胞）を選択することによって得られる。

【0028】

ＭＳＣの例示的な開示は、米国特許出願公開第２００３／０００３０９０号；Prockop（１９９７年）Science２７６巻：７１〜７４頁およびJiang（２００２年）Nature４１８巻：４１〜４９頁に提供される。ＭＳＣの単離および精製のための方法は、例えば、米国特許第５，４８６，３５９号；Pittengerら（１９９９年）Science２８４巻：１４３〜１４７頁およびDezawaら（２００１年）Eur. J. Neurosci.１４巻：１７７１〜１７７６頁に見出すことができる。ヒトＭＳＣは市販されている（例えば、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）か、または例えば、骨髄吸引および続く接着骨髄細胞の選択によってドナーから得ることができる。例えば、ＷＯ２００５／１００５５２を参照。

【0029】

ＭＳＣは、さい帯血から単離することもできる。例えば、Campagnoliら（２００１年）Blood９８巻：２３９６〜２４０２頁；Ericesら（２０００年）Br. J. Haematol.１０９巻：２３５〜２４２頁およびHouら（２００３年）Int. J. Hematol.７８巻：２５６〜２６１頁を参照。ＭＳＣのさらなる供給源には、例えば、月経血および胎盤が含まれる。

【0030】

Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン
Ｎｏｔｃｈタンパク質は、細胞内シグナル伝達を通して細胞分化に影響する、全ての後生動物で見出される膜貫通受容体である。Ｎｏｔｃｈ細胞外ドメインとＮｏｔｃｈリガンド（例えば、Ｄｅｌｔａ、Ｓｅｒｒａｔｅ、Ｊａｇｇｅｄ）との接触は、Ｎｏｔｃｈタンパク質の２つのタンパク分解性開裂をもたらし、第２のものはγ−セクレターゼによって触媒され、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）を細胞質に放出する。マウスＮｏｔｃｈタンパク質では、この開裂はアミノ酸ｇｌｙ１７４３とｖａｌ１７４４の間で起こる。ＮＩＣＤは核に転位し、そこでそれは転写因子として作用し、さらなる転写調節タンパク質（例えば、ＭＡＭ、ヒストンアセチラーゼ）を動員して、様々な標的遺伝子（例えば、Ｈｅｓ１）の転写抑制を軽減する。

【0031】

Ｎｏｔｃｈシグナル伝達に関するさらなる詳細および情報は、例えばArtavanis-Tsakonasら（１９９５年）Science２６８巻：２２５〜２３２頁；MummおよびKopan（２０００年）Develop. Biol.２２８巻：１５１〜１６５頁ならびにEhebauerら（２００６年）Sci. STKE２００６年（３６４号）、cm7.［DOI: 10.1126/stke.3642006cm7］で見出される。

【0032】

細胞培養およびトランスフェクション
細胞培養の標準の方法は、当技術分野で公知である。例えば、R. I. Freshney「Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique」、第５版、Wiley、New York、２００５年を参照。

【0033】

細胞への外因性ＤＮＡの導入（すなわち、トランスフェクション）のための方法、および外因性ＤＮＡを含む細胞の選択のための方法も、当技術分野で周知である。例えば、Sambrookら「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、第３版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、２００１年；Ausubelら、「Current Protocols in Molecular Biology」、John Wiley & Sons、New York、１９８７年および定期最新版を参照。

【0034】

ＳＢ６２３細胞
ＳＢ６２３細胞の調製のための一実施形態では、ＭＳＣの培養物を、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）をコードする配列を含むポリヌクレオチドと、例えばトランスフェクションによって接触させ、続いて、薬物選択およびさらなる培養によってトランスフェクション細胞を濃縮する。例えば、米国特許第７，６８２，８２５号（２０１０年３月２３日）；米国特許出願公開第２０１０／０２６６５５４号（２０１０年１０月２１日）およびＷＯ２００９／０２３２５１（２００９年２月１９日）を参照；その開示の全ては、髄接着幹細胞の単離およびＳＢ６２３細胞（それらの文書では「神経前駆体細胞」および「神経再生細胞」と表される）への髄接着幹細胞の変換を記載するために、参照により完全に組み込まれる。

【0035】

これらの方法では、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインをコードする任意のポリヌクレオチド（例えば、ベクター）を用いることができ、トランスフェクション細胞の選択および濃縮のための任意の方法を用いることができる。例えば、特定の実施形態では、ＭＳＣは、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインをコードする配列を含有し、薬剤耐性マーカー（例えばＧ４１８への耐性）をコードする配列も含有するベクターでトランスフェクトされる。さらなる実施形態では、１つはＮｏｔｃｈ細胞内ドメインをコードする配列を含有し、もう１つは薬剤耐性マーカーをコードする配列を含有する２つのベクターがＭＳＣのトランスフェクションのために用いられる。これらの実施形態では、ベクターによる細胞培養物のトランスフェクションの後、ベクターを含まない細胞を死滅させるがベクターを含む細胞を温存するのに十分である量の選択剤（例えば、Ｇ４１８）を細胞培養物に加えることによって、選択は達成される。選択なしとは、前記選択剤の除去、またはベクターを含まない細胞を死滅させないレベルまでのその濃度の低減を伴う。選択の後（例えば、７日間）、選択剤を除去し、細胞をさらに培養する（例えば、２継代）。

【0036】

したがって、ＳＢ６２３細胞の調製は、ＭＳＣでの外因性Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインの一時的発現を含む。この目的のために、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインをコードする、完全長Ｎｏｔｃｈタンパク質をコードしない配列を含むベクターでＭＳＣをトランスフェクトすることができる。全てのそのような配列は当業者に周知であり、直ちに利用できる。例えば、Del Amoら（１９９３年）Genomics１５巻：２５９〜２６４頁は、マウスＮｏｔｃｈタンパク質の完全なアミノ酸配列を提示し、MummおよびKopan（２０００年）Devel. Biol.２２８巻：１５１〜１６５頁は、細胞内ドメインを放出するいわゆるＳ３開裂部位を囲んでいる、マウスＮｏｔｃｈタンパク質からのアミノ酸配列を提供する。まとめると、これらの参考文献は、完全長Ｎｏｔｃｈタンパク質でないＮｏｔｃｈ細胞内ドメインを含有するいかなるペプチドも当業者に提供し、それによって、完全長Ｎｏｔｃｈタンパク質をコードしないＮｏｔｃｈ細胞内ドメインをコードする配列を含むあらゆるポリヌクレオチドも当業者に提供する。前述の文書（Del AmoおよびMumm）は、完全長Ｎｏｔｃｈタンパク質のアミノ酸配列およびＮｏｔｃｈ細胞内ドメインのアミノ酸配列をそれぞれ開示するために、参照により完全に組み込まれる。

【0037】

ラット、アフリカツメガエル、ショウジョウバエおよびヒトを含むさらなる種からのＮｏｔｃｈタンパク質および核酸について、類似した情報が入手できる。例えば、Weinmasterら（１９９１年）Development１１３巻：１９９〜２０５頁；Schroeterら（１９９８年）Nature３９３巻：３８２〜３８６頁；ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿０１７１６７（およびその中の引用文献）；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｐ４６５３１（およびその中の引用文献）；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｑ０１７０５（およびその中の引用文献）；およびＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＢ４０７３３（およびその中の引用文献）を参照。前述の参考文献は、いくつかの異なる種の完全長Ｎｏｔｃｈタンパク質のアミノ酸配列およびＮｏｔｃｈ細胞内ドメインのアミノ酸配列を開示するために、参照により完全に組み込まれる。

【0038】

さらなる実施形態では、ＳＢ６２３細胞は、ＭＳＣが外因性Ｎｏｔｃｈ細胞外のドメインを発現しないように、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインをコードする配列を含む核酸をＭＳＣに導入することによって調製される。そのことは、例えば、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインをコードする、完全長Ｎｏｔｃｈタンパク質をコードしない配列を含むベクターでＭＳＣをトランスフェクトすることによって達成することができる。

【0039】

ＳＢ６２３細胞の調製および本明細書に開示される方法で用いることができるＳＢ６２３細胞のそれらに類似した特性を有する細胞の作製方法に関するさらなる詳細は、米国特許第７，６８２，８２５号；米国特許第８，１３３，７２５号ならびに米国特許出願公開第２０１０／０２６６５５４号および第２０１１／０２２９４４２号で見出され、その開示は、ＳＢ６２３細胞に関するさらなる詳細およびその調製のための代替方法を提供するために、ならびにＳＢ６２３細胞のそれらに類似した特性を有する細胞の作製方法を提供するために、参照により本明細書に組み込まれる。Dezawaら（２００４年）J. Clin. Invest.１１３巻：１７０１〜１７１０頁も参照。

【0040】

ＳＢ６２３細胞の移植によるＴＢＩの症状の逆転
ＴＢＩのための処置として、ＳＢ６２３細胞移植の効能をラットモデル系で試験した。全ての動物がベースライン時に（すなわち、脳発作の前に）正常な行動を示すことを確認するために、試験の前に、成体雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（８週齢）を運動系および神経系の試験で評価した（全て、研究全体を通して処置条件に盲検化した二人の研究者によって実施された）。次に、動物に実験的外傷性脳損傷（ＴＢＩ）を施し、７日後、ＴＢＩによって誘導された典型的な運動系および神経系の機能障害を確認するために、同じ行動試験を受けさせた。これらの試験に続いて（ＴＢＩの７日後）、Ｎｏｔｃｈ誘導骨髄由来幹細胞（ＳＢ６２３細胞）の定位移植^{２６、２９}または皮質へのビヒクル注入のいずれかを受けるように、動物を２つの群の１つにランダムに割り当てた（実施例３を参照）。

【0041】

本発明者らは、ＴＢＩの１カ月後および３カ月後の両方に、ＳＢ６２３細胞の移植を受けた外傷動物は、ビヒクルだけを受けた外傷動物と比較して、皮質コアおよび損傷周囲の皮質エリアへの傷害の有意な低減に加えて、有意に改善された運動系および神経系の機能を示すことを見出した（実施例を参照）。これらの行動および身体の改善は、ＴＢＩの１カ月および３カ月後にそれぞれ０．６０％および０．１６％の適度の移植片生存で達成された。ＴＢＩの影響を受ける脳の他の部位には、線条体および海馬が含まれる。したがって、これらのエリアに影響を及ぼすＴＢＩの処置のために、線条体および海馬へのＳＢ６２３細胞の移植を用いることもできる。要約すると、脳損傷動物へのＳＢ６２３細胞の移植は、移植片持続性がないにもかかわらず、頑強な機能回復を提供した。

【0042】

ＳＢ６２３細胞の移植によるバイオブリッジの形成
ＴＢＩの１カ月後にＳＢ６２３細胞の移植を受けた脳損傷動物の宿主組織の検査は、損傷周囲の皮質エリアおよび脳室下帯（ＳＶＺ）での内因性細胞増殖（Ｋｉ６７の発現によって検出された）および神経原性細胞の分化（ネスチンの発現によって検出された）の急増を明らかにした。これらの動物の脳梁（ＣＣ）に沿って移動する細胞（ダブルコルチンを発現する）の流れも検出された。対照的に、ビヒクルだけを受けた、実験的ＴＢＩを施した動物は、損傷周囲の皮質エリアにおいて、限定的な細胞増殖、わずかな神経分化、および散乱移動だけを示した。さらに、新たに形成された細胞は、これらの対照動物の脳室下帯で極めて少数しか見られなかった（実施例を参照）。

【0043】

ＴＢＩの３カ月後には、ＳＢ６２３細胞移植を受けた動物からの脳は、ＳＶＺから衝撃を受けた皮質までＣＣに沿ってだけでなくそれを越えて移動する神経細胞（ネスチンおよびダブルコルチンの両方を発現する）の充実流に加えて、損傷周囲の皮質エリアを取り囲むずっと高いレベルの細胞増殖および神経分化を示した。ビヒクルだけを受けた損傷動物からの脳は、ＴＢＩの１カ月後よりもＴＢＩの３カ月後に非常により高いレベルの細胞増殖を示したが、新たに形成された細胞はＳＶＺおよび脳梁の範囲内に「捕獲されて」いるように見え、少数の細胞だけが衝撃を受けた皮質に到達することができた。ＳＶＺ、ＣＣおよび損傷を受けた皮質エリアでのＫｉ６７、ネスチンおよびダブルコルチンの免疫反応性の定量分析は、ＳＢ６２３細胞移植を受けた動物とビヒクルだけを受けた動物の間で、これらのマーカーの発現の差が統計的に有意なことを示した。

【0044】

別個の実験で、ＳＶＺから損傷部位に移動する内因性細胞によって形成されるバイオブリッジは、レーザー捕捉顕微解剖によって単離し（Espinaら（２００６年）Nature Protoc.１巻：５８６〜６０３頁）、その酵素原性を分析した。この実験では、３群の動物を分析した：（１）ＴＢＩを施し、続いてＴＢＩの７日後にＳＢ６２３細胞を移植した動物、（２）ＴＢＩを施し、続いてＴＢＩの７日後にビヒクルを注入した動物、（３）偽手術をし、年齢をマッチさせた対照の成体Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（１群につきｎ＝３）。ＴＢＩを施した動物からのレーザー捕捉バイオブリッジのザイモグラフアッセイは、移植の１カ月後および３カ月後、ビヒクルを注入した動物または偽手術をした動物と比較して、ＳＢ６２３細胞移植を受けた動物で、マトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ−９）の発現／活性のそれぞれ２倍および９倍の上方制御を明らかにした（実施例１１）。

【0045】

ＭＭＰは慢性脳損傷の回復と結びつけられ^２９、ＭＭＰ活性の阻害は、ＳＶＺから受傷組織への神経原性細胞の移動を抑止し、神経血管リモデリングを遅らせることが示された^３０。したがって、ＭＭＰは、ＳＢ６２３細胞がＴＢＩからの機能回復を提供する過程の一部として、損傷脳エリアへの宿主細胞の移動を促進する役割をすることができる。

【0046】

要約すると、本発明者らは、ＳＢ６２３細胞の移植が、ＳＶＺと損傷周囲の皮質の間でバイオブリッジを形成することによって、外傷を受けた脳をリモデリングすることを発見した。今や、細胞療法のこの方法は、さもなければ細胞運動性の障壁となるかもしれない組織を越えて細胞の損傷特異的移動を促進するために、神経原性部位と非神経原性部位の間で類似したバイオブリッジを形成するために用いることができる。

【0047】

製剤、キットおよび投与経路
本明細書に開示されるＳＢ６２３細胞を含む治療組成物も提供される。そのような組成物は、ＳＢ６２３細胞および薬学的に許容される担体を一般的に含む。補助活性化合物を、ＳＢ６２３細胞組成物に組み込むこともできる。

【0048】

本明細書に開示される治療組成物は、ＴＢＩを処置し、脳での幹細胞移動をモジュレートするためにとりわけ有益である。したがって、ＳＢ６２３細胞を含む組成物の「治療的有効量」は、ＴＢＩの症状を低減するか、脳で幹細胞の移動を刺激する任意の量である。例えば、投与量は、細胞数が約１００、５００、１，０００、２，５００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、３００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００から１０，０００，０００、またはそれ以上（または、それらの間の任意の整数）で異なってよく、投与頻度は、例えば体重、投与経路、疾患の重症度などによって、例えば、１日につき１回、１週につき２回、１週につき１回、１カ月につき２回、１カ月につき１回であってよい。したがって、治療的有効量は、ＳＢ６２３細胞の同じ量または異なる量の複数回の投与を含むことができる。特定の実施形態では、ＳＢ６２３細胞の１回の投与が治療的有効量である。

【0049】

様々な医薬組成物ならびにそれらの調製および使用のための技術は、本開示を考慮して当業者に公知である。適する薬理学的組成物およびそれらの投与技術の詳細なリストについては、Remington's Pharmaceutical Sciences、第１７版、１９８５年；Bruntonら、「Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics」、McGraw-Hill、２００５年；University of the Sciences in Philadelphia（編）、「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」、Lippincott Williams & Wilkins、２００５年；およびUniversity of the Sciences in Philadelphia（編）、「Remington: The Principles of Pharmacy Practice」、Lippincott Williams & Wilkins、２００８年、などのテキストを参照することができる。

【0050】

本明細書に記載される細胞は、移植のための生理的に適合する担体に懸濁されてもよい。本明細書で用いるように、用語「生理的に適合する担体」は、ＳＢ６２３細胞に、および製剤の任意の他の成分に適合し、そのレシピエントに有害でない担体を指す。当業者は、生理的に適合する担体に詳しい。適する担体の例には、細胞培地（例えば、イーグルの最少必須培地）、リン酸緩衝食塩水、ハンクの平衡塩溶液＋／−グルコース（ＨＢＳＳ）および複数の電解質溶液、例えばＰｌａｓｍａ−Ｌｙｔｅ（商標）Ａ（Ｂａｘｔｅｒ）が含まれる。

【0051】

対象に投与されるＳＢ６２３細胞懸濁液の容量は、移植部位、処置目標および溶液中の細胞数によって異なる。一般的に、投与される細胞の量は、治療的有効量である。本明細書で用いるように、「治療的有効量」または「有効量」は、特定の障害の処置を成し遂げるために、すなわち、その障害と関連する症状の量および／または重症度の低減をもたらすために必要とされる移植細胞の数を指す。例えば、ＴＢＩの場合、ＳＢ６２３細胞の治療的有効量の移植は、ＴＢＩの症状の低減および／または逆転、例えば、運動活性および神経系の性能の修復、ならびに宿主神経原性細胞の移動の刺激をもたらす。治療的有効量は、脳傷害のタイプおよび程度によって異なり、対象の全体の状態によって異なることもある。

【0052】

開示される治療組成物は、薬学的に許容される材料、組成物またはビヒクル、例えば液体もしくは固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒またはカプセル化材、すなわち担体を含むこともできる。これらの担体は、例えば、ＳＢ６２３細胞を安定させることおよび／または体内でのＳＢ６２３細胞の生存を促進することができる。各担体は、製剤の他の成分に適合し、対象に損傷を与えないという意味において「許容される」ものであるべきである。薬学的に許容される担体の役割をすることができる材料の一部の例には、以下のものが含まれる：糖、例えば乳糖、グルコースおよびスクロース；デンプン、例えばコーンスターチおよびジャガイモデンプン；セルロースおよびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース；粉末トラガカント；モルト；ゼラチン；タルク；賦形剤、例えばカカオ脂および坐薬ワックス；油、例えば落花生油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油；グリコール、例えばプロピレングリコール；ポリオール、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール；エステル、例えばオレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；寒天；緩衝剤、例えば水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；アルギン酸；無発熱物質水；等張性食塩水；リンガー液；エチルアルコール；リン酸緩衝液；ならびに医薬製剤で採用される他の無毒の適合物質。湿潤剤、乳化剤および滑沢剤、例えばラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム、ならびに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味料、香料および芳香剤、保存料および抗酸化物が組成物に存在してもよい。

【0053】

例示的な製剤には、それらに限定されないが、非経口投与、例えば、肺内、静脈内、動脈内、眼内、頭蓋内、髄膜下、または皮下投与に適するもの、例えばミセル、リポソームまたは薬物放出カプセルに封入される製剤（活性薬剤は緩効性のために設計された生体適合性のコーティングの中に組み込まれる）；摂取可能な製剤；局所使用のための製剤、例えば点眼剤、クリーム剤、軟膏およびゲル剤；ならびに吸入剤、エアゾール剤およびスプレー剤などの他の製剤が含まれる。開示の組成物の投薬量は、処置の必要性の程度および重大度、投与される組成物の活性、対象の全身的健康状態ならびに当業者に周知である他の考慮事項によって異なる。

【0054】

さらなる実施形態では、本明細書に記載される組成物は、外傷性脳損傷の部位かその近くの頭蓋内に送達される。そのような限局性送達は、組成物の非全身的な送達を可能にし、それによって全身送達と比較して組成物の体への負荷を低減する。局部送達は、例えば、頭蓋内注射によって、もしくは限定されずにステントおよびカテーテルを含む様々な医療用植込み型器具の使用を通して達成することができ、または、吸入、静脈切開もしくは外科手術によって達成することができる。所望の薬剤をステントおよびカテーテルなどの医療器具にコーティング、植え込む、包埋する、さもなければ付着させる方法は当技術分野で確立されており、本明細書で企図される。

【0055】

本開示の別の態様は、任意選択で別の治療薬剤と一緒に、対象へのＳＢ６２３細胞の投与を実行するためのキットに関する。一実施形態では、キットは、移植のために適する、薬用担体で製剤化されたＳＢ６２３細胞の組成物を含む。

【実施例】

【0056】

本明細書に開示される研究では、ラットに実験的な外傷性脳損傷（ＴＢＩ）を施し、７日後に、十分な運動および神経系の欠損を有するラットは損傷エリアにＳＢ６２３細胞の移植またはビヒクルを受けた。運動および神経系の性能の値は、ＴＢＩの前（ベースライン値）、ＴＢＩの７日後（移植前）に再び、その後はＴＢＩ後の３カ月間毎月評価した。

【0057】

ＴＢＩの１カ月後および３カ月後の行動試験の完了後、４％パラホルムアルデヒドによる心臓横断灌流によってランダムに選択した動物を安楽死させた（１群につきｎ＝１０）。移植された細胞の持続性、損傷エリアの内外の脳組織の組織学的外観、損傷エリアの内外の様々な神経マーカーの発現、および損傷エリアの内外の酵素原活性の評価のために、それらの脳を取り出し、切断した。

【0058】

以下の基準を用いて移植転帰を評価した：１）上昇ボディスイング試験（ＥＢＳＴ）およびＲｏｔｏｒｏｄによる運動行動；２）Ｂｅｄｅｒｓｏｎ改変神経学的検査による神経系の性能；３）組織学（Ｈ＆Ｅ染色切片）による病変容量；４）ヒト細胞を特異的に検出する抗体（ＨｕＮｕ）を用いる免疫組織化学による移植片生存；ならびに５）移植されたヒト細胞および宿主細胞に対する抗体を用いた神経保護および／または再生の機構ベースの免疫組織化学的分析。

【0059】

（実施例１）
ＭＳＣおよびＳＢ６２３細胞の調製
成人ヒトドナーからの骨髄穿刺液を、Ｌｏｎｚａ Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｉｎｃ．（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から得、１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）およびペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したα−ＭＥＭ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ）に平板培養した。細胞を３７℃および５％ＣＯ_２で３日間培養して、接着細胞の単層を得た。非接着細胞の除去の後、同じ条件の下で培養を２週間継続した。この間に、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡを用いて、細胞を２回継代させた。第２継代からの細胞の一部を、ＭＳＣとして冷凍した。

【0060】

サイトメガロウイルスプロモーターに作動可能に連結したＮｏｔｃｈ細胞内ドメインをコードする配列を含有するプラスミド（ｐＣＭＶ−ｈＮＩＣＤ１−ＳＶ４０−Ｎｅｏ（登録商標））と一緒にＦｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いて、第２継代からの残りの細胞を平板培養し、トランスフェクトした。このプラスミドは、ＳＶ４０プロモーターの転写制御下の、ネオマイシンおよびＧ４１８への耐性をコードする配列も含有した。トランスフェクション細胞は、１００μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を補充した前の段落に記載の成長培地において、３７℃および５％ＣＯ_２で培養した。７日後に、Ｇ４１８耐性コロニーを増殖させ、培養を２回継代させた。第２継代の後、細胞を収集し、ＳＢ６２３細胞として冷凍した。

【0061】

さらなる研究のために、本明細書に記載されるように調製したＭＳＣおよびＳＢ６２３細胞を必要に応じて解凍して用いた。

【0062】

（実施例２）
ラットモデルでのＴＢＩの誘導
ベースライン時（ＴＢＩ外科手術の前）に正常な行動（ＥＢＳＴで５０〜６０％バイアススイング活性；Ｒｏｔｏｒｏｄで６０秒の滞在期間；および最大０〜０．５の平均Ｂｅｄｅｒｓｏｎスコア）を示すと特定された合計４０匹の動物が、下記の通りのＴＢＩ外科手術を受けた。

【0063】

全ての外科的手技は、無菌状態下で実行された。成人雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを１．５％イソフルラン（isofluorane）で麻酔をかけ、疼痛反射をチェックした。深い麻酔下、動物は以下の通り中等度ＴＢＩモデルを受けた。各動物を定位フレームに置き、ガスマスクを通して投与された１〜２％イソフルランで麻酔を維持した。頭蓋を曝露させた後に、４ｍｍ骨切除開頭を左前頭頭頂の皮質に施し、その中心は前頂に対し−２．０ｍｍ ＡＰおよび＋２．０ｍｍ ＭＬであった。直径３ｍｍの圧縮空気作動金属インパクターを用いて、６．０ｍ／ｓの速度で脳に衝撃を与え、硬膜層の１．０ｍｍ下の深さに到達させ、脳内に１５０ミリ秒の間残存した。衝撃部位での脳表面の接線面に直角になるように、インパクターロッドは垂直から１５°の角度にした。一貫性を検証するために、インパクターに接続した線状可変型変位変換器（Ｍａｃｒｏｓｅｎｓｏｒｓ、Ｐｅｎｎｓａｕｋｅｎ、ＮＪ）を用いて速度および持続時間を測定した。

【0064】

制御された皮質衝撃損傷に続いて、出血が終わった後、切開を縫合した。フィードバック制御を有する一体化された加熱パッドおよび直腸検温器ユニットは、正常限度での体温度の維持を可能にした。麻酔から回復するまで、全ての動物を監視した。さらに、ＴＢＩの誘導の後、３日連続で毎日動物を計量、観察し、その後週に２回計量し、健康状態および問題点または合併症を示す任意の徴候について全研究期間中の毎日監視した。

【0065】

（実施例３）
ＳＢ６２３細胞の移植
ＴＢＩを施した動物のうち、ＴＢＩ後の７日目に以下の度合いの行動機能障害を有する動物だけを移植研究のために選択した：ＥＢＳＴで少なくとも７５％バイアススイング活性；Ｒｏｔｏｒｏｄで３０秒以下の滞在期間；および少なくとも２．５の平均Ｂｅｄｅｒｓｏｎスコア。選択した動物は、ＳＢ６２３移植を受けた群（ｎ＝２０）またはビヒクル注入を受けた群（ｎ＝２０）のいずれかにランダムに割り当てた。移植の標的エリアは内側皮質であり、そこは、類似した定位植込剤のために前に確立された標的部位に基づく損傷周囲の皮質エリアに対応した。

【0066】

全ての外科的手技は、無菌状態下で実行した。動物を１．５％イソフルランで麻酔をかけ、疼痛反射をチェックした。深い麻酔が達成されると（疼痛反射の喪失で判断される）、手術切開のエリア（頭蓋エリア）の周囲の毛を剃り、手術部位の汚染を防止するのに十分な境界を残した。この後に、部位の外科殺菌スクラブを２回行い、滅菌ドレープを掛けた。

【0067】

次に動物を定位固定装置（Ｋｏｐｆ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｔｕｊｕｎｇａ、ＣＡ）に固定し、バーで頭蓋に小開口部を設けた。開口部の座標は、前頂の０．５ｍｍ前および１．０ｍｍ横、ならびに硬膜表面の２．０ｍｍ下であった。これらは、PaxinosおよびWatson（１９９８年）の地図に基づいて、コア損傷部位に隣接する皮質エリアに対応するように選択された。試験材料を含有する２６ゲージのハミルトンシリンジを、次に開口部まで下げた。１回の針の通過で、各々３μｌの３つのデポジットが形成された。各デポジットは、３分間にわたって注入された３μｌのＰｌａｓｍａｌｙｔｅ Ａ中の、１００，０００個の生存細胞からなった。さらなる２分の吸収時間の後、針を引き込ませ、ステンレス鋼創傷クリップで傷口を閉じた。加熱パッドおよび直腸検温器は、外科手術の間中および麻酔からの回復後も、体温度を約３７℃に維持することを可能にした。対照注射は、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ Ａだけを含有した。

【0068】

処置動物および対照動物は、ベースライン時（ＴＢＩ前）、ＴＢＩの７日後（移植直前）およびその後ＴＢＩの３カ月後まで月１回、上昇ボディスイング試験（ＥＢＳＴ、実施例４）、神経学的検査（実施例５）およびＲｏｔｏｒｏｄ試験（実施例６）を受けさせた。

【0069】

さらに、傷害の度合い（実施例８および９）；宿主細胞の増殖、移動および神経分化の程度（実施例１０）；ならびに酵素原活性の存在（実施例１１）を判定するために、ＴＢＩの１カ月後および３カ月後に、処置動物および対照動物の脳を組織学的に特徴づけた。

【0070】

（実施例４）
上昇ボディスイング試験（ＥＢＳＴ）
動物を試験した全ての研究者は、処置条件に盲検化された。ＥＢＳＴは、動物をその尾によって扱い、動物がその頭部を振った方向を記録することによって実行した。試験機器は、透明なプレキシグラスボックス（４０×４０×３５．５ｃｍ）からなった。動物を尾の基部で優しくつまみあげ、動物の鼻が表面から２インチ（５ｃｍ）の高さになるまで尾をもって上昇させた。動物の頭部が体の正中位置からおよそ１０度側方に動いたとき、スイングの方向（左または右）を記録した。１回のスイングの後、動物をプレキシグラスボックスに戻し、再試験の前に３０秒間自由に行動させた。これらのステップは、各動物について合計２０回のアッセイで繰り返した。損傷を受けていないラットは、５０％のスイングバイアス、すなわち左および右に同じ数のスイングを示す。７５％のスイングバイアスは、２０回の試みの間、１つの方向に１５回のスイングおよびもう１つの方向に５回のスイングを示した。ＥＢＳＴを利用した以前の結果は、片側に障害を起こした動物が、黒質線条体病変または片側性半球体損傷の１カ月後に７５％を超える偏ったスイング活性を示すこと、およびそのような非対称は最高６カ月間安定していることを示した^３、２６。

【0071】

ＥＢＳＴの結果を図１に示す。ＴＢＩの後、事実上全ての動物は偏ったスイング活性を示した。ＳＢ６２３細胞を移植された動物では、偏ったスイング活性は、ＴＢＩおよび移植に続く３カ月の期間に着実にわたって低下した。対照的に、ビヒクルを移植された動物では、ＴＢＩの後に偏ったスイング活性を示す動物の百分率は、事実上不変であった。

【0072】

（実施例５）
改変Ｂｅｄｅｒｓｏｎ神経学的検査
ＥＢＳＴの終結の約１時間後に、軽微な改変を加えた前述の手順^３、２６に従って、改変Ｂｅｄｅｒｓｏｎ神経学的検査を実行した。各ラットの神経学的スコアは、（１）２〜３ｃｍ横に変位した後、前肢を元に戻す動物の能力を測定する前肢引込み、０（即時の返還）から３（数秒後の返還または返還なし）まで等級付け；（２）ビーム歩行能力、幅２．４ｃｍ、長さ８０ｃｍのビームを容易に横断したラットの０から、ビーム上に１０秒間留まることができないラットの３まで等級付け；および（３）直径２ｍｍの鋼鉄製ロッドにしがみつく能力を測定した両側前足把握、正常な前足把握行動を有するラットの０から、前足で把握することができないラットの３まで等級付けを含む３つの試験を用いて得られた。各調査日に約１５分間にわたって実行された全ての３つの試験からのスコアを加算して、平均の神経学的欠損スコアを与えた（可能な最大スコア、９ポイントを３つの試験で割る＝３）。

【0073】

これらの神経学的検査の結果を、図２に示す。ＴＢＩの後、平均の神経学的スコアは、全ての動物で２．５（３のうち）であった。ＳＢ６２３細胞を移植した動物では、このスコアは、ＴＢＩおよび移植に続く３カ月の期間にわたって着実に低下した（改善した神経機能を示す）。ＳＢ６２３細胞を移植した動物での神経機能の改善は、ビヒクルを注入した動物と比較して、統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）。

【0074】

（実施例６）
Ｒｏｔｏｒｏｄ（登録商標）試験
神経学的検査の完了の１時間後、動物をＲｏｔｏｒｏｄ（登録商標）試験にかけた。この試験は、６０秒間にわたって４ｒｐｍから４０ｒｐｍまで加速する回転トレッドミルの上に動物を置くことを含んだ（Ｒｏｔｏｒｏｄ（登録商標）、Ａｃｃｕｓｃａｎ，Ｉｎｃ．、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、ＯＨ）。動物がトレッドミルの上に残ることができた合計秒数を記録し、共調運動の指数として用いた。ＴＢＩモデル系を用いた以前の結果は、偽手術をしたか正常な対照と比較して、損傷動物が有意により短い時間Ｒｏｔｏｒｏｄの上に残ることができたことを示した。

【0075】

このアッセイの結果を、図３に示す。損傷を受けていない動物は、平均６０秒の間トレッドミルの上に残ることができた。トレッドミルの上での平均時間は、ＴＢＩの７日後に２０秒未満に低下した。ＴＢＩの後にＳＢ６２３細胞を移植した動物では、トレッドミルの上での平均時間はおよそ４０秒に倍加した。ビヒクルを注入したＴＢＩを施した動物と比較して、これらの改善は統計的に有意であった。

【0076】

（実施例７）
灌流および切片作製
ＴＢＩの１カ月後および３カ月後、実施例４〜６に記載の行動試験の完了後、４％パラホルムアルデヒドによる心臓横断灌流によってランダムに選択したラットを安楽死させた（１群につきｎ＝１０）。脳を解剖し、４％パラホルムアルデヒドで一晩の間後固定し、次に３０％スクロースに浸漬した。前頂から前方に−５．２ｍｍから始まり、前頂から−８．８ｍｍになるまで後方に移動して、各前脳を４０μｍの冠状切片に切断した。切片は、実施例８および９に記載される通り、病変周囲エリアでの脳傷害の判定および細胞生存の分析のために処理した。

【0077】

（実施例８）
脳傷害の測定
脳傷害の程度および宿主細胞生存を特定するために、脳切片の調製および検査を行った。脳につき少なくとも４つの冠状組織切片を、ヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈ＆Ｅ）またはニッスル染色のために処理した。対側半球の面積から同側半球の無傷の面積を引き算することによって計算された間接病変面積を判定することによって、脳傷害を定量化した。病変容量は、連続切片からの病変面積を合計することによって、対側半球と比較した病変の容量百分率として提示した。

【0078】

図４Ｂに定量的に示す結果は、ＳＢ６２３細胞の移植を受けた、ＴＢＩを施した動物が、ビヒクルの注入を受けた、ＴＢＩを施した動物と比較して、皮質コアおよび損傷周囲の皮質エリアへの傷害が有意により少ないことを示す。

【0079】

（実施例９）
ＴＢＩ周囲病変エリアでの細胞生存の分析
損傷周囲の皮質エリアに対応する、ランダムに選択された高倍率視野を検査して、この領域に生存する宿主細胞を計数した。結果を、図４Ａに示す。

【0080】

（実施例１０）
免疫組織化学
浮動切片を、免疫蛍光顕微鏡検査のために処理した。簡潔には、４０μｍのクリオスタット切片組織を４倍の倍率で検査し、ＰＣベースの画像ツールコンピュータプログラムを用いてデジタル化した。齧歯動物のタンパク質と交差反応しなかったモノクローナルヒト特異抗体ＨｕＮｕを用いて、移植されたＳＢ６２３細胞の生着を調査した。細胞増殖（Ｋｉ６７）、移動（ダブルコルチンまたはＤＣＸ）および神経分化（ネスチン）に重点を置いて、脳組織試料の機構ベースの免疫組織化学的分析のために、さらなる脳切片を処理した。脳切片をブラインドコード化し、Ａｂｅｒｃｒｏｍｂｉｅの式を用いて免疫陽性細胞の総数を計算した^３、２６。

【0081】

これらの分析の結果は、ＳＢ６２３細胞の移植が、ＳＶＺと、高度に増殖性の、神経的に献身的な移動性の細胞からなる衝撃を受けた皮質の間でバイオブリッジの形成を誘導することを示した。ＴＢＩの１カ月後、免疫蛍光および共焦鏡検は、損傷周囲の皮質エリアおよび脳室下帯（ＳＶＺ）での、ＳＢ６２３細胞の移植を受けた動物の脳梁（ＣＣ）に沿った移動性細胞（ダブルコルチンを発現する細胞）の流れを伴う、内因性細胞増殖（Ｋｉ６７を発現する細胞によって証明される）および未熟な神経分化（ネスチンを発現する細胞）の急増を明らかにした。ビヒクルだけを受けた動物からの脳は、損傷周囲の皮質エリアにおいて、限定的な細胞増殖および神経分化、ならびに散乱移動を示し、新たに形成された細胞はＳＶＺにほとんど存在しなかった。ＴＢＩの３カ月後には、ＳＢ６２３移植を受けた動物からの脳は、ＳＶＺから衝撃を受けた皮質までＣＣに沿うだけでなくそれを越えて移動する神経標識細胞（ネスチンおよびダブルコルチンの両方を発現する）の充実流を伴って、損傷周囲の皮質エリアを取り囲むずっと大量の細胞増殖および神経分化を示した。対照的に、ビヒクルを注入した動物からの脳では、細胞増殖は強化されたが、新たに形成された細胞はＳＶＺおよびＣＣの中に「捕獲され」、ほんの少しの細胞だけが衝撃を受けた皮質に到達することができた。ＳＶＺ、ＣＣおよびＣＴＸでのＫｉ６７、ネスチンおよびＤＣＸ免疫標識細胞の定量分析は、移植された動物とビヒクルを注入された動物の間で統計的に有意な差を明らかにした（図５〜７）。

【0082】

（実施例１１）
ザイモグラフィ
損傷脳へのＳＢ６２３細胞の移植後のタンパク質分解酵素の存在および／または活性について試験するために、その分析が実施例４〜１０に記載されたものとは別個の動物のコホートを用いた。ラットにＴＢＩを施し、次にＳＢ６２３細胞またはビヒクルを移植した。年齢をマッチさせ、偽手術をした成体Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの対照群に、同じ実験手順を受けさせた（１群につきｎ＝３ラット）。ＴＢＩの１カ月後および３カ月後に、ＳＶＺから衝撃を受けた皮質まで移動する細胞によって形成されるバイオブリッジに対応する組織を、レーザー解剖によって得た。抽出後、組織をクライオチューブに入れ、液体窒素で瞬間冷凍した。ホモジナイゼーションまで、チューブを−８０℃のフリーザーに保管した。

【0083】

５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、７５ｍＭのＮａＣｌおよび１ｍＭのＰＭＳＦを含有する４５０μＬの低温加工緩衝液で、試料をホモジナイズした。組織を１０分間ホモジナイザーで処理し、４℃で２０分間、１３０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を分離、冷凍し、使用時まで−８０℃に保った。上清中の総タンパク濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によって調査した。

【0084】

ザイモグラフィを実行した日に、５０μｇの総タンパクと同等の容量を、新たに提供したゼラチンザイモグラフィゲルに投入した。全てのゲルは、酵素量（ｎｇ）およびゼラチン溶解活性（相対的光学密度単位で表される、下記を参照）の両方の標準として用いられた、０．５ｎｇの組換えＭＭＰ−９を投入した対照レーンを有していた。１００Ｖの非還元条件下のゲルで、タンパク質を電気泳動的に分離した。電気泳動の後、ゲルを１２５ｍｌの２．５％Ｔｒｉｔｏｎで２０分間、２回洗浄した。次に、３７℃で２０時間、活性化緩衝液（Ｚｙｍｏｇｒａｍ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｂｕｆｆｅｒ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）でゲルをインキュベートした。翌日、ゲルをクーマシーブルーＲ−２５０染色液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で３時間染色し、脱色液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で２５分間脱色した。試料のゼラチン溶解活性は、バンドの濃度測定分析（Ｇｅｌ−Ｐｒｏ ｖ３．１、Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によって調査した。溶解活性を示すゲル領域中のタンパク質の分子量は、同じゲルの上を流した前染色標準タンパク質マーカー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）との比較により判定した。活性は、標準としてゲルに流した０．５ｎｇの組換えＭＭＰ−９のそれに対する光学密度で表した。

【0085】

結果を、図８に示す。ＴＢＩ後にＳＢ６２３細胞を移植した動物からのレーザー捕捉バイオブリッジ（ＳＶＺと衝撃を受けた皮質の間の脳組織に対応する）は、ＴＢＩの１カ月後および３カ月後に高レベルのＭＭＰ−９ゼラチン溶解活性を表した。ＳＢ６２３処置動物でのレベルは、ビヒクルを注入した偽手術をした動物からのバイオブリッジでのそれらより、両時点で有意に高かった（ｐ＜０．０５）。ビヒクルを注入した動物からのバイオブリッジは、ＴＢＩの１カ月後の偽手術をした動物と比較してＭＭＰ−９活性の有意な増加を示したが、これらのレベルはＴＢＩの３カ月後に対照レベルに戻った（すなわち、偽手術をした動物のそれらと有意に異ならない）。

【0086】

ブロットの上の検出のために、膜をブロットグレードの脱脂粉乳（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）でブロックした。０．１％トゥイーン２０−トリス緩衝食塩水（ＴＴＢＳ）による洗浄の後、膜を４℃で一晩、１μｇ／ｍｌの抗ＭＭＰ−９モノクローナルマウス抗体とインキュベートした。膜をＴＴＢＳで再び洗浄し、二次抗体（西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧの１：１，０００希釈溶液、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）と１時間インキュベートし、最後に西洋ワサビペルオキシダーゼ現像溶液（ＥＣＬアドバンス検出キット、Ａｍｅｒｓｈａｍ）で現像した。膜は、オートラジオグラフィフィルム（Ｈｙｂｌｏｔ ＣＬ、Ｄｅｎｖｉｌｌｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）に曝露させた。ザイモグラムのための試料バンドの密度は、標準バンド（０．５ｎｇの組換えＭＭＰ−９）に対する最大光学密度として表した。

【0087】

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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】